SK18122002A3 - Protilátky proti ľudskému MCP-1 - Google Patents

Protilátky proti ľudskému MCP-1 Download PDF

Info

Publication number
SK18122002A3
SK18122002A3 SK1812-2002A SK18122002A SK18122002A3 SK 18122002 A3 SK18122002 A3 SK 18122002A3 SK 18122002 A SK18122002 A SK 18122002A SK 18122002 A3 SK18122002 A3 SK 18122002A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
mcp
amino acid
ser
gly
antibody
Prior art date
Application number
SK1812-2002A
Other languages
English (en)
Inventor
Peter Hiestand
Hans Hofstetter
Trevor Glyn Payne
Roman Urfer
Padova Franco E. Di
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of SK18122002A3 publication Critical patent/SK18122002A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka protilátok proti ľudskému monocytovému chemoatrahujúcemu proteinu 1 (MCP-1), a tiež použitia takýchto protilátok na liečenie ochorení a porúch, ktoré zahŕňajú migráciu a aktiváciu monocytov a T-lymfocytov, ako sú napr. zápalové ochorenia.
Doterajší stav techniky
Publikovaná japonská patentová prihláška JP 05276986, (Sumitomo Electric Co.) opisuje prípravu hlodavčej monoklonálnej protilátky proti ľudskému MCP-1, ktorá je užitočná na stanovenie MCP-1 a na liečenie a diagnostiku ochorení, ktoré zahŕňajú infiltráciu makrofágov. Publikovaná japonská patentová prihláška JP 09067399 (Mitsui Toatsu) opisuje prípravu ľudskej mcr.oklonálnej protilátky proti ľudskému MCP-1 z ľudských krviniek periférnej krvi transformovaných EBV na použitie na liečenie zápalov. Publikovaná japonská patentová prihláška JP 11060502 (Teijin) opisuje použitie inhibítora MCP-1, konkrétne ľudskej protilátky anti-MCP-1 na liečenie mozgovej mŕtvice.
Podstata vynálezu
Autori predkladaného vynálezu pripravili zlepšené protilátky proti ľudskému MCP-1 na použitie na liečenie ochorení a porúch, ktoré zahŕňajú migráciu a aktiváciu monocytov a T-lymfocytov.,
Predkladaný vynález teda poskytuje molekulu viažucu MCP-1, a táto molekula obsahuje miesto viažuce antigén obsahujúce aspoň jednu variabilnú doménu ťažkého reťazca (VH) imunoglobulínu, ktorá obsahuje rad hypervariabilných úsekov CDR1, CDR2 a CDR3, kde CDR1 má aminokyselinovú sekvenciu His-Tyr-Trp-Met-Ser, CDR2 má aminokyselinovú sekvenciu Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly, a CDR3 má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu, a jej priame ekvivalenty.
Ďalej vynález tiež poskytuje molekulu viažucu MCP-1, ktorá obsahuje miesto viažuce antigén obsahujúce aspoň jednu variabilnú doménu ľahkého reťazca imunoglobulinu (VL) , ktorá obsahuje sled hypervariabilných úsekov CDRľ, CDR2' a CDR3', kde CDRľ má aminokyselinovú sekvenciu Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala, kde CDR2' má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser, a kde CDR3' má aminokyselinovú sekvenciu Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro, a jej priame ekvivalenty.
Prvý aspekt vynálezu poskytuje jednodoménovú molekulu viažucu MCP-1 obsahujúcu izolovaný ťažký reťazec imunoglobulinu obsahujúci variabilnú doménu ťažkého reťazca (VH) ako je definovaná skôr.
Druhý aspekt vynálezu tiež poskytuje molekulu viažucu MCP-1 obsahujúcu tak variabilné domény ťažkého (VH) ako aj ľahkého reťazca (VL) , pričom molekula viažuca MCP-1 obsahuje aspoň jedno miesto viažuce antigén obsahujúce:
a) variabilnú doménu ťažkého reťazca imunoglobulinu (VH) , ktorá obsahuje sled hypervariabilných úsekov CDR1, CDR2 a CDR3,· kde CDR1 má aminokyselinovú sekvenciu His-Tyr-Trp-Met-Ser,. CDR2 má aminokyselinovú sekvenciu Asn-Ile-GluGln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly, a CDR3 má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu, a
b) variabilnú doménu ľahkého reťazca imunoglobulinu (VL) , ktorá obsahuje sled hypervariabilných úsekov CDRľ, CDR2' a CDR31 , kde CDR1' má aminokyselinovú sekvenciu Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala, CDR2' má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser, a CDR3' má aminokyse3 linovú sekvenciu Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro, a jej priame ekvivalenty.
Pokiaľ nie je uvedené inak, ktorýkoľvek polypeptidový reťazec je v tomto texte opísaný tak, že uvedená aminokyselinová sekvencia začína N-koncovým úsekom a končí C-koncovým úsekom.
Keď miesto viažuce antigén obsahuje tak VH ako aj VL domény, tieto domény môžu byť lokalizované na rovnakej polypeptidovej molekule alebo, výhodne, každá doména môže byť na odlišnom reťazci, pričom VH doména je časťou ťažkého reťazca imunoglobulínu alebo jeho fragmentu a VL je časťou ľahkého reťazca imunoglobulínu alebo jeho fragmentu.
Termínom molekula viažuca MCP-1 sa v predkladanom opise myslí ktorákoľvek molekula schopná viazať MCP-1 antigén, buď samotný alebo asociovaný s inými molekulami. Väzbová reakcia sa môže dokázať štandardnými metódami (kvalitatívnymi testami), ako sú napríklad biologický test (bioassay) na stanovenie inhibície väzby MCP-1 na jeho receptor, t.j.. chemokínový receptor 2 (CCR-2), napr. CCR2B alebo ktorýkoľvek iný druh väzbového testu, v porovnaní s negatívnym kontrolným testom, v ktorom sa ako protilátka použije protilátka s nepríbuznou špecificitou, ale výhodne s rovnakým izotypom. A výhodne môže byť väzba molekuly viažucej MCP-1 podľa vynálezu a MCP-1 ukázaná napríklad pomocou BIAcore testu.
K príkladom molekúl viažucich antigén patria protilátky, ktoré sú vytvárané v B-lymfocytoch alebo hybridómoch, a tiež chimérické, CDR-štepené alebo ľudské protilátky alebo akékoľvek ich fragmenty, napr. F(ab')2 a Fab fragmenty, a tiež jednoreťazcové alebo jednodoménové protilátky.
Jednoreťazcová protilátka pozostáva z variabilnej domény ťažkého a ľahkého reťazca protilátky kovalentne spojených pomocou peptidovej spojky (linkeru), ktorú tvorí zvyčajne 10 až 30 aminokyselín, výhodne 15 až 25 aminokyselín. Teda takáto štruktúra neobsahuje konštantné úseky ťažkého a ľahkého reťazca a verí sa, že malý spojovací peptidový úsek by mal byť menej antigénny ako celý konštantný úsek protilátky.
Termín chimérická protilátka v opise označuje protilátku, v ktorej konštantné úseky ťažkého alebo ľahkého reťazca alebo oboch sú ľudského pôvodu, zatiaľ čo variabilné domény tak ťažkého ako aj ľahkého reťazca sú iného ako ľudského pôvodu (non-humánne), napr. myšieho alebo ľudského pôvodu, ale pochádzajú z odlišnej ľudskej protilátky.
Termín CDR-štepená protilátka označuje protilátku, v ktorej hypervariabilné úseky (CDR) pochádzajú z donorovej protilátky, ako je napríklad iná ako ľudská (non-human) protilátka (napr. myšia) alebo odlišná ľudská protilátka, zatiaľ čo všetky alebo v podstate všetky ďalšie časti imunoglobulínu, napr. konštantné úseky a vysoko konzervatívne úseky variabilnej domény, t.j. úseky definujúce rámec protilátky („framework), pochádzajú z akceptorovej protilátky, napr. protilátky ľudského pôvodu. CDR-štepená protilátka môže však obsahovať niekoľko aminokyselín donorovej sekvencie v úseku rámca, napríklad v úsekoch rámca susediacich s hypervariabilnými úsekmi.
Termín ľudská protilátka označuje protilátku, v ktorej konštantné a variabilné úseky tak ťažkého ako aj ľahkého reťazca sú ľudského pôvodu, alebo majú sekvencie v podstate identické so sekvenciami ľudského pôvodu, nie nutne z rovnakej protilátky, a patria sem aj protilátky produkované v myšiach, v ktorých gény pre variabilné a konštantné časti imunoglobulínu boli nahradené ich ľudskými analógmi, napr. ako je opísané všeobecne v dokumentoch EP 0546073 BI, US Patent č. 5545806, US Patent č. 5569825, US Patent č. 5625126, US Patent č. 5633425, US Patent č. 5661016, US Patent č. 5770429, EP 0 438474 BI a EP 0 463151 BI.
Osobitne výhodné molekuly viažuce MCP-1 podľa vynálezu sú ľudské protilátky, osobitne potom protilátky AAV293, AAV294 a
ABN912, ktoré sú následne opísané v príkladoch (protilátka
AAV293 je ľudská protilátka typu IgG3/K, protilátka ABN912 je ľudská protilátka typu IgG4/K, ale v ďalších ohľadoch sú v podstate identické. Protilátka AAV294 je ľudská protilátka typu IgGl/κ, ktorá má variabilné domény identické s doménami protilátky AAV293 s výnimkou jednoduchej aminokyselinovej zámeny vo FR1, CDR2 a FR3 vo VH a CDR1' a FR31 vo VL, ako je opísané v príkladoch) .
Takže vo výhodných chimérických protilátkach sú variabilné domény tak ťažkého ako aj ľahkého reťazca ľudského pôvodu, napríklad také, aké sú v protilátke ABN912, a sú v zozname sekvencií uvedené ako sekvencia SEQ ID NO: 1 a sekvencia SEQ ID NO: 2. Domény konštantného úseku výhodne tiež obsahujú vhodné ľudské domény konštantného úseku, napríklad ako sú opísané v Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat E.A. et al, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Inštitúte of Health).
Hypervariabilné úseky môžu byť asociované s akýmikoľvek úsekmi rámca protilátky, avšak výhodne sú ľudského pôvodu. Vhodné úseky rámca protilátok sú opísané v Kabat E.A. et al. (pozri skôr). Výhodný rámec ťažkého reťazca je ľudský rámec ťažkého reťazca, napríklad protilátky ABN912, uvedený v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 1. Táto sekvencia pozostáva zo sekvenčných úsekov FR1, FR2, FR3 a FR4. Podobne sekvencia SEQ ID NO: 2 ukazuje výhodný rámec ľahkého reťazca protilátky ABN912, ktorého sekvencia pozostáva z úsekov FRľ , FR2', FR31 a FR4'. Alternatívne úseky rámca protilátok, výhodne úseky rámca ľudských protilátok, sa môžu použiť k úsekom uvedeným ako sekvencie SEQ ID NO: 1 a 2, napr. ako je opísané v Kabat et al.. (pozri skôr). Niekoľko aminokyselinových zvyškov v úseku rámca, konkrétne v častiach rámca susediacich s hypervariabilnými úsekmi, sa môže líšiť od relevantných definovaných úsekov rámca, napr. s cieľom ovplyvniť väzbové vlastnosti.
Teda vynález tiež poskytuje molekulu viažucu MCP-1, ktorá obsahuje aspoň jedno väzbové miesto pre antigén obsahujúce buď prvú doménu s aminokyselinovou sekvenciou v podstate identickou so sekvenciou uvedenou v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 1 začínajúcou aminokyselinou v polohe 1 a končiacou aminokyselinou v polohe 122, alebo prvú doménu opísanú skôr a druhú doménu s aminokyselinovou sekvenciou v podstate identickou so sekvenciou uvedenou v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 2, začínajúcou aminokyselinou v polohe 1 a končiacou aminokyselinou v polohe 109.
Monoklonálne protilátky namierené proti proteínom prirodzene sa vyskytujúcim u všetkých ľudí sa vyvíjajú typicky v iných ako ľudských systémoch, napr. v myši. Priamym dôsledkom týchto skutočností je to, že xenogénna protilátka produkovaná pomocou hybridómu, pokiaľ je podaná človeku, vyvoláva nežiaducu imunitnú reakciu, ktorá je predovšetkým sprostredkovaná konštantnou časťou xenogénneho imunoglobulínu. To výrazne obmedzuje použitie takých protilátok, keďže sa nemôžu podávať dlhšie obdobie. Teda je osobitne výhodné použitie jednoreťazcových, jednodcménových, chimérických, CDR-štepených alebo hlavne ľudských protilátok, ktoré po podaní človeku s veľkou pravdepodobnosťou nevyvolajú žiadnu podstatnú allogénnu reakciu.
Z hľadiska toho, čo je uvedené v predchádzajúcom, texte, výhodnejšia molekula viažuca MCP-1 podľa vynálezu je vybraná zo skupiny, ktorú tvorí ľudská anti-MCP-1 protilátka, ktorá obsahuje aspoň
a) ťažký reťazec imunoglobulínu alebo fragment, ktorý obsahuje (i) variabilnú doménu obsahujúcu rad hypervariabilných úsekov CDR1, CDR2 a CDR3 a (ii) konštantnú časť ľudského ťažkého reťazca alebo jej fragment, kde CDR1 má aminokyselinovú sekvenciu His-Tyr-Trp-Met-Ser, CDR2 má aminokyselinovú sekvenciu Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly, a CDR3 má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu a
b) ľahký reťazec imunoglobulínu alebo jeho fragment, ktorý obsahuje (i) variabilnú doménu obsahujúcu hypervariabilný úsek CDR3 ' a voliteľne tiež hypervariabilné úseky CDR1' a CDR2' a (ii) konštantnú časť ľudského ľahkého reťazca alebo jej fragment, kde CDR1' má aminokyselinovú sekvenciu Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala, CDR2' má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser, a CDR3' má aminokyselinovú sekvenciu Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro, a jej priame ekvivalenty.
Alternatívne, molekula viažuca MCP-1 podľa vynálezu môže byť vybraná zo skupiny, ktorú tvorí jednoreťazcová väzbová molekula, ktorá obsahuje miesto viažuce antigén obsahujúce
a) prvú doménu obsahujúcu rad hypervariabilných úsekcv CDR1, CDR2 a CDR3, kde hypervariabilné úseky majú aminokyselinovú sekvenciu tu uvedenú ako sekvencia SEQ ID NO: 1,
b) druhú doménu obsahujúcu hypervariabilné úseky CDR1', CDR2' a CDR3', kde hypervariabilné úseky majú aminokyselinovú sekvenciu tu uvedenú ako sekvencia SEQ ID NO: 2, a
c) peptidový linker, ktorý je naviazaný buď na N-koniec prvej domény a C-koniec druhej domény alebo na C-koniec prvej domény a N-koniec druhej domény, a jej priame ekvivalenty.
Ako je odborníkovi známe, malé zmeny v aminokyselinovej sekvencii, ako je napríklad delécia (odstránenie), adícia (pridanie) nebo substitúcia (nahradenie) jednej, iba niekoľko málo alebo dokonca aj niekoľko viac aminokyselín, môžu poskytnúť alelickú formu pôvodného proteínu, ktorá má v podstate identické vlastnosti.
Teda termín jej priamy ekvivalent označuje v predkladanom vynáleze buď jednodoménovú molekulu viažucu MCP-1 (molekula X), (i) v ktorej hypervariabilné úseky CDR1, CDR2 a CDR3, chápané ako celok, sú aspoň na 80% homologické, výhodne aspoň na 90% homologické, výhodnejšie aspoň na 95% homologické s hypervariabilnými úsekmi v sekvencii SEQ ID NO: 1, a (ii) ktorá je schopná inhibovať väzbu MCP-1 na jeho receptor v podstate v rovnakom rozsahu ako referenčná molekula, ktorá má úseky protilátkového rámca identické so zodpovedajúcimi úsekmi molekuly X, ale ktoré majú hypervariabilné úseky CDR1, CDR2 a CDR3 identické so zodpovedajúcimi úsekmi sekvencie SEQ ID NO: 1, alebo akúkoľvek molekulu viažucu MCP-1, ktorá má aspoň dve domény na každé väzobné miesto(molekula X'), (i) v ktorej hypervariabilné úseky CDR1, CDR2, CDR3, CDR3', CDR1', CDR2' a CDR3', chápané ako celok, sú aspoň na 80% homologické, výhodne aspoň na 90% homologické, výhodnejšie aspoň na 95% homologické s hypervariabilnými úsekmi sekvencie SEQ ID NO: 1 a sekvencie SEQ ID NO: 2, a (ii) ktorá je schopná inhibovať väzbu MCP-1 na jeho receptor v podstate v rovnakom rozsahu ako referenčná molekula, ktorá má úseky protilátkového rámca a konštantné úseky identické so zodpovedajúcimi úsekmi molekuly X', ale ktorá má hypervariabilné úseky CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' a CDR3 ’ identické so zodpovedajúcimi úsekmi sekvencie SEQ ID NO: 1 a sekvencie SEQ ID NO: 2.
V kontexte opisu predkladaného vynálezu je aminokyselinová sekvencia aspoň na 80% homologické s druhou sekvenciou, ak tieto sekvencie majú aspoň 80% identických aminokyselinových zvyškov v rovnakej polohe, ak sú sekvencie optimálne priradené („aligned), pričom medzery („gaps) alebo inzercie v aminokyselinovej sekvencii sú považované za neidentické „zvyšky.
Inhibicia väzby MCP-1 na receptor sa môže ľahko testovať pomocou rôznych testov, ako sú napríklad testy, ktoré sú opísané ďalej v texte. Výraz v rovnakom rozsahu (alebo v rovnakej miere) znamená v kontexte predkladaného opisu, že referenčná a s ňou ekvivalentná molekula vykazujú zo štatistického hľadiska v podstate identickú funkčnú závislosť inhibicie MCP-1 väzby podľa jedného z testov spomenutých skôr. Tak napríklad molekula viažuca MCP-1 podľa vynálezu má typicky hodnotu IC50 pre inhibíciu väzby MCP-1 na jeho receptor (CCR2B) ležiacu v intervale +/- x 5 hodnoty IC50 zodpovedajúcej referenčnej molekuly pri testovaní, ako je už opísané skôr, výhodne sú obidve hodnoty v podstate zhodné.
Použitý môže byť napr. test kompetitívnej inhibicie väzby MCP-1 na membránovo viazaný receptor MCP-1 (CCR2B) a molekulu viažucu MCP-1 podľa vynálezu, a to metódou SPA, ako bude opísané v príkladoch.
Najvýhodnejšie ľudská MCP-1 protilátka obsahuje aspoň
a) jeden ťažký reťazec, ktorý obsahuje variabilnú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú so sekvenciou uvedenou tu ako sekvencia SEQ ID NO: 1 začínajúcou aminokyselinou v polohe 1 a končiacou aminokyselinou v polohe 122, a konštantnú časť ľudského ťažkého reťazca, a
b) jeden ľahký reťazec, ktorý obsahuje variabilnú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú so sekvenciou uvedenou tu ako sekvencia SEQ ID NO: 2 začínajúcou aminokyselinou . v polohe 1 a končiacou aminokyselinou v polohe 109, a konštantný úsek ľudského ľahkého reťazca.
Konštantný úsek ľudského ťažkého reťazca môže byť typu γι, y2, Y3/ Y4z P/ «1/ «2, δ alebo ε, výhodne typu y, a výhodnejšie typu Y4, zatiaľ čo konštantná časť ľudského ľahkého reťazca je typu k alebo λ (ktorý zahŕňa subtypy λχ, λ2, λ3) , ale výhodne je typu k. Aminokyselinové sekvencie všetkých týchto konštantných úsekov sú uvedené v publikácii Kabat et al., citované skôr.
Molekula viažuca MCP-1 podľa vynálezu môže byť pripravená tzv. technikou rekombinantnej DNA (génového inžinierstva).
Vzhľadom na to musí byť skonštruovaná jedna alebo viac molekúl
DNA kódujúcich väzbovú molekulu, ktorá sa potom umiestni pod vhodnú kontrolnú sekvenciu a prenesie do vhodného hostiteľského organizmu, kde sú potom expr.imované.
V celkom všeobecnom zmysle tak vynález poskytuje:
(i) DNA molekuly kódujúce jednodoménovú molekulu viažucu MCP-1 podľa vynálezu, jednoreťazcovú molekulu viažucu MCP-1 podľa vynálezu, ťažké alebo ľahké reťazce z molekuly viažuce MCP-1 podľa vynálezu alebo ich fragmenty, a (ii) použitie DNA molekúl podľa vynálezu na produkciu molekuly viažucej MCP-1 podľa vynálezu pomocou rekombinantnéj technológie.
Doterajší stav techniky je taký, že odborník je schopný ľahko syntetizovať DNA molekuly podľa predkladaného vynálezu na základe informácií uvedených v tomto opise, t.j. aminokyselinových sekvencií hypervariabilných úsekov a DNA sekvencií, ktoré ich kódujú. Metóda konštrukcie génu variabilnej domény je napríklad opísaná v Európskej patentovej prihláške č. 239 400 a môže byť stručne zhrnutá nasledujúcim spôsobom:
Klonuje sa gén kódujúci variabilnú doménu mAb (monoklonálne protilátky) s ľubovoľnou špecificitou. Určia sa DNA segmenty kódujúce rámec protilátky a hypervariabilné úseky a DNA segmenty kódujúce hypervariabilné úseky sa odstránia, takže DNA segmenty kódujúce rámcové úseky sú vzájomne spojené pomocou vhodných reštrikčných miest v mieste spojenia. Reštrikčné miesta sa môžu vytvoriť vo vhodných polohách mutagenézou DNA molekúl pomocou štandardných postupov odborníkovi známych. Dvojreťazcové syntetické CDR kazety sú pripravené pomocou DNA syntézy podľa sekvencie uvedenej ako sekvencia SEQ ID NO: 1 alebo sekvencia SEQ ID NO: 2. Tieto kazety sa potom zakončia kohéznymi lepivými koncami, takže sa môžu ligovať do spojovacích miest (reštrikčných miest) rámcových úsekov.
Navyše nie je nutné mať prístup k mRNA z produkujúcej hybridómovej bunkovej línie, aby bolo možné získať DNA konštrukt kódujúci molekulu viažucu MČP-1 podľa vynálezu. Tak napr. PCT prihláška publikovaná pod č. WO 90/07861 poskytuje úplné inštrukcie na prípravu protilátky pomocou techniky rekcmbinantnej DNA, pričom východiskovou informáciou je iba nukieotidová sekvencia génu. Opísaný spôsob zahŕňa syntézu radu oligonukleotidov, ich amplifikáciu pomocou PCR (polymerázovej reťazovej reakcie) a nakoniec ich zostrih a spojenie (splicing), čím vznikne požadovaná DNA sekvencia.
Expresné vektory obsahujúce vhodný promótor alebo gény kódujúce konštantné úseky ťažkého a ľahkého reťazca sú odbornej verejnosti k dispozícii. Teda ak je jedna DNA molekula podľa vynálezu pripravená, môže sa ľahko preniesť do vhodného expresného vektora. DNA molekuly kódujúce jednoreťazcové protilátky sa môžu tiež pripraviť s použitím štandardného postupu, napríklad ako je opísaný v medzinárodnej patentovej prihláške WO 88/1649.
Vzhľadom na to, čo je - už uvedené, na splnenie požiadavky dostatočnosti opisu vynálezu nie je nutné uvádzať ani hybridómy ani bunkové línie opísané vo vynáleze.
V konkrétnom uskutočnení vynález obsahuje prvý a druhý DNA konštrukt na produkciu molekuly viažucej MCP-1, ako sú opísané ďalej :
Prvý DNA konštrukt kóduje ťažký reťazec alebo jeho fragment a obsahuje
a) prvú časť, ktorá kóduje variabilnú doménu obsahujúcu striedavo úsek rámca a hypervariabilné úseky, pričom hypervariabilné úseky sú v sekvenciách CDR1, CDR2 a CDR3 aminokyselinové sekvencie ktorých sú uvedené v sekvencii SEQ ID NO: 1; pričom prvá časť začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu variabilnej domény a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu variabilnej domény, a
b) druhú časť kódujúcu konštantný úsek ťažkého reťazca alebo jeho fragment, ktorý začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu konštantnej časti ťažkého reťazca a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu konštantnej časti alebo jej fragmentu, po ktorom nasleduje stop kodón.
Výhodne prvá časť kóduje variabilnú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 1 začínajúca aminokyselinou v polohe 1 a končiaca aminokyselinou v polohe 122. Výhodnejšie má prvá časť nukleotidovú sekvenciu, ktorá je uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 1 začínajúca nukleotidom v polohe 1 a končiaca nukleotidom v polohe 366. Výhodne druhá časť kóduje konštantnú časť ludského ťažkého reťazca, výhodnejšie konštantnú časť ludského reťazca γ4.· Táto druhá časť môže byť DNA fragment genómového pôvodu (t.j. obsahuje intróny) alebo cDNA fragment (t.j. bez intrónov).
Druhý DNA konštrukt kóduje lahký reťazec alebo jeho fragment a obsahuje
a) prvú časť, ktorá kóduje variabilnú doménu obsahujúcu striedavo úseky rámca a hypervariabilné úseky, pričom hypervariabilné úseky sú CDRľ, CDR2' a CDR3', ktorých aminokyselinové sekvencie sú v zozname sekvencii uvedené ako sekvencia SEQ ID NO: 2, pričom táto prvá časť začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu variabilnej domény a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu variabilnej domény, a
b) druhú časť kódujúcu konštantnú časť ľahkého reťazca alebo jej fragment, ktorý začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu konštantnej časti lahkého reťazca a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu konštantnej časti alebo jej fragmentu, po ktorom nasleduje stop kodón.
Výhodne táto prvá časť kóduje variabilnú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID
NO: 2 začínajúca aminokyselinou v polohe 1 a končiaca aminokyse-
linou v polohe 109. Výhodnejšie, prvá časť má nukleotidovú
sekvenciu uvedenú tu ako sekvencia SEQ ID NO: 2 začínajúcu
nukleotidom v polohe 1 a končiacu nukleotidom v polohe 327.
Výhodne druhá časť kóduje konštantnú časť ľudského ľahkého reťazca, výhodnejšie konštantnú časť ľudského reťazca k.
Vynález tiež zahŕňa molekuly viažuce MCP-1, v ktorých je jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov v CDR1, CDR2, CDR3, CDRľ, CDR2' alebo CDR3' ' zmenených v porovnaní so zvyškami v sekvencii SEQ ID NO: 1 a sekvencii SEQ ID NO: 2, napríklad mutáciou, napr. miestne cielenou mutagenézou príslušnej DNA sekvencie. Vynález teda zahŕňa tiež DNA sekvencie kódujúce takto zmenené molekuly viažuce MCP-1. Vynález tiež zahŕňa molekuly viažuce MCP-1, v ktorých jeden alebo viac, typicky len niekoľko málo, aminokyselinových zvyškov v úseku rámca bolo zmenených v porovnaní so zvyškami v sekvencii SEQ ID NO: 1 a v sekvencii SEQ ID NO: 2.
V prvom a druhom DNA konštrukte môže byť prvá a druhá časť oddelená intrónom, a v intróne medzi prvou a druhou časťou môže byť výhodne lokalizovaný enhancer (zosilňovací element) . Prítomnosť takéhoto enhanceru, ktorý je transkribovaný, ale nie je translatovaný, môže pomôcť účinnosti transkripcie. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu prvý a druhý DNA konštrukt obsahujú enhancer génu ťažkého reťazca, výhodne ľudského pôvodu..
Každý z DNA konštruktov je umiestnený pod kontrolu vhodných kontrolných sekvencii, konkrétne pod kontrolou vhodného promótora. Môže sa použiť akýkoľvek typ promótora, za predpokladu, že je adaptovaný pre hostiteľský organizmus, do ktorého sa budú DNA konštrukty prenášať na expresiu. Avšak pokiaľ má expresia prebehnúť v cicavčích bunkách, osobitne výhodné je použitie promótora imunoglobulínového génu.
Požadovaná protilátka môže byť produkovaná v bunkovej kultúre alebo v transgénnom zvierati. Vhodné transgénne zviera sa môže pripraviť štandardným spôsobom, ktorý je odborníkom známy, ako je napr. mikroinjekcia prvého a druhého DNA konštruktu riadeného vhodnými kontrolnými sekvenciami do vajíčka, a potom prenosom takto pripraveného vajíčka do vhodnej pseudo-gravidnej samice, a nakoniec selekciou potomstva exprimujúceho požadovanú protilátku.
Keď sú reťazce protilátky produkované v bunkovej kultúre, DNA konštrukty sa musia najskôr vložiť buď do jedného expresného vektora alebo do dvoch oddelených, ale pritom kompatibilných expresných vektorov, pričom táto druhá možnosť je výhodnejšia.
Teda predkladaný vynález tiež poskytuje expresný vektor schopný replikácie v prokaryotickej alebo eukaryotickej bunkovej línii, ktorý obsahuje aspoň jeden z DNA konštruktov skôr opísaných .
Každý z expresných vektorov obsahujúcich DNA konštrukt je potom prenesený do vhodného hostiteľského organizmu. Keď sú DNA konštrukty oddelene vložené do dvoch expresných vektorov, môžu byť prenesené oddelene, t.j. jeden typ vektora do jednej bunky, alebo môžu byť prenesené spoločne (tzv. kotransfer), čo sa považuje za výhodnejšiu možnosť. Vhodným hostiteľským organizmom sú baktérie, kvasinky alebo cicavčie bunkové línie, pričom výhodná je táto tretia možnosť. Výhodnejšie, cicavčia bunková línia je línia lymfoidného pôvodu, napr. myelóm, hybridom alebo normálne imortalizované B-lymfocyty, ktoré neexprimujú žiadne endogénne ťažké ani ľahké reťazce protilátky, napr. bunková línia SP2/0.
Pre expresiu v cicavčích bunkách je výhodné, keď sekvencia kódujúca molekulu viažucu MCP-1 je integrovaná do DNA hostiteľskej bunky v lokuse, ktorý umožňuje alebo podporuje vysoký stupeň expresie molekúl viažucich MCP-1. Bunky, v ktorých je sekvencia kódujúca molekulu viažuca MCP-1 integrovaná do takého výhodného lokusu, môžu byť identifikované a selektované na základe hladiny molekúl viažucich MCP-1, ktorú exprimujú. Akýkoľvek vhodný selekčný marker sa môže použiť na prípravu hos15 titeľských buniek obsahujúcich kódujúcu sekvenciu pre molekulu viažucu MCP-1, napr. gén dhfr/metotrexát alebo ekvivalentný selekčný systém. Výhodné systémy na expresiu molekuly viažucej MCP-1 podía vynálezu sú napr. amplifikačné/selekčné systémy založené na GS, opísané v EP 0256055 B, EP 0323997 Bav európskej patentovej prihláške 89303964.4.
Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje spôsob prípravy molekuly viažucej MCP-1, ktorý zahŕňa kroky:
(i) kultivácia organizmu, ktorý je transformovaný expresným vektorom definovaným skôr, a (ii) izolácia molekuly viažucej MCP-1 z bunkovej kultúry.
Najvýhodnejšie molekula viažuca MCP-1 podľa vynálezu je ľudská protilátka, napr. protilátka AAV293, AAV294 alebo ABN912, a môže byť pripravená kultiváciou zodpovedajúcej hybridómovej bunkovej línie, alebo výhodne z rekombinantne j. bunkovej línie obsahujúcej DNA kódujúcu ľudskú protilátku, vrátane DNA zmenenej tak, že sa mení izotyp protilátky alebo iná funkcia alebo vlastnosť protilátky.
Podľa predkladaného vynálezu sa zistilo, že protilátka AAV294 a osobitne AAV293 a ABN912 protilátky krížovo reagujú s rekombinantným ľudským eotaxínom-1. Tieto protilátky výhodne interagujú s eotaxínom-1 a tiež MCP-1, a môžu sa použiť na inhibiciu väzby eotaxínu-1 na jeho'receptor, okrem toho na inhibíciu väzby MCP-1 na jeho receptor. Predpokladá sa, že sekrécia eotaxínu sa podieľa na alergických ochoreniach vrátane alergických a zápalových ochorení dýchacích ciest, ako je astma. Protilátky, konkrétne chimérické a CDR-štepené protilátky, a osobitne potom ľudské protilátky, ktoré majú väzbovú špecificitu tak pre MCP-1 ak; aj eotaxín, napr. ľudský MCP-1 a ľudský eotaxín, a použitie takýchto protilátok na liečenie ochorení sprostredkovaných MCP-1 alebo eotaxínom, sú zahrnuté v predkladanom vynáleze.
Takže ďalší aspekt vynálezu zahŕňa protilátku proti MCP-1, ktorá krížovo reaguje s eotaxinom.
Výhodne protilátky podlá tohto aspektu predkladaného vynálezu sú protilátky, ktoré sú schopné inhibovať väzbu MCP-1 na jeho receptor a tiež schopné inhibovať väzbu eotaxinu na jeho receptor.
Ešte v ďalších aspektoch predkladaný vynález zahŕňa:
i) použitie protilátky proti MCP-1, ktorá krížovo reaguje s eotaxínom-1, a ktorá je schopná inhibovať väzbu MCP-1 a eotaxínu-1 na ich receptory, na liečenie ochorení alebo porúch sprostredkovaných MCP-1 alebo eotaxinom-1;
ii) liečenie ochorení alebo porúch sprostredkovaných MCP-1 alebo eotaxinom u pacienta, ktoré zahŕňa podávanie účinného množstva protilátky proti MCP-1 pacientovi, ktorá krížovo reaguje s eotaxinom, a ktorá je schopná inhibovať väzbu MCP-1 a eotaxinu na ich receptory;
iii) farmaceutickú kompozíciu obsahujúcu protilátku proti MCP-1, ktorá krížovo reaguje s eotaxinom, a ktorá je schopná inhibovať väzbu MCP-1 a eotaxinu na ich receptory, v kombinácii s farmaceutický prijateľným vehikulom, riedidlom alebo nosičom; a iv) použitie protilátky proti MCP-1, ktorá krížovo reaguje s eotaxinom, a ktorá je schopná inhibovať väzbu MCP-1 a eotaxinu na ich receptory, na výrobu lieku na liečenie ochorení alebo porúch sprostredkovaných MCP-1 alebo eotaxínom.
Protilátka proti MCP-1 podľa týchto ďalších aspektov vynálezu výhodne krížovo reaguje s eotaxinom-1 a ochorenia sprostredkované eotaxinom sú výhodne ochorenia sprostredkované eotaxínom-1.
V kontexte predkladaného opisu výraz, že protilátka je schopná inhibovať väzbu MCP-1 a eotaxinu na ich receptory znamená, že protilátka je schopná inhibovať väzbu MCP-1 na jeho receptor a väzbu eotaxínu na jeho receptor v podstate v rovnakom rozsahu ako protilátka AAV294, AAV293 alebo ABN912, pričom výraz v rovnakom rozsahu je už definovaný skôr v texte.
V kontexte predkladaného opisu výraz choroba sprostredkovaná MCP-1 a tiež „choroba sprostredkovaná eotaxinom zahŕňa všetky ochorenia a zdravotné stavy, v ktorých hrá nejakú úlohu MCP-1 alebo eotaxin, konkrétne potom eotaxin-1, či už priamo alebo nepriamo pri chorobe alebo stave, vrátane podielu na príčinách ochorenia, rozvoji a progrese choroby, perzistencie alebo patologických prejavoch choroby alebo stavu.
V kontexte predkladaného opisu sa termíny liečený alebo liečiť týkajú tak profylaktickej čiže preventívnej starostlivosti ako aj kuratívnej starostlivosti alebo liečby modifikujúcej ochorenie, vrátane starostlivosti o pacientov, ktorí sú v riziku získania ochorenia alebo majú podozrenie, že chorobu získali, a tiež starostlivosti o pacientov, ktorí chorobou už trpia alebo boli diagnostikovaní ako trpiaci chorobou, a ďalej sa termíny týkajú aj potlačenia klinického relapsu choroby.
Protilátky AAV293 a ΆΒΝ912 majú väzbovú afinitu pre MCP-1, ktorá je vyššia, ako afinity skôr opísané pre anti-MCP-1 protilátky, napr. anti-ľudské MCP-1 protilátky. Tak napr. ABN912 má disociačnú rovnovážnu konštantu KD pre väzbu na MCP-1 nižšiu ako približne 50 pM, napr. približne 43 pM. Táto vysoká väzbová afinita robí z protilátky. ABN912 konkrétne veľmi vhodnú protilátku na terapeutické použitie.
Teda v ešte ďalšom aspekte vynález poskytuje protilátku proti MCP-1, ktorá má KD pre väzbu na MCP-1 približne 50 pM alebo nižšiu. Tento aspekt vynálezu tiež zahŕňa použitia, spôsoby a kompozície pre protilátky s takou vysokou afinitou, ako je opísané skôr pre protilátky proti MCP-1, ktoré krížovo reagujú s eotaxinom.
A ďalej sa podlá predkladaného vynálezu zistilo, že protilátka ABN912 sa viaže na antigénny epitop MCP-1, ktorý zahŕňa argininový zvyšok v polohe 24 sekvencie MCP-1. Teda výhodne protilátka ABN912 je schopná interferovať priamo s väzbou MCP-1 na jeho receptor (CCR2B) , Arg24 je dôležitý zvyšok v MCP-1 na naviazanie MCP-1 na CCR2B. Navyše väzbové miesto ABN912 miesto zahŕňa zvyšky Argl8 a Lys49 v sekvencii MCP-1.
V súlade s ešte ďalším aspektom vynález zahŕňa protilátku proti MCP-1, ktorá sa viaže na antigénny epitop MCP-1, ktorý zahŕňa argininový zvyšok v polohe 24 aminokyselinovej sekvencie MCP-1. Výhodne antigénny epitop tiež zahŕňa argininový zvyšok v polohe 18 a lyzínový zvyšok v polohe 49 MCP-1. Podobne aj tento aspekt vynálezu zahŕňa použitia, spôsoby a kompozície, ako je opísané už skôr pre protilátky proti MCP-1, ktoré krížovo reagujú s eotaxínom.
Molekuly viažuce MCP-1, ako sú definované skôr, konkrétne molekula viažuca MCP-1 podlá prvého a druhého aspektu predkladaného vynálezu, protilátky proti MCP-1, ktoré krížovo reagujú s eotaxínom, konkrétne protilátky, ktoré sú schopné inhibovať väzbu MCP-1 a eotaxínu na ich receptory, protilátky proti MCP-1, ktoré majú KD pre väzbu na MCP-1 približne 50 pM alebo nižšiu, a protilátky proti MCP-1, ktoré sa viažu na antigénny epitop MCP-1, ktorý zahŕňa argininový zvyšok v polohe 24 MCP-1, sú naďalej v texte nazývané protilátky podlá vynálezu.
Výhodne sú protilátky podlá vynálezu molekuly viažuce MCP-1 podía prvého a druhého aspektu vynálezu. Výhodne sú protilátky podía vynálezu ľudskej protilátky, najvýhodnejšie je to protilátka ABN912 alebo jej priamy ekvivalent.
Protilátky podlá vynálezu inhibujú účinky MCP-1 na jeho cieľové bunky a sú teda určené na použitie na liečenie ochorení a porúch sprostredkovaných MCP-1. Tieto a ešte ďalšie farmakologické účinky protilátky podľa vynálezu sa môžu dokázať v štandardných testoch, napríklad v testoch opísaných ďalej.
1. Inhibícia väzby MCP-1 na bunky exprimujúce CCR2B
Predpokladom pre signalizačnú a efektorovú funkciu MCP-1 je jeho interakcia s receptorom CCR2B. Scintilačný proximitný test (SPA) sa použil na dokázanie toho, že protilátky podlá vynálezu inhibujú väzbu MCP-1 na membránu bunky,· ktorá exprimuje tento receptor.
Membrány buniek CHO exprimujúcich CCR2B sa inkubujú v sérii koncentrácií cieľovej protilátky (napr. 1014 M až 10“8 M) a reziduálna väzba (125-1)-MCP-1 sa meria pomocou SPA s použitím perličiek pšeničných klíčkov s aglutinínom. Protilátky cedia vynálezu typicky majú IC50 v rozmedzí približne od 0,1 do približne 10 nM, osobitne potom približne 0,5 nM (napr. 461. ± 206 pM) pri testovaní takýmto typom testu.
2. Inhibícia signalizácie sprostredkovanej MCP-1
Potenciál protilátok podľa vynálezu inhibovať fyziologické účinky vyvolané MCP-1 sa stanovia meraním intracelulárnej Ca‘ + mobilizácie indukovanej MCP-1 v prítomnosti a za absencie protilátky.
Meranie kalciovej odozvy sa uskutočňovalo s. trvalé cransfekovanou CHO bunkovou líniou exprimujúcou CCR2B a bunkami THP-1 pomocou fluorescenčných farbív a FACS analýzy, ako je ďalej opísané v príkladoch. Protilátky podľa vynálezu typicky mali IC50 v rozmedzí približne od 0,05 do približne 10 nM, osobitne približne 0,5 nM (napr. 390 ± 20 pM) , keď sa testovali v tomto type testov.
Protilátky podľa vynálezu výhodne krížovo reagujú s eotaxínom, konkrétne eotaxinom-1, a teda výhodne môžu inhibovať účinky eotaxínu na jeho cieľové bunky, a tieto protilátky sú teda navyše určené na použitie na liečenie ochorení a porúch sprostredkovaných eotaxínom. Krížová reaktivita protilátky podľa vynálezu s eotaxínom môže byť určená s využitím technológie optických biosenzorov, ako je napr. metóda a zariadenie BIAcore® (Karlsson et al. J. Immunol. Meth. 1991, 145:229-240).
Ako je už skôr ukázané v testoch, protilátky podlá vynálezu silne blokujú účinky MCP-1, a výhodne križovo reagujú s eotaxínom. V súlade s tým protilátky podľa vynálezu majú nasledujúce farmaceutické využitie:
Protilátky podľa vynálezu sú použiteľné na prevenciu a liečenie ochorení alebo porúch sprostredkovaných MCP-1 alebo eotaxínom. MCP-1 hrá dôležitú úlohu v transporte leukocytov, konkrétne v migrácii monocytov do miest zápalov, a teda protilátky podľa vynálezu sa môžu použiť na inhibíciu migrácie monocytov, napr. pri liečení zápalových ochorení a stavov, alergických ochorení a stavov, autoimunitných ochorení, rejekcií štepu, karcinómov, pri ktorých dochádza k infiltrácii leukocytov, stenózy alebo restenózy, aterosklerózy, reumatoidnej aruritídy a osteoartritídy.
K ďalším ochoreniam alebo stavom, ktoré sa môžu liečiť pôsobením protilátok podľa vynálezu, patria: zápalové alebc alergické stavy, zahrňujúce respiračné alergické ochorenia ako je astma, alergická rinitída, COPD, hypersenzitívne pľúcne ochorenie, hypersenzitívna pneumonitída, ochorenie pľúcneho inuerstícia (ILD) (napr. idiopatická pľúcna fibróza alebo ILD asociovaná s autoimunitným ochorením ako je napr. RA, SLE atď.), anafylaktická alebo hypersenzitívna reakcia, alergie na liečivá (napr. na penicilíny alebo cefalosporíny), alergie na bodnutie alebo hryznutie hmyzom, zápalové črevné ochorenie ako je napr. Crohnova choroba a ulceratívna kolitída, spondyloartropatia, skleroderma, psoriáza, zápalové dermatózy ako je napr. dermatitída, ekzémy, atopická dermatitída, alergická kontaktná dermatitída, žihlavka a vaskulitída.
Autoimunitné ochorenie, konkrétne autoimunitné ochorenie s etiológiou zahrňujúcou zápalovú zložku, zahrňuje choroby ako je artritída (napríklad reumatoidnej artritída, chronická pro21 gradujúca, psoriatická artritída a deformujúca artritída), a reumatické ochorenia, zahrňujúce zápalové ' stavy a reumatické ochorenia zahrňujúce stratu kostnej hmoty, zápalové bolesti, hypersenzitivitu (vrátane hypersenzitivity dýchacích ciest a hypersenzitivity kože) a alergie.
K špecifickým autoimunitným ochoreniam, na ktoré sa môžu použiť protilátky podľa vynálezu, patria autoimunitné hematologické poruchy (vrátane napr. hemolytickej anémie, aplastickej anémie, čistej anémie červených krviniek a idiopatickej trombocytopénie), systémový lupus erythematosus, polychondritída, skleroderma, Wegenerova granulomatóza, dermatomyozitída,. chronická aktívna hepatitída, myasthenia gravis, psoriáza, Stevn-Johnsonov syndróm, idiopatická porucha vstrebávania v čreve, autoimunitné zápalové črevné ochorenie (ako je napr. ulceratívna kolitída, Crohnova choroba a syndróm dráždivého čreva), autoimunitná tyroiditida, Behcetova choroba, endokrinná oftalmopatia, Gravesova choroba, sarkoidóza, sclerosis multiplex, primárna biliárna cirhóza, juvenilný diabetes {diabetes mellitus typu I), uveitída (predná a zadná), keratoconjunctivitis sicca a keratoconjunctivitis vernalis, fibróza pľúcneho interstícia a glomerulonefritida (s a alebo bez nefrotického syndrómu, ako je napr. idiopatický nefrotický syndróm alebo nefropatia s minimálnou zmenou), a ďalej rejekcia štepu (napr. pri transplantácii srdca, pľúc, bloku srdce-pľúca, pečene, obličiek, pankreasu, kože alebo transplantátoch rohovky) zahrňujúca rejekciu allotransplantátu alebo xenotransplantátu, alebo choroba reakcie transplantátu proti príjemcovi, artérioskleróza spojená s transplantáciou orgánu, a ďalej ateroskleróza, karcinóm s infiltráciou leukocytov do kože alebo orgánov, stenóza alebo restenóza vaskulatúry, konkrétne artérií, napr. koronárnej artérie, vrátane stenózy alebo restenózy, ktorá je dôsledkom cievnej intervencie, a tiež neointimálnej hyperplázie, a ďalšie ochorenia alebo stavy, zahrňujúce zápalové reakcie vrátane reperfúzie poranenia, hematologické maligne ochorenie, cytokinom indukovaná toxicita (napr. septický šok alebo endotoxický šok), polymyozitida, dermatomyozitida a granulomatózne ochorenie vrátane sarkoidózy.
Protilátky podlá vynálezu sú osobitne výhodné na použitie na liečenie ochorení metabolizmu kostí a chrupaviek, ako je ošteoartritída, osteoporóza a ďalšie zápalové artritídy, napr. reumatoidná artritída, a strata kostnej hmoty všeobecne, vrátane straty kostnej hmoty súvisiacej so starnutím, a konkrétne ochorenia periodontu (okostice).
Pre skôr uvedené indikácie vhodná dávka samozrejme závisí od rôznych faktorov, ako je napríklad konkrétne použitá protilátka podľa vynálezu, príjemca, spôsob podávania, a tiež povaha a závažnosť liečeného ochorenia. Pri profylaktickom použití sa ukazujú uspokojivé výsledky pri dávkach približne od 0,05 mg až približne 10 mg na jeden kilogram telesnej hmotnosti, zvyčajne približne od 0,1 mg do približne 5 mg na jeden kilogram telesnej hmotnosti. Množstvo dávok pri profylaktickom použití je normálne v rozmedzí približne od podávania jeden krát týždenne až po približne jeden krát za 3 mesiace, zvyčajne v rozmedzí približne jeden krát za 2 týždne až približne jeden krát za 10 týždňov, teda napr. jeden krát za 4 alebo za 8 týždňov. Protilátka podľa vynálezu je zvyčajne výhodne podávaná parenterálne, intravenózne, napr. do antekubitálnej alebo inej periférnej žily, intramuskulárne alebo subkutánne. Napríklad profylaktické podávanie typicky zahŕňa podávanie protilátky podľa vynálezu jeden krát za mesiac až jeden krát za 2 až 3 mesiace, alebo aj menej často.
Farmaceutické kompozície podľa vynálezu sa vyrábajú zvyčajnými metódami, ktoré sú odborníkom známe. Kompozícia podľa vynálezu sa výhodne poskytuje v lyofilizovanej forme. Bezprostredne pred podaním sa taká kompozícia rozpustí vo vhodnom vodnom nosiči, ako je napríklad sterilná voda pre injekcie alebo sterilný pufrovaný fyziologický roztok. Pokiaľ je potrebné pripraviť roztok s vyšším objemom na podávanie pomocou infúzie namiesto injekčného podania bolusu, je výhodné do fyziologického roztoku pri príprave pridať ľudský sérový albumín alebo heparinizovanú pacientovu vlastnú krv. Prítomnosť nadbytku takého fyziologicky inertného proteínu zabraňuje stratám protilátky, ku ktorým inak dochádza adsorpciou na steny zásobníka a hadičiek použitých pre infúzny roztok. Pokiaľ sa použije albumín, vhodná koncentrácia je 0,5 až 4,5% (hmotnoštných) vo fyziologickom roztoku.
Predkladaný vynález je ďalej opísaný v nasledujúcich príkladoch, ktoré slúžia na podrobnejšie vysvetlenie vynálezu, a ktoré sú navyše doplnené nasledujúcimi obrázkami.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1
A - graf ukazujúci aktivitu eozinofilperoxidázy (EPO) pre rôzne odbery biopsie z makakov rhesus podrobených liečeniu alebo neliečených,
B - podobný graf ukazujúci aktivitu myeloperoxidázy (MPO) z biopsií.
Obrázok 2
Fotografie ukazujúce farbenie eozinofilov v histologických vzorkách zo štyroch makakov rhesus pred a po liečení použitím protilátok ABN912 a CGP44290 (kontrolná protilátka).
Obrázok 3
Grafy ukazujúce migráciu Th buniek (%) v ľudských kožných transplantátoch pre rôzne liečebné režimy
Obrázok 4
Graf ukazujúci relatívne väzbové afinity mutanta ABN912 pre väzbu MCP-1.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Transgénne myši pripravené metódami génového inžinierstva modifikované tak, že exprimujú ludský IgG/κ repertoár namiesto zodpovedajúceho myšieho imunoglobulínového repertoáru .(Fishwild et al., 1996, Nat Biotechnol. 14, 845-851), sa použili na prípravu protilátok proti ľudskému MCP-1. B lymfocyty z týchto myší sa imortalizovali pomocou štandardnej hybridómové technológie, a tak sa získali myšie hybridómové bunky, ktoré secernujú ľudskú IgG3/K protilátku AAV293.
Príklad 1
Imunizácia myší a vytvorenie hybridómovej bunkovej línie
Štyri myši Medarex (myši č. 16194-16197, Medarex Inc. Annadale, NJ, USA) sa imunizovali rekombinantným ľudským MCP-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) , a to dávkou 100 pg proteínu na myš, v kompletnom Freundovom adjuvans, v dňoch 0, 14 (i.p.) a 26 (i.v.). Na deň 41 žiadna myš nevykazovala detegovateľr.é sérové protilátky. Myši sa ďalej imunizovali rhMCP-1, a to dávkou 100 pg proteínu na myš, v kompletnom Freundovom adjuvans, v dňoch 49 a 65. Keď sa potom testovali na deň 106, bol v sére jednej myši (myš č. 16194) významný titer anti-MCP-1 protilátky. Táto myš sa znovu sedemkrát imunizovala: 100 pg proteínu na myš, vo fyziologickom roztoku, a to na deň 106 (i.p.), 119 (sa.c.) a
135 (i.p.), a nakoniec 25 pg proteínu na myš, vo fyziologickom roztoku, v deň -4 (x2 - i.v. a i.p.) a -3 a -2 (oba i.p.) pred fúziou.
Fúzia a selekcia hybridómov
V deň fúzie sa myš č. 16194 usmrtila inhaláciou CO2 a bunky z celej sleziny (4,8 x 107) sa fúzovali rutinným spôsobom s použitím PEG4000 s bunkami myšej myelómovej bunkovej línie PAI-0 (5 x 107). Fúzované bunky sa preniesli do 720 jamiek (1 ml/jamka) obsahujúcich podpornú (feeder) vrstvu myších peritoneálnych buniek (Balb/c myši), v médiu RPMI1640 doplnenom HAT, 10% tepelne inaktivovaného teľacieho fetálneho séra, 5 x 10’5 M β-merkaptoetanolu, 50 pg/ml Gentamicínu. Kultivačné médium sa vymieňalo vždy každý štvrtý deň a po 14 dňoch sa HAT médium zmenilo na HT médium, t. j. vynechal sa Aminopterin. Z počiatočných 720 jamiek bolo 461 jamiek (64%) pozitívnych na rast hybridómov. Supernatanty sa zozbierali a uskutočnil sa screening na MCP-1 reaktívnu monoklonálnu protilátku ELISA testom. Bolo tak identifikovaných sedem monoklonálnych protilátok triedy IgG. Klonovanie sa uskutočnilo s použitím 4 x 96 jamkových mikrotitračných doštičiek, kde sa nanieslo 0,5 bunky/100 pl na jamku. Klony sa kontrolovali mikroskopicky po 8 dňoch, pridalo sa 100 pl rastového média a supernatant sa testoval nasledujúci deň s ELISA testom. Kajreaktívnejší hybridom, a to kloň 149, sa vybral pre ďalšie klonovanie a charakterizáciu. Hybridómový subklon 149-12 sa vybral na základe inhibičnej aktivity v teste mobilizácie kalcia závislej od rhMCP-1 produktu AAV293, t. j. monoklonálnej protilátky typu IgG3/x
Čistota a čiastočná aminokyselinová' sekvencia ťažkého a ľahkého reťazca
Sekvenovanie aminokyselín
Ľahké a ťažké reťazce purifikovanej protilátky AAV293 sa oddelili pomocou SDS-PAGE a aminokoncové aminokyseliny sa stanovili pomocou Edmanovej degradácie. cDNA sekvencie kódujúce variabilné domény ťažkého a ľahkého reťazca sa získali pomocou PCR amplifikácie z cDNA pripravenej z mRNA z klonovaných hybridómových buniek a potom sa úplne sekvenovali. Aminokoncové sekvencie variabilných domén ťažkého a ľahkého reťazca a zodpo vedajúce DNA sekvencie sú uvedené ďalej ako sekvencia SEQ ID NO: 1 a sekvencia SEQ ID NO: 2, pričom úseky CDR sú vyznačené tučné.
A ďalšia anti-MCP-1 monoklonálna protilátka, IgGl/κ monoklonálna protilátka AAV294, sa získala rovnako, ako je opísané skôr. Táto protilátka sa viaže na MCP-1 s približne 3 x nižšou afinitou ako protilátka AAV293, a zistilo sa, že má aminokyselinovú sekvenciu VH a VL identickú so zodpovedajúcimi sekvenciami protilátky AAV293 s výnimkou toho, že VH AAV294 má v polohe 24 Val namiesto Ala, v polohe 60 Phe namiesto Tyr a v polohe 74 Ser namiesto Asn, a VL AAV294 má v polohe 30 Tyr namiesto Ser a v polohe 69 má Thr namiesto Pro.
Sekvencia SEQ ID NO: 1 GGG Gly GGA Gly 30 GGC TTG Gly Leu 10 GTC Val CAG Gin CCT Pro GGG Gly GGG Gly TCC Ser CTG Leu AGA Arg 60 CTC Leu 20
GAG GTG CAG Glu Val Gin CTG GTG CAG TCT Leu Val Gin Ser
90 CDR1 120
TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGT CAC TAC TGG ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gin ä.
30 40
150 CDR2 130
CCA GGG AAA GGG CTG GAG TGG CTG GCC AAC ATA GAG CAA GAT GGA AGT GAG AAA TAC TAT
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asn íle Glu Gin Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr
50 60
210 240
GTG GAC TCT GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAC GCC AAG AAT TCA CTG TAT
Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
70 30
270 300
CTG CAA ATG AAC AGT CTG AGA GCC. GAG GAC ACG GCT GTG TAT TTC TGT GCG AGG GAT CTT
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Leu
90 100
CDR3 330 360
GAA GGT CTA CAT GGG GAT GGG TAC TTC GAT CTC TGG GGC CGT GGC ACC CTG GTC ACC GTC
Glu Gly Leu His Gly Asp Gly Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val
110 120
60
TCT TCA
Ser Ser
Sekvencia SEQ ID NO: 2
GCC ATC CAG TTG Leu ACA CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC íle 20
Ala íle Gin Thr Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
CDR1 90 120
CTC ATC TGC CGG GCA AGT CAG GGC GTT AGC AGT GCT TTA GCC TGG TAT CAG CAG AAA CC.-.
Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Val Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys
30 40
150 CDR2 190
GGG AAA GCT CCT AAG CTC CTG ATC TAT GAT GCC TCC AGT TTG GAA AGT GGG GTC CCA TCA
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu íle Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser .Gly Val Pro v
50 c 3
210 2 -Z
AGG TTC AGC GGC AGT GGA TCT GGG CCA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin ť ΣΟ
70 S-0
270 CDR3 J ύ -
GAA GAT TTT GCA ACT TAT TTC TGT CAA CAG TTT AAT AGT TAC CCT CTC ACT TTC GGC C-G A
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Glv
90 1 o '
GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGA ACT
Gly Thr Lys Val Glu íle Lys Arg Thr
Konštrukcie expresných vektorov pre ťažký a ľahký reťazec
Klonované sekvencie kódujúce VL a VH sa amplifikovali pomocou PCR a vložili prostredníctvom vhodných reštrikčných miest do kazety vektorov obsahujúcich imunoglobulínový promótor, vedúcu („leader) sekvenciu z protilátky RFT2 (Heinrich et al. (1989) J. Immunol. 143, 3589-97), časť J-segmentov a zostrihové donorové miesto. Kazeta pre ľahký reťazec obsahujúca celý VL úsek, promótor a vedúcu sekvenciu na sekréciu sa preniesla do expresného vektora obsahujúceho ľudský gén Ck, zosilňovač („enhancer) ťažkého reťazca imunoglobulinu a modifikovanú myšiu dhfr cDNA na metotrexátovú (MTX) selekciu.
Kazeta ťažkého reťazca sa preniesla do expresného vektora kódujúceho ľudský gén IgG4, enhancer ťažkého reťazca imunoglobulinu a gén rezistencie proti neomycinu pre selekciu s neomycínom.
Tak ťažký ako aj ľahký reťazec sú v expresných vektoroch lokalizované v takej konfigurácii, ktorá je podobná genómovej konfigurácii preskupených („rearranged) imunoglobulinových génov, čo je kľúčový faktor pre vysoký stupeň expresie.
Na produkciu protilátky podľa vynálezu boli vyššie opísané vektory kotŕansfekované do vhodnej hostiteľskej bunkovej línie, napr. bunkovej línie SP2/0. Bunky obsahujúce vektorové sekveňcie sa selektovali pomocou metotrexátovej selekcie a vyselektované bunkové línie sa kultivovali, aby exprimovali protilátku ABN912 (t.j. ľudská protilátka anti-ľudskému MCP-1 typu IgG4/x).
Expresné vektory· nesúce gény pre ťažké a ľahké reťazce NVP-ABN912, v danom poradí, sa linearizovali a boli transfekované elektroporáciou do buniek Sp2/0. Transfekované bunky sa potom pestovali 20 hodín v neselektívnom médiu RPMI s fetálnym teľacím sérom (FCS) a aplikovala sa selekcia s použitím G418 počas 48 až 72 hodín pri 1,4 mg/ml. Transfekované pooly sa adaptovali na médium RPMI bez FCS, ktoré obsahuje všeobecne používané prísady (ako je pyruvát, glutamín, ľudský sérový albumín, transferrin, inzulín). Vysoko produkčné klony sa izolovali po dvoj krokovej amplifikácii s metotrexátom v 200 nM a 1 μΜ.
Produkčná stabilita klonov a subklonov sa hodnotila v kultúrach T175 počas štyroch až piatich mesiacov nepretržitej kultivácie, a ďalej v experimentoch s rotačnou kultiváciou. Pre vysokoprodukčné klony sa potom uskutočnil posun z laboratórnej škály na kultiváciu v bioreaktore. Získalo sa tak niekoľko vysokoprodukčných bunkových línii, použiteľných na produkciu protilátky ABN912. Maximálne množstvo akumulovaného produktu získané po kultivácii cez noc bolo 504 mg/1.
Príklad 2
Biochemické a biologické údaje
Ľudská monoklonálna protilátka ABN912 viaže ľudský MCP-1 a neutralizuje jeho funkciu in vitro. Monoklonálna protilátka bola ďalej charakterizovaná svojou väzbou na rekombinantný ľudský MCP-1 dvoma nezávislými biochemickými metódami, analýzou BIAcore a scintilačným proximitným testom (SPA). Špecificita protilátky ABN912 na ďalšie CC-chemokíny alebo iný ako ľudský MCP-1 sa vyhodnocuje pomocou BIAcore a inhibícia väzby MCP-1 na bunky exprimujúce CCR2B protilátkou ABN912 sa demonštruje pomocou SPA.
Biologická aktivita ABN912 k rekombinantnému a prirodzene vytvorenému MCP-1 sa demonštrovala v testoch mobilizácie Ca2+ v bunkách exprimujúcich CCR2B. Aktivita ABN912 k svojim prirodzeným cieľovým bunkám, ľudským monocytom periférnej krvi (hPBMC), sa demonštrovala testom chemotaxie indukovanej MCP-1.
2.1 BIAcore analýza
Asociačné a disociačné konštanty pre väzbu rekombinantného ľudského MCP-1 na imobilizovanú ABN912 sa určovali analýzou BIAcore a derivovanou hodnotou KD. ABN912 sa imobilizovala na povrchu senzorového čipu a väzba rekombinantného MCP-1 sa merala povrchovou plazmónovou rezonanciou (BIACORE 2000 Inštrument Handbook, marec 1999 (Version AC), http:www.biacore.com). Získané výsledky sú uvedené v tabuľke nižšie.
Asociačná konštanta [M'1s’1] (n=30) (1, 3 ± 0,1) x 107
Disociačná konštanta [sa-1] (n=30) (5,0 ±0,1) x IO*4
Disociačná ekvilibračná konštanta KD [M] (n=30) (43,0 ± 2,9) x IO’12
ΑΒΝ912 sa viaže na rekombinantný ľudský MCP-1 s veľmi vysokou afinitou.
2.2. Selektivita chemokinov a druhovo špecifický profil
Aby sa určila špecificita MCP-1 interakcie s ABN912, bol hodnotený veľký počet iných ako ľudských MCP-1 a CC-chemokinov na potenciál interagovať s ABN912 pomocou BIACORE.
2.2.1 Interakcia s MCP-1 iných živočíchov ako primátov
Séria MCP-1 zo živočíšnych druhov všeobecne používaných v laboratóriách sa hodnotila na väzbu na protilátku ABN912.
Merania sa uskutočňovali injekciou 5 nM roztoku chemokinu do prietokovej komôrky v zariadení BIAcore, ktorá sa predtým naplnila ABN912.
Po 8 minútach sa meralo množstvo naviazaného chemokinu pre každý vyšetrovaný chemokín. Získané výsledky sú ukázané v tabuľke nižšie ako percento väzby každého chemokinu v porovnaní s rekombinantným ľudským MCP-1 (100%).
Chemokín Percento väzby ABN912 Priemer ± SEM, n = 3
Rec hu MCP-1 100
Rec myší JE/MCP-1 -0,4 ± 0,2
Rec potkaní MCP-1 -0,2 ± 2,3
Rec králičí MCP-1 0,9 ± 0,4
Rec psí MCP-1 1,3 ± 0,3
Rec prasači MCP-1 0,5 ± 0,4
Rec morčací MCP-1 2,3 + 0,2
ABN912 je špecifická pre ludský MCP-1 a nereaguje krížovo s
MCP-1 ktoréhokoľvek iného testovaného živočíšneho druhu.
2.2.2 Interakcia s rekombinantnými chemokínmi
Aby sa určil profil krížovej reaktivity ABN912 s inými
CC-chemokínmi, hodnotil sa ich väzbový potenciál na protilátku postupom opisovaným skôr. Percento väzby každého chemokinu v porovnaní s rekombinantným ľudským MCP-1 je ukázané v nasledujúcej tabuľke.
Chemokín Väzba na ABN912 Priemer ± SEM, n = 3
rh MCP-1 100
rh MCP-2 6,2 ± 0,9
rh MCP-3 4,3 ± 4,3
rh MCP-4 -2,4 ±0,6
rh LEC -2,8 ± 0,3
rh RANTES -2,7 + 0,4
rh MIP-la -2,8 ± 0,9
rh ΜΙΡ-1β -2, 9 ± 0,1
rh eotaxín 52,6 ± 1,9
ABN912 je špecifický pre ľudský MCP-1 a nereaguje križovo s MCP-2, MCP-3, MCP-4, LEC, RANTES, MIP-la a MIP-Ιβ, ale reaguje významne križovo s ľudským eotaxínom, t.j. ľudským eotaxinom-1. Tiež sa zistilo, že AAV294 tiež významne križovo reaguje sa eotaxínom.
2.3 Inhibícia väzby MCP-1 na bunky exprimujúce CCR2B
Technológia SPA (scintilačný proximitný test) sa použila, aby sa ukázalo, že protilátka ABN912 zabraňuje väzbe MCP-1 na bunkové membrány exprimujúce receptor CCR2B. Membrány buniek CHO exprimujúcich CCR2B (CHO#84 - pozri nižšie) sa inkubovali s radom koncentrácií ABN912 (10-14M až 10'8M) a reziduálna väzba rádioaktívneho (125-1)-MCP-1 sa merala pomocou SPA s použitím aglutinínových perličiek z pšeničných klíčkov. Priemerná hodnota IC5o [M] získaná z troch nezávislých experimentov bola (461 ±
206) x ΙΟ’12. ABN912 zabraňuje väzbe MCP-1 na bunkové membrány exprimujúce receptor CCR2B.
2.4 Inhibícia signalizácie sprostredkovanej MCP-1
Raný jav signalizácie indukovanej MCP-1 je mobilizácia intracelulárneho Ca2+, čo sa môže merať s použitím fluorescenčných farbív.
Merania reakcie vápnika sa uskutočňujú s použitím bunkovej línie CHO#84, čo je CHO bunková línia trvalé transfekovar.á tak, aby exprimovala chemokinový receptor CCR2B. Bunky CHO=84 sa pestovali v médiu MEM alfa bez ribonukleáz a deoxyribonukleáz, s glutamaxom-1 doplneným 10% dialyzovaným FCS, 200 U/ml per.icilínu/streptomycinu a 80 nM metotrexátu ako selektívnych činidiel. Keď bola tkanivová kultúra hustá, ale ešte predtým ako sa stala konfluentná, sa bunky premyli s PBS a oddelili krátkou inkubáciou s trypsínom-EDTA (maximálne 1 minútu).
Bunky CHO#84 sa raz premyli v RPMI, centrifugovali minút pri 250 g a resuspendovali v množstve 3,5xl06 buniek/ml v pufri Hepes obsahujúcom 0,5% BSA, 0,04% kyselinu pluronovú, 1,0 μΜ fura-červeň a 0,3 μΜ fluo-3. Bunky sa označili týmito fluorescenčnými kalciovými sondami 1 hodinu pri teplote miestnosti v tme, s príležitostným jemným trepaním (6-8 krát). Potom sa bunky odobrali dvakrát centrifugáciou v pufri Hepes, 0,5% BSA, a pelet sa resuspendoval v množstve 1,5 až 2xl06 buniek/ml v pufri Hepes, 0,5% BSA. Bunky boli teraz pripravené na stimuláciu a meranie vápnika a uložené pri teplote miestnosti v tme až do použizia.
Obe protilátky a chemokín (MCP-1, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) sa pripravili ako roztoky s dvadsaťnásobnou koncentráciou a zmiešali dohromady pri teplote miestnosti 5-8 min pred pridaním k bunkám. Obidve zelené a červené fluorescencie sa merali v závislosti od času na prietokovom cytometri (FACS, Becton Dickinson). Pre každú vzorku buniek sa najskôr zaznamenávala fluorescencia buniek označených fluorescenčnými kalciovými sondami počas 15 sekúnd, aby sa získali základné hodnoty. Získavanie údajov bolo krátko prerušené na stimuláciu buniek pridaním malého objemu stimulu (desaťnásobný koncentrát chemokínu s protilátkou alebo bez nej) a meranie fluorescencie sa obnovilo. Celkové meranie fluorescencie trvalo 51 sekúnd.
Použité indikátory . Ca2+ prejavovali recipročné posuny v intenzite fluorescencie na väzbu na vápnik, fluorescencia fura-červene sa znížila, zatiaľ čo fluorescencia fluo-3 sa zvýšila. Pre každý experiment boli zaznamenané červené a zelené fluorescencie a vyrátali sa pomery medzi zelenou a červenou fluorescenciou ä vyniesli sa do grafu v závislosti od času. Pomer základných hodnôt a stimulačný pomer sa príslušne definovali ako priemerná hodnota pomerov získaných tesne pred stimuláciou a priemerná hodnota maximálnych pomerov získaných po stimulácii. Intenzita reakcie sa kvantifikovala stimulačným, indexom (SA.I.) daným stimulačným pomerom deleným pomerom základných hodnôt. Stimulačné indexy získané v prítomnosti protilátky sa vyjadrili ako percento SA.I. získané v prítomnosti samotného rozpúšťadla.
Inhibícia (%) protilátky Al rozpustenej v rozpúšťadle SI je daná vzorcom:
100-[SA.I.a1 x 100)/SA. I.si]
Inhibícia protilátkou. ABN912 sa porovnala s inhibíciou prekurzorovej protilátky, AAV293, a nepríbuznej komerčne dostupnej anti-MCP-1 myšej protilátky (R&D Systems). Tiež keďže imunogén použitý na vyvolanie AAV293 bol neglykozylovaný rekombinantný ľudský MCP-1 z E. coli, MCP-1 supernatant z buniek HUVEC (ľudské endotelové bunky umbilikálnej žily) stimulovaných TNFa, sa tiež použil na stimuláciu buniek CHO#84 a antagonizujúci účinok ABN912 na mobilizáciu Ca2+ sa meral tak, ako je opísané skôr. Získané výsledky sú uvedené v tabuľke nižšie.
Ľudský MCP-1 mAb proti ľudskému MCP-1
Zdroj Molarita (nM) Ľudský ABN912 (IC50 v nM) Ľudský AAV293 (IC50 v nM) Myšie R&D Systémy (IC50 v nM)
E. coli (neglykozylovaný) 0,3 0,1 ± 0,02 0,20 ± 0,00
1 0,39 ± 0,02 0,66 ± 0,16 0,73 ± 0,09
3 1,53 ± 0,47 2,12 ± 0,06
HUVEC (glykozylovaný) 1 0,33 ± 0,01 0,73 ± 0,04 0,95 ± 0,49
ΑΒΝ912 špecificky inhibuje mobilizáciu Ca2+ indukovanú MCP-1 v bunkách CHO#84, s podobnou účinnosťou pre obidve MCP-1 pochádzajúce z E. coli a pochádzajúce z HUVC.
2.5 Inhibícia chemotaxie indukovanej MCP-1
Schopnosť ABN912 inhibovať chemotaktický účinok MCP-1 na hPBMC (ľudské monocyty periférnej krvi) sa merala v testoch chemotaxie uskutočnených v Boydenovej komôrke. HPBMC sa pripravili pomocou Lymphoprep™ a použilo sa 2 x 106 monocytov na ml ako vstup. ABN912 alebo nepríbuzná protilátka (negatívna kontrola) sa pridala v uvedených molárnych pomeroch do dolného a horného úseku komôrky. Chemotaxia sa indukovala s 5,7 nM rekombinantným ľudským MCP-1 alebo 1 nM fMIFL (negatívna kontrola) na dne komôrky. Bunky sa ponechali migrovať z hornej komory do dolnej časti počas 90 minút pri teplote miestnosti. Počet buniek, ktoré migrovali, sa určil značením a počítaním. Zistilo sa, že ABN912 dávka závislé inhibuje chemotaxiu hPBMC indukovanú MCP-1. Účinok ABN912 na chemotaxiu indukovanú MCP bol špecifický, nepríbuzná protilátka nemala žiadny účinok a ABN912 nemala žiadny účinok na chemotaxiu indukovanú fMIFL.
2.6 Inhibícia migrácie leukocytov u makakov rhesus
Tento mechanistický model sa použil na testovanie, či sa migrácia leukocytov do kože makakov rhesus indukovaná MCP-1 môže inhibovať protilátkou NVP-ABN912, keď je podávaná ako bolus i.v. injekcia.
Dospelým samcom makakus rhesus sa podávala injekcia 30 μς/kg IL-3 počas 13 dni (dvakrát denne, i.v.), s cieľom zvýšiť počet leukocytov a inštruovať endotelové bunky na optimálne posilnenie leukocytov. 13. deň sa makakom podala anestézia a MCP-1 (10 μς) sa injikoval v triplikátoch (troch opakovaniach) intradermálne na pravej strane hrudníka a brucha. Štyri hodiny potom sa makakom znovu podala anestézia a odobrali sa biopsie z miesta injekcie MCP-1.
Potom buď NVP-ABN912 alebo izotypovo zodpovedajúca humanizovaná negatívna kontrolná protilátka (CGP44290) namierená proti ľudskému karcinómembryonálnemu antigénu sa podávala ako bolus i.v. injekcie s dávkou 5 mg/kg. Nakoniec MCP-1 (10 μg) sa injikoval znova v triplikátoch intradermálne na ľavej strane hrudníka a brucha. Tieto injekčné miesta boli umiestené súmerne relatívne k predchádzajúcej sérii injekcií. Štyri hodiny sa potom makakom podala anestézia a odobrali sa biopsie z miesta injekcie MCP-1. Všetky biopsie sa potom rozdelili na polovicu a jedna polovica sa zmrazila v kvapalnom dusíku na enzýmové analýzy. Druhá polovica sa uschovala vo formalíne na neskoršie histologické vyšetrenie. Enzýmovými testami pre eozinofily a neutrofily sa stanovili aktivity eozinofilperoxidázy (EPO) a myeloperoxidázy (MPO), v danom poradí. Paralelne sa na každej opici uskutočnili kontroly s injekciami PBS a žiadnymi injekciami stimulujúcimi bunkovú infiltráciu. Pri negatívnej kontrole neboli pozorované významné účinky sprostredkované protilátkou.
Enzýmové aktivity v miestach injekcie MCP-1 pred a po ošetrení s NVP-ABN912 a CGP44290 (IgG4, izotyp zodpovedal negatívnej kontrole) , v danom poradí, sú ukázané ako priemer ± SD. Na každej opici sa použili miesta mnohonásobných injekcii (3) pre každý stav. Spojené údaje z dvoch nezávisle uskutočnených experimentov sú ukázané na obrázku 1. Obrázok IA - migrácia (A) alebo MPO (B) v biopsiách po ošetrení s protilátkami sú leukocytov v koži makakov „rhepozorovala sa inhibícia migráv prítomnosti NVPprotibunkodo úvahy, (eozinofiμς MCP-1, leukocytov na PBS. Rozdiely protilátkou sú vzhľadom na veľkosť závažnosť. Reprezenukázaná na obrázku 2.
eozinofilov a obrázok 1B - migrácia neutrofilov.
Normalizované aktivity EPO pred (neošetrené MCP-1, 100%) a ukázané ako priemer ± SD.
Keď sa indukovala migrácia sus prostredníctvom 10 μg MCP-1, cie 85,5% eozinofilov a 81,4% neutrofilov
-ABN912 v porovnaní látkou. Namerala sa s migráciou leukocytov pred iba približne 20% inhibícia u oboch ošetrením vých typov, že injekcia keď sa samotného PBS spôsobila odvádzanie 13,0% ly) a 22,7% (neutrofily) reakcie pozorovanej pri 10 podávanie NVP-ABN912 znížilo úroveň pozadia pozorovaného rozsah migrácie pri stimulácii pozorované štatisticky medzi vysoko účinku sa zdá, že
NVP-ABN912 a kontrolnou významné tiež majú biologickú tatívna histológia migrácie eozinofilov je
Histologické vyšetrenie biopsií z experimentov migrácie eozinofilov indukovanej MCP-1 sú ukázané pre štyri opice (2279, 2280, 2281 a 2282).
(A), (B), (E), (F) farbenie eozinofilov pred ošetrením opíc
2279, 2280, 2281 a 2282 protilátkami, v danom poradí.
(C), (D), (G), (H), farbenie eozinofilov po ošetrení opíc 2279,
2280, 2281 a 2282 protilátkami, v danom poradí.
Opice 2279 a 2280 boli ošetrené s izotypmi zodpovedajúcimi negatívnej kontrolnej protilátke CGP44290 (5 mg/kg) a opice 2281 a 2282 boli ošetrené s NVP-ABN912 (5 mg/kg). Eozinofily boli zafarbené na červeno (videné ako tmavé škvrny v černej a bielej) a šípky na paneloch (G) a (H) upozorňujú na niekoľko eozinofilov prítomných u dvoch opíc ošetrených NVP-ABN912.
Žiadny rozdiel medzi situáciou pred ošetrením a po ošetrení nebol pozorovaný s CGP 44290, zatiaľ čo takmer kompletná inhibicia migrácie eozinofilov sa pozorovala u opíc ošetrených s NVP-ABN912.
2.7 Inhibícia infiltrácie T lymfocytov u myší SCID-hu.
Tento mechanistický model sa použil na otestovanie, či sa infiltrácia Th buniek do kože myší „SCID-hu Skin indukovaná MCP-1 môže inhibovať i.p. injekciou NVP-ABN912.
SCID myšiam sa transplantovali dva malé kusy ľudskej dospelej kože (myši nazvané „SCID-hu Skin). Kvalita štepov sa monitorovala počas 5-6 týždňov po transplantácii, a potom sa úspešne transplantované myši (všeobecne >85%) vybrali na in vivo migračné experimenty. Pre migráciu indukovanú chemokínmi sa PBMC izolovali štandardnou separáciou v hustotnom gradiente zo vzoriek obsahujúcich „buffy coat a adoptívne sa preniesli (i.p. lxlO8 buniek/myš, objem 500 μΐ) na myši „SCID-hu Skin, ktorým sa predtým transplantovali (5-8 týždňov) dva kusy ľudskej kože (na pravej a ľavej strane hornej časti chrbta). Prenos buniek sa uskutočnil v 0. deň. MCP-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN) a PBS sa podávali intrakutánne do ľudských štepov v experimentálnych dňoch 1, 2, 4 a 6. Kontrolné myši (ošetrené CGP44290) dostali 500 ng MCP-1 do pravého kožného štepu a rovnaký objem (30 μΐ) PBS do ľavého štepu. Myšiam ošetreným NVP-ABN912 sa podala injekcia 500 ng MCP-1 do obidvoch, pravého a ľavého kožného štepu. NVP-ABN912 a izotypová kontrola CGP44290 sa podávali i.p. (100 μg/myš, 4 mg/kg, objem 500 μΐ) v deň 0 (5 hodín pred prenosom buniek) a v experimentálne dni 2 a 5. V deň 8 sa všetky myši usmrtili a ľudské kožné štepy sa odobrali na ďalšiu analýzu. Pripravila sa jednobunková suspenzia z každého ľudského kožného štepu s použitím DÁKO Medimachine® podľa inštrukcií výrobcu. Tieto bunkové suspenzie sa označili ľudskými anti-CD3 a anti-CD4 mAb konjugovanými s FITC a PE a analyzovali sa prietokovým cytometrom FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) .
Výsledky sú uvedené na obrázku 3. 0,73 ± 0,15% infundovaných ľudských Th lymfocytov infiltrovalo kožný štep v skupine ošetrenej s ABN912 (5 myši, n = 10) v porovnaní sa 3,73 ± 1,03% nameranými v zodpovedajúcej skupine ošetrenej s CPG44290 (3 myši, n = 3) . U myší, kde sa bunková migrácia indukovala PBS, infiltrovalo ľudský kožný štep 0,34 ± 0,17% Th lymfocytov (3 myši, n = 3) .
Štatistická analýza sa uskutočnila jednosmernou analýzou variácie nasledovanou Dunnettovým mnohonásobným porovnávacím testom post hoc. Redukcia Th infiltrácie buniek u zvierat ošetrených ABN912 proti CGP44290, v danom poradí, bola vysoko významná (p <0,01, **).
2.8 Charakterizácia väzby epitopu ABN912 na ľudský MCP-1 a spôsob pôsobenia
Trojrozmerná štruktúra komplexu MCP-1 s Fab fragmentom z NVP-ABN912 sa zisťovala róntgenovou kryštalografiou.
Fab fragment z NVP-ABN912 bol vytvorený proteolytickým štiepením celej protilátky a purifikovaný chromatografiou s proteínom A, po ktorej nasledovala vylučovacia chromatografia. Komplex medzi Fab a rekombinantným ľudským MCP-1 sa purifikoval chromatografiou s proteínom G a vylučovacou chromatografiou, a koncentroval sa ultrafiltráciou na 26 mg/ml v 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M NaCI. Kryštály rástli pri teplote miestnosti technikou párovej difúzie vo visiacich kvapkách (vapor diffusion in hanging drops) , v 20% (hmotnosť/objem) PEG 4000, 10% (objem/objem) izopropanole, 0,1 M Na Hepes, pH 7,5. Boli v priestorovej skupine Ρ2ι2ι2χ s rozmermi jednotkovej bunky a=63,90 Ä, b=86,08 Ä, c=321,64 Ä a tromi komplexmi na asymetrickú jednotku. Pred zberom údajov bol jeden kryštál namočený v 17% (hmotnosť/objem) PEG 4000, 8,5% (objem/objem) izopropanole, 15% glycerole, 85 mM Na Hepes, pH 7,5, počas približne 3 minút. Kryštál sa potom upevnil v nylonovom CryoLoop a priamo zmrazil v prúde dusíka pri teplote 120 K. Difrakčné údaje sa merali zobrazovacím doskovým systémom MAR 345 v ožarovacej dráhe SNBL, . European Synchrotron Radiation Facility (λ = 0,90 Ä). V celkom 242 617 pozorovaniach, zodpovedajúcich 68 948 unikátnych odrazov (Rsym = 0,050), sa zbieralo v rozlíšení medzi 20,0 až 2,33 A (úplnosť 89,3%). Štruktúra sa určila molekulárnym nahradzovaním, s použitím rôntgenovej štruktúry Fab fragmentu z monoklonálnej protilátky 3D6 (RCSB záznam 1DFB, He et al., 1992) a ľudského MCP-1 (RCSB záznam IDOL, Lubkowski et al., 1997) ako východiskových modelov. Štruktúra bola vylepšená na základe dynamiky ' torzného uhla a minimalizácie energie pomocou programu CNX, ku konečnému R-faktoru 0,224 (Rfree=0,261) pre všetky odrazy medzi 20 a 2,33 Ä. Konečný model zahŕňa L1 až L214 a Hl až H222 z ABN912 a zvyšky 10 až 71 z ľudského MCP-1. Má dobrú geometriu, s rms odchýlkou 0,006 Ä na dĺžke väzby a 1,36° na väzbových uhloch.
Komplex NVP-ABN912 Fab/ľudský MCP-1 ukazuje veľké väzbové rozhranie (1,590 Ä2 kombinovaného ponoreného povrchu) zahrňujúce mnoho hydrofóbnych a polárnych interakcií, rovnako ako niekoľko kľúčových elektrostatických interakcií. Hlavné kontakty s antigénom boli sprostredkované dlhou H-CDR3 slučkou NVP-ABN912, ktorá je preložená cez centrum antigénneho kombinovaného miesta a je prevažne ponorená v komplexe. Väzbový epitop na ľudskom MCP-1 obsahuje aminokyselinové zvyšky Asn 14, Thr 16, Asn 17, Arg 18, Lys 19, íle 20, Ser 21, Gin 23, Arg 24, Lys 49, Glu 50, íle 51 a Cys 52. Arg 18, Arg 24 a Lys 49 sú zapojené do elektrostatických interakcií s protilátkovými zvyškami Glu L55, Asp H99 a Glu H101, a v H-väzbových interakciách s Tyr L94, Trp H33, Asn H50, Gin H53, Asp H99 a Tyr H108. Okrem toho guanidínová skupina Arg 18 a Arg 24 z MCP-1 je π-zložená proti aromatickým kruhom Trp H33 a Tyr H32, v danom poradí. Ďalšie interakcie medzi NVP-ABN912 a Tyr 13, Gin 17, Ser 21, Lys 19, Arg 24, a Glu 50 antigénu sú sprostredkované ôsmymi molekulami vody ponorenými v proteínovom rozhraní. Pretože Tyr 13 a Arg 24 z MCP-1 sú zapojené do väzby na CCR2B chemokínový receptor (Hemmerich et al., 1999, Biochemistry, 38, 13013-13025), vyzerá to, že NVP-ABN912 priamo súťaží s receptorom o väzbu antagonistu.
2.9 Mapovanie ABN912 epitopu na MCP-1 miestne cielenou mutagenézou
Aby sa určili funkčne dôležité zvyšky na MCP-1 pre rozpoznávanú protilátku NVP-ABN912, uskutočnila sa skenovacia alanínová mutagenéza (Cunningham, B. C. And Wells, J. A. (1989) Science 244, 1081-1085). Najskôr sa vizuálne vyšetrila trojrozmerná štruktúra MCP-1 (Handel, T. M. And Domaille, P. J. (1996) Biochemistry 35, 6569-6584, Lubkowski, J., Bujacz, G., Boqué, L., Domaille, P. J., Handel, T. M. And Wlodawer, A. (1997) Náture Struct. Biol. 4, 64-69), aby sa identifikovali povrchové exponované zvyšky s použitím software WebLab Viewer. Celkom 39 zvyškov, ktoré mohli potenciálne interagovať s ABN912, bolo individuálne mutovaných na alanín alebo lyzín (D3K, A48K) s použitím kitu QuikChange Site-Directed Mutagenesis (Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J, and Wright, D. A. (1996) Strategies 9 (3), 3-4). .Výsledné mutované gény sa exprimovali v bunkách HEK.EBNA prvou transfekciou buniek dvoma mikrogramami expresných plazmidov nesúcich MCP-1 mutované sekvencie pomocou transfekčného činidla Géneporter (Géne Therapy Systems). Po transfekcii sa bunky inkubovali tri dni pri 37°C a potom sa odobrali supernatanty, stočené počas 5 minút a podrobili sa purifi.kácii. afinitnou chromatografiou. Koncentrácie mutovaného MCP-1 sa určovali s použitím súpravy Protein Assay (Biorad) s purifikovaným MCP-1 ako štandardom. Z 3 ml kultúry sa typicky získalo 40 pg purifikovaných ľudských MCP-1 alebo mutantných MCP-1.
Afinita MCP-1 a mutanta MCP-1 na NVP-ABN912 sa merala povrchovou plazmónovou rezonanciou s prístrojom BIAcore (BIAcore). Najskôr sa aktivoval povrch senzorového čipu prístroja a injikovalo sa 30 pg/ml roztoku anti-Fcy, aby sa kovalentne naviazali na čip. Protilátka NVP-ABN912 sa akumulovala na povrchu’ modifikovanom anti-Fcy injekciou 5 pg/ml roztoku. Pripravili sa riedenia MCP-1 alebo mutanta MCP-1 s konečnými koncentráciami od 0,75 do nM a injikovali sa, aby sa naviazali na imobilizovanú NVP-ABN912 na povrchu senzorového čipu. Asociácia a disociácia nasledovali po 5 minútach, počas ktorých sa zaznamenával signál povrchovej plazmónovej rezonancie. Titračná séria sa potom analyzovala s použitím software BIAevaluation 3.0 (Software part of the inštrument installation, Handbook Cat. No. BR-1002-29, vydanej 7-97). Výsledky sú uvedené na obrázku 4, ktorý ukazuje väzbu MCP-1 a mutanta MCP-1 na NVP-ABN912.
Hlavné determinanty na MCP-1 na rozpoznávanie NVP-ABN912, identifikované, ako je opísané skôr, sú zvyšky T16, R18, R24 a
K49. Mutácie T16, R18 a R24 na alanín úplne zrušili väzbu na
NVP-ABN912, zatiaľ čo mutácia K49 na alanín spôsobila 133-násobný pokles afinity.
Zoznam sekvencii
<110> Novartis AG Novartis-Erfindungen Verwaltunggesellschaft m-b-H. Hiestand Peter Hofstetter Hans Payne Trevor Glyn Urfer Roman
<120> Protilátky proti ľudskému MCP-1
<130> 31491
<140> PCT/EP 01/07468
<141> 2001-06-29
<150> GB0016138.0
<151> 2000-06-30
<160> 10
<170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1
<211> 366
<212> DNA
<213> Mus muscaris
<220>
<221> CDS
<222> (D . . (366)
<223> CDR1 od 91 do 105; CDR2od 148 do 198; CDR3 od 295 do 333;
<400> 1
gag gtg cag ctg gtg cag tet ggg gga ggc ttg gtc cag cct ggg ggg Gly Gly 15 48
Glu 1 Val Gin Leu Val Gin 5 Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tet gga ttc acc ttt agt cac tac 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
tgg atg age tgg gtc ege cag get cca ggg aaa ggg ctg gag tgg ctg 144
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
gcc aac ata gag caa gat gga agt gag aaa tac tat gtg gac tet gtg 192
Ala Asn íle Glu Gin Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc ega ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aat tca ctg tat 240
Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg aac agt ctg aga gcc gag gac acg get gtg tat ttc tgt 288
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
gcg agg gat ctt gaa ggt cta cat ggg gat ggg tac ttc gat ctc tgg 336
Ala Arg Asp Leu Glu Gly Leu His Gly Asp Gly Tyr Phe Asp Leu Trp
100 105 110
ggc cgt ggc acc ctg gtc acc gtc tet tca 366
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> MUS MUSCARIS
<400> 2 Glu Val Gin 1 Leu Val 5 Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Asn íle Glu Gin Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Glu Gly Leu His Gly Asp Gly Tyr Phe Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser <210> 3 <211> 327 <212> DNA < 213 > Mus muscaris <220>
<221> CDS <222> (1)..(327) <223> CDR1' od 70 do 102; CDR2' od 148 do 168; CDR3' od 265 do 285;
<400> 3
gcc Ala 1 atc cag íle Gin ttg aca cag Gin tct cca Ser Pro tcc Ser tcc ctg tct gca Ala tct Ser gta Val 15 gga Gly 48
Leu Thr 5 Ser 10 Leu Ser
gac aga gtc atc ctc atc tgc cgg gca agt cag ggc gtt agc agt get 96
Asp Arg Val íle Leu íle Cys Arg Ala Ser Gin Gly Val Ser Ser Ala
20 25 30
tta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa get cct aag ctc ctg atc 144
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu íle
35 40 45
tat gat gcc tcc agt ttg gaa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt gga tct ggg cca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240
Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
gaa gat ttt gca act tat ttc tgt caa cag ttt aat agt tac cct ctc 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gaa atc aaa ega act 327
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu íle Lys Arg Thr
100 105
<210> 4 <211> 109 <212> PRT <213> Mus muscaris <400> 4
Ala íle Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val íle Leu íle Cys Arg Ala Ser Gin Gly Val Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu íle
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu íle Lys Arg Thr
100 105
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus muscaris
<220>
<221> PEPTID
<222> (1)·.(5)
<223> Vh CDR1
<400> 5
His Tyr Trp Met Ser
5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus muscaris
<220>
<221> PEPTID <222> (1)..(17) <223> Vh CDR2 <400> 6
Asn íle Glu Gin Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Mus muscarís <220>
<221> PEPTID <222> (1)..(13) <223> Vh CDR3 <400> 7
Asp Leu Glu Gly Leu His Gly Asp Gly Tyr Phe Asp Leu
10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Mus muscarís <220>
<221> PEPTID <222> (1)..(11) <223> VI CDR1' <400> 8
Arg Ala Ser Gin Gly Val Ser Ser Ala Leu Ala
10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT < 213 > Mus muscarís <220>
<221> PEPTID <222> (1)..(7) <223> VI CDR2 ' <400> 9
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT < 213 > Mus muscaris <220>
<221> PEPTID <222> (1)..(7) <223> VI CDR3' <400> 10
Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro
5 ΐ? WZ-20t2_

Claims (13)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Molekula viažuca MCP-1, ktorá obsahuje miesto viažuce antigén obsahujúce aspoň jednu variabilnú doménu ťažkého reťazca (VH) imunoglobulinu, ktorá obsahuje sled hypervariabilných úsekov CDR1, CDR2 a CDR3, kde CDR1 má aminokyselinovú sekvenciu His-Tyr-Trp-Met-Ser, CDR2 má aminokyselinovú sekvenciu Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly, a CDR3 má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu; a jej priame ekvivalenty.
  2. 2. Molekula viažuca MCP-1, ktorá obsahuje miesto viažuce antigén obsahujúce aspoň jednu variabilnú doménu ľahkého reťazca imunoglobulinu (VL) , ktorá obsahuje sled hypervariabilných úsekov CDR1', CDR21 a CDR3', kde CDR1' má aminokyselinovú sekvenciu Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala, CDR2' má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser, a CDR3' má aminokyselinovú sekvenciu Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro; a jej priame ekvivalenty.
  3. 3. Molekula viažuca MCP-1, ktorá obsahuje variabilnú doménu tak ťažkého (VH) ako aj ľahkého reťazca (VL) , pričom molekula viažuca MCP-1 obsahuje aspoň jedno miesto viažuce antigén obsahujúce:
    a) variabilnú doménu ťažkého reťazca imunoglobulinu (VH) , ktorá obsahuje sled hypervariabilných úsekov CDR1, CDR2 a CDR3, kde CDR1 má aminokyselinovú sekvenciu His-Tyr-Trp-Met-Ser, CDR2 má aminokyselinovú sekvenciu Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly, a CDR3 má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu, a
    b) variabilnú doménu ľahkého reťazca imunoglobulinu (VL) , ktorá obsahuje sled hypervariabilných úsekov CDR1', CDR2' a CDR3', kde
    CDRľ má aminokyselinovú sekvenciu Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser~Ser-Ala-Leu-Ala, CDR2' má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser, a CDR3' má aminokyselinovú sekvenciu Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro;
    a jej priame ekvivalenty.
  4. 4. Molekula viažuca MCP-1 podľa nároku 1, 2 alebo 3, ktorá je ľudská protilátka.
  5. 5. Molekula viažuca MCP-1, ktorá obsahuje aspoň jedno miesto viažuce antigén obsahujúce buď prvú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú so sekvenciou uvedenou v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 1 začínajúcou aminokyselinou v polohe 1 a končiacou aminokyselinou v polohe 122, alebo prvú doménu opísanú vyššie a druhú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú so sekvenciou uvedenou v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 2, začínajúcou aminokyselinou v polohe 1 a končiacou aminokyselinou v polohe 109.
  6. 6. Prvý DNA konštrukt, ktorý kóduje ťažký reťazec alebo jeho fragment, a ktorý obsahuje
    a) prvú časť, ktorá kóduje variabilnú doménu obsahujúcu striedavo úseky rámca a hypervariabilné úseky, pričom hypervariabilné úseky sú sled CDR1, CDR2 a CDR3, s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou v zozname sekvencii ako sekvencia
    SEQ ID NO:
    1; pričom prvá časť začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu variabilnej domény a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu variabilnej domény, a
    b) druhú časť, ktorá kóduje konštantnú časť ťažkého reťazca alebo jej fragment, a ktorá začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu konštantnej časti ťažkého reťazca a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu konštantnej časti alebo jej fragmentu, po ktorom nasleduje stop kodón.
  7. 7. Druhý DNA konštrukt, ktorý kóduje ľahký reťazec alebo jeho fragment, a ktorý obsahuje
    a) prvú časť, ktorá kóduje variabilnú doménu obsahujúcu striedavo úseky rámca a hypervariabilné úseky; pričom hypervariabilné úseky sú CDRľ, CDR2' a CDR3', ktorých aminokyse.linové sekvencie sú v zozname sekvencií uvedené ako sekvencia SEQ ID NO:
    2;
    pričom táto prvá časť začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu variabilnej domény a konči kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu variabilnej domény, a
    b) druhú časť kódujúcu konštantnú časť ľahkého reťazca alebo jej fragment, ktorá začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu konštantnej časti ľahkého reťazca a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu konštantnej časti alebo jej fragmentu, po ktorom nasleduje stop kodón.
  8. 8. Expresný vektor schopný replikovať sa v prokaryotickej alebo eukaryotickej bunkovej línii, ktorý obsahuje aspoň jeden DNA konštrukt podľa nároku 6 alebo nároku 7.
  9. 9. Spôsob prípravy molekuly viažucej MCP-1, ktorý zahŕňa kroky, keď sa (i) kultivuje organizmus, ktorý je transformovaný expresným vektorom podľa nároku 8, a (ii) molekula viažuca MCP-1 sa izoluje z kultúry.
  10. 10. Protilátka proti MCP-1, ktorá križovo reaguje s eotaxínom.
  11. 11.
    i) Použitie protilátky proti MCP-1, ktorá križovo reaguje s eotaxínom-1, a ktorá je schopná inhibovať väzbu MCP-1 a eotaxínu-1 na ich receptory, pri liečení ochorení alebo porúch sprostredkovaných MCP-1 alebo eotaxinom;
    ii) spôsob liečenia ochorení alebo porúch sprostredkovaných MCP-1 alebo eotaxinom u pacienta, ktorý zahŕňa podávanie účinného množstva protilátky proti MCP-1, ktorá krížovo reaguje s eotaxinom, a ktorá je schopná inhibovať väzbu MCP-1 a eotaxinu na ich receptory, pacientovi;
    iii) farmaceutická kompozícia, ktorá obsahuje protilátku proti MCP-1, ktorá krížovo reaguje s eotaxinom a ktorá je schopná inhibovať väzbu. MCP-1 a eotaxinu na ich receptory, v kombinácii s farmaceutický prijateľným vehikulom, riedidlom alebo nosičom; a iv) použitie protilátky proti MCP-1, ktorá krížovo reaguje s eotaxinom, a ktorá je schopná inhibovať väzbu MCP-1 a ectaxínu na ich receptory, na výrobu lieku na liečenie ochorení alebo porúch sprostredkovaných MCP-1 alebo eotaxinom.
  12. 12. Protilátka proti MCP-1, ktorá má KD pre väzbu na MCP-1 okolo 50 pM alebo nižšiu.
  13. 13. Protilátka proti MCP-1, ktorá sa viaže na antigénnv epitop MCP-1, ktorý obsahuje arginínový zvyšok v polohe 24 v MCP-1.
SK1812-2002A 2000-06-30 2001-06-29 Protilátky proti ľudskému MCP-1 SK18122002A3 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0016138.0A GB0016138D0 (en) 2000-06-30 2000-06-30 Organic compounds
PCT/EP2001/007468 WO2002002640A2 (en) 2000-06-30 2001-06-29 Antibodies to human mcp-1

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK18122002A3 true SK18122002A3 (sk) 2003-06-03

Family

ID=9894801

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1812-2002A SK18122002A3 (sk) 2000-06-30 2001-06-29 Protilátky proti ľudskému MCP-1

Country Status (27)

Country Link
US (1) US20040047860A1 (sk)
EP (1) EP1299421B1 (sk)
JP (2) JP3920215B2 (sk)
KR (1) KR100603899B1 (sk)
CN (1) CN100486996C (sk)
AR (1) AR046379A1 (sk)
AT (1) ATE426616T1 (sk)
AU (2) AU8390301A (sk)
BR (1) BR0112086A (sk)
CA (1) CA2412775A1 (sk)
CZ (1) CZ20024256A3 (sk)
DE (1) DE60138102D1 (sk)
EC (1) ECSP024402A (sk)
ES (1) ES2322643T3 (sk)
GB (1) GB0016138D0 (sk)
HU (1) HUP0301477A3 (sk)
IL (1) IL153721A0 (sk)
MX (1) MXPA03000201A (sk)
NO (1) NO20026063L (sk)
NZ (1) NZ523195A (sk)
PE (1) PE20020125A1 (sk)
PL (1) PL207133B1 (sk)
PT (1) PT1299421E (sk)
RU (1) RU2314316C2 (sk)
SK (1) SK18122002A3 (sk)
WO (1) WO2002002640A2 (sk)
ZA (1) ZA200300199B (sk)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001066754A1 (en) 2000-03-03 2001-09-13 Cambridge Antibody Technology Limited Human antibodies against eotaxin and their use
US6946546B2 (en) 2000-03-06 2005-09-20 Cambridge Antibody Technology Limited Human antibodies against eotaxin
EP2298717B1 (en) 2001-11-30 2015-10-28 Biogen MA Inc. Antibodies against monocyte chemotactic proteins
US7202343B2 (en) * 2002-08-19 2007-04-10 Abgenix, Inc. Antibodies directed to monocyte chemo-attractant protein-1 (MCP-1) and uses thereof
WO2004024921A1 (ja) 2002-09-12 2004-03-25 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute ヒト抗ヒトｍｃｐ−１抗体及び該抗体フラグメント
EP1684703A4 (en) * 2003-11-05 2008-10-01 Centocor Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING PATHOLOGIES ASSOCIATED WITH MCP-1
US20080299130A1 (en) * 2004-05-04 2008-12-04 University Of Kentucky Research Foundation Methods And Compositions For The Treatment Of Ocular Neovascularization
GB0412400D0 (en) * 2004-06-03 2004-07-07 Univ Newcastle Treatment of inflammatory conditions
TW200716174A (en) * 2005-05-19 2007-05-01 Centocor Inc Anti-MCP-1 antibodies, compositions, methods and uses
US8114964B2 (en) * 2005-05-19 2012-02-14 Centocor, Inc. Anti-MCP-1 antibodies, compositions, methods and uses
US20090297502A1 (en) * 2006-06-15 2009-12-03 Li Li Ccr2 antagonists for chronic organ transplantation rejection
CA2658719A1 (en) * 2006-07-24 2008-01-31 Yeda Research And Development Co. Ltd. Pharmaceutical compositions comprising ccl2 and use of same for the treatment of inflammation
US20080076120A1 (en) * 2006-09-14 2008-03-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for the identification, evaluation and treatment of patients having CC-Chemokine receptor 2 (CCR-2) mediated disorders
WO2008060783A2 (en) * 2006-10-05 2008-05-22 Centocor Ortho Biotech Inc. Ccr2 antagonists for treatment of fibrosis
CA2672944A1 (en) 2006-12-22 2008-07-03 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against chemokines and polypeptides comprising the same for the treatment of chemokine-related diseases and disorders
EP2170387A4 (en) * 2007-06-29 2011-01-19 Centocor Ortho Biotech Inc ANTI-MCP-1 ANTIBODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES
US20090170770A1 (en) * 2007-11-06 2009-07-02 Ali Hafezi-Moghadam Methods and compositions for treating conditions associated with angiogenesis using a vascular adhesion protein-1 (vap 1) inhibitor
AU2009283199B2 (en) 2008-08-18 2015-08-13 Amgen Fremont Inc. Antibodies to CCR2
NZ591187A (en) 2008-08-20 2012-07-27 Probiodrug Ag Antibodies directed against pyroglutamate monocyte chemoattractant protein-1 (mcp-1 n1pe)
JP2012531202A (ja) * 2009-06-25 2012-12-10 フレッド ハチンソン キャンサー リサーチ センター 適応免疫を測定する方法
EP2864358B1 (en) 2012-06-22 2019-08-07 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind ccr2
BR112017002980A2 (pt) * 2014-08-15 2017-12-12 Pixarbio Corp composição para inibir a inflamação em um indivíduo com um dano na coluna vertebral, método para tratar inflamação em um indivíduo tendo um dano na coluna vertebral e kit para produzir a composição
CN104198727A (zh) * 2014-08-22 2014-12-10 广西南宁隆吉维特生物科技有限公司 人血清ccl2酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法
DK3050574T3 (da) 2015-01-28 2020-01-20 Univ Bordeaux Anvendelse af plerixafor til behandling og/eller forebyggelse af akutte forværringer af kronisk obstruktiv lungesygdom
CN105695495B (zh) * 2015-12-07 2020-02-18 中国石油大学(华东) 一种高活性人趋化因子的制备方法及用途
EP4252629A3 (en) 2016-12-07 2023-12-27 Biora Therapeutics, Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
EP3554541B1 (en) 2016-12-14 2023-06-07 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a chemokine/chemokine receptor inhibitor
CN108048408B (zh) * 2018-01-26 2020-02-07 扬州大学 牛单核细胞趋化蛋白-1杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及应用
EP3883634A1 (en) 2018-11-19 2021-09-29 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
CA3135694A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 Hiroshima University Therapeutic agent for urological cancer which is characterized by being administered with il-6 inhibitor and ccr2 inhibitor in combination
EP4309722A2 (en) 2019-12-13 2024-01-24 Biora Therapeutics, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
CA3164818A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-ccl2 antibodies
CN112358547A (zh) * 2020-09-30 2021-02-12 浙江大学 抗人cxcl-2单克隆抗体3-d3及其编码基因和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9115364D0 (en) * 1991-07-16 1991-08-28 Wellcome Found Antibody
EP1784425A4 (en) * 2004-06-30 2009-02-18 Centocor Inc ANTI-MCP-1 ANTIBODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES

Also Published As

Publication number Publication date
EP1299421A2 (en) 2003-04-09
PT1299421E (pt) 2009-06-26
CN100486996C (zh) 2009-05-13
NO20026063D0 (no) 2002-12-17
PE20020125A1 (es) 2002-03-12
AU8390301A (en) 2002-01-14
CA2412775A1 (en) 2002-01-10
JP2004502421A (ja) 2004-01-29
ECSP024402A (es) 2003-02-06
BR0112086A (pt) 2003-05-06
EP1299421B1 (en) 2009-03-25
CN1443199A (zh) 2003-09-17
JP3920215B2 (ja) 2007-05-30
KR20030014272A (ko) 2003-02-15
ZA200300199B (en) 2003-11-13
NO20026063L (no) 2003-02-27
AU2001283903B2 (en) 2005-06-02
HUP0301477A2 (hu) 2003-08-28
RU2314316C2 (ru) 2008-01-10
DE60138102D1 (de) 2009-05-07
IL153721A0 (en) 2003-07-06
GB0016138D0 (en) 2000-08-23
CZ20024256A3 (cs) 2003-04-16
KR100603899B1 (ko) 2006-07-25
NZ523195A (en) 2005-09-30
MXPA03000201A (es) 2003-05-27
US20040047860A1 (en) 2004-03-11
PL207133B1 (pl) 2010-11-30
ATE426616T1 (de) 2009-04-15
ES2322643T3 (es) 2009-06-24
PL359854A1 (en) 2004-09-06
JP2007054079A (ja) 2007-03-08
WO2002002640A3 (en) 2002-05-16
WO2002002640A2 (en) 2002-01-10
HUP0301477A3 (en) 2005-11-28
AR046379A1 (es) 2005-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK18122002A3 (sk) Protilátky proti ľudskému MCP-1
KR102256152B1 (ko) Ｐｄ-1 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 이의 의약 용도
EP1871807B1 (en) Antibodies against cxcr4 and methods of use thereof
EP2242771B1 (en) Binding molecules to the human ox40 receptor
AU2001283903A1 (en) Antibodies to human MCP-1
MXPA02007091A (es) Anticuerpos para il-1b humana.
UA123398C2 (uk) Виділене антагоністичне антитіло, яке специфічно зв&#39;язує cd154, та фармацевтична композиція, яка його містить
US20210009706A1 (en) Anti-CD27 Antibody, Antigen-binding Fragment Thereof, and Medical Use Thereof
EP1708961B1 (en) Anti-ip-10 antibodies
AU2020322588A1 (en) Anti-BCMA antibody, antigen-binding fragment thereof and medical use thereof
AU2018202095B2 (en) Binding Molecules to the Human OX40 Receptor
AU2014202213A1 (en) Binding Molecules to the Human OX40 Receptor

Legal Events

Date Code Title Description
FB9A Suspension of patent application procedure