JP2007054079A - ヒトmcp−1に対する抗体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】定義されるような配列からなる超可変領域CDR1、CDR2およびCDR3Rを含む免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン(VH)を少なくとも1つ含む抗体を提供することにより、上記課題を解決した。
【選択図】なし
Description
本発明は、ヒト単球遊走性タンパク質(MCP)−1に対する抗体、および単球およびT細胞の遊走および活性化が関与する疾患および障害、例えば炎症性疾患の処置への当該抗体の使用に関する。
公開された日本特許出願JP05276986号(住友電気工業株式会社)には、MCP−1を決定して、マクロファージの浸潤が関与する疾患を処置および治療するのに有益なヒトMCP−1に対するげっ歯類のモノクローナル抗体の調製法が記載されている。公開された日本特許出願JP09067399号(三井東圧)には、炎症の治療に使用されるEBV形質転換ヒト末梢血細胞由来のヒトMCP−1に対するヒトモノクローナル抗体を記載されている。公開された日本特許出願JP11060502号(帝人)には、MCP−1インヒビター、特に脳梗塞の処置のためのヒト抗MCP−1抗体の使用が記載されている。
我々は、今や単球およびT細胞の遊走および活性化が関与する疾患および障害の治療に使用されるヒトMCP−1に対する改良型の抗体を作成した。
a)配列中に超可変領域CDR1、CDR2、およびCDR3であって;当該CDR1がアミノ酸配列His−Tyr−Trp−Met−Serを有し、当該CDR2がアミノ酸配列Asn−Ile−Glu−Gln−Asp−Gly−Ser−Glu−Lys−Tyr−Tyr−Val−Asp−Ser−Val−Glyを有し、そして当該CDR3がアミノ酸配列Asp−Leu−Glu−Gly−Leu−His−Gly−Asp−Gly−Tyr−Phe−Asp−Leuを有する領域を含む免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン(VH)、および
b)配列中に超可変領域CDR1'、CDR2'およびCDR3'であって;当該CDR1'がアミノ酸配列Arg−Ala−Ser−Gln−Gly−Val−Ser−Ser−Ala−Leu−Alaを有し、当該CDR2'がアミノ酸配列Asp−Ala−Ser−Ser−Leu−Glu−Serを有し、そして当該CDR3'がアミノ酸配列Gln−Gln−Phe−Asn−Ser−Tyr−Proを有する領域を含む免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン(VL);
を含む抗原結合部位;
およびその直接的に等価なものを少なくとも1つ含む結合分子もまた提供する。
抗原部位がVHおよびVLドメインの双方を含む場合、これらが同じポリペプチド分子上に配置されていてもよく、あるいは好ましくは各ドメインが異なる鎖状にあって、VHドメインが免疫グロブリンの重鎖またはそのフラグメントの一部分であってもよく、そしてVLが免疫グロブリンの軽鎖またはそのフラグメントの一部分であってもよい。
例えば抗原結合分子としては、B細胞またはハイブリドーマにより産生されるような抗体、およびキメラのCDR移植またはヒト抗体、あるいはそのフラグメント、例えばF(ab')2およびFabフラグメント、ならびに1本鎖またはシングルドメイン抗体が挙げられる。
a)(i)配列中に超可変領域CDR1、CDR2、およびCDR3を含む可変ドメインおよび(ii)ヒト軽鎖の定常部分またはそのフラグメントを含む免疫グロブリンの重鎖またはそのフラグメントであって;当該CDR1がアミノ酸配列His−Tyr−Trp−Met−Serを有し、当該CDR2がアミノ酸配列Asn−Ile−Glu−Gln−Ap−Gly−Ser−Glu−Lys−Tyr−Tyr−Val−Asp−Ser−Val−Glyを有し、そして当該CDR3がアミノ酸配列Asp−Leu−Glu−Gly−Leu−His−Gly−Asp−Gly−Tyr−Phe−Asp−Leu有するもの、および
b)(i)CDR3'超可変領域および任意でCDR1'、CDR2'超可変領域を含む可変ドメインおよび(ii)ヒト軽鎖の定常部分またはそのフラグメントを含む免疫グロブリンの軽鎖またはそのフラグメントであって;当該CDR1'がアミノ酸配列Arg−Ala−Ser−Gln−Gly−Val−Ser−Ser−Ala−Leu−Alaを有し、当該CDR2'がアミノ酸配列Asp−Ala−Ser−Ser−Leu−Glu−Serを有し、そして当該CDR3'がアミノ酸配列Gln−Gln−Phe−Asn−Ser−Tyr−Proを有するものを少なくとも1つ含むヒト抗MCP−1抗体;
およびその直接的に等価なものから選択される。
a)超可変領域CDR1、CDR2およびCDR3を配列中に含む第1のドメインであって、当該超可変領域が配列番号1に示されるようなアミノ酸配列を有するもの
b)超可変領域CDR1'、CDR2'およびCDR3'を含む第2のドメインであって、当該超可変領域が配列番号2に示されるようなアミノ酸配列を有するもの、および
c)第1のドメインのN末端部と第2のドメインのC末端部か、あるいは第1のドメインのC末端部と第2のドメインのN末端部かのいずれかに結合するペプチドリンカーを含む抗原結合部位を含む1本鎖結合分子;
その直接的に等価なものから選択されてもよい。
(i)全体としてみなされる超可変領域CDR1、CDR2およびCDR3が、配列番号1に示されるような超可変領域と少なくとも80%相同し、好ましくは少なくとも90%相同し、より好ましくは少なくとも95%相同し、そして
(ii)分子Xと同等のフレームワーク領域を有するが、配列番号1に示されるのと同等の超可変領域CDR1、CDR2、およびCDR3を有する基準分子とほぼ同程度までMCP−1のレセプターへの結合を阻害可能であるものか、
あるいは結合部位当たり少なくとも2つのドメインを有する任意のMCP−1結合分子(分子X')であって、
(i)全体としてみなされる超可変領域CDR1、CDR2、CDR3、CDR1'、CDR2'およびCDR'3が、配列番号1および2に示されるような超可変領域と少なくとも80%相同し、好ましくは少なくとも90%相同し、より好ましくは少なくとも95%相同し、そして
(ii)分子X'と同等のフレームワーク領域および定常部分を有するが、配列番号1および2に示されるのと同等の超可変領域CDR1、CDR2、CDR3、CDR1'、CDR2'およびCDR3'を有する基準分子とほぼ同程度までMCP−1のレセプターへの結合を阻害可能であるもの、
のいずれかを意味する。
例えば、利用されるアッセイは、膜結合MCP−1レセプター(CCR2B)および本発明のMCP‐1結合分子によるMCP‐1結合の競合阻害アッセイ、例えばこれ以降、実施例で性召されるようなSPA法を用いるアッセイであってもよい。
a)1位のアミノ酸で始まり122位のアミノ酸で終了する配列番号1に示されるものとほぼ同等のアミノ酸配列を有する可変ドメインとヒト重鎖の定常部分を含む1つの重鎖;および
b)1位のアミノ酸で始まり109位のアミノ酸で終了する配列番号2に示されるものとほぼ同等のアミノ酸配列を有する可変ドメインとヒト軽鎖の定常部分を含む1つの軽鎖
を含む。
本発明のMCP−1結合分子は、組み換えDNA技術により産生され得る。この点から、該結合分子をエンコードする1以上のDNA分子が、構築され、適当なコントロール配列下に配置され、そして発現用の好適な宿主組織中に移入されなければならない。
(i)本発明のシングルドメインのMCP−1結合分子、本発明の1本鎖のMCP−1結合分子、その重若しくは軽鎖またはフラグメント、あるいは本発明のMCP−1結合分子をエンコードDNA分子、および
(ii)組み換え法による本発明のMCP−1結合分子の産生への本発明のDNA分子の使用が提供されている。
既述の観点から、どのハイブリドーマまたは細胞株の寄託も十分に記述の範囲に準拠している必要はない。
第1のDNA構築物は、重鎖またはそのフラグメントをエンコードして、
a)代替としてフレームワークおよび超可変領域を含む可変ドメインをエンコードする第1部分であって、当該超可変領域が、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなる配列CDR1、CDR2およびCDR3中にあり;この第1部分が可変ドメインの最初のアミノ酸をエンコードするコドンで開始し、可変領域の最後のアミノ酸をエンコードするコドンで終了する部分、および
b)重鎖定常部分またはそのフラグメントをエンコードする第2部分であって、重鎖の定常部分の最初のアミノ酸をエンコードするコドンで開始し、その定常部分またはフラグメントの最後のアミノ酸をエンコードするコドンで終了し、その後に停止コドンが続く部分を含む。
a)代替としてフレームワークおよび超可変領域を含む可変ドメインをエンコードする第1部分であって、当該超可変領域が、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる配列CDR1'、CDR2'およびCDR3'中にあり;この第1部分が可変ドメインの最初のアミノ酸をエンコードするコドンで開始し、可変領域の最後のアミノ酸をエンコードするコドンで終了する部分、および
b)軽鎖定常部分またはそのフラグメントをエンコードする第2部分であって、軽鎖の定常部分の最初のアミノ酸をエンコードするコドンで開始し、その定常部分またはフラグメントの最後のアミノ酸をエンコードするコドンで終了し、その後に停止コドンが続く部分を含む。
従って、本発明は、上述のDNA構築物のうち少なくとも1つを含む原核または真核細胞株中で複製可能である発現ベクターもまた提供する。
本発明のMCP−1結合分子がヒト抗体、例えばAAV293、AAV294またはABN912抗体であるのがより好ましく、そして相応するハイブリドーマ細胞株の培養により、あるいは好ましくは抗体のアイソタイプまたは他の抗体機能若しくは特性を変えるために変更されたDNAを含むヒト抗体に対してコードされるDNAを含む組み換え細胞株から産生されて得る。
有利なことに本発明のこの態様の抗体は、MCP−1のレセプターへの結合を阻害可能であり、そしてエオタキシンのレセプターへの結合を阻害可能である。
i)MCP−1およびエオタキシンのレセプターへの結合を阻害可能なエオタキシンと交差反応するMCP−1に対する抗体のMCP−1またはエオタキシンを介する疾患または障害の処置への使用;
ii)エオタキシンと交差反応し、そしてMCP−1およびエオタキシンのレセプターへの結合を阻害可能であるMCP−1に対する抗体を有効量患者に投与することを含む、MCP−1またはエオタキシンを介する疾患または障害の患者の処置法;
iii)エオタキシンと交差反応し、そしてMCP−1およびエオタキシンのレセプターへの結合を阻害可能であるMCP−1に対する抗体を含み、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせた医薬組成物;そして
iv)エオタキシンと交差反応し、そしてMCP−1およびエオタキシンのレセプターへの結合を阻害可能であるMCP−1に対する抗体の、MCP−1またはエオタキシンを介した疾患または障害の処置用の薬物調製への使用
を含む。
これらの更なる態様において、MCP−1抗体は、好ましくはエオタキシン1と交差反応し、エオタキシンを介した疾患は、好ましくはエオタキシン1を介した疾患である。
従ってさらに更なる態様において、本発明は、MCP−1への結合に対して50pM以下のKDを有する抗体を提供する。本発明のこの態様はまた、上述のエオタキシンと交差反応するMCP−1に対する抗体に対して示されるような、高親和性抗体に対する使用および組成物が挙げられる。
本発明の抗体が、本発明の第1および第2の態様によるMCP−1結合分子であるのが好ましい。本発明の抗体がヒト抗体であるのが有利であり、最も好ましいのはABN912抗体またはその直接的に等価なものである。
1.MCP−1のCCR2B発現細胞への結合の阻害
MCP−1のシグナル伝達およびエフェクター機能に対する必須条件は、MCP−1のレセプターCCR2Bとの相互作用である、シンチレーション近接アッセイ(SPA)技術が、本発明の抗体がMCP−1の当該レセプターを発現する細胞膜への結合を阻害するのを示すために利用される。
CCR2B発現CHO細胞の膜を濃度範囲のある標的抗体(例えば10−14M〜10−8M)とインキュベートし、(125−I)MCP−1の残りの結合を小麦胚凝集素ビーズを用いてSPAにより測定する。本発明の抗体は、典型的には約0.1〜約10nMの範囲、特にこのアッセイで検定したときは約0.5nM(例えば461±206pM)のIC50を有する。
MCP−1により誘発される本発明の抗体の生理的影響を阻害する能力は、抗体の存在および非存在中でのMCP−1誘発性の細胞内Ca2+の流動を測定することにより決定される。
カルシウム反応の測定は、安定にトランスフェクションされたCCR2B発現CHO細胞株およびTHP−1細胞により、本明細書の後述の実施例に示されるような蛍光色素およびFACS分析を利用して実施される。本発明の抗体は、典型的には約0.05〜約10nM、特にこのアッセイで検定した場合は約0.5nM(例えば390±20pM)のIC50を有する。
本発明の抗体は、MCP−1またはエオタキシンが介する疾患または病状の予防および処置に対して有益である。MCP−1は、白血球輸送、特には炎症部位への単球遊走において重要な役割を果たす。本発明の抗体は、例えば炎症性の症状、アレルギーおよびアレルギー症状、自己免疫疾患、移植の拒絶反応、白血球の浸潤が関与する癌、狭窄または再狭窄、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、および骨粗鬆症において単球の遊走を阻害するために利用され得る。
呼吸器アレルギー疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、COPD、過敏性肺疾患、間質性肺疾患(ILD)、(例えば特発性灰線維症、またはRA、SLE等のような自己免疫疾患と関係するILD)を含む炎症性またはアレルギー症状;アナフィラキシーまたは過敏性反応、薬物アレルギー(例えばペニシリンまたはセファロスポリンに対する)、および虫刺されアレルギー;クローン病および潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患;脊椎関節症、内臓悪性腫瘍;皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹、血管炎のような乾癬および炎症性皮膚疾患;自己免疫疾患、特には骨喪失、炎症性痛覚、過敏症(気道性過敏症および皮膚性過敏症の双方を含む)およびアレルギーを含む、関節炎(例えば関節リウマチ、進行性慢性リウマチ、乾癬性関節炎および変形性関節炎)およびリウマチ性疾患のような炎症性成分を含む病因のある自己免疫疾患。
上述の適応症に対して、もちろん適用量は、例えば、特には使用される本発明の抗体、宿主、投与形態、および処置されるべき症状の性質および重症度によって変動する。しかしながら予防的使用において、体重のキログラム当たり約0.05mg〜約10mg、通常では体重のキログラム当たり約0.1mg〜約5mgの用量で有効な結果が得られると一般的には示されている。予防的利用に対する服用頻度は、通常は1週間にほぼ1回〜3ヶ月ごとにほぼ1回の範囲であり、通常では、2週間ごとにほぼ1回〜10週間ごとにほぼ1回、例えば4または8週間ごとに1回である。本発明の抗体は、経口で、静注(例えば前腕前部または他の末梢の血管中に)で、例えば筋注で、または皮下に簡単に投与可能である。例えば予防的処置は、典型的には本発明の抗体を1ヶ月ごとに1回〜2、3ヶ月ごとに1回、またはそれより少ない頻度で投与することを含む。
図1Aは、処置または未処置のアカゲザル由来の種々のパンチ生検に対する好酸球ペルオキシダーゼ(EPO)活性を示すグラフであり;
図1Bは、その生検に対するミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性を示す同様のグラフであり;
図2は、ABN912およびBCGP44290(コントロール抗体)での処置前および後の両方における4頭のアカゲザルからの組織試料に対する好酸球染色を示す写真であり;
図3は、種々の処置法に対するヒト皮膚移植のTh細胞遊走(%)を示すグラフであり;そして
図4は、MCP−1の結合に対するABN912変異体の相対的結合親和性を示すグラフである。
マウス免疫グロブリン能の代わりにヒトIgG/κ能を発現するように作成されたトランスジェニックマウス(Fishwild et al., 1996, Nat Biotechnol. 14, 845-851)を、ヒトMCP−1に対する抗体を産生するために使用する。これらマウス由来のB細胞は、標準的なハイブリドーマ技術により不死化させて、ヒトIgG3/κ抗体AAV293を分泌するマウスのハイブリドーマ細胞を得る。
免疫化
4匹のMedarexマウス(マウス番号第16194−16197番、Medarex Inc. Annadale, NJ, USA)を、組み換えヒトMCP−1(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)で0および14(i.p.)および26(i.v.)日目に、完全フロイントアジュバント中にマウス当たり100μgのタンパク質を用いて免疫する。更にマウスをrhMCP−1で、0および49および65日目に皮下投与で不完全フロイントアジュバント中にマウス当たり100μgのタンパク質を用いて免疫する。106日目にアッセイするときに、マウスのうちの1匹(マウス番号第16194番)において実質的な抗MCP−1抗体価を検定する。このマウスを、融合前に更に7回追加免疫する:106日目(i.p.)、119日目(s.c.)および135(i.v.)日目に生理食塩水中にマウス当たり100μgと、融合4日前(i.v.とi.p.を2回)、3日前および2日前(両方ともi.p.)に生理食塩水中にマウス当たり25μg。
融合時にマウス16194番をCO2吸入により屠殺して、すべての脾臓細胞(4.8x107)をPEG4000を用いて常法により、PAI−O細胞(5x107)、マウスの細胞株に融合する。RPMI1640、10% 熱不活性化ウシ胎仔血清、5x10−5M β−メルカプトエタノール、50μg/ml ゲンタマイシンを補充したHATにおいて、マウス腹腔細胞(Balb/cマウス)のフィーダー層を含有する720ウェル(1ml/ウェル)中に、融合細胞をプレーティングする。培養培地は4日ごとに交換し、14日以降はHAT培地をHT培地に交換した(すなわちアミノプテインを除いた)。プレーティングした最初の720ウェルのうち、461ウェル(64%)が陽性のハイブリドーマ成長である。上清を回収して、MCP−1反応性モノクローナル抗体についてELISAでスクリーニングする。IgGサブクラスの7つのモノクローナル抗体が同定される。4x96ウェルのマイクロタイタープレートを用いて、ウェル当たり0.5細胞/100μlでプレーティングして、クローニングを実施する。クローンは、8日後に顕微鏡でチェックして、成長培地を100μl添加して、上清を次の日にELISAで検定する。最も反応性の高いハイブリドーマである、クローン149を更にクローニングして特性評価するために選択する。IgG3/κ抗体生成物、AAV293のrhMCP−1依存カルシウム代謝アッセイにおける阻害活性に基づいて、ハイブリドーマサブクローン149−12を選択する。
アミノ酸配列決定
精製した抗体AAV293の軽鎖および重鎖を、SDS−PAGEにより分離して、エドマン分解によりアミノ末端のアミノ酸を決定する。重鎖および軽鎖可変ドメインに対してコードされるcDNA配列は、クローニングしたハイブリドーマ由来のmRMAから得られるcDNAのPCR増幅により得られ、そして完全に配列決定される。重鎖および軽鎖可変ドメインおよび相応するDNA配列のアミノ末端アミノ酸配列は、以下の配列番号1および配列番号2に示され、配列中CDRが太字で示されている。
クローニングされたVLおよびVHを、エンコードする配列をPCRで増幅して、免疫グロブリンプロモーター、RFT2抗体(Heinrich et al. (1989) J. Immunol. 143, 3589-97)由来のリーダー配列、Jセグメントの一部分およびスプライスドナー部位を備えたカセットベクター中に、適当な制限部位を介して挿入する。分泌に対してVL領域全体、プロモーターおよびリーダー配列を含有する軽鎖カセットを、ヒトCk遺伝子、免疫グロブリン重鎖エンハンサー、およびメトトレキサート(MTX)により選択される変異型マウスdhfr cDNAを含有する発現ベクター中に移入する。
従って重鎖カセットは、ヒトIgG4遺伝子、免疫グロブリン重鎖エンハンサー、および選択されたネオマイシン耐性遺伝子をエンコードする発現ベクター中に移入される。
抗体産生のために、上述のベクターを、適当な宿主細胞株、例えばSP2/0細胞株中に同時形質移入する。そのベクター配列を含む細胞を、メトトレキサート選択により選択し、選択された細胞株を培養してABN912抗体(ヒトIgG4/κ抗ヒトMCP−1抗体)を発現させる。
ヒトモノクローナル抗体、ABN912は、ヒトMCP−1に結合して、インビトロではその機能が失われる。Biacore分析およびシンチレーション近接アッセイ(SPA)分析による2つの別々の生化学的方法により、組み換えヒトMCP−1への結合に対して、該モノクローナル抗体を更に特性評価する。他のCC−ケモカインまたは非ヒトMCP−1に対するABN912抗体の特異性をBIAcoreにより評価し、ABN912によるMCP−1のCCR2B発現細胞への結合の阻害をSPAにより示す。組み換えおよび自然発生的に産生されるMCP−1に対するABN912の生物学的活性は、CCR2B発現細胞におけるCa2+代謝アッセイにより示す。天然の標的細胞、ヒト末梢血単球(hPBMCs)に対するABN912の活性は、MCP−1による走化能アッセイにより示す。
組み換えヒトMCP−1の固定化ABN912への結合に対する結合速度定数および解離速度定数をBIAcore分析により決定して、Kd値を導き出す。ABN912をセンサーチップの表面に固定して、組み換えMCP−1の結合を表面プラズモン共鳴法(BIOCORE 2000 Instrument Handbook, March 1999(Version AC);http:www.biacore.com)により測定する。得られた結果を下の表に示す。
MCP−1のABN912との相互作用の特異性を検定するために、いくつかの非ヒトMCP−1およびCC−ケモカインを、ABN912との相互作用の潜在能力についてBIAcoreにより評価する。
ABN912抗体への結合について、研究室で一般的に利用される種由来の一連のMCP−1を評価する。定量は、ABN912で前もってロードしたBIAcoreフローセル中に5nM ケモカイン溶液を注入することにより実施する。8分後、検定された各ケモカインについて結合したケモカイン量を定量する。得られた結果は、組み換えヒトMCP−1(100%)と比較した各ケモカインの結合%として下の表に示す。
ABN912の他のCC−ケモカインとの交差反応性のプロファイルを検定するために、それらの抗体に対する結合潜在性を、上述の方法により評価する。組み換えヒトMCP−1(100%)と比較した各ケモカインの結合%を下の表に示す。
ABN912抗体がMCP−1がCCR2Bレセプターを発現している細胞膜に結合するのを阻害することを示すために、SPA(シンチレーション近接アッセイ)技術が利用される。CCR2B発現CHO細胞(CHO#84、下記参照)の細胞膜を10−14M〜10−8Mの濃度範囲でABN912とインキュベーションして、放射活性(125−I)−MCP−1の残りの結合を小麦胚凝集素ビーズを用いてSPAにより測定する。3回別々の試験により得られる平均IC50[M]は、(461±206)x10−12である。ABN912は、MCP−1のCCR2Bレセプターを発現する細胞膜への結合を阻害する。
MCP−1による情報伝達の初期事象は細胞内Ca2+の代謝であり、これは蛍光色素を用いて測定可能である。
カルシウム応答の測定は、細胞株CHO#84、すなわちトランスフェクションしてケモカインレセプターCCR2Bを発現させたCHO細胞株を用いて実施する。CHO#84細胞をリボヌクレアーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼを含まないで、10% 透析FCS、200U/ml ペニシリン/ストレプトマイシンおよび選択剤として80nM メトトレキサートを補充したglutamax-1を有するMEMアルファ培地中で培養する。培養細胞が密ではあるが集密(confluence)となる前に細胞をPBSで洗浄し、トリプシン−EDTAと短時間(最大1分)インキュベーションして剥離する。
溶媒S1中での抗体A1の阻害(%)は式:
100−[S.I.A1x100/S.I.S1]
で与えられる。
ABN912のhPBMC(ヒト末梢血単球細胞)に対するMCP−1の走化効果を阻害する能力は、走化能アッセイをベースにしたボイデンチャンバー中で測定される。HPBMCをLymphoprep(登録商標)を用いて調製して、ml当たり2x106の単球をインプットとして使用する。ABN912または無関係の抗体(ネガティブコントロール)をチャンバーの底および先端のコンパートメントに指示されたモル比で添加する。チャンバー底において5.7nM 組み換えヒトMCP−1または1nM fMIFL(ネガティブコントロール)により走化を誘発する。細胞は、チャンバーの先端からチャンバーの底まで室温で90分間遊走可能とする。遊走した細胞の数を染色およびカウントにより測定する。ABN912は、MCP−1誘発性のhPBMCsの走化を用量依存的に阻害する。ABN912のMCP−1誘発性の走化に対する効果は特異的であり;無関係の抗体は効果がなく、ABN912はfMIFL誘発性の走化に対しては効果がない。
この機構モデルは、アカゲザルの白血球の皮膚中へのMCP−1誘発性の遊走が、NVP−ABN912を静注の大量瞬時投与で投与した場合に阻害可能であるかどうかを検定するために利用される。
白血球数を増やして最適に白血球を補充するための内皮細胞を準備するために、雄性成体アカゲザルに30μg/kg IL−3を13日間(1日に2回の静注)投与した。13日目に、サルを麻酔して、MCP−1(10μg)を、胸部および腹部の右側に3回腹腔内投与した。4時間後、サルを再度麻酔してMCP−1投与部位からパンチ生検を採取した。その後、NVP−ABN912またはアイソタイプに適合する癌胎児性抗原に対するヒト化ネガティブコントロール抗体(CGP44290)を、静注の大量瞬時投与で投与すると5mg/kgの用量に達した。これらの投与部位はこれまでの投与に対して対称な位置とした。4時間後、サルを麻酔して、MCP−1投与部位からパンチ生検を採取した。すべてのパンチ生検を半分に切り取って、その半分のうちの1つを酵素分析用に液体窒素中で冷凍した。半分のもう一方は、後の組織像用にホルマリン中に保存した。好酸球および好中球に対する酵素アッセイは、それぞれ好酸球ペルオキシダーゼ(EPO)活性およびミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性である。PBS投与およびコントロールおよび細胞浸潤を刺激するために投与なしのコントロールを、各サルに対して並行して実施した。どちらのコントロールでも抗体を介した有意な効果は見られなかった。
抗体による処置前(MCP−1未処置、100%)および処置後のパンチ生検における正規化したEPO(A)またはMPO(B)活性を、平均値±SDで示す。
(A)、(B)、(E)、(F)は、それぞれサル2279、2280、2281および2282の抗体による処置の前に染色した好酸球。
(C)、(D)、(G)、(H)は、それぞれサル2279、2280、2281および2282の抗体による処置の後に染色した好酸球。
CGP44290では処置の前と後との間には差が見られなかったものの、NVP−ABN912で処置したサルにおいては好酸球遊走のほぼ完全な阻害が見られた。
この機構モデルは、MCP−1によるTh細胞のSCID−huマウスの皮膚への浸潤が、NVP−ABN912をi.p.投与することにより阻害可能であるかどうかを検定するために利用される。
SCIDマウスに、成人のヒト皮膚(SCID−hu皮膚)の2つの小片を移植した。この移植片の特性を移植後5〜6週間の間モニターして、その後移植が成功したマウス(一般的に>85%)をインビボでの遊走試験に選択した。ケモカインによる遊走について、PBMCを軟膜試料から標準的な密度勾配分離により単離して、2つのヒト皮膚片(上背の右および左側)で先に移植された(5−8週間)SCID−hu皮膚中任意でに移入した(i.p.、1x108細胞/マウス、容量500μl)。細胞移入は0日目に実施した。試験1、2、4および6日目にヒト移植片中に、MCP−1(R&D System, Minneapolis, MN)およびPBSを皮内投与した。コントロールマウス(CGP44290処置)は、500ng MCP−1を右の皮膚移植片中に、および等量のPBS(30μl)を左の皮膚移植片中に得た。NVP−ABN912処置マウスに、左右両方の皮膚移植片に500ng MCP−1を投与した。0日目(細胞移入の5時間前)と試験の2および5日目に、NVP−ABN912およびそのアイソタイプコントロールCGP44290をi.p.(100μg/マウス、4mg/kg、容量500μl)で投与し、すべてのマウスを屠殺してヒト皮膚移植片を更なる分析用に回収した。各ヒト皮膚移植片の単一細胞懸濁液を、DAKO Medimachine(登録商標)を取扱説明書に従って用いて調製した。これらの細胞懸濁液を、FITCおよびPEと共役したヒト抗CD3および抗CD4mAbで染色して、FACcalibur フローサイトメーター(Becton Dickinson, San Jose, CA)中で分析した。その結果を図3に示している。ABN912処置群(5例のマウス、n=10)においては、相応するCPG44290処置群(3例のマウス、n=3)において見られる3.73±1.01%と比較すると、注入したヒトTh細胞の0.73±0.15%が皮膚移植片を浸潤した。細胞遊走がPBSによって誘発されるマウスにおいては、Th細胞の0.34±0.17%がヒト皮膚移植片(3例のマウス、n=3)を浸潤した。
Dunnett's 多重比較検定(post hoc)に従って一元配置分散分析により統計的分析を実施した。ABN912対CGP44290処置動物におけるTh細胞の浸潤の減少は、それぞれ有意差が高い(p<0.01**)。
NVP−ABN912のFabフラグメントを有するMCP−1複合体の3次元構造をX線結晶学により決定した。
NVP−ABN912のFabフラグメントを、抗体全体からタンパク質分解により切断して作成して、プロテインAクロマトグラフィーに続きサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。Fabと組み換えヒトMCP−1との間の複合体をプロテインGおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製して、50mM Tris−HCl pH8.0、0.1M NaCl中、限外濾過により26mg/mlまで濃縮した。結晶を蒸気拡散法により懸滴中、20%(w/v)PEG4,000、10%(v/v)イソプロパノール、0.1M Na、Hepes pH7.5において室温で成長させた。それらは、単位セル寸法がa=63.90Å、b=86.08Å、c=321.64Åである空間群p212121中にあり、非対称的単位当たり3つの複合体である。データ収集の前に1つの結晶を、17%(w/v)PEG4,000、8.5%(v/v)イソプロパノール、15% グリセロール、85mM Na、Hepes pH7.5において約3分間浸漬した。次にこの結晶をナイロン製のCryoLoop中にマウントして、120Kの窒素気流中、そのまま冷凍した。回折データは、European Synchrotron Radiation FacilityのSNBLビームライン(λ=0.90Å)で、MAR345画像プレートシステムを用いて測定した。全部で242,617の所見において、68,948に相当する固有反射(Rsym=0.050)が20.0〜2.33Åの間の解像度(89.3%の完全性)で回収された。その構造を、開始モデルとして3D6モノクローナル抗体(RCSB entry 1DFB;He et al.,1992)およびヒトMCP−1(RCSB entry 1DOL;Lubkowski et al.,1997)のFabフラグメントのX線構造を用いて、分子置換により決定した。その構造は、CNXプログラムを用いてねじれ角のダイナミクスおよびエネルギー最小化により純化すると、20〜2.33Åのすべての反射に対して最終的なR因子が0.224(Rfree=0.261)となった。最終モデルとしては、ABN912のL1〜L214とH1〜H222、およびヒトMCP−1の10〜71残基が挙げられる。それは、結合長さに対しては0.006Åであり、結合角に対しては1.36°のrms偏差である良好なジオメトリーを有する。
NVP−ABN912による認識に対してMCP−1上の機能的に重要な残基を決定するために、アラニンスキャニング変異誘発試験を実施した(Cunnigham, B. C. and Wells, J. A. (1989) Science 244, 1081-1085)。第1に、MCP−1の3次元構造(Handel, T.M. and Domaille, P.J. (1996) Biochemistry 35, 6569-6584; Lubkowski, J., Bujacz, G., Boque, L., Domaille, P. J., Handel, T. M. and Wlodawer, A. (1997) Nature Struct. Biol. 4, 64-69)を表面に露出された残基を同定するためにWebLab Viewerソフトウェアを用いて視察した。ABN912と強力に相互作用可能な39残基全部を、QuikChange Site-Directed Mutagenesis キット(Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J. and Wright, D. A. (1996) Strategies 9(3), 3-4)を用いて個々にアラニンまたはリジン(D3K、A48K)へ変異させた。Geneporterトランスフェクション試薬(Gene Therapy System)を用いてMCP−1変異配列を保有する発現プラスミド2μgと一緒に細胞に最初にトランスフェクションすることにより、その結果生成する変異遺伝子をHEK.EBNA細胞中で発現させた。トランスフェクション後、細胞を3日間37℃でインキュベートして、次にその上清を回収し、5分間遠心分離してアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。変異型MCP−1の濃度を、精製MCP−1を標準物質として用いるプロテインアッセイ(Biorad)により決定した。典型的には、3mlの培地から40μgの精製ヒトMCP−1またはMCP−1変異体が得られた。
Claims (12)
- MCP−1結合分子であって、超可変領域CDR1、CDR2、およびCDR3を有する免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン(VH)の少なくとも1つを有する抗原結合部位を含むもの;ただし、CDR1はアミノ酸配列His−Tyr−Trp−Met−Serを有し、CDR2はアミノ酸配列Asn−Ile−Glu−Gln−Asp−Gly−Ser−Glu−Lys−Tyr−Tyr−Val−Asp−Ser−Val−Lys−Glyを有し、CDR3はアミノ酸配列Asp−Leu−Glu−Gly−Leu−His−Gly−Asp−Gly−Tyr−Phe−Asp−Leuを有する;または
MCP−1結合分子(分子X)であって、
(i)超可変領域CDR1、CDR2およびCDR3が全体として配列番号1に示される超可変領域と少なくとも80%相同であり、そして
(ii)分子Xと同じフレームワーク領域および定常領域を有するが、配列番号1に示されるものと同じ超可変領域CDR1、CDR2、およびCDR3を有する基準分子と、本質的に同程度にMCP−1のレセプターに対する結合を阻害することができるもの。 - 以下の重鎖可変ドメイン(VH)と軽鎖(VL)可変ドメインの双方を有する抗原結合部位の少なくとも1つを含むMCP−1結合分子:
a)超可変領域CDR1、CDR2、およびCDR3を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(VH);ただし、CDR1はアミノ酸配列His−Tyr−Trp−Met−Serを有し、CDR2はアミノ酸配列Asn−Ile−Glu−Gln−Asp−Gly−Ser−Glu−Lys−Tyr−Tyr−Val−Asp−Ser−Val−Glyを有し、CDR3はアミノ酸配列Asp−Leu−Glu−Gly−Leu−His−Gly−Asp−Gly−Tyr−Phe−Asp−Leuを有する;
および
b)超可変領域CDR1’、CDR2’およびCDR3’を有する免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン(VL);ただし、CDR1’はアミノ酸配列Arg−Ala−Ser−Gln−Gly−Val−Ser−Ser−Ala−Leu−Alaを有し、CDR2’はアミノ酸配列Asp−Ala−Ser−Ser−Leu−Glu−Serを有し、CDR3’はアミノ酸配列Gln−Gln−Phe−Asn−Ser−Tyr−Proを有する;
または、
MCP−1結合分子(分子X’)であって、
(i)超可変領域CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’およびCDR’3が全体として配列番号1および2に示される超可変領域と少なくとも80%相同であり、そして
(ii)分子X’と同じフレームワーク領域および定常部分を有するが、配列番号1および2に示されるものと同じ超可変領域CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’およびCDR3’を有する基準分子と、本質的に同程度にMCP−1のレセプターに対する結合を阻害することができるもの。 - ヒト抗体である、請求項1または2に記載のMCP−1結合分子。
- 以下の第1部分と第2部分を有する、重鎖またはそのフラグメントをエンコードするDNA構築物であって、
a)フレームワーク領域と超可変領域を交互に含む可変ドメインをコードする第1部分;ただし、当該超可変領域が配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3であり、当該第1部分が可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで始まり、可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終るものである;
および
b)重鎖定常部分またはそのフラグメントをコードする第2部分;ただし、当該重鎖定常部分の最初のアミノ酸をコードするコドンで始まり、定常部分またはそのフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンで終り、その後に停止コドンが続くものである。 - 以下の第1部分と第2部分を有する、重鎖またはそのフラグメントおよび軽鎖またはそのフラグメントをコードするDNA構築物:
a)フレームワーク領域と超可変領域を交互に含む可変ドメインをコードする第1部分;ただし、当該超可変領域が配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3であり;当該第1部分が可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで始まり、可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終るものである;
および
b)フレームワークおよび超可変領域を交互に含む可変ドメインをコードする第2部分;ただし、当該超可変領域が配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するCDR1’、CDR2’およびCDR3’であり;当該第2部分が可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで始まり、可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終るものである。 - 原核細胞または真核細胞において複製可能であって、請求項4または請求項5に記載のDNA構築物を少なくとも1つ含む、発現ベクター。
- (i)請求項6に記載の発現ベクターにより形質転換した有機体を培養し、そして(ii)その培地からMCP−1結合分子を回収することを含む、MCP−1結合分子物質の産生法。
- エオタキシン−1と交差反応する、MCP−1に対するヒト抗体。
- MCP−1に対する結合についてのKD値が43±2.9pMである、MCP−1に対するヒト抗体。
- MCP−1の24位にアルギニン残基を有するMCP−1の抗原性エピトープに結合する、MCP−1に対するヒト抗体。
- 請求項3に記載のMCP−1に対する抗体を有効成分とする、MCP−1またはエオタキシン介在性疾患または障害を処置するための医薬。
- 請求項3に記載のMCP−1に対する抗体を有効成分とし、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせてなる、MCP−1またはエオタキシン介在性疾患または障害を処置するための医薬組成物。
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