CN100519749C - 抗trk-c拮抗剂的单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗trkC促效单克隆抗体，它模拟trkC的天然配体NT-3的某些生物活性。本发明进一步涉及此类抗体在预防和/或治疗细胞退化方面的应用，包括与急性神经细胞系统损伤和慢性神经退化疾病有关的神经细胞损害，包括周围神经病。

Description

抗TRK-C拮抗剂的单克隆抗体
发明背景
发明领域
本发明涉及抗trkC促效单克隆抗体。本发明进一步涉及此类抗体在预防和/或治疗细胞退化方面的应用，包括与急性神经细胞系统损伤和慢性神经退化疾病有关的神经细胞损害，包括周围神经病。
相关技术的描述
神经营养蛋白是一族小型碱性蛋白，它在神经系统的发育和维持中起着非常重要的作用。这一族中最早被鉴定且可能是了解得最彻底的是神经生长因子(EGF)，它对于渐进性感觉以及周围神经系统的交感神经元起着重要的的作用(Levi-Montalcini，R.和Angeletti，P.U.，Physiol.Rev.48，534-569[1968]；Thoenon，H.等，Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.109，145-178[1987]。尽管知道NGF已经右很长时间，包括小鼠下颌下腺的一种同系物，其活化形式通常被称为2.5S NGF，但是在多年以后才鉴定出顺序相关但有类似功能的性质不同的多肽。
首先是一种被称为脑衍生神经营养因子(BDNF)的因子，它被Leibrock，J.等(Nature 341，149-152[1989])克隆并测序。这种因子通常是从猪脑中纯化的(Barde，Y.A.等，EMBO J.1，549-553[1982])，但直到它的cDNA被克隆和测序，它与NGF的同源性才变得显而易见。NGF和BNDF之间总的氨基酸序列同一性约是50％。基于这一发现，Leibrock等推测，没有理由认为BDNF和NGF是神经营养蛋白家族中具有相同结构和功能特征的唯一成员。
实际上，还发现了与NGF和BDNF关系密切的神经营养蛋白。一些小组鉴别了一种原来称为神经因子(NF)的神经营养蛋白，它现在被称为神经营养蛋白-3(NT-3)(Ernfors等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87.5454-5458[1990]；Hohn等，Nature 344,339[1990]；Maisonpierre等，Science 247，1446[1990]；Rosenthal等，Neuron4,767[1990]；Jones和Reichardt，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，8060-8064[1990]；Kaisho等，FEBS Lett.266，187[1990]；NT-3与NGF和BDNF(NT-2)共享约50％的氨基酸。神经营养蛋白-4和-5(NT-4和NT-5)也已经加入到这一家族(美国专利5,364,769号，发表于1994年11月15日；Hallbook，F.等，Neuron 6，845-858[1991]；Berkmeier，L.R.等，Neuron 7，857-866[1991]；Ip等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 89，3060-3064[1992])。最初由Berkmeier等(同上)描述的哺乳动物的分子(以后被认为是非洲爪蟾属NT-4的的同系物)通常被称为NT-4/5。此外，在哺乳动物中鉴别了一种酸性同源蛋白质，它被称为是NT-6(Berkemeir等，Somat.Cell Mol.Genet.18(3)：233-245[1992])。最沂，另一种来自于剑尾鱼属的鱼的同源蛋白质也被NT-6标记(Gotz等，Nature 372：266-269[1994])。有两种蛋白质在文献中被描述为NT-7，一种来自鲤鱼(鲤属)的克隆(Lai等，Mol.Cell.Neurosci.11(1-2)：64-76[1998])，一种来自于斑马鱼(担尼鱼属)(Nilsson等，FEBS Letters 424(3)：285-90[1998])。叙述的最后三种鱼神经营养蛋白都没有在鱼以外被描述，它们与任何哺乳类神经营养蛋白的关系还不清楚。斑马鱼神经营养蛋白-7(zNT-7)的氨基酸序列与鱼神经生长因子(NGF)和神经营养蛋白-6(NT-6)的关系比任何其它的神经营养蛋白更加密切。然而，zNT-7与鱼NGF和NT-6的关系一样密切(分别有65％和63％氨基酸序列同一性)说明它代表了一种性质不同的神经营养蛋白序列。zNT-7在成熟蛋白质中部的β-转角区域含有15个氨基酸残基。重组体zNT-7能够与人p75神经营养蛋白受体结合，并诱导大鼠trkA受体酪氨酸激酶的酪氨酸磷酸化作用，虽然它不及大鼠NGF有效。zNT-7不与大鼠trkB或trkC相互反应，这说明它与NGF有类似的受体特异性。我们假设，在神经营养蛋白的进化树中，NGF亚科的多样化发生在硬骨鱼的进化过程中，它随后出现了几个额外的在结构与功能上与NGF有关的成员，比如zNT-7和NT-6。
与其它的多肽生长因子相似，神经营养蛋白通过与细胞表面受体相互反应影响它们的靶细胞。根据我们现有的知识，有两类跨膜糖蛋白作为神经营养蛋白的受体。平衡结合研究显示，神经营养蛋白应答神经元具有一种普通的低分子量(65-80kDa)、低亲和力受体(LNGFR)—也被称为p75NTR或p75，它结合NGF、BDNF和NT-3(KD为2×10-9M)和大分子量(130-150kDa)、高亲和力(KD为10-11M)受体，它们是酪氨酸激酶受体的trk家族的成员。
trk受体家族的第一个成员是trA，它最初被认为是因原肌球蛋白序列转运入其催化域而导致的致癌转化的结果(Martin-Zanca等，Mol.Cell.Biol.9(1)：24-33[1989])。以后的工作将trkA鉴定为NGF的一种信号转导受体。随后，另外两种相关受体，小鼠和大鼠的trkB(Klein等，EMBO J.8，3701-3709[1989]；Middlemas等，Mol.Cell.Biol.11，143-153[1991]；公布于1991年11月6日的欧洲专利455,460号)以及猪、小鼠和大鼠的trkC(Lamballe等，Cell 66，967-979[1991]；公布于1993年1月13日的欧洲专利522,530号)被鉴定作为trk受体家族的成员。trk受体的结构十分类似，但可变剪接通过产生两种已知形式的trkA，三种已知形式的trkB(两种没有功能性的酪氨酸激酶域)以及至少四种形式的trkC(有一些没有功能性酪氨酸激酶域，两种在酪氨酸激酶域中有小的插入片段)从而增加了这一家族的复杂性。
p75和trk受体的作用是有争论的。通常被接受的是，trk受体酪氨酸激酶在使特定神经营养蛋白具有结合特异性方面起重要作用，然而，表达trkA的细胞系不仅结合NGF还结合NT-3和NT-4/5(但不结合BDNF)，表达trkB的细胞结合BDNF、NT-3、NT-4和NT-4/5(但不结合NGF)，相反，已报道表达trkC的细胞仅仅结合NT-3(不与其它的神经营养蛋白结合)。此外，在模型系统中显示，由可变剪接事件产生的各种形式的trk受体可以活化不同的细胞内信号途径，因此，可以认为它们在体内介导不同的生理功能。还不清楚表达给定trk受体的细胞在没有p75时是否以低的亲和力还是以高的亲和力与神经营养蛋白结合(Meakin和Shooter，Trends Neurosci.15，323-331[1992])。
用各种细胞系发表的研究结果是混淆的，它们提示p75对于神经营养蛋白的反应性是必需的或是非必需的。仅仅表达p75的细胞系在平衡时以类似的低亲和力与NGF、BDNF、NT-3和NT-4结合，但结合速度常数是显著不同的。其结果是，尽管结合p75是神经营养蛋白的共同特性，但说明p75受体可能也在配体辨别中起作用(Rodriguez-Tebar等，EMBO J.11，917-922[1992])。由于trk受体通常被认为是生物学上重要的神经营养蛋白受体，最近证明，在缺乏trkA表达的黑色素瘤细胞中，大概通过p75，NGF仍能够引发生物学行为的深刻变化(Hermann等，Mol.Cell.Biol.4，1205-1216[1993])。Davies等(Neuron 11，565-574[1993])报道了研究结果，研究了p75基因中携带无效突变的转基因小鼠模型中，p75在介导胚胎神经元对神经营养蛋白的存活反应中的作用。他们发现p75增强了NGF依赖性皮肤感觉神经元对NGF的敏感性。现在已经有很多研究表明，p75能够介导至少一些神经营养蛋白的生物学效应。这一领域仍有一些争议，但已经发觉p75信号能够控制细胞死亡和轴突生长物。(Barker，PA，CellDeath Diff.5：346-356[1998]；Bredesen等，Cell Death Diff.5：357-364[1998]；Casaccia-Bonnefil等，Cell Death Diff.5：357-364[1998]；Raoul等，Curr.Op.Neurobiol.10：111-117[2000]；Davies，AM，Curr.Biol.10：R198-R200[2000])。重要的是，p75的刺激能够改变刺激trkC的作用(HaDner等，Developm.Biol.201：90-100[1998])。
全长天然trkA、trkB和trkC受体的胞外域有五个功能域，这是根据同源性，或换句话说是根据在各种其它蛋白质中鉴定的类似结构确定的。从成熟trk受体的氨基酸序列的N末端开始，这些域依次为：1)从人trkA的第1个氨基酸到约第32个氨基酸，从人trkB的第1个氨基酸到约第36个氨基酸，以及从人trkC的第1个氨基酸到约第48个氨基酸是第一个半胱氨酸富集的域；2)从trkA中约第33个氨基酸到约第104个氨基酸，从trkB中约第37个氨基酸到约第108个氨基酸，以及从trkC中约第49个氨基酸到约第120个氨基酸是亮氨酸富集的域；3)从trkA中约第105个氨基酸到约第157个氨基酸，从trkB中约第109个氨基酸到约第164个氨基酸，以及从trkC中约第121个氨基酸到约第177个氨基酸是第二个半胱氨酸富集的域；4)从trkA中约第176个氨基酸到约第234个氨基酸，从trkB中约第183个氨基酸到约第239个氨基酸，以及从trkC中约第196个氨基酸到约第257个氨基酸是第一个免疫球蛋白样的域；5)从trkA中约第264个氨基酸到约第330个氨基酸，从trkB中约第270个氨基酸到约第334个氨基酸，以及从trkC中约第288个氨基酸到约第351个氨基酸是第二个免疫球蛋白样的域。
神经营养蛋白对周围神经元和中央神经元有明显但重叠的作用。这些作用的范围包括，在确保发育中的神经元存活中起决定性作用(感觉和交感神经元中的NGF)，以及对神经元的形态起相对较弱的作用(浦肯野细胞上的NT-3)。这些作用使人们对将神经营养蛋白用作某些神经退化性疾病的治疗剂产生了兴趣。已经发现NT-3促进外周血淋巴细胞的增殖，其结果是，这提示NT-3能用于治疗中性禾细胞减少症、传染性疾病和肿瘤(发表于2000年6月18日的美国专利6,015,552号)。
还研究了神经营养蛋白在控制心血管发展和调节血管对损伤的反应的作用(Donovan等，Nature Genetics 14：210-213[1996]；Donovan等，A.J.Path. 147：309-324[1995]；Kraemer等，Arteriol.Thromb.and Vasc.Biol.19：1041-1050[1999])。神经营养蛋白被描述为控制血管发生和血管完整性的潜在的治疗剂(公布于2000年5月4日的PCT公布WO 00/24415号)。
除了它们在治疗细胞退化(比如由于神经退化性疾病和急性神经元损伤造成)以及潜在的血管生成方面的希望，神经营养蛋白也有一些缺点。一个显著的缺点是缺乏特异性。大多数神经营养蛋白与一种以上的受体有交叉反应。例如，NT-3这种优选的trkC受体酪氨酸激酶的配体还结合并活化trkA和trkB(Barbacid，J.Neurobiol.25：1386-1403[1994]；Barbarcid，Ann.New York Acad. Sci.766：442-458[1995]；Ryden和Ibanez，J.Biol.Chem.271：5623-5627[1996]；Belliveau等，J.Biol.Chem.136：375-388[1997]；Farinas等，Neuron 21：325-334[1998])。其结果是，很难设计目标为特异性神经元群体的治疗。神经营养蛋白治疗的另一个限制是，已知神经营养蛋白(包括NT-3)能够引发痛觉过敏(Chaudhry等，Muscle and Nerve 23：189-192[2000])。此外，某些神经营养蛋白比如NT-3在啮齿类动物中有差的药物动力学和生物利用率特性，这就产生了有关它们在人类临床应用方面的严重问题(Haase等，J.Neurol.Sci.160：S97-S105[1998]，Helgren等在J.Neurol.17(1)：372-82[1997]中所用的剂量，以及以下数据)。
由此，对开发治疗神经退化性疾病以及急性细胞损伤，且没有现有神经营养蛋白的缺点的新的治疗剂有很大的需求。
发明概要
本发明基于抗trkC促效单克隆抗体的发展和特征，在trkC受体的胞外域中直接针对抗原表位，它模拟trkC受体的天然配体NT-3的生物学活性，但没有NT-3的一些已知的损害。本发明还证实了这些促效抗体在实验动物模型中治疗神经病的用途。在预防或治疗细胞退化中，比如神经细胞损伤，尤其是与周围神经病等神经退化性疾病相关的或是由于外伤、毒性剂、外科手术(暂提这些)等外界因素造成的神经细胞损伤，抗trkC促效单克隆抗体提供了优于NT-3的许多优点。
在一个方面，本发明涉及抗trkC的促效单克隆抗体，它
(a)和trkA或trkB没有显著的交叉反应；并且
(b)识别trkC第5域中的抗原表位。
本发明的某些促效抗体还能识别trkC第4域中的抗原表位。在优选的实施方案中，这些与人和啮齿类(比如大鼠或小鼠)trkC结合的抗体可以是鼠嵌合抗体(包括人源化的)或人抗体。这些抗体模拟天然trkC配体、NT-3的至少一种活性，因此可有效预防和/或治疗各种包括细胞退化在内的疾病，这些疾病包括(例如)神经病，比如顺氯氨铂或吡哆醇诱导的神经病，或是糖尿病性的神经病，以及(那里的细胞退化包括骨髓细胞的退化)血细胞机能不全的疾病，比如白细胞减少症，包括嗜酸性细胞减少症和/或嗜碱细胞减少症、淋巴细胞减少症、单核细胞减少症和中性白细胞减少症。在特别优选的实施例中，本发明的促效抗体显示了优于NT-3的特性，例如，当施用于患者时不会造成痛觉过敏，且与NT-3相比，它提高生物利用率和/或较高的比活。
在另一方面，本发明涉及一种含有以下CDR的抗trkC抗体重链：选自SEQIDNOs：1、2、3、4和5的CDR1；选自SEQ ID NOs：6、7、8、9、10和11的CDR2；以及选自SEQ ID NOs：12、13、14、15、16和17的CDR3。
再在另一方面，本发明涉及一种含有以下CDR的抗trkC抗体轻链：选自SEQ IDNOs：18、19、20、21、22、23和24的CDR1；选自SEQ ID NOs：25、26、27、28、29和30的CDR2；以及选自SEQ ID NOs：31、32、33、34、35和36的CDR3。
在进一步的方面，本发明涉及一种含有以下CDR的鼠抗trkC抗体重链：
(a)有式XaaWXaaXaaWVK(SEQ ID Mo：37)的CDR1，其中位置1上的Xaa是F或Y；位置3上的Xaa是I或M；位置4上的Xaa是E或H；
(b)有式EIXaaPXaaXaaXaaXaaTNYNEKFKXaa(SEQ ID Mo：38)的CDR2，其中位置3上的Xaa是L或Y；位置5上的Xaa是G或S；位置6上的Xaa是S或N；位置7上的Xaa是D或G；位置8上的Xaa是N或R；位置16上的Xaa是G或S；以及
(c)式有KNRNYYGNYVV(SEQ ID Mo：12)或KYYYGNSYRSWYFDV(SEQ ID Mo：13)的CDR3。
仍在进一步的方面，本发明涉及一种含有以下CDR的人抗trkC抗体重链：
(a)式有XaaXaaXaaYYWXaa(SEQ ID Mo：39)的CDR1，其中位置1上的Xaa是S或I；位置2上的Xaa是G或S；位置3上的Xaa是G、T或Y；位置7上的Xaa是S或N；
(b)有式XaaIXaaXaaSGSXaaTXaaNPSLKS(SEQ ID Mo：40)的CDR2，其中位置1上的Xaa是Y或R；位置3上的Xaa是Y或F；位置4上的Xaa是Y或T；位置8上的Xaa是S或R；位置10上的Xaa是N或Y；以及
(c)选自式有DRDYDSTGDYYSYYGMDV(SEQ ID Mo：14)；DGGYSNPFD(SEQ ID Mo：15)；ERIAAAGXaaDYYYNGLXaaV(SEQ ID Mo：41)的CDR3，其中位置8上的Xaa是A或T；位置16上的Xaa是D或A。
在另一方面，本发明涉及一种抗trkC促效单克隆抗体，其所含重链含有与轻链相连的如权利要求14所述的鼠抗trkC抗体重链的CDR。这种抗体优选是人或含有人框架残基，且优选与trkA和trkB没有显著的交叉反应。在使用过程中，抗体有最广泛的定义，并且特别包括抗体片段，比如Fv片段，Fab片段，Fab’或F(ab’)2片段。包括所有种类和同种型的抗体，但是IgG，尤其是IgG-2和IgG-4是优选的。
仍在另一方面，本发明涉及编码鼠或人抗trkC促效单克隆抗体重链或轻链或其片段的分离的核酸。在特定的实施例中，此核酸是2000年6月21日保藏于ATCC的核酸分子，编号为PTA-2133、PTA-2134、PTA-2135、PTA-2136、PTA-2137、PTA-2138、PTA-2139、PTA-2140、PTA-2141、PTA-2142和PTA-2143。
在进一步的方面，本发明涉及一种含有编码上述抗体重链和/或轻链的核酸分子的载体。本发明还涉及用这种核酸转化的细胞。本发明进一步涉及用这种核酸转化的杂交瘤细胞系以及用这种杂交瘤细胞产生的抗体。
仍在进一步的方面，本发明涉及一种与药学上可接受的载体混合的、含有效量的如上所述抗trkC促效单克隆抗体的药物组合物。
在另一方面，本发明涉及一种治疗与细胞退化有关的疾病或症状的方法，包括向哺乳动物施用有效量的如本文所述的抗trkC促效单克隆抗体。
仍在另一方面，本发明涉及一种治疗神经病或神经退化性疾病，或修补受损神经细胞的方法，包括向哺乳动物施用有效量的如本文所述的抗trkC促效单克隆抗体。神经病可以是，例如，周围神经病，包括(但不限于)糖尿病性的神经病和大纤维感觉神经病。神经退化性疾病可以是，例如，肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、亨特氏病。受损的神经元可以是周围的，比如感觉神经元(如背根神经节神经元)，运动神经元(比如来自脊索的神经元)，或是中央神经元，损伤可以是由于各种外部和内部因素造成的，包括外伤、暴露于神经毒素、代谢疾病、传染性因子等。
在进一步的方面，本发明涉及一种促进周围神经元的发育、增殖、维持或再生的方法，包括使此类神经元与有效量的本发明的一种抗体接触。
仍在进一步的方面，本发明涉及一种在哺乳动物受试者中治疗(包括预防)有关细胞退化的疾病或症状的方法，方法是在此类受试者的细胞中引入编码抗trkC抗体的核酸。这种方法(基因疗法)最好涉及对神经病或神经退化性疾病的治疗，或是修复损伤的神经细胞。由此，受体细胞最好是神经细胞。
再在另一方面，本发明涉及含有遗传物质(核酸)的传递载体，这种遗传物质能够编码适合基因疗法使用的抗trkC的抗体。
在另一方面，本发明涉及一种诱导血管生成的方法，它通过传递有效量的本发明的抗trkC的抗体以诱导血管生成。传递特别包括施用抗体并传递编码抗体的核酸(如，在基因疗法中)。
再在另一方面，本发明涉及一种独立的可编码选自SEQ ID No：58、SEQ ID No：59、SEQ ID No：60、SEQ ID No：61、SEQ ID No：62、SEQ ID No：63、SEQ ID No：64、SEQ ID No：65、SEQ ID No：66、SEQ ID No：67、SEQ ID No：68、SEQ ID No：69、SEQ ID No：70和SEQ ID No：71的鼠或人抗trkC促效抗体的重链或轻链的核酸分子。本发明还涉及由一种或多种独立的核酸分子编码的多肽。
在另一方面，本发明涉及一种用编码鼠或人抗trkC促效抗体的重链、轻链或这两条链的核酸转化的完整细胞。
附图简述
图1A-D显示了用KIRA(A和B)和PC12轴突生长物测定法(C和D)证实的各种人(A和C)和鼠(B和D)单克隆抗体抗trkC受体的促效活性。KIRA刺激缓冲液(F12/DMEM 50:50，含有2％的小牛血清白蛋白[BSA，Intergen公司，Purchase，纽约]和25mM Hepes，通过0.2μm的滤膜过滤)中，用单克隆抗体纯化的蛋白质A稀释至27μg/ml。然后在刺激培养基中以1:3的比例稀释单克隆抗体(共8种稀释物；浓度从0.01-180nM Nab)。然后用NT-3或Mab(在复制中测定的稀释物)刺激GD转染的CHO细胞(5×104细胞/孔)6小时，并按实施例的描述进行测定(图1A，人Mab；图1B，鼠Mab)。如实施例中所描述的，在PC12轴突生长物测定法中对纯化的Mab的促效活性进行测定。用全长的人trkC转染大鼠的PC12细胞，并以1000细胞/孔的密度接种细胞。转染三天后，以三倍的量在含有trkC转染子的孔中加入Mab(浓度为0.002-2.7nM)，并在37℃再温育3天。然后使用相差显微镜分析细胞，并对超过细胞直径两倍的带有轴突的细胞计数。
图2以6.1.2抗体作为代表性的例子，显示了抗trkC促效单克隆抗体与trkC特异性结合。
图3证明，抗trkC促效单克隆抗体比大志trkC更有效地识别人trkC。单克隆抗体与大鼠trkC结合的能力是用受体的免疫粘附素构建物确定的。将TrkC(人trkC-gD或大鼠trkC-IgG)在微量滴定平板(将100μl1μg/ml的溶液稀释在50mM碳酸盐缓冲液中，pH9.5)上固定过夜。洗涤并封闭平板。然后在含有0.5％BSA和0.05％Tween20的PBS中将Mab稀释至1μg/ml，将其加到合适的孔中(100μl/孔)，并在室温培养1小时。洗涤平板并加入合适的HRP共轭物(人Mab：羊抗人κ-HRP为1:5K；鼠Mab：羊抗moIgG(Fc)-HRP为1:5K)并在室温培养1小时。洗涤、显影并阅读平板。
图4显示了用竞争性ELISA进行抗原表位作图的代表性实例。在含有或不含有过量的各种未标记的抗trkC单克隆抗体的情况下，将生物素化的人抗trkC 6.1.2单克隆抗体和固定的trkC一起培养。
图5总结了用竞争性ELISA进行抗原表位作图的结果。
图6A-C显示了各种trkC嵌合体的示意图(A)，以及它们用于对被各种促效的人(B)或鼠(C)的抗trkC单克隆抗体识别的trkC上的抗原表位进行作图。
图7显示了人trkC第4域和第5域的氨基酸序列，标出了用作诱变的残基，以解释它们在被抗trkC促效单克隆抗体识别中的作用。
图8显示了与抗trkC单克隆抗体形成的复合物中trkC的三维剖面图。特别显示在被抗trkC抗体的CDR识别中可能起重要作用的trkC的氨基酸残基。
图9显示了鼠和人抗trkC的促效单克隆抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列。此外，以黑体突出显示了三个CDR区域(CDR1、CDR2和CDR3)。2250和2253重链的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No：1。2256重链的CDR1的氨基酸序列是SEQ IDNo：2。6.1.2和2345重链的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No：3。6.4.1重链的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No：4。2349重链的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No：5。2250和2253重链的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No：6。2256重链的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No：7。6.1.2重链的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No：8。6.4.1重链的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No：9。2345重链的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No：10。2349重链的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No：11。2250和2253重链的CDR3的氨基酸序列是SEQI D No：12。2256重链的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No：13。6.1.2重链的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No：14。6.4.1重链的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No：15。2345重链的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No：16。2349重链的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No：17。
图10显示了鼠和人抗trkC的促效单克隆抗体r轻链可变区(VL)的氨基酸序列。此外，以黑体突出显示了三个CDR区域(CDR1、CDR2和CDR3)。2250轻链的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No：18。2253轻链的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No：19。2256轻链的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No：20。6.1.2轻链的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No：21。6.4.1轻链的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No：22。2345轻链的CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No：23。2349轻链的CDR1的氨基酸序列是SEQID No：24。2250轻链的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No：25。2253轻链的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No：26。2256轻链的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No：27。6.1.2轻链的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No：28。6.4.1轻链的CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No：29。2345和2349轻链的CDR2的氨基酸序列是SEQID No：30。2250轻链的CDR3的氨基酸序列是SEQID No：31。2253轻链的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No：32。2256轻链的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No：33。6.1.2轻链的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No：34。6.4.1轻链的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No：35。2345和2349轻链的CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No：36。
图11显示了鼠和人抗trkC促效单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列。还基于与数据库中得到的CDR序列的同源性，显示了这些序列所述的家族。
图12显示了抗trkC促效单克隆抗体在体内有改进的半衰期和生物利用率。
图13显示了抗trkC促效单克隆抗体对顺氯氨铂诱导的神经病的功效。
图14显示了由吡哆醇神经病导致的标记表达的减少。
图15显示了抗trkC促效单克隆抗体对低剂量的吡哆醇作用的改善。
图16显示了抗trkC促效单克隆抗体对高剂量的吡哆醇作用的改善。
图17显示了抗trkC促效单克隆抗体对吡哆醇神经病的改善。
图18显示了抗trkC促效单克隆抗体对吡哆醇诱导的梯状物缺乏的改善。
图19显示了NT3，但不是抗trkC促效单克隆抗体，在治疗剂量造成的痛觉过敏。
图20显示了人trkC受体(SEQ ID No：56)的氨基酸序列，其中指出了第4域和第5域的分界线。
图21(在第二页)显示了人trkC受体(SEQ ID No：57)的核苷酸序列。
图22显示了抗trkC的促效单克隆抗体2250的重链(A；SEQ ID No：58)和轻链(B；SEQ ID No：59)的核苷酸序列。
图23显示了抗trkC的促效单克隆抗体2253的重链(A；SEQ ID No：60)和轻链(B；SEQ ID No：61)的核苷酸序列。
图24显示了抗trkC的促效单克隆抗体2256的重链(A；SEQ ID No：62)和轻链(B；SEQ ID No：63)的核苷酸序列。
图25显示了抗trkC的促效单克隆抗体2345的重链(A；SEQ ID No：64)和轻链(B；SEQ ID No：65)的核苷酸序列。
图26显示了抗trkC的促效单克隆抗体2349的重链(A；SEQ ID No：66)和轻链(B；SEQ ID No：67)的核苷酸序列。
图27显示了抗trkC的促效单克隆抗体6.1.2的重链(A；SEQ ID No：68)和轻链(B；SEQ ID No：69)的核苷酸序列。
图28显示了抗trkC的促效单克隆抗体6.4.1的重链(A；SEQ ID No：70)和轻链(B；SEQ ID No：71)的核苷酸序列。
优选实施例的详细描述
A.定义
术语“神经营养蛋白”及其语法上的变体可以互相交换使用，它是指包含神经生长因子(NGF)以及依次相关的同系物的多肽家族。NGF、脑衍生的生长因子(BDNF，也叫做NT-2)、神经营养蛋白3(NT-3)、神经营养蛋白4和5(NT-4/5)、神经营养蛋白6(NT-6)和神经营养蛋白7(NT-7)迄今已被鉴定为这一家族的成员。
术语“神经营养蛋白”包括任何(人或非人)动物种类的天然的神经营养蛋白，以及它们的功能性的衍生物，无论是从天然来源通过重组DNA技术的方法、或化学合成、或这些方法的组合，或任何其它的方法制备的。“天然的”或“天然序列”神经营养蛋白含有在任何人或非人的动物种类中天然存在的神经营养蛋白的氨基酸序列，包括天然存在的截短的或变体形式，以及天然存在的等位变体。
术语“trk”、“trk多肽”、“trk受体”以及其语法上的变体可以互相交换使用，它们是指受体酪氨酸激酶亚科的多肽，它们能够结合至少一种天然的神经营养蛋白。目前鉴定的这一家族的成员是trkA(p140trkA)、trkB和trkC。
表达“胞外域”或“ECD”用在这里是指任何享有天然存在的受体的胞外域的配体结合功能的多肽序列。胞外域的配体结合功能是指多肽与配体结合的能力。由于已发现较小的片段对于配体结合是足够的，因此不必要包括完整的胞外域。截短的胞外域通常是可溶的。ECD一词包含的多肽序列中，成熟受体的疏水跨膜序列(任选是跨膜域的C末端和/或N末端的1-20个氨基酸)已被删除。
“抗trkC促效抗体”一词是指一种抗体，它能结合并激活天然序列trkC受体和/或由trkC信号功能介导的下游途径，因此能够模拟受体天然配体(尤其是NT-3)的生物学活性。例如，促效抗体可以结合trkC受体的ECD域并因此导致受体的二聚化，其结果是活化了细胞内的催化激酶区域。因此，这可能会刺激在体外和/或体内表达受体的细胞的生长和/或分化。本发明的促效抗体最好能够识别包括人trkC受体的第5域(从约第266个氨基酸至约381个氨基酸)和/或第4域(从约第178个氨基酸至约265个氨基酸)的至少部分在内的抗原表位，或是非人(如鼠)trkC受体上的相应的抗原表位。
当与本发明的抗trkC促效抗体联合使用时，“生物学活性”通常是指有和trkC的天然配体NT-3一样的效应子功能。效应子功能最好是能够结合并活化trkC受体酪氨酸激酶和/或有trkC信号功能介导的下游途径。没有任何限制，优选的生物学活性包括促进损伤细胞，尤其是体外或体内的神经元，包括周围(交感、副交感、感觉和肠)神经元、运动神经元和中央(脑和脊索)神经元，以及非神经元细胞(如外周血淋巴细胞)的发育、增殖、维持和/或再生的能力。尤其优选的生物学活性是治疗(包括预防)神经病，例如周围神经病或其它神经退化性疾病、或修复损伤的神经细胞的能力。损害的神经元可以是感觉神经元、交感神经元、副交感神经元或肠神经元(如背跟神经节神经元)，运动神经元，以及中央神经元(如来自脊索的神经元)，损伤可由任何原因造成，包括外伤、毒性剂、外科手术、中风、缺血、感染、代谢疾病、营养缺乏和各种恶性肿瘤。另一种特定的生物学活性是诱导血管生成的能力。
当用在这里时，“治疗”是指为获得有益或所需临床结果的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括(但不限于)减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。“治疗”也可以指与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。“治疗”是以防治疾病发展或改变疾病的病状为目的进行的干涉。由此，“治疗”是指治疗性的手段和预防性或防御性的措施。需要治疗的目标包括那些已经患病以及那些需要预防疾病的目标。特别地，治疗可以是直接的预防、减慢或减少损伤的细胞退化的病状，比如神经细胞的病状，也可以用其它治疗剂使细胞(如神经元)对治疗更敏感。在一个优选的实施例中，治疗减少或减慢了靶神经元功能的衰退并/或刺激靶神经元功能的恢复。
(慢性)神经退化性疾病或急性神经系统损伤的“病状”包括所有影响患者保持良好状态的现象，包括(但不限于)神经元机能失常、退化、损伤和/或死亡。
“神经退化性疾病”和“神经退化性障碍”以最广泛的含义使用，包括所有障碍与神经退化和/或机能失常有关的病状，包括(但不限于)周围神经病；运动神经元障碍，比如肌萎缩性侧索硬化症(ALS，Lou Gehrig氏病)、面神经麻痹、以及各种与脊髓肌萎缩或麻痹有关的症状；以及其它人神经退化疾病，比如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、癫痫、多发性硬化、亨延顿舞蹈症、唐氏综合症、神经性耳聋和梅尼埃尔氏病。
“周围神经病”是一种影响周围神经的神经退化性障碍，经常以运动神经、感觉运动神经或自主神经功能失调的一种或组合的形式出现。周围神经病可以是，例如，通过遗传获得的，由系统性疾病引起的，或是有毒性剂(比如神经毒性药物，如抗肿瘤药物或是工业或环境污染)引起的。“周围感觉神经病”以周围感觉神经元的退化为特征，它可以是自发性的，可能是作为(例如)糖尿病(糖尿病性神经病)、癌症中抑制细胞的药物治疗(如用化学治疗剂，如长春新碱、顺氯氨铂、氨甲蝶呤、3’-叠氮-3’-脱氧胸腺嘧啶，或紫杉烷，如紫杉醇[
Figure C01814421D0018101408QIETU
，Bristol-Myers SquibbOncology，普林斯顿，新泽西州]和多烯紫杉醇[
Figure C01814421D0018101430QIETU
，-Poulenc Rorer，安东尼市，法国])、酒精中毒、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)或遗传型素质的后果发生。遗传获得性的周围神经病包括(例如)雷弗素姆氏病、克拉伯氏病、异染性脑白质营养不良、法布莱氏病、德雅兰-素塔斯综合征、无β脂蛋白血症以及沙-马-图(CMT)病(也被称为腓侧肌萎缩)或遗传性运动感觉神经病(HMSN))。大多数类型的周围神经病发展缓慢，时间超过几个月或几年。在临床实践中，此类神经病被称为是慢性的。有时一种神经病发展迅速，时间超过几天，这被称为是急性的。周围神经病通常一起影响感觉和运动神经，以致造成混合性的感觉和运动神经病，但已知也有单纯的感觉神经病和单纯的运动神经病。
在本发明的内容中使用的“毒性剂”一词是指一种物质，它通过其化学作用，损害、削弱或抑制神经系统的组分的活性。毒性剂(也被称为“神经毒剂”)的名单包括(但不限于)化学治疗剂(比如上面所列出的那些)、酒精、金属、工业毒素、食品和药物的污染等。
出于治疗的目的，“哺乳动物”是指归类于哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农畜、以及动物园的动物、运动动物或宠物，比如狗类、马类、羊类、猫类、牛类等。优选的哺乳动物是人。
“trkC免疫粘附素”一词可以和“trkC免疫球蛋白嵌合体”交换使用，它是指trkC的一部分(通常是其胞外域)与免疫球蛋白序列结合形成的嵌合分子。免疫球蛋白序列最好是(但这不是必需的)免疫球蛋白的恒定区。这一领域中已知结合到合适的免疫球蛋白恒定区序列(免疫粘附素)的由受体序列构建的嵌合体。在文献中报道的免疫粘附素包括T细胞受体*的融合(Gascoigne等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：2936-2940[1987])；CD4*的融合(Capon等，Nature337：525-531[1989]；Traunecker等，Nature，339：68-70[1989]；Zettmeissl等，DNA Cell Biol.9：347-353[1990]；Bym等，Nature，344：667-670[1990])；L-选择蛋白(归巢受体)的融合(Watson等，J.Cell.Biol.，110：2221-2229[1990]；Watson等，Nature，349：164-167[1991])；CD44*的融合(Aruffo等，Cell，61：1303-1313[1990])；CD28*和B7*的融合(Linsl ey等，J.Exp.Med.，173：721-730[1991])；CTLA-4*的融合(Lisley等，J.Exp.Med.174：561-569[1991])；CD22*的融合(Stamenkovic等，Cell，66：1133-11144[1991])；TNF受体的融合(Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：10535-10539[1991]；Lesslauer等，Eur.J.Immunol.，27：2883-2886[1991]；Peppel等，J.Exp.Med.，174：1483-1489[1991])；NP受体的融合(Bennett等，J.Biol.Chem.266：23060-23067[1991])；以及IGE受体α*的融合(Ridgway等，J.Cell.Biol.，115：摘要1448[1991])，其中，星号(*)表示受体是免疫球蛋白亚科的成员。
本发明的上下文中，“独立的”核酸或多肽是从动物源或人源中存在的杂质核酸或多肽中鉴别并分离的核酸或多肽。出于诊断或探测目的，可以用下面的有关诊断测定的讨论中描述并定义的标记来标记核酸或多肽。
通常，术语“氨基酸序列变体”是指与参考(如天然序列)多肽相比，在它们的氨基酸序列中有一些不同的分子。氨基酸改变可以是在天然的氨基酸序列中进行取代、插入、缺失或是任何所需的此类变化的结合。
术语“DNA序列编码”、“DNA编码”和“核酸编码”是指沿着一条脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷的顺序决定了沿着多肽链的氨基酸的顺序。因此，DNA的顺序编码氨基酸的顺序。
术语“可复制的表达载体”和“表达载体”是指一条DNA，通常是双链的，可以在它当中插入一条外源DNA。外源DNA被定义为异源DNA，它是在宿主细胞中没有自然发现的DNA。载体被用来将外源或异源DNA转移到合适的宿主细胞。一旦在宿主细胞中，载体可以不依赖宿主染色体DNA复制，并且可以产生载体和其插入(外源)DNA的几份拷贝。此外，载体含有必要的元件以使其能够将外源DNA翻译到多肽中。因此，由外源DNA编码的许多多肽的分子可以迅速合成。
“调控序列”一词是指在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适合原核生物的调控序列(例如)包括启动子、任选的操纵基因序列、核糖体结合位点，其它还了解不多的序列。已知真核细胞可以利用启动子、多腺苷化信号以及增强子。
当核酸与另一种核酸序列有功能关系时，这种核酸是“可操作地连接”的。例如，如果前序列或分泌前导区的DNA作为参与多肽分泌的前蛋白表达，则可操作地连接到多肽的DNA上；如果启动子或增强子影响序列的转录，则可操作地连接到编码序列上；或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，则可操作地连接到编码序列上。通常，“可操作地连接”意味着被结合的DNA序列是邻接的，并且，就分泌前导区而论，则是邻接的并且在阅读阶段。但是增强子没有要邻接的。连接是通过在合适的限制位点上连接完成的。如果不存在此类位点，则需根据常规的实践使用合成的寡核苷酸接头或接头。
在本发明的上下文中，“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以交换使用，所有的此类名称都包括后代。因此，“转化体”和“转化的(宿主)细胞”包括原代受试细胞和由它们衍生的培养物，而不必考虑转移的数量。还可以理解为，由于故意的或非故意的突变，所以所有后代的DNA含量不是正好相同的。被筛选出的与原始的转化细胞有同样功能或生物活性的突变型后代也包括在内。这里使用了不同的名称，从上下文将会清楚。
本文定义了“外源”元件，它指对细胞而言是外来的核酸序列，或者与细胞是同源的，但位于通常未发现这一元件的宿主细胞的核酸内。
“抗体”(Abs)和“免疫球蛋白”(Igs)是有相同结构特征的糖蛋白。当抗体对特定抗原显示结合特异性时，免疫球蛋白包括抗体和其它缺乏抗原特异性的抗体样分子。后一类的多肽是(例如)在低水平通过淋巴系统以及在增加的水平通过骨髓瘤产生的。
“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，它由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，不同的免疫球蛋白同种型的重链中二硫键的数目是不同的。每条重链和轻链还含有规则地分隔的链内二硫键。每条重链的一端是可变区(VH)，随后是若干恒定区。每条轻链的一端是可变区(VL)，另一端是恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区成一直线，轻链的可变区与重链的可变区成一直线。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链的可变区之间形成界面。
术语“可变”是指可变区的某些部分在抗体中的序列是高度不同的，并且被用在各个特定的抗体对其特定的抗原的结合和特异性中。然而，可变性甚至并没有完全分布在抗体的可变区中。它集中在轻链和重链可变区中三个被称为高变区的片段上。可变区的较高度保守的部分被称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区分别含有四个FR(分别为FR1、FR2、FR3和FR4)，大多数采用由三个高变区连接的片层构型，这形成了环连接，有时还形成部分片层结构。各条链的高变区被FR紧靠在一起，并且和其它链的高变区一起，有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，Public HealthService，美国国立卫生研究院，贝塞斯达、马里兰州(1991)，第647-669页)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但有各种效应物的功能，比如参与抗体依赖性细胞毒性中的抗体。
本文使用的术语，“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补性决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变区中的残基24-34{L1}、50-56{L2}、89-97{L3}以及重链可变区中的残基31-35{H1}、50-65{H2}、95-102{H3}；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，Public Health Service，美国国立卫生研究院，贝塞斯达、马里兰州(1991))和/或那些来自“高变环”的残基(即轻链可变区中的残基26-32{L1}、50-52{L2}、91-96{L3}以及重链可变区中的残基26-32{H1}、53-55{H2}、96-101{H3}；Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“构架”或“FR”残基是除了这里定义的高变区残基以外的那些可变区残基。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段都只有单一抗原结合位点，和一个残余的“Fc”片段，它们的名字代表了容易结晶的能力。木瓜蛋白酶处理产生有两个抗原结合位点并能交联抗原的F(ab’)2片段。
“Fv”是最小的抗体片段，它含有完整的抗原识别和结合位点。这一区域含有紧密但非共价结合的一条重链和一条轻链的可变区的二聚体组成。这一构型中，各个可变区的三个高变区相互作用，以确定在VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。总的来说，六个高变区赋与抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(或Fv的一半，仅仅含有三个对抗原特异的高变区)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力低于完整的结合位点。
Fab片段还含有轻链的恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。Fab’片段不同于Fab片段，它在重链CH1区域的羧基末端加入几个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab’-SH在这里是指恒定区的半胱氨酸残基上带有一个游离巯基的Fab’。F(ab’)2抗体片段最初是与Fab’片段配对产生的，在它们之间含有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它的化学偶联也是已知的。
来自任何脊椎动物的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”根据它们恒定区的氨基酸序列可以被分成一类或两类清楚可辨的类型，叫做κ()和λ()。
根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分成不同的类型。有五种主要的免疫球蛋白类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中的一些可以被进一步分成子类(同种型)，比如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类型的免疫球蛋白相对应的重链恒定区分别被称为、、、、和，不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。
术语“抗体”在这里以最广泛的含义使用，且特别地包括人、非人(比如鼠)和人源化单克隆抗体(包括全长的单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(如，双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们有所需的生物学活性即可。
“抗体片段”包括全长抗体的一部分，通常是抗原结合部分或其可变区。抗原片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双特异抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
本文用的术语“单克隆抗体”指从基本上同源抗体的群体中得到的抗体，即除了可以小量存在的天然存在的突变，包含群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异的，针对单一的抗原位点。此外，与常规(多克隆)抗体制剂相反，它通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体，美国单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。修饰剂“单克隆”表明了从抗体的同源群体中获得的抗体的特性，且不能理解为需要用任何特定的方法产生抗体。例如，Kohler等，Nature 256：495(1975)，首先描述了采用杂交瘤方法或采用重组DNA方法(见，例如，美国专利4,816,567号)制备了用于本发明的单克隆抗体。例如，采用Clackson等，Nature 352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)描述的方法也可以从噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。
这里的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链部分与抗体中的相应序列相同或同源，这些抗体衍生自特定的中或属于特定的抗体类或亚类，剩余的链与抗体中的相应序列相同或同源，这些抗体衍生自另一个种或属于另一个抗体类或亚类，以及这类抗体的片段，只要它们显示所需的生物活性(美国专利4,86,567号；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
“人源化”形式的非人(如鼠)抗体是嵌合抗体，它含有衍生自非人免疫球蛋白的极小序列。人源化抗体多半是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区残基被非人种(供体受体)，如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(具有所需的特异性、亲和性和能力)的高变区残基所替代。在有些情况下，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基被相应的非人残基所替代。此外，人源化抗体可包括在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。所作的这些修饰进一步改进了抗体的性能。总的来说，人源化抗体基本上包括至少一种，和通常两种可变区，其中所有的或基本上所有的高变区与非人免疫球蛋白序列的高变区相符号，所有的或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的RF。人源化抗体还任选地包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的一部分。进一步的详述参见Jones等，Nature 351：522-525(1986)；Reichmann等，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包括抗体的VH和VL区，其中这些区存在于单一多肽链中。通常，Fv多肽进一步包括VH和VL区之间的多肽接头，它使得sFv能够形成所需的结构用于抗原结合。有关sFv的综述，抗原参见Pluckthun在ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994)。
术语“双特异抗体”是指有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包含一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)结合在同一个多肽链(VH-VL)上。通过使用一个过短而不能在同一链上的两个区域间进行配对的接头，这些区域不得不与另一链的互补区域配对，从而产生了两个抗原结合位点。双特异抗体被更加具体的描述在，例如，欧洲专利404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6449(1993)。
当用在本申请时，“线性抗体”这种表达是指在Zapata等在ProteinEng.8(10)：1057-1062(1995)中所描述的抗体。简单地说，这些抗体包括一对串联的Fd片段(VH-CH1-H-CH1)，它形成了一对抗原结合区域。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
术语“抗原表位”被用来指(单克隆或多克隆)抗体在蛋白质抗原上的结合位点。
抗原结合到天然序列人trkC的氨基酸序列内第5域和/或第4域，或结合到天然序列非人trkC受体中等价的抗原表位上，被称为“抗原表位作图”。在这一领域中已知有很多方法用来作图并表征抗原表位在蛋白质上的位置，包括溶解抗体-抗原复合体的晶体结构，竞争性测定，基因片段表达测定，以及以合成肽为基础的测定，这些方法被描述在(例如)Harlow and Lane，Using Antibodies，a LaboratoryManual的第11章中，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州，1999。竞争性ELISA特别描述在实施例1中。根据基因片段表达测定，编码蛋白质的开放阅读框被随意切割或被特定的遗传结构切割，同时确定了表达的蛋白质片段与要测试的抗体的反应性。基因片段可以(例如)通过PCR产生，然后在体外在放射性氨基酸存在下将其转录并翻译到蛋白质中。然后通过免疫沉淀和凝胶电泳确定抗体与放射性标记的蛋白质片段的结合。使用出现在噬菌体颗粒(噬菌体文库)表面上的随机肽序列的大型文库还可以鉴别某些抗原表位。或者，可以测试确定的重叠肽片段的文库以便在简单的结合测定中与测试抗体结合。后面一种方法适用于确定约5-15个氨基酸的线性抗原表位。
当两个抗体识别一样的或空间上重叠的抗原表位时，抗体结合“基本上一样的抗原表位”作为参考抗体。最广泛使用且快速确定两个抗原表位是否与一样的或空间上重叠的抗原表位结合的方法是竞争性测定，采用标记的抗原或标记的抗体，这种方法适用于所有不同的形式。通常，抗体被固定在96孔的平板上，用放射性标记或酶标记测定未被标记的抗体阻断标记的抗体结合的能力。竞争性ELISA在实施例1中描述。
本文使用的术语：氨基酸或氨基酸残基是指如下面所描述的天然存在的L氨基酸或D氨基酸以及它们相应的变体。这里使用了常用的一个或三个字母的缩写来代表氨基酸(Bruce Alberts等，Molucular Biology of the Cell，GarlandPublishing公司，纽约州(第三版，1994)。
杂交最好是在“严格条件”下进行，是指(1)采用低离子强度和高的洗涤温度，例如，0.015氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，温度为50C，或(2)在杂交过程中使用变性剂，比如甲酰胺，例如，用50％(体积/体积)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH6.5，以及750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠，温度为42C。另一实施例使用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6/8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhard溶液、超声处理的鲑鱼精子DNA(50g/ml)、0.1％SDS和10％的硫酸葡聚糖，温度为42C，在42C用0.2×SSC和0.1％SDS洗涤。
B.实施本发明的方法
本发明涉及人和非人的促效单克隆抗体(包括后者的人源化形式)，它模拟trkC受体的天然配体NT-3的某些生物学性质。生产鼠和人抗trkC抗体的常规技术在这一领域中是熟知的并将在下面描述。此外，更详细的，在实施例1中提供了对促效抗体的选择。
1.抗体制备
(i)多克隆抗体
制备多克隆抗体的方法在这一领域中是已知的。可以在哺乳动物中(例如)通过一次或多次注射免疫剂和(如果需要的话)佐剂来产生多克隆抗体。通常，免疫剂和/或佐剂将通过多次皮下和腹膜内注射注射到哺乳动物中。可用于使免疫剂与已知在被免疫的哺乳动物中能够产生免疫的蛋白质偶联，此类蛋白质有血清白蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。可使用的佐剂的例子包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM。
(ii)单克隆抗体
可以使用Kohler等，Nature，256：495(1975)首次描述的使用杂交瘤法制备单克隆抗体，或使用重组DNA法(美国专利4,816,567号)制备。
在杂交瘤法中，小鼠或其它合适的宿主动物，比如仓鼠或猕猴，按上述方法免疫以诱出淋巴细胞，这些淋巴细胞产生或能够产生与用于免疫的蛋白质特异性结合的抗体。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。用合适的融合剂，比如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，从而产生杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，第59-103页，[学术出版社，1986])。
将制备的杂交瘤细胞接种到最好含有一种或多种能够抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质的合适的培养基上并使其生长。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，供杂交瘤使用的培养基通常含有次黄嘌呤、氨蝶呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)，在避免HGPRT缺陷细胞生长的条件下。
优选的骨髓瘤细胞是那些有效融合，支持由选择的抗体生产细胞稳定的高水平产生抗体，并且对HAT培养基之类的培养基敏感的细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，比如那些衍生自MOP-21和M.C.-11小鼠肿瘤的细胞系(来自索尔克研究院细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center)，圣地亚哥，美国加利福尼亚州)和SP-2或X63-Ag8-653细胞(来自美国模式培养物保藏所，罗克维尔，美国马里兰州)的细胞系。人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系也被叙述用来生产人单克隆抗体(Kozhor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页，Marcel Dekker公司，纽约州，[1987])。
对生长有杂交瘤细胞的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产量进行测定。优选用免疫沉淀法或通过体外结合测定，比如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)确定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
可以通过(例如)Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)的斯卡查德分析来确定单克隆抗体的结合亲和性。
在鉴定出能够产生所需特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过限制性稀释步骤将这些细胞亚克隆并用标准的方法使其生长(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103页(学术出版社，1986))。用于这一目的的合适培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞也可以在体内生长，正如动物中的腹水瘤一样。
用常规的免疫球蛋白纯化方法，比如(例如)蛋白质A-琼脂糖、羟磷灰石层析法、凝胶电泳、透析或亲和层析法，将亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水液或血清中合适地分离出来。
编码单克隆抗体的DNA容易被分离，并用常规的方法(比如，使用能够与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)测序。杂交瘤细胞是这种DNA的优选来源。一旦分离，就可以将DNA放入表达载体中，然后将表达载体转染入大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞之类不会产生免疫球蛋白的宿主细胞中，以在重组的宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。DNA也可以被修饰，例如，用编码序列取代人的重链和轻链恒定区代替同源的鼠类序列，Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.81，6851(1984)，或在免疫球蛋白的编码序列中共价地加入非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列。用那种方法，就制得了具有抗trkC单克隆抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂交”抗体。
通常用此类非免疫球蛋白多肽取代本发明抗体的恒定区，或用它们取代本发明抗体的一个抗原结合位点的可变区以产生含有一个对trk受体有特异性的抗原结合位点和另一个对不同抗原有特异性的抗原结合位点的嵌合二价抗体。
还可以采用在合成蛋白质化学中已知的方法，包括那些与交联剂有关的方法，在体内制备嵌合或杂交抗体。例如，可以通过二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的合适的试剂包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基丁酰亚胺酸盐。
下面将更加详细的描述抗体的重组生产。
(iii)人源化抗体
通常，人源化抗体中有一个或多个非人源的氨基酸残基被引入。这些非人的氨基酸残基通常被称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。可以按照Winter和同事的方法[Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988)]，通过用啮齿动物的CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列，从而实质性地进行人源化。
由此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(Cabilly，同上)，其中比完整的人可变区少得多的序列被非人源的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CRD残基以及可能的话，一些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
重要的是，抗体被人源化后保持有对抗原的高度亲和力和其它良好的生物学性质。为达到这个目的，根据优选的方法，人源化抗体是用亲本和人源化序列的三维模型，通过测定亲本序列和各种概念上的人源化产物的方法制备的。三维免疫球蛋白模型一般是存在的，且它们对于这一领域中的技术人员是熟悉的。图示并显示经过选择的候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序是可以获得的。，对这些图示的检查使得能够分析残基在候选的免疫球蛋白序列的功能中所起的可能的作用，即分析残基对候选免疫球蛋白与其抗原结合能力的影响。用这种方法，可从共有序列和输入序列中选择并结合FR残基，从而获得所需的抗体特性，比如提高了对靶抗原的亲和力。通常，CDR残基直接并最主要的参与影响抗原结合。为了解进一步的细节可以参阅提交于192年8月21日的美国专利申请07/934,373号，这是提交于1991年6月14日的第07/715,272号申请的部分继续申请。
(iv)人抗体
可以用杂交瘤法制造人单克隆抗体。用来生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤已经被描述，例如，Kozbor，J.Immunol.133.3001(1984)和Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker公司，纽约州，1987)。
现在有可能生产能够(在免疫作用后)在没有内源免疫球蛋白产生的情况下产生具有人抗体所有组成成分的转基因动物(如小鼠)。例如，已描述在嵌合小鼠和种系突变的小鼠中抗体重链连接区(JH)的纯合缺失会导致内源抗体生产的完全抑制。在这种种系突变的小鼠中转移种系的免疫球蛋白基因阵列导致在抗原攻击后产生人抗体。参见(例如)Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，2551-255(1993)；Jakobovits等，Nature 362，255-258(1993)。
Mendez等(Nature Genetics 15：146-156[1997])进一步改进了这一技术并制得一系列被称为“Xenomouse II”的转基因小鼠，当和抗原攻击时，产生高亲和力的完整的人抗体。这是通过将兆碱基的人重链和轻链基因座的种系整合到如上所述的缺失内源JH片段的小鼠中获得的。Xenomouse II拥有1,020kb的含有大约66个VH基因，完整的DH和JH区域以及三个不同的恒定区(μ、δ和χ)的人重链基因座，并拥有800kb的含有32Vκ基因、Jκ片段和Cκ基因的人κ基因座。在这些小鼠中产生的抗体与在人中看到的抗体在所有方面都非常类似，这些方面包括基因重排、组装和所有组成成分。人抗体最好以内源抗体的形式表达，因为JH片段的缺失阻止了在鼠基因座中的基因重排。
或者，可以用噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature 348，552-553[1990])，用来自未免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)区基因的所有组成成分在体外产生人抗体和抗体片段。根据这种技术，抗体V区基因框内被克隆入丝状细菌噬菌体(比如M13或fd)的大或小包被蛋白质基因中，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体功能特性的选择还导致了对编码有这些特性的抗体的基因的选择。因此，这种噬菌体模拟B细胞的一些特性。可以用各种形式进行噬菌体展示，有关综述可以参阅，例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3，564-571(1993)。V基因片段的几种来源都可以供噬菌体展示使用。Clackson等，Nature 352，624-628(1991)从衍生自被免疫的小鼠的脾细胞的V基因的小随机组合文库中分离了不同阵列的抗噁唑酮抗体。可以构建来自未免疫的人供体的V基因的各种组成成分，并且可以按照Marks等，J.Mol.Biol.222，581-598(1991)或Griffith等，EMBO J.12，725-734(1993)叙述的技术来分离不同阵列的抗原(包括自身抗原)的抗体。在天然免疫反应中，抗体基因以高速率累积突变(体细胞高变)。一些引入的变化将赋予较高的亲和力，有高亲和表面免疫球蛋白的B细胞在随后的抗原共和攻击中优先被复制和分化。可以用被称为“链改组”的技术来模拟这种天然的过程(Marks等，Bio/Technol.10，779-783[1992])。这一方法中，通过用来自未免疫供体得到的V区基因的天然存在的变体(各种组成成分)的各种组成成分连续取代重链和轻链V区基因，可以改进由噬菌体展示获得的“原代”人抗体的亲和力。这种技术允许用nM范围内的亲和力来产生抗体和抗体片段。Waterhouse等，Nucl.Acids Res.21，2265-2266(1993)描述了制造非常大的噬菌体抗体各种组成成分(也被称为“整个母文库(the mother-of-all libraries)”)的方法，Griffith等，EMBO J.(1994)(印刷中)报道了直接从这种大型噬菌体文库中分离高亲和力的人抗体的方法。基因改组也可以用来从啮齿动物抗体中衍生出人抗体，这里的人抗体与开始的啮齿动物抗体有类似的亲和性和特异性。根据这种方法(也被称为“抗原表位印记”)，通过噬菌体展示技术获得的啮齿动物抗体的重链或轻链V区基因被人V区基因的各种组成成分替代，从而产生了啮齿动物-人嵌合体。对抗原的选择导致了能够恢复功能性抗原结合位点，即控制(印记)选择合作者的抗原表位的人变量的分离。当这一过程被重复以替代剩下的啮齿动物V区时，就获得了人抗体(参见PCT专利申请WO 93/06213号，公布于1993年4月1日)。不像通过CDR移植进行传统的人源化啮齿动物抗体，这种技术提供了完整的人抗体，它没有啮齿动物源的构架或CDR残基。
(v)双特异性抗体
双特异性抗体是单克隆，优选是人的或人源化的抗体，它至少对两种不同的抗原有结合特异性。在这里，一种结合特异性是对trkC受体的以提供促效抗体，另一种是对任何其它抗原的，优选是另一种受体或受体亚基。例如，双特异性抗体特异性结合trkC受体和神经营养蛋白，或是trkC受体和另一种本发明范围内的trk受体。
制备双特异性抗体的方法在这一领域中是已知的。通常，双特异性抗体的重组生产基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，这里的两条重链有不同的特异性(Millstein和Cuello，Nature 305，537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(quadromas)产生了10中不同抗体分子的混合物，其中只有一种有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常是通过亲和层析步骤完成的，这种方法颇烦琐且产物的产量低。类似的步骤公开在PCT申请公开WO93/08829号中(公布于1993年5月13日)和Traunecker等，EMBO 10，3655-3659(1991)。
根据一个不同且更加好的方法，有所需结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)被融合到免疫球蛋白恒定区序列上。最好是和含有至少部分铰链区、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区融合。在至少一个融合体中存在含有轻链结合所必需的位点的第一个重链恒定区(CH1)较好。编码免疫球蛋白重链配合体的DNA，如果需要的话，免疫球蛋白轻链被插入独立表达的载体并共转染入合适的宿主生物中。当用于构建比例不等的三种多肽链提供了最佳产量时，这为调节实施例中的三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，当至少两种多肽链以等比例表达导致高产量，或当这些比例不是特别重要时，也可以在一种表达载体中插入两种或三种多肽链的编码序列。在这一方法优选的实施例中，双特异性抗体由一条臂上具有第一种结合特异性的杂种免疫球蛋白重链组成，在另一条臂上有杂种免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二种结合特异性)。人们发现，这种不对称结构有利于从不想要的免疫球蛋白链组合物中分离所需的双特异性化合物，这是由于免疫球蛋白轻链仅在双特异性分子的一半存在提供了简单的分离途径。这一方法叙述在公布于1994年3月3日的PCT公开第WO 94/04690号中。
为进一步了解制备双特异性抗体的方法，可以参阅，例如，Suresh等，Methods in Enzymology 121，210(1986)。
(vi)异共轭(heterocon jugate)抗体
异共轭抗体也包括在本发明的范围内。异共轭抗体由两个共价结合的抗体组成。此类抗体(例如)试图将免疫系统的细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980号)以及治疗HIV感染(PCT申请公布第WO 91/00360和WO 92/200373号；欧洲专利03089号)。可以用任何方便的交联法制备异共轭抗体。合适的交联法在本领域中是已知的，且在美国专利4,676,980号中公开了许多交联技术。
(vii)抗体片段
某些实施例中，抗trkC抗体(包括鼠、人和人源化抗体，以及抗体变体)是抗体片段。已经开发了各种生产抗体片段的技术。通常，这些片段是通过蛋白水酶解消化完整的抗体得到的(参阅，例如，Morimoto等，J.Biochem.Biophys.Methods24：107-117(1992)和Brennan等，Science 229：81(1985))。然而，现在可以直接通过重组宿主细胞生产这些片段。例如，Fab’-SH片段可以从大肠杆菌中直接回收并化学偶联形成F(ab’)2片段(Carter等，Biol/Technology 10：163-167(1992))。另一实施例中，F(ab’)2片段是用亮氨酸拉链GCN4促进F(ab’)2分子的组装而形成的。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物中直接分离Fv、Fab或F(ab’)2片段。其它生产抗体片段的方法对于熟练的技术人员是显见的。
(viii)抗体的氨基酸序列变体
通过在抗trkC抗体DNA中引入合适的核苷酸改变或通过肽合成，可以制得抗trkC抗体的氨基酸序列变体。此类变体包括，例如，本文的实施例中抗trkC抗体的氨基酸序列内有残基缺失和/或残基插入和/或残基取代。缺失、插入和取代的任何组合都可以采用以获得最终的构建物，只要最终的构建物具有所需的特征。氨基酸的改变还可以改变人源化或变体抗trkC抗体的翻译后加工，比如改变糖基化位点的数量和位置。
鉴定抗trkC抗体的优选诱变位置上的某些残基或区域的有用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells在Science，244：1081-1085(1989)中所描述的。这里，一个残基或一组目标残基被鉴别(如，带电荷的残基，如arg、asp、his、lys和glu)，并被中性或带负电荷的氨基酸(最好是丙氨酸或聚丙氨酸)取代以便影响氨基酸和trkC抗原的相互反应。然后在取代位点或为取代位点引入进一步的或其它的变体，从而使那些被证明对取代是功能敏感性的氨基酸位置得到澄清。因此，由于用来引入氨基酸序列变体的位置是预先确定的，故突变本身的性质是不用预先确定的。例如，为分析给定位点上突变的性能，在靶密码子或区域上进行丙氨酸扫描或随机诱变，并以所需活性对表达的抗trkC抗体变体进行筛选。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端融合，融合范围可以从一个残基到含有几百个或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括有N-末端甲硫氨酰残基的抗trkC抗体或与抗原表位标记物融合的抗体。抗trkC抗体分子的其它的插入变体包括将抗trkC抗体的N-或C-末端融合到能够增加抗体的血清半衰期的酶或多肽上(见下)。
另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体在抗trkC抗体分子中至少有一个氨基酸残基被除去，并在这个位置上插入一个不同的残基。倍受瞩目的取代诱变位点包括高变区，但是也考虑了FR变化。表1在“优选的取代”一栏下列出了保守性取代。如果此类取代导致了生物活性的变化，然后更加实质性的变化，在表1中被称为“示范性取代”，或根据氨基酸类型在下文中进一步描述，可以被引入并对产物进行筛选。
表1
 
原始残基 示范性取代 优选的取代
Ala(A) val；leu；ile val
Arg(R) lys；gln；asn lys
Asn(N) gln；his，asp，lys；arg gln
Asp(D) gly；asn glu
Cys(C) ser；ala ser
Gln(Q) asn；glu asn
Glu(E) asp；gln asp
Gly(G) ala ala
His(H) asn；gln；lys；arg arg
Ile(I) leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸 leu
Leu(L) 正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe ile
Lys(K) arg；gln；asn arg
Met(M) leu；phe；ile leu
Phe(F) leu；val；ile；ala；tyr tyr
Pro(P) ala ala
Ser(S) thr thr
Thr(T) ser ser
Trp(W) tyr；phe tyr
Tyr(Y) trp；phe；thr；ser phe
Val(V) ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸 leu
在抗体的生物学特性中进行的具体修饰是通过选择取代完成的，这些取代在保持(a)取代区域中多肽主链的结构，例如，作为片层或螺旋构型，(b)位于靶位点的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小方面的作用显著不同。按照侧链的常规性质可以将天然存在的残基分成几类：
(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性亲水性：cys、ser、thr；
(3)酸性：asp、glu；
(4)碱性：asn、gln、his、lys、arg；
(5)影响链定向的残基：gly、pro；以及
(6)芳香性：trp、tyr、phe。
非保守性取代需要将若干这些类型之一与另一种类型交换。
不涉及保持人源化或变体抗trkC抗体的适当构型的任何半胱氨酸残基也可以被取代，通常是和丝氨酸，以改进分子的氧化稳定性并防止异常的交联。相反地，半胱氨酸键可以被加到抗体上以改善其稳定性(尤其当抗体是抗体片段，比如Fv片段时)。
一种特别优选的取代变体类型包括取代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或几个高变区残基。通常，为进一步开发而选择的所得变体与产生它们的亲本抗体相比，将有改进的生物学特性。一种方便的产生此类取代变体的方法是用噬菌体展示进行亲和力成熟。简单地说，几个高变区位点(如6-7个位点)被突变以在各个位点产生所有可能的氨基取代。由此产生的抗体变体以单价形式展示，从作为融合体的丝状噬菌体颗粒到包装在各个颗粒内的M13的基因III产物。然后按照本文公开的生物学活性(如结合亲和力)对噬菌体展示的变体进行筛选。为了鉴别候备的供修饰的高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴别对抗原结合有显著作用的高变区残基。或者/此外，它有利于分析抗原-抗体复合体的晶体结构以鉴别抗体和人trkC之间的接触点。根据本文描述的技术，这种接触残基和邻近残基是取代的候选者。一旦产生了此类变体，按这里的描述对变体平板进行筛选，可以选择在一项或多项有关测定中有突出特性的抗体以供进一步改进。
(ix)抗体的糖基化变体
抗体在它们恒定区中的保守位点被糖基化(Jefferis和Lund，Chem.Immunol.65：111-128[1997]；Wright和Morrison，TibTECH 15：26-32[1997])。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白质的功能(Boyd等，Mol.Immunol.32：1311-1318[1996]；Wittwe和Howard，Biochem.29：4175-4180[1990])，并且在糖蛋白部分之间的分子内反应会影响糖蛋白的构型和它所表现的三维表面(Hefferis和Lund，同上；Wyss和Wagner，Current Opin.Biotech.7：409-416[1996])。寡糖可以靶向一个给定的糖蛋白以根据特定识别结构确定分子。例如，据报道，在无半乳糖基化的IgG中，寡糖部分“翻”出间-CH2空间，末端N-乙酰葡糖胺残基变得能够结合甘露糖结合蛋白(Malhotra等，Mature Med.1：237-243[1995])。用糖肽酶除去在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中制得的CAMPATH-1H(一种重组的人源化鼠单克隆IgG1抗体，它可以识别人淋巴细胞的CDw52抗原)中的寡糖，可以导致补体介导的裂解(CMCL)完全减少(Boyd等，Mol.Immunol.32：1311-1318[1996])，而用神经氨酸酶选择性除去唾液酸结果没有DMCL的损失。已报道抗体的糖基化影响依赖于抗体的细胞毒性(ADCC)。特别地，据报道，用四环素调节β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)，一种催化等分GlcNAc形成的糖基转移酶，表达的CHO细胞有改进的ADCC活性(Umana等，Nature Biotech.17：176-180[1999])。
抗体的糖基化变体是抗体的糖基化模式被改变的变体。改变意味着删除一个或多个在抗体中发现的糖类部分，向抗体添加一个或多个糖类部分，改变糖基化的构成(糖基化模式)、糖基化的范围等。例如，可以在编码抗体的核酸序列中除去、改变和/或加入一个或多个糖基化位点来制得糖基化变体。
抗体的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接是指将糖类部分连接到天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X苏氨酸，其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，是酶促将糖类部分结合到天冬氨酸侧链的识别序列。因此，这些三肽序列中的任一个出现在多肽中都产生一个潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指N-乙酰葡糖胺、半乳糖或木糖等糖类中的一种结合到羟氨基酸上，通常是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
在抗体中加入糖基化位点通常是通过改变氨基酸序列实现的，这样它就含有一个或多个上述的三肽序列(用于N-连接的糖基化位点)。这种改变也可以在原始抗体序列中加入一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基，或被一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代来完成(用于O-连接的糖基化位点)。
编码抗trkC抗体的氨基酸序列变体的核酸分子是通过这一领域中已知的各种方法制备的。这些方法包括(但不限于)从天然来源中分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况下)或通过寡核苷酸介导的(或定点的)诱变、PCR诱变以及盒式诱变先前制得的抗trkC抗体的变体或非变体版本来制备。
不用改变划线的核苷序列也可以改变抗体的糖基化(包括糖基化模式)。糖基化很大程度上依赖于用来表达抗体的宿主细胞。既然作为潜在的治疗剂用于重组糖蛋白表达的细胞类型，如抗体很少是天然细胞，可以考虑对抗体的糖基化模式进行显著的改变(参阅，例如Hse等，J.Biol.Chem.272：9062-9070[1997])。此外，对宿主细胞的选择，在抗体的重组生产中影响糖基化的因素包括生长模式、培养基配方、培养物密度、氧合作用、pH、纯化方案等。各种方法都被提议用来在特定的宿主生物中改变糖基化模式，这些方法包括引入或过度表达某些参与寡糖生产的酶(美国专利5,047,335；5,510,261和5,278,299号)。糖基化或某些类型的糖基化可以通过酶的方法从糖蛋白中除去，例如用内糖苷酶H(Endo H)。此外，可以通过遗传工程方法改造重组宿主细胞，例如在加工某些类型的多糖时产生缺陷。这些技术和类似的技术在这一领域是熟知的。
通过常规的糖类测定可以容易地分析抗体的糖基化结构，这些技术包括凝集素层析法、NMR、质谱法、HPLC、GPC、单糖组成分析法、连续酶消化法，以及HPAEC-PAD，它根据电荷用高pH的阴离子交换色谱来分离寡糖。出于分析目的的释放寡糖的方法是已知的，这些方法包括(但不限于)酶处理(通常用肽-N-糖苷酶F/内-β-半乳糖苷酶)、用强碱性环境消除以释放主要的O-连接结构、以及用无水肼释放N-连接和O-连接的寡糖的化学方法。
(x)抗体的其它修饰
这里所公开的抗trkC抗体还可以被制成免疫脂质体。含有抗体的脂质体是用这一领域中已知的方法制备的，比如在Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；和美国专利4,485,045和4,544,545号中描述的方法。具有提高的循环时间的脂质体公开在美国专利5,013,556号中。
特别有用的脂质体可以和含有磷酯酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质成分用反相蒸发法产生。脂质体是通过有规定孔径的膜中挤出以产生有所需直径的脂质体。如Marin等，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所描述的，本发明抗体的Fab’片段通过二硫键交换反应可以和脂质体共轭。脂质体中任选地含有一种化学治疗剂(比如阿霉素)。参阅Gabizon等，J.National CancerInst.81(19)：1484(1989)。
通过使抗体与能够将前药(如，肽基化学治疗剂，参见WO 81/01145)转化成活性抗癌药物的前药活化酶共轭，本发明的抗体也可以用在ADEPT中。参见，例如，WO 88/07378以及美国专利4,975,278号。
对ADEPT有用的免疫共轭物的酶组分包括任何能够在此类途径中作用于药物前体以使其变成更有活性、细胞毒形式的酶。
用于本发明的方法中的酶包括(但不限于)用来将含有磷酸的前药转变成游离药物的碱性磷酸酶；用来将含有硫酸盐的前药转变成游离药物的芳基硫酸酯酶；用来将无毒的5-氟胞嘧啶转变成抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；蛋白酶类，比如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶以及组织蛋白酶(比如组织蛋白酶B和L)，可以用它们将含有肽的前药转变成游离药物；用来转化含有D-氨基酸取代基的前药的D-丙氨酰羧肽酶类；用来将糖基化的前药转变成游离药物的糖类切割酶类，比如半乳糖苷酶和神经氨酸酶；用来将与内酰胺衍生的前药转变成游离药物的内酰胺酶；以及用来将分别与苯氧基乙酰或苯乙酰基团在它们的氨基氮上衍生的药物转变成游离药物的青霉素酰胺酶类，比如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，具有酶活性的抗体，在此领域中也被称为“抗体酶”，也可以被用来将本发明的前药转变成游离的活性药物(参阅，例如，Massey，Nature328：457-458(1987))。可以按照这里的描述制备抗体-抗体酶共轭物以将抗体酶传递到肿瘤细胞种群中。
用此领域熟知的技术，比如使用上面讨论的异双功能交联试剂可以将本发明的酶类共价连接到抗trkC抗体上。或者，可以用此领域中熟知的重组DNA技术构建连接到本发明的酶的至少一个功能活性部分上的至少含有本发明的抗体的抗原结合区的融合蛋白(参见，例如，Neuberger等，Nature 312：604-608[1984])。
在本发明的某些实施例中，可能需要使用抗体片段而不是完整的抗体。在这种情况下，可能需要修饰抗体片段以增加其血清半衰期。例如，这可以通过将补救受体结合的抗原表位掺入到抗体片段中实现(例如，通过突变抗体片段中合适的区域，或在肽标记物中掺入抗原表位，然后再(例如)通过DNA或肽合成，将标记物融合到抗体片段的任一端或中间)。参见公布于1996年10月17日的WO96/32478。
补救受体结合的抗原表位通常含有一个区域，其中Fc域的一个或两个环上的任何一个或多个氨基酸残基被转移到抗体片段的类似位置上。更加好的是，Fc域的一个或两个环上的三个或更多的残基被转移。再好的是，抗原表位取自Fc域(比如来自IgG)的CH2域并被转移到抗体的CH1、CH3或VH域或多个此类区域。或者，抗原表位取自Fc域的CH2域并被转移到抗体的CL域或VL域，或这两个域。
人源化或变体抗trkC抗体(包括糖基化变体)的共价修饰也包括在本发明的范围之内。如果可行的话，它们可以通过化学合成或通过酶或化学切割抗体的方法制得。使抗体的靶向氨基酸残基与能够与选定的侧链或N-或C末端残基反应的有机衍生试剂反应，可以在分子中引入抗体的其它类型的共价修饰。示范性的多肽的共价修饰描述在美国专利5,534,615号中，在此特别将其引入以供参考。优选的抗体共价修饰类型包括将抗体连接到多种非蛋白质聚合物如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧乙烯)中的一种上，例如在美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337号中提到的。
2.载体、宿主细胞和重组方法
本发明还提供了编码本发明的非人，例如鼠和人抗trkC的抗体(包括非人抗体的人源化版本)的分离的核酸，载体和包括核酸的宿主细胞，以及生产抗体的重组技术。
为重组生产抗体，编码它的核酸可以被分离并插入可复制的载体中以便进一步克隆(DNA扩增)或表达。在另一个实施例中，可以通过同源重组生产抗体，如美国专利5,204,244号中所描述的，在此特别将其引入以供参考。用常规的步骤容易分离并测序编码单克隆抗体的DNA(例如，使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。许多载体都是可以获得的。载体的成分通常包括(但不限于)以下中的一个或多个：一个信、一个复制起点、一个或多个标记基因、一个增强子元件、一个启动子以及一段转录终止序列，例如，如出版于1996年7月9日的美国专利5,534,615号中所描述的，在此特别将其引入以供参考。
用来在载体中克隆或表达DNA的合适的载体细胞是原核生物、酵母或上述高等真核细胞。用于这一目的的合适的原核生物包括真细菌类，比如革兰氏阴性或革兰氏阳性的生物，例如肠杆菌科(如，大肠杆菌)、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏杆菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属(如，鼠伤寒沙门氏菌)、沙雷氏菌属(如粘质沙雷氏菌(serratia marcescans))和志贺氏菌属，以及杆菌，如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(如，公布于1989年4月12日的DD 266,710中所描述的地衣芽孢杆菌)，假单胞菌属如铜绿假单胞菌和链霉菌属。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其它菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)以及大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些例子是为了阐述而不是限制。
除了原核生物，丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是编码抗trkC抗体的载体的合适的克隆或表达宿主。低等真核宿主微生物中最常用的是酿酒酵母或普通的面包酵母。然而，一些其它的属、种和菌株通常是可得到的和有用的，比如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母菌属宿主如，例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆弱克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克曼氏克鲁维酵母(K.Wickeramii)(ATCC24,178)、沃尔特克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)以及马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶罗威亚酵母属(yarrowia)(欧洲专利402,226号)；巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)(欧洲专利183,070号)；假丝酵母菌(Candida)；里西亚木霉(Trichoderma reesia)(欧洲专利244,234号)；粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)；西方许旺氏酵母属(Schwanniomyces)如西方许旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌如，例如，脉孢属、青霉属、弯颈霉(Tolypocladium)以及曲霉属宿主(如构巢曲霉和黑曲霉)。
用来表达糖基化的抗trkC抗体的合适的宿主细胞是从多细胞生物中衍生的。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了各种杆状病毒毒株及其变体以及来自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑尾果蝇(Drospophilamelanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)的相应允许的昆虫宿主细胞。各种用于转染的病毒菌株是公开可得到的，例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(NPV)的L-1变体和家蚕核型多角体病毒的Bm-5毒株，根据本发明，此类病毒在这里可被用作病毒，尤其是用来转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、牵牛花、西红柿和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。
然而，人们对脊椎动物的细胞的兴趣最浓厚，且脊椎动物的细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已经是常规的过程。有用的哺乳动物宿主细胞的例子是被SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1品系；人胚胎肾脏品系(293或供悬浮培养的亚克隆的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.36：59[1977])；幼年仓鼠肾脏细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216[1980])；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251[1980])；猴肾脏细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲青猴肾脏细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(Hela，ATCC CCL 2)；犬肾脏细胞(MDCK，ATCC CLL 34)；水牛大鼠肝脏细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝脏细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68[1982])；MRC5细胞；以及FS4细胞。
用上述抗trkC抗体生产的表达或克隆载体转化宿主细胞并将细胞培养在常规的经适当改进以诱导启动子的营养培养基中，选择转化体，或扩增编码所需序列的基因。
用来生产本发明的抗trkC抗体的宿主细胞可以培养在各种培养基中。商业上可获得的培养基，比如Ham’s F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco氏改进的Eagle培养基(DMEM)(Sigma)是适合培养宿主细胞的。此外，在Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)，美国专利序列号第4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655或5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利参考30,985中描述的任何培养基都可用作宿主细胞的培养基。按照需要，可以在这些培养基中添加激素和/或其它生长因子(比如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(比如HEPES)、核苷酸(比如腺苷和胸苷)、抗生素(比如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)以及葡萄糖或等当量的能源。还可以包括精通此领域的那些技术人员已知的任何其它适宜浓度的必要添加物。培养条件，如温度、pH等，就是前面选择用以供表达的宿主细胞使用的条件，这对于此领域的一般技术人员是显而易见的。
当采用重组技术时，可以在壁膜间隙中细胞内产生抗体，或直接分泌入培养基中。如果抗体是细胞内产生的，作为第一个步骤，宿主细胞或裂解片段的颗粒碎片(例如)通过离心或超滤除去。Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了分离分泌到大肠杆菌的壁膜间隙的抗体的步骤。简单地说，将细胞浆在醋酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氯(PMSF)中融解约30分钟以上。通过离心可以除去细胞碎片。若抗体是分泌入培养基中，通常首先用商业上获得的蛋白质浓缩滤器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤装置)将此类表达系统的上清液浓缩。在以下任一步骤中可以含有PMSF之类的蛋白酶抑制剂以抑制蛋白水解作用，也可以加入抗生素以防止外来污染物的生长。
可以用(例如)羟基磷灰石层析法、凝胶电泳、透析和亲和层析法纯化从细胞中制得的抗体组合物，亲和层析是优选的纯化方法。作为亲和配体的蛋白质A的适合性依赖于存在于抗体中的任何免疫球蛋白Fc域的种类和同种型。蛋白质A可用来纯化抗体，这些挤体是基于人的1、2或4重链(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。对所有的小鼠同种型和人3都是推荐蛋白质G(Guss等，EMBOJ.5：15671575(1986))。亲和配体附着的基质通常是琼脂糖，但其它的基质也适用。与琼脂糖相比，机械稳定的基质，如受控的多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许较快的流速和较短的程序时间。当抗体含有CH3域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，菲利浦斯勃格，新泽西州)对于纯化是有用的。根据要回收的抗体，其它的蛋白质纯化技术，比如在离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上层析、肝素SEPHAROSETM上层析、在阴离子或阳离子交换树脂(比如聚天冬氨酸柱)上层析、层析聚焦、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀也是可行的。
在任何初步纯化步骤之后，可以将含有感兴趣的抗体以及杂质的混合物进行低pH疏水相互反应层析，使用pH约在2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选低盐浓度的(例如，约含0-0.25M盐)。
3.抗trkC促效抗体的鉴定
例如，可以用美国专利5,766,863和5,891,650中描述的激酶受体活化(KIRA)测定法鉴定促效抗体。这种ELISA型测定适合于定性或定量测量激酶的活化(通过测量受体蛋白质酪氨酸激酶(rPTK，如trk受体)激酶域的自身磷酸化)，并可用来对选定的rPTK的促效剂或拮抗剂进行鉴定和表征。这种测定的第一个阶段涉及激酶受体的激酶域的磷酸化，当为trkC受体时，其中，受体出现在真核细胞的细胞膜上。这种受体可以是内源受体或是编码受体的核酸，或是可被转移入细胞中的受体构建物。通常，在第一固相(例如，第一测定平板的一个孔)涂上此类细胞(通常是哺乳动物细胞系)基本上均匀的群体，这样细胞就粘附在固相上了。通常，细胞是附着的并因此自然粘附在第一固相上。如果使用“受体构建物”，它通常包括激酶受体和标记多肽的融合。在测定的ELISA部分中，标记多肽被捕获剂(通常是捕获抗体)识别。分析物，比如候选促效剂然后被加到含有粘附细胞的孔中，这样，酪氨酸激酶受体(如trkC受体)就被暴露在分析物中(或与分析物接触)。这种测定使得人们能够识别所感兴趣的酪氨酸激酶受体配体(如trkC)的促效剂配体。用这种测定有可能检测酪氨酸激酶受体的拮抗剂。为检测组织促效剂与受体结合的拮抗剂配体，粘附的细胞首先被暴露在可疑的拮抗剂配体中，然后暴露在促效剂配体中，这样就可以测定受体结合的竞争性抑制和活化。同样，这种测定可以确定与促效剂配体结合的拮抗剂从而降低或消除其与rPTK结合或活化rPTK的能力。为检测此类拮抗剂，将可疑的rPTK的拮抗剂和促效剂一起培育，然后将粘附的细胞暴露在配体的这种混合物中。暴露在分析物中以后，用裂解缓冲液(其中含有可溶性的去污剂)溶解粘附的细胞并轻轻搅动，由此释放的细胞裂解液被直接置于测定的ELISA部分，而不需要将细胞裂解物浓缩或澄清。
然后对制得的细胞裂解物进行测定ELISA阶段。作为ELISA阶段的第一个步骤，用与酪氨酸激酶受体特异性结合的捕获剂(通常是捕获抗体)包涂第二固相(通常是ELISA微量滴定平板的一个孔)，或者，如果是受体构建物的话，就用与标记多肽特异性结合的捕获剂。对第二固相进行了包涂，这样捕获剂就附着在第二固相上了。捕获剂通常是单克隆抗体，但是，如这里的实施例所描述的，也可以使用多克隆抗体。然后将所得的细胞裂解物暴露在粘附的捕获剂中(或与粘附的捕获剂接触)，这样受体或受体构建物就粘附在第二固相上(或被第二固相捕获)。然后进行洗涤步骤，以除去未结合的细胞裂解物，留下被捕获的受体或受体构建物。然后将粘附或捕获的受体或受体构建物暴露在能够识别酪氨酸激酶受体中被磷酸化的酪氨酸残基的抗磷酸酪氨酸的抗体中，或与这种抗体接触。在优选的实施例中，抗磷酸酪氨酸抗体共轭连接在(直接或间接)催化非放射性显色试剂变色的酶上。故而可以通过随后的试剂变色来检测受体的磷酸化。这种酶可以直接结合在抗磷酸酪氨酸抗体上，或者共轭的分子(如，生物素)可以共轭连接在抗磷酸酪氨酸抗体上，且这种酶随后可以通过共轭的分子结合到抗磷酸酪氨酸抗体上。最终，比如可以通过显色剂的变色来测定抗磷酸酪氨酸抗体与被捕获的受体或受体构建物的结合。
初步鉴定后，可以通过已知用来测试靶生物活性的生物测定法进一步确认并精制促效抗体。例如，可以用实施例1中所描述的PC12轴突生长测定来检测模拟NT-3活性的抗trkC单克隆抗体的作用，并在已知的神经退化疾病的动物模型，比如实施例2中所描述的顺氯氨铂和吡哆醇诱导的神经病的示范性动物模型中确认。
3.抗trkC的促效抗体的治疗和诊断应用
本发明的抗trkC的促效抗体被认为在治疗(包括预防)与细胞退化或机能失常有关的病理学病症是有效的。特别地，抗trkC的促效抗体是治疗各种(慢性)神经退化病症和急性神经细胞损伤的有希望的候选药物。这类神经退化病症包括(但不限于)周围神经病；运动神经元障碍，比如肌萎缩性侧索硬化症(ALS，Lou Gehrig氏病)、面神经麻痹和各种与脊髓肌萎缩或麻痹有关的症状；以及其它人神经退化疾病，比如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、癫痫、多发性硬化、亨延顿舞蹈病、唐氏综合症、神经性耳聋和梅尼埃尔氏病，以及急性神经细胞损伤，例如由于外伤或脊索损伤造成的。
据信，本发明的抗trkC的抗体特别适合于治疗周围神经病、影响周围神经的神经退化性障碍，这大多数是由运动、感觉、感觉运动或自主神经中的一种或几种功能失调造成的。周围神经病可以是，例如，遗传获得的，可以是有全身疾病造成的，可以是由毒性剂(如神经毒性药物，例如抗癌剂或是工业或环境污染)导致的，或是可以是特发的。因此，周围感觉神经病的特征是周围感觉神经元功能退化、降低或衰竭，这可能是(例如)作为糖尿病(糖尿病性神经病)、癌症中抑制细胞的药物治疗(例如用长春新碱、顺氯氨铂、氨甲蝶呤或3’-叠氮-3’-脱氧胸腺嘧啶等化学治疗剂治疗)、酒精中毒、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)或遗传素质的后果发生。遗传获得性的周围神经病包括(例如)雷弗素姆氏病、克拉伯氏病、异染性脑白质营养不良、法布莱氏病、德雅兰-素塔斯综合征、无β脂蛋白血症以及沙-马-图(CMT)病(也被称为腓侧肌萎缩或遗传性运动感觉神经病(HMSN))。
基于已被证实的trkC受体的天然配体NT-3对促进周围血淋巴细胞增殖的能力，本发明的抗trkC的促效抗体也可被用作治疗中性白细胞减少症、各种感染和肿瘤的治疗剂。既然trkC的表达不限于神经元，人们预期在不限制神经细胞的情况下，可以用抗trkC的促效抗体来预防或治疗通常以细胞退化为特征的障碍。
本发明的抗trkC的抗体也可被用来诱导血管生成，或治疗其中需要诱导血管生成的病理症状/疾病。此类病理症状包括，例如，不考虑潜在病理的心脏缺血，包括脑循环不足造成的脑血管障碍。在治疗创伤，包括溃疡、镰形细胞疾病的糖尿病并发症和外科后创伤时可能也需要血管生成。
本发明的抗trkC的抗体还可用于诊断与细胞退化，尤其是上面所列的神经退化疾病有关的疾病。
对于诊断用途，通常用可检测的部分标记抗体。可获得各种各样的标记，它们通常被分成以下几类：
(a)放射性同位素，比如35S、14C、125I、3H和131I。可以用(例如)Current Protocolsin Immunology，第1、2卷，Coligen等编，Wiley-Interscience，纽约。纽约州，(1991年出版)中描述的技术用放射性同位素标记抗体，并通过闪烁计数来测定放射性。
(b)荧光标记，如稀土金属鳌合物(铕鳌合物)或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、丽丝胺、藻红蛋白和德克萨斯红是可以获得的。可以用(例如)Current Protocols in Immunology，(同上)所描述的技术使荧光标记与抗体共轭。用荧光计可以将荧光定量。
(c)各种酶-底物标记是可以获得的，且美国专利4,275,149号提供了一些综述。酶通常催化显色底物的化学变化，这可以用各种技术来检测。例如，酶可以催化底物变色，这可以通过分光光度测量。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。上面描述了定量荧光改变的技术。用化学反应可以使化学发光底物被电子学方法激发，然后可以发射出可被检测的光(例如，用化学发光计)或向荧光受体提供能量。酶标记的例子包括荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利4,737,456号)、荧光素、2，3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶(如辣根过氧化物酶(HRPO))、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-β-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(比如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。将酶共轭连接到抗体上的技术描述在O’Sullivan等，制备用于酶免疫测定的酶-抗体共轭物的方法(Methods for Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in EnzymeImmunoassay)，刊登于Methods in Enzym.(J.Langone和H.Van Vunakis编)，学术出版社，纽约，73：147-166(1981)。
酶-底物结合物的例子包括，例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRPO)和过氧化氢酶作为底物，其中过氧化氢酶氧化一种染料前体底物(例如，邻二苯胺(OPD)或3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB))；
(ii)碱性磷酸酶(AP)和对硝基苯磷酸作为显色底物；以及
(iii)-D-半乳糖苷酶(-D-GAl)和显色底物(例如，对硝基苯-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形酮酰-D-半乳糖苷酶。
对于精通此领域的技术人员而言，还可以获得的许多其它酶-底物结合物。对于这些综述可以参阅美国专利4,275,149和4,318,980号。
有时，标记直接和抗体共轭连接。熟练的技术人员将意识到有很多方法都可以实现这一点。例如，抗体可以和生物素共轭连接，且上面提到的三种标记中的任何一种都可以和抗生物素蛋白共轭连接，反之亦然。生物素与抗生物素蛋白特异性结合，因此，标记可以这种非直接的方式与抗体共轭连接。或者，为使标记非直接与抗体共轭连接，将抗体与小的半抗原(如，地高辛)共轭连接，并使一种不同类型的上面提到的标记与抗半抗原抗体(如，抗地高辛抗体)共轭连接。因此，就可以实现标记和抗体的非直接共轭连接。
在本发明的其它实施例中，抗trkC抗体不需要被标记，并且可以用与抗trkC抗体结合的标记的抗体来检测它的存在。
本发明的抗体可被用在任何一种已知的测定方法中，比如竞争性结合测定、直接和间接的夹心测定以及免疫沉淀测定。Zola，单克隆抗体：技术手册(MonoclonalAntibodies：A Manual of Technique)，第147-158页(CRC出版公司，1987)。
竞争性结合测定依赖于标记的标准物与测试样品分析物竞争与有限量的抗体结合的能力。测试样品中trkC蛋白的量和变得与抗体结合的标准物的量是成反比的。为了便于对变得结合的标准物的量进行测定，抗体在竞争前或后通常是不溶的，这样就可以很方便地将结合到抗体上的标准物和分析物与未结合的标准物和分析物分开。
夹心测定涉及使用两种抗体，每一种都能够与要测蛋白质的不同的免疫原性部分或抗原表位结合。在夹心测定中，测试样品分析物被固定在固相载体上的第一抗体结合，因此，第二抗体与分析物结合，这就形成了一种不溶的三部分复合体。参见，例如，美国专利4,376,110号。第二抗体自身可以被可检测的部分标记(直接夹心测定)，或者可以用可检测部分标记的抗免疫球蛋白抗体来检测(间接夹心测定)。例如，一种类型的夹心测定是ELISA测定，这种方法中，可检测的部分是酶。
这种抗体也可用于体内诊断测定。通常，抗体用放射性核素(如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)标记，这样就可以用免疫闪烁照相法将感兴趣的细胞或组织定位。
按照此领域已知的技术，这种抗体也可以用作病理学中的染色试剂。
据信，本发明的抗trkC促效抗体作为治疗剂有许多优于NT-3的地方，包括改进的效果、改进的药代动力学性质(pK)和生物利用率，并且在施用后没有痛觉过敏。
4.药物制剂
本发明抗体的治疗制剂是为储存制备的，方法是将有所需纯度的抗体和任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编(1980))混合，制成冻干制剂或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在用药剂量和浓度对受体是无毒的，并且包括像磷酸盐、柠檬酸盐和其它无机盐之类的缓冲液；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(比如)氯化十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；杀藻胺、苯索氯铵；酚、丁基或苄基醇；烷基对羟基苯甲酸酯类，如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽类；蛋白质类，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸类，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和包括葡萄糖、甘露糖或糊精在内的其它碳水化合物；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的反荷离子，如钠离子；金属复合物(例如，锌-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEETM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
这里的制剂还可以含有多于一种的被治疗的特定征兆所必需的活性化合物，它们最好有互补的活性而相互之间不会有不利的影响。这类分子以足够用于所需目的的量存在于组合物中。
这种活性成分可以被包载在微胶囊中，例如，可以通过凝聚技术或通过界面聚合作用制备微胶囊，例如，胶体药物传递系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、毫微颗粒和毫微囊剂)或巨乳剂中分别有羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基异丁烯酸脂)微胶囊。此类技术描述在Remington’s PharmaceuticalSciences第16版，Osol，A.编(1980)中。
供体内施用的制剂必需是无菌的。这可以通过无菌滤膜过滤很容易的实现。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体的固态疏水聚合物的半透基质，这些基质以成型物体的形式出现，如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-异丁烯酸脂)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919号)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如Lupron DepotTM(含有乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林的可注射的微球体)以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之类的聚合物能够释放分子超过100天，某些水凝胶释放蛋白质的时间则较短。当胶囊化的抗体在体内保留较长时间时，暴露在37℃的潮湿环境中会使它们变性或聚集，这会造成生物活性的丧失并有可能改变免疫原性。根据所涉及的机理可以设计出合理的稳定的方法。例如，如果发现聚集机制是由于通过硫-二硫交换在分子间形成了S-S键，可以通过修饰巯基残基、冻干酸性溶液、控制水分含量、用合适的添加剂以及改进特定聚合物基质组成以获得稳定性。
根据(例如)治疗目的、用药途径和患者的状况，有效量的本发明的抗体可以用于治疗。由此，治疗学家有必要对剂量进行滴定并根据需要改变用药途径以获得最佳疗效。典型的日剂量可以从约1g/kg至100mg/kg或更多，这取决于上面提到的因素。通常，临床医师将施用一种本发明的分子直至剂量能够提供所需的生物学功效。通过常规的测定很容易监测这种治疗的进展。
可以通过此领域中已知的任何常规途径给药，这包括(但不限于)静脉、皮下、局部、肌肉内、气管内、大脑内、鼻内、肺内和腹膜内用药。
4.基因治疗
编码本发明抗体的核酸也可被用于各种(慢性)神经退化性障碍和急性神经细胞损伤，尤其是遗传获得的周围神经病的基因治疗。已经进行了两种基础性的基因治疗研究：体外基因治疗和体内基因治疗。在体外基因治疗中，从受试者中取出细胞并在体外培养。在体外在细胞中引入一种功能性替换基因，在培养物中扩增被修饰的细胞，然后再植入在受试者上。在体内基因治疗中，没有从受试者中取出靶细胞。而是将被转移的基因引入原位受体的细胞中，即在受体内引入受体的细胞。
已经报道并综述了一些在人体中进行体外基因治疗研究，例如，Anderson，Science 256：808-813(1992)和Miller，Nature 357：455-460(1992)。在几种动物模型中证实了体内基因治疗的成活力，如Felgner等在Nature 349：351-352(1991)中作了综述。已经报道了直接基因转移，例如，将其转移到肌肉组织中(Ferry等，Proc Natl.Acad.Sci.88：8377-8781[1991]；Quantin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2581-2584[1992])；转移到动脉壁中(Nabel等，Science 244：1342-1344[1989])；以及转移到神经系统中(Price等，Proc.Natl.Acad.Sci.84：156-160[1987])。
由此，本发明还提供了适合将编码抗trkC促效抗体的多核苷酸传递入细胞的传递载体(无论是体内或体外)。通常，编码抗体(例如线性抗体或抗体链)的多核苷酸将可操作地连接到启动子和异源多核苷酸上。适合将编码本发明抗体的多核苷酸引入宿主细胞的传递载体包括非病毒载体和病毒载体。Verma和Somia，Nature 389：239-242(1997)。
各种用来传递编码本发明抗体的多核苷酸的非病毒载体是此领域已知的，并包含在本发明中。编码抗trkC抗体的多核苷酸可以作为裸DNA被传递到细胞中(美国专利5,692,622号，WO 97/40163)。或者，编码抗trkC抗体的多核苷酸可以通过各种方法与多种物质(传递形式)连接传递至细胞，这些物质包括(但不限于)阳离子脂质、生物相容聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒被膜；金属颗粒；以及细菌。传递载体可以是微粒。这些各种物质的混合物或共轭物也可被用作传递载体。编码抗体的多核苷酸可以和这些各种形式的输递非共价或共价连接。脂质体可以被靶向特定的细胞类型，如，靶向肾小球上皮细胞。
病毒载体包括(但不限于)DNA病毒载体，如基于腺病毒的那些载体、单纯疱疹病毒、痘病毒(如牛痘病毒)和细小病毒，包括腺伴随病毒；和RNA病毒载体，包括(但不限于)逆转录病毒。逆转录病毒包括鼠白血病病毒和慢病毒(如人免疫缺陷病毒)。Naldini等，Science 272：263-267(1996)。
可以用此领域已知的任何方法将含有编码抗trkC抗体的多核苷酸的非病毒传递载体引入宿主细胞和/或靶细胞，比如用磷酸钙共沉淀技术进行转染；电穿孔；电透化作用；脂质体介导的转染；射击转染；biolistic法(包括微粒轰击、快速注射和针注射以及针筒注射)；或通过微注射。许多转染的方法是此领域的熟练技术人员已知的。
可以通过注射将病毒传递载体引入细胞。或者，可以将病毒载体与上述任何非病毒传递载体合并以传递入细胞。例如，病毒载体可以和阳离子脂质混合(Hodgson和Solaiman，Nature Biotechnol.14：339-342[1996])；或和薄片状脂质体混合(Wilson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：3471[1977]；和Faller等，J.Virol.49：269[1984])。
在优选的实施例中，编码本发明抗trkC抗体的重链和轻链(包括片段)的核酸将出现在同样的多顺反子表达载体上，比如美国专利4,965,196和4,713,339中公开的那些。多顺反子表达载体含有编码二级蛋白质和所需蛋白质的序列，其中的二级序列和所需序列由同一个启动子控制。这个编码序列被翻译终止和起始信号密码子分开。二级序列的表达影响对所需蛋白质序列表达的控制，和作为标记用来选择被转染的细胞的二级蛋白质的功能。
体内基因治疗中，可以通过，例如，静脉(i.v.)注射向受体施用载体。合适的滴定度依赖于各种因素，比如特定载体的选择、宿主、所用启动子的强度以及被治疗疾病的严重程度。
将通过以下非限制性的实施例进一步阐述本发明。
实施例
实施例1抗trkC促效单克隆抗体的生产和鉴定
抗体的生产和同种型化
如Mendez等(同上)所描述的在Frieund或Ribi佐剂中用20μg人trkC-IgG(Shelton等，J.Neurosci.15：477-491[1995])腹膜内、通过后爪或皮下将野生型Balb/C小鼠或产生人IgG2或IgG4的转基因小鼠(Xenomice，描述在Mendez等，Nature Genetics 15：146-156[1997])超免疫。将免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞(X63.Ag8.653，ATCC罗克维尔，马里兰州)融合。用253只Xenomice和35只野生型Balb/C小鼠完成总共33个融合体。用trkC-IgG进行直接ELISA对平板(共21,734个孔)进行最初的筛选。ELISA筛选鉴定了684个trkC阳性的杂交瘤，然后对它们全部进行trkC KIRA(激酶活化的受体测定)以评价促效剂的活性。KIRA鉴定了14个Xenomouse衍生的和22个野生型Balb/C小鼠衍生的能够分泌抗trkC促效抗体的杂交瘤。然后通过限制稀释亚克隆这些杂交瘤，再次测定以确认促效剂的活性，然后将它们注射进Pristane-primed Balb/C小鼠或裸鼠以诱导腹水(Hongo等，Hybridoma 14：253-260[1995])。通过蛋白质A亲和层析纯化存在于腹水中的单克隆抗体(Hongo等，同上)。Xenomouse和野生型Balb/C小鼠融合体的特定融合效率(阳性数目/被筛选的孔数)都是3％。Xenomouse和野生型Balb/C小鼠融合体对促效单克隆抗体的发病率(促效剂/trkC ELISA阳性的数目)分别为3％和8％。根据生产商的说明，用GIBCO BRL量尺(GIBCO BRL dipstick)或Zymed小鼠打印机同种型试剂盒(Zymed mouse-typer isotyping kit)鉴定鼠单克隆抗体的同种型。Xenomice是IgG2或IgG4品系的，产生抗体相应的同种型。表1显示了各种人和鼠抗trkC单克隆抗体的同种型。总共鉴定了8种人IgG2、6种人IgG4、7种鼠IgG1、10种鼠IgG2a和5种鼠IgG2b的单克隆抗体。根据KIRA测定的结果，具有最有效的促效活性的单克隆抗体(在表2中用星号表示)被选出以供进一步鉴定。
表2
人单克隆抗体(共14种)
IgG2同种型(8种单克隆抗体)   IgG4同种型(6种单克隆抗体)
2.5.1*                     4.8
6.1.2*                     2337
6.4.1*                     2338
2342                       2339
2343                       2348
2344*                      2349*
2345*
2346
鼠单克隆抗体(共22种)
IgG1(7)     IgG2a(10)     IgG2b(5)   IgG3
2249        2248*         2252
2250*       2272          2273
2253*       2251          2277
2254        2255          2279
2256*       2274          2280
2257        2275
2260        2276
            2278
            2281
            2282
对促效活性的测定
a.KIRA测定法
用两种生物测定法来测定抗trkC单克隆抗体的NT-3促效活性。激酶活化的受体测定(KIRA)，在上面已经详细讨论过了，根据用配体例如NT-3或促效单克隆抗体刺激，测量被转染的细胞中trkC的酪氨酸磷酸化(Sadick等，Exp.CellRes.234：354-361[1997])。在KIRA刺激缓冲液(F12/DMEM 50:50含有2％牛血清白蛋白(BSA；Intergen公司，Purchase，纽约)和25mM Hepes，经0.2μm滤膜过滤)中将单克隆抗体稀释至27μg/ml。继续以1:3的比例在刺激培养基中连续稀释单克隆抗体(共稀释8次；浓度从0.01-180mM)。将中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(被和26种衍生自HSV糖蛋白D(gD)的氨基酸多肽标记抗原表位融合的trkC稳定地转染)接种(5×104细胞/孔)并使其生长在96孔的细胞培养平板上。然后用NT-3(作为阳性对照)或各种抗trkC单克隆抗体刺激这些细胞，用0.1；1.56；3.13；6.25；12.5；50和100ng/ml的连续稀释。所有的稀释物一式两份测定6小时。用基本上如Sadick等(同上)描述的方法进行测定。简单地说，用Triton X-100裂解细胞，用抗gD抗原表位的抗体在ELISA中捕获细胞裂解物中出现的trkC，用与酶适当共轭的抗磷酸酪氨酸抗体检测并定量磷酸化的trkC。不直接抗trkC的单克隆抗体(抗IL8IgG2Xenomous衍生的人抗体或抗gp120 IgG1鼠单克隆抗体)被用作阴性对照。如图1(A和B)所示，所有选择的抗trkC单克隆抗体都能模拟NT-3的活性，因为它们能够刺激trkC受体的酪氨酸磷酸化。人抗trkC单克隆抗体(图1A)显示了比鼠抗trkC单克隆抗体(图1B)更加有效的促效活性。例如，最好的人抗trkC单克隆抗体比最好的鼠抗trkC单克隆抗体要有效10倍。此外，人单克隆抗体与NT-3几乎同样有效，尤其是在较低的浓度范围时。
b.PC12轴突生长物测定法
另一种用来测定抗trkC单克隆抗体的NT-3模拟活性的方法是PC12轴突生长物测定法。这种测定法测量了响应合适配体刺激中由大鼠嗜铬细胞(pheocytochroma cell)(PC12)形成的轴突的生长。这些细胞表达内源trkA，因此可以响应NGF。然而，它们不表达内源trkC，因此用trkC表达构建物将它们转染以便诱发对NT-3及其促效剂的响应。用全长的人trkC转染PC12细胞(Urfer等，Biochem.36:4775-4781[1997]；Tsoulfas等，Neuron 10:975-990[1993])并置于96孔的细胞培养平板中(1000细胞/孔)。转染三天后，加入三倍量的抗trkC单克隆抗体(浓度从0.0002-2.7nM)，并在37℃再温育3天。然后用相差显微镜分析细胞，并对轴突超过细胞直径两倍的细胞计数。如图1C和D所示，人和鼠抗trkC单克隆抗体能够刺激轴突在PC12细胞中生长。与鼠抗trkC单克隆抗体(图1D)相比，人抗trkC单克隆抗体(图1C)显示了更加有效的活性，这更加确证了在KIRA测定中观察到的结果。此外，与KIRA测定结果一致，人抗trkC单克隆抗体显示了和用NT-3获得的结果大致类似的刺激。用上述两种生物测定法获得的结果证实了抗trkC单克隆抗体模拟trkC受体的天然配体NT-3活性的能力。
单克隆抗体的促效抗体是根据酪氨酸磷酸化的最大诱导评价的，并计算了KIRA测定和PC12轴突生长测定中磷酸化曲线的EC50。表3总结了各种抗trkC促效单克隆抗体的特征。
表3
 
单克隆抗体编号 同种型 促效活性KIRA/PC12 与大鼠trkC结合 免疫印记NR/Red. 亲和力Kd(nM)
人单克隆抗体 NR    Red.
2.5.1 G2 (+++/+++) 不结合 ++    ++ 12
6.1.2 G2 (++++/++++) 不结合 +     + 12.5
6.4.1 G2 (++++/++++) 结合结合 +     + 12
2344 G2 (+++/+++) 不结合 ++    + 19
2345 G2 (++++/++++) 不结合 ++    ++ 12.1
2349 G4 (++++/++++) 不结合 ++    + 23
鼠单克隆抗体
2248 G2a (+/+) 不结合 +++   - 5.9
2250 G1 (++/++) 不结合 ++    ++ 8.7
2253 G1 (++/+) 不结合 ++    ++ 42
2256 G1 (+/+) 结合结合 ++    + 62
检测抗trkC抗体的特异性
抗trkC单克隆抗体的特异性是用直接ELISA测定的。用作为捕获抗原的受体trkA-IgG、trkB-IgG或trkC-IgG的免疫粘附素构建物包涂微量滴定平板过夜(描述在Shelton等，J.Neurosci.15：477-491[1995])，使用100μl 1μl/ml溶液稀释在50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)中。用CD4-IgG(Capon等，Nature 337:525-531[1989])代替捕获抗原作为阴性对照。将被包涂的平板和稀释在含有0.5％BSA和0.05％Tween20的PBS中的各种浓度的抗trkC单克隆抗体(100μl，浓度为1μg/ml)在室温培育1小时。洗涤除去多余的未结合的抗体后，加入适当的HRP共轭物(人单克隆抗体：羊抗人κ-HRP，稀释1:5000；鼠单克隆抗体：羊抗鼠IgG(Fc)-HRP，稀释1:5000)并在室温培育1小时。然后如前面的描述洗涤、显影并阅读平板(Hongo等，Hybridoma 14:253-260[1995])。图2显示了使用人抗trkC单克隆抗体6.1.2的代表性实施例。对trkC的结合是高度特异的，而对trkA和trkB则没有观察到明显的交叉反应。类似的，其它的人和鼠抗trkC单克隆抗体也显示了对trkC的特异性识别。
除了用trkC-gD而不是trkC-IgG作为人trkC的捕获抗原外，用基本上如上所述的直接ELISA对各种抗trkC促效单克隆抗体与人trkC和大鼠trkC的结合进行了比较。图3显示的结果表明，在人抗trkC单克隆抗体中，只有6.4.1明显识别大鼠trkC，其余的对人trkC有特异性。类似的，在鼠单克隆抗体中，只有2256对大鼠trkC有显著程度的识别，而其余的只对人trkC有特异性识别。
亲和力研究
抗trkC促效单克隆抗体的亲和力用BIAcore-2000TM表面胞质基因组共振(SPR)系统(BIAcore公司，皮斯卡塔市，新泽西州)测定。按照制造商的说明，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化CM5生物传感器芯片。在结合实验的第一系列中，抗原，gD-标记的trkC，被稀释在10mM的醋酸钠缓冲液(pH4.8)中，并以0.09mg/ml的浓度注射到活化的芯片上。使用可变的暴露时间，获得了四种抗原密度范围：14,000-17,000响应单位(RU)、7000-9000RU、2000-3000RU和400-600RU。用乙醇胺封闭芯片。
在动力学测量的第一系列中，将抗trkC抗体(IgG’s)稀释到流动缓冲液(含有0.05％ Tween-20和0.01％叠氮化钠的PBS)中，并在25℃以0.01mL/min的流速将0.03mL(667nM)注射到生物传感器芯片上。用10mM HCL脉冲30秒，然后用100mMTris-HCl(pH8.0)脉冲1分钟，再洗涤两次，这样就获得了再生。
在实验的第二系列中，按上述固定IgG’s(0.1mg/ml，存在于10mM的醋酸钠中，pH4.8)，不同的是抗体的密度被限制在1000-2000RU。然后在生物传感器芯片上注射3.7-29nM的两倍连续稀释的gD-trkC，用于按以上所述进行动力学测量。
每条动力学曲线的解离阶段与单一的解离速度指数(koff)是符合的，用简单的1:1 Langmuir结合模型(Lofas和Johnsson，1980)，这些速度被用来计算注射阶段的缔合速度(kon)。
计算了SPR测量的平衡解离常数Kd’s，并将其作为koff/kon的比例。
抗trkC抗体对gD-trkC的亲和力是在SPR动力学实验中用抗原或固定的抗体测量的。在采用低密度的固定抗原(0.4-0.6ng/mm2)的实验中测定的表观亲和力与在采用固定的IgG的实验中测定的数据通常是一致的(见表2)。然而，在较高密度的固定的gD-trkC时，各个抗体的表观结合亲和力变得渐渐严密多达10倍，这或许是由于被二价IgG结合的亲合力效应造成的(未显示数据)。一些情况下，当trkC被注射到固定的IgG时，没有检测到结合。这可能是由于IgG的固定导致了抗原结合位点的空间阻碍造成的。在所有的测试条件下，所有测试的抗体中，抗体2248有最高的表观亲和力(Kd＝5.6-8.5nM)。
表4
用SPR测定的结合亲和力。结果显示了IgG’s与固定的gD-trkC(400-600RU)的结合以及gD-trkC与固定的IgG’s(1000-3000RU)的结合。NDB表示没有可检测的结合。
Figure C01814421D00511
竞争性ELISA
竞争性ELISA被用来获得有关各种类别的基本信息，这些抗体属于哪个类别取决于它们识别trkC上的抗原表位。在这一测定中，trkC-gD(1μg/ml)被用作捕获抗原以涂布微量滴定平板。在被涂布的平板上单独或在其它抗trkC单克隆抗体存在的情况下(这种单克隆抗体没有被标记，并且是过量使用的(50μg/ml)，以便与标记的抗体比较)加入一种特殊生物素化的抗trkC单克隆抗体(1μg/ml)。如果生物素化的抗体和未标记的抗体都识别同样的或重叠的抗原表位，它们就会竞争以结合到固定的trkC上，这就减少了标记的抗体的结合。如果它们识别不同且不重叠的抗原表位，它们之间就不会竞争，且标记的抗体与固定的trkC的结合就不会收到影响。未标记的人IgG2和小鼠IgG被用作阴性对照。图4中代表性的数据显示，所有的抗trkC单克隆抗体，除了鼠抗trkC 2248单克隆抗体外，都和标记的人抗trkC 6.1.2单克隆抗体竞争以便与固定的trkC结合，这说明鼠22448抗体识别trkC上的抗原表位不同于所有其它的抗trkC抗体识别的抗原表位。有趣的是，当未标记的鼠单克隆抗体2248第一次与固定的trkC结合时，其它(生物素化的)抗体都不能接近它们的结合位点，这说明即便抗原表位是性质不同的，空间阻碍可能起作用。这种成对的比较提供了有价值的信息，并且有助于按照抗原表位识别将针对同一抗原的抗体分成不同的种类。对这种比较的总结显示在图5中。结果说明，抗体可被分成两种性质不同的类别：类别1包括除了2248以外的所有的单克隆抗体，而类别2包括2248。
用结构域切换交换突变体进行抗原表位作图
用嵌合体trkC(其中，各个结构域被trkA或trkB相应的结构域替换)进行进一步的抗原表位作图。这种方法是可能的，因为抗trkC抗体和trkA和trkB没有明显的交叉反应。采用这种结构切换域突变体比缺失突变体有明显的优点。结构域的缺失可能会破坏蛋白质的二级结构，而用相应的有类似大小和基本类似的氨基酸序列的，来自结构域切换突变体中相关蛋白质的结构域取代一个结构域可能保持二级结构。trk受体的胞外域包含有如图6A所示的5个域。D1和D3是半胱氨酸富集的域，D2是亮氨酸富集的域，D4和D5是免疫球蛋白样的域。制得了用trkB或trkA相应的域替换含有D1、D4和D5的trkC的结构域切换突变体(Urfer等，EMBOJ.14：2795-2805[1995])。野生型trkC和野生型trkA分别用作阳性和阴性对照。根据替换的域的来源命名了trkC的结构域切换突变体。例如，s1B有trkB的D1域，s4B有trkB的D4域，s5B有trkB的D5域，s5A有trkA的D5域。所有这些突变体都作为免疫粘附素，即融合到IgG上表达，并纯化。
用ELISA评价了各个抗trkC促效单克隆抗体与各种结构域切换突变体的结合。羊抗人IgG的F(ab’)2片段被用来涂布微量滴定平板以捕获免疫粘附素(以trkC-IgG、trkA-IgG和trkC的结构域切换突变体作为免疫粘附素)的连续稀释(100μg/ml-2.4ng/ml，100μl/孔，室温一小时)。在含有固定的免疫粘附素的平板中加入未标记的人抗trkC的单克隆抗体或生物素化的鼠抗trkC的单克隆抗体(每孔100μl；1μg/ml，室温一小时)，洗涤以除去未结合的过量试剂，并和与HRP共轭连接的羊抗人κ或链霉抗生物素蛋白一起培育。如图6B所示，所有的人抗trkC单克隆抗体都能够识别用D1和D4域替换的trkC结构域切换突变体。然而，用衍生自trkB或trkA的相应的域替换D5域则不能被抗trkC抗体识别。结合的程度降到了与用阴性对照trkA观察到的结果一样低的水平。这些结果说明，所有测试的人抗trkC单克隆抗体识别定位在D5域中某处的抗原表位。
除了用与HRP偶联的羊抗鼠IgG Fc作为第二抗体外，用基本上一样的方法对鼠抗trkC单克隆抗体进行了类似的分析。与人抗trkC的抗体相比，D5域的替换不能够结合所有被测试的鼠抗trkC单克隆抗体(图6B)。此外，D4域的替换也破坏了2248鼠抗trkC抗体的结合。除了2248鼠抗体外，人和鼠的抗trkC促效单克隆抗体似乎识别第5域中的抗原表位，2248鼠抗体似乎另外识别第4域中的一个决定子。显然2248抗原表位是一个与第4域和第5域的边界重叠的线性抗原表位。或者，2248抗体可能识别由不相邻的抗原表位形成含有衍生自第4域和第5域的决定子的二级结构。有趣的是，Urfer等(J.Biol Chem.273：5829-2840[1998])早就确定了trkC受体中第5域在介导与NT-3相互作用中的决定性作用。惊奇的是，这里描述的抗体也能结合trkC的抗原表位，这与NT-3识别的抗原表位有很大的重叠。由于NT-3和免疫球蛋白分子的相对大小和形状这种结果是令人吃惊的。这些活化子可能的作用模式是以这种方式与两种trkC分子的胞外域交联，以将它们细胞内的酪氨酸激酶结构域带到一起，交叉磷酸化并将它们活化。
在同源二聚体的NT-3中，已经证明与trkC相互作用的分子的两个区域在分子相对的侧链上是正好相反的，相互之间相隔180度。这些区域之间的距离大约有16。另一方面，这里描述的免疫球蛋白分子中的两个trkC相互作用位点不是正好相反的。除了trkC结合域以不同于NT-3的角度出现外，免疫球蛋白将使trkC结合域彼此分离，且分隔的距离比它们在NT-3中更大。这将随着两个Fab域的准确角度而改变，但在50
Figure C01814421D0053095409QIETU
-150
Figure C01814421D0053095409QIETU
的范围之内。当结合到trkC上同样的位点时，要预见两个作为NT-3的很不同的交联剂和作为促效剂的促效单克隆抗体是困难的。
定点诱变
定点诱变方法被用来确定第5域的被选定的个体氨基酸残基在被抗trkC抗体识别中的作用。图7显示了人trkC第4域和第5域的氨基酸序列。除了L284、L286和E287残基分别被变成E、H和K以外，所有打点的残基都突变成了丙氨酸(Urfer等，J.Biol.Chem.273:5829-5840[1998])。总共制得了26个单个氨基酸突变，并评价了它们对结合抗trkC单克隆抗体的作用。表5中列出的值代表了结合到突变体的抗trkC抗体与野生型trkC的比例。为使变化最小并提供有效的比较，测定了各个抗体的各个突变体的EC50值，并用野生型trkC得到的EC50值进行了分类。
表5
Figure C01814421D00541
灰色区域说明指定的突变体对单克隆抗体的结合没有初期效果，因此没有再次测定。完全没有单克隆抗体结合的突变以NB(“未观察到结合”)表示。这一分析说明了trkC的氨基酸残基L284、E287和N335在测试的抗trkC促效单克隆抗体识别中的主要作用。trkC第5域和NT3的复合体的模型显示了与抗体的CDR紧密接触的残基的位置(图8)。这一模型基于trkA的第5域与NGF的复合体的表层结构。为进一步了解细节可以参阅，例如Urfer等，J.Biol.Chem.(1998)，同上，或Ultsch等，J.Mol.Biol.290:149-159(1999)。
抗体可变区的克隆和测序
为更好的了解trkC和抗trkC单克隆抗体之间相互作用的分子基础，克隆了促效抗体的重链和轻链可变序列，并测定了DNA序列。用来自Stratagene(拉霍亚，加利福尼亚州)的RNA分离试剂盒，从产生人和鼠抗trkC单克隆抗体的杂交瘤细胞中分离了所有的RNA。用SuperScript II系统(Life Technologies公司，盖瑟斯堡，马里兰州)和基于衍生自各个重链或轻链亚组的框架4序列的特殊的3’引物将RNA反转录入cDNA(Kabat和Wu，J.Immunol.147:1709-1719[1991])。然后用AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer，福斯特市，加利福尼亚州)，在存在2.5M DMSO和特殊的基于重链和轻链的N-末端氨基酸序列的正向引物，以及用于cDNA合成的同样的3’引物的情况下进行PCR扩增。PCR产物被亚克隆入含有人重链和轻链恒定区的F(ab)’2载体(Carter等，Biol/Technology 10:163-167[1992])。VH和VL的5个克隆被测序并获得了共有序列。
图9显示了推导出的抗trkC促效单克隆抗体的重链的氨基酸序列(2250，SEQ IDNo：42；2253，SEQ ID No：43；2256，SEQ ID No：44；6.1.2，SEQ ID No：45；6.4.1，SEQ ID No：46；2345，SEQ ID No：47；和2349，SEQ ID No：48)。推导出的抗trkC促效单克隆抗体的轻链的氨基酸序列显示在图10中(2250，SEQ ID No：49；2253，SEQ ID No：50；2256，SEQ ID No：51；6.1.2，SEQ ID No：52；6.4.1，SEQ ID No：53；2345，SEQ ID No：54；和2349，SEQ ID No：55)。在图9和图10中，互补性决定区(CDR)被标成CDR1、CDR2和CDR3，相应的氨基酸残基以黑体显示。图11总结了各种抗trkC单克隆抗体的重链和轻链的CDR序列，并指出了它们所属的各自的重链和轻链可变家族。
根据所确定的抗trkC促效单克隆抗体的重链和轻链CDR的氨基酸序列，有可能为这些区域中几个提供一般的结构式。对于鼠抗体，重链CRD1可以用结构式XaaWXaaXaaWVK(SEQ ID No：37)表示，其中位置1上的Xaa是F或Y；位置3上的Xaa是I或M；位置4上的Xaa是E或H。鼠重链CDR2可以用结构式EIXaa Pxaa XaaXaa Xaa TNYNEKFK Xaa(SEQ ID No：38)表示，其中位置3上的Xaa是L或Y；位置5上的Xaa是G或S；位置6上的Xaa是S或N；位置7上的Xaa是D或G；位置8上的Xaa是N或R；位置17上的Xaa是G或S。鼠重链CDR3可以用结构式KNRNYYGNYVV(SEQ ID No：12)或KYYYGNSYRSWYFDV(SEQ ID No：13)表示。对于人抗体，重链CDR1可以用结构式XaaXaaXaaYYWXaa(SEQ ID No：39)表示，其中位置1上的Xaa是S或I；位置2上的Xaa是G或S；位置3上的Xaa是G、T或Y；位置7上的Xaa是S或N。人重链CDR2可以用结构式XaaIXaaXaaSGSXaaTXaaNPSLKS(SEQID No：40)表示，其中位置1上的Xaa是Y或F；位置3上的Xaa是Y或F；位置4上的Xaa是Y或T；位置8上的Xaa是S或R；位置10上的Xaa是N或Y。人重链CDR3可以用结构式DRDYDSTGDYYSYYGMDV(SEQ ID No：14)、DGGYSNPFD(SEQ ID No：15)或ERIAAAGXaaDYYYNGLXaaV(SEQ ID No：41)表示，其中位置8上的Xaa是A或T；位置16上的Xaa是D或A。
对这些抗体的N-末端肽序列的测定证实了推导出的重链和轻链可变区的氨基酸序列。在BioRad电转移印迹槽中用250mA恒定电流在Millipore Immobilon-PSQ膜上进行1小时电印迹(Matsudaira，J.Biol.Chem.262：10035-10038[1987])。用含50％甲醇中的0.1％的考马斯蓝R-250将PVDF膜染色0.5分钟，并用50％甲醇中的10％醋酸褪色2-3分钟。用水将膜彻底洗涤并在贮存于20℃前使其干燥。在装有在线PTH分析器的型号494A Perkin-Elmer测序仪(Perkin-Elmer公司，福斯特市，加利福尼亚州)上进行自动蛋白质测序。在6mm微型玻璃筒中对电印迹在PVDF膜上的蛋白质进行测序。采用Nelson Analytical 760界面，用Justice Innovation软件对峰进行积分。在DECα上进行序列翻译(Henzel等，J.Chromatography404：41-52[1987])。表6总结了基于它们的N-末端序列的人和鼠抗trkC-促效单克隆抗体的分类。
表6
人抗trkC促效单克隆抗体      重链        轻链
6.1.2                      亚组II       κI
6.4.1                      亚组II       κI
2345                       亚组II       κIII
2349                       亚组II       κIII
2.5.1                      亚组II       κI
2344                       亚组II       κI
鼠抗trkC促效单克隆抗体
2248亚                     组IIA        κI
2250亚                     组IIA        κI
2253亚                     组IIA        κIV
2256                       亚组IIA      κIII
实施例2 实验动物模型中抗trkC促效单克隆抗体对神经病的作用
实验动物模型
NT-3促效剂的主要用途是治疗和/或预防周围神经病。已知与介导本体感觉和振动感觉有关的大纤维有髓感觉神经元，表达作为NT-3高亲和受体的trkC。与大纤维有关的神经病在糖尿病中是常见的，它也可以因响应某些化学治疗剂尤其是顺氯氨铂和吡哆醇而被诱导。NT-3在实验性糖尿病型神经病和顺氯氨铂诱导的神经病的动物模型中是有效的。然而，由于啮齿动物模型中显示的生物利用率差，NT-3的用途受到了严重限制。作为NT-3促效剂的抗trkC单克隆抗体的应用提供了很多优点，并排除了许多与使用NT-3有关的潜在的问题。
通过对实验动物进行静脉或皮下注射测定了抗trkC促效单克隆抗体的体内半衰期。图12显示了在大鼠中以1mg/kg静脉(IV)注射或以5mg/kg皮下(subQ)注射后，不同时间单克隆抗体2256的血清水平。血清水平是用KIRA测定法测定的，以便根据它提高trkC的酪氨酸自发磷酸化的能力测定全功能抗体2256的量。这些数据说明，大鼠中单克隆抗体2256的半衰期为9天，皮下用药后的生物利用率为69％。这些值与用其它抗体获得的值是一致的，而与用NT3获得的那些值却明显不同。在图12中还显示了用与单克隆抗体2256(1mg/kg，IV；5mg/kg subQ)一样的剂量和途径注射NT-3后所得的数据。这些数据表明NT-3的血清半衰期约为4-5分钟，皮下生物利用率为7％。这些数据表明，在生物利用率和体内血清半衰期这些非常重要的性质上，抗体比NT3有显著的改进。
已显示，在两个大纤维感觉神经病的动物模型中，NT-3可以保护或逆转化学损伤的作用。很高剂量的NT3保护大纤维感觉神经元免受高剂量吡哆醇的毒性作用，中等剂量的NT3逆转施用顺氯氨铂的作用。尽管NT-3的组织分布以及这里所描述的促效单克隆抗体可能有很多不同，但重要的是确定单克隆抗体的体外活性是否能够在动物模型中转变成疗效。
为建立顺氯氨铂诱导的神经病的动物模型，连续16周每周两次以1mg/kg的剂量腹膜内(IP)向成年大鼠施用顺氯氨铂。此时，将大鼠分成4组。所有4组大鼠继续每周接受两次顺氯氨铂。除了继续施用顺氯氨铂外，一组大鼠接受了每周三次的1mg/kg剂量的NT-3，一组接受了每周一次的1mg/kg剂量的单克隆抗体2256，一组接受了每周一次的1mg/kg剂量的单克隆抗体6.4.1，一组接受每周一次的盐水。NT-3剂量是皮下给予的，而单克隆抗体和盐水是静脉施用的。这种处理方式持续了四周，即总共施用了20周的顺氯氨铂。
采用H-波记录仪，从电生理学上检测了这些动物中大纤维感觉神经元的功能(Gao等，Ann.Neurol.38(1)：30-7[1995])。从图13显示的数据中可以看出，在单独用顺氯氨铂和盐水处理的动物中感觉传导速度很慢。一周三次NT-3处理提高了这种较低的传导速度，用单克隆抗体2256或单克隆抗体6.4.1每周处理一次的结果也是这样。用单克隆抗体每周处理一次得到的提高的数量级至少与用NT-3每周处理三次得到的结果一样大。
已知吡哆醇也诱导感觉神经病，它主要损伤感觉神经元的大的有髓亚群(Helegren等，J.Neurosci.17(1)：372-82[1997])。高剂量的NT3阻止这种神经病的发展(Helgren等，同上)。用两种不同剂量的吡哆醇(每天400mg/kg或600mg/kg，IP)处理动物两周会对DRG的大神经元造成损伤。这种损伤可以通过已知被DRG中的大神经元优先表达或唯一表达的几种蛋白质的表达量的减少来检测。这些标记的表达水平是通过用TAQMAN RT-PCR技术测量编码它们的mRNA水平而检测的。
用来检测trkC促效剂作用的Taqman RT-PCR
A.探针和引物
NFL
    F-CAGCAGAACAAGGTCCTGGAA       21MER(SEQ ID No：72)
    R-AGCGGGAAGGCTCTGAGTG         19MER(SEQ ID No：73)
    P-AGCTGTTGGTGCTGCGCCAGAA      22MER(SEQ ID No：74)
NSE
    F-TCCATTGAAGACCCATTCGAC       21MER(SEQ ID No：75)
    R-GCCGACATTGGCTGTGAAC         19MER(SEQ ID No：76)
    P-AGGATGACTGGGCAGCTTGGTCCA    24MER(SEQ ID No：77)
TRKC
    F-CAGCCCACTGCACCATATCA        20MER(SEQ ID No：78)
    R-CTGTATCCGGCCCAGCAT          18MER(SEQ ID No：79)
    P-CCATGGCATCACTACACCTTCATCGCT 27MER(SEQ ID No：80)
CALRET
    F-TGGGAAAATTGAGATGGCAGA       21MER.(SEQ ID No：81)
    R-GCTGCCTGAAGCACAAAAGG        20MER(SEQ ID No：82)
    P-CGCAGATCCTGCCAACCGAAGAGA    24MER(SEQ ID No：83)
PARVALB
    F-GACACCACTCTTCTGGAAAATGC     23MER(SEQ ID No：84)
    R-TTGCCAAACCAACACCTACCA       21MER(SEQ ID No：85)
    P-ATCGGACACCACCTGTAGGGAGGACC  26MER(SEQ ID No：86)
GAPDH
    F-CAGTGGCAAAGTGGAGATTGT       21MER(SEQ ID No：87)
    R-AATTTGCCGTGAGTGGAGTC        20MER(SEQ ID No：88)
    P-CCATCAACGACCCCTTCATTGACCTC  26MER(SEQ ID No：89)
探针和引物是用Primer Express(ABI-Perkin-Elmer)设计的。有关引物探针选择的原则描述在Williams和Tucker(1999)的PCR applications，第365-75页(学术出版社)。
B.总RNA的制备和定量
从磷酸缓冲盐溶液灌注的大鼠中解剖出L4和L5。左侧和右侧被隔离在独立的试管中。为得到用在标准曲线中的总RNA，从对照大鼠中解剖出所有的DRG。用Qiagen Rneasy小柱分离总的RNA。按照各个制造商的说明将组织匀浆。按照制造商的说明，用Ribogreen Quantitation试剂盒(Molucular Probe)将总的RNA定量。
C.RT-PCR
每50μl反应用25纳克总RNA，不同的是，在标准曲线反应中每个反应分别使用500、250、25或2.5纳克。每个反应含有25pmol的各寡核苷酸引物、0.2mM的各dNTP、100mM荧光标记的寡核苷酸探针、1X RT-PCR缓冲液(PE biosystems)、2.0mM MgCl2、20U RNA酶抑制剂、12.5MuLV逆转录酶(RT，PE biosystems)和2.5UAmplitaq Gold聚合酶(PE biosystems)。在48摄氏度下进行30分钟逆转录，然后在95摄氏度10分钟使Amplitaq Gold活化并使RT失活，然后进行PCR；在95摄氏度进行40次循环，每次15秒钟，然后在60摄氏度保持1分钟或半分钟。
D.基因表达定量
采用各个taqman run用对照RNA产生管家基因和感兴趣的基因的标准曲线。通过绘制与加入的对照总RNA的量的对数值比较的得自Taqman run的阈循环(Ct)值可以获得标准曲线。解出了所得的线性方程以得到RNA值的对数。插入实验的Ct值产生了实验基因表达值的对数。这些值的10次幂使实验基因表达达到了纳克数量级。
从图14中可见，用吡哆醇处理两周导致神经丝轻链(NFL)、神经元特异性烯醇酶(NSE)、trkC和钙视网膜蛋白(calretinin)表达中剂量依赖性下降。剂量依赖性和它们下降的数量级在标记和标记之间是不同的，这说明这些作为神经元损伤标记的蛋白质有不同的敏感性。
在图15中，显示了单独用两倍剂量的单克隆抗体2256和低剂量(每天400mg/kg)的吡哆醇处理动物的结果。NFL和NSE显示在此水平的吡哆醇处理时提高了表达。用5mg/kg的单克隆抗体2256(subQ，每周)一起处理动物完全阻止了这种表达的减少。1mg/kg剂量的单克隆抗体2256对这些蛋白质的表达没有明显的作用。trkC和钙视网膜蛋白的表达都没有明显受到这种低剂量吡哆醇处理的影响，但用5mg/kg的单克隆抗体2256处理使trkC的表达超过了对照水平。
当用每天600mg/kg的较高吡哆醇剂量处理动物时，NFL、NSE和钙视网膜蛋白的表达降到了非常低的水平，而trkC的表达降到了对照值的约50％(图16)。用1mg/kg或5mg/kg的单克隆抗体2256共同处理没有完全阻止trkC和钙视网膜蛋白表达的减少。在用单克隆抗体2256处理的动物中，NFL和NSE的表达有些许保护倾向，但这没有获得统计显著性。因此，使用损害大感觉神经元的多生化标记，单克隆抗体2256能够改善吡哆醇处理的毒性。
为检测吡哆醇神经病的电生理学和行为学效果，每天两次向大鼠注射400mg/kg的吡哆醇，共注射8天。用电生理学方法测试了它们的大直径感觉传入的功能，方法是在大腿和腓肠刺激坐骨神经后，在足部的肌肉中记录M-波(直接运动)和H-波(反射感觉)的响应(Gao等，Ann.Neurol.38(1)：30-7[1995])。从图18可见，与运动神经响应相比，用吡哆醇处理8天使感觉响应的幅度大大减小。和单克隆抗体2256一起处理明显阻碍了吡哆醇诱导的感觉幅度的减小。这与用很高剂量(每天20mg/kg)的NT3得到的效果是类似的。
还在行为上对用这种方法以吡哆醇处理的动物的本体感受功能进行了测试。训练它们穿过平行的梯子以躲避光亮和白噪声的刺激从而进入暗盒。从下面对动物进行录像，它们的后爪在梯子横档上的位置质量可以由隐蔽起来的观察者读出。每个爪位被记录成好的位置(爪以跖骨前部着地，紧接在脚趾后面，用脚趾立即包住横档)，稳固着陆(爪没有碰到后脚趾，而是稳固的放在横档上，脚趾通常没有包住横档)、接近脚步犯规(爪仅仅以脚趾的最前端或以脚跟的后部碰到横档，但能够支持体重)或脚步犯规(爪完全没有碰到横档或放得很不好以致足不能支持体重并从梯子上掉下去)。通常，大鼠能够非常快的学会将它们的后爪正确放置，这要求对前爪所放的位置有出色的本体感觉。用吡哆醇处理后(400mg/kg，每天两次，8天)，在这项任务上的表现下降了，好的定位下降了大约30％，而脚步犯规和接近脚步犯规都上升了(图18)。在比期间用单克隆抗体2256一起处理动物，使动物在这项表现上保持了高得多的水平，好的定位下降较小而脚步犯规和接近脚步犯规上升较小。
总之，用生化、电生理学方法测量以及通过行为任务的表现，用单克隆抗体2256一起处理能够改善吡哆醇的毒性效果。
在确信trkC单克隆抗体在治疗上至少和NT-3一样有效后，检测了痛觉过敏的表观负面作用。在啮齿动物(见图19)和人(Chaudhary等，Muscle and Nerve23：189-192[2000])中观察到了施用NT-3的副作用。大鼠被训练并用Hargreaves装置检测了它们后爪的热灵敏度，然后在颈背皮下施用1mg/kg的单克隆抗体2256IV，或1mg/kg NT-3。在施用2、4和6小时后，再次测试大鼠的热退缩时间。从图19中可以看出，在用药4和6小时后，NT-3的施用造成了明显的热痛觉过敏，而用trkC单克隆抗体2256则对热痛觉没有任何反应。因此，在已知可有效逆转或预防神经病的剂量下，NT-3增加对痛觉的灵敏度，而单克隆抗体2256则没有。
一种广泛使用的化学治疗剂顺氯氨铂，能诱导振动感觉和本体感觉选择性丧失的感觉神经病。这里我们证明神经营养蛋白-3(NT-3)，神经营养因子的神经生长因子家族的一名成员，在大鼠中能够将顺氯氨铂诱导的下降的与H-反射相关的感觉神经传导速度恢复到正常的水平。NT-3治疗纠正了背根神经节中大感觉神经元的神经丝蛋白异常的胞质分布，并纠正了由顺氯氨铂造成的腓肠神经中有髓纤维数量的减少。NT-3依赖的顺氯氨铂神经毒性的逆转提示了用NT-3治疗周围感觉神经病的可能性。
用高剂量的吡哆醇(维生素B6)慢性处理成年大鼠2-3周使本体感觉严重受损，这类似于在人中发现的用过量维生素或用化学治疗剂顺氯氨铂处理的现象。吡哆醇的毒性表现为简单和精确运动和感觉神经功能的缺乏以及大直径/大纤维脊椎感觉神经元的退化。在走横杆任务中，对用EMG记录的周围神经刺激激发的H波进行定量估计，在慢性吡哆醇处理中用神经营养因子神经营养蛋白-3(NT-3；5-20mg/kg/天，s.c.)一起处理大大减轻了与吡哆醇毒性有关的行为学和电生理学的遗症。此外，NT-3的施用预防了脊髓的背柱中感觉纤维的退化。这些数据与这一证据是一致的，即NT-3是肌肉感觉传入的靶衍生的神经营养因子，并提示药理学剂量的NT-3有利于治疗大纤维感觉神经病。
生物材料的存储
以下杂交瘤细胞系和质粒已于2000年6月21日保存于美国模式培养物保藏所，10801大学路，马纳萨斯，弗吉尼亚洲20110-2209，美国(ATCC)：
杂交瘤/质粒名称            ATCC编号
2.5.1                      PTA-2151
6.1.2                      PTA-2148
6.4.1                      PTA-2150
2344                       PTA-2144
2345                       PTA-2146
2349                       PTA-2153
2248                       PTA-2147
2250                       PTA-2149
2253                       PTA-2145
2256                       PTA-2152
DNA pXCA-2250HL            PTA-2136
DNA pXCA-2253HL            PTA-2137
DNA pXCA-2256HL            PTA-2138
DNA pXCA-6.1.2H            PTA-2141
DNA pXCA-6.4.1H            PTA-2143
DNA pXCA-2345HL            PTA-2142
DNA pXCA-2349HL            PTA-2133
DNA vegf4chim-6.1.2L       PTA-2134
DNA vegf4chim-6.4.1L       PTA-2135
DNA vegf4chim-2345L        PTA-2139
DNA vegf4chim-2349L        PTA-2140
保藏是在国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约(以下简称为布达佩斯条约)下进行的。它保证从保藏之日起保持活性培养物30年。根据布达佩斯条约，ATCC使这些生物可以获得，并服从基因技术公司和ATCC之间的协议，这份协议保证，在公布相关美国专利或向公众公开任何美国或外国专利申请后，无论哪个在先，公众可以永久并无条件的获得这些培养物的后代，并保证根据35 USC§122和按照其专员规则(包括特别涉及886 OG 638的37 CFR§1.12)授权的美国专利和商标专员决定个人可以得到的后代。
至于欧洲专利局检索的那些专利，保藏微生物的样品直至欧洲专利局允许公开后或直至专利申请被拒绝或驳回或视为未提交后，由索要样品的人提名的专家才可以获得这种样品。(条约28(4)EPC)
本发明的受让人同意，当在合适的条件下培养时，如果保藏的培养物死亡或丢失或被破坏，他们将立即公告用同一培养物的活的样品替换。保藏的菌种的利用率不能理解为许可在违反任何政府当局根据其专利法授予的权利的情况下实施本发明。
上面的说明书被认为足以使此领域的技术人员实施本发明。本发明并未限制保藏的构建物的范围，因为存储的实施例只是为了阐述本发明的某些方面，功能等价的任何构建物都包括在本发明的范围内。这里保藏的材料不构成一种允许，即本说明书不足以能实施本发明的任何方面，包括其最佳模式，且不能理解为限制了它们所代表的特别列出的权利要求的范围。实际上，除了上面的描述，从前面的说明书中，对本发明作出的许多修改对于精通此领域的技术人员都是显而易见的，并都在附加的权利要求的范围之内。
应该理解，考虑到这里所含的说明，本发明关于特殊问题或情况的指导的申请是在此领域一般技术人员的能力之内。本发明产品的例子和分离、使用的代表性的过程和生产商将在下面显示，但不是限制本发明。
在此全文引入说明书和参考资料中提到的所有的参考文献以供参考。
序列表
<110>基因技术股份有限公司(Genentech，Inc.)
     B.德沃(Devaux，Brigitte)
     J.-A.S.弘勾(Hongo，Jo-Anne S.)
     L.G.普雷斯塔(Presta，Leonard G.)
     D.L.谢尔顿(Shelton，David L.)
<120>抗TRK-C拮抗剂的单克隆抗体
<130>GENENT.040QPC
<140>60/238,319
<141>2000-10-05
<160>89
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>7
<212>PRT
<213>鼠
<400>1
Figure C01814421D00641
<210>2
<211>7
<212>PRT
<213>鼠
<400>2
Figure C01814421D00642
<210>3
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
Figure C01814421D00643
<210>4
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
Figure C01814421D00651
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>5
Figure C01814421D00652
<210>6
<211>17
<212>PRT
<213>鼠
<400>6
<210>7
<211>17
<212>PRT
<213>鼠
<400>7
Figure C01814421D00654
<210>8
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>8
Figure C01814421D00655
<210>9
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>9
Figure C01814421D00661
<210>10
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>10
Figure C01814421D00662
<210>11
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>11
Figure C01814421D00663
<210>12
<211>11
<212>PRT
<213>鼠
<400>12
Figure C01814421D00664
<210>13
<211>15
<212>PRT
<213>鼠
<400>13
Figure C01814421D00665
<210>14
<211>18
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>14
Figure C01814421D00666
Figure C01814421D00671
<210>15
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>15
Figure C01814421D00672
<210>16
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>16
Figure C01814421D00673
<210>17
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>17
Figure C01814421D00674
<210>18
<211>15
<212>PRT
<213>鼠
<400>18
Figure C01814421D00675
<210>19
<211>10
<212>PRT
<213>鼠
<400>19
Figure C01814421D00681
<210>20
<211>15
<212>PRT
<213>鼠
<400>20
Figure C01814421D00682
<210>21
<211>11
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>21
Figure C01814421D00683
<210>22
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>22
Figure C01814421D00684
<210>23
<211>12
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>23
Figure C01814421D00685
<210>24
<211>12
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>24
Figure C01814421D00691
<210>25
<211>7
<212>PRT
<213>鼠
<400>25
Figure C01814421D00692
<210>26
<211>7
<212>PRT
<213>鼠
<400>26
Figure C01814421D00693
<210>27
<211>7
<212>PRT
<213>鼠
<400>27
Figure C01814421D00694
<210>28
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>28
Figure C01814421D00695
<210>29
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>29
Figure C01814421D00701
<210>30
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>30
Figure C01814421D00702
<210>31
<211>9
<212>PRT
<213>鼠
<400>31
Figure C01814421D00703
<210>32
<211>9
<212>PRT
<213>鼠
<400>32
Figure C01814421D00704
<210>33
<211>9
<212>PRT
<213>鼠
<400>33
Figure C01814421D00705
<210>34
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>34
Figure C01814421D00706
1           5
<210>35
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>35
Figure C01814421D00711
<210>36
<211>10
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>36
Figure C01814421D00712
<210>37
<211>7
<212>PRT
<213>鼠
<220>
<221>UNSURE
<222>1
<223>Xaa＝F或Y
<221>UNSURE
<222>3
<223>Xaa＝I或M
<221>UNSURE
<222>4
<223>Xaa＝E或H
<400>37
Figure C01814421D00713
<210>38
<211>17
<212>PRT
<213>鼠
<220>
<221>UNSURE
<222>3
<223>Xaa＝L或Y
<221>UNSURE
<222>5
<223>Xaa＝G或S
<221>UNSURE
<222>6
<223>Xaa＝S或N
<221>UNSURE
<222>7
<223>Xaa＝D或G
<221>UNSURE
<222>8
<223>Xaa＝N或R
<221>UNSURE
<222>17
<223>Xaa＝G或S
<400>38
Figure C01814421D00721
<210>39
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>UNSURE
<222>1
<223>Xaa＝S或I
<221>UNSURE
<222>2
<223>Xaa＝G或S
<221>UNSURE
<222>3
<223>Xaa＝G，T或Y
<221>UNSURE
<222>7
<223>Xaa＝S或N
<400>39
Figure C01814421D00731
<210>40
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>UNSURE
<222>1
<223>Xaa＝Y或R
<221>UNSURE
<222>3
<223>Xaa＝Y或F
<221>UNSURE
<222>4
<223>Xaa＝Y或T
<221>UNSURE
<222>8
<223>Xaa＝S或R
<221>UNSURE
<222>10
<223>Xaa＝N或Y
<400>40
Figure C01814421D00732
<210>41
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>UNSURE
<222>8
<223>Xaa＝A或T
<221>UNSURE
<222>16
<223>Xaa＝D或A
<400>41
Figure C01814421D00733
<210>42
<211>122
<212>PRT
<213>鼠
<400>42
<210>43
<211>122
<212>PRT
<213>鼠
<400>43
Figure C01814421D00743
<210>44
<211>126
<212>PRT
<213>鼠
<400>44
Figure C01814421D00751
<210>45
<211>130
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>45
Figure C01814421D00752
<210>46
<211>119
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>46
Figure C01814421D00761
<210>47
<211>129
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>47
Figure C01814421D00762
<210>48
<211>129
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>48
Figure C01814421D00771
<210>49
<211>112
<212>PRT
<213>鼠
<400>49
Figure C01814421D00772
<210>50
<211>109
<212>PRT
<213>鼠
<400>50
Figure C01814421D00773
Figure C01814421D00781
<210>51
<211>114
<212>PRT
<213>鼠
<400>51
Figure C01814421D00782
<210>52
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>52
Figure C01814421D00783
Figure C01814421D00791
<210>53
<211>116
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>53
Figure C01814421D00792
<210>54
<211>112
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>54
Figure C01814421D00793
<210>55
<211>112
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>55
Figure C01814421D00802
<210>56
<211>808
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>56
Figure C01814421D00803
Figure C01814421D00811
Figure C01814421D00821
<210>57
<211>2607
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>57
Figure C01814421D00822
Figure C01814421D00831
<210>58
<211>360
<212>DNA
<213>鼠
<400>58
Figure C01814421D00832
<210>59
<211>330
<212>DNA
<213>鼠
<400>59
Figure C01814421D00841
<210>60
<211>360
<212>DNA
<213>鼠
<400>60
Figure C01814421D00842
<210>61
<211>321
<212>DNA
<213>鼠
<400>61
<210>62
<211>372
<212>DNA
<213>鼠
<400>62
Figure C01814421D00844
<210>63
<211>336
<212>DNA
<213>鼠
<400>63
Figure C01814421D00851
<210>64
<211>381
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>64
Figure C01814421D00852
<210>65
<211>330
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>65
Figure C01814421D00853
<210>66
<211>381
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>66
Figure C01814421D00854
<210>67
<211>330
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>67
Figure C01814421D00861
<210>68
<211>384
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>68
Figure C01814421D00862
<210>69
<211>324
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>69
<210>70
<211>354
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>70
Figure C01814421D00864
<210>71
<211>342
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>71
Figure C01814421D00871
<210>72
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>72
Figure C01814421D00872
<210>73
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>73
Figure C01814421D00873
<210>74
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>74
Figure C01814421D00874
<210>75
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>75
Figure C01814421D00875
<210>76
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>76
Figure C01814421D00881
<210>77
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>77
Figure C01814421D00882
<210>78
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>78
Figure C01814421D00883
<210>79
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>79
Figure C01814421D00884
<210>80
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>80
Figure C01814421D00891
<210>81
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>81
Figure C01814421D00892
<210>82
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>82
Figure C01814421D00893
<210>83
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>83
Figure C01814421D00894
<210>84
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>84
Figure C01814421D00895
<210>85
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>85
Figure C01814421D00901
<210>86
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>86
Figure C01814421D00902
<210>87
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>87
Figure C01814421D00903
<210>88
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>88
<210>89
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>89
Figure C01814421D00905

Claims (62)

1、一种抗trkC促效单克隆抗体，其特征在于，
(a)未显示显著的和trkA或trkB的交叉反应；并且
(b)识别trkC第5域中包含氨基酸残基L284、E287和N335的抗原表位。
2、如权利要求1所述的抗体，其特征在于，它可进一步识别trkC第4域中的抗原表位。
3、如权利要求1所述的抗体，其特征在于，它可以结合人和大鼠trkC。
4、如权利要求1所述的抗体，其特征在于，它是人抗体。
5、如权利要求1所述的抗体，其特征在于，它是鼠抗体。
6、如权利要求5所述的抗体，其特征在于，它是人源化的。
7、如权利要求1所述的抗体，它可有效治疗顺氯氨铂或吡哆醇诱导的神经病。
8、如权利要求1所述的抗体，它可有效治疗糖尿病型神经病。
9、如权利要求1所述的抗体，其特征在于，当向患者施用时它不会引起痛觉过敏。
10、如权利要求1所述的抗体，其特征在于，它与NT-3相比提高了生物利用率。
11、如权利要求1所述的抗体，其特征在于，它的比活性高于NT-3。
12、一种含有以下CDR的抗trkC抗体重链：选自SEQ ID NOs：1、2、3、4和5号的CDR1；选自SEQ ID NOs：6、7、8、9、10和11号的CDR2；以及选自SEQ ID NOs：12、13、14、15、16和17号的CDR3。
13、一种含有以下CDR的抗trkC抗体轻链：选自SEQ ID NOs：18、19、20、21、22、23和24号的CDR1；选自SEQ ID NOs：25、26、27、28、29和30号的CDR2；以及选自SEQ ID NOs：31、32、33、34、35和36号的CDR3。
14、一种含有以下CDR的鼠抗trkC抗体重链：
(a)有XaaWXaaXaaWVK(SEQ ID No：37)式的CDR1，其中位置1上的Xaa是F或Y；位置3上的Xaa是I或M；位置4上的Xaa是E或H；
(b)有EIXaaPXaaXaaXaaXaaTNYNEKFKXaa(SEQ ID No：38)式的CDR2，其中位置3上的Xaa是L或Y；位置5上的Xaa是G或S；位置6上的Xaa是S或N；位置7上的Xaa是D或G；位置8上的Xaa是N或R；位置17上的Xaa是G或S；以及
(c)有KNRNYYGNYVV(SEQ ID No：12)或KYYYGNSYRSWYFDV(SEQ ID No：13)式的CDR3。
15、一种含有以下CDR的人抗trkC抗体重链：
(a)有XaaXaaXaaYYWXaa(SEQ ID No：39)式的CDR1，其中位置1上的Xaa是S或I；位置2上的Xaa是G或S；位置3上的Xaa是G、T或Y；位置7上的Xaa是S或N；
(b)有XaaIXaaXaaSGSXaaTXaaNPSLKS(SEQ ID No：40)式的CDR2，其中位置1上的Xaa是Y或R；位置3上的Xaa是Y或F；位置4上的Xaa是Y或T；位置8上的Xaa是S或R；位置10上的Xaa是N或Y；以及
(c)有DRDYDSTGDYYSYYGMDV(SEQ ID No：14)；DGGYSNPFD(SEQID No：15)；ERIAAAGXaaDYYYNGLXaaV(SEQ ID No：41)式的CDR3，其中位置8上的Xaa是A或T；位置16上的Xaa是D或A。
16、一种抗trkC促效单克隆抗体，它由含有如权利要求14所述的鼠抗trkC抗体重链的CDR的重链和轻链结合组成。
17、如权利要求16所述的抗体，它包括人框架残基。
18、如权利要求17所述的抗体，其特征在于，它没有显示显著的和trkA和trkB的交叉反应。
19、如权利要求17所述的抗体，它具有由两个二硫键连接的抗体重链-轻链对组成的同四聚体结构。
20、如权利要求17所述的抗体，其特征在于，它是选自Fv、Fab、Fab′、和F(ab′)2片段的抗体片段。
21、一种抗trkC促效单克隆抗体，它由如权利要求15所述的人抗trkC抗体重链和人抗体轻链结合组成。
22、如权利要求21所述的抗体，其特征在于，没有显示显著和trkA和trkB的交叉反应。
23、如权利要求22所述的抗体，它具有由两个二硫键连接的抗体重链-轻链对组成的同四聚体结构。
24、如权利要求22所述的抗体，其特征在于，它是选自Fv、Fab、Fab′和F(ab′)2片段的抗体片段。
25、如权利要求22所述的抗体，其特征在于，它是IgG。
26、如权利要求25所述的抗体，其特征在于，它是IgG-2或IgG-4。
27、一种选自抗体2250、2253和2256的鼠抗trkC促效单克隆抗体，其中所述抗体2250、2253和2256具有图9所示重链序列和图10所示轻链序列。
28、一种选自抗体6.1.2.、6.4.1、2345和2349的人抗trkC促效单克隆抗体，其中所述抗体6.1.2.、6.4.1、2345和2349具有图9所示重链序列和图10所示轻链序列。
29、一种编码如权利要求27所述的鼠抗trkC促效单克隆抗体的分离的核酸分子。
30、一种编码如权利要求28所述的人抗trkC促效单克隆抗体的分离的核酸分子。
31、一种含有如权利要求29-30中任何一项所述的核酸分子的载体。
32、一种用如权利要求29-30中任何一项所述的核酸分子转化的宿主细胞。
33、一种用如权利要求29-30中任何一项所述的核酸分子转化的杂交瘤细胞系。
34、一种用如权利要求33所述的杂交瘤细胞系产生的抗体。
35、一种编码抗trkC促效单克隆抗体重链的分离的核酸分子，所述核酸分子选自SEQ ID No：58、SEQ ID No：60、SEQ ID No：62、SEQ ID No：64、SEQ ID No：66、SEQ ID No：68和SEQ ID No：70。
36、一种编码抗trkC促效单克隆抗体轻链的分离的核酸分子，所述核酸分子选自SEQ ID No：59、SEQ ID No：61、SEQ ID No：63、SEQ ID No：65、SEQ ID No：67、SEQ ID No：69和SEQ ID No：71。
37、一种含有如权利要求35或36所述的核酸分子的载体。
38、一种用如权利要求35或36所述的核酸分子转化的宿主细胞。
39、一种用如权利要求35的所述的核酸分子和如36所述的核酸分子转化的宿主细胞。
40、一种用如权利要求35或36所述的核酸分子转化的杂交瘤细胞。
41、一种用如权利要求35所述的核酸分子和如36所述的核酸分子转化的杂交瘤细胞。
42、一种用如权利要求40所述的杂交瘤细胞产生的抗体。
43、一种用如权利要求41所述的杂交瘤细胞产生的抗体。
44、一种由如权利要求35或36所述的核酸分子编码的多肽。
45、一种含有如权利要求35所述的核酸分子和如36所述的核酸分子编码的多肽链的多肽。
46、一种药物组合物，它含有有效量的如权利要求1、16和21中任何一项所述的抗trkC促效单克隆抗体，并与一种药学上可接受的载体混合。
47、如权利要求1所述的抗体在制备用于治疗神经病或神经退化病症、或修复受损神经细胞的药物中的用途，所述治疗包括向哺乳动物施用有效量的如权利要求1所述的抗体。
48、如权利要求47所述的用途，其特征在于，所述神经病选自周围神经病、糖尿病型神经病和大纤维感觉神经病。
49、如权利要求47所述的用途，其特征在于，所述神经退化病症是肌萎缩侧索硬化症(ALS)。
50、如权利要求47所述的用途，其特征在于，所述神经细胞是感觉神经元或运动神经元。
51、如权利要求50所述的用途，其特征在于，所述感觉神经元来自背跟神经节。
52、如权利要求50所述的用途，其特征在于，所述运动神元来自脊髓。
53、如权利要求47所述的用途，其特征在于，所述施用方法是静脉或皮下的。
54、如权利要求47所述的用途，其特征在于，所述施用方法是局部的。
55、如权利要求1、16或21所述的抗体在制备用于增强周围神经元增殖、维持或再生的药物中的用途，所述增强包括使所述神经元与有效量的如权利要求1、16或21所述的抗体接触。
56、编码如权利要求1所述的抗trkC抗体的核酸在制备用于在哺乳动物受试者中治疗与细胞退化有关的疾病或症状的药物中的用途，所述治疗是在受试者的细胞中引入编码如权利要求1所述的抗trkC抗体的核酸。
57、如权利要求56所述的用途，其特征在于，疾病或症状选自神经病、神经退化疾病和神经细胞损伤。
58、如权利要求56所述的用途，其特征在于，所述细胞是神经细胞。
59、如权利要求56所述的用途，其特征在于，所述核酸在体外被引入所述细胞。
60、如权利要求56所述的用途，其特征在于，所述核酸在体内被引入所述细胞。
61、如权利要求1所述的抗trkC抗体在制备用于诱导血管生成的药物中的用途，所述诱导包括以有效诱导血管生成的量传递如权利要求1所述的抗trkC抗体。
62、一种生产抗trkC促效抗体的方法，其中所述抗体识别trkC第5域中包含氨基酸残基L284、E287和N335的抗原表位。
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