KR20070107756A

KR20070107756A - 슈도모나스 애루기노사 혈청형 ｉａｔｓｏ１１의지질다당류에 특이적인 인간 단일 클론 항체

Info

Publication number: KR20070107756A
Application number: KR1020077020669A
Authority: KR
Inventors: 알로이스 비 랑; 마이클 피. 호른; 마틴 에이. 임보덴; 아드라인 쭈에르체르
Original assignee: 켄타 바이오테크 아게
Priority date: 2005-02-14
Filing date: 2006-02-13
Publication date: 2007-11-07
Also published as: EP1848741B1; US20090068191A1; IL184774A; JP4944799B2; CA2597701C; US8197816B2; ATE480563T1; EP1848741A1; CN101120018A; IL184774A0; EP1690875A1; CA2597701A1; CN101120018B; JP2008530988A; KR20130018991A; ES2348263T3; WO2006084758A1; DE602006016736D1

Abstract

본 발명은 P. aeruginosa 혈청형 IATS 011에 특이적인 인간 단일 클론 항체와 그를 생산하는 하이브리도마, 그를 암호화하는 핵산 그리고 그 핵산으로 유전자 이입한 숙주세포에 관련된 것이다. 나아가 본 발명은 상기 단일 클론 항체를 생산하는 방법에 관련된 발명이다. 또한 본 발명은 적어도 하나의 항체 또는 상기 항체를 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 약학적 조성물에 관련된 발명이다.

Description

슈도모나스 애루기노사 혈청형 ＩＡＴＳＯ１１의 지질다당류에 특이적인 인간 단일 클론 항체{Human Monoclonal Antibody Specific for Lipopolysaccharides(LPS) of the Pseudomonas aeruginosa IATS 011 Serotype}

본 발명은 P. aeruginosa 혈청형 IATS 011에 특이적인 인간 단일 클론 항체와 그를 생산하는 하이브리도마, 그를 암호화하는 핵산 그리고 그 핵산으로 유전자 이입한 숙주세포에 관련된 것이다. 나아가 본 발명은 상기 단일 클론 항체를 생산하는 방법에 관련된 발명이다. 또한 본 발명은 적어도 하나의 항체 또는 상기 항체를 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

P. aeruginosa는 신선한 물 및 토양의 환경에 널리 분포하는 그람음성균이다. 이는 면역적격숙주는 공격하지 않고, 항체 및 식균작용에 의해 제거되는 전형적인 기회감염균이다. 그러나 낭포성섬유증(cystic fibrosis) 환자, 면역억제 개체-화상 환자, 중환자실의 삽관(intubation) 치료중인 환자, 암 및 AIDS 환자 뿐만 아니라, 장기 이식 후 환자-들은 특히 원내 감염에 높은 빈도로 노출되어 있다. 메티실린 내성 S. aureus(MRSA)와 반코마이신 내성 장구균(VRE)과 함께 P. aeruginosa는 모든 병원내 감염의 34%를 이루며, 병원내 감염은 1975년 7.2/1000 치료일(patient day)에서 1995년 9.8/1000 치료일로 증가하였다. 자주 관찰되는 병원내 감염은 패혈증(blood-stream infection) 및 폐렴이다.

낭포성섬유증 환자의 만성 P. aeruginosa 감염을 예방하는 데에 있어서, 능동면역화용으로는 P. aeruginosa의 지질다당류(LPS) 혈청형 중 가장 관련 있는 8가지를 독성이 제거된 P. aeruginosa 독소에 결합시킨 8가(octavalent) 결합 백신이 확립되어 있다. 이 백신에 대한 장기 연구는 18세 환자의 경우, 만성 감염 환자의 비율이 72%에서 32%로 줄어든다는 결과를 보여 주었다. 그러나 능동 면역화는 면역적격 환자와 그리고 예측 가능한 상황에서만 가능한 상황에서만 가능한 일이다. 따라서 대부분의 P. aeruginosa 감염 환자는 상기 8가 백신으로 능동면역화할 수 없다. 이러한 이유 및 대부분의 P. aeruginosa 균주가 다중약제내성인 점 때문에 P. aeruginosa 감염 환자를 치료할 새로운 치료 도구가 필요하다. 이러한 시도로서 한 가지는 하이브리도마 기술이나 파지 디스플레이(phage display) 접합체에 의한 클로닝에 기반한 인간 단일 클론 항체를 제조하는 것이다.

상기 방법 및 그에 따른 항체 모두에는 상당한 결점이 있다.

전형적인 하이브리도마 기술(“Kohler와 Milstein” 접근방식)은 선택한 항원으로 능동면역시켜 원하는 면역특이성을 갖는 쥐 B 세포와 융합 대상인 골수종 세포를 융합시킴으로써 불멸화하는 것에 기초하고 있다. 그러므로, 항체-생산 클론의 유전적 정보는 유적공학 기술에 의해 인간화되는 것이 필요하며, 항체는 적합한 발현계에서 생산된다. 마찬가지로, 파지 디스플레이 접합체 클로닝은 항체의 정교한 유전 공학 기술 및 적당한 발현계의 확립이 요구된다.

세균의 지질다당류(LPS, lipopolysaccharide)에 대한 쥐 단일 클론 항체가 사람 항체가 인식하는 항원 외의 항원 결정기도 인식한다는 사실은 알려져 있다. 따라서 단일 클론 항체를 쥐에서 제조한 뒤 그것을 인간화하면 사람에게 사용할 용도의 결합 특이성을 갖춘 항체를 반드시 분리할 수 있다고 할 수는 없다.

더 나아가, IgM 동종형 항체는 항세균성면역을 위한 최적의 IgM과 연결된 작용기전(effector mechanisms)이기 때문에 가장 효과적이다. 그러나 IgM 항체의 재조합 발현은 이 분자의 5량체 복합체 때문에 이루어지지 않았다. 결론적으로, 파지 디스플레이 기술에 의한 항체 발현은 IgM 이외의 동종형에는 제한적이다.

대안적으로, P. aeruginosa의 LPS 부위에 대한 사람 단일 클론 항체를 제조하려는 다양한 시도가 있었다. 그러나, 상기 항체 생산을 위하여 이용된 방법은 이익이 없거나(임파구 세포의 불안정때문에), 항체는 비-인간 당화 분포를 나타내거나 또는 매우 많은 양의 항체가 요구되었다. 더 나아가, 당 업계에 알려진 항체의 대부분은 작용 기능(effector function)이 결여되어 있었기 때문에, 보호기능이 없었다.

따라서, 본 발명의 밑바탕을 이루는 한 가지 기술적인 문제는 P. aeruginosa에 대하여 높은 보호능, 특히 생체내(in vivo)에서 보호능이 뛰어난 이 세균의 특이한 혈청형의 LPS에 특이적인 인간 단일 클론 항체를 제공하는 것이다.

이 기술적인 문제는 하기에 정의된 인간 단일 클론 항체에 의해 해결될 수 있다.

본 발명에 따른, P. aeruginosa 혈청형 IATS 011의 LPS에 특이적인 인간 단일 클론 항체인 1BO11라고 칭한 인간 단일 클론 항체는 CDR1 부위의 서열번호 1, CDR2 부위의 서열번호 2, CDR3부위의 서열번호 3 중 적어도 하나를 포함하는 경사슬 가변부위 및 CDR1 부위의 서열번호 4, CDR2 부위의 서열번호 5, CDR3부위의 서열번호 6 중 적어도 하나를 포함하는 중사슬 가변부위를 포함하거나 또는 상기 LPS에 결합할 수 있는 절편 또는 이의 유도체를 포함한다.

더 나아가 본 발명은 상기 단일 클론 항체를 제조하는 하이브리도마 및 상기 항체의 경사슬과 중사슬을 암호화하는 핵산을 각각 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 단일 클론 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 적어도 하나의 항체 및/또는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 약학적 조성물 및 이의 이차 의학적 용도들을 제공한다.

놀랍게도 본 발명의 인간 단일 클론 항체는 매우 높은 보호능을 갖는 것이 밝혀졌다. 특히 인간 단일 항체는 시험관 내(in vitro)에서 옵소닌식세포작용(opsonophagocytosis)을 나타냄이 증명되었다. 더욱 중요한 것은 본 명세서의 실시예에서 측정한 결과, 본 발명의 항체는 급성 폐 감염 모델 마우스에서 기도 감염을 막을 뿐만 아니라, 화상을 입은 쥐에서 패혈증(blood stream infection)을 막는 능력을 가짐으로서, 생체 내(in vivo)에서 보호능을 보였다.

본 발명의 인간 단일 항체를 첨가하면, Collins 등에 의해 보고(Collins MS et al ., 1990. FEMSIM 64:263-268)된 인간 단일 항체에 비교할 때, 높은 보호뿐만 아니라, 아주 낮은 용량으로 옵소닌식세포작용을 달성할 수 있다.

선행기술(Harrison FJJ et al. 1997. Hybridoma 16(5):413-420; Zweerink HJ et al. 1988. Infection and Immunity 56(8): 1873-1879)에서 보고된 인간 단일 항체와는 대조적으로, 본 발명의 인간 단일 항체는 결합 백신으로 능동적으로 면역된 개개인의 건강한 혈액에서 생성된다. 다당류에 대한 항체는 T 세포 형성을 돕는 능력이 부족하기 때문에 보통은 중요하지 않은 것(예를 들면 작은 작용기전를 가진 낮은 친화도)으로 알려져 있다.

결합 백신의 이용을 통해서만 목적의 다당류에 대한 강력한 작용기전를 갖는 높은 친화도의 유용한 항체를 수득할 수 있다. 더 나아가, 본 발명에 따른 인간 단일 항체의 생산 비율은 선행기술에 기재된 단일 항체의 생산 비율(Zweerink HJ et al. 1988. Infection and Immunity 56(8): 1873-1879)과 비교했을 때 더 높다.

선행기술상의 어떠한 인간 단일 항체도 P. aeruginosa에 의한 폐감염을 막는다는 보고는 없었다.

본 발명의 항체는 P. aeruginosa 혈청형 IATS 011의 LPS에 대하여 특이적이며 형광 접합 세균(fluorescence-conjugate bacteria)을 사용하여 측정한 옵소닌식세포작용의 값이 0.1 ng/㎖ 이하이다. 선행기술상의 어떠한 항체도 상기와 같이 낮은 농도로 옵소닌식세포작용을 갖는다는 보고는 없었다.

본 발명의 단일 클론 항체는 높은 특이성을 갖고 임상적 분리물을 인식한다. 이 항체를 사용하여 혈청형 IATS 011인 P. aeruginosa 감염 환자 20명 중 18명의 시료를 인지할 수 있었다. 어떤 특정한 이론에 구애되고자 하는 것은 아니지만, 이 단일 클론 항체는 선행기술상의 P. aeruginosa IATS O11 균주 모두를 인식할 수 있다고 가정할 수 있다. 이러한 특성 덕택에 상기 항체는 진단 및 치료용으로 특별히 유용하다. 따라서 본 발명의 항체는 매우 우수한 신뢰도를 나타낸다.

본 명세서에서 “인간 단일 클론 항체”는 그 단일 클론 항체를 수득한 생물원에 상관없이 모든 부분 또는 전체적 인간 단일 클론 항체를 포함한다. 상기 인간 단일 클론 항체는 하이브리도마 방법으로 제조하는 것이 바람직하다. 이 단일 클론 항체는 유전공학적 방법, 특히 유용가능한 단일 클론 항체를 배경 항체로 삼아 그 배경 항체 CDR 부위를 청구항에서 정의하는 CDR 절편으로 교체하는 이식 방법으로도 얻을 수 있다.

본 명세서에서 “CDR 부위”란 항체의 상보성 결정 부위(complementarity determining region), 즉 한 항체가 특정한 항원에 대하여 가지는 특이성을 결정하는 부위를 말한다. 항원 결합은 경사슬 및 중사슬의 세 개의 CDR 부위(CDR1에서 CDR3까지)에 달려 있다. 중사슬 내의 CDR 부위 위치는 다음과 같다:

CDR1 부위는 V_H 엑손의 아미노산 31에서 35까지,

CDR2 부위는 V_H 엑손의 아미노산 50에서 65까지,

CDR3 부위는 V_H 엑손의 아미노산 95 및 그 후속 아미노산.

상기 CDR 부위의 위치는 항체의 종류(class), 즉 IgM, IgG의 IgA와 무관하다.

κ경사슬의 CDR 부위 위치는 다음과 같다:

CDR1 부위는 V_κ 엑손의 아미노산 24에서 34까지,

CDR2 부위는 V_κ 엑손의 아미노산 50에서 56까지,

CDR3 부위는 V_κ 엑손의 아미노산 89 및 그 후속 아미노산.

λ경사슬의 CDR 부위 위치는 다음과 같다:

CDR1 부위는 V_λ 엑손의 아미노산 23에서 34까지,

CDR2 부위는 V_λ 엑손의 아미노산 50에서 56까지,

CDR3 부위는 V_λ 엑손의 아미노산 89 및 후속 아미노산.

V_H, V_κ및 V_λ의 아미노산 정렬은 V 염기 색인(V base index)으로부터 구할 수 있다 (http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok.php?menu=901) .

본 명세서에서 “혈청형”이란 P. aeruginosa의 모든 알려진 혈청형을 가리킨다. 서로 다른 P. aeruginosa 혈청형에 대하여 현재 사용되는 상이한 명명법들 사이의 대조표는 명세서의 표 1에 나타내었다.

본 명세서에서 “절편”이란 상기 LPS 혈청형에 결합할 수 있는 모든 항체 절편을 가리킨다. 이 절편은 그 길이는 적어도 10 아미노산 잔기 이상, 바람직하게는 20 이상, 더욱 바람직하게는 50 이상이다. 상기 절편은 항체의 결합 부위를 포함하고 있는 것이 바람직하며, Fab 또는 F(ab')₂절편 또는 그 혼합물인 것이 바람직하다.

본 명세서에서 “유도체”란 적어도 하나의 아미노산을 첨가, 삭제 및/또는 치환한 것에 의하여 달라진 상기 인간 단일 클론 항체 뮤테인(mutein)을 가리킨다. 바람직하게는, 이 유도체는 상기 사람 단일 클론 항체의 뮤테인으로서 청구항에서 가리키는 바와 같이, 중사슬 및/또는 경사슬의 CDR에 있어서 적어도 하나의 보존적 치환이 일어난 것이다. 더욱 바람직하게는, 상기 뮤테인은 이러한 보존적 치환을 5개 이상, 특히 바람직하게는 2개 이상 가지지 않는다. 상기 항체의 항체 절편 또는 유도체가 특정 LPS 혈청형과 결합하는 능력은 직접 방식 ELISA를 사용하여 측정할 수 있는데, 이에 대해서는 실험 재료 및 방법에서 기술하고 있다: 특정 LPS는 ELISA 판에 고체상으로 고정하게 된다. 항체 절편 또는 항체 유도체를 상기 고정된 LPS와 함께 배양하여 결합된 항체 또는 그 유도체는 적절한 효소 접합 2차 항체를 통하여 시각화된다.

본 명세서에서 “보존적 치환”이란 특정 물리-화학적 집단에 속하는 한 아미노산을 그와 동일한 집단에 속하는 아미노산으로 치환하는 것을 의미한다. 이 물리-화학적 집단은 하기와 같이 정의할 수 있다:

비극성 아미노산 집단에는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌 및 트립토판이 속한다. 전하를 띠지 않는 극성 곁사슬을 가진 아미노산 집단에는 아스파라긴, 글루타민, 티로신, 시스테인 및 시스틴(cystine)이 속한다. 양전하를 띠는 극성 곁사슬을 가진 아미노산 집단에는 리신, 아르기닌 및 히스티딘이 속한다. 음전하를 띠는 극성 곁사슬을 가진 아미노산 집단에는 아스파르트산 및 글루탐산이 속하며 또한 아스파르테이트(aspartate) 및 글루타메이트(glutamate)도 속한다.

앞 부분에서 설명한 바대로, 본 발명은 P. aeruginosa 혈청형 IATS O11의 LPS에 특이적인 항체를 제공한다.

본 발명의 추가 실시예에서는 LPS 또는 P. aeruginosa LPS 혈청형 IATS O11에 특이적인 인간 단일 클론 항체를 제공한다. 상기 항체는 경사슬 가변부위가 서열번호 7의 아미노산 서열이며, 중사슬 가변부위가 서열번호 8의 아미노산 서열을 가진다; 또는 상기 LPS에 결합할 수 있는 상기 항체의 유도체는, 그의 경사슬의 가변부위 아미노산 서열이 서열번호 7에 적어도 85%의 상동성을 가지며, 그의 중사슬의 가변부위 아미노산 서열은 서열번호 8에 적어도 85%의 상동성을 갖는다.

본 기술분야의 당업자에게 있어서 “상동성”이란 두 개 또는 그 이상의 폴리펩티드 분자 사이의 유사한 정도를 가리키는데, 이는 그 서열의 일치 정도에 따라 결정된다. 퍼센트 “상동성”은 두 개 또는 그 이상의 서열에서 상동성이 있는 부위의 퍼센트 비율로부터 서열의 결손 또는 다른 서열상의 면도 고려하면서 구할 수 있다.

서로 연관된 폴리펩티드의 상동성은 공지의 절차에 의해 결정될 수 있다. 대부분은 특정한 작업에 필요한 알고리즘을 갖춘 특정 컴퓨터 프로그램을 사용하는 것이 보통이다. 상동성을 결정하는 모범적 절차에서는 먼저 연구 대상 서열 사이의 가장 큰 일치점을 찾는다. 두 서열 사이의 상동성을 결정하는 컴퓨터 프로그램에는 GAP을 포함하는 GCG 프로그램 패키지[Devereux 외, Nucleic Acids Research 12(12):387(1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison (Wl); BLASTP, BLASTN and FASTA(Altschul S et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)]가 포함되는데, 이들로 국한되는 것은 아니다. BLAST X 프로그램은 NCBI(the National Centre for Biotechnology Information)와 다른 곳[BLAST Handbook, Altschul S et al ., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul S et al., J. MoI . 215: 403-410 (1990)]에서 구할 수 있다. 잘 알려진 Smith Waterman 알고리즘 또한 상동성 결정에 이용될 수 있다.

서열을 비교하기 위하여 선호되는 파라미터는 하기를 포함한다:

알고리즘: Needleman와 Wunsch, J Mol . Biol . 48:443~453(1970)

비교 매트릭스: Henikoff와 Henikoff의 PNAS USA 89:10915~10919에 기재된 BLOSUM62

결손 벌점(Gap penalty): 12

결손 길이 벌점(Gap-length penalty): 2

GAP 프로그램 역시 상기 파라미터를 가지고 사용하는데 적합하다. 상기 파라미터는 아미노산 서열을 비교하는 표준(디폴트) 파라미터로서 양 말단의 결손이 상동성 값을 떨어뜨리지 않는다. 참조 서열(reference sequence)와 비교할 서열이 매우 짧을 때에는 기대값(expectancy value)을 100,000까지 늘리고 몇몇 경우에는 워드 길이(word length 또는 word size)를 2까지 줄이는 것이 필요할 수 있다.

다른 모델 알고리즘, 결손 개시 벌점(gap opening penalties), 결손 연장 벌점(gap extension penalty) 및 프로그램 핸드북(Wisconsin Package, Version 9, September 1997)에 기재된 프로그램을 포함한 비교 매트릭스를 사용할 수도 있다. 이러한 것들을 선택하는 일은 실시할 비교 작업 및 더 나아가 그 비교 작업을 서열쌍 사이에서 수행할 것인가, GAP 또는 Best Fit이 더 바람직한것이가 또는 한 서열과 대규모의 서열 데이터베이스를 비교하는 작업인가, FASTA 또는 BLAST가 바람직것인가 등의 요건에 따라 정해진다.

상기 알고리즘에 따라 85% 일치하는 것으로 결정되면 85% 상동성이 있다고 하게 된다. 더 높은 수준의 상동성에 대해서도 마찬가지이다.

바람직한 실시예에서 본 발명의 뮤테인은 85% 또는 그 이상의 상동성, 예를 들어 90% 또는 95% 이상의 상동성을 갖는다.

더 나아가, 본 발명의 인간 단일 클론 항체의 경사슬은 κ 또는 λ형인 것이 선호된다. 특히 바람직한 것은 κ형의 경사슬이다. 경사슬은 자연적으로 재배열(rearrangement)되거나 유전학적으로 변형되거나 합성된 경사슬을 포함하여 자연적으로 존재하는 사슬일 수 있다. 만약 본 발명의 IATS O11에 특이적인 항체가 κ형인 경우, 그 경사슬은 생식 계열(germ line) DPK18 유래인 것이 바람직하다 (http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php?menu=901#VKEX) .

본 발명의 또 다른 실시예에서, 본 발명의 인간 단일 클론 항체의 중사슬은 모든 인간 아이소형(isotype), 즉 IgM, IgA 또는 IgM에서 선택된다. 바람직하게는 상기 중사슬은 IgM 아이소형이다. 만약 상기 항체가 IgM 형이라면, 이 항체는 P. aeruginosa LPS에 대한 높은 결합력, 보체와 효과적으로 결합함으로써 세균의 직접 살상을 매개하는 능력 및/또는 식세포작용을 위하여 세균을 효과적으로 옵소닌화(opsonization)하는 유리한 특성을 가진다. 더 나아가, IgM은 IgG 또는 IgA와 같은 다른 아이소형이 P. aeruginosa 엘라스타제(elastase)에 의하여 파괴되는 데에 반하여 단백질 가수분해에 대한 내성이 있다. IgM 항체는 적은 양에서도 효과가 있다. 화상 입은 쥐에 대한 패혈증 방지 모델에서 마우스 당 1에서 4 μg으로 완벽하게 보호되었다.

중사슬 가변 부위는 생식 계열 DP-53에서 유래하는 것이 바람직하다 (http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php?menu=901#VKEX) . 상기 경사슬과 중사슬은 단일 사슬 항체(예를 들어 2가의 scFv, 이중 기능 scFv와 이중 특이성 scFv)로 공유결합 연결되거나 또는 서로 비공유결합적으로 연결될 수도 있다.

본 발명의 실시태양에서 상기 인간 단일 클론 항체는 전적으로 인간 아미노산 서열로 이루어진다.

“전적으로 사람 아미노산 서열로 이루어진다”란 인간 단일 클론 항체의 아미노산 서열이 인간 생식 계열로부터 유래한 것을 의미한다. 이는 다양한 방법으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 인간 아미노산 서열로 이루어진 인간 단일 클론 항체는 융합 대상 B세포가 인간 B세포인 하이브리도마로부터 수득될 수 있다. 한편, 인간 단일 클론 항체는 청구항에서 지정한 CDR 부위를 유용가능한 인간 단일 클론 항체에 이식함으로써 본 발명에서 특정하는 P. aeruginosa LPS 혈청형에 특이적인 항체를 수득할 수도 있다.

전적으로 인간 아미노산 서열로 이루어진 인간 단일 클론 항체 서열은 거부 반응이나 아나필락시쇼크(anaphylactic shock)와 같은 부작용을 막아준다.

더 나아가, 인간 단일 클론 항체는 본질적으로 인간 항원 인식하는 능력을 나타낸다. “본질적으로 인간 항원을 인식하는 능력”이란 본 발명의 인간 단일 클론 항체의 항원 인식은 건강한 사람의 항원 인식 능력과 본질적으로 동일한 것을 의미한다. 특히 상기 인간 단일 클론 항체 경사슬과 중사슬 Fc 부분은 인간 보체 시스템과의 상호작용을 확실하게 하고, 이른바 HAMA(인간 항-마우스 항체, human anti-mouse antibody)가 생성될 위험성을 줄이기 위하여, 사람 항체형일 것이 요구된다.

또 다른 실시태양에서 본 발명의 인간 단일 클론 항체는 인간 B세포 또는 상기 B세포를 골수종 또는 헤테로골수종 세포와 융합시킨 하이브리도마로부터 수득될 수 있다.

인간 B세포는 건강한 사람이나 환자를 접종한 뒤, 공지의 방법(Current Protocols in Immunology. Chapter 7.1. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Published by Wiley & sons, Eds: JC Coligan et al.)으로 인간 B세포를 얻을 혈액 시료를 채취함으로써 얻을 수 있다. 상기 사람 B세포는 공지 방법에 따라 고전적인 Kohler와 Milstein 접근법을 통하여 하이브리도마를 생산하기 위하여 골수종 또는 헤테로골수종 세포와 융합시킬 수 있다. 적절한 골수종 세포는 P3X63Ag8.653(ATCC CRL-1580) 또는 SP2/0(ATCC CRL-1646)과 같은 P3X63 유도체들이다. 적절한 헤테로골수종 세포는 F3B6(ATCC HB-8785) 등이 있다. 이렇게 하여 생기는 하이브리도마는 공지 방법에 따라 선택될 수 있다. 이 하이브리도마를 적절한 배지에서 배양하고 그 생산된 항체를 상층액으로부터 회수한다.

그에 더하여 본 발명은 각각 상기 인간 단일 클론 항체 중사슬과 경사슬을 암호화하는 핵산 분자들을 제공한다. 이 핵산은 생식 계열 또는 B세포에서 일어나는 재배열(rearrangement)에서 유래한 자연적인 것일 수도 있고, 또는 합성될 수도 있다. 또한, 합성 핵산은 내분해성을 향상시키기 위한 인산티오에스테르(phosphothioester)를 포함하는 변형된 뉴클레오시드간 결합을 갖는 핵산을 포함한다. 이 핵산은 유전공학적으로 또는 뉴클레오티드 합성을 통하여 완벽하게 합성될 수 있다.

더 나아가 본 발명은 본 발명의 인간 단일 클론 항체 경사슬을 암호화하는 핵산을 적어도 하나 및/또는 상기 항체 중사슬을 암호화하는 핵산을 적어도 하나 포함하는 벡터를 제공한다. 이 핵산들은 같은 벡터에 동시 존재하거나 한 쌍의 벡터로 존재할 수 있다. 이 벡터는 경사슬 및/또는 중사슬을 발현하는 상기 핵산의 발현을 촉진하기 위하여 상기 핵산에 연결되어 작동하는 프로모터를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 벡터는 숙주세포내에서 복제되고 유지되기 위한 복제기원을 포함하는 것이 바람직하다. 이 벡터는 또한 상기 경사슬 또는 중사슬을 암호화하는 핵산의 5’ 방향에 위치하는 신호 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이 신호 서열은 암호화된 사슬을 배양액으로 분비하는 것을 촉진할 수 있다.

상기 벡터는 아데노바이러스, 백시나(vaccina)바이러스, 바큘로바이러스(baculovirus), SV40 바이러스, 역전사바이러스(retrovirus), 식물 바이러스 또는 람다 유도체 또는 M13과 같은 박테리오파지에서 유래한 것이 선호된다. 특히 선호되는 벡터는 인간 면역 글로불린 중사슬 및 인간 경사슬 부위를 포함하는 벡터인데, Persic 등이 기재한 진핵의 면역 글로불린 발현을 위한 통합 벡터 시스템(Persic et al . 1997. Gene . 187(1): 9-18)이 이와 같은 것이다.

상기 벡터는 히스티딘 꼬리(tag)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가적으로 포함할 수 있는데, 이 경우 상기 인간 단일 클론 항체 경사슬 및/또는 중사슬의 N-말단에 히스티딘 꼬리를 갖는 융합 단백질을 발현하게 되며, 킬레이트 형성을 통한 니켈 컬럼으로 융합 단백질을 정제할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 벡터 및/또는 핵산을 포함하고 그 벡터를 발현하는데 적합한 숙주세포를 제공한다. 선행기술에서 다양한 원핵 및 진핵 발현 시스템이 잘알려져 있는데, 진핵 숙주세포로는 효모, 곤충, 식물과 포유동물 세포 등이 해당되며, 포유동물 세포에는 HEK293, PerC6, CHO, COS 또는 HeLa 세포 및 그 유도체가 선호된다. 특히 선호되는 것은 생산용 인간 세포주이다. 트렌스펙션(transfection)된 숙주세포는 생산된 항체를 배양액으로 분비하는 것이 바람직하다. 세포내에서 발현시키는 경우, 탈변성(renaturation) 작업은 Benetti P. H. 등[Protein Expr . Purif . 8월(13):283~290(1988)]에 기재된 내용 등의 표준적인 방법에 따라 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 인간 단일 클론 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 한 실시예에서 상기 인간 단일 클론 항체는 앞서 기술한 하이브리도마를 배양함으로써 생산된다. 생산된 단일 클론 항체는 상층액으로 분비되고 통상적인 크로마토그래피법을 적용하여 정제될 수 있다.

한편, 상기 인간 단일 클론 항체는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주세포를 암호화되는 항체 사슬의 재조합 발현에 적합한 조건에서 배양함으로써 생산할 수 있다. 바람직하게는 상기 숙주세포는 경사슬을 암호화하는 핵산을 적어도 하나 그리고 중사슬을 암호화하는 핵산을 적어도 하나 포함하고 인간 단일 클론 항체를 조립할 능력을 갖추고 있어야 하며, 이 항체의 3차원 구조는 인간 B세포가 생산하는 인간 단일 클론 항체의 3차원 구조와 동등한 것이어야 한다. 만약 이 경사슬이 중사슬과 분리되어 생산될 경우, 양 사슬을 모두 정제한 뒤 조립하여 인간 B세포가 생산하는 인간 단일 클론 항체와 실질적으로 같은 3차원 구조를 가지는 인간 단일 클론 항체를 생산할 수 있다.

상기 인간 단일 클론 항체는 암호화되는 경사슬 및/또는 중사슬의 재조합 발현으로 수득할 수 있으며, 이때 핵산은 인간 단일 클론 항체를 암호화하는 것을 공지 기술로써 분리하여 청구항에서 정의하는 CDR 부위를 암호화하는 핵산 서열을 상기 분리한 핵산에 이식하는 방식으로 생산할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서 상기 인간 단일 클론 항체는 변형된다. 상기 변형은 이를 테면 디사이클로헥실카르보디이미드(dicyclohexylcarboxydiimide)를 사용한 가교 형성(cross-linking)을 통하여 단량체를 이량체, 올리고량체 또는 고분자화하는 것을 포함한다. 따라서 생산된 이량체, 올리고량체 또는 고분자는 겔 여과를 통하여 각각 분리해낼 수 있다. 나아가 변형에는 측쇄의 변형이 포함되는데, 예를 들어 ε-아미노리신(aminolysine) 잔기 또는 아미노 및 카르복시(carboxy) 각각의 말단 변형이 있다. 또 다른 변형의 예에는 번역 후 수식(post-translational modification)이 포함되는데, 그 예로 단백질의 글리코실화 및/또는 부분적 또는 전체적 탈글리코실화(deglycosylation) 및 이황화 결합 형성을 들 수 있다. 또한, 항체는 효소학적, 형광 또는 방사성 표지와 같은 표지에 접합될 수도 있다.

더 나아가 본 발명은 적어도 하나의 인간 단일 클론 항체 및/또는 상기 항체 경사슬 및/또는 중사슬을 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 갖춘 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 선행기술상의 약학적으로 허용가능한 성분을 추가적으로 포함할 수 있다.

이 약학적 조성물은 패혈증, 만성 기관지염, 국부적 감염과 같이 주로 면역 기능이 저하된 환자 및/또는 호흡 기능이 저하된 환자에서 일어나는 P. aeruginosa 감염을 치료하는 데에 적용하는 것이 바람직하다. 이 약학적 조성물은 나아가 병원 감염(nosocomial infection)의 예방 및/또는 치료 용도로 사용할 수 있다. P. aeruginosa의 주된 감염 대상은 낭포성섬유증 환자, 화상 환자, 삽관 치료중인 환자, 중환자실 환자, 암환자, AIDS 환자, 면역기능이 저하된 환자, 면역 억제된 환자, 당뇨병자 그리고 정맥 주사 약물남용자들이기 때문에 이 약학적 조성물은 특히 상기 집단에서 일어나는 P. aeruginosa 질환을 예방 및/또는 치료하는 데 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 항생제, 바람직하게는 새로운 단일 클론 항체에 접합된 항생제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 새로운 단일 클론 항체를 체중 1 kg당 0.1 - 30 mg 농도로 포함한다.

이 약학적 조성물은 공지기술인 정맥, 근육, 피내(intradermal), 피하, 복강내, 국부 및 흡입용 스프레이와 같은 비강내 투여 방식 중 어느 것에 의해서라도 투여할 수 있다.

본 발명은 또한 P. aeruginosa 감염을 진단하는 검사 키트를 제공하는데, 이에는 본 발명의 인간 단일 클론 항체가 적어도 하나, 그리고 선택적으로는 그러한 진단 검사를 수행하는 데 적절한 성분이 포함될 수 있다.

이 검사 키트는 P. aeruginosa 감염을 특이적이고 신뢰성 있게 검사하는 데 적합하다. 검사는 통상적인 ELISA 검사법을 액상이나 막에 결합한 형태로 수행하는 방식에 바탕을 둘 수 있다. 검출 방식은 선행기술상 알려진 직접 혹은 간접적인 방식일 수 있는데, 이때 상기 항체를 효소학적, 형광 또는 방사성 표지에 접합시키는 것을 선택적으로 추가할 수 있다.

도 1은 1BO11 중사슬 가변부위의 DNA와 아미노산 서열을 나타낸다.

도 2는 1BO11 κ경사슬 가변부위의 DNA와 아미노산 서열을 나타낸다.

도 3a는 단일 클론 항체 1BO11에 의한 혈청형 IATS 011의 P. aeruginosa 임상 분리물의 인식 패턴을 나타낸다. 도 3b는 혈청형 IATS O11의 P. aeruginosa 임상 분리물에 대하여 단일 클론 항체 1BO11이 인식하는 패턴을 IATS O11 혈청형에 특이적인 다른 단일 클론 항체의 경우와 비교한 것이다. 1BO11에 대한 결합은 전세포(whole cell) ELISA로 측정하였다.

도 4는 단일 클론 항체 1BO11이 P. aeruginosa 혈청형 IATS O11에 대하여 직접적인 옵소닌식세포작용의 활성을 나타낸다.

도 5는 마우스에서 단일 클론 항체 1BO11의 약력학을 나타낸다. 생체 내에서 1B011의 보호능은 화상 쥐 모델에서 측정되었다. NMRI 마우스에 다른 용량의 1BO11를 i.p. 또는 i.v. 투여하였다. 투여 후 3일 후에 생존률을 나타냈다.

도 6은 마우스에서 단일 클론 항체 1BO11의 약력학을 나타낸다. 폐감염후의 폐 및 비장에서 1BO11의 P. aeruginosa 제거 능력은 급성 폐감염 마우스 모델에서 측정하였다. P. aeruginosa에 의한 폐감염 에 앞서, 1BO11을 i.v.투여하였다. 감염 6, 12, 24 및 48 시간 후에 폐 및 비장에 존재하는 세균을 특정하였다.

도 7은 단일 클론 항체 1BO11의 상보 활성을 나타낸다. 인간 정상 혈청과 혼합한 1BO11에 보체 성분 C4d의 생산을 생체 외에서 측정하였다. 생산된 C4d는 ELISA로 검출하였다. 혈청에서 100 μg/㎖ 및 10 μg/㎖의 다른 농도의 1BO11이 조사되었다. 혈청만 있는 대조군의 농도는 0 μg/㎖였다.

하기 기재할 실시예는 본 발명을 예시하지만 본 발명의 범위를 제한하기 위한 용도는 아니다. 해당 분야의 일반적 지식을 갖춘 당업자에게는 본 명세서를 연구하면 또 다른 실시예도 생각할 수 있음이 명백할 것이다.

실험 재료와 방법

실시예에서 이용된 실험 재료 및 실험 방법은 하기와 같다:

세포 상층액의 IgM 정량 및 LPS 특이성의 결정

세포 상층액 속에 있는 항체를 선별하고 분석하기 위하여 본 명세서 외에서 기술(Cryz, S. J. et al ., 1987, J. Clin . Invest . 80(1):51~56)하고 있는 ELISA법을 약간 변형하여 수행하였다. 간략하게 설명하여, P. aeruginosa 지질다당류(직접 생산하였음) LPS 저장 용액(stock solution)을 2 mg/mL 농도로 36 mM 트리에틸아민(triethylamine) 용액으로 준비하였다. 피막 형성을 위하여, 이 용액을 0.02% 아지드화나트륨을 함유한 PBS(PBS-Az)로 10 μg/㎖까지 희석하였다. 이 용액을 PBS-Az 속에서 같은 부피의 10μg/mL 메틸화 인간 혈청 알부민[HSA; 다음과 같은 방식으로 직접 생산하였음; 동결건조(lyophilization)한 HSA 2 g을 순수한 메탄올 200 ㎖에 녹였다. 37% HCl 1.68 ㎖을 가한 후, 그 용액을 어두운 곳에서 최소한 3일 동안 실온에 놓아 두고 가끔씩 흔들어 주었다. 여기서 나오는 침전을 10분 동안의 원심분리(4,500rpm, GS1 로터)로 수집한 다음 순수한 메탄올로 두 번 세척하 고, 그 펠렛(pellet)을 무수 에테르에 담가서 두 번 세척하였다. 이 침전을 건조기(dessiccator)에서 2 시간 동안 건조한 뒤, 그 펠렛을 H₂O에 재현탁하고 그 현탁액을 나누어 -20℃에 저장하였다. 단백질 농도는 8.05 mg/㎖였다]과 5분 동안 실온에서 교반하여 줌으로써 혼합하였다.

NUNC® ELISA 판에 웰(well) 당 100 μL의 LPS-HSA 용액으로 하룻밤 동안 실온에서 피막을 입혔다. ELISA 판을 0.05% Tween20(#93773; Fluka Chemie AG, Switzerland)을 함유하는 pH 7.4짜리 PBS(PBS-T) 300μL로 3회 세척한 뒤, 세포 상층액을 PBS를 가지고 1:2로 희석하고 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다. ELISA 판을 PBS-T로 3회 세척한 다음, 결합해 있는 항체는 5% (v/v) FCS를 함유한 PBS에 1:2000으로 희석한 서양 고추냉이 과산화효소 접합 염소 항-인간 IgM 항체(Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-human IgM antibody, # 074-1003; KPL; Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. Gaithersburg, MD)를 사용하여 검출하였다. ELISA 판은 37℃에서 1 시간 동안 배양한 뒤, PBS-T로 세 번 세척하였다. 항체의 결합은 웰 당 100 ㎕의 OPD 용액[0.4 mg/㎖ orthophenyldiamine이 24 mM 시트르산과 52 mM 제2인산나트륨, 그리고 0.0012%(V/V) 과산화수소에 용액상으로 존재]을 가하여 시각화하였다. 발색 반응은 2 ~ 3분 뒤, 1 M HCl을 웰 당 50 ㎕ 가하여 정지시켰다. 흡광도는 ELISA 기록 장치로 490 nm에서 Softmax Pro® 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.

세포 배양 상층액의 IgM 정량을 위하여, ELISA 판은 비접합 염소 항-인간 IgM 항체의 1 ㎍/㎖ PBS 용액으로 4℃에서 하룻밤 동안 피막을 입혔다. 그 판들을 PBS-T로 3회 세척한 다음, 세포 상층액과 표준 물질을 2배 희석하여 배양하였다. 표준 물질로서 인간 표준 혈청(Behring)을 0.5 ㎍/㎖ 농도를 시작으로 사용하였다. 모든 희석 작업은 PBS-T를 사용하였다. ELISA 판은 실온에서 2 시간 동안 교반 테이블(rocking table)로 배양하며 흔들어주었다. PBS-T로 3회 세척한 다음, 결합한 항체를 5%(v/v) FCS를 함유하는 PBS로 1:2000 희석한 서양 고추냉이 접합 염소 항-인간 IgM 항체(KPL)로 검출하였다. ELISA 판들을 교반 테이블을 사용하여 실온에서 1 시간 동안 배양하고 PBS-T로 3회 세척해 주었다. 항체 결합은 OPD 기질 용액을 웰당 150 ㎕ 가하여 시각화하였다. 발색 반응은 1분이 지나서 1 M HCl을 웰당 50 ㎕씩 가하여 정지시켰다. 흡광도는 ELISA 기록 장치로 490 nm에서 Softmax Pro® 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.

서열 분석

하이브리도마 세포의 RNA를 Qiagen의 RNeasy-Kit를 사용하여 분리하였다. cDNA는 SMART Technology(Becton Dickenson)를 사용하여 합성하였다. 둘째 가닥의 PCR을 위하여 하기 프라이머(표 3)를 사용하였다: (1)역방향 불변부위 IgM(con μ): 5'-GCC ACG CTG CTC GTA TCC GAC G-3'(서열번호 11); (2)역방향 κ(con κ): 5'-AGC AGG CAC ACA ACA GAG GCA GTT CC-3'(서열번호 12). 정방향 프라이머는 SMART 키트에 포함되어 있었다. 서열결정을 위하여 하기의 프라이머를 사용하였 다: (3)IgM 서열(μ 서열): 5'- GCT GCT CGT ATC CGA CGG-3'(서열번호 13) 및 (4)κ 서열: 5'- CAC AAC AGA GGC AGT TCC-3'(서열번호 14).

서열결정은 Microsynth AG(Balgach, Switzerland)에서 이루어졌고 그 서열은 V-Base DNAplot 소프트웨어 (http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/DNAPLOT.php?menu=901) 를 사용하여 존재하는 생식 계열 서열과 비교하였다.

P. aeruginosa 표준 균주의 IATS 혈청형

IATS 혈청형	구 분
O1	PA53(IT4)
O2	E576(IT3)
O3	6510(Habs3)
O4	6511(Habs4)
O6	PA220(IT1)
O7	Fisher 6(IT6)
O10	Fisher 5(IT5)
O11	Fisher 2(IT2)
O16	Fisher 7(IT7)

P. aeruginosa 혈청형 IATS O11 의 임상 분리물

분 리 물 번 호	분리물이 유래한 근원
2309.36	소변
2309.38	귀
2309.58	혈액
2309.60	소변
2309.61	소변
2309.65	기관 분비물(tracheal secretion)
2310.49	소변
2310.55	혈액
2311.58	기관 분비물(tracheal secretion)
2312.25	기관 분비물(tracheal secretion)
V02 610	쓸개
VA 1014	귀
VA 26939	폐(BAL)
VA 28/1	상처
VA 2813	상처
VA 3348	폐(BAL)
VA 3805	눈
VA 4156/1	상처
VA 695	상처
VA 843	기관 분비물(tracheal secretion)
FT-2	참조 균주

전세포 ( whole cell ) ELISA

서로 다른 임상 분리물로부터 얻은 세균(표 2 참조)을 37℃에서 LB(Luria broth) 배양액으로 600 nm 흡광도 1까지 배양한 다음, 37% 포르말린(최종 포르말린 농도: 0.5%)으로 하룻밤 동안 37℃에서 고정하였다. 고정된 세균을 PBS로 1:50으로 희석하고 ELISA 판에 고정하였다. 5%(v/v) 송아지 태아 혈청을 함유하는 PBS로 ELISA 판을 차단한 다음, 단일 클론 항체 1BO11을 고정된 세균과 함께 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 한편, 다른 혈청형은 상기와 같이 생장시키고, 단일 클론 항체 1BO11 또는 양성 대조군으로서 단일 항체에 각각 특이적인 항혈청과 함께 배양하였다(도 3b, 혈청형-특이 양성 대조군 단일 항체를 집합적으로 "양성 대조군"이라 칭함). ELISA 판을 PBS-T로 3회 세척한 다음, 결합한 항체를 서양 고추냉이 과산화효소 접합 염소 항-인간 IgM 항체(# 074-1003; KPL; Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. Gaithersburg, MD)로 시각화했는데, 이 항체는 5%(v/v) FCS를 함유한 PBS를 가지고 1:2000으로 희석하여 사용하였다. 이 판을 37℃에서 1 시간 동안 배양하고, PBS-T로 3번 세척하였다. 항체의 결합은 웰 당 100 ㎕의 OPD 용액[0.4 ㎎/㎖ orthophenyldiamine이 24 mM 시트르산과 52 mM 제2인산나트륨, 그리㎕고 0.0012%(V/V) 과산화수소에 용액상으로 존재]을 가하여 시각화하였다. 발색 반응은 2 ~ 3분 뒤, 1 M HCl을 웰 당 50 ㎕ 가하여 정지시켰다. 흡광도는 ELISA 기록 장치로 490 nm에서 Softmax Pro® 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.

옵소닌식세포작용 분석

생물학적 활성을 측정하기 위하여, 단일 클론 항체 1BO11의 옵소닌식세포작용 활성을 시험하였다. 이를 위하여 표 1의 혈청형 IATS O11을 갖는 P. aeruginosa 균주를 TSBS 배지[1%(w/v) 포도당 함유 트립신 처리 대두 영양 육즙(tryptic soy broth) 30 g/ℓ]에서 하룻밤 동안 생장시켰다. 찬 PBS로 세균을 2회 세척한 다음, 세균 펠렛을 pH 8.0, 0.1 M 중탄산 완충용액 5 ㎖에 재현탁하였고, 여기에 5-(및-6)-carboxyfluorescein succinylimide ester[5(6)-FAM,　SE; Molecular Probes, Eugene 또는 10 ㎎/㎖ DMSO(Dimethyfsulfoxid) 용액 속의 SE], 50 ㎕를 가하고 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 이 세균을 37% 포름알데히드 100 ㎕를 가하여 고정한 다음, 하룻밤 동안 37℃에서 배양하였다. 접합되지 않은 색소를 제거하기 위하여, 세균을 찬 멸균 PBS 20 ㎖로 원심분리 및 재현탁을 6번 반복하였다. 표지된 세균을 다음 사용시까지 4℃에서 저장하였다. 실험을 위하여 이 세균의 일부를 550 nm에서의 흡광도로 1까지 희석한 다음 HBSS-BSA(0.1% BSA 함유 Hank 균형 염류 용액)로 1:50까지 희석하였다. 이 세균 20 ㎕를 하이브리도마 세포 배양액 상층액을 다양한 비율로 희석한 현탁액 10 ㎕와 혼합하였는데, 이 현탁액에는 단일 클론 항체 1BO11 또는 비특이적 단일 클론 대조군 항체가 각각(자료는 나타내지 않음) 포함되어 있었다. 37℃에서 30분 동안의 배양을 마친 후, 새끼 토끼 혈청(Charles River Laboratories, Germany) 10 ㎕를 가하여 보체를 첨가하였고, 이 탐지자(probe)들을 함께 37℃에서 30분 더 배양하였다. 분화된 HL-60 세포[전골수세포주(promyelocyte line)인 HL-60 세포들을 3일 동안 Iscoves 변형 Dulbecco 배양액(IMDM, Sigma)에 10%(v/v) FCS와 100 mM 디메틸포름아미드를 첨가한 배양액에 배양하는 것을 통하여 유사과립세포(granulocytic cell)로 분화시켰다.] 40 ㎕를 옵소닌 처리된 세균에 가하여 최종 농도를 1.25×10⁶세포/ ㎖로 하였다. 37℃에서 90분 동안 교반 배양한 다음, 세포를 2 ㎖ 세포 세척 완충액[0.02%(v/v) 아지드염 함유 PBS, Becton Dickenson]으로 옮겨 수득하였다. 250×g에서 5분간 원심분리한 다음, 세포 펠렛을 세포 세척 완충액 150 ㎕에 재현탁하고 유세포 분석기(flow cytometry)로 분석하였다. 옵소닌식세포작용 활성의 양성 반응은 HL-60 세포의 녹색 형광을 배경 염색과 비교 분석하여 결정하였다. 배경 염색은 플루오레신(fluorescein) 접합 세균을 보체 존재하에 HL-60 세포와 배양하여 결정하였다.

P. aeruginosa 감염 마우스의 생체내 보호

화상마우스 모델

1BO11의 생체내 보호능은 화상 마우스 모델로 측정하였다. NMRI 마우스(18 ~ 20 g, Charles River Laboratories)들에게 화상 처리 4 시간 전에 0.16 에서 10 ㎍(대략 kg 체중당 0.4 to 0.006 ㎎)의 단일 클론 항체 1BO11을 함유하는 주사액을 0.1 ㎖ 부피로 정맥 주사하였다. 대조군에는 비특이적 항체 상층액 0.1 ㎖을 주사하였다. 화상 처리를 위하여, 10마리씩 묶은 암컷 마우스 집단들을 3-chloro-1,1,2-trifluoroethyl-difluoromethyl-ether(Ethrane, Abbott Lab., Chicago, IL)를 공기 중에 노출시켜 마취하였다. 마우스들은 등에 2 cm² 넓이로 에탄올 화상 처리를 10초 동안 받았다. 마우스당 처리 기관 70cfu(P. aeruginosa IATS 011; 임상학적 분리 번호 2310.55, 표 2 참조)를 0.5 ㎖ PBS에 현탁한 다음, 곧바로 화상을 입은 부위에 피하주사하였다. 이 마우스들을 7일 동안 관찰하였다. 처리 3일 후에 보호 생존능을 측정하였다.

급성 폐 감염 모델

P. aeruginosa 폐감염에 대한 1BO11의 보호능을 측정하기 위하여, 급성 폐 감염 모델을 이용하였다. 10 ㎍(0.4 ㎎/㎏) 1BO11을 BALB/c 마우스에 i.v. 투여하였다. 그 후, 4.0 x 10⁷/㎖ 균주 2310.55(표 2, 대략 마우스당 1.6 x 10⁶) 40 ㎕를 마취하에 구부러진 구슬-팁 바늘(curved bead-tipped needle)을 이용하여 왼쪽 기관지 아래에 IT(intrat-racheally) 처리하였다. 상기 용량은 단지 치사만이 제한된 양이었다. 6, 12, 24 및 48 시간 후에, 마우스를 희생하고 폐 및 비장을 무균적으로 제거하였다. 기관은 3 ㎖ PBS로 현탁되었고, 얼음 상에서 블렌더(blender)를 이용하여 45초 동안 균질화하였다. 단계적으로 희석된 균질 기관(0.1 ㎖)은 CFU/폐 또는 CFU/비장을 측정하기 위하여, 수정된 Conradi Drigalski의 배지에 평판배양하였다.

단일 항체에 의한 전형적인 보체 경로 활성의 결정

하류기술 공정(downstream processing) 동안 형성된 IgM-응집물에 의한 전형적인 보체의 결과로 일어나는 자발적 유도를 측정하기 위하여, 한정된 농도의 1BO11 항체를 37℃에서 30분 동안 건강한 공여자의 혈청에서 배양하였다. 반응을 10 mM EDTA에서 정지시키고 C4d 절편 보체 활성은 상업적 ELISA(Quidel Corp, San Diego)로 측정하였다. 대조군으로서, 1BO11 항체를 포함하는 IgM-항원 복합체 및 이것의 같은 기원인 LPS 항원을 이용하였다.

< 실시예 1> 1 BO11 의 DNA 와 아미노산 서열

항체의 특이성은 DNA 및 아미노산 서열에 의하여 각각 정해진다. 중사슬 및 경사슬 가변부위 절편의 DNA 서열을 각각 결정하였다. 간략하게 설명하여, 하이브리도마 세포의 총 RNA를 분리한 다음, SMART Technology 키트(Becton Dickinson)를 사용하여 완전한 cDNA로 역전사하였다. 이 방식에 따라서 만능 프라이머(universal primer)를 cDNA의 5’ 말단에 첨가하였다. 이 프라이머와 표 3에 나타낸 C_κ 또는 C_μ 특이적 프라이머를 사용하여 IgM과 κ의 가변부위와 불변부위를 PCR로 증폭하였다. 이 PCR 절편을 아가로스 겔에서 전기 영동 후 잘라내고 정제한 다음, 표 3에 나타낸 프라이머로 서열 결정할 DNA 주형으로 삼았다.

1 BO11 의 IgM 중사슬 및 κ 경사슬 가변부위들의 PCR 증폭과 서열 결정에 사용된 프라이머들

프라이머 이름	서열	사용된 실험
Con μ	5' GCC ACG CTG CTC GTA TCC GAC G 3'(서열번호 11)	PCR
Con κ	5' AGC AGG CAC ACA ACA GAG GCA GTT CC 3'(서열번호 12)	PCR
μ seq.	5‘ GCT GCT CGT ATC CGA CGG 3'(서열번호 13)	서열 결정
κ seq.	5‘ CAC AAC AGA GGC AGT TCC 3'(서열번호 14)	서열 결정

가변부위의 서열은 이어서 Vbase 색인과 비교하였다. 생식 계열 서열과 비교한 결과는 표 4에서 “교체 및 침묵" 변형(R:S)의 숫자로 나타내었다. DNA 서열과 아미노산 서열은 도 1과 2에 나타내었다.

생식 계열의 서열로부터 교체(R) 대 침묵(S) 돌연변이의 비율

	중 사 슬		경 사 슬
	생식 계열	R : S	생식 계열	R : S
1BO11	DP-53	17 : 3	DPK-18	0 : 2

< 실시예 2> 단일 클론 항체 1 BO11 에 의한 P. aeruginosa IATS O11 혈청형 임상 분리물의 인식

1BO11은 8가 OPS-Toxin A 백신을 맞은 건강한 지원자의 면역에 의해 생산되어 왔다. 이 백신은 IATS 011 표준 균주 FT-2를 포함한다. 이 균주의 LPS에 대하여 생성된 1BO11이 다른 IATS 011 혈청형도 인지하는지를 조사하기 위하여, 다른 병원에서 광범위한 영역의 임상 분리물을 수집하였다(표 2 참조). 분리물의 모든 혈청형은 상업적으로 사용가능한 혈청형 응집반응 키트를 사용하여 결정하였다. 혈청형은 PCR로 재확인하였다. 다른 혈청형(도 3b)뿐만 아니라 다양한 혈청형 IATS 011의 임상 분리물(도 3a)의 1BO11과의 겹합을 조사하기 위하여 전세포(whole cell) ELISA로 측정하였다.

1BO11은 조사한 IATS 011 분리물 모두와 강력하게 반응하였으나, 이들 분비물의 표면에 낮은 LPS 발현에 기인한 두 개는 약한 반응을 보였다. 더 나아가, IATS 011 혈청형 분리물과의 결합이 관찰되었으며, 01, 02, 03, 06 또는 010의 다양한 혈청형과는 결합하지 않았다. 이러한 분리물들은 양성 대조군으로서 각각의 혈청형에 대한 단일 클론 항체를 이용하여 확인하였다.

< 실시예 3> 1B011의 시험관내 활성: 옵소닌식세포 활성

시험관내에서 1BO11의 생체 활성은 옵소닌식세포작용(opsonophagocytosis) 분석에 근거한 유세포 분석기(flow cytometry)의 사용으로 평가될 수 있다. FITC-접합된 P. aeruginosa IATS O11혈청형은 보체로서 이용될 정상 토끼 혈청 존재하에 1BO11과 함께 순차적으로 배양하였다. 옵소닌화(opsonization)된 세균을 분화된 HL-60 세포[전골수세포주(promyelocyte line)인 ATCC: CCL-240; 단핵세포로의 분화는 3일 동안 0.1 M 디메틸포름아미드를 첨가하여 달성하였다.]와 함께 배양하였다. 옵소닌식세포작용은 FACS로 측정하였다. 옵소닌식세포작용 활성의 양성 반응은 HL-60 세포의 녹색 형광을 배경 염색(FITC-접합 세균을 혈청은 없으나 보체 존재하에 HL-60 세포와 함께 배양)과 비교 분석하여 결정하였다. 결과는 도 4에 나타냈다.

1BO11는 농도 의존적 방식(폐쇄 환)으로 P. aeruginosa IATS 011 혈청형의 식세포작용을 중재하였다. 가열-불활성화된 보체를 이용하였을 경우(개방 환)에는 식세포작용이 관찰되지 않았다. 1BO11의 옵소닌화 능력(OA50)은 FITC-양성 HL-60 세포의 반-극대 비율의 농도, 0.1 ng/㎖로 결정하였다. 낮은 농도에서의 활성은 1BO11이 잠재적인 높은 작용기임을 시사한다.

< 실시예 4> 단일 클론 항체 1 BO11 의 생체내 보호능

생체내에서의 단일 클론 항체 1BO11의 보호능은 마우스 화상 모델에서 평가하였다. NMRI 마우스에 1BO11의 다른 농도로 i.p. 또는 i.v. 투여하였다. 3 시간 후에, 2x2 cm 화상을 가하였고, 2x10⁷ CFU P. aeruginosa 균주 2310.55(011)를 화상 입은 피부 주위에 s.c. 주입하였다. 전 실험기간 동안 마우스에게 진통제를 주었다. 몇몇은 하루에 세번 관찰되었다. 처리 3일 후 생존률은 도 5에 나타냈다.

4개의 실험 개체(A-D로 표시)로부터의 모든 자료(Pooled data)는 포함된다.

kg 체중당 0.2 mg 이상의 농도는 전신의 슈도모나스 처리로부터 70 ~ 100%의 보호를 주었다. 감소된 농도의 투여는 낮은 생존율을 가져왔다. 화상은 입었으나 슈도모나스 감염은 되지 않은 마우스는 100% 생존률을 가지므로, 직접적으로 치사는 슈도모나스의 감염에 기인한 것이다. 이러한 결과는 생체내에서 P. aeruginosa에 의한 전신성 감염에 대한 1BO11의 효능을 증명한다.

< 실시예 5> 급성 호흡 처리 후, 폐 및 비장으로부처 증가된 세균 제거

1BO11이 호흡기 슈도모나스의 제거능을 평가하기 위하여, 마우스에서 급성 폐 감염 모델을 이용하였다. 이 목적을 위하여, 기관내 폐에 P. aeruginosa 균주 2310.551을 처리하기 앞서, BO11(kg 체중당 0.4 mg)을 i.v. 투여하였다. 처리 농도는 최소의 치사율에서 선택되었다. 그러므로, 폐로부터의 세균의 제거는 평가 지표가 된다.

1BO11의 투여는 폐에서 P. aeruginosa의 빠른 제거를 유도하였다(도 6). 이것은 IgM 항체는 보통 폐조직을 통과하지 않기 때문에 놀라운 사실이다. 48 시간 후에 세균은 완전하게 제거되었지만, 그 시점에 어떤 처리도 하지 않은 감염된 동물은 진행중이었다. 비슷하게, 인간에서도 P. aeruginosa 폐렴은 세균 감염이 전신적이 될 수 있고, 비장에서 P. aeruginosa 존재하의 이러한 실험은 반영될 수 있다.

전신성 감염의 완전한 해결은 1BO11C에 의해 중재된 반면, 무-처리 마우스에는 여전히 세균이 존재하였다(도 6). 이러한 결과는 원내 감염과 같은 호흡기 P. aeruginosa 감염의 치료를 위한 1BO11의 잠재성을 시사한다.

< 실시예 6> 인간 조직에서의 단일 클론 항체 1 BO11 의 교차-반응

인간 조직에서 원하지 않은 1BO11의 비특이적인 결합을 제거하기 위하여, "FDA Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use (1997)" 및 "The Rules Governing Medicinal Products in the European Community Vol. 3a (1994)"에 따라 교차-반응을 조사하였다. 이용된 조직은 하기 표에 나타내었다. 조직은 항체 결합에 영향을 미치는 공여자의 특이적 요소를 최소화하기 위하여, 3개의 상관없는 공여자로부터 수득하였다.

잠재적인 1 BO11 의 교차-반응의 조사를 위하여 이용된 인간 조직

신장부근( Adrenal )	방광	혈액 세포	혈관(내피)
골수	가슴	소뇌	대뇌피질
결장	눈	수란관	심장
회장(위장관)	신장(사구체, 세관)	간	폐
림프절	난소	췌장	부갑상선
이하선	말초 신경	뇌하수체	태반
전립선	피부	척수	비장
위	가로무늬근	정소	흉선 ^*
갑상선	편도	수뇨관	자궁( 자궁목 , 자궁내막)

*: 단지 하나의 공여자로부터 수득한 조직

이러한 어떤 조직에서도 교차-반응을 일어나지 않았다(자료는 나타내지 않음). 생체내에서 조직에 비특이적으로 결합하지 않으므로, 염증성의 부작용은 아주 제한적일 것이다.

< 실시예 7> 단일 클론 항체 1 BO11 에 의한 보체 활성

생체내에서 투여된 인간 항체는 보체의 연속적인 활성에 의한 역반응을 일으킬 수 있다. 이러한 전형적인 보체 경로의 활성은 인간 혈청과 1BO11의 혼합된 상태에서 보체 성분 C4d의 발생을 측정 및 상업적 ELISA(Quidel Corp., San Diego)에 의한 C4d 검출로써 시험관 내에서 조사될 수 있다. GMP 조건에서 생산된 두개의 1BO11 배치("배치 1" 및 "배치 2")는 서로 다른 두 개의 농도, 100 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖로 혈청에서 조사되었다. 혈청만 있는 대조군의 농도는 0 ㎍/㎖으로 하였고, 결과는 도 7에 나타내었다.

혈청에서 1BO11에 의해 촉발된 순차적인 C4d의 생성은 없었지만(white bars), P. aeruginosa 혈청형 IATS 011의 LPS 10 ㎍/㎖ 존재하에 C4d는 높은 생성률을 보였다(black bars). 이러한 결과는 1BO11가 인간에 이용될 경우, 순차적인 염증 부작용은 최소임을 보여주는 것이다.

<110> KENTA Biotech AG <120> Human Monoclonal Antibody Specific for Lipopolysaccharides(LPS) of the Pseudomonas aeruginosa IATS 011 Serotype <130> 7fpi-07-08 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Gln Gly Thr His Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Pro Tyr Trp Met His 1 5 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Arg Tyr Tyr Gly Pro Glu Met 1 5 <210> 7 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 8 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Glu Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Arg Tyr Tyr Gly Pro Glu Met Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gatgttgtga tgactcagtc tccgctctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta tatagtgatg gaaacaccta cttgaattgg 120 tttcagcaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc taaccgggac 180 tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaggtac acactggcct 300 ctcactttcg gcggagggac caaggtggag atcaaa 336 <210> 10 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gaggagcagg tggtggagtc cgggggaggc tttgttcagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt ccatactgga tgcactgggt ccgccaagct 120 ccagggaagg ggctggtgtg ggtctcacgt attaatagtg atgggagcac atactacgcg 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaggaacac actgtatctg 240 caaatgaaca gtctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcaag agatcgatac 300 tatggccccg aaatgtgggg ccaagggaca atggtcaccg tctcttca 348 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR-Primer <400> 11 gccacgctgc tcgtatccga cg 22 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR-Primer <400> 12 agcaggcaca caacagaggc agttcc 26 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing-Primer <400> 13 gctgctcgta tccgacgg 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing-Primer <400> 14 cacaacagag gcagttcc 18

Claims

항체 경사슬 가변부위가 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지고, 중사슬 가변부위가 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는, P. aeruginosa 혈청형 IATS O11 지질다당류(LPS)에 특이적인 인간 단일 클론 항체; 또는 상기 경사슬 가변부위의 아미노산 서열은 서열번호 7과 적어도 85%의 상동성을 가지고, 상기 중사슬 가변부위의 아미노산 서열은 서열번호 8과 적어도 85%의 상동성을 가지며 상기 LPS에 결합할 수 있는 상기 인간 단일 클론 항체의 변이체(variant).
제 1항에 있어서, 상기 경사슬은 카파(κ) 유형인 인간 단일 클론 항체.
제 1항에 있어서, 상기 경사슬은 람다(λ) 유형인 인간 단일 클론 항체.
제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서, 상기 중사슬은 IgM, IgA 또는 IgG 유형인 인간 단일 클론 항체.
제 4항에 있어서, 상기 중사슬은 IgM 유형인 인간 단일 클론 항체.
제 1항 내지 제 4항의 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 클론 항체는 전적으로 인간 아미노산 서열로 이루어진 인간 단일 클론 항체.
제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 클론 항체는 실질적으로 인간 항체의 항원을 인식하는 능력을 갖는 인간 단일 클론 항체.
제 1항 내지 제 7항의 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 클론 항체는 N-말단 및/또는 C-말단 또는 그 사이 부분에 변형이 있는 인간 단일 클론 항체.
제 8항에 있어서, 상기 변형은 다량체화(oligomerization) 및 약물 및/또는 표지 물질(label)과의 접합(conjugation) 중에서 적어도 하나가 선택되는 인간 단일 클론 항체.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사람 단일 클론 항체는 인간 B 세포 또는 상기 인간 B 세포를 골수종 세포 또는 헤테로골수종(heteromyeloma) 세포와 융합시켜 얻은 하이브리도마로부터 수득하는 인간 단일 클론 항체.
제 1항 내지 제 7항 또는 제 10항 중 어느 한 항의 인간 단일 클론 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마.
제 1항 내지 제 7항 또는 제 10항 중 어느 한 항의 인간 단일 클론 항체 경사슬을 암호화하는 핵산.
제 1항 내지 제 7항 또는 제 10항 중 어느 한 항의 인간 단일 클론 항체 중사슬을 암호화하는 핵산.
제 12항의 경사슬을 암호화하는 핵산을 적어도 하나 및/또는 제 13항의 중사슬을 암호화하는 핵산을 적어도 하나 포함하는 벡터.
제 14항에 있어서, 상기 벡터는 그 핵산 서열에 연결되어 그 핵산 정보를 발현하는 데 효과적으로 작용하는 프로모터를 포함하는 벡터.
제 14항의 벡터 및/또는 제 12항 또는 제 13항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
항체의 분비를 허용하는 조건에서 제 11항의 하이브리도마를 배양하거나 또는 인간 단일 클론 항체의 발현에 적합한 조건 하에 제 16항의 숙주세포를 배양하고 선택적으로 그 배양 상층액으로부터 항체를 정제하는, 제 1항 내지 제 7항 또는 제 10항 중 어느 한 항의 인간 단일 항체 생산 방법.
제 1항 내지 제 10항의 중 어느 한 항의 인간 단일 클론 항체를 적어도 하나 및/또는 제 12항 또는 제 13항의 핵산을 적어도 하나, 그리고 약학적으로 적합한 성분을 선택적으로 포함하는 약학적 조성물.
P. aeruginosa 감염 환자의 예방 및/또는 치료를 위한 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 인간 단일 클론 항체 및/또는 제 12항 또는 제 13항의 핵산의 용도.
제 19항에 있어서, 상기 P. aeruginosa 감염은 병원질환인 용도.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 인간 단일 클론 항체를 적어도 하나 이상 및/또는 제 12항 또는 제 13항의 핵산을 적어도 하나, 그리고 진단 검사를 수행하는 데 있어서 적합한 성분을 추가적으로 포함하는 P. aeruginosa 감염 진단용 키트.