JP2011517548A - 抗ｍｃｐ−１抗体、組成物、方法及び使用 - Google Patents

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Abstract

エピトープ特異的な抗ＭＣＰ−１抗体、組成物、方法及び使用
本発明は、特異的エピトープを有する少なくとも１つの新しい抗ＭＣＰ−１抗体に関するものであり、これには、抗ＭＣＰ−１抗体、ＭＣＰ−１、ベクター、宿主細胞、トランスジェニック動物又は植物のうち少なくとも１つをコードする単離核酸、並びにそれらの製造及び使用の方法（治療用組成物、方法及びデバイスが挙げられる）が含まれる。

Description

本発明は、少なくとも１つのヒト単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）タンパク質又はその断片について特異的なエピトープに固有の、特定の部分又は変異体を含む抗体、並びに抗イディオタイプ抗体、更にこの抗ＭＣＰ−１抗体をコードする核酸、相補的核酸、ベクター、宿主細胞、及びこれらの製造・使用方法（治療用処方、投与及び装置を含む）に関するものである。
ヒト単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）（ＣＣＬ−２とも呼ばれる）は、７６個のアミノ酸残基（配列番号１）を有する８．６ｋＤａのタンパク質であり、サイトカインのケモカイン−ベータ（又はＣ−Ｃ）ファミリーの一員である。ケモカインは、血管周囲の通過、及び組織損傷箇所での白血球の特定のサブセットの蓄積において中心的役割を果たすことが明らかになっている、低分子量（８〜１０ｋＤａ）、誘導性、分泌型、炎症促進性の走化性サイトカインである。４つの保存されたシステインの配置に応じて、２つの主なファミリーが定義されている。ＣＸＣ又はα−ケモカインは主に好中球を誘引し、ＣＣ又はβ−ケモカインは主に単球及びその他の白血球を誘引するが、好中球は誘引しない（Leonard and Yoshimura et al., 1990）。単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）ファミリーのメンバーは、ケモカインのＣ−Ｃファミリーの主要な構成要素を形成し、単球、マクロファージ及び活性化リンパ球の補充に関与する主要なケモカインと見なされている。異なる種からのＭＣＰ−１の相同性を見てみると、ヒトとサルのＭＣＰ−１は、２つのアミノ酸においてのみ異なり、９７％の配列同一性が明らかにされているが、１２５個のアミノ酸残基を含有する１３．８ｋＤａのタンパク質であるマウスＭＣＰ−１は、分子サイズ及びグリコシル化の程度がヒトＭＣＰ−１と異なっている。
ケモカイン受容体は、Ｇタンパク質を結合する７回膜貫通（７ＴＭ）ドメイン受容体（ＧＰＣＲ、セルペンチン受容体とも呼ばれる）の大きなファミリーに属している。１９９６年の走化性サイトカインに関するＧｏｒｄｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで制定された受容体命名法に基づいて、ＣＸＣケモカインを結合するケモカイン受容体は、ＣＸＣＲと呼ばれ、ＣＣケモカインを結合する受容体はＣＣＲと呼ばれる。
ＭＣＰ−１は、ケモカイン受容体ＣＣＲ２を介して結合しシグナル伝達することが知られている。ＣＣＲ２は、単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び好塩基球を含む数多くの細胞に発現する、７回膜貫通領域Ｇタンパク質共役受容体である。ＭＣＰ−１のナノモル（ｎＭ）濃度に応答してシグナル伝達する２つのＭＣＰ−１特異的受容体、ＣＣＲ２Ａ及びＣＣＲ２Ｂが、これまでにクローニングされている。ＣＣＲ２Ａ（ＣＣ−ＣＫＲ２Ａ）及びＣＣＲ２Ｂ（ＣＣ−ＣＫＲ２Ａ）は、選択的スプライスされたカルボキシル末端をもつ２つのＭＣＰ−１特異的受容体をコードする２つのｃＤＮＡを表わす。ＭＣＰ−１は、高親和性で両方のイソ型に結合する。ＭＣＰ−１はＣＣＲ２Ｂを発現する細胞中でカルシウム流を誘導するが、ＣＣＲ２Ａを発現する細胞内ではこれを誘導しない。ＣＣＲ２Ａを発現する細胞と比べて、ＣＣＲ２Ｂを発現する細胞内では、５分の１のＭＣＰ−１で走化性が誘導される。
ヒトＭＣＰ−１に対するある種の機能的相同性及び配列相同性を有するその他のタンパク質が知られている。特にＭＣＰ−１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００２９７３）に類似しているのは、ＭＣＰ−２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００５６１４）及びエオタキシン（ＧｅｎＢａｎｋ Ｐ＿５１６７１）である。ＭＣＰ−１に対して、ＭＣＰ−２は６１．８パーセントの配列同一性を有し、エオタキシン−１は６３．２パーセントの配列同一性を有する。ヒトのホメオスタシスの機構及び病理におけるこれらのタンパク質が関与する活動の範囲及びスペクトルは、ＭＣＰ−１相同体についてはあまりよく理解されていない。例えばＭＣＰ−２（ＣＣＬ８と改名）はＭＣＰ−１及びＭＣＰ−３（ＣＣＬ７と改名、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００６２６４）に密接に関係づけられており、その機能的受容体としてＣＣＲ１並びにＣＣＲ２Ｂの両方を使用する。ＭＣＰ−３は、Ｄ６と呼ばれる受容体に結合する。ＭＣＰ−３はＣＣＲ１０及びＣＣＲ１にも結合する。ＭＣＰ−３タンパク質（アミノ酸９７個）配列はＭＣＰ−１と７４パーセントの同一性を示し、ＭＣＰ−２と５８パーセントの相同性を示す。分泌されたＭＣＰ−３はＮ−グリコシル化されているという点でＭＣＰ−１と異なっている。ＭＣＰ−４（ＣＣＬ１３と改名、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００５３９９）は、３つの既知の単球走化性タンパク質と５６〜６１パーセントの配列同一性を共有し、エオタキシン−１と６０パーセント同一である。ＭＣＰ−４の機能は、ＭＣＰ−３及びエオタキシンのものときわめて類似しているように見られる。ＭＣＰ−３と同様、ＭＣＰ−４は単球及びＴリンパ球に対する強い走化性物質である。これは、好中球に対しては不活性である。単球に対しては、ＭＣＰ−４は、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）及びエオタキシン（ＣＣＲ１及びＣＣＲ３受容体）を認識する受容体に結合し、エオタキシン−１との完全な交差脱感作を示す。ＭＣＰ−５はマウスＣＣ−ケモカインであり、ヒトＭＣＰ−１に最も密接に関係している（６６％のアミノ酸同一性）。ＭＣＰ−５の遺伝子記号はＳＣＹＡ１２（ＣＣＬ１２に改名）である。ケモカイン受容体ＣＣＲ２でトランスフェクションされた細胞は、ＭＣＰ−５に応答することが示されている。サイトカイン及びケモカインに関する一般的な情報については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｐｅｗｉｔｈｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．ｄｅ／ｃｏｐｅ．ｃｇｉを、及び現行の分類システムについてはＺｌｏｔｎｉｋ Ａ．，Ｙｏｓｈｉｅ Ｏ．２０００．Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ：ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅ ｉｎ ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：１２１〜１２７を参照のこと。
１２５Ｉ−ＭＣＰ−１は単球に結合し、スキャッチャードプロット分析では、単球が約２ｎＭのＫｄで細胞１個あたり最低約１７００個の結合部位を有することが示されている（Yoshimura and Leonard, 1990）。その後の、ヒト単球での平衡結合実験では、０．７７ｎＭのＫｄで細胞１個あたり約３０００個の結合部位の存在が明らかにされている（Ernst et al., 1994）。１２５Ｉ−ＭＣＰ−１では、０．４ｎＭのＫｄ値でＣＣＲ２受容体を発現しているｄＥｏＬ−３細胞に対する高親和性結合も示されており（Sarau et al., 1997）、その受容体に対するＭＣＰ−１のサブナノモル親和性が確認されている。その受容体ＣＣＲ２と接触するＭＣＰ−１の領域を同定するために、全ての表面露出残基がアラニンに置換された。一部の残基はまた、特定の位置での電荷、疎水性又は芳香族性の重要性を同定するために、他のアミノ酸へと変異導入された。３５Ａの疎水性溝で分離された、主として塩基性の残基（Ｒ２４、Ｋ３５、Ｋ３８、Ｋ４９、及びＹ１３）の２つのクラスターによって、結合レベルが１５〜１００分の１に低減された。ＭＣＰ−１の大きな表面積が受容体と接触する、という１つのモデルが、データにより示唆されており、数多くの弱い相互作用の蓄積の結果として、野生型（ＷＴ）タンパク質に対して３５ｐＭの親和性が観察された（Hemmerich et al., 1999）。文献中、２ｎＭ〜３５ｐＭの親和性範囲は、使用されたアッセイ及びそれぞれのアッセイの限界によるものである可能性がある。
ヒトＭＣＰ−１に対するある種の機能的相同性及び配列相同性を有する、他のタンパク質が知られている。特にＭＣＰ−１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００２９７３）に類似しているのは、ＭＣＰ−２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００５６１４）及びエオタキシン（ＧｅｎＢａｎｋ Ｐ＿５１６７１）である。ＭＣＰ−１に対して、ＭＣＰ−２は６１．８パーセントの配列同一性を有し、エオタキシン−１は６３．２パーセントの配列同一性を有する。ヒトのホメオスタシスの機構及び病理におけるこれらのタンパク質が関与する活動の範囲、及びスペクトルは、ＭＣＰ−１相同体についてはあまりよく理解されていない。例えばＭＣＰ−２はＭＣＰ−１及びＭＣＰ−３（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＰ＿００６２６４）に密接に関係づけられており、その機能的受容体としてＣＣＲ１並びにＣＣＲ２Ｂの両方を使用する。ＭＣＰ−３は、Ｄ６と呼ばれる受容体に結合する。ＭＣＰ−３はＣＣＲ１０にも結合する。ＭＣＰ−３タンパク質（アミノ酸９７個）配列はＭＣＰ−１と７４パーセントの同一性を示し、ＭＣＰ−２と５８パーセントの相同性を示す。分泌されたＭＣＰ−３はＮ−グリコシル化されているという点でＭＣＰ−１と異なっている。ＭＣＰ−４（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００５３９９）は、３つの既知の単球走化性タンパク質と５６〜６１パーセントの配列同一性を共有し、エオタキシン−１と６０パーセント同一である。ＭＣＰ−４の機能は、ＭＣＰ−３及びエオタキシンのものときわめて類似しているように見られる。ＭＣＰ−３と同様、ＭＣＰ−４は単球及びＴリンパ球に対する強い走化性物質である。これは、好中球に対しては不活性である。単球に対しては、ＭＣＰ−４は、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、及びＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＲ２）を認識する受容体に結合する。好酸球に対しては、ＭＣＰ−４は、ＭＣＰ−３、ＲＡＮＴＥＳ及びエオタキシンと類似の有効性及び効力を有する。ＭＣＰ−４は、エオタキシン（ＣＣＲ１及びＣＣＲ３）と受容体を共有し、エオタキシン−１との完全な交差脱感作を示す。
ＭＣＰ−１を結合する能力を有するその他の抗体が報告されている。ＪＰ９０６７３９９は、分離した血球から得た抗体を開示しており、ＪＰ０５２７６９８６は、ＩｇＭ抗ヒトＭＣＰ−１を分泌するハイブリドーマを開示している。更に最近では、ＭＣＰ−１を含む複数のベータケモカインを結合する能力を有する抗体（ＷＯ０３０４８０８３）、及び、エオタキシンも結合させるＭＣＰ−１結合抗体（ＵＳ２００４００４７８６０）が開示されている。
したがって、ＭＣＰ−１依存性疾患の症候を軽減又は除去するための治療に使用するためのヒトＭＣＰ−１に特異的なヒト抗体、並びに既知の抗体又はその断片に対する改良を供給する必要が存在する。
本発明は、当該技術分野において既知のものと組合せた形で、本明細書に記載され、可能にされた通りに、単離ヒト、霊長類、ゲッ歯類、哺乳動物、キメラ、ヒト化及び／又はＣＤＲ移植型エピトープ特異的抗ＭＣＰ−１抗体及びその他の免疫グロブリン由来のタンパク質、断片、分割産物及びそれらの、その他の特定された部分及び変異体、並びにエピトープ特異的抗ＭＣＰ−１抗体組成物、コードしている核酸又は相補的核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、処方物、デバイス、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物及びその製造及び使用方法を提供している。本明細書に記載されているような本発明の抗体の組成物に加えて、本発明の抗体は、ヒトＭＣＰ−１に対するその親和性、ヒトＭＣＰ−１に対する特異性、及びヒトＭＣＰ−１の生物活性をブロックする能力により定義される。
本発明は、本明細書に記載されているような少なくとも１つの抗体、抗体融合タンパク質、又は断片などの（ただしこれらに限定されない）少なくとも１つの単離抗ＭＣＰ−１抗体もまた、提供している。本発明に従った抗体には、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含むあらゆるタンパク質又はペプチド含有分子が含まれ、この免疫グロブリンには例えば、少なくとも１つのリガンド結合ドメインが含まれ（ただしこれらに限定されない）、このリガンド結合ドメインには例えば、表４Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥ（配列番号６〜２６）に提供されているような重鎖又は軽鎖可変領域、重鎖又は軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）又はそのリガンド結合部が含まれ（ただしこれらに限定されない）、並びに所望により、表４Ｃ（配列番号２〜５）に記載されている通りのフレームワーク領域（例えばＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）又はその断片と場合によって機能的に会合し、更に所望により、ヒト免疫グロブリンの少なくともＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２又はＣＨ３が含まれ得る。少なくとも１つの抗体アミノ酸配列は更に、所望により、本明細書に記載されているか又は当該技術分野において既知のような、少なくとも１つの特定の置換、挿入又は欠失を含み得る。
１つの実施形態において、抗体のリガンド結合部は、配列番号２７及び２８を含む。１つの態様において、本発明は、配列番号２７又は２８を含む少なくとも１つの可変領域を含む、少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体を提供する。
別の態様において、本発明は（ｉ）配列番号６、７及び９の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の全て；又は（ｉｉ）配列番号１３、１４及び１６の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全て、のいずれかを含む少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体を提供している。
本発明は、１つの態様において、少なくとも１つの特定の配列、ドメイン、部分又はその変異体を含む特定の抗ＭＣＰ−１抗体をコードするポリヌクレオチドを含むか、これに対し相補的か、又はこれに対しハイブリッド形成する単離核酸を提供している。本発明は更に、前記抗ＭＣＰ−１抗体核酸分子を含む組換えベクター、このような核酸及び／又は組換えベクターを含有する宿主細胞、並びにこのような抗体核酸、ベクター及び／又は宿主細胞の製造及び／又は使用方法をも提供している。
本発明の少なくとも１つの抗体は、配列番号１中に提供されているもののような、少なくとも１つのＭＣＰ−１タンパク質又は変異体又は誘導体に対して特異的な、少なくとも１つの特定のエピトープを結合する。この少なくとも１つのエピトープは、前記タンパク質の少なくとも一部分を含む少なくとも１つの抗体結合領域を含むことができ、このエピトープは好ましくは、前記タンパク質の少なくとも１つの機能的、細胞外、可溶性、親水性、外部又は細胞質ドメイン又はその任意の部分といった（ただしこれらに限定されない）その少なくとも一部分の少なくとも１〜５個のアミノ酸で構成されている。特に、本発明では、配列番号１のアミノ酸４〜７及び４６〜４７のうち少なくとも２つのアミノ酸を含む残基に対し、特異的に結合又は競合的に結合する抗体又は抗体断片を含むことができ、これには、配列番号１のアミノ酸４〜７又は４６〜４７のうち少なくとも２つのアミノ酸、配列番号１のアミノ酸４、５、６、７、４〜７、４〜５、４〜６、５〜６、５〜７、６〜７、又は４６、４７、４６〜４７のうち少なくとも１つのアミノ酸、又はこれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
少なくとも１つの抗体は、少なくとも１つの定常領域又は可変フレームワーク領域又はその任意の部分を所望により更に含む、配列番号６、７、９、１３、１４及び１６として提供されている少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、それぞれ配列番号２７及び２８として提供されている重鎖又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３）の少なくとも１つの特定の部分を所望により含むことができ、ここでこの抗体は、細胞表面上の受容体に対するＭＣＰ−１結合、ＣＣＲ２受容体内在化、ＭＣＰ−１刺激型Ｃａ２＋可動化又はその他のあらゆる適切な既知のＭＣＰ−１アッセイといったような（ただしこれらに限定されない）少なくとも１つの活性をブロック、阻害又は防止する。よって、抗ＭＣＰ−１抗体は、ＭＣＰ−１タンパク質に対する少なくとも１つの生物活性などの（ただしこれらに限定されない）対応する活性について、既知の方法に従ってスクリーニングされ得る。
本発明は更に、本発明の少なくとも１つのＭＣＰ−１抗体に対する少なくとも１つのＭＣＰ−１抗イディオタイプ抗体を提供する。該抗イディオタイプ抗体は、本発明の抗イディオタイプ抗体の中に取込むことのできる、重鎖又は軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）又はそのリガンド結合部、重鎖又は軽鎖可変領域、重鎖又は軽鎖定常領域、フレームワーク領域、又はその任意の部分などの（ただしこれらに限定されない）少なくとも１つのリガンド結合部（ＬＢＰ）などの（ただしこれらに限定されない）免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む、あらゆるタンパク質又はペプチド含有分子を内含する。本発明の抗イディオタイプ抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、ゲッ歯類、霊長類などといった（ただしこれらに限定されない）あらゆる哺乳動物を含むか、又はこれらから誘導され得る。
本発明は、一態様において、少なくとも１つの特定の配列、ドメイン、部分又はその変異体を含む、少なくとも１つのＭＣＰ−１抗イディオタイプ抗体をコードするポリヌクレオチドを含むか、これに対し相補的か、又はこれに対しハイブリッド形成する単離核酸分子を提供している。本発明は更に、核酸分子をコードする前記ＭＣＰ−１抗イディオタイプ抗体を含む組換えベクター、このような核酸及び／又は組換えベクターを含有する宿主細胞、並びに、このような抗イディオタイプ抗体核酸、ベクター及び／又は宿主細胞の製造及び／又は使用方法を提供している。
本発明は更に、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体が検出可能かつ／又は回収可能な量で発現される条件下で、本明細書に記載されたような宿主細胞を培養する工程を含む、宿主細胞中で少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体又はＭＣＰ−１抗イディオタイプ抗体を発現させるための少なくとも１つの方法をも提供している。
本発明は更に、（ａ）本明細書に記載されているような核酸及び／又は抗体をコードする単離抗ＭＣＰ−１抗体；及び（ｂ）適切な担体又は希釈剤を含む少なくとも１つの組成物をも提供する。担体又は希釈剤は所望により製薬上許容できるものであり、既知の担体又は希釈剤に準じる。組成物は所望により、更に少なくとも１つの更なる化合物、タンパク質又は組成物を含むことができる。
本発明は更に、当該技術分野で既知のような及び／又は本明細書に記載されているような関連する状態の前後又はその間に、かつ／又は細胞、組織、器官、動物又は患者の中の少なくとも１つのＭＣＰ−１関連の状態を調節又は治療するべく治療上有効な量を投与するための、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体方法又は組成物を提供している。
本発明は更に、本発明に従った治療的又は予防的有効量の少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体の少なくとも１つの組成物、送達用デバイス及び／又は方法をも提供している。
本発明は更に、当該技術分野で既知のような及び／又は本明細書に記載されているような関連する状態の前後又はその間に、かつ／又は細胞、組織、器官、動物又は患者の中の少なくとも１つのＭＣＰ−１関連の状態について診断を下すための、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体方法又は組成物を提供している。
本発明は更に、本発明に従った少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を診断するための少なくとも１つの組成物、送達用デバイス及び／又は方法をも提供している。
１つの態様においては、本発明は、配列番号２７又は２８を含む少なくとも１つの可変領域を含む少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体を提供している。
もう１つの態様においては、本発明は（ｉ）配列番号６、７及び８又は９の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の全て；又は（ｉｉ）配列番号１３、１４及び１５又は１６の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全て、のいずれかを含む少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体を提供している。
もう１つの態様においては、本発明は（ｉ）配列番号６、７及び８又は９の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の全て；又は（ｉｉ）配列番号１３、１４及び１５又は１６の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全て、のうちの少なくとも一方を含む少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体を提供している。
少なくとも１つの抗体は所望により更に、少なくとも１０-9Ｍ、少なくとも１０-10Ｍ、少なくとも１０-11Ｍ、又は少なくとも１０-12Ｍから選択される少なくとも１つの親和性でＭＣＰ−１を結合させることと、少なくとも１つのＭＣＰ−１タンパク質の少なくとも１つの活性を実質的に中和することのうちの、少なくとも１つのことを行うことができる。同様に提供されているのは、少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体をコードする単離核酸、単離核酸を含む単離核酸ベクター及び／又は単離核酸を含む原核生物宿主若しくは真核生物宿主細胞である。該宿主細胞は、所望により、ＮＳＯ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、ＨｅｐＧ２、ＹＢ２／０、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、骨髄腫又はリンパ腫細胞、又はそのあらゆる誘導体、それらの不死化あるいは形質転換細胞から選択された、少なくとも１つのものであり得る。同様に提供されているのは、ＭＣＰ−１抗体が検出可能な又は回収可能な量で発現されるようにインビトロ、インビボ又はインサイチュ条件下で核酸をコードする抗体を翻訳する工程を含む、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体の生産方法である。
同様に提供されているのは、少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体及び少なくとも１つの製薬上許容できる担体又は希釈剤を含む組成物である。
同様に提供されているのは、細胞、組織、器官又は動物内のＭＣＰ−１関連の状態を診断又は治療するための方法であって、（ａ）前記細胞、組織、器官又は動物と有効量の本発明の少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体を含む組成物と接触させる工程又はそれらに対しこのような組成物を投与する工程を含む方法である。
同様に提供されているのは、本発明の少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体を含む医療デバイスであり、非経口、皮下、筋内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内又は経皮から選択された少なくとも１つの様式により、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を投与又は接触させる工程に適する。
同様に提供されているのは、本発明の少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体を溶液、微粒子又は凍結乾燥形態で含む包装材料及び容器を含む、ヒトの製薬又は診断用途向けの製造品である。
同様に提供されているのは、抗体を回収可能な量で発現する能力をもつ宿主細胞又はトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物又は植物細胞を提供する工程を含む、本発明の少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体の生産方法である。更に提供されているのは、上述の方法により生産された少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体である。
本発明は更に、本明細書に記載する任意の発明を提供する。
配列リストの簡単な説明
Figure 2011517548
本発明は、少なくとも１つの精製、単離、組換え及び／又は合成の、抗ＭＣＰ−１ヒト抗体、霊長類抗体、ゲッ歯類抗体、哺乳動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、改変抗体、又はＣＤＲ移植抗体、及びそれらに対するＭＣＰ−１抗イディオタイプ抗体、並びに少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体又は抗イディオタイプ抗体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物及びコードする核酸分子を提供している。本発明は更に、かかる核酸並びに抗体及び抗イディオタイプ抗体の製造及び使用方法を含む、診断用及び治療用組成物、方法及びデバイスを含むが、これらに限定されない。
引用：本明細書で引用される全ての発行物又は特許は、本発明の時点の当該技術分野の状態を示すため、参考として本明細書に全体が組み入れられ、及び／又は本発明の説明及び使用可能性を提供する。発行物とは、任意の科学的又は特許公開、又は全ての記録、電子、又は印刷形式を含む任意のメディア形式で入手可能な任意の他の情報を意味する。以下の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2004); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2004); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2004)。
略語
ａａ：アミノ酸；ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン；ＣＤＲ：相補性決定領域；ＥＣＬ：電気化学発光；ＨｕＣＡＬ（登録商標）：ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリ；ＨＳＡ：ヒト血清アルブミン；ＭＣＰ−１：単球走化性タンパク質−１；Ｉｇ：免疫グロブリン；ＩＰＴＧ：イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド；ｍＡｂ：モノクローナル抗体；ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）；ＳＥＴ：溶液平衡滴定；ＶＨ：免疫グロブリン重鎖可変領域；ＶＬ：免疫グロブリン軽鎖可変領域。
定義
本明細書で使用されている「抗抗ＣＣＬ２抗体」、「抗ＭＣＰ−１抗体」、「抗ＭＣＰ−１抗体部分」、又は「抗ＭＣＰ−１抗体断片」及び／又は「抗ＭＣＰ−１抗体変異体」などの用語は、本発明の抗体の中に取り込むことのできる、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含むあらゆるタンパク質又はペプチド含有分子が含まれており、これには例えば、重鎖又は軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）又はそのリガンド結合部、重鎖又は軽鎖可変領域、重鎖又は軽鎖定常領域、フレームワーク領域又はその任意の一部分、又はＭＣＰ−１受容体若しくは結合タンパク質の少なくとも一部分が挙げられ、これらに限定されない。これら抗体は所望により、更に、特定のリガンドに影響を及ぼし、例えばかかる抗体は、インビトロ、インサイチュ及び／又はインビボで、少なくとも１つのＭＣＰ−１活性若しくは結合、又はＭＣＰ−１受容体活性若しくは結合を、調節、低減、増大、拮抗、作動、軽減、緩和、ブロック、阻害、無効化、及び／又は干渉し、これらに限定されない。限定的ではない例として、本発明の好適な抗ＭＣＰ−１抗体、その特定部分、又は変異体は、少なくとも１つのＭＣＰ−１又はその特定部分、変異体、又はドメインを結合することができる。
本明細書で使用されている「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質のセグメント又は特性を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの化学的に活性な分子表面基で構成されており、通常、特定の３次元構造特性並びに特定の電荷特性を有する。立体構造的エピトープと非立体構造的エピトープとは、変性溶媒の存在下で、立体構造エピトープに対する結合が失われるが、非立体構造的エピトープに対する結合は失われないという点で区別される。ＭＣＰ−１の線形配列において別の部分からのアミノ酸が３次元空間内で近接して集まる場合に発生するＭＣＰ−１分子の立体構造的折り畳みの結果としてもたらされるタンパク質エピトープが、含まれる。
「ＭＣＰ−１」は、ＮＣＢＩ記録登録番号ＮＰ＿００２９７３の中で言及され、ＭＣＰ（単球走化性タンパク質）、ＳＭＣ−ＣＦ（平滑筋細胞走化性因子）、ＬＤＣＦ（リンパ球由来走化性因子）、ＧＤＣＦ（神経膠腫由来単球走化性因子）、ＴＤＣＦ（腫瘍由来走化性因子）、ＨＣ１１（ヒトサイトカイン１１）、ＭＣＡＦ（単球走化性及び活性化因子）としてさまざまな形で知られている７６個のアミノ酸配列を意味する。遺伝子記号は、ＳＣＹＡ２（ヒト染色体１７上のＪＥ遺伝子）であり、新名称はＣＣＬ２である（Zlotnik, Yoshie 2000. Immunity 12:121-127）。ＪＥは、ヒトＭＣＰ−１／ＣＣＬ２のマウス相同体である。
本明細書で使用されている「ヒト抗体」という用語は、タンパク質の実質的に全ての部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣL、ＣHドメイン（例えばＣH１、ＣH２、ＣH３）、ヒンジ、（ＶL、ＶH））がヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列の組換え事象から、又は、成熟ヒト抗体配列に由来する抗体を意味する。ヒトから単離された抗体に加えて、このようなヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン生殖細胞株遺伝子との免疫反応を開始する能力をもつトランスジェニックマウスに免疫付与することによって得ることができ（Lonberg et al., Int Rev Immunol 13（1）:65-93（1995）、及びFishwald et al., Nat Biotechnol 14（7）:845-851（1996））、又は、本明細書に記載されているようなヒト抗体レパートリーライブラリから選択することができる。このようなヒト遺伝子配列の供給源は、任意の適切なライブラリ内で見出すことができ、例えばヒト抗体遺伝子データベースであるＶＢＡＳＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ）若しくはその翻訳産物、又はヒト抗体をそのアミノ酸配列類似性に基づいた群に分類しているｈｔｔｐ：／／ｐｅｏｐｌｅ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／〜ｕｂｃｇ０７ｓ／に見出すことができる。この定義の範囲に入るのは、１つ以上のヒト抗体配列からのフレームワーク領域、及び２つの異なるヒト又は非ヒト供給源からのＣＤＲ領域を含む、複合抗体又はヒト複合抗体の機能断片である。「ヒト抗体」の定義には、生殖細胞株及び再構成の両方のヒト抗体配列からのフレームワーク領域、並びに２つの異なる供給源抗体からのＣＤＲ領域を含有する、複合抗体又はヒト複合抗体の機能断片が含まれる。本開示に従ったヒト複合抗体又はその機能断片は、１つ以上のヒト抗体配列からのフレームワーク領域、及びヒト又は非ヒト抗体配列由来のＣＤＲ領域を含み、あるいは、完全に合成であってもよい。このように、ヒト抗体は、キメラ又はヒト化抗体とは区別される。ヒト抗体が、機能的に再構成されたヒト免疫グロブリン（例えば重鎖及び／又は軽鎖）遺伝子を発現する能力をもつ非ヒト動物又は原核若しくは真核細胞により産生され得るということが指摘されている。更に、ヒト抗体が１本鎖抗体である場合、これはネイティブのヒト抗体の中に見出されないリンカーペプチドを含む可能性がある。例えば、Ｆｖは、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域を接続する２〜約８個のグリシン又はその他のアミノ酸残基などのリンカーペプチドを含み得る。このようなリンカーペプチドはヒト由来のものと見なされる。
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態とは、非ヒト免疫グロブリンから誘導された、実質的に置換された配列部分を有するキメラ抗体である。通常、ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲ（超可変領域としても知られている相補性決定領域）残基が、望ましい特異性、親和性及び能力をもつマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）からのＣＤＲ残基で置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基により置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体内に見出されない残基を含むことがある。これらの改変は、抗体性能を更に高めるように行われる。一般にヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、このドメインにおいて、超可変領域の全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、所望により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒトＩｇＧ免疫グロブリンの一部分を含むことになる。更なる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
本明細書で使用されるとき、抗体のＫｄとは、既定の抗原についての抗体の解離定数ＫDを意味し、特異的標的に対する抗体の親和性の尺度である。高親和性抗体は、既定の抗原について、有するＫDが１０-8Ｍ以下、より好ましくは１０-9Ｍ以下、更に好ましくは１０-10Ｍ以下である。本明細書で使用されるとき、用語「Ｋdis」又は「ＫD」若しくは「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を意味するよう意図されている。「ＫD」は解離速度（ｋ2）（「オフ速度（ｋoff）とも呼ばれる）と結合速度（ｋ１）（又は「オン速度（ｋon）」）との比である。よってＫDはｋ2／ｋ1又はｋoff／ｋonに等しく、モル濃度（Ｍ）として表現される。ここで、ＫDが小さくなるほど、結合は強くなる。よって、ＫDが１０-6Ｍ（又は１マイクロＭ）とは、１０-9Ｍ（又は１ｎＭ）に比べ、弱い結合を表わす。
本明細書で使用されるとき、用語「〜に対する特異性」及び「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、他の抗原又はタンパク質に対するよりも大きな親和性をもって、既定の抗原に抗体結合することを意味する。典型的に、抗体は、解離定数（ＫD）が１０-7Ｍ以下で結合し、既定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、又はその他任意の特定ポリペプチド）に結合するためのＫDに比べ、少なくとも２分の１のＫDで、既定の抗原に結合する。「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語句は、ここでは「抗原に対し特異的に結合する抗体」又は「抗原特異的抗体」、例えばＭＣＰ−１特異的抗体、という用語と互換的に用いられる。
１．本発明の抗体の調製
単離及び／又はＭＣＰ−１タンパク質若しくはその一部分（合成ペプチドなどの合成分子を含む）のヒトＭＣＰ−１タンパク質又はその断片に対して特異的なヒト抗体の調製は、当該技術分野において既知のあらゆる適切な技術を用いて実施可能である。ヒト抗体は、当該技術分野において既知のさまざまな技術を用いて生産可能である。１つの実施形態において、ヒト抗体は、１つのファージライブラリから選択され、ここでそのファージライブラリはヒト抗体を発現するものである（Vaughan et lo al. Nature Biotechnology 14:309-314（1996）：Sheets et al. PITAS（USA）95:6157-6162（1998））；Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381（1991）；Marks et al.' J. Mol. Biol., 222:581（1991））。
ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的に又は完全に不活性化されているトランスジェニック動物（例えばマウス）の中に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって作成することもできる。例えば、機能的に再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖導入遺伝子、及び機能的再構成を受けることのできるヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座からのＤＮＡを含む導入遺伝子を含む、トランスジェニックマウスは、ヒトＭＣＰ−１又はその断片で免疫され、抗体の産生を引き起こすことができる。所望により、本明細書に記載されているように、及び／又は当該技術分野において既知のように、抗体産生細胞を単離し、ハイブリドーマ又はその他の不死化抗体産生細胞を調製することができる。別の方法として、抗体、特定の部分、又は変異体を、適切な宿主細胞内で、コードする核酸又はその一部分を用いて発現させることができる。
適当な抗原の攻撃に応じて、遺伝子再構成、組立て及び抗体レパートリーを含む全ての面で、ヒトについて見られるものに非常に似ているヒト抗体の産生が観察される。このアプローチは、例えばU.S. Patent Nos. 5,545,807; 5,545, 806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016及び以下の：Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg and Huezar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)といった科学刊行物に記載されている。別の方法としては、ヒト抗体は、標的抗原に対応する抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化によって調製可能である（かかるＢリンパ球は、個体から回収しても、又はインビトロで免疫してもよい）。例えばCole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991)；及びUS Pat No. 5,750,373を参照されたい。抗体産生細胞は、対象とする抗原で免疫されたヒト又はその他の適切な動物の末梢血、又は好ましくは脾臓若しくはリンパ節から得ることもできる。その他の任意の適切な宿主細胞を使用して、本発明の抗体、特定の断片、又はその変異体をコードする非相同性の又は内因性の核酸を発現させることも可能である。選択的培養条件又はその他の適切な既知の方法を用いて、融合細胞（ハイブリドーマ）又は組換え細胞を単離し、限界希釈法若しくは細胞選別、又はその他の既知の方法によりクローニングすることができる。望ましい特異性をもつ抗体を産生する細胞を、適切なアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）により選択することができる。
１つのアプローチにおいて、適切な不死細胞株（例えばＳｐ２／０、Ｓｐ２／０−ＡＧ１４、ＮＳＯ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＡＥ−１、Ｌ．５、＞２４３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２ ＳＡ３、Ｓｐ２ ＭＡＩ、Ｓｐ２ ＳＳ１、Ｓｐ２ ＳＡ５、Ｕ９３７、ＭＬＡ １４４、ＡＣＴ ＩＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ−１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ−５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＨＬ−６０、ＭＬＡ １４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、又はＮＥＵＲＯ ２Ａなどの骨髄腫細胞株があるが、これらに限定されない）若しくはヘテロ骨髄腫、その融合産物、又は任意の細胞若しくはそれらから誘導された融合細胞、又は当該技術分野において既知の任意のその他の適切な細胞株を融合させることによって、ハイブリドーマが作成される。例えばｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ、又はｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍなどにおいて、単離若しくはクローニングされた脾臓、末梢血、リンパ液、扁桃腺、又はその他の免疫細胞若しくはＢ細胞含有細胞、又はその他の細胞で、重鎖若しくは軽鎖の、定常若しくは可変若しくはフレームワーク若しくはＣＤＲ配列を発現する（内因性若しくは非相同核酸のいずれとしてであれ）、又は、組換え若しくは内因性のいずれとしてであれ、ウイルス、細菌、藻類、原核生物、両生類、昆虫、爬虫類、魚類、哺乳類、齧歯類、ウマ、ヒツジ類、ヤギ、ヒツジ、霊長類、真核生物、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ若しくはＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、１本鎖、２本鎖若しくは３本鎖、ハイブリッド形成されたもの、及び同様のもの、あるいはこれらの組合せであり、これらに限定されない、抗体産生細胞について、参照されたい。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれている上記Ａｕｓｕｂｅｌ及び上記Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｃｈａｐｔｅｒ ２を参照されたい。
ヒトＭＣＰ−１に結合し、定義された重鎖又は軽鎖可変領域を含むヒト抗体は、ファージディスプレイなどの適切な方法を用いて調製可能である（Katsube, Y., et al., Int J Mol. Med, 1（5）:863-868（1998））。必要な特異性を有する抗体を産生する又は分離する、他の適切な方法としては、ペプチド又はタンパク質ライブラリ（例えばバクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、又はｃＤＮＡなど、ディスプレイライブラリ；例えば、Cambridge antibody Technologies, Cambridgeshire, UK; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Scotland,UK;BioInvent,Lund,Sweden;Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, CA; Ixsys。また例えばEP 368,684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; US 08/350260(5/12/94); PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC); WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; PCT/US94/1234; WO92/18619; WO96/07754; (Scripps); WO96/13583, WO97/08320 (MorphoSys); WO95/16027 (BioInvent); WO88/06630; WO90/3809 (Dyax); US 4,704,692 (Enzon); PCT/US91/02989 (Affymax); WO89/06283; EP 371 998; EP 550 400; (Xoma); EP 229 046; PCT/US91/07149 (Ixsys)；又は確率論的に産生されたペプチド又はタンパク質−US 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824514, 5976862, WO 86/05803, EP 590 689（Ixsys、現在はApplied Molecular Evolution（AME）（それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない）から、組換え抗体を選択する方法か、あるいは、トランスジェニック動物の免疫付与（例えばＳＣＩＤマウス、Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41:901-907（1997）; Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118（1996）; Eren et al., Immunol. 93:154-161（1998）を参照（それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる））に依存している方法を含み、これらに限定されない方法がある。
具体的な実施形態
出願人は、ファージディスプレイヒトＦａｂライブラリから出発して、ヒトＭＣＰ−１に対する望ましい親和性、特異性、及び生物活性を有するヒト抗体を選択し作製する方法を例示した。要約すると、１０回のパニング全てから１７８５６のクローンがスクリーニングされ、１１０４のプライマリーヒット、及び最終的に２６のユニークなＦａｂを導いた。
自然発生のＭＣＰ−１受容体に結合する抗原保持能力を例証する、ユニークなリガンドを提供するために、ヒトＭＣＰ−１及びその類似体、又は「変異タンパク質」を化学的に合成し、選択、親和性及び生物アッセイにおける特異性用途のために改変した。最初の固相パニング、並びに抗体選択及び親和性成熟度アッセイの他の態様において、ヒトＭＣＰ−１Ｉｌｅ41及びヒトＭＣＰ−１Ｔｙｒ43が使用され、本明細書では、ＭＣＰ−１変異タンパク質のビオチン化したもの、すなわちＩｌｅ４１、Ｌｙｓ（ビオチン−ＰＥＧ4）69）及び（Ｉｌｅ４１、Ｌｙｓ（ビオチン−ＰＥＧ4）75（配列番号１）として記述されている。
２６個のユニークＦａｂのいずれも、ＫD＜０．５ｎＭの親和性測定値を有さず、又は特定化された生物アッセイにおいて、望ましいＩＣ50値を有していなかったことから、成熟が不可欠であった。親和性成熟の候補をＦａｂとして選択し、それぞれのＩｇＧを成熟プロセスと並行して分析した。選択基準は、１）全細胞受容体結合アッセイにおける活性、２）カルシウム可動化アッセイにおける活性、３）ヒトＭＣＰ−１に対する親和性、４）ヒトＭＣＰ−１に対する特異性、及び５）カニクイザルＭＣＰ−１に対する親和性及びネイティブＭＣＰ−１に対する結合、であった。
溶液中のＭＣＰ−１でのＦａｂ捕捉モードにおけるビアコア親和性測定は、成熟候補の等級づけに有効に機能し、親和性は４９〜４０６ｎＭの範囲内にあった。最高の親Ｆａｂは、５０ｎＭの親和性を示し、これは、親和性成功基準に達するためには親和性を少なくとも１００倍最適化しなければならないことを示した。更に、カニクイザル及びネイティブのヒトＭＣＰ−１に対する結合は、Ｆａｂ捕捉モードで検出でき、これは、成熟のための付加的な前提条件であった。カニクイザルＭＣＰ−１に対する親和性は、ヒトＭＣＰ−１の場合と同じ範囲内にあった。例えばグリコシル化などのような可能性のある修飾のために、抗体が合成又は組換えＭＣＰ−１を認識したばかりでなく、内因的に発現され、ヒトＰＡＮＣ−１細胞上清から精製されたネイティブＭＣＰ−１をも認識することを示さなくてはならなかった。
ＭＣＰ−１に対する特異性は、各ケモカインを１００ｎＭずつ添加し、結合シグナルを検出して、ビアコアにおいて抗体捕捉モードで測定した。成熟のための候補Ｆａｂの大部分が特異的である一方で、一対が相同体ケモカインに対してある程度の交差反応性を示した。
Ｆａｂの非常に重要な特徴は中和活性であり、この活性を分析するために、複数の異なるアッセイがセットアップされた。125Ｉ ＭＣＰ−１ ＴＨＰ−１細胞結合アッセイは最も感度の高いアッセイであり、これは特に、最適化の後に重要であった。親Ｆａｂは、１０〜６５０ｎＭのＩＣ50値を示した。放射性リガンド結合アッセイに加え、ＭＣＰ−１の下流側シグナル伝達経路の異なるレベルでの中和活性を証明するために、他の２次的な生物アッセイが計画された。
単球の誘引は、ＭＣＰ−１の主要機能の１つであるが、活性の欠如、同時精製された因子又は内毒素のために、高い確率で親Ｆａｂが走化性アッセイ内で作用せず、したがって、このアッセイで作用するＦａｂの獲得を試みる代わりに、それぞれのＩｇＧ１のみをテストすることが合意された。もう１つの下流側シグナル伝達事象は、細胞質へのカルシウム放出である。実際に、放射性リガンド結合アッセイにおいて中和活性を示した全てのＦａｂは、０．１〜３μＭの範囲のＩＣ50を有するＴＨＰ−１細胞において、ＭＣＰ−１により誘発されたカルシウム可動化を阻害した。ＩｇＧ形式への転換後に、親Ｆａｂの生物学的活性が完全に保持されていることを示さなければならなかった。予想された通りに、各ＩｇＧは全て、放射性リガンド結合アッセイ、カルシウム可動化アッセイ、更に走化性アッセイにおいても活性を示し、最終的に全てのＩｇＧがＦａｂ形式で見られた活性を保持したこと、そして更にはＭＣＰ−１誘導型走化性を阻害したことが証明された。
親和性成熟については、放射性リガンド結合アッセイにおいて、１０〜４００ｎＭの範囲内のＫD、及び１０〜６５０ｎＭの範囲内のＩＣ50値を有する、７つの異なるＦａｂが、その特性に従って選択された。次にこれらを、ライブラリクローニング及び続く選択のために、３つの群に分けた。Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ２最適化を、並行して実施した。高品質ライブラリが作成された。選択プロセスのために溶液パニングを使用し、抗原の減少、オフ速度選択、及び非常に長い洗浄手順により、選択のストリンジェンシーを高めた。後続するスクリーニングプロセスについては、最適化されたバインダーの高スループット等級付けを可能にするバイオベリス（BioVeris）スクリーニングを使用した。このスクリーニングは、改良型バインダーの同定を行うのに極めて効率良く機能した。更に、Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ２で最適化されたＦａｂを同定することができ、ＭＯＲ０３４７１及びＭＯＲ０３５４８誘導体のための交差クローニングが可能となった。特に、ＭＯＲ０３４７１誘導体の交差クローニングが非常に功を奏し、２つの最適化された開始Ｆａｂに比べて、親和性が更に最大１００倍改善された。１７個の最適化されたＦａｂのうち、１６個が、詳細な特徴づけのために選択され、最終的には親ＭＯＲ０３４７１由来の４つのバインダーが全ての成功基準を満たし、うち２つがＬ−ＣＤＲ３においてのみ最適化され、２つが交差クローニングに由来した。親和性成熟した候補分析及び配列は、例３及び例４、表４〜６並びに配列番号２〜２８の中で詳述されている。
成熟後、主として検出限界に達したために、最適化されたバインダーの親和性をビアコアにおいて分析することはできなかった。ＭｏｒｐｈｏＳｙｓでは、バイオベリス技術と組合わせた溶液平衡滴定（ＳＥＴ）である、非常に感度の高いＫD決定方法を使用した。Ｆａｂ及びＩｇＧのための適切な適合モデルを用いて、一価の解離定数を計算することができた。親和性測定に加えて、この方法を、交差反応性研究に用いた。最終候補の親和性は、バイオベリスで測定し、ＣｅｎｔｏｃｏｒにてキネックスＡ（KinexA）により確認し、ヒト及びカニクイザルＭＣＰ−１に対して１０〜３２０ｐＭの範囲内であった。バイオベリスを用いた特異性テストでは、テストされた１６個全てのＦａｂ及びＩｇＧについて、ヒトＭＣＰ−２に対する交差反応性は全く示されなかった。いくつかのＦａｂ及びＩｇＧはまた、ヒトエオタキシンに対しても有意な交差反応性を示さなかった。成功基準に従って、ビアコア抗体捕捉モードで、１００ｍＭの相同体ヒトＭＣＰ−２、３、４及び１００ｎＭのヒトエオタキシン１、２及び３に対する結合はないとして、特異性基準が定められた。ビアコアＦａｂ捕捉モードにおいて、全ての選択されたＦａｂは、ＭＣＰ−２及びエオタキシンと、異なる程度の交差反応性を示した。ＩｇＧと比較してＦａｂが推定上わずかに不安定性が増大したこと、及びケモカインの一般的な非特異的結合能力が、非特異的結合に寄与した可能性がある。選択されたＩｇＧのうちのいくつかは、相同体ケモカインに対する有意な結合シグナルを全く示さず、ビアコアＩｇＧ捕捉モードでの特異性成功基準を満たした。バイオベリスを用いた溶液平衡滴定実験においては、いくつかのＦａｂでさえ交差反応性を全く示さなかった。ビアコア内で検出されたＭＣＰ−２に対するＦａｂ結合活性が中和活性に移行するか否かを分析するために、Ｃｅｎｔｏｃｏｒで放射線リガンド全細胞結合アッセイが開発された。このアッセイでテストされたＦａｂは、Ｔｈｐ−１細胞上で、ＣＣＲ２受容体に対する１２５Ｉ標識されたＭＣＰ−２の結合の有意な阻害を全く示さなかった（ＩＣ５０≧２μＭ）。
必要とされるＭＣＰ−１の量が１ｎｇ／ｍＬと低いことから、放射性リガンド結合アッセイは、アッセイＩＣ50限界がＦａｂについては約１００ｐＭ、ＩｇＧについては実に２０ｐＭという、このプロジェクトにおいて最も感度の高いアッセイであった。親和性以外に、このアッセイにおける活性を、詳細な特徴づけのために最適化されたバインダーの、等級付け及び選択のために用いた。最適化中の活性の全体的な改善は、最高で１０００倍の倍率であったが、最終的には、１つのＭＯＲ０３４７１由来Ｆａｂ、ＭＯＲ０３８７８が１１０ｐＭで最高の親和性を示した。テストされた全てのＩｇＧは放射性リガンド結合アッセイにおいて活性を保持した。４つの最終的なＩｇＧ候補、ＭＯＲ０３７８１、ＭＯＲ０３７９０、ＭＯＲ０３８５０及びＭＯＲ０３８７８のＩＣ50値は、２０〜５０ｐＭの範囲内にあり、Ｆａｂのそれぞれの活性に比べてわずかに優れてさえいた。活性が改善された理由の１つは、二価のＩｇＧが分子１個あたり２つのＭＣＰ−１を中和する（倍率２倍）ことである。ＩｇＧは純粋な量産製造由来であり、したがって、もう１つの理由は抗体の純度、安定性又は活性にあった可能性がある。二次的生物アッセイとして、ＭＣＰ−１誘導型ＣＣＲ２受容体の内在化の阻害を測定するＦＡＣＳベースのアッセイの開発に成功した。このアッセイは最終的に、ＩＣ50の決定及び等級付けさえ可能にした。最終的な４つの候補Ｆａｂ、ＭＯＲ０３７９０、ＭＯＲ０３８５０、ＭＯＲ０３７８１及びＭＯＲ０３８７８は、３〜５ｎＭの範囲のＩＣ50値を示した。
合成又は組換えＭＣＰ−１に対して単離されたＭＣＰ−１抗体の活性を確認するためにはネイティブＭＣＰ−１が必要であった。ネイティブＭＣＰ−１がＰＡＮＣ１上清から精製され、カルシウム放出の誘導のために使用された。最適化されたＦａｂは、参照抗体Ｃ７７５に比べて高い活性で、ネイティブＭＣＰ−１誘導型カルシウム可動化の阻害を示した。ＭＯＲ０３５４８由来のあらかじめ選択されたＦａｂは全て、競合ＥＬＩＳＡにおいてＭＣＰ１に対するＣ７７５の結合を完全に阻害した。ＭＯＲ０３４７１由来のあらかじめ選択されたＦａｂは全て、ＥＬＩＳＡにおいて部分的（約６０％）な競合を示し、これはエピトープが少なくとも重複していることを表わしている。最終的に、４つの抗体ＭＯＲ０３７８１、ＭＯＲ０３７９０、ＭＯＲ０３８５０及びＭＯＲ０３８７８は、特異性基準及びネイティブＭＣＰ−１の中和を含む全ての成功基準を満たした。
抗体を生産するその他の適切な方法
当該技術分野で既知であり、かつ／又は本明細書に記載されている通り、ヒト抗体のレパートリーを産生することができる、本発明の抗体を産生するためのその他の方法。このような技術としては、リボソームディスプレイ（Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942（May 1997）；Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135（Nov. 1998））；単一細胞抗体産生技術（例えば、選択リンパ球抗体方法（ＳＬＡＭ）（US pat. No. 5,627,052, Wen et al., J. Immunol. 17:887-892（1987）；Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848（1996））；ゲル微液滴とフローサイトメトリー（Powell et al., Biotechnol. 8:333-337（1990）；ワンセルシステムズ（One Cell Systems）Cambridge, MA；Gray et al., J. Imm. Meth. 182:155-163（1995）；Kenny et al., Bio/Technol. 13:787-790（1995））；Ｂ細胞選択（B-cell selection）（Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports 19:125-134（1994）；Jonak et al., Progress Biotech, Vol. 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Netherlands（1988））。が含まれるが、これらに限定されない。
非ヒト抗体又はヒト抗体を工学的処理又はヒト化するための方法も同様に使用でき、当該技術分野において周知である。一般に、ヒト化又は工学的処理された抗体は、例えばマウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類又はその他の哺乳動物などの（ただしこれらに限定されない）ヒト以外の供給源からの１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらのヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、典型的には既知のヒト配列の「インポート」可変領域、定常領域又はその他のドメインから採取される。既知のヒトＩｇ配列は当該技術分野において周知であり、任意の既知の配列であり得る。工学的処理されたヒト化抗体の結合、立体構造、及び減少された免疫原性を最適化するためのさまざまな戦略が、例えばPresta et al. J Immunol. 151:2623-2632, 1993; WO200302019, and WO2005080432で記述されている。
このようなインポートされた配列は、免疫原性を減少させるため、又は、当該技術分野において既知のように、結合、親和性、オン速度、オフ速度、結合活性、特異性、半減期、又はその他の適切な任意の特性を低減、増強又は改変するために使用することができる。一般的に、可変領域及び定常領域の非ヒト配列がヒト又はその他のアミノ酸に置き換えられている一方で、非ヒト又はヒトＣＤＲ配列の一部分又は全てが維持されている。抗体は、所望により、抗原に対する高い親和性及びその他の有利な生物学的特性を伴い、ヒト化することもできる。この目的を達成するため、所望により、ヒト化抗体を、親配列及びヒト化配列の３次元モデルを使用した、親配列及びさまざまな概念的ヒト化産物の分析プロセスによって調製することが可能である。３次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補の免疫グロブリン配列について、可能性の高い３次元立体構造を図示及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を調べることにより、候補の免疫グロブリン配列の機能における残基の役割として可能性の高いものの分析、すなわち候補の免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大など、望ましい抗体特性が達成されるように、コンセンサス配列及びインポート配列から、ＦＲ残基を選択し組合せることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は抗原結合に対する影響において、直接的かつ最も実質的に関与している。本発明の抗体のヒト化又は工学的処理は、任意の既知の方法を使用して実施することができ、例えばWinter (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), US patent Nos: 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246が挙げられ（これらに限定されない）、これらはそれぞれ、その中に引用されている参考文献を含め、参照によって本明細書に組み込まれる。
ヒト抗原に結合するヒト抗体のレパートリーを産生できるトランスジェニックマウスは、既知の方法で生産可能である（例えば、U.S. Pat. Nos：5,770,428, 5,569,825, 5,545,806, 5,625,126, 5,625,825, 5,633,425, 5,661,016 and 5,789,650 issued to Lonberg et al.；Jakobovits et al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98/24893, Lonberg et al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO 97/13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Kucherlapate et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. EP 0463 151 B1, Kucherlapate et al. EP 0710 719 A1, Surani et al. US. Pat. No. 5,545,807, Bruggemann et al. WO 90/04036, Bruggemann et al. EP 0438 474 B1, Lonberg et al. EP 0814 259 A2, Lonberg et al. GB 2 272 440 A, Lonberg et al. Nature 368:856-859（1994）, Taylor et al., Int. Immunol. 6（4）579-591（1994）, Green et al, Nature Genetics 7:13-21（1994）, Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156（1997）, Taylor et al., Nucleic Acids Research 20（23）:6287-6295（1992）, Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90（8）3720-3724（1993）, Lonberg et al., Int Rev Immunol 13（1）:65-93（1995）and Fishwald et al., Nat Biotechnol 14（7）:845-851（1996）が挙げられ（これらに限定されない）、それぞれ参照により全体が本明細書に組み込まれる。）一般に、これらのマウスは、機能的に再構成されているか、又は機能的に再構成され得る、少なくとも１つのヒト免疫グロブリン遺伝子座からのＤＮＡを含む少なくとも１つの導入遺伝子を含む。このようなマウスの内因性免疫グロブリン遺伝子座を分断又は欠失させ、内因性遺伝子によりコードされた、抗体を産生する動物の能力を除去することができる。
類似タンパク質又は断片への特異的結合に関する抗体のスクリーニングは、ペプチド表示ライブラリを使用して、便宜的に達成することができる。この方法は、望ましい機能又は構造をもつ個々のメンバーについて大きなペプチド収集物をスクリーニングすることに関与している。ペプチド表示ライブラリの抗体スクリーニングは、当該技術分野において周知である。表示されるペプチド配列の長さは、３〜５０００個又はそれ以上のアミノ酸、しばしば５〜１００個のアミノ酸、更にしばしば約８〜２５個のアミノ酸であり得る。ペプチドライブラリを作成するための直接的な化学合成方法に加えて、複数の組換えＤＮＡ方法も記述されている。１つのタイプには、バクテリオファージ又は細胞の、表面上のペプチド配列のディスプレイが関与している。各バクテリオファージ又は細胞は、特定のディスプレイされたペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含有する。このような方法は、PCT Patent Publication Nos. 91/17271, 91/18980, 91/19818及び93/08278に記載されている。ペプチドのライブラリを作成するためのその他のシステムは、インビトロ化学合成及び組換え方法の両方の特徴を有している。PCT Patent Publication Nos. 92/05258, 92/14843、及び96/19256を参照こと。また、U.S. Patent Nos. 5,658,754及び5,643,768も参照のこと。ペプチドディスプレイライブラリ、ベクター及びスクリーニングキットはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Carlsbad,CA）及びＣａｍｂｒｉｄｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Cambridgeshire, UK）などのサプライヤから市販されている。例えば、Ｅｎｚｏｎに割り当てられたU.S. Pat. Nos. 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456; Ｄｙａｘに割り当てられた5223409, 5403484, 5571698, 5837500, Ａｆｆｙｍａｘに割り当てられた5427908, 5580717; Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに割り当てられた5885793;Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈに割り当てられた 5750373,Ｘｏｍａ、Ｃｏｌｌｉｇａｎ、ｓｕｐｒａ，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｓｕｐｒａ，またはＳａｍｂｒｏｏｋ、ｓｕｐｒａに割り当てられた5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417を参照のこと。なお上述の特許及び刊行物はそれぞれ、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
２．本発明の核酸
配列番号２〜５及び２７〜２８のうちの少なくとも１つの隣接するアミノ酸の少なくとも７０〜１００％をコードするヌクレオチド配列、その特定の断片、変異体又はそのコンセンサス配列などの、本明細書に提供されている情報を用いて、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体をコードする本発明の核酸分子を、本明細書に記載の方法又は当該技術分野で既知の方法を用いて得ることができる。本発明の単離核酸分子には、本明細書に記載されているように、及び／又は当該技術分野において既知のように、１つ以上のイントロン（例えば、少なくとも１つの重鎖（例えば配列番号６〜１２、２２及び２３）又は軽鎖（例えば配列番号１３〜２１及び２４〜２６）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３といった少なくとも１つのＣＤＲの少なくとも１つの特定された部分であってこれらに制限されない）を所望により伴うオープンな読取り枠（ＯＲＦ）を含む核酸分子；抗ＭＣＰ−１抗体又は可変領域（例えば配列番号２〜５、２７及び２８）のためのコード配列を含む核酸分子；及び、上記に説明されているものとは実質に異なるヌクレオチド配列を含むものでありながら、遺伝コードの縮退に起因して、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を依然としてコードする、核酸分子が含まれる。当然のことながら、遺伝子コードは、当該技術分野においてよく知られている。したがって、当業者には、本発明の特異的な抗ＭＣＰ−１抗体をコードする、これらの変性核酸変異体を作成することは、日常的であるだろう。例えばＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａを参照されたい。このような核酸変異体は、本発明に含まれる。
本明細書に記されているように、抗ＭＣＰ−１抗体をコードする核酸を含む本発明の核酸分子には、単独で抗体断片のアミノ酸配列をコードするもの；全抗体又はその一部分についてのコード配列；１つの抗体、断片又は一部分についてのコード配列並びに付加的配列、例えばスプライシング及びポリアデニル化シグナルを含む、転写、ｍＲＮＡプロセッシングにおいて１つの役割を果たす転写された非翻訳配列（例えばリボソーム結合及びｍＲＮＡの安定性）といった非コーディング５’及び３’配列を含みこれらに限定されない、付加的な非コード配列を伴う、少なくとも１つのイントロンなどの、前述の付加的なコード配列を伴うか否かを問わず、少なくとも１つのシグナルリーダー又は融合ペプチドのコード配列；付加的なアミノ酸（例えば付加的な機能を提供するものなど）についてコードする付加的なコード配列、が含まれる可能性があり、これらに限定されない。したがって、抗体をコード化する配列は、抗体断片又は部分を含む融合された抗体の精製を促進するペプチドをコードする配列などのマーカー配列に融合させることができる。
本明細書に記載されているポリヌクレオチドに対して選択的にハイブリッド形成するポリヌクレオチド：本発明は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に開示されているポリヌクレオチドにハイブリッド形成する単離核酸を提供する。したがって、本実施形態のポリヌクレオチドは、このようなポリヌクレオチドを含む核酸を単離、検出、及び／又は定量するために使用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドを使用して、蓄積されたライブラリにおける部分又は全長クローンを同定、単離、又は増幅することができる。一部の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、単離された、又はそうでなければヒト又は哺乳類の核酸ライブラリからのｃＤＮＡに相補的な、ゲノム配列又はｃＤＮＡ配列である。
好ましくは、ｃＤＮＡライブラリは全長配列の少なくとも８０％、好ましくは全長配列の少なくとも８５％又は９０％、及びより好ましくは全長配列の少なくとも９５％を含む。ｃＤＮＡライブラリは、稀な配列の発現量を増大させるために正規化され得る。ストリンジェンシーが低度又は中程度のハイブリダイゼーション条件が、典型的であり（ただし排他的ではなく）、相補的な配列に比べて低い配列同一性をもつ配列を伴い、利用される。ストリンジェンシーが中程度及び高度の条件は、所望により、より高い同一性をもつ配列について利用することができる。低ストリンジェンシー条件は、約７０％の配列同一性をもつ配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、オルソロガス又はパラロガス配列を同定するために利用できる。
所望により、本発明のポリヌクレオチドは本明細書に記載されているポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも一つの部分をコードすることになる。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドに対する選択的ハイブリダイゼーションのために利用可能な核酸配列を包含する。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｓｕｐｒａ；Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｓｕｐｒａを参照のこと。これらはそれぞれ参照により全体が本明細書に組み込まれる。
核酸の構築：本発明の単離核酸は、当該技術分野において周知のように、（ａ）組換え方法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、又はこれらの組合せを用いて作ることができる。
核酸を構築するための組換え方法：例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はこれらの任意の組合せのような本発明の単離核酸組成物は、当業者に既知の任意の数のクローニング手順を用いて生物学的な供給源から得ることが出来る。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下で選択的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブが、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリ内の望ましい配列を同定するために使用される。ＲＮＡの単離、並びにｃＤＮＡ及びゲノムライブラリの構築は、通常の当業者にとって周知である（例えば、Ausubel、上掲書又はSambrook、上掲書を参照のこと）。
核酸スクリーニング及び単離方法：本明細書で開示されているような、本発明のポリヌクレオチドの配列に基づいたプローブを用いて、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることができる。同じ又は異なる生体内の相同遺伝子を単離するため、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列とハイブリッド形成するためにプローブを使用することができる。当業者であれば、アッセイ中でさまざまな度合のハイブリダイゼーションストリンジェンシーを用いることができ、ハイブリダイゼーション又は洗浄培地のいずれかがストリンジェントであり得るということは明らかだろう。ハイブリダイゼーションのための条件がストリンジェントになるにつれて、二重鎖形成が生じるための、プローブと標的の間に必要な相補性の程度は大きくなる。ストリンジェンシーの程度は、温度、イオン強度、ｐＨ、及びホルムアミドのような部分的な変性溶媒の存在、のうちの、１つ以上によって制御され得る。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば０％〜５０％の範囲内のホルムアミド濃度の操作を通して反応溶液の極性を変えることにより都合良く変更される。検出可能な結合のために必要な相補性（配列同一性）の程度は、ハイブリダイゼーション培地及び／又は洗浄培地のストリンジェンシーに従って変化する。相補の程度は、最適には１００％、又は７０〜１００％、又はその中の任意の範囲若しくは値である。しかしながら、プローブ及びプライマー内のわずかな配列変動は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄培地のストリンジェンシーを低減させることで補償できるということを理解すべきである。
ＲＮＡ又はＤＮＡの増幅方法は、当該技術分野において周知であり、本明細書中で紹介する教示及び指針に基づいて、過度の実験なしに、本発明に従って使用可能である。ＤＮＡ又はＲＮＡ増幅の既知の方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び関連する増幅プロセスが含まれるが、これらに限定されない（Mullis, et al., U.S. Patent No. 4,683,202 （1987）；及びInnis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA（1990））。
核酸を構築するための合成方法：本発明の単離核酸は、既知の方法による直接化学合成によっても調製可能である（例えば、Ausubel, et al.、上掲書を参照）。化学合成は、一般に、相補的配列とのハイブリダイゼーション、又は単鎖をテンプレートとして使用するＤＮＡポリメラーゼでの重合によって、二本鎖ＤＮＡに変換可能な単鎖オリゴヌクレオチドを作成する。当業者であれば、ＤＮＡの化学合成が約１００以上の塩基の配列に限定され得る一方で、より長い配列は、より短い配列の連結によって得ることができることを認識するであろう。コード配列の化学的合成のための特に好ましい方法が、US Patent Nos. 6521427及び6670127に教示されている。
３．ベクターと発現系
本発明は、抗ＭＣＰ−１抗体をコードする核酸を含有するか、又は、さまざまな抗体ＨＣ若しくはＬＣ遺伝子又はそれらの一部分を含有するプラスミドを得るために使用可能なベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。本明細書で使用するとき、用語「ベクター」は、連結されたもう１つの核酸を輸送する能力をもつ核酸分子を意味する。ベクターの一種である「プラスミド」は、環状二本鎖ＤＮＡループを意味し、追加のＤＮＡセグメントがこれに連結され得る。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントが、このウイルスゲノムに連結され得る。本発明は、本発明の単離核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子組換えされている宿主細胞、及び当該技術分野において周知であるような組換え技術による少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体の生産にも関連する。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．、上掲書、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．、上掲書を参照のこと。これらは参照により全体が本明細書に組み込まれる。
抗体又はその抗体断片の発現のためには、部分的な又は全長の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを、遺伝子が転写及び翻訳制御配列に、動作可能なように連結されるような形で発現カセット又はベクター内に挿入することができる。抗体をコードするカセットは、１つの構築物として組み立てることができる。当該技術分野において既知の方法を用いて、構築物を調製することができる。より大きなプラスミドの一部として、構築物を調製することができる。このような調製は、適正な構成のクローニング及び選択を効率良い方法で可能にする。この構築物は、それらを残りのプラスミド配列から容易に単離できるような形で、プラスミド又はその他のベクター上の都合の良い制限部位の間に配置することができる。
一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物内、又はＤＥＡＥ−デキストランの荷電脂質との錯体内に導入される。ベクターがウイルスである場合は、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでこれをパッケージングし、その後、宿主細胞内に形質導入することができる。宿主細胞内へのベクター構築物の導入は、電気穿孔法又はその他の既知の方法により行うこともできる。このような方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上掲書、第１〜４及び１６〜１８章；Ａｕｓｕｂｅｌ、上掲書、第１、９、１３、１５、１６章などのように、当該技術分野において記述されている。
この文脈において、「動作可能に連結される」という用語は、抗体遺伝子がベクターに連結されて、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するというそれらの意図される機能を果たすことを意味することが意図される。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、個別のベクターに挿入することができるが、又はより典型的には、両遺伝子は、同一の発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相捕的制限部位の連結、又は制限部位が存在しない場合には平滑末端連結）によって発現ベクターに挿入される。
本明細書に記載される抗体の軽鎖及び重鎖可変領域を使用し、望ましいアイソタイプの重鎖定常部及び軽鎖定常部を既にコード化している発現ベクターにそれらを挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を形成して、ＶＨセグメントが、ベクター内のＣＨセグメントに動作可能に連結され、ＶＩセグメントがベクター内のＣＬセグメントに動作可能に連結されるようにする。追加的又は代替えとして、組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進する、シグナルペプチドをコード化することができる。抗体鎖遺伝子は、ベクターにクローン化されて、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるようにすることができる。シグナルぺプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであるか、又は異種シグナルぺプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であり得る。
原核又は真核宿主細胞のいずれかにおいて本発明の抗体を発現することは理論的に可能であるが、真核細胞及び最も好ましくは哺乳類宿主細胞における抗体の発現は、原核細胞よりも、適切に折り畳まれ免疫学的に活性である抗体を、組み立てて分泌する可能性が高いため、このような真核細胞、及び特に哺乳類細胞が、最も好適である。
一般に、哺乳動物発現ベクターは、（１）通常、ウイルスプロモーター又はエンハンサー配列の形をしており、広い範囲の宿主及び組織により特徴づけられる調節エレメント；（２）プラスミドベクター内部の抗体コード配列を含むＤＮＡ断片の挿入を促進する「ポリリンカー」配列、及び（３）ｍＲＮＡ転写のイントロンスプライシング及びポリアデニル化に対応する配列、を含有する。プロモーター・ポリリンカー・ポリアデニル化部位の隣接領域は、一般に転写単位と呼ばれる。ベクターは、（４）大腸菌（E. coli）内の初期陽性形質転換体の選択を可能にする、抗生物質（例えばアンピシリン）に対する耐性をしばしば付与する、選択可能なマーカー遺伝子（例えばベータ・ラクタマーゼ遺伝子）；及び（５）細菌宿主及び哺乳動物宿主の両方において、ベクターの複製を促進する配列、をも含む可能性が高くなる。プラスミド複製起点が、大腸菌内での発現構成体の増殖のために含まれており、Ｃｏｓ細胞内の一過性発現のために、ＳＶ４０複製起点が発現プラスミド中に含まれている。
プロモーターは、ＳＶ４０プロモーター（例えば晩期又は早期ＳＶ４０プロモーター）、ＣＭＶプロモーター（US Pat.Nos. 5,168,062; 5,385,839）、ＨＳＶ ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセラートキナーゼ）プロモーター、ＥＦ−１アルファプロモーター（US Pat.No. 5,266,491）、少なくとも１つのヒト免疫グロブリンプロモーターから選択され得る。
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択可能なマーカーを含むが、これは任意である。このようなマーカーは、例えば、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ、US Pat.Nos. 4,399,216; 4,634,665; 4,656,134; 4,956,288; 5,149,636; 5,179,017）、アンピシリン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ミコフェノール酸、又は真核細胞培養に耐性のあるグルタミン合成酵素（ＧＳ、US Pat.Nos. 5,122,464; 5,770,359; 5,827,739）、及び大腸菌及び他の細菌又は原核生物において培養するためのテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子を含むが、これらに限定されない（上記の特許は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる）。上記の宿主細胞に対して適切な培養培地及び条件は、当該技術分野において知られている。適切なベクターは、当事者にとって容易に明白となる。
真核宿主細胞が利用される場合は、通常、ベクター内にポリアデニル化又は転写ターミネーター配列が組み込まれる。ターミネーター配列の一例は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写の正確なスプライシングのための配列も、同様に含めることができる。スプライシング配列の一例としては、ＳＶ４０由来のＶＰ１イントロンがある（Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781（1983））。更に、宿主細胞内の複製を制御するための遺伝子配列を、当該技術分野において既知の通りに、ベクター内に組み込むことができる。また、重鎖分子の高い表面発現を回避するためには、膜貫通ドメイン変異体スプライスを排除するような発現ベクターを使用する必要があり得る。
付加的な要素としては、エンハンサー、コザック配列、及びＲＮＡスプライシングのためのドナー及びアクセプター部位により隣接された介在配列が含まれる。高効率の転写は、ＳＶ４０からの早期及び晩期プロモーター、レトロウイルスからの長末端反復（ＬＴＲＳ）、例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ、及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の早期プロモーターで達成可能である。しかしながら、細胞要素も同様に使用可能である（例えばヒトアクチンプロモーター）。本発明を実践する上で使用するための適切な発現ベクターとしては例えば、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ＰＬＸＳＮ、又はｐＬＮＣＸ（Clonetech Labs, Palo Alto, CA）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐｃＤＮＡ／Ｚｅｏ（＋／−）若しくはｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋／−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＳＶＬ及びＰＭＳＧ（Pharmacia, Uppsala, Sweden）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）及びｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）といったベクターが含まれる。
別の方法としては、染色体内に組み込まれた遺伝子を含む安定した細胞株において、抗体配列をコードする核酸を発現させることができる。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン又はハイグロマイシンなどの選択可能なマーカーでの同時トランスフェクションにより、コードされた抗体を大量に発現するトランスフェクション細胞の同定及び単離が可能となる。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、対象とする遺伝子の数百あるいは数千ものコピーを擁する細胞株を開発するのに有用である。もう１つの有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Murphy, et al., Biochem. J. 227:277-279（1991）；Bebbington, et al., Bio/Technology 10:169-175（1992））。これらのマーカーを用いて、哺乳動物細胞を選択培地内で増殖させ、最高の耐性をもつ細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体内に組み込まれた増幅遺伝子を含有する。抗体の産生には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＮＳＯ細胞がしばしば用いられる。
本発明の抗体の生産において用いられるＤＮＡ構成体は、所望により、少なくとも１つのインシュレーター配列を含むことができる。「インシュレーター」、「インシュレーター配列」及び「インシュレーター要素」は本明細書では互換的に使用される。インシュレーター要素は、その活動範囲内に置かれた遺伝子の転写を絶縁するものの、遺伝子発現をマイナス又はプラスのいずれにも動揺させない制御要素である。好ましくは、インシュレーター配列は、転写されるべきＤＮＡ配列のいずれかの側に挿入される。例えば、インシュレーターは、対象とする遺伝子の３’末端でプロモーターから少なくとも約１ｋｂ〜５ｋｂ、プロモーターからの５’で、約２００ｂｐ〜約１ｋｂのところに配置することができる。プロモーター及び対象とする遺伝子の３’末端からのインシュレーター配列の距離は、対象とする遺伝子の相対的サイズ、構成体中で用いられるプロモーター及びエンハンサーに応じて、当業者が決定することができる。更に、２つ以上のインシュレーター配列をプロモーターから５’の位置、又は導入遺伝子の３’末端に配置することができる。例えば、プロモーターから５’の位置に２つ以上のインシュレーター配列を配置することができる。導入遺伝子の３’末端にあるインシュレーターは、対象とする遺伝子の３’末端又は３’制御配列の３’末端、例えば３’非翻訳領域（ＵＴＲ）又は３’隣接配列に配置することが可能である。
適切な誘発性非融合大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Amann et al.,（1988）Gene 69:301-315）及びｐＥＴ１１ｄ（Studier et al., Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.（1990）60-89）が含まれる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存している。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現されたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）により媒介されたＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下で、Ｔ７ｇｎ１遺伝子を擁する常在λプロファージからの宿主菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。
別の実施形態において、発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldari et al.（1987）EMBO J. 6:229-234）、ｐＭＦａ（Kurjan and Herskowitz,（1982）Cell 30:933-943）、ｐＪＲＹ８８（Schultz et al.（1987）Gene 54:113-123）、ｐＹＥＳ２（Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.）、及びｐＰｉｃＺ（Invitrogen Corp, San Diego, Calif.）が挙げられる。
あるいは、発現ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターである。培養された昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）内でのタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Smith et al.（1983）Mol. Cell Biol. 3:2156-2165）及びｐＶＬシリーズ（Lucklow and Summers（1989）Virology 170:31-39）が含まれる。
更に別の実施形態において、本発明の核酸が、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞内で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Seed（1987）Nature 329:840）及びｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman et al.（1987）EMBO J.6:187-195）が含まれる。哺乳動物細胞内で使用される場合、発現ベクターの制御機能はしばしば、ウイルスの調節エレメントにより提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、及びシミアンウイルス４０に由来する。原核と真核の両方の細胞の他の好適な発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、上掲書の第１６章及び１７章を参照のこと。
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、リンパ腫細胞（例えばマウス骨髄腫細胞）などの特定の細胞型の中で優先的に核酸の発現を導く能力を有する。特定の細胞型においては、核酸を発現するために、組織特異的調節エレメントが使用される。組織特異的調節エレメントは、当該技術分野において既知である。適切な組織特異的プロモーターの、非制限的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkert et al.（1987）Genes Dev. 1:268-277）、リンパ系特異的プロモーター（Calame and Eaton（1988）Adv. Immunol. 43:235-275）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Winoto and Baltimore（1989）EMBO J. 8:729-733）、及び免疫グロブリン（Banerji et al.（1983）Cell 33:729-740；Queen and Baltimore（1983）Cell 33:741-748）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Byrne and Ruddle（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477）、膵臓特異的プロモーター（Edlund et al.（1985）Science 230:912-916）、並びに乳腺特異的プロモーター（例えば乳清プロモーター；U .S. Pat. No. 4,873,316及びEuropean Application Publication No. 264,166）が含まれている。例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Kessel and Gruss（1990）Science 249:374-379）及びα−フェトタンパク質プロモーター（Campes and Tilghman（1989）Genes Dev. 3:537-546）などにより、発生学的に調節されているプロモーターも包含されている。
本発明は更に、アンチセンス配向で発現ベクター内にクローニングされたＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対しアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を可能にするような形で、制御配列に動作可能なように連結されている。さまざまな細胞型内でアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を導くような、アンチセンス配向でクローニングされた核酸に動作可能に連結された制御配列を、選択することができる。例えば、アンチセンスＲＮＡの構成性、組織特異的又は細胞型特異的発現を導くような、ウイルスプロモーター及び／若しくはエンハンサー、又は制御配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、又は弱毒化ウイルスの形をしている可能性があり、これらにおいては、高効率調節領域の制御下でアンチセンス核酸が作成され、ベクターが導入される細胞型によって活性が決定され得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の議論については、ワイントローブ（Weintraub）ら（Reviews--Trends in Genetics, Vol. 1（1）1986）を参照のこと。
骨髄腫細胞のクローニング及び発現
ｃＭ−Ｔ４１２として知られている、ヒトＣＤ４に対するキメラマウス／ヒトＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体（ＥＰ０５１１３０８、参照によりその全体が組み込まれる）が、トランスフェクションを受けたマウス骨髄腫細胞内で高レベルに発現されることが観察された（Looney et al. 1992. Hum Antibodies Hybridomas 3（4）:191-200）。１９９０年、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡで、培養条件を最適化するのに多大な努力を払うことなく、５００ｍｇ／Ｌを超える生産レベル（ｐｇ当たり、細胞当たり、１日あたりの具体的な生産性は不明）が、容易に得られている。これらの発現ベクターの構成要素に基づき、遺伝子プロモーター／転写開始核酸配列、５’非翻訳配列及び翻訳開始核酸配列、シグナル配列をコードする核酸配列、シグナルイントロン及びＪ−Ｃイントロンのためのイントロン／エキソンスプライスドナー配列、並びにＪ−Ｃイントロンエンハンサー核酸配列を含む、ＨＣ及びＬＣクローニングに有用な抗体クローニングベクターが開発された。ｐＵＣ１９プラスミドであるプラスミドｐ１３９は、全マウスＭ−Ｔ４１２Ａｂを分泌するＣ１２３ハイブリドーマ細胞からクローニングされた５．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩゲノム断片を含む。この断片は、ｃＭ−Ｔ４１２ＨＣ遺伝子のプロモーター及びＶ領域部分を含有する。ＬＣ Ｖ領域ベクター工学的処理用の出発材料は、Ｃ１２３ハイブリドーマ細胞からクローニングされた３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩゲノム断片を含有するｐＵＣプラスミドである、プラスミドｐ３９であった。この断片は、ｃＭ−Ｔ４１２ＬＣ遺伝子のプロモーター及びＶ領域部分を含有する。Ｐ１３９及びｐ３９由来の工学的処理済みベクターは、１）Ｖ領域ベクター内の特別に調製された制限部位間で対象とする配列をコードするＤＮＡをクローニングし、これにより、Ｖ領域コード配列がベクターコーディングされたシグナル配列のすぐ下流側、並びに遺伝子プロモーターの一部分又は全部の下流側に配置されるようにする工程；並びに、２）Ｖ領域ベクターからＣ領域ベクターまで好適な配向で挿入された配列を擁する断片を移送し、これにより、結果として得られたプラスミドが細胞内での発現に適した最終的発現プラスミドを構成するようにする工程（Scallon et al. 1995 Cytokine 7（8）:759-769）を伴う２段階プロセスにおいて、哺乳動物宿主細胞内で発現するのに適したＨＣ又はＬＣ遺伝子の好都合な組立てを可能にするように設計された。
ＣＨＯ細胞内でのクローニング及び発現
プラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ATCC Accession No. 37146）の誘導体である。このプラスミドは、ＳＶ４０早期プロモーターの制御下でマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクションされるチャイニーズハムスターの卵巣又はその他の細胞で、ジヒドロ葉酸活性が欠如したものを、化学療法剤メトトレキサートを添加した選択培地（例えば、アルファマイナスＭＥＭ、Life Technologies, Gaithersburg, MD）の中で細胞を増殖させることによって選択することができる。メトトレキサート（ＭＴＸ）に対する耐性をもつ細胞内のＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、文献により充分に知られている（例えば、F. W. Alt, et al., J. Biol. Chem. 253:1357-1370（1978）；J. L. Hamlin and C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097:107-143（1990）；及びM. J. Page and M. A. Sydenham, Biotechnology 9:64-68（1991）を参照のこと）。ＭＴＸの濃度の増加の中で増殖した細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素であるＤＨＦＲを過剰産生することにより、薬物に対する耐性を生じる。第２の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結されている場合は、通常、同時増幅され、かつ過剰発現される。当該技術分野において、増幅遺伝子の１，０００コピー以上を擁する細胞株を発生させるために、このアプローチを使用できることが知られている。その後、メトトレキサートが除去された時点で、宿主細胞の１つ以上の染色体の中に組み込まれた増幅遺伝子を含有する細胞株が得られる。
プラスミドｐＣ４は、対象とする遺伝子を発現するために、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）の強いプロモーター（Cullen, et al., Molec. Cell. Biol. 5:438-447（1985））と、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の直前初期遺伝子のエンハンサーから単離された断片（Boshart, et al., Cell 41:521-530（1985））とを含有している。このプロモーターの下流側には、遺伝子の組み込みを可能にするＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、及びＡｓｐ７１８制限酵素切断部位がある。このプラスミドは、これらのクローニング部位の後ろに、ラットプレプロインスリン遺伝子の３’イントロン及びポリアデニル化部位を有している。発現のためには、例えばヒトｂ−アクチンプロモーター、ＳＶ４０早期若しくは晩期プロモーター、又は例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶＩなどの他のレトロウイルスからの長末端反復といった、その他の高効率プロモーターを使用することもできる。哺乳動物細胞内で制御された方法でＭＣＰ−１抗体を発現するためには、クローンテック（Clontech）社のテットオフ（Tet-Off）及びテットオン（Tet-On）遺伝子発現系及び類似の系を使用することができる（M. Gossen, and H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：5547-5551（1992））。ｍＲＮＡのポリアデニル化のためには、例えばヒト成長ホルモン又はグロビン遺伝子からの他のシグナルを同様に使用することもできる。
４．抗体生産用の宿主細胞
本発明の少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体は、所望により、当該技術分野において周知の細胞株、混合細胞株、不死化細胞又は不死化細胞のクローン集団によって生産され得る。例えばＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７〜２００４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２nd Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４−２００４）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，（１９９７〜２００４）を参照されたい。これらはそれぞれ、参照により全体が本明細書に組み込まれている。
生物製剤製品を生産するためには、組換えポリペプチドを効率良く、再現可能に発現する能力がある生産細胞株が必要とされる。この細胞株は、安定していて確かなものである。さまざまな宿主細胞株を、この目的で利用することができる。細胞機構がどのように生物製剤製品の最終的な量及び組成物に影響を及ぼすのかという複雑さを理解するにつれて、製品の生産及び組成に対し必要な属性を付与することになる宿主細胞株の選択は、より明白なものとなる。
連続的ゲノムＤＮＡ配列から転写される大部分の遺伝子とは異なり、抗体遺伝子は、生殖系列内で広く分離され得る遺伝子セグメントから組立てられる。特に、抗体の可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）及び連結（Ｊ）／定常（Ｃ）領域をコードする３つのゲノムセグメントの組合せにより、重鎖遺伝子が形成される。機能的軽鎖遺伝子は、Ｖ領域をコードするものとＪ／Ｃ領域をコードするものとの２つの遺伝子セグメントを接合することにより、形成される。重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座の両方が、全長が１０００ｋｂをはるかに超えると推定される数多くのＶ遺伝子セグメント（推定値は１００ｓ〜１０００ｓの間で変動）を含む。これとは対照的に、ラムダ遺伝子座ははるかに小さく、マウス内の１６番染色体上で全長が約３００ｋｂであることが示されている。これは、２つの可変遺伝子セグメントと４つの連結／定常（Ｊ／Ｃ）領域遺伝子セグメントからなる。機能的遺伝子の形成には、Ｖ及びＪ／Ｃエレメントの間の組換えが必要である。
抗体が自然に産生されるＢ細胞の中では、再構成重鎖とカッパ軽鎖の両方の転写の制御が、Ｖ領域の上流側の組織特異的プロモーター及びＪ−Ｃイントロン内に位置づけられる組織特異的エンハンサーの両方の活性に基づいている。これらの要素は相乗的に作用する。また、第２のＢ細胞特異的エンハンサーが、カッパ軽鎖遺伝子座内で同定されている。この更なるエンハンサーは、Ｃkappaの下流側の９ｋｂの位置にある。よって、抗体発現遺伝子を不死化するハイブリドーマ方法は、親Ｂ細胞系統の内因性プロモーター及びエンハンサー配列に依存している。別の方法としては、本発明の核酸は、本発明の抗体をコードする内因性ＤＮＡを含む宿主細胞内で、（操作により）オン切換えすることにより、宿主細胞中で発現させることができる。このような方法は、ＵＳ ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，５８０，７３４、５，６４１，６７０、５，７３３，７４６、及び５，７３３，７６１に記載されているように、当該技術分野において周知である。これらは参照により全体が本明細書に組み込まれる。
人工ベクター内への抗体ゲノムＤＮＡのクローニングは、抗体発現能力をもつ宿主細胞を作成するもう１つの方法である。しかしながら、強いプロモーターによるモノクローナル抗体の発現は、高生産性細胞株を同定しモノクローナル抗体のより高い収量を得る確率を増大させる。本発明のヒト抗体は、例えば、当該技術分野において周知のように、組み換えＤＮＡ技術と遺伝子トランスフェクション方法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて生産することもできる（例えばMorrison, S.（1985）Science 229:1202）。
さまざまな異なる宿主細胞において、抗体を含む生物製剤のクローニング及び発現のための系は、周知である。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母及びバキュロウイルス系、並びにトランスジェニック植物及び動物が挙げられる。非相同ポリペプチド無傷グリコシル化タンパク質の発現のための当該技術分野において利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、ＮＳＯマウス黒色腫細胞及び派生細胞株、例えばＳＰ２／０、ＹＢ２／０（ＡＴＣ ＣＲＬ−１６６２）ラット骨髄腫細胞、ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ）、ヒト胚網膜細胞ＰｅｒＣ．６細胞、ｈｅｐＧ２細胞、ＢＳＣ−１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６）、及び例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から入手可能なその他の数多くのものが含まれる。一般的な好ましい細菌宿主は、大腸菌である。
非相同遺伝子の安定した発現のためには、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ２１、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０）、マウスＬｔｋ−細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞といったような哺乳動物細胞がしばしば用いられている。これとは対照的に、組換えタンパク質の過渡的な発現のためには、Ｃｏｓ（ＣＯＳ−１ ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０；ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）及びＨＥＫ２９３などの細胞株が、日常的に用いられる。
本発明の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞としては、その高い発現速度のため、Ｓｐ２／０、ＹＢ２／０（ＡＴＣ ＣＲＬ−１６６２）、ＮＳＯ、及びＰ３Ｘ６３．Ａｇ８．６５３（例えば、ＳＰ２／０−Ａｇ１４）といったような骨髄腫細胞が挙げられる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞に使用するための、別の好ましい発現系は、ＷＯ ８７／０４４６２、ＷＯ ８９／０１０３６及びＥＰ ３３８，８４１において開示されているＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞内に導入されると、宿主細胞内での抗体の発現を可能にするのに、又はより好ましくはその宿主細胞が増殖する培地内への抗体の分泌を可能にするのに、充分な時間宿主細胞を培養することによって、抗体が産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して、培地から回収することができる。
抗体、その特定された部分又は変異体の産生にとって有用な細胞培養の一例としては哺乳動物細胞がある。哺乳動物細胞系は、しばしば細胞の単層の形をとるが、哺乳動物細胞の懸濁液又はバイオリアクターも使用可能である。
無傷なグリコシル化タンパク質を発現可能な多数の適切な宿主細胞株が当該技術分野において開発されており、これにはＣＯＳ−１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０）、ＣＨＯ（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１０）及びＢＳＣ−１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６）細胞株、Ｃｏｓ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐＧ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、その他同様物を含み、これらは例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から容易に入手できる。好適な宿主細胞には、骨髄腫及びリンパ腫細胞などのリンパ系起源の細胞が含まれる。特に好ましい宿主細胞はＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１５８０）及びＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１８５１）である。
ＣＨＯ−Ｋ１及びＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞ＤＧ４４及びＤＵＫ−Ｂ１１（G. Urlaub, L.A. Chasin, 1980. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4216-4220）が、高レベルのタンパク質産生のために使用される。これは、対象とする遺伝子の増幅が、例えば薬物メトトレキサート（ＭＴＸ）を用いた選択可能かつ増幅可能なマーカーＤＨＦＲの取込みによって可能になるためである（R.J. Kaufman, 1990. Methods Enzymol. 185：537-566）。高レベルで組換えｍＡｂを産生するためには、ＤＨＦＲ-ＣＨＯ細胞を使用するとうまくいく。ＤＨＦＲ-ＣＨＯは、１０6個の細胞において一日当たり８０〜１１０ｍｇ、又は２００ｍｇを超える速度で抗ＭＣＰ−１抗体を産生することができる。例えばｂ−アクチンプロモーター、ヒトＣＭＶ ＭＩＥプロモーター、Ａｄウイルス主要晩期プロモーター（ＭＬＰ）、ＲＳＶプロモーター、及びマウス白血病ウイルスＬＴＲなど、さまざまなプロモーターが、これらのＣＨＯ細胞内でのＨ鎖及びＬ鎖の発現を得るために使用されている。ｍＡｂ発現のための数多くのベクターが文献に記述されており、その中で、独立した選択可能／増幅可能なマーカーとともに２つの異なるプラスミドにより２つのＩｇ鎖が供給されている。ＤＨＦＲマーカーに連結された１つの抗体鎖（Ｈ鎖など）、及びＮｅｏrマーカーを伴うＬ鎖発現カセット、又はその反対を含んでいるベクターを用いて、スピナーフラスコ内で、７日当たりで最高１８０ｍｇＬ-1のヒト化ｍＡｂを得ることができる。初期選択及びその後の増幅のために用いられる方法はさまざまに変えることができ、当業者にとって周知である。一般に、以下の工程を用いて、高レベルのｍＡｂ発現を得ることができる：候補クローンの初期選択及びその後の増幅、同時選択（例えばＨ鎖及びＬ鎖発現ベクターの両方がＤＨＦＲ発現単位を担持している場合）及び増幅、さまざまな増幅可能マーカーを用いた同時増幅、並びに大量培養中の初期選択及び増幅とそれに続く個々の高発現クローンを同定するための希釈クローニング。組み込み部位がＨ鎖及びＬ鎖の発現及び全体的なｍＡｂ発現の効率に影響を及ぼし得ることから、２つのＩｇ鎖発現単位が縦一列に並んでいる単一のベクターが作り出されている。これらのベクターは更に、Ｎｅｏr及びＤＨＦＲ発現カセットといったような優勢選択可能マーカーを担持している。検討のために、Ｇａｎｇｕｌｙ，Ｓ．ａｎｄ Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ＩＮ：Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．１９９９ ｂｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと。
Ｃｏｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８，６６２〜６６７）は、ＣＨＯ細胞中での非相同遺伝子の高レベル発現のためのＧＳ系を開発した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞内へのｃＤＮＡ（ｈＣＭＶプロモーターの転写制御下）及びＧＳミニ遺伝子（ＳＶ４０晩期プロモーターの制御下）を含む発現ベクターのＣＨＯ−Ｋ１細胞へのトランスフェクション（及びそれに続く２０ｍＭ〜５００ｍＭのＭＳＸでの選択）を用いて、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ系のものと比較可能な収率で本発明の抗体を発現するクローンを作成することができる。ＧＳ系についてはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．０ ２１６ ８４６、０ ２５６ ０５５、及び０ ３２３ ９９７、並びにＥｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．８９３０３９６４．４．に関連して、全体的に又は部分的に論述されている。
非限定例として、組み換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉は、例えば、誘導プロモーターを使用して、大量の組み換えタンパク質を提供するために使用され成功している。例えばＣｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：９５〜１１８（１９９９）及びその中で引用された参考文献を参照のこと。またトランスジェニックトウモロコシは、他の組み換え系において産生されるか、又は天然源から精製されるものと同等の生物活性で、商業生産レベルで哺乳類タンパク質を発現するために使用されている。例えばＨｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６４：１２７〜１４７（１９９９）及びその中で引用された参考文献を参照のこと。抗体はまた、トランスジェニック植物の種（タバコの種及びジャガイモ塊茎を含む）から大量に産生されており、これには、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体断片を含む抗体が含まれる。例えばＣｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１０１〜１０９（１９９８）及びその中で引用された参考文献を参照のこと。したがって、本発明の抗体は、周知の方法に基づいて、トランスジェニック植物を使用して生産することもできる。例えばＦｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：９９〜１０８（Ｏｃｔ．，１９９９）、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５２２〜７（１９９５）；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９：３４１〜６（１９９５）；Ｗｈｉｔｅｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２：９４０〜９４４（１９９４）；及びその中で引用された参考文献を参照のこと。同様に、抗体の植物発現について一般的には（ただし制限するものではないが）ＵＳ Ｐａｔ．Ｎｏ．５９５９１７７を参照のこと。上述の参考文献のそれぞれは参照により全体が本明細書に組み込まれる。
５．抗体の精製
抗ＭＣＰ−１抗体は、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない、周知の方法により、組換え細胞培養から、回収し精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に採用することもできる。例えばＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｏｒ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，（１９９７〜２００１），ｅ．ｇ．，Ｃｈａｐｔｅｒｓ １，４，６，８，９，１０を参照のこと。これらはそれぞれ参照により全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の抗体には、天然に精製された産物、化学合成手順の産物、及び例えば酵母、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞を含む真核生物宿主から組換え技術により生産された産物が含まれる。組み換え生産手順において選択される宿主に応じて、本発明の抗体は、グリコシル化又は非グリコシル化されていてもいなくてもよいが、グリコシル化されていることが好ましい。このような方法については数多くの標準的な実験室マニュアル、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ｓｕｐｒａ，Ｓｅｃｔｉｏｎｓ １７．３７〜１７．４２；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｓｕｐｒａ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ １０，１２，１３，１６，１８ ａｎｄ ２０、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｓｕｐｒａ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ １２〜１４の中で記載されている。これらはそれぞれ参照により全体が本明細書に組み込まれる。
６．発明の抗体
本発明の方法及び組成物において有用な抗ＭＣＰ−１抗体（抗ＣＣＬ−２抗体又はＭＣＰ−１抗体とも呼ばれる）は、所望により、ＭＣＰ−１に対する高い親和性結合、ＭＣＰ−１に対するきわめて特異的な結合、ＭＣＰ−１に関連する生物活性のうち１つ以上のものを阻害する能力、及び所望によりかつ好ましくは低い毒性を有すること、によって特徴づけられ得る。
本発明の抗体は、広範な親和性（ＫD）を持つヒトＭＣＰ−１を結合することができる。好適な実施形態においては、本発明の少なくとも１つのヒトｍＡｂは、ヒト組織因子と高い親和性で任意に結合することができる。例えば、ヒトｍＡｂは、ヒトＭＣＰ−１をＫDカ゛約１０-7Ｍ以下で、結合することができ、例えば０．１〜９．９（又はその中の任意の範囲又は値）×１０-7、１０-8、１０-9、１０-10、１０-11、１０-12、１０-13Ｍ、又はその中の任意の範囲又は値でこれらに限定されない。
ある抗原についてのある抗体の親和性又は結合活性は、任意の適切な方法を用いて実験的に決定可能である（例えば、Berzofsky,et al.,"Antibody-Antigen Interactions,"In Fundamental Immunology,Paul,W.E.,Ed.,Raven Press:New York,NY（1984）;Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and Company:New York,NY（1992）；及び本明細書中に記載されている方法を参照のこと）。特定の抗体抗原相互作用の測定される親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）下で測定される場合に異なり得る。よって、親和性及びその他の抗原結合パラメータ（例えばＫD、Ｋa、Ｋd）の測定は好ましくは、抗体及び抗原の標準化溶液、及び標準緩衝液、例えば本明細書中に記述された標準溶液及び緩衝液を用いて行われる。
本発明の単離された抗体は、任意の適切なポリヌクレオチドによってコードされた本明細書で開示されている抗体アミノ酸配列、又は任意の単離又は調製された抗体を含む。好ましくは、ヒト抗体又は抗原結合断片はヒトＭＣＰ−１と結合し、これにより、部分的又は実質的に、このタンパク質の少なくとも１つの生物活性を中和する。少なくとも１つのＭＣＰ−１タンパク質又は断片の少なくとも１つの生物活性を、部分的に又は好ましくは実質的に中和する抗体又はその特定された部分若しくはそれらの変異体は、このタンパク質又は断片を結合し、これによりＭＣＰ−１のＭＣＰ−１受容体に対する結合を通して、又はその他のＭＣＰ−１依存性又は媒介型機序を通して、媒介される活性を阻害することができる。本明細書で使用される「中和抗体」という用語は、アッセイに応じて約２０〜１２０％、好ましくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％又はそれ以上、ＭＣＰ−１依存活性を阻害できる抗体を意味する。ＭＣＰ−１依存性活性を阻害する抗ＭＣＰ−１抗体の能力は、好ましくは、本明細書に記載されているように及び／又は当該技術分野において既知のように、少なくとも１つの適切なＭＣＰ−１タンパク質又は受容体アッセイによって評価される。本発明のヒト抗体は、あらゆるクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど）又はイソタイプのものであり得、カッパ又はラムダ軽鎖を含み得る。１つの実施形態において、ヒト抗体はＩｇＧ重鎖又は画定された断片、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４などの少なくとも１つのイソタイプを含む。このタイプの抗体は、トランスジェニックマウス、又は、本明細書に記載されているかつ／又は当該技術分野において既知のような少なくとも１つのヒト軽鎖（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭ（例えばγ１、γ２、γ３、γ４））導入遺伝子を含むその他のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることによって調製可能である。別の実施形態において、抗ヒトＭＣＰ−１ヒト抗体はＩｇＧ１重鎖及びＩｇＧ１軽鎖を含む。
本発明の少なくとも１つの抗体は、少なくとも１つのＭＣＰ−１タンパク質、その断片、一部分又はそれらの任意の組合せに特異的な、少なくとも１つの特定されたエピトープと結合する。この少なくとも１つのエピトープは、タンパク質の少なくとも一部分を含む少なくとも１つの抗体結合領域を含むことが可能であり、このエピトープは好ましくは、配列番号１の隣接するアミノ酸の少なくとも１〜３個のアミノ酸から特定された部分全体で構成されている。
一般に、本発明のヒト抗体又は抗原結合断片は、少なくとも１つのヒト相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）又は少なくとも１つの重鎖可変領域の変異体及び少なくとも１つのヒト相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）又は少なくとも１つの軽鎖可変領域の変異体を含む抗原結合領域を含むようになる。制限的ではない例として、抗体又は抗原結合部分又は変異体は、配列番号９若しくは１２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、並びに／又は配列番号１５〜１７、２０若しくは２１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３のうちの、少なくとも１つを含み得る。特定の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、対応するＣＤＲ１、２及び／又は３（例えば配列番号６〜１２並びに／又は２２、２３及び２６）を有する少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）の少なくとも一部分を含む抗原結合領域を有することができる。別の特定の実施形態において、抗体又は抗原結合部分又は変異体は、対応するＣＤＲ１、２及び／又は３のアミノ酸配列（例えば配列番号１３〜２１及び／又は２４及び２５）を有する少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）の少なくとも一部分を含む抗原結合領域を有することができる。好ましい実施形態において、抗体又は抗原結合断片の３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲは、本明細書に記載されているように、Ｆａｂ ＭＯＲ０３３６、ＭＯＲ０３４６４、ＭＯＲ０３４６８、ＭＯＲ０３４７０、ＭＯＲ０３４７１、ＭＯＲ０３４７３、ＭＯＲ０３５４８のうちの少なくとも１つのものに対応するＣＤＲに由来するアミノ酸配列、及び、ＶＨ３抗体由来の重鎖フレームワーク領域（配列番号２）及びカッパ型抗体由来の軽鎖フレームワーク領域（配列番号４）を有する。このような抗体は、従来の技術を用いて抗体のさまざまな部分（ＣＤＲ及びフレームワーク）を化学的に連結させることによって、又は、組換えＤＮＡ技術の従来の技術を用いて抗体をコードする核酸分子を調製し発現させることによって、又は、その他の適切な任意の方法を用いることによって、調製可能である。
抗ＭＣＰ−１抗体は、フレームワーク領域内に画定されたアミノ酸配列を有する重鎖又は軽鎖可変領域のうちの少なくとも１つを含み得る。例えば、好ましい実施形態において、抗ＭＣＰ−１抗体は、所望により配列番号２又は３のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの重鎖可変領域、及び／又は、所望により配列番号４又は５のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの軽鎖可変領域のうち、少なくとも１つを含む。
抗体のクラス又はイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ）は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる定常領域によって付与される。ヒトＩｇＧクラスの中には、血清中に自然に存在する豊富さの順に命名されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４（最高のものから順に最低まで）という４つのサブクラス又はサブタイプが存在する。ＩｇＡ抗体は、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２という２つのサブクラスとして見出される。本明細書で使用するとき、用語「イソタイプスイッチング」も、ＩｇＧサブクラス又はサブタイプの間での変更を意味している。
本発明は更に、本明細書に記載されているアミノ酸配列と実質的に同じである配列内のアミノ酸を含む抗体、抗原結合断片、免疫グロブリン鎖及びＣＤＲにも関連する。好ましくは、このような鎖又はＣＤＲを含むこのような抗体又は抗原結合断片及び抗体は、高い親和性（例えばＫDが約１０-9Ｍ以下）で、ヒトＭＣＰ−１を結合することができる。本明細書に記載されている配列と実質的に同じであるアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換、並びにアミノ酸欠失及び／又は挿入を含む、配列を有する。保存的アミノ酸置換とは、第１のアミノ酸のものに類似した化学的及び／又は物理的特性（例えば電荷、構造、極性、疎水性／親水性）をもつ第２のアミノ酸で、第１のアミノ酸を置換することを意味する。保存的置換には、あるアミノ酸を、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）；アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ及びＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）及びグリシン（Ｇ）；Ｆ、Ｗ及びＹ；Ｃ、Ｓ及びＴという群の中の別のアミノ酸で置換することが含まれる。
本発明の抗ＭＣＰ−１抗体は、天然の突然変異又は人間による操作のいずれかに由来する、１つ以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を含み得る。この人間による操作は、本明細書で特定されている通り、あるいは、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．ＵＳ６８２８４２２で教示されている、ヒト生殖系列遺伝子配列に由来する配列類似性によりＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ２などとして称されるファミリーに分類され、かつカッパ又はラムダサブグループとして軽鎖により分類される可変領域についてのものである。これらの配列及び本発明において使用可能なその他の配列としては、表１に提示された立体配置が含まれるがこれらに限定されない。より詳しくは、ＰＣＴ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ０５／００５６０４の図１〜４２及びＵＳ １０／８７２，９３２（ｆｉｌｅｄ ０６／２１／２００４）に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。その参照された図１〜４２では、本明細書で教示されている通り、本発明のＩｇ由来タンパク質の中でその一部分を使用することのできる、重鎖及び軽鎖の可変及び定常ドメイン配列、フレームワーク、サブドメイン、領域、並びに置換の例を示す。
Figure 2011517548
当業者が行い得るアミノ酸置換の数は、上記のものを含む数多くの要因に基づく。一般的に言えば、所与の抗ＭＣＰ−１抗体、断片又は変異体について、そのアミノ酸置換、挿入又は欠失の数は、本明細書に記載されているように、例えば１〜３０又はその中の任意の範囲又は値といったように、４０、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１を超えない。
機能上不可欠である本発明の抗ＭＣＰ−１抗体内のアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニン走査突然変位誘発などの、当該技術分野において既知の方法により同定可能である（例えば、Ausubel, supra, Chapters 8,15; Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085（1989））。後者の手順は、分子内の全ての残基において単一アラニン突然変異を導入する。これにより結果として得られた突然変異分子が、例えば（ただしこれに制限されない）少なくとも１つのＭＣＰ−１中和活性などの生物活性について、次にテストされる。抗体結合にとってきわめて重要である部位もまた、結晶化、核磁気共鳴又は光親和性標識などの構造分析によって同定することができる（Smith, et al., J. Mol. Biol.224:899-904（1992）及びde Vos, et al., Science 255:306-312（1992））。
本発明の抗ＭＣＰ−１抗体は、少なくとも１つの配列番号２〜５及び２７〜２８の隣接アミノ酸のうち、５個ないし全てのアミノ酸から選択された、少なくとも１つの部分、配列又は組合せを含むが、これらに限定されない。
抗ＭＣＰ−１抗体は更に、所望により、少なくとも１つの配列番号２７及び２８のポリペプチドを含む。１つの実施形態において、免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列、又はその一部分は、抗ＭＣＰ−１抗体の結合特異性を変えない保存的置換を除いて、配列番号２７〜２８の少なくとも１つに対応する鎖のアミノ酸配列に対する約１００％の同一性を有する。例えば、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４又は５の配列と比較可能であり、あるいは、重鎖のアミノ酸配列は、配列番号２又は３と比較可能である。好ましくは、アミノ酸同一性は、当該技術分野で既知のように、適切なコンピュータアルゴリズムを用いて決定される。
当業者には明らかなように、本発明には、本発明の少なくとも１つの生物活性抗体が含まれている。生物活性抗体は、ネイティブ（非合成）、内因性又は関連する、及び既知の抗体のものの、少なくとも２０％、３０％、又は４０％、及び好ましくは少なくとも５０％、６０％、又は７０％、及び最も好ましくは少なくとも８０％、９０％又は９５％〜１０００％の比活性を有する。酵素活性及び基質特異性のアッセイ及び定量測定の方法は、当業者にとって周知であり、本明細書中に記載されている。
別の態様において、本発明は、有機部分の共有結合連結により修飾される、本明細書に記載されているような、ヒト抗体及び抗原結合断片に関するものである。このような修飾は、改善された薬物動態特性（例えば、増大した、生体内での血清半減期）を持つ抗体又は抗原結合断片を作成することができる。この有機部分は、直線状又は分岐した親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であり得る。特定の実施形態においては、親水性ポリマー基は、約８００〜約１２０，０００ダルトンの分子量を有し、ポリアルカングリコール（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマー又はポリビニルピロリドンであり得、脂肪酸又は脂肪酸エステル基は、約８〜約４０の炭素原子を含み得る。
本発明の修飾された抗体及び抗原結合断片は、直接又は間接的に抗体に共有結合される、１つ以上の有機部分を含み得る。本発明の抗体又は抗原結合断片に結合しているそれぞれの有機部分は、独立に、親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であり得る。本明細書で使用されている「脂肪酸」という用語は、モノカルボン酸及びジカルボン酸を包含する。本明細書で使用されている「親水性ポリマー基」という用語は、オクタンに対するよりも水に対する溶解度が高い有機ポリマーを意味する。例えばポリリシンは、オクタンに対するよりも水に対する溶解度が高い。よって、ポリリシンの共有結合付着により修飾された抗体が、本発明に包含されている。本発明の抗体を修飾するために適切な親水性ポリマーは、直線状又は分岐状であり得、例えば、ポリアルカングリコール類（例えばＰＥＧ、モノメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧなど）、炭水化物（例えばデキストラン、セルロース、オリゴ糖類、多糖類など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸塩など）、ポリアルカンオキシド類（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）、及びポリビニルピロリドンを含む。好ましくは、本発明の抗体を修飾する親水性ポリマーは、個別の分子体として、約８００〜約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えば、ＰＥＧ5000及びＰＥＧ20,000を使用することができ、ここで下付き文字はポリマーの平均分子量（ダルトン）である。親水性ポリマー基は、１〜約６個の、アルキル基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基と置換され得る。脂肪酸又は脂肪酸エステル基に置換された親水性ポリマーは、適切な方法を採用することによって調製することができる。例えば、アミン基を含むポリマーを、脂肪酸又は脂肪酸エステルのカルボン酸塩にカップリングさせることができ、脂肪酸又は脂肪酸エステル上の活性化カルボン酸塩（例えばＮ，Ｎ−カルボニルジイミダゾールで活性化されている）をポリマー上のヒドロキシル基にカップリングさせることができる。
本発明の抗体を修飾するのに適した脂肪酸及び脂肪酸エステルは飽和状態であり得、又は、１個以上の不飽和単位を含有し得る。本発明の抗体を修飾するために適切な脂肪酸は、例えば、ｎ−ドデカン酸（Ｃ12、ラウリン酸）、ｎ−テトラデカン酸（Ｃ14、ミリスチン酸）、ｎ−オクタデカン酸（Ｃ18、ステアリン酸）、ｎ−エイコ酸（Ｃ20、アラキジン酸）、ｎ−ドコサン酸（Ｃ22、ベヘン酸）、ｎ−トリアコンタノエート（Ｃ30）、ｎ−テトラコンタノエート（Ｃ40）、ｃｉｓ−Δ９−オクタデカノエート（Ｃ18、オレイン酸）、全てのｃｉｓ−Δ５、８、１１、１４−エイコサテトラエノエート（Ｃ20、アラキドン酸）、オクタンジオン酸、テトラデカンジオン酸、オクタデカンジオン酸、ドコサンジオン酸などを含む。適切な脂肪酸エステルは、直線状又は分岐状の低級アルキル基を含む、ジカルボキシル酸のモノエステルを有する。低級アルキル基は、１〜約１２個、好ましくは１〜約６個の炭素原子を含み得る。
修飾したヒト抗体及び抗原結合断片は、１つ以上の変性剤との反応など、適切な方法を使用して調製することができる。本明細書で使用されるとき、用語「修飾剤」は、活性化基を含む適切な有機基（例えば親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を意味する。「活性化基」とは、適切な条件下で第２の化学基と反応し、これにより修飾剤と第２の化学基の間に共有結合を形成することのできる、化学部分又は官能基である。例えば、アミン反応性活性化基は、トシル酸、メシル酸、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）などの求電子性基、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル（ＮＨＳ）などを含む。チオール類と反応できる活性化基は、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）などを含む。アルデヒド官能基は、アミン又はヒドラジド含有分子と結合することができ、アジド基は、三価リン基と反応して、ホスホルアミド化又はホスホルイミド結合を形成することができる。分子中に活性基を導入するための適切な方法が、当該技術分野において既知である（例えばHermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press:San Diego, CA（1996））。活性化基は、有機基（例えば親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に対して直接、又はリンカー部分（例えば二価のＣ1〜Ｃ12基、ここで１個以上の炭素原子を酸素、窒素若しくは硫黄などのヘテロ原子に置換可能）を介して、結合することができる。適切なリンカー部分としては例えば、テトラエチレングリコール、−（ＣＨ2）3−、−ＮＨ−（ＣＨ2）6−ＮＨ−、−（ＣＨ2）2−ＮＨ−及び−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−が挙げられる。リンカー部分を含む修飾剤は例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で、モノ−Ｂｏｃ−アルキルジアミン（例えばモノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン、モノ−Ｂｏｃ−ジアミノへキサン）を脂肪酸と反応させることにより、遊離アミンと脂肪酸カルボキシレートとの間のアミド結合を形成することによって、生成可能である。Ｂｏｃ保護基を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）処理により生成物から除去し、記載されているようにもう１つのカルボン酸塩にカップリングし得る一級アミンを露出させることができ、あるいは、これを無水マレイン酸と反応させ、結果として得られた生成物を環化させて脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成することができる。（例えばＴｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９２／１６２２１を参照。引用によりこの教示の全体が本明細書に組み込まれる。）
本発明の修飾抗体は、抗体又は抗原結合断片を変性剤と反応させることによって生産することができる。例えば、有機部分は、アミン反応性変性剤、例えば、ＰＥＧのＮＨＳエステルを採用することによって、非部位特異的方法で抗体に結合させることができる。抗体又は抗原結合断片のジスルフィド結合（例えば鎖内ジスルフィド結合）を還元することによって、修飾されたヒト抗体又は抗原結合断片を調製することもできる。このとき、還元された抗体又は抗原結合断片をチオール反応性修飾剤と反応させて、本発明の修飾された抗体を生産することが可能である。本発明の抗体の特異的部位に結合させられた有機部分を含む修飾ヒト抗体及び抗原結合断片を、逆タンパク質分解（Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153（1992）; Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417（1994）； Kumaran et al., Protein Sci. 6（10）: 2233-2241（1997）; Itoh et al., Bioorg. Chem., 24（1）: 59-68（1996）; Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56（4）: 456-463（1997））、及びＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）に記載されている方法のような、適切な方法を用いて調製することが可能である。
７．抗ＭＣＰ−１抗体に対する抗イディオタイプ抗体
モノクローナル又はキメラの抗ＭＣＰ−１抗体に加えて、本発明は、本発明のこのような抗体に特異的な抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体も目的としている。抗Ｉｄ抗体は、一般に、別の抗体の抗原結合領域と関連する、ユニークな決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄは、抗体又はそのＣＤＲ含有領域を伴うＩｄ抗体の供給源と同じ種及び遺伝子型（例えばマウス株）の動物を免疫化することによって調製可能である。免疫化された動物は、免疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識してこれに反応し、抗Ｉｄ抗体を産生する。抗Ｉｄ抗体は同様に、更に別の動物において免疫反応を誘導し、いわゆる抗−抗−Ｉｄ抗体を産生するための「免疫原」としても使用可能である。
８．更なる治療活性成分を含む抗体組成物
組成物は、所望により更に、皮膚病薬、抗炎症薬、鎮痛剤、腎臓作用薬（例えばアンギオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）又はアンタゴニスト）、抗感染症薬、心臓血管（ＣＶ）系作用薬、中枢神経系（ＣＮＳ）薬、自律神経系（ＡＮＳ）薬、呼吸管薬、消化（ＧＩ）管作用薬、ホルモン薬、体液又は電解質平衡作用薬、血液製剤、抗新生物薬、免疫調節薬、眼用、耳用又は鼻用薬、局所作用薬、栄養薬などのうち、少なくとも１つから選択された少なくとも１つの化合物又はタンパク質を有効量含むことができる。このような薬物は、それぞれについて本明細書で提示されている処方、適応症、用量決定及び投与方法を含め、当該技術分野において周知のものである（例えば、Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional’s Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ; Pharmcotherapy Handbook, Wells et al., ed., Appleton & Lange, Stamford, CT，を参照のこと。これらはそれぞれ参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
本発明の抗ＭＣＰ−１抗体組成物は更に、組成物又は薬学的組成物を任意の適切な量及び有効量のうちの少なくとも１つを含み得て、これには、改変、治療又は療法を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に対する少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体が含まれる。これには所望により、次のものから選択された少なくとも１つのものが更に含まれる：少なくとも１つのＴＮＦアンタゴニスト（例えば制限するものではないが、ＴＮＦ化学物質又はタンパク質アンタゴニスト、ＴＮＦモノクローナル又はポリクローナル抗体又は断片、可溶性ＴＮＦ受容体（例えばｐ５５、ｐ７０又はｐ８５）又はその断片、融合ポリペプチド、又は小分子ＴＮＦアンタゴニスト、例えばＴＮＦ結合タンパク質Ｉ又はＩＩ（ＴＢＰ−１又はＴＢＰ−ＩＩ）、ネレリモンマブ（nerelimonmab）、インフリキシマブ、エンテラセプト（enteracept）、ＣＤＰ−５７１、ＣＤＰ−８７０、アフェリモマブ、レネルセプトなど）、抗リウマチ剤（例えばメトトレキサート、オーラノフィン、オーロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサラジン）、筋肉弛緩剤、睡眠薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔剤、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌剤（例えばアミノグリコシド、抗真菌薬、駆虫薬、抗ウイルス薬、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、その他の抗菌剤）、乾癬治療薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、糖尿病関連作用剤、ミネラル、栄養薬、甲状腺作用剤、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉薬、鎮咳薬、制吐薬、抗潰瘍薬、便秘薬、抗凝血剤、エリスロポエチン（例えば、エポエチンアルファ）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ニューポジェン）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、ロイキン（Leukine））、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）作用薬、抗線維症剤、予防接種、免疫グロブリン、免疫抑制薬（例えばバシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体調節物質、散瞳薬、調節麻痺剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、分裂抑制剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経刺激薬、興奮剤、ドネペジル、タクリン、喘息治療薬、ベータアゴニスト、吸引ステロイド薬、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリン又は類似体、ドルナーゼアルファ（パルモザイム）、サイトカイン又はサイトカインアンタゴニスト。このようなサイトカインの、非制限的な例としては、ＩＬ−１〜ＩＬ−２９のいずれかが含まれ、これらに限定されない。適切な投与量は、当該技術分野において周知である。例えばＷｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２nd Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ（２０００）；ＰＤＲ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｏｃｋｅｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ２０００，Ｄｅｌｕｘｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ Ｌｉｎｄａ，ＣＡ（２０００）を参照のこと。これらはそれぞれ、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
このような抗癌剤又は抗感染薬はまた、本発明の少なくとも１つの抗体に関連、結合、同時処方、又は同時投与される毒素分子も含むことができる。毒素は任意に作用して、病原性細胞又は組織を選択的に死滅させることができる。病原細胞は、癌細胞又は他の細胞であり得る。このような毒素は、限定されないが、例えば、リシン、ジフテリア毒、ヘビ毒、又は細菌毒の少なくとも１つから選択される、毒素の少なくとも１つの機能的細胞毒性ドメインを含む、精製又は組み換え毒素又は毒素断片であり得る。毒素という用語は、ヒト及び他の哺乳類において、死に至り得る毒素性ショックを含む、任意の病原状態をもたらし得る任意の自然発生する突然変異若しくは組み換え細菌又はウイルスによって産生される内毒素及び外毒素のいずれも含む。このような毒素には、腸毒素産生の熱に不安定な大腸菌エンテロトキシン（ＬＴ）、熱安定エンテロトキシン（ＳＴ）、赤痢菌細胞毒素、アエロモナス属エンテロトキシン、中毒性ショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１）、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、Ｂ（ＳＥＢ）、又はＣ（ＳＥＣ）、連鎖球菌エンテロトキシンなどを含み得るが、これらに限定されない。かかる細菌は、エンテロトキシン大腸菌（ＥＴＥＣ）種、腸管出血性大腸菌（例えばセロタイプ０１５７：Ｈ７の株）、ブドウ球菌種（例えば黄色ブドウ球菌、化膿ブドウ球菌）、赤痢菌種（例えばShigella dysenteriae、 Shigella flexneri、 Shigella boydii、及びShigella sonnei）、サルモネラ種（例えばSalmonella typhi、 Salmonella cholera-suis、サルモネラ腸炎）、クロストリジウム種（例えばClostridium perfringen、 Clostridium dificile、 Clostridium botulinum）、カンプロバクター種（例えばCamphlobacter jejuni、Camphlobacter fetus）、ヘリコバクター種（例えばHeliobacter pylori）、アエロモナス種（例えばAeromonas sobria、 Aeromonas hydrophila、 Aeromonas caviae）、Ｐｌｅｉｓｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅ、エルシニア腸コリティカ、ビブリオ種（例えば、コレラ菌、ビブリオ属）、クレブシエラ種、緑膿菌、及び連鎖球菌の株を含み、これらに限定されない。例えば、Ｓｔｅｉｎ，ｅｄ．，ＩＮＴＥＲＮＡＬ ＭＥＤＩＣＩＮＥ，３ｒｄ ｅｄ．，ｐｐ １−１３，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，（１９９０）；Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎｓ：Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ，２ｄ．Ｅｄ．，ｐｐ ２３９〜２５４，Ｐｌｅｎｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｍａｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３ｄ．Ｅｄ．，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）；Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．，Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９９２；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７６：１２１〜１３４（１９９１）；Ｍａｒｒａｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：７０５〜７１１（１９９０）を参照のこと。参照により、これらの内容は全て本明細書に組み込まれる。
本発明の抗ＭＣＰ−１抗体化合物、組成物又は組合せは更に、希釈剤、バインダー、安定剤、緩衝液、塩、親油性溶媒、防腐剤、アジュバントなどのような（ただしこれらに限定されない）任意の適切な補助剤のうちの少なくとも１つを含み得る。製薬上許容できる助剤が好ましい。このような無菌溶液の、非制限的な例及びその調製方法は、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８th Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）１９９０などのように（ただしこれらに限定されない）、当該技術分野において周知である。当該技術分野において周知のように、又は本明細書に記載されているように、抗ＭＣＰ−１抗体、断片又は変異体組成物の投与様式、溶解度及び／又は安定性に適した製薬上許容できる担体を、日常的に選択することができる。
本組成物において有用な医薬賦形剤及び添加剤には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、及び炭水化物（例えば、糖には、単糖類、二糖類、三糖類、四糖類、及びオリゴ糖などの糖；アルジトール、アルドン酸、エステル化糖などの誘導化糖類、及び多糖類又は糖ポリマーが挙げられる）を含み、これらに限定されず、単独又は組み合わせで存在することができ、単独、又は１〜９９．９９重量％又は体積％での組み合わせを含む。典型的なタンパク質賦形剤には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清アルブミン、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼイン及び同様物が挙げられる。緩衝能においても機能し得る代表的なアミノ酸／抗体構成要素には、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテーム及び同様物などを含む。好ましいアミノ酸の１つはグリシンである。
本発明における使用に適した炭水化物賦形剤には、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖類、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖類、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどの多糖類、及びマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、ミオイノシトールなどのアルジトール類を含む。本発明における使用に適した炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロース、及びラフィノースである。
抗ＭＣＰ−１抗体組成物は、緩衝液又はｐＨ調整剤も含み得る。典型的には、緩衝液は有機酸又は塩基から調製された塩である。代表的な緩衝剤には、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、又はフタル酸の塩などの有機酸塩；トリス、塩酸トロメタミン、又はリン酸緩衝剤が挙げられる。本組成物における使用に適した緩衝剤は、クエン酸などの有機酸塩である。
更に、本発明の抗ＭＣＰ−１抗体組成物は、ポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン類）、ポリエチレングリコール、着香剤、抗菌剤、甘味料、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤（例えば「ＴＷＥＥＮ ２０」及び「ＴＷＥＥＮ ８０」などのポリソルベート類）、脂質（例えばリン脂質、脂肪酸）、ステロイド類（例えばコレステロール）、及びキレート剤（例えばＥＤＴＡ）などのポリマー賦形剤／添加剤を含むことができる。
本発明による抗ＭＣＰ−１抗体、部分又は変異体組成物における使用に適するこれら及び追加の周知の医薬賦形剤及び／又は添加剤は、当該技術分野において既知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」，１９th ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５）、及び「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」，５２nd ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ（１９９８）に一覧記載されている。これらの開示は、参照によって全体が本明細書に組み込まれる。好適な担体又は賦形剤材料は、炭水化物（例えば単糖類及びアルジトール類）及び緩衝剤（例えばクエン酸）又はポリマー剤である。
９．処方物
上述の通り、本発明は、製薬上許容できる処方物中に少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を含む、薬学又は獣医学での使用に適した安定した処方物を提供する。
上述の通り、本発明は、包装材及び所望により水性希釈剤中の規定の緩衝液及び／又は防腐剤を伴う少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体の溶液を含む少なくとも１つのバイアルを含む製造品を提供し、前記包装材は、このような溶液を１、２、３、４、５、６、９、１２、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、５４、６０、６６、７２時間以上の期間にわたり保持できることを記したラベルを含む。本発明は、包装材、凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を含む第１のバイアル、及び処方された緩衝剤又は保存剤の水性希釈剤を含む第２のバイアルを含む、製造製品を更に含み、前記包装材は、水溶性希釈剤中の少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を再構成して、２４時間以上の期間にわたって保持できる溶液を形成するように患者に指示するラベルを含む。
本発明の生産物における少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体の範囲は、再構成時に生産する量、湿／乾システムの場合には、約１．０μｇ／ｍＬ〜約１０００ｍｇ／ｍＬの濃度を含むが、これより低い濃度及び高い濃度が実施可能であり、意図される送達ビヒクルに依存する。例えば溶液製剤は、経皮パッチ、肺、経粘膜、又は浸透圧性若しくはマイクロポンプ方法とは異なる。
水性希釈剤は所望により、更に、製薬上許容できる防腐剤を含む。好ましい防腐剤には、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ジヒドロ酢酸ナトリウム、及びチメロサール、又はそれらの混合物からなる群から選択されるものが含まれる。処方中で使用される防腐剤の濃度は、抗菌効果を生み出すのに十分な濃度である。この濃度は選択された防腐剤に基づき、当業者により容易に決定される。
他の賦形剤、例えば、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、保存剤エンハンサーは、所望により、かつ好ましいものとして希釈剤に添加することができる。グリセリンなどの等張性剤が、既知の濃度で一般に使用される。好ましくは、生理学的に許容される緩衝剤を添加して、改善されたｐＨ制御を提供する。処方物は、約ｐＨ４〜約ｐＨ１０、及び好ましくは約ｐＨ５〜約ｐＨ９の範囲、及び最も好ましくは約６．０〜約８．０の、広範囲のｐＨ範囲をカバーし得る。好ましくは、本発明の処方物は約６．８〜約７．８の間のｐＨを有する。好ましい緩衝液には、リン酸緩衝液、最も好ましくはリン酸ナトリウム、特にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。
他の添加剤、例えばＴｗｅｅｎ ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）、並びにＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの、製薬上許容できる可溶化剤、又は、ポリソルベート２０若しくは８０又はポロキサマー１８４若しくは１８８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリルなどの非イオン性界面活性剤、その他のブロックコポリマー、並びにＥＤＴＡ及びＥＧＴＡなどのキレート剤を、任意に製剤又は組成物に凝集を低減するために添加することができる。これらの添加物は、処方物を投与するためにポンプ又はプラスチック容器が使用される場合に特に有用である。製薬上許容できる界面活性剤の存在により、タンパク質の凝集の傾向が軽減される。
本発明の処方物は、所望の濃度でタンパク質を提供するのに充分な量で、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体及び緩衝溶液を混合する工程を含むプロセスによって調製され得る。当業者は、このプロセスの変化形態を認識し得る。例えば、構成要素の添加順序、付加的な添加剤を使用するか否か、処方物が調製される濃度及びｐＨは、全て、使用する投与濃度及び手段について最適化され得る因子である。
本発明で請求される処方物は、溶液として、あるいは、水、防腐剤、及び／又は賦形剤、好ましくはリン酸緩衝液及び／又は生理食塩水、及び選択された塩を水溶性希釈剤内に含む第２のバイアルで再構成される、少なくとも１つの凍結乾燥した抗ＭＣＰ−１抗体のバイアルを含む、二重バイアルとして、患者に提供することができる。単一溶液バイアル又は再構成を必要とする二重バイアルのいずれかを複数回再利用することができ、更に、患者治療の単一又は複数サイクルを満たすことができ、したがって、現在使用できるよりも多くの便宜的な治療レジメンを提供することができる。
請求される本製造品は、即時から、２４時間以上の期間にわたる投与に有用である。したがって、今回請求される製造品は、患者に著しい利益を提供する。本発明の製剤は、約２〜約４０℃の温度で、任意で安全に保管し、長期間タンパク質の生物活性を保持することができ、したがってパッケージラベルは、溶液が６、１２、１８、２４、３６、４８、７２、又は９６時間以上にわたって保持及び／又は使用され得ることを示すことができる。保存希釈剤が使用される場合には、このようなラベルに最高１〜１２ヵ月、半年、１年半及び／又は２年までの使用を含むことができる。
請求される製品は、透明溶液、あるいは、水性希釈剤を収容している第２のバイアルを用いて再構成される凍結乾燥した少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体のバイアルを含む二重バイアルを、薬局、診療所又はその他のこのような機関及び施設に提供することによって、患者に対し間接的に提供され得る。この場合、透明溶液は最高１リットル又は更にはそれ以上のサイズであり、大きなタンクが提供され、そこから薬局又は診療所が、少なくとも１つの抗体溶液のより小さい部分を１回又は多数回取り出してより小さなバイアルに移し、顧客及び／又は患者に提供する。
これらのシングルバイアルシステムを含む認定されたデバイスとしては、例えばＢＤ Ｐｅｎｓ、ＢＤ Ａｕｔｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｈｕｍａｊｅｃｔ（登録商標）、ＮｏｖｏＰｅｎ（登録商標）、Ｂ−Ｄ（登録商標）Ｐｅｎ、ＡｕｔｏＰｅｎ（登録商標）、及びａｎｄ ＯｐｔｉＰｅｎ（登録商標）、ＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎＰｅｎ（登録商標）、Ｇｅｎｏｔｒｏｎｏｒｍ Ｐｅｎ（登録商標）、Ｈｕｍａｔｒｏ Ｐｅｎ（登録商標）、Ｒｅｃｏ−Ｐｅｎ（登録商標）、Ｒｏｆｅｒｏｎ Ｐｅｎ（登録商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｉｊｅｃｔ（登録商標）、Ｊ−ｔｉｐ Ｎｅｅｄｌｅ−Ｆｒｅｅ Ｉｎｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｉｎｔｒａｊｅｃｔ（登録商標）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ（登録商標）、などの溶液の送達用ペンインジェクタデバイスが挙げられる。これらはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｅｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ｗｗｗ．ｂｅｃｔｏｎｄｉｃｋｅｎｓｏｎ．ｃｏｍ）、Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ（Ｂｕｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，ｗｗｗ．ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ．ｃｏｍ；Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ（ｗｗｗ．ｂｉｏｊｅｃｔ．ｃｏｍ）；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｅｓｔｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ，ｗｗｗ．ｗｅｓｔｏｎ−ｍｅｄｉｃａｌ．ｃｏｍ）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ Ｃｏｒｐ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ｗｗｗ．ｍｅｄｉｊｅｃｔ．ｃｏｍ）によって製造又は開発されたものである。二重バイアルシステムを含む認定されたデバイスとしては、例えばＨｕｍａｔｒｏ Ｐｅｎ（登録商標）などの、再構築された溶液の送達用のカートリッジの中で凍結乾燥された薬物を再構築するための、ペン型インジェクタが挙げられる。
今回請求される製品は、包装材を含む。包装材は、規制当局によって必要とされる情報に加えて、製品を使用できる条件を提供する。本発明の包装材は、患者に、水溶性希釈剤中の少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を再構成し溶液を形成する、及び２つのバイアル湿／乾製品の場合には、２〜２４時間にわたって溶液を使用する、という指示を提供する。単一バイアルの溶液製品の場合、ラベルは、このような溶媒を２〜２４時間以上にわたって使用できることを示す。今回請求される製品は、ヒト医薬製品使用に有用である。
抗ＭＣＰ−１抗体を安定化するその他の処方物又は方法は結果として、前記抗体を含む凍結乾燥粉末の透明な溶液以外のものをもたらし得る。非透明溶液としては、微粒子懸濁液を含む処方物があり、このような微粒子は、ミクロスフェア、微小粒子、ナノ粒子、ナノスフェア又はリポソームなどのさまざまな形で知られる、寸法可変の構造内に、抗ＭＣＲ−１抗体を含有する組成物である。活性薬剤を含有するこのような比較的均質で基本的に球形の微粒子処方物は、Ｕ．Ｓ．４，５８９，３３０で教示されている、活性剤及びポリマーを含有する水相と、非水相とを接触させ、その後非水相を蒸発させて水相からの粒子の融合をひき起こすことによって形成可能である。活性剤及び、連続溶媒中に分散したポリマー、を含有する第１の相を用い、Ｕ．Ｓ．４，８１８，５４２に教示されているような凍結乾燥又は希釈−抽出−沈殿により、懸濁液から前記溶媒を除去することで多孔質微小粒子を調製することができる。このような調製物のための好ましいポリマーは、ゼラチン、寒天、でんぷん、アラビノガラクタン、アルブミン、コラーゲン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコリド−Ｌ（−）ラクチドポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（ε−カプロラクトン−ＣＯ−乳酸）、ポリ（ε−カプロラクトン−ＣＯ−グリコール酸）、ポリ（β−ヒドロキシ酪酸）、酸化ポリエチレン、ポリエチレンン、ポリ（アルキル−２−シアノアクリレート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリアミド、ポリ（アミノ酸）、ポリ（２−ヒドロキシエチルＤＬ−アスパルトアミド）、ポリ（エステル尿素）、ポリ（Ｌ−フェニルアラニン／エチレングリコール／１，６−ジイソシアナートへキサン）及びポリ（メチルメタクリレート）からなる群から選択された、天然又は合成のコポリマー又はポリマーである。特に好ましいポリマーは、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコリド−Ｌ（−）ラクチドポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（ε−カプロラクトン−ＣＯ−乳酸）、及びポリ（ε−カプロラクトン−ＣＯ−グリコール酸）などのポリエステルである。ポリマー及び／又は活性剤を溶解させるのに有用な溶媒としては水、ヘキサフルオロイソプロパノール、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、へキサン、ベンゼン、又はヘキサフルオロアセトンセスキ水和物がある。第二相で活性薬剤含有相を分散させるプロセスには、ノズル内のオリフィスに前記第一相を圧力で強制的に通過させて液滴形成に作用する工程を含むことができる。
乾燥粉末処方物は、例えば水性又は非水性溶媒を除去するための１つ以上の工程が後続する、結晶質組成物の沈殿あるいは蒸発による溶媒抽出又は噴霧乾燥、凍結乾燥以外のプロセスの結果として得ることもできる。噴霧乾燥された抗体調製物の調製は、Ｕ．Ｓ．６，０１９，９６８で教示されている。抗体ベースの乾燥粉末組成物は、抗体の溶液又はスラリー、及び所望により、呼吸用乾燥粉末を提供するための条件下で賦形剤を溶媒中で噴霧乾燥させることによって生産可能である。溶媒には、容易に乾燥可能な、例えば水及びエタノールなどの極性化合物を含むことができる。抗体安定性は、例えば窒素ブランケット下において、又は乾燥用気体として窒素を使用することによって、酸素不在下での噴霧乾燥手順を実施することで増強させることができる。別の比較的乾燥した処方物は、ＷＯ ９９１６４１９中で教示されているようなヒドロフルオロアルカン噴射剤を標準的に含む懸濁培地中に分散した、複数の有孔微細構造の分散である。安定化された分散は、定量吸入器を用いて患者の肺に投与できる。噴霧乾燥された薬剤の商業的製造において有用な機器は、Ｂｕｃｈｉ Ｌｔｄ．又はＮｉｒｏ Ｃｏｒｐ．により製造されている。
本明細書に記載される、安定製剤又は保存製剤、あるいは溶液の、いずれかにおける抗−ＭＣＰ−１抗体は、本発明に従って、多様な送達経路及びＳＣ又はＩＭ注射、経皮、肺、経粘膜、移植、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、あるいは当業者に理解される他の手段を含む方法を介して、当該技術分野において周知のように、患者に投与することができる。
１０．治療適用
本発明はまた、本発明の少なくとも１つのＭＣＰ−１抗体を用いて、当該技術分野において既知のように、又は本明細書に記載されているように、細胞、組織、器官、動物、又は患者における少なくとも１つのＭＣＰ−１関連疾患を調節するか又は治療するための方法をも提供している。本発明は更に、悪性疾患、代謝性疾患、免疫又は炎症関連疾患、心臓血管疾患、感染性疾患又は神経系疾患を含み（ただしこれらに限定されない）、細胞、組織、器官、動物又は患者における少なくとも１つのＭＣＰ−１関連疾患を調節させるか又は治療するための方法をも提供している。
このような疾患は、細胞接着及び／又は血管形成により媒介される疾病又は疾患から選択されるが、これらに限定されない。このような疾病若しくは疾患には、免疫障害若しくは疾患、心臓血管障害又は疾患、感染性、悪性及び／若しくは神経系障害若しくは疾患、又はその他の既知の若しくは特定されたＭＣＰ−１関連疾患が含まれる。特に、抗体は、血管形成が関与する疾病例えば眼疾患及び腫瘍性疾患、再狭窄などの組織再形成及びある種の細胞型の増殖、特に上皮及び扁平上皮細胞癌の治療に有用である。特定の適応症としては、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、癌転位、関節リウマチ、糖尿病性網膜症及び黄斑変性症の治療における使用が含まれる。本発明の中和抗体は更に、例えば骨粗鬆症において見られる、又は一部の腫瘍によるＰＴＨｒＰ過剰発現の結果生じる、望ましくない骨吸収又は骨分解の予防又は治療にも有用である。抗体はまた、特発性肺線維症、糖尿病性腎症、肝炎、及び肝硬変といったさまざまな線維症の治療においても有用であり得る。
よって、本発明は、当該技術分野において既知のように、又は本明細書に記載されているように、本発明の少なくとも１つのＭＣＰ−１抗体を用いて、細胞、組織、器官、動物、又は患者における少なくとも１つのＭＣＰ−１関連疾患を調節又は治療するための方法を提供している。特別な指摘については以下に論述する：
肺疾患
本発明は更に、肺炎；肺膿瘍；粉塵、ガス又は飛沫の形をした作用物質を原因とする職業性肺疾患；喘息、閉塞性繊維性細気管支炎、呼吸不全、過敏性肺炎（外因性アレルギー性肺胞炎）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、及び薬物反応を含む肺の過敏性疾患；成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、グッドパスチャー症候群、慢性閉塞性気道疾患（ＣＯＰＤ）、特発性間質性肺疾患、例えば特発性肺線維症及びサルコイドーシス、剥離性間質性肺炎、急性間質性肺炎、呼吸細気管支炎関連間質性肺疾患、気質性肺炎を伴う特発性閉塞性細気管支炎、リンパ球性間質性肺炎、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、特発性肺ヘモジデリン沈着症；急性気管支炎、肺胞タンパク症、気管支拡張症、胸膜疾患、無気肺、嚢胞性線維症、及び肺腫瘍、及び肺栓塞症のうちの少なくとも１つを含む（ただしこれらに限定されない）、細胞、組織、器官、動物、又は患者における少なくとも１つの悪性疾患を調節又は治療するための方法をも提供している。
悪性疾患
本発明はまた、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞又はＦＡＢ ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、直腸結腸癌、膵臓癌、腎細胞癌、乳癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、悪性の腫瘍随伴症候群／高カルシウム血症、固形腫瘍、腺癌、扁平上皮細胞癌、肉腫、悪性黒色腫、特に転移性黒色腫、血管腫、転移性疾患、癌関連骨吸収、及び癌関連骨痛などのうちの少なくとも１つを含む（ただしこれらに限定されない）、細胞、組織、器官、動物、又は患者における少なくとも１つの悪性疾患を調節又は治療するための方法をも提供している。
免疫関連疾患
本発明は同様に関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身発症性若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、胃潰瘍、血清反応陰性関節症、変形性関節症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、全身性紅斑性狼瘡、抗リン脂質抗体症候群、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、特発性肺線維症、全身性血管炎／ウェゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、精巣炎／精管切除後再疎通術、アレルギー性／アトピー性疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎、移植、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病、全身性炎症反応症候群、敗血症候群、グラム陽性菌敗血症、グラム陰性菌敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、好中球減少性発熱、尿路性敗血症、髄膜炎菌血症、外傷／出血、火傷、電離放射線曝露、急性膵炎、成人呼吸窮迫症候群、関節リウマチ、アルコール性肝炎、慢性炎症性病理、サルコイドーシス、クローン病、鎌状赤血球貧血、糖尿病、ネフローゼ、アトピー性疾患、過敏反応、アレルギー性鼻炎、花粉症、通年性鼻炎、結膜炎、子宮内膜症、喘息、蕁麻疹、全身性アナフィラキシー、皮膚炎、悪性貧血、溶血性疾患、血小板減少症、任意の臓器又は組織の移植片拒絶反応、腎臓移植拒絶反応、心臓移植拒絶反応、肝臓移植拒絶反応、膵臓移植拒絶反応、肺移植拒絶反応、骨髄移植片（ＢＭＴ）拒絶反応、皮膚同種移植片拒絶反応、軟骨移植片拒絶反応、骨移植片拒絶反応、小大腸移植片拒絶反応、胎児胸腺移植片拒絶反応、副甲状腺移植片拒絶反応、任意の臓器又は組織の異種移植片拒絶反応、同種移植片拒絶反応、抗受容体過敏性反応、グレーブス（バセドウ）病、レイノー病、Ｂ型インスリン抵抗性糖尿病、喘息、重症筋無力症、抗体媒介性細胞毒性、ＩＩＩ型過敏反応、全身性紅斑性狼瘡、ＰＯＥＭＳ症候群（多発性ニューロパシー、臓器肥大、内分泌傷害、モノクローナル高ガンマグロブリン血症及び皮膚変化症候群）、多発性ニューロパシー、臓器肥大、内分泌傷害、モノクローナル高ガン強皮症マグロブリン血症、皮膚変化症候群、抗リン脂質抗体症候群、天疱瘡、混合結合組織病、特発性アディソン病、真性糖尿病、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、白斑、血管炎、ＭＩ後心臓切開症候群、ＩＶ型過敏性、接触皮膚炎、過敏性肺炎、同種移植片拒絶反応、細胞内生物に起因する肉芽種、薬物感度、代謝性／特発性、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、α−１−アンチトリプシン欠損症、糖尿病性網膜症、橋本甲状腺炎、骨粗鬆症、視床下部−下垂体−副腎軸評価、原発性胆汁性肝硬変、甲状腺炎、脳脊髄炎、悪液質、嚢胞性線維症、新生児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、家族性血球貪食性リンパ組織球増殖症、皮膚病状態、乾癬、脱毛症、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、急性腎臓不全、血液透析、尿毒症、毒性、子癇前症、ＯＫＴ３療法、抗ＣＤ３療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法（例えば、無力症、貧血、悪液質などが含まれこれらに限定されない）、慢性サリチル酸中毒などのうちの少なくとも１つを含む（ただしこれらに限定されない）、細胞、組織、器官、動物、又は患者における少なくとも１つの免疫関連疾患を調節又は治療するための方法をも提供している。例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，１２ｔｈ〜１７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ（１９７２，１９７７，１９８２，１９８７，１９９２，１９９９），Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．（１９９８，２０００）を参照されたい。それぞれ参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
心臓血管疾患
本発明は更に、心筋気絶症候群、心筋梗塞、うっ血性心不全、脳卒中、虚血性脳卒中、出血、動脈硬化症、アテローム硬化症、再狭窄、糖尿病性アテローム硬化疾患、高血圧、動脈性高血圧、腎血管性高血圧、失神、ショック、心臓血管系の梅毒、心不全、肺性心、原発性肺高血圧、心臓不整脈、心房異所性拍動、心房粗動、心房細動（持続性又は発作性）、潅流後症候群、心肺バイパス炎症性反応、無秩序又は多病巣性の心房性頻脈、規則的狭ＱＲＳ頻脈、特異的不整脈、心室細動、ヒス束不整脈、房室ブロック、脚ブロック、心筋虚血性疾患、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、心筋症、拡張型うっ血性心筋症、拘束型心筋症、心臓弁膜症、心内膜炎、心膜疾患、心臓腫瘍、大動脈及び末梢大動脈瘤、大動脈解離、大動脈の炎症、腹大動脈及びその分岐部の閉塞、末梢血管障害、閉塞性動脈障害、末梢アテローム硬化疾患、閉塞性血栓血管炎、末梢動脈機能障害、レイノー現象及び疾患、肢端チアノーゼ、肢端紅痛症、静脈疾患、静脈血栓症、静脈瘤、動静脈瘻、リンパ水腫、脂肪性浮腫、不安定狭心症、再潅流傷害、ポストポンプ症候群、虚血性再潅流傷害などのうちの少なくとも１つを含む（ただしこれらに限定されない）、細胞、組織、器官、動物、又は患者における少なくとも１つの心臓血管疾患を調節又は治療するための方法をも提供している。このような方法は、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を、かかる制御、治療又は療法を必要とする、細胞、組織、器官、動物、又は患者に対して投与する工程を、所望により含むことができる。
神経系疾患
本発明は更に、神経変性疾患、多発性硬化症、片頭痛、エイズによる認知症、脱髄疾患、例えば多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎；錐体外路及び小脳疾患、例えば皮質脊髄系の病変；基底核の疾患又は小脳疾患；多動性障害、例えばハンチントン舞踏病及び老年舞踏病；薬物誘発型運動障害、例えばＣＮＳドーパミン受容体をブロックする薬剤によって誘発されるもの；運動減退障害、例えばパーキンソン病；進行性核上性麻痺；小脳の構造的病変；脊柱小脳変性、例えば脊髄性運動失調症、フリードライヒ失調症、小脳皮質変性、多系統変性症（メンセル、デジェリン・トーマス、シャイ・ドレガー、及びマチャド・ジョセフ）；全身性疾患（レフサム病、無βリポタンパク血症、運動失調、毛細血管拡張症及びミトコンドリア多系統疾患）；脱髄性コア障害、例えば多発性硬化症、急性横断性脊髄炎；及び運動単位、例えば脊髄性筋萎縮症（前角細胞変性、例えば萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症及び若年性脊髄性筋萎縮症）；アルツハイマー病；中年期ダウン症候群；びまん性レビー小体病；レビー小体型の老年性認知症；ウェルニッケ・コルサコフ症候群；慢性アルコール中毒；クロイツフェルト・ヤコブ病；亜急性硬化性全脳炎、ハレルフォルデン・スパッツ病；及びボクサー認知症などのうちの少なくとも１つを含む（ただしこれらに限定されない）、細胞、組織、器官、動物、又は患者における少なくとも１つの神経系疾患を調節又は治療するための方法をも提供している。所望により、少なくとも１つのＴＮＦ抗体又は特定部分又は変異体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を、このような調節、治療又は療法を必要としている細胞、組織、器官、動物、又は患者に対し投与する工程を含むことができる。例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，１６th Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ（１９９２）を参照のこと。
線維性疾患
上述の疾患及び疾病に加えて、本発明はまた、肝臓線維症（アルコール性肝硬変、ウイルス性肝硬変、自己免疫性肝炎を含むがこれらに限定されない）；肺線維症（強皮症、特発性肺線維症を含むがこれらに限定されない）；腎臓線維症（強皮症、糖尿病性腎炎、糸球体腎炎、ループス腎炎を含むがこれらに限定されない）；皮膚線維症（強皮症、肥厚性及びケロイド瘢痕、火傷を含むがこれらに限定されない）；骨髄線維症；神経線維腫症；線維腫；腸線維症；及び外科手術の結果としての線維化付着といったようなさまざまな病因の線維性疾患を調節又は治療するための方法をも提供している。
本発明は更に、胸部、腹部、頭蓋又は口腔外科手術を含む外科手術に付随する肉体的損傷又は外傷のうちの少なくとも１つを含み（ただしこれらに限定されない）、又は創傷が非感染創、挫傷、切創、裂創、非穿通創、開放創、穿通創、穿孔創、穿刺創、感染創、栓塞及び皮下創からなる群から選択されている、又は創傷が虚血性潰瘍、辱瘡、瘻孔、重度の咬傷、熱傷及び採取部位創からなる群から選択されている、又は創傷がアフタ創、外傷又はヘルペス関連創からなる群から選択されている、細胞、組織、器官、動物又は患者における少なくとも１つの創傷、外傷又は組織傷害又は慢性疾患を調節又は治療するための方法をも提供している。ドナー部位創傷は、例えば移植に関連して、例えば体の一部分から体の別の部分への硬組織の除去に関連して発生する創傷である。このような手術の結果としてもたらされる創傷はきわめて苦痛であり、したがって治癒の改善は非常に価値のあることである。創傷線維症も同様に、創傷部に最初に侵入する細胞が好中球とそれに続く、マクロファージにより活性化された単球であることから、抗ＭＣＰ−１抗体療法に適している。マクロファージは、それらも病原体の食作用及び組織残屑の片付けを担当することから、効率の良い創傷治癒にとって不可欠であると考えられている。更にこれらは、後続する治癒プロセスの事象に関与する数多くの因子を放出する。マクロファージは、コラーゲンの産生を開始する線維芽細胞を誘引する。ほぼ全ての組織修復プロセスが早期結合組織形成を含んでおり、この刺激と、後続するプロセスの刺激とが、組織の治癒を改善させるが、結合組織及びコラーゲンの過剰産生は、非弾性であり低酸素であるとして特徴づけられる線維性組織を導く可能性がある。本発明の抗ＭＣＰ−１抗体は、創傷治癒のこのような続発症を調節、治療又は予防するための方法において使用することができる。
本発明の当該抗体は、例えば心臓移植片などの移植された器官、組織又は細胞の慢性的拒絶の少なくとも１つの症候を調節又は治療するための方法において使用することもできる。
抗ＭＣＰ−１抗体のその他の治療的使用
本発明は、細胞、組織、器官、動物、又は患者において少なくとも１つの感染症を制御又は治療するための方法も提供し、急性又は慢性細菌感染、細菌、ウイルス、及び菌感染を含む急性及び慢性寄生又は感染プロセス、ＨＩＶ感染／ＨＩＶ神経障害、髄膜炎、肝炎（Ａ、Ｂ、又はＣなど）、敗血症性関節炎、腹膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、大腸菌０１５７：ｈ７、溶血性尿毒症症候群／塞栓性血小板減少性紫斑病、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、ハンセン病、中毒性ショック症候群、連鎖球菌筋炎、ガス壊疽、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、ニューモシスティス・カリニ肺炎、骨盤感染症、精巣炎／精巣上体炎、レジオネラ、ライム病、Ａ型インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス、ウイルス関連血球貪食症候群、ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎などの少なくとも１つを含むが、それらに限定されない。
本発明のあらゆる方法が、このような調節、治療又は療法を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に対して、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を投与する工程を含むことができる。このような方法は所望により更に、少なくとも１つのＴＮＦアンタゴニスト（例えばＴＮＦ抗体又は断片、可溶性ＴＮＦ受容体又は断片、その融合タンパク質又は小分子ＴＮＦアンタゴニスト、ただしこれらに限定されない）、抗リウマチ剤（例えば、メトトレキサート、オーラノフィン、オーロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサルジン）、筋肉弛緩剤、麻酔薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、睡眠薬、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋遮断薬、抗菌薬（例えば、アミノグリコシド、抗真菌薬、駆虫薬、抗ウイルス薬、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、その他の抗菌薬）、乾癬治療薬、コルチコステロイド（デキサメタゾン）、アナボリックステロイド（テストステロン）、糖尿病関連作用剤、ミネラル、栄養薬、甲状腺作用薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉薬、鎮咳薬、制吐薬、抗潰瘍薬、便秘薬、抗凝血剤、エリスロポエチン（例えば、エポエチンアルファ）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ニューポジェン）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、ロイキン）、予防接種、免疫グロブリン（リツキシマブ）、免疫抑制薬（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、生殖ホルモンアンタゴニスト（フルタミド、ニルタミド）、ホルモン放出調節因子（ロイプロリド、ゴセレリン）、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体調節物質（タモキシフェン）、レチノイド（トレチノイン）、トポイソメラーゼ阻害剤（エトポシド、イリノテカン）、細胞毒（ドキソルビシン）、散瞳薬、毛様筋調節薬、アルキル化剤（カルボプラチン）、ナイトロジェンマスタード（メルファレン、クロラブシル）、ニトロソウレア（カルムスチン、エストラムスチン）、代謝拮抗物質（メトトレキサート、シタラビン、フルオロウラシル）、分裂抑制剤（ビンクリスチン、タキソール）、放射性医薬品（イオジン１３１−トシツモマブ）、放射性増感剤（ミソニダゾール、チラパザミン）、抗うつ薬、抗躁薬、精神病治療薬、抗不安薬、催眠薬、交換神経様作用薬、興奮剤、ドネペジル、タクリン、喘息治療薬、ベータアゴニスト、吸引ステロイド薬、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリン又は類似体、ドルナーゼアルファ（プルモジム）、サイトカイン（インターフェロンα−２、ＩＬ２）又はサイトカインアンタゴニスト（インフリキシマブ）から少なくとも１つが選択される。適切な投薬量は当該技術分野において周知である。例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２nd Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ（２０００）；ＰＤＲ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｏｃｋｅｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ２０００，Ｄｅｌｕｘｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ Ｌｉｎｄａ，ＣＡ（２０００）を参照のこと。これらはそれぞれ、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
腫瘍性疾患の治療のための特殊な組合せは、例えばアルキル化剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、抗生物質、代謝拮抗物質、ホルモンアゴニスト又はアンタゴニスト、免疫調節剤などの抗腫瘍薬を、前、同時、及び／又は後に投与することによる、同時投与又は組合せ療法を含む。転移性悪性黒色腫及びその他の腫瘍性疾患で使用するためには、好ましい組合せは、デカルバジン、インターフェロンα、インターロイキン−２、テモゾロミド、シスプラチン、ビンブラスチン、メシル酸イマチニブ、カルムスチン、パクリタキセルなどとともに抗体を同時投与することである。転移性黒色腫に対しては、ダカルバジンが好ましい。
１１．投薬量と投与方法
本発明の方法は、このような調節、治療又は療法を必要とする細胞、組織、器官、動物又は患者に対して少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を投与する工程を含む、ＭＣＰ−１媒介型障害を治療するための方法を含み得る。このような方法は、このような疾病又は傷害を治療するための同時投与又は組合せ療法を所望により更に含み、ここで少なくとも１つの前記抗ＭＣＰ−１抗体、その特定された部分又は変異体の投与工程は更に、前、同時、及び／又は後に、腎臓作用薬、皮膚病薬、抗血管形成薬、抗感染症薬、心臓血管（ＣＶ）系作用薬、中枢神経系（ＣＮＳ）薬、自律神経系（ＡＮＳ）薬、呼吸管薬、消化（ＧＩ）管作用薬、ホルモン薬、体液又は電解質平衡のための作用薬、血液製剤、抗新生物薬、免疫調節薬、眼、耳、又は鼻用薬、局所作用薬、栄養薬など、少なくとも１つのＴＮＦアンタゴニスト（例えば、ＴＮＦ抗体又は断片、可溶性ＴＮＦ受容体又は断片、その融合タンパク質、又は小分子ＴＮＦアンタゴニスト、ただしこれらに制限されない）、抗リウマチ剤（例えば、メトトレキサート、オーラノフィン、オーロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサルジン）、筋肉弛緩剤、睡眠薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋遮断薬、抗菌薬（例えば、アミノグリコシド、抗真菌薬、駆虫薬、抗ウイルス薬、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、その他の抗菌薬）、乾癬治療薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、糖尿病関連作用剤、ミネラル、栄養薬、甲状腺作用薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉薬、鎮咳薬、制吐薬、抗潰瘍薬、便秘薬、抗凝血剤、エリスロポエチン（例えば、エポエチンアルファ）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ニューポジェン）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、ロイキン）、予防接種、免疫グロブリン、免疫抑制薬（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充作用薬、エストロゲン受容体調節物質、散瞳薬、毛様筋調節薬、アルキル化剤、代謝拮抗物質、分裂抑制剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁薬、精神病治療薬、抗不安薬、催眠薬、交換神経様作用薬、興奮剤、ドネペジル、タクリン、喘息治療薬、ベータアゴニスト、吸引ステロイド薬、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリン又は類似体、ドルナーゼアルファ（プルモジム）、サイトカイン又はサイトカインアンタゴニストから選択された少なくとも１つのものを投与することを含む。このような薬物は、本明細書に提示されているそれぞれについての処方、適応症、用量決定及び投与を含め、当該技術分野において周知である（例えばNursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional’s Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ; Pharmcotherapy Handbook, Wells et al., ed., Appleton & Lange, Stamford, CTを参照のこと。これらはそれぞれ参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
典型的には、病的状態の治療は、組成物の中に含まれているの比活性に応じて合計で１用量あたり患者の体重１ｋｇあたり少なくとも約０．０１〜５００ミリグラムの少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体組成物、及び好ましくは単回又は複数回投与あたり患者の体重１ｋｇにつき少なくとも約０．１〜１００ミリグラムの範囲となる有効量又は投薬量の少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を投与することによって達成される。代替としては、有効な血清濃度は、単一又は複数投与当たり０．１〜５０００μｇ／ｍＬ血清濃度を含み得る。適切な用量は、医療実践者には周知であり、当然のことながら、特定の疾患状態、投与される組成物の特異的活性、及び治療を受けている特定の患者に依存する。一部の例においては、望ましい治療量に達するために、反復投与、すなわち特定の監視された量又は計量された量の反復個別投与を提供することが必要となることがあり、個別投与は、望ましい日用量又は効果が得られるまで繰り返される。
好ましい用量としては、所望により、投与１回、体重１ｋｇあたり０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９及び／又は１００〜５００ｍｇ、又はその任意の範囲、値若しくは分散、又は単回若しくは複数回投与あたり、０．１、０．５、０．９、１．０、１．１、１．２、１．５、１．９、２．０、２．５、２．９、３．０、３．５、３．９、４．０、４．５、４．９、５．０、５．５、５．９、６．０、６．５、６．９、７．０、７．５、７．９、８．０、８．５、８．９、９．０、９．５、９．９、１０、１０．５、１０．９、１１、１１．５、１１．９、２０、１２．５、１２．９、１３．０、１３．５、１３．９、１４．０、１４．５、４．９、５．０、５．５、５．９、６．０、６．５、６．９、７．０、７．５、７．９、８．０、８．５、８．９、９．０、９．５、９．９、１０、１０．５、１０．９、１１、１１．５、１１．９、１２、１２．５、１２．９、１３．０、１３．５、１３．９、１４、１４．５、１５、１５．５、１５．９、１６、１６．５、１６．９、１７、１７．５、１７．９、１８、１８．５、１８．９、１９、１９．５、１９．９、２０、２０．５、２０．９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９６、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００及び／又は５０００μｇ／ｍＬの血清濃度を達成するための用量又はその任意の範囲、値又は分散が含まれ得る。
代替として、投与される用量は、特定薬剤の薬力学的特性などの周知の要素、及びその投与方法及び投与経路、レシピエントの年齢、健康、及び体重、症状の性質及び程度、現行治療の種類、治療の頻度、及び所望の効果に応じて異なり得る。活性成分の用量は、通常、体重１キログラム当たり約０．１〜１００ミリグラムであり得る。通常、０．１〜５０、好ましくは投与につき１キログラム当たり０．１〜１０ミリグラム、又は徐放性形態が、望ましい結果を得るために有効である。
非制限的な例としては、ヒト又は動物の治療は、単回用量、注入量又は反復用量を用いて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０日目のうちの少なくとも１つの日に、又は、代替的に又は付加的には１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１又は５２週目のうちの少なくとも１つの週、又は、代替的に又は付加的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０年のうちの少なくとも１つの間、又はそのいずれかの組合せで、一日あたり体重１ｋｇにつき０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍｇといった０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの１回又は周期的投薬量の本発明の少なくとも１つの抗体として、提供可能である。
体内投与に適した投薬形態（組成物）は、一般に、１単位又は容器当たり約０．００１ミリグラム〜約５００ミリグラムの活性成分を含む。これらの医薬組成物において、活性成分は、組成物の総重量に基づいて、通常、約０．５〜９９．９９９重量％で存在する。
非経口投与のためには、抗体を、製薬上許容できる非経口ビヒクルと合わせた状態の、又は別途供給される状態の、溶液、懸濁液、エマルション、粒子、粉末、若しくは凍結乾燥された粉末として、処方され得る。このようなビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及び１〜１０％ヒト血清アルブミンである。リポソーム及び固定油などの非水性ビヒクルを使用することもできる。ビヒクル又は凍結乾燥粉末は、等張性（例えば塩化ナトリウム、マンニトール）及び化学安定性（例えば緩衝剤及び保存剤）を維持する添加剤を含有することができる。製剤は、周知又は適切な技術によって滅菌される。適切な製薬学的担体は、この分野での標準的参考テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌの最新版の中で記載されている。
代替的投与。本発明に従った少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を製薬学的に有効な量だけ投与するために、数多くの既知の及び開発された投与様式を使用することができる。以下の記述では経肺投与が用いられているが、本発明に従ってその他の投与様式を使用して、適切な結果を得ることもできる。本発明のＭＣＰ−１抗体は、担体中で、溶液、エマルション、コロイド、又は懸濁液として、又は乾燥粉末として、吸入によるか、又は、当該技術分野の範囲内の若しくは本明細書に記載したその他の様式による投与に適したさまざまなデバイス及び方法のいずれかを用いて、送達可能である。
非経口処方物及び投与。非経口投与のための処方は、一般的な賦形剤として滅菌水又は生理食塩水、ポリアルキレングリコール（例えばポリエチレングリコール）、植物性油、水素化ナフタレンなどを含有し得る。注射用の水性又は油性懸濁液は、既知の方法に従って、適切な乳化剤又は加湿剤及び懸濁剤を使用することによって調製可能である。注入剤は、例えば水溶液又は溶媒中の無菌注射溶液若しくは懸濁液などの非毒性で経口投与不能の希釈剤であり得る。使用可能なビヒクル又は溶媒としては、水、リンガー溶液、等張食塩水などが許容される。通常の溶媒又は懸濁溶媒としては、無菌不揮発性油を使用することができる。これらの目的では、天然又は合成の又は半合成の、脂肪油又は脂肪酸；天然又は合成若しくは半合成の、モノグリセリド又はジグリセリド又はトリグリセリドを含む、あらゆる種類の不揮発性油及び脂肪酸を使用することができる。非経口投与は当該技術分野において既知であり、これには当該技術分野において周知のような従来の注射手段、ガス加圧式無針注入デバイス又はレーザー穿孔機デバイスが含まれるがこれらに限定されない（例えば限定するものではないが材料及び方法はＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８５１，１９８、及びＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８３９，４４６に開示されている。これらは参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
代替的送達本発明は更に、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮手段による少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体の投与に関する。少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体組成物を、特に液体溶液又は懸濁液の形での非経口（皮下、筋肉、若しくは静脈内）又はその他のあらゆる投与に使用するため；クリーム又は座薬といった（ただしこれらに限定されない）特に半固体形態での膣内又は直腸内投与で使用するため；錠剤又はカプセルの形での（ただしこれらに限定されない）口腔内又は舌下投与のため；粉末、点鼻薬、若しくはエアロゾル、又は一部の作用物質の形で（ただしこれらに限定されない）鼻腔内で；皮膚構造を修飾するか又は経皮パッチ内の薬物濃度を増大させるためジメチルスルホキンドといったような化学的エンハンサーを伴った（Junginger, et al. In"Drug Permeation Enhancement"; Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90（Marcel Dekker,Inc.New York 1994）、参照により全体が本明細書に組み込まれる）又は皮膚上へのタンパク質及びペプチドを含有する処方の塗布（ＷＯ ９８／５３８４７）又は電気穿孔といった過渡的輸送経路を作り出すか又はイオントフォレシスなどの皮膚を通して荷電薬物の易動性を増大させるための電界の適用、又はソノフォレシスなどの超音波の適用（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．４，３０９，９８９及び４，７６７，４０２）を可能にする酸化剤を伴うゲル、軟こう、ローション、懸濁液又はパッチ送達系といった（ただしこれらに限定されない）ように経皮的に投与するために、調製することができる（上述の刊行物及び特許は参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
肺／鼻腔内投与。経肺投与のためには、好ましくは少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体組成物が、肺の下気道又は洞に達するのに有効な粒径で送達される。本発明に従って、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体は、吸入される治療薬の投与のため当該技術分野において既知のさまざまな吸入又は鼻腔内デバイスのいずれかにより送達可能である。患者の洞腔又は肺胞内にエアロゾル化した処方物を被着させる能力のあるこれらのデバイスには、定量吸入器、ネブライザ、乾燥粉末発生器、噴霧器などが含まれる。当該技術分野においては、抗体を肺又は鼻腔内投与を導くのに適したその他のデバイスも知られている。このようなデバイスは全てエアロゾル中の抗体送り出しのための投与に適した処方物を使用することができる。このようなエアロゾルは、溶液（水性及び非水性の両方）又は固体粒子のいずれかで構成され得る。Ｖｅｎｔｏｌｉｎ（登録商標）定量吸入器のような定量吸入器は典型的には推進ガスを使用し、標準的に、吸息中の作動を必要とする（例えば、ＷＯ ９４／１６９７０，ＷＯ ９８／３５８８８を参照のこと）。ドライパウダー吸入器、例えばＴｕｒｂｕｈａｌｅｒ（商標）（Astra）、Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（登録商標）（Glaxo）、Ｄｉｓｋｕｓ（登録商標）（Glaxo）、Ｓｐｉｒｏｓ（商標）吸入器（Dura）、Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓにより市販されているデバイス、及びＳｐｉｎｄａｌｅｒ（登録商標）パウダー吸入器（Fisons）などの乾燥粉末吸入器は、混合粉末の呼気作動を用いる（ＵＳ ４６６８２１８ Ａｓｔｒａ、ＥＰ ２３７５０７ Ａｓｔｒａ、ＷＯ ９７／２５０８６ Ｇｌａｘｏ、ＷＯ ９４／０８５５２ Ｄｕｒａ、ＵＳ ５４５８１３５ Ｉｎｈａｌｅ、ＷＯ ９４／０６４９８ Ｆｉｓｏｎｓ。これらは参照により全体が本明細書に組み込まれる）。ＡＥＲｘ（商標）Ａｒａｄｉｇｍ、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ（登録商標）ネブライザ（Mallinckrodt）、及びＡｃｏｒｎ ＩＩ（登録商標）ネブライザ（Marquest Medical Products）（ＵＳ ５４０４８７１ Ａｒａｄｉｇｍ、ＷＯ ９７／２２３７６）などのネブライザ（以上の参考文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる）は溶液からエアロゾルを生成するのに対し、定量吸入器、乾燥粉末吸入器などは小粒子エアロゾルを生成する。市販の吸入デバイスのこれらの具体例は、本発明の実施に適した具体的デバイスを代表するものとして意図されており、本発明の範囲を制限するものとして意図されているものではない。好ましくは、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を含む組成物は、乾燥粉末吸入器又は噴霧器によって送達される。本発明の少なくとも１つの抗体を投与するための吸入デバイスには、複数の望ましい特徴が存在する。例えば、吸入デバイスによる送達は、有利に信頼性が高く、再現可能でありかつ正確である。吸入デバイスは所望により、うまく呼吸できるように例えば約１０μｍ未満、好ましくは約１〜５μｍの小さな乾燥粒子を送達することができる。
実施例１：非制限的な例としての、ファージディスプレイを用いたＭＣＰ−１に特異的なＭＣＰ−１抗体の作製
出願人らは、出願人の同時係属特許出願であるＵ．Ｓ．Ｓｅｒ．Ｎｏ．１１／１７０４５３（配列番号７及び８）及び関連出願の中に記載されている、Ｃ７７５と呼ばれるマウス抗ヒトＭＣＰ−１抗体の望ましい治療特性について、以前に示している。当該研究努力の目標は、ヒトケモカインＭＣＰ−１の生物活性を中和し類似の属性を提示するＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）からの少なくとも１つのヒト抗体を同定することにあった。Ｃ７７５抗体ひいては所望のヒト抗ＭＣＰ−１抗体が、以下に概略的に示した成功基準により定義づけられた。
少なくとも１つの治療用抗体のための成功基準：
固相形式でヒトＭＣＰ−１に結合する。
相同タンパク質ヒトＭＣＰ−２、３、４、並びにヒトエオタキシン１、２、及び３に対する、１００ｎＭでの結合の欠如として特異性が定義づけられる。
Ｔｈｐ−１細胞上のそのヒト受容体ＣＣＲ２に対するヒトＭＣＰ−１の結合を阻害し、ＩＣ５０の値は基準ＦａｂＣ７７５の場合より低い。
ＴＨＰ−１細胞のヒトＭＣＰ−１媒介型走化性を阻害し、ＩＣ５０の値は基準ＦａｂＣ７７５の場合よりも低い。
定量的アッセイにおいて基準ＦａｂＣ７７５に匹敵する効力で、又は定性的イエス／ノー基準として、第２の生物アッセイ（例えばＣａ２＋可動化又はＣＣＬ−２誘導型受容体内在化）におけるヒトＭＣＰ−１媒介型活性を阻害する。
Ｋｄ＜０．５ｎＭでヒトＭＣＰ−１に結合する。
ＫD＜２０ｎＭ、及び好ましくは＜１０ｎＭで、カニクイザルＭＣＰ−１に結合する。
比較可能な効力で、ネイティブヒトＭＣＰ−１及び化学合成されたヒトＭＣＰ−１の生物活性を阻害する。
比較対象としてのＣ７７５の全長ＩｇＧ形態に基づいて、ＩｇＧとしてのＦａｂの再工学的処理の後基準１〜８を保持する。
選択プロセスの要約
ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）を用いて１０個の異なるパニングを実施し、１７８５６個のクローンをスクリーニングし、結果として１１０４個の一次ヒットを得た。最終的に、ＥＬＩＳＡにおいて合成ヒトＭＣＰ−１を結合する２６のユニークＦａｂを同定した。これらのうち、カニクイザル及びネイティブヒトＭＣＰ−１に対する親和性、生物活性、特異性及び結合によって、親和性成熟について７個の異なるＦａｂを選択した。親Ｆａｂの親和性は、１０〜４００ｎＭの範囲内にあり、放射性リガンド結合アッセイにおけるＩＣ50値は１０〜６００ｎＭであった。
材料及び方法
ＤＮＡ制限酵素及び修飾酵素並びにポリメラーゼを、（Carlsbad, CA, USA）、New England Biolabs（Beverly, MA, USA）、Roche Diagnostics（Mannheim, Germany）及びMBI Fermentas（Vilnius, Lithuania）から購入した。ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）2断片特異的ＰＯＤ複合体は、Jacksons（West Grove, PN, USA））により供給され、Ｆｄ断片特異的なヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体はThe Binding Site（Birmingham, UK）により供給され、アルカリホスファターゼと複合化されたストレプトアビジン（ＺｙＭＡＸＴＭ（商標）グレード）はZymed Laboratories（San Francisco, CA, USA）により複合化された。組換えヒトケモカイン、ｈＭＣＰ−１、２、３、４及びｈエオタキシン１、２及び３（R&D systems）試薬、リガンド及び抗体：ヒトＭＣＰ−１特異的ｍＡｂ２７９（R&D systems）；合成ｈＭＣＰ−１（Bachem）；ｍＡｂｌマウス抗ｈＣＣＲ２ビオチン（R&D systems）；ヒトガンマグロブリン（Jackson Immuno Research）；マウスガンマグロブリン（Jackson Immuno Research）；ｍＡｂ ｍＩｇＧ２ｂイソタイプ対照ビオチン（R&D systems）；ストレプトアビジン−ＰＥ（BD Pharmingen）；Ｖｅｒｓｅｎｅ（Invitrogen）；ＰＢＳ（Invitrogen）。ＦＣＳ（ＰＡＮ）；Ｖ底ウェルプレート（Greiner）；及びＵ底ウェルプレート（Nunc）。
ＭＣＰ−１ポリペプチド及び類似体の調製。出願人の同時係属出願であるＵ．Ｓ． Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．６０／６８２６２０及びＫｒｕｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｊ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉ．１２：２５〜３２に記載されている通りの生物活性をもつ、単離された全長でありかつ成熟（７６個のアミノ酸）し適切に折り畳まれ、所望により修飾されたヒトＭＣＰ−１及び変異体を提供するための、段階的な固相ペプチド合成及び親和性精製。変異体は、天然の表面トポロジー及びペプチド主鎖構造を示すことを意図し、Ａ４０Ｓ、Ｖ４１ｌ、Ｆ４３Ｙを含む。化学合成はまた、受容体結合又は表面活性に関与しないリジンのイプシロンアミノ基を用いた、ヒトＭＣＰ−１の部位特異的ビオチン化のための方法を提供し、構造内でＫ６９及びＫ７５において無秩序化されている（U.S. Serial No. 60/682620及びKruszynski et al. 2006, J Peptide Sci. 12:354-360）。４つのエチレンオキシ単位（ＰＥＧ4）の親水性スペーサが、ビオチンと、リジン残基のｅアミノ基との間に挿入された。ビオチンアミドから末端カルボニルまでの鎖長は１９．２Åである。スペーサは、溶解度を増大させストレプトアビジン複合体を結合させるのに充分なスペーサ長を提供するように選択された。ＭＣＰ−１及び変異体の配列は、配列番号１に記されている。変異体は、ＴＨＰ−１細胞内でＣａ２＋可動化を誘導する能力を保持するものと判定された。スクリーニング、整理統合及び親和性判定において、ビオチン−Ｌｙｓ69及びビオチン−Ｌｙｓ75ＭＣＰ−１を並べて比較し、有意な差異は全く観察されなかった。ビアコアを用いて、３５個の最適化したＦａｂをＭＣＰ−１Ｉｌｅ41、Ｌｙｓ（ビオチン−ＰＥＧ4）69及びＭＣＰ−１Ｉｌｅ41上で分析し、並行してＬｙｓ（ビオチン−ＰＥＧ4）75をストレプトアビジンチップ上で固定化した。一般に、ＭＣＰ−１Ｋ６９及びＫ７５上での測定された親和性は比較可能なものであった。
ファージＦａｂライブラリ。ファージミドライブラリは、ＨｕＣＡＬ（登録商標）の概念（Knappik et al., 2000）に基づくものであり、ファージ表面上でＦａｂを提示するためにＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（商標）技術を用いている（Lohning, 2001）。このライブラリは、小外皮タンパク質ｐＩＩＩに対する融合としてＭ１３バクテリオファージ上に提示された約１０10個のユニークＦａｂをコードする。選択のため、ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）抗体−ファージを、異なるＶＨマスター遺伝子を含む３つのプールに分割した。更に、１つのプール（ＶＨ１〜６）中で全ライブラリを使用した。各パニングのために２×１０13個のＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）入力（input）ファージを使用した。それぞれヒトＭＣＰ−１類似体１（Ｖ４１Ｉ、Ｉｌｅ41）及び類似体−２（Ｆ４３Ｙ、Ｔｙｒ43）についての３回のパニングラウンド並びに１−２−１及び２−１−２の順での類似体に対する２つの交互パニングを含む、４つの異なるパニング戦略を適用した。
固相パニング。ｐＨ７．４のＰＢＳ中５０μｇ／ｍＬの、ヒトＭＣＰ−１類似体−１（Ｖ４１Ｉ）又は類似体−２（Ｆ４３Ｙ）の１００μＬのアリコートで、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）ウェル（Nalgen Nunc, Rochester, NY）上を４℃で一晩、直接コーティングした。コーティングされたウェルを洗浄し、５％ＭＰＢＳ（ＰＢＳ、５％低脂肪粉乳）でブロックした。１ウェルあたり１００μＬのブロックしたＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）ファージを室温で２時間添加した。複数の洗浄工程の後、結合したファージをｐＨ８．０の１０ｍＭトリス／ＨＣｌ中の１００μＬの２０ｍＭＤＴＴによって１０分間室温でインキュベートして溶出させた。中相大腸菌ＴＧ１（Stratagene, Amsterdam, The Netherlands）を感染させるためにこの溶出液を使用し、記載されている通りに（Krebs et al., 2001）ファージミドを増幅させた。
中和Ｆａｂ分子を結果としてもたらすヒトＭＣＰ−１類似体−１（Ｖ４１Ｉ）及び類似体−２（Ｆ４３Ｙ）に対する半溶解（Semi-Solution）パニング。溶液状態のＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）ファージとともに２つのビオチン化されたヒトＭＣＰ−１誘導体、Ｖ４１Ｉ、Ｋ６９−ＰＥＧ−ビオチン又はＶ４１Ｉ、Ｋ７５−ＰＥＧ−ビチオン（配列番号１）をインキュベートし、その後ポリスチレンマイクロタイタープレートストリップ（PERBIO）にコーティングしたＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎでファージ抗原複合体を捕捉することにより、半溶解パニングを実施した。パニングのためには、１．５ｍＬエッペンドルフチューブを、ＰＢＳで１対１希釈したケミブロッカ（Chemicon International）で、４℃で一晩ブロックした。翌日、Ｒｅａｃｔｉ Ｂｉｎｄ（商標）NeutrAvidin（商標）（Pierce, Rockford, IL, USA）マイクロタイタープレートストリップ（結合能：ビオチン２５ｐｍｏｌ／ウェル；PERBIO）を、neutravidinバインダーの数を低減するための２回の予備吸着工程に必要な３００μＬＰＢＳで２回洗い流した。１００μＬの５０％ケミブロッカー（Chemicon）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Sigma）中の、２×１０13個のファージ（ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリからのもの）を１ウェル毎に添加し、穏やかに振盪させながら室温で１時間ブロックさせた。第２の予備吸着工程のために、ファージ溶液をＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎがコーティングされた新しいポリスチレンマイクロタイタープレートストリップに移し、穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベートした。次に、予備吸着したファージ及びビオチン化抗原（ビオチン化のために３：１のビオチン対抗原比：最終濃度２００ｎＭ）を、あらかじめブロックした１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに添加し、回転ホイール上で室温で１時間インキュベートした。並行して、３００ｍＬのＰＢＳで更にＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎコーティングされたポリスチレンマイクロタイタープレートストリップを２回洗い流し、ＰＢＳで１：１希釈した３００μＬのケミブロッカーで１時間ブロックさせ、３００μＬのＰＢＳで１回洗浄した。マイクロタイタープレートストリップ内に１ウェルあたり１００μＬのビオチン−抗原−ファージ複合体をピペットでとり、穏やかに振盪しながら室温で一時間インキュベートした。複数の洗浄工程の後、１０分間室温でインキュベートしたｐＨ８．０の１０ｍＭトリス／ＨＣｌ中の１１０μＬの２０ｍＭＤＴＴにより溶出させた。溶出液は、中相大腸菌ＴＧ１（Stratagene, Amsterdam, The Netherlands）を感染させるために使用され、記載されているように（Krebs et al., 2001）ファージミドを増幅させた。
選択されたＦａｂ断片のサブクローニング及びミクロ発現。可溶性Ｆａｂの急速な発現を促進するため、選択されたＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）ファージのインサートをコードするＦａｂを、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩを介して発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿ＦＨ内にサブクローニングした。Ｆａｂ断片はＣ末端ＦＬＡＧ（商標）タグ（Prickett et al., 1989）及び第２のＣ末端タグとして６×Ｈｉｓ−タグ（Chen et al., 1994）を担持している。ＴＧ１−Ｆ-単クローンの形質転換後、ＨｕＣＡＬ（登録商標）−Ｆａｂ断片を含有するペリプラズム抽出物の発現及び調製が、先に記述されたように（Rauchenberger et al., 2003）に実施された。
上述の通りに、ヒトＭＣＰ−１類似体−１（Ｖ４１Ｉ）についての固相形式結合アッセイを実施した。ブロッキングの後、ペリプラズム抽出物を添加した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）2断片特異的抗体とともにインキュベートすることにより、Ｆａｂ−断片の検出を実施した。
ＰＨ７．４のＰＢＳ中で希釈した０．５μＬ／ｍのビオチン化ｈＭＣＰ−１類似体−１（Ｖ４１Ｉ）又は類似体−２（Ｆ４３Ｙ）２０μＬで４℃で１６時間コーティングしたＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）NeutrAvidin（商標）３８４ウェルプレート（Pierce, Rockford, IL, USA）を用いて、固定化したビオチン化ｈＭＣＰ−１Ｖ４１Ｉについてのスクリーニングを実施した。室温で１時間、ＴＢＳ中の１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（Sigma, St. Louis, MO, USA）でブロッキングした後、ペリプラズム抽出物を添加した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）2断片特異的抗体とのインキュベーションにより、Ｆａｂ−断片の検出を実施した。
４℃で１６時間ｐＨ７．４のＰＢＳ中で１：１０００に希釈した２０μＬのヒツジ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｄ断片特異的抗体でＭａｘｉｓｏｒｐ（Nunc, Rochester, NY, USA）３８４ウェルプレートをコーティングすることにより、ビオチン化ｈＭＣＰ−１類似体−１（Ｖ４１Ｉ）での溶液相スクリーニングを実施した。室温で２時間、ＴＢＳ中の３％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（Sigma, St. Louis, MO, USA）でブロッキングした後、ペリプラズム抽出物を添加した。その後、捕捉されたＨｕＣＡＬ（登録商標）−Ｆａｂ断片をＴＢＳ中の０．２μｇ／ｍＬのビオチン化ｈＭＣＰ−１類似体−１（Ｖ４１Ｉ）に結合させ、これをアルカリホスファターゼに複合体化されたストレプトアビジンでのインキュベージョンとそれに続くＡｔｔｏ Ｐｌｏｓ蛍光基質（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）の添加により検出した。５３５ｎｍの蛍光放射を、４３０ｎｍの励起で記録した。
生物活性アッセイ
細胞培養。加湿されたインキュベータの中で３７℃、５％ＣＯ2で標準化された条件下で全ての細胞を培養した。標準培地内で、ＣＣＲ２を発現する細胞を増殖させた。更に、２ｍＭＬ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１．０ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有するＲＰＭＩ ９０％；１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Vitacell RPMI 20-2001, ATCC, Manassas, VA）の中で３７℃、５％ＣＯ2で、４〜８×１０5細胞／ｍＬの密度で、ＴＨＰ−１細胞（ヒト急性単球性白血病細胞）を培養した。
放射性リガンド結合アッセイ。ミリポア（Millipore）フィルタプレート（Millipore, Bedford, MA）内で競合アッセイを実施した。異なる濃度の組換えヒト（ｒｈ）ＭＣＰ−１（２７９−ＭＣ、R&D Systems, Minneapolis, MN）又は合成タンパク質と合わせて125Ｉ−ＭＣＰ−１（１ｎｇ／ｍＬ；Perkin Elmer Life Science, Boston, MA）とともに１×１０6個のＴＨＰ−１細胞／ウェルをインキュベートした。ＲＰＭＩ培地１６４０（Invitrogen Corp., Grand Island, NY）及び０．１％ＢＳＡからなる結合緩衝液中で全ての試薬を希釈した。競合を室温で１時間進行させ、１５０μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（結合緩衝液＋１ＭＮａＣｌ）で３回ウェルを洗浄した。ワラック・ウィザード（Wallac Wizard）１４７０自動ガンマ計数器（Perkin Elmer Life Sciences Inc., Boston, MA）を用いてフィルタ上の放射能を計数した。変動する用量の組換え又は合成ＭＣＰ−１のいずれかによる125Ｉ−ＭＣＰ−１のＣＣＲ２に対する結合の阻害百分率を計算した。阻害百分率値を次にグラフパッド・プリズム（Graphpad Prism）プログラム内にインポートし、最低値＝０及び最高値＝１００の定数及び可変勾配を伴うＳ字形用量−応答曲線を用いてプロットした。
カルシウム可動化アッセイ。非接着性細胞及びＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎ（商標）（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）のための、メーカーのプロトコルに従ってＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎ（商標）Ｃａ2+プラスアッセイキット（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を用いて、９６ウェル形式で、Ｃａ2+可動化アッセイを実施した。ピークＲＦＵ値を、分析のグラフパッドプリズム内にインポートした。
ＭＣＰ−１誘導型ＣＣＲ２受容体内在化ＦＡＣＳアッセイ。リガンド濃度（合成ＭＣＰ−１のＥＣ５０、約１００ｎｇ／ｍＬ）及びインキュベーション時間（１時間後に最大の内在化が発生した）の最適化の後、異なる濃度の抗体を添加することによりＩＣ５０を決定した。培養したＣＣＲ２発現細胞をＰＢＳで洗浄し、３７℃で約１０分間ヴェルシーン（Versene）（Invitrogen）で脱離した。細胞の全ての遠心分離工程は約２００×ｇで行われた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／３％ＦＣＳ）で２回洗浄し、計数し、生存率について検査した（トリパンブルー）。９６Ｖ底ウェルプレート（Greiner）に、１ウェルにつき１００μＬ中約２．５×１０5個の細胞を充填し、氷上に置いた。９６Ｕ底ウェルプレート（Nunc）の中で、細胞培地（ＭＥＭＥ）中に抗体を希釈し、約２００μｇ／ｍＬから０．００１μｇ／ｍＬまでのトリプリケート試料を得た。異なる濃度の抗体を室温で１０分間、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬの合成ＭＣＰ−１（Bachem）とともに予備インキュベートした。細胞を、予備インキュベートした１００μＬのＭＣＰ−１／抗体混合物で再懸濁し、受容体内在化のためインキュベータ内で３７℃で１時間インキュベートした。内在化の後、細胞を一回１８０μＬの低温ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。更なる内在化を防ぐために全ての後続工程についてプレートを氷上に保たなくてはならない。ＦＡＣＳ緩衝液で１：１０の割合でビオチン化マウス抗ｈＣＣＲ２ｍＡｂ（R&D Systems）を希釈した。対照としてマウスＩｇＧ２ｂイソタイプビオチンｍＡｂ（R&D Systems）も同様にＦＡＣＳ緩衝液で１：１０に希釈した。最終濃度１０μｇ／ｍＬのヒト及びマウスガンマグロブリンの１：１混合物（Jackson Immuno Research）を、抗ｈＣＣＲ２及び対照ｍＡｂの両方に添加してＦｃ受容体をブロックした。細胞を５０μＬの抗ＣＣＲ２／ガンマグロブリン混合液（又は対照ＩｇＧ２ｂ／ガンマグロブリン混合液）の中に再懸濁させ、氷上で１時間インキュベートした。細胞を１８０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、５０μＬの１：４００の希釈ストレプトアビジン−ＰＥ（BD Pharmingen）で再懸濁し、暗所で氷上にて４℃で１時間インキュベートした。細胞を、１８０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μＬの２％ＰＦＡ／ＰＢＳ中で再懸濁し、固定のため４℃で一晩貯蔵した（別の方法としては、ＰＦＡ固定なしの直接的測定が可能である）。ＦＡＣＳ測定のために、細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁し、少なくとも５０００個の細胞をそれぞれ計数した。
親和性アッセイ
ＫD判定用溶液平衡滴定（ＳＥＴ）方法及びバイオベリスを用いた交差反応性実験。溶液状態の親和性測定を基本的に文献中で記載されている通りに実施した（Friguet et al., 1985）。ＳＥＴ方法の感度及び精度を改善するために、それを従来のＥＬＩＳＡからＥＣＬベースのバイオベリス技術に移行した（Haenel et al., 2005, Analytical Biochemistry中に公表受諾されたもの）。メーカーの指示に従って、１ｍｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト（Ｆａｂ）2又はヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的抗体（Jackson Immuno Research）を、ＢＶ−ｔａｇ（商標）ＮＨＳエステル（Bioveris Europe, Witney, Oxfordshire, UK）で標識した。０．５％ＢＳＡ及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳをアッセイ緩衝液とし、ポリプロピレンマイクロタイタープレートにおいて実験を実施した。４n段階で未標識抗原を希釈した：ヒト及びカニクイザルＭＣＰ−１については１０ｐＭ〜４０ｎＭの濃度範囲及び交差反応性（エオタキシン及びＭＣＰ−２）については４０ｐＭ〜１６０ｎＭの濃度範囲を選択した。抗原なしのウェルを用いてＳｍａｘ値を判定した。１００ｐＭのＦａｂ又はＩｇＧ（最終体積７５μＬ中の最終濃度）の添加後、混合物を室温で２時間インキュベートした。その後、抗ヒトＦａｂについて１：４０００、又は抗マウスＩｇＧについて１：２０００の最終希釈物中の、０．２５μｇ／ｍＬビオチン化ＭＣＰ−１（Ｋ６９）及びＢＶ−ｔａｇ標識化検出抗体でコーティングされた２５μＬダイナビーズ（Dynabeads）（０．４ｍｇ／ｍＬのＭ−２８０ストレプトアビジン、DYNAL, Hamburg）の混合物を１ウェルにつき添加した。室温でエッペンドルフ振盪器（７００ｒｐｍ）上で３０分間インキュベートした後、Ｍ−３８４シリーズ（登録商標）ワークステーション（Bioveris Europe）を用いて電気化学発光シグナルを検出した。カスタマイズされた適合モデルを適用するＯｒｉｇｉｎ ５．０（Microcal）ソフトウェア（ＦａｂについてはHaenel et al., 2005, Analytical Biochemistry中に公表受諾されたもの；ＩｇＧについてはPiehler et al., 1997による）で、データを評価した。
直接コーティングされた抗原についてのビアコアＫD判定。速度定数ｋon及びｋoffを、ビアコア３０００計器（Biacore, Uppsala, Sweden）を用いて共有結合により固定化されたＭＣＰ−１に結合するそれぞれのＦａｂの段階希釈物で判定した。共有結合性抗原固定化のためには、標準的なＥＤＣ−ＮＨＳアミンカップリング化学が用いられた。反応速度測定を、１．５〜５００ｎＭの濃度範囲のＦａｂを用いて２０μＬ／分の流速でＰＢＳ（１３６ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．７６ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４）中で行った。各濃度についての注入時間は１分であり、その後３分間の解離段階が続いた。再生のためには、５μＬの１０ｍＭ ＨＣｌを使用した。ＢＩＡ評価ソフトウェア３．１（ビアコア）を用いて全てのセンソグラム（sensogram）を適合させた。ビオチン−Ｋ６９ヒトＭＣＰ−１及びカニクイザルＭＣＰ−１についてのビアコアＫD判定。ストレプトアビジンチップ表面に対してビオチン−Ｋ６９ヒトＭＣＰ−１及びビオチン化カニクイザルＭＣＰ−１をコーティングし、ＣＭ５チップに対し直接カニクイザルＭＣＰ−１をコーティングした。標準的な方法を用いてＦａｂの結合をテストした。
抗体捕捉モードでのビアコアＫD判定。ＣＭ５チップ（流速５μＬ／分）上で抗ｈＦａｂ（ｓ．３．１５）を用いて５００ｎＭでＦａｂを捕捉し、各類似体（ＭＣＰ１、２、３、４及びエオタキシン、エオタキシン−２及び３）の溶液を注入した。全てのサイトカインは担体を含まず、親和性判定のための検体として１５〜５００ｎＭ（最適化前の親Ｆａｂについて）の濃度範囲で使用した。ＢＩＡ評価ソフトウェアを用いて、センソグラムを分析した。ビアコアの検出限界に達したため、最適化されたバインダーについて抗体捕捉モードでのＭＣＰ−１に対するビアコア親和性測定は不可能であった。
Ｆａｂの特異性分析には、捕捉アッセイを用いる表面プラズモン共鳴を使用した（Biacore 3000, Uppsala, Sweden）。Ｆａｂを捕捉し、さまざまなタンパク質（ＭＣＰ−２、−３、−４及びエオタキシン−１、−２及び−３）を検体として使用した。ＣＭ５チップ（Biacore, Sweden）を、標準的なＥＤＣ−ＮＨＳアミンカップリング化学を用いて４フローセル全てについて、６５００〜８０００ＲＵの抗Ｆ（ａｂ）2（Dianova, Affipure Ｆ（ａｂ）2断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）2断片特異的；１０ｍＭ酢酸塩緩衝液、ｐＨ４．５）でコーティングした。フローセル２〜４を、特異的抗ＭＣＰ−１ Ｆａｂで捕捉した（１０μＬ／ｍＬの流速で２０μＬの５００ｎＭ Ｆａｂ、結果としての捕捉密度３００〜４００ＲＵ）。Ｆａｂの捕捉後、１００ｎＭの濃度でケモカインを注入した（２０μＬ、流速２０μＬ／分、ＰＢＳ ｐＨ７．４）。小さなアリコートでケモカインを貯蔵し、測定のためには、最大１回の冷凍・解凍サイクルで解凍されたばかりの材料のみを使用した。ＭＣＰ−１のオフ速度、Ｆａｂ特異的相互作用及び抗Ｆａｂ／Ｆａｂ相互作用により引き起こされるオフ速度の組合せを避けるために、抗Ｆａｂ／Ｆａｂ相互作用の解離を判定するべく緩衝液を注入した。達成した緩衝液センソグラムを特異的なものから差し引いた。応答単位は、表面上への捕捉抗体の量に正規化した。
抗体捕捉モード内でのネイティブＭＣＰ−１に対する結合。上述の通りの方法を使用した。ＰＡＮＣ１上清からネイティブＭＣＰ−１を精製し、結合分析のために使用した。Ｆａｂ捕捉モードでのネイティブＭＣＰ−１に対する結合は、検出限界をはるかに上回っていたが、ネイティブＭＣＰ−１の正確な濃度を不明瞭にする、抽出物中の不純物のせいで、真の親和性測定は不可能であった。
ＩｇＧへの変換
全長ＩｇＧを発現する目的で、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ４、キメラヒト／マウスＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａについてＦａｂ発現ベクターから適切なｐＭｏｒｐｈ＿ｈＩｇベクターへと、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン断片をサブクローニングした。制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＭｆｅＩ、ＢｌｐＩを使用して、それぞれ、ｐＭｏｒｐｈ＿ｈＩｇＧ１．１、ｐＭｏｒｐｈ＿ｈＩｇＧ４．１、ｐＭｏｒｐｈ＿ｍＩｇＧ１．１又はｐＭｏｒｐｈ＿ｍＩｇＧ２ａ．１ベクターへのＶＨドメイン断片のサブクローニングを行い、及びＥｃｏＲＶ、Ｂｓｉ ＷＩを使用して、ｐＭｏｒｐｈ＿ｈＩｇκ＿１、ｐＭｏｒｐｈ＿ｈＩｇλ＿１、ｐＭｏｒｐｈ＿ｍＩｇκ＿１又はｐＭｏｒｐｈ＿ｍＩｇλ＿１のそれぞれのベクターへのＶＬドメイン断片のサブクローニングを行った。結果としてのＩｇＧ構成体はＣＮＴＯにおいて発現された。
結果
Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに直接コーティングされたｈＭＣＰ−１（４１Ｉ）及びｈＭＣＰ−１（４３Ｙ）上で固相パニングを実施した。それぞれ３つの選択ラウンドを含む４つの異なるパニング戦略を適用した。発現ベクターｐＭＯＲＰＨｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨ内へのサブクローニングの後、直接コーティングされたｈＭＣＰ−１（４１Ｉ）及びビオチン化ｈＭＣＰ−１について、固相スクリーニングを実施した。合計８８３２個のクローンを一次スクリーニングにおいて分析し、９８３の一次ヒットを得た。最終的に５個のユニークＦａｂを同定したが、５つのＦａｂ全てが細胞アッセイ内でＭＣＰ−１を中和せず、Ｍａｘｉｓｏｒｐに対する直接的コーティングが、中和エピトープの立体構造又は少なくとも接触性を損う可能性があることを表わしていた。
溶液状態のＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）ファージとともにビオチン化ヒトＭＣＰ−１類似体−１（Ｖ４１Ｉ）及び類似体−２（Ｆ４３Ｙ）をインキュベートし、続いて、記載されているように、ファージ抗原複合体を捕捉して、半溶解パニングを実施した。それぞれビオチン化ヒトＭＣＰ−１タンパク質類似体−１（Ｖ４１Ｉ）及び類似体−２（Ｆ４３Ｙ）（交互パニングなし）に対する３ラウンドのパニングを含む２つの異なる主パニング戦略を適用した。合計９０２４のクローンを一次スクリーニングにおいて分析し、１２１の一次ヒットを得、最終的に１８個のユニークバインダーが明らかとなった。ビオチン化ヒトＭＣＰ−１タンパク質類似体−１（Ｖ４１Ｉ）についてのパニングからの１９２クローンのＬｕｍｉｎｅｘベースの再スクリーニングにより、９つの付加的な一次ヒット及び３つの付加的なユニークバインダーが導かれ、Ｌｕｍｉｒｅｘスクリーニングが捕捉スクリーニングに対する適切な代替的スクリーニング方法であることを示している。半溶解パニングから合計２１のユニークバインダーが同定され、そのうち１４のバインダーが中和活性を示した。ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）からの中和Ｆａｂは全て、このパニングに由来していた。
ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）Ｆａｂの特徴づけ。ユニークＦａｂを発現させ、更なる特徴づけのために精製した。ビアコアによりｈＭＣＰ−１結合親和性を決定し、続く１）125Ｉ−ＣＣＬ−２のＴｈｐ−１細胞に対する結合の阻害、及び２）Ｔｈｐ−１細胞中のｈＭＣＰ−２誘導型Ｃａ２＋可動化の阻害というアッセイの中でＦａｂを特徴づけた。細胞ベースのアッセイにおいて中和活性を示したＦａｂを更に、１）合成カニクイザルｈＭＣＰ−２に対する結合；２）結合特異性のためのｈＭＣＰ−２ファミリー関連ヒトケモカインに対する結合（すなわちＭＣＰ−２、３、４及びエオタキシン１、２、３）；及び３）合成ｈＭＣＰ−２ペプチドを用いて選択されたＦａｂがネイティブｈＭＣＰ−２を確実に認識するようにするためのネイティブヒトｈＭＣＰ−２に対する結合、について証明した。付加的な親和性成熟のために、最適な特性をもつ７つのＦａｂを選択した。親和性成熟のために選択されたＦａｂの特性は表２にまとめられている。親和性成熟のために選択された７つのＦａｂは、ライブラリクローニング及び選択のため３つのグループに割当てられた。Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ２最適化が並行して実施された。軽可変鎖及び重可変鎖の並行した最適化は、更なる改良型抗体でさえ作製するための、交差クローニングを介する改良型重鎖及び軽鎖の組合せの潜在的可能性を作り出した。
Figure 2011517548
実施例２：ＦＡＢからの高親和性ＭＣＰ−１特異的抗体の評価
指摘した通り、親和性成熟のための候補の選択は、遊離Ｆａｂ形式の候補について実施された。選択基準は、放射性リガンド結合アッセイにおける活性、Ｃａ２＋可動化アッセイにおける活性、ビアコアにより測定されるヒトＭＣＰ−１に対する親和性、ヒトＭＣＰ−１に対する特異性、カニクイザルＭＣＰ−１に対する親和性及びビアコア内で検出されたネイティブＭＣＰ−１に対する結合であった。親Ｆａｂをグループ化するための付加的な基準は、ＥＬＩＳＡにおけるＣ７７５競合であり、可変重鎖及び軽鎖のフレームワークファミリーに基づいていた。特に走化性アッセイにおけるＩｇＧとしての成熟候補の特徴づけを、成熟選択プロセスと並行して実施した。
成熟のため選択された７つのＦａｂは、３つの異なる配列クラスに分類された。１つのクラス（グループ１、表２）では、Ｆａｂ０３３３６、０３４６４、０３４６８及び０３４７０が、２つの異なる重鎖フレームワークの１つとともにＶλ３軽鎖フレームワークを有していた。Ｆａｂ０３３３６及び０３４６４はＶＨ３重鎖フレームワークを有し、Ｆａｂ０３４６８及び０３４７０は、ＶＨＩＢ重鎖フレームワークを有していた。Ｆａｂの第２のクラス（グループ２、表２）０３４７１及び０３４７３は、ＶＨ１Ａ重鎖フレームワーク及びＶκ３軽鎖フレームワークを有していた。Ｆａｂ０３５４８は、第１のクラス内のＦａｂのうちの２つ（ＶＨ３、Ｖλ３）と同じ重鎖及び軽鎖フレームワークを有していたが、非常に強力な生物活性及びエオタキシンとの結合交差反応性を有していたことから別々に維持された（グループ３、表２）。本明細書で使用されている可変領域配列分類の完全な記述については、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６８２８４２２を参照のこと。これは参照により全体が本明細書に組み込まれる。後者の成熟の最終目的は、特異性を増大させながらＣＣＬ−２に対する０３５４８の親和性を改善することにあった。
成熟の前に、カニクイザル及びネイティブヒトＭＣＰ−１に対する、親和性ではなく結合のみがビアコアＦａｂ捕捉モードで測定された。７つの親Ｆａｂは全て、成熟のための前提条件であるカニクイザル及びネイティブＭＣＰ−１の両方に対する結合を示した。
親ＩｇＧの結合特異性。７つの親Ｆａｂ全てのＩｇＧ１への転換後、ＩｇＧ形態について交差反応性実験を繰り返した。エオタキシン３はセンサーチップ上でデキストラン表面に非特異的に結合し、この非特異的結合はカルボキシルメチルデキストランを添加することにより競合させて取去ることができた。その他のケモカインのデキストラン表面に対する非特異的結合も可能であったことから、全てのビアコア特異性アッセイにおいてカルボキシルメチルデキストランを添加した。Ｆａｂとは対照的に、２つのＩｇＧがヒトＭＣＰ−１に対する有意な結合を全く示さず、興味深いことに、全ての成功基準を満たした４つの最終バインダー全てが１つの親Ｆａｂから来ていた。
表面上の捕捉抗体の量により、ＭＣＰ−１の結合シグナル（応答単位）を正規化した。すなわちモル結合比＝（結合した抗原のＲＵ／抗原のＭＷ）×（ｍＡｂのＭＷ／表面上に捕捉されたｍＡｂのＲＵ）であり、０．５未満のモル結合比が有意でないものと予想された。４つのＩｇＧが、ＭＣＰ−１に対して０．５超、及び全相同体ケモカインに対し０．５未満の正規化された結合比を示し、したがって、ＩｇＧレベルで特異的と称された。１つのＩｇＧも同様に、Ｆａｂレベルですでに検出されたＭＣＰ−２及びエオタキシンに対する幾分かの結合を示したが、この交差反応性はＩｇＧレベルで削減された。ＭＯＲ０３４６８ＩｇＧのデータは示されていない。
ＴＨＰ−１細胞（ＣＮＴＯ）に対するＩ125ＭＣＰ−１結合の阻害。ＩｇＧ１形式での親バインダーの中和活性を最初に放射性リガンド結合アッセイにおいてテストした。無関係のヒトＩｇＧ１を添加することによりＴＨＰ−１細胞上のＦＣ受容体をブロックした後、全ての親ＩｇＧについてＭＣＰ−１結合の阻害を検出することができた。４つのＩｇＧが、基準ＩｇＧＣ７７５の範囲内のＩＣ50値でＴＨＰ−１に対する放射性標識されたヒトＭＣＰ−１の阻害を示した。
カルシウム可動化の阻害（ＣＮＴＯ）。全ての親ＩｇＧは、ＴＨＰ−１細胞内でＭＣＰ−１誘導型のカルシウム可動化を阻害した。４つのＩｇＧが、基準ＩｇＧＣ７７５に比べて高い抗体濃度でＭＣＰ−１誘導型のカルシウム可動化の阻害を示した。
ＭＣＰ−１誘導型走化性の阻害（ＣＮＴＯ）。親Ｆａｂを走化性アッセイにおいてテストすることができなかったことから、ＭＣＰ−１誘導型走化性の阻害をＩｇＧ形式でテストした。テストされた親ＩｇＧは全て走化性アッセイにおいて活性であり、４つのＩｇＧは基準ＩｇＧＣ７７５に比べて高い抗体濃度でＭＣＰ−１誘導型走化性の阻害を示した。
実施例３：Ｌ−ＣＤＲ３／Ｈ−ＣＤＲ２カセットの並行交換による選択されたＦＡＢの親和性成熟
親和性成熟プロセスの要約
第１の成熟ラウンドにおいて、Ｌ−ＣＤＲ３最適化及びＨ−ＣＤＲ２最適化が並行して実施された。それぞれのＦａｂクラスからのＤＮＡを、成熟ライブラリ構築のためにプールした。それぞれのＤＮＡプールについてランダム化された配列によりもとの重鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３配列を置き換え、結果として６つの新しいライブラリすなわち３つのランダム化されたＨ−ＣＤＲ２と３つのランダム化されたＬ−ＣＤＲ３ライブラリを得た。６つのライブラリのそれぞれの多様性は、１０8超のユニークＦａｂであった。Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎがコーティングされたプラスチックウェル上で捕捉されたビオチンペプチドの溶液パニング又はパニングのいずれかのために、合成ＣＣＬ−２−４１Ｉ−ビオチン−Ｋ６９ペプチドを使用した。６つのライブラリのそれぞれをさまざまな条件下でパニングして、緩慢なオフ速度（すなわち長時間洗浄、低減された抗原濃度）でＦａｂについて富化させた。溶液及び半溶解パニングを含む３６の並行パニングを実施した。抗原濃度の低減、オフ速度選択及び長期洗浄の結果、ストリンジェントなパニング条件が得られた。バイオベリス（旧称ＩＧＥＮ）電気化学発光（ＥＣＬ）ベースのプラットフォームを用いて、親和性スクリーニングを実施し、改善された親和性での高生産性親和性等級付け及びＦａｂ分子の同定が可能となった。
Ｈ１Ａ及びＨ１Ｂの重鎖Ｈ−ＣＤＲ２ライブラリとしての親和性成熟用ライブラリを別々にクローニングし、７つの異なる可変領域ライブラリをクローニングした。その後２つのＨ１Ａ及びＨ１Ｂライブラリを選択に先立ちプールし、６つの選択ライブラリを得た。ライブラリサイズは、１０8〜８×１０9の範囲内であった。理論的多様性の０．６２５倍がなおも網羅されていたＭＯＲ０３５４８λ３ Ｌ−ＣＤＲ３ライブラリを除き、全てのライブラリについて全ての理論的多様性が網羅された。無作為に取り上げたクローンの配列決定により、ライブラリの品質管理を実施した。配列の７５個中７１個（９５％）が正確で多様であったが、７５個の配列のうち４個について、フレームシフトが検出された。全ての親Ｆａｂの誘導体がそのそれぞれのライブラリ内で見出された。
選択された抗体断片の親和性及び生物活性を増大させるために、フレームワーク領域が恒常に保たれる一方で、トリヌクレオチド誘導突然変異誘発（Virnekas et al, 1994）を用いたカセット突然変異誘発により並行してＬ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ２領域を最適化した。親和性成熟のためのクローニングに先立ち、全ての親Ｆａｂ断片を対応する発現ベクター（pMORPH（登録商標）X9_FH）からＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩを介してＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（商標）ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２５＿ＬＨＣ内に移送した。Ｈ−ＣＤＲ２最適化のためのライブラリクローニングと干渉する１つのＢｓｓＨＩＩ部位の除去により、ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標）表示ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２３＿ＬＨＣからＰＭＯＲＰＨ（登録商標）２５＿ＬＨＣを作り出した。親Ｆａｂ断片のプールのＬ−ＣＤＲ３を最適化するために、フレームワーク４、及びバインダープールの軽鎖（４０５ｂｐ）の定常領域ＢｐｉＩ／ＳｐｈＩにより除去し、フレームワーク４及び定常ドメインとともに、多様化されたＬ−ＣＤＲ３ｓのレパートリーで置き換えた。このＬ−ＣＤＲ３カセットの設計、合成及びクローニングについては、別途記述する予定である（原稿準備中）。５μｇのバインダープールベクターを、多様化されたＬ−ＣＤＲ３ｓを担持するインサート断片の３倍モル過剰でライゲートさせた。第２のライブラリセットにおいては、結合するフレームワーク領域が定常に保たれる一方で、Ｈ−ＣＤＲ２（ＸｈｏＩ／ＢｓｓＨＩＩ）を多様化させた。クローニング効率を監視するために、親Ｈ−ＣＤＲ２をダミーで置き換えてから、多様化したＨ−ＣＤＲ２カセットを中にクローニングした。４ｍＬの大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ細胞内で７つの異なるライブラリのライゲーション混合物を電気穿孔し（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）、１×１０8〜８×１０9個の独立したコロニーを生成した。このライブラリサイズは、理論的多様性を確実に網羅した。ライブラリの増幅を、前述の通りに実施した（Rauchenberger et al., 2003）。品質管理のため、単一のクローンを無作為に取上げ、配列決定した（SequiServe, Vaterstetten, Germany）。
親和性成熟のためのヒトビオチン−Ｋ６９ＭＣＰ−１（Ｖ４１Ｉ）に対する半溶解パニング。最適化ライブラリから取返した１×１０13個のファージを、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎでコーティングされたポリスチレンマイクロタイタープレートストリップ上に２回予備吸着させ、その後ケミブロッカーでブロックした（Chemicon, Temecula, CA, USA）。予備吸着させたファージ及び異なる濃度のビオチンＫ６９ＭＣＰ−１（０．０２〜５０ｎＭ）を溶液状態で２２℃で１．５時間インキュベートし、その後、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎでコーティングされたポリスチレンマイクロタイタープレートストリップ（PERBIO）に対しファージ−抗原複合体を捕捉した。２２℃での洗浄工程を、１２時間まで延長させた。１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の２０ｍＭ ＤＴＴによる溶出及びそれぞれのパニングラウンド間のファージミド増幅を、上述の通り行った。
親和性成熟のためのヒトビオチン−Ｋ６９ＭＣＰ−１（Ｖ４１Ｉ）に対する溶液パニング。上述の通りの親和性成熟ライブラリから取り出した１×１０13個のファージをケミブロッカー（Chemicon, Temecula, CA, USA）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（Sigma, St. Louis, MO, USA）でブロックし、Ｔｗｅｅｎ ２０なしでケミブロッカーによりブロックされたダイナビーズ（Dynabeads）（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン（Dynal Biotech, Oslo, Norway）上で２回予備吸着させた。パニングラウンドの間中抗原の低減を適用し、ビオチンＫ−６９ＭＣＰ−１の濃度は０．０１〜５ｎＭの範囲であった。ビオチン化抗原に結合しているファージを捕捉するために、ブロックされたダイナビーズ（Dynabeads）（登録商標）及び磁気粒子分離装置、ＭＰＣ−Ｅ（Dynal Biotech, Oslo, Norway）を使用した。洗浄工程（Rauchenberger et al., 2003）、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の２０ｍＭ ＤＴＴによる溶出及びそれぞれのパニングラウンド間のファージミド増幅を上述の通りに行った。更に、パニングストリンジェンシーを、オフ速度選択（Hawkins et al., 1992）及び長時間洗浄工程（最高６時間）により更に増大させた。
３３１２個のクローンをスクリーニングし、７個の親Ｆａｂのうちの４個に由来する８５個の最適化されたＦａｂを同定した。Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ２の両方において最適化されたＦａｂを同定し、２つの異なる親クローンの誘導体について、改良型軽鎖及び重鎖の交差クローニングを実施し、最高１００倍の、親和性（ＫD）における更なる改善を導いた。約１〜１０ｎＭで推定されたＫｄをもつ上位バインダー（約１００個）を配列決定して、４１個のユニークな改良型Ｆａｂの同定を導いた。改良型バインダーの大部分は、グループＩＩＩ（０３５４８）に由来していた。グループＩ及びグループＩＩにおいて付加的なスクリーンを行って、これらの成熟群においてより改良されたＦａｂを同定した。２９個の付加的なクラスＩ及びＩＩのバインダーを同定した。全体として、７個の親Ｆａｂのうちの５個に由来する８７個のユニークＦａｂを成熟プロセスにおいて同定した。表３は、成熟パニングの結果をまとめたものである。
Figure 2011517548
親クローン０３７４１及び０３５４８のＨ−ＣＤＲ２又はＬ−ＣＤＲ３のいずれかの中に、成熟したＦａｂ内のアミノ酸変化が位置していた。Ｆａｂの最良の軽鎖ＣＤＲ３と最良の改良型重鎖ＣＤＲ２の交差クローニングを次に実施して、更に高い親和性をもつＦａｂを生産しようと試みた。約３６個の交差クローンが生成された。全てのユニークＦａｂ配列を同様に、Ｎ−結合型グリコシル化部位の予測についてスクリーニングした。重鎖ＣＤＲ２内のグリコシル化のためのＮＩＳコンセンサス配列をもつわずかなＦａｂを同定した。これらのＦａｂを更なる特徴づけから除外した。合計８４のＦａｂを発現させ、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓで精製し、生物学的特徴づけのためＣｅｎｔｏｃｏｒに移した。
ビアコアを用いた親和性測定のための感度限界には、最適化Ｆａｂで達した。したがって、ＥＣＬベースの溶液平衡滴定（ＳＥＴ）により、親和性の値を判定した（Haenel et al., 2004, Analytical Biochemistry中での公表に提出されたもの）。親和性成熟の後、約１０ｐＭのＫDが達成され、値をＫｉｎｅｘＡを用いて確認した。放射性リガンドアッセイにおけるＦａｂ結合は、１１０ｐＭのＩＣ50を達成した。このようにして、ＭＣＰ−１親和性及び結合反応速度の両方が、親Ｆａｂに比べて最高１０００倍まで改善した。４つの最適化Ｆａｂは、９つの全ての成功基準を満たした。２つはＬ−ＣＤＲ３最適化Ｆａｂであり、２つはＬ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ２の最適化鎖からなる交差クローンであった。４個は全てＩｇＧ１に転換され、放射性リガンド結合アッセイにおいて１０ｐＭの最良のＫD及び２０ｐＭの最良のＩＣ50で、全てのテスト対象アッセイにおいて活性を保持した。１つの付加的な交差クローンＭＯＲ０３８９９は、ＦａｂとしてではなくＩｇＧ１として全ての成功基準を満たした。成功基準を満たした全てのバインダーは、ＭＯＲ０３４７１親Ｆａｂ（配列番号２、４）に由来していた。ユニークＦａｂであるＭＯＲ０３７９０は、表４Ｄ及び配列番号６、７、９、１３、１４及び１６内に記されている重鎖及び軽鎖可変領域配列を含み、ＭＯＲ０３４７１に基づく動物モデル内でのインビボ評価、スケールアップ製造開発、及びＩｇＧ生産のため選択された。
親和性成熟中のバイオベリススクリーニング。ＥＣＬベースのハイスループット親和性スクリーニングバイオベリスアッセイにより、親和性改良型Ｆａｂクローンを同定した。ヒット選択後、４つのサブクローンを同じ方法で確立した。
親和性成熟のためのパニング戦略。合計で３６個の異なるパニングを実施した。ストレプトアビジンビーズに対するファージ−抗原複合体の捕捉を伴うビオチン−Ｋ６９ＭＣＰ−１（Ｖ４１Ｉ）に対する１８回の溶液パニング。抗原濃度の低減、オフ速度選択及び長時間洗浄により、選択プロセス中のストリンジェンシーを増大させた。更に、ビオチン−Ｋ６９ＭＣＰ−１に対する１８回の半溶解パニングを実施し、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎプレートにファージ−抗原複合体を捕捉した。これらのパニングにおいては、抗原の低減及び長い洗浄によりストリンジェンシーを増大させた。
親和性成熟についてのバイオベリススクリーニング。成熟パニングにおいて及びまた、バイオベリスベースのスクリーニングのために、抗原ビオチン−Ｋ６９ＭＣＰ−１４１Ｉを使用した。改良型バインダーの同定のために、スクリーニングが非常に効率良く機能した。３６個のパニングのそれぞれについて、９２個のクローンをスクリーニングし、結果として３３１２個のスクリーニング済みクローンが得られた。合計して８５個の異なるユニーク最適化バインダーを同定した。３つのグループ全てから最適化Ｆａｂを見出した。更に、Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ２の中で最適化したＦａｂを同定することができ、ＭＯＲ０３４７１及びＭＯＲ０３５４８誘導体と命名されたＦａｂについての交差クローニングが可能となった。４６個の最適化ＦａｂがＭＯＲ０３５４８に由来し、Ｈ−ＣＲＤ２最適化に由来したＦａｂのうち３５個が、１１Ｌ−ＣＤＲ３で最適化されたＦａｂに比べ高い親和性及び活性を示した。しかしながら親ＭＯＲ０３４７１も同様に、この成熟において非常にうまく最適化されており、２３個のＦａｂがＬ−ＣＤＲ３内で、及び１個がＨ−ＣＤＲ２内で最適化された。７個の親Ｆａｂのうちの４個から改良型Ｆａｂが由来し、このことはそれぞれの親バインダーが異なる最適化潜在性を有することを表わしていた。最終的に、全ての成功基準を満たす４つのＦａｂが、ＭＯＲ０３４７１に由来し、２つがＬ−ＣＤＲ３のみにおいて最適化され、交差クローニングからの２つがＬ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ２において最適化された。
最適化されたＦａｂ分子の交差クローニング。ＨｕＣＡＬ（登録商標）技術のモジュール構造は、クローニング工程において２つの最適化された鎖を組合せるだけで、同じ親クローンに由来する最適化Ｆａｂの最適化軽鎖及び重鎖の急速な交差クローニングを可能にする。交差クローニングは、付加的な成熟ラウンドなく更に改善された抗体を得る潜在性をもつ高速方法である。一方では、２個のＬ−ＣＤＲ３最適化ＭＯＲ０３５４８誘導体を６個のＨ−ＣＤＲ２最適化ＭＯＲ０３５４８と交差クローニングさせて、１２個の交差クローンを導いた。他方では、２２個のＬ−ＣＤＲ３最適化ＭＯＲ０３４７１を１つの利用可能なＨ−ＣＤＲ２最適化ＭＯＲ０３４７１クローンと交差クローニングさせた。このプロジェクトにおいては、交差クローニングは成功し、２つの異なるＭＯＲ０３４７１由来の交差クローン、ＭＯＲ０３８５０及びＭＯＲ０３８７８を導き、これらは最終的に全ての成功基準を満たした。
１６個の予備選択された抗体の詳細な特徴づけ
親和性スクリーニングから同定された８５個の最適化Ｆａｂ及び付加的な３４個の交差クローン（上記参照）が結果として、利用可能なあらゆるアッセイによっても特徴づけされなかった合計１１９個の異なるユニークな最適化Ｆａｂをもたらした。したがって、１６個の最適化Ｆａｂを、放射性リガンド結合阻害におけるそのＩＣ50、カルシウム放出アッセイにおける活性、ＣＤＲ中のＮ−グリコシル化部位の欠如（表４Ａ及びＢ）及び親和性に従って予備選択した。更なる詳細な特徴づけには、特異性試験、ネイティブＭＣＰ−１に対する結合及びその中和、ヒト及びカニクイザルＭＣＰ−１に対する親和性、走化性アッセイにおける活性並びに全ての転換済みＩｇＧ１の特徴づけが含まれていた。
最適化Ｆａｂを表わすクローンは、表４Ａ−Ｃに示された配列によって表わされており、ここで、クローンＭＯＲ０３４７１親ＦａｂはＶＨ３ｘカッパ３フレームワークを有し、ＭＯＲ０３５４８はＶＨ１Ａｘラムダ３フレームワークを有する。所望の物理化学属性（ＣＤＲ中のＮ−グリコシル化部位なし）及び親和性及び生物活性の最適化された特性をもつ１７個の選択されたＦａｂは、いくつかの交代性のユニークＣＤＲ配列及び使用されたフレームワーク（ＶＨ３及びＶＨ１Ａ）内部のＨＣ−ＣＤＲ２及びＬＣＣＤＲ３配列間の代表的なコンセンサス配列、並びにより一般的に全てのＨＣ−ＣＤＲ１間の１つのコンセンサスを示す。これらのコンセンサス配列は、表４Ｃ〜４Ｅ及び配列番号２〜２６に示されている。
Figure 2011517548
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Figure 2011517548
Figure 2011517548
Figure 2011517548
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ビアコアにより測定されたネイティブＭＣＰ−１に対する結合。ネイティブＭＣＰ−１に対する結合をビアコアＦａｂ捕捉モードでテストし、選択された全てのＦａｂはネイティブＭＣＰ−１に対する結合を示した。特に、最適化されたＦａｂでビアコア内でのＫD測定についての検出限界に達したことから、親和性判定及び特異性確認のための代替的方法を使用しなければならなかった。
ＩｇＧ転換。詳細な特徴づけのために選択された全ての最適化ＦａｂをＩｇＧ１形式に転換させ、更に４つのＦａｂをＩｇＧ４形式にサブクローニングした。テスト対象のヒトＩｇＧ４の異なるアッセイにおける発現データ及び活性はそれぞれのＩｇＧ１のものと同じぐらい優れていた。
バイオベリスを用いた溶液平衡滴定。敏感なＫD判定の代替的方法として、バイオベリス技術を用いた溶液平衡滴定（ＳＥＴ）を実施した。Ｆａｂ及びＩｇＧのための適切な適合モデルを用いて一価の解離定数を計算した。この方法は、親和性測定及び交差反応性実験に適していた。バイオベリスを用いた溶液平衡滴定（ＳＥＴ）により全ての選択された１６のバインダーを分析し（表５及び表６）、これらの親和性値を最終的親和性値とみなした。Ｆａｂ及びＩｇＧとしてのＭＯＲ０３７５７、ＭＯＲ０３７８１、ＭＯＲ０３７９０、ＭＯＲ０３８５０、ＭＯＲ０３８７８、並びにＩｇＧとしてのＭＯＲ０３８９９を含む複数のバインダーが、０．５ｎＭ未満であるヒトＭＣＰ−１及び２０ｎＭ未満であるカニクイザルＭＣＰ−１に対する親和性成功基準を満たした。ヒトＭＣＰ−１に対する最良の親和性はＦａｂのレベルで２０〜４０ｐＭであり、ＩｇＧのレベルで１０〜２０ｐＭであった（表５）。カニクイザルＭＣＰ−１に対する最良の親和性は、Ｆａｂレベルで１０〜４０ｐＭであり、ＩｇＧレベルで２０ｐＭであった（表６）。
バイオベリスを用いた特異性試験。親和性以外にも特異性、特にエオタキシン及びＭＣＰ−２に対する交差反応性をバイオベリスを用いて溶液平衡滴定（ＳＥＴ）において分析した。テストを行った、選択した１６個のＦａｂ及び１５個のＩｇＧ（１６個の選択されたＩｇＧのうちの１つは利用不可能であった）のどれもが、ヒトＭＣＰ−２に対する交差反応性が全く検出不可能であった。ヒトＭＣＰ−１と同様、ヒトＭＣＰ−２は主としてＣＣＲ２受容体に結合し、一方でヒトエオタキシンは大部分がＣＣＲ３受容体に結合する。バイオベリスにおいて、ＭＯＲ０３７４４、ＭＯＲ０３７４７、ＭＯＲ０３７９０及びＭＯＲ０３７８１Ｆａｂ及びＩｇＧについてはヒトエオタキシンに対する交差反応性は全く検出不可能であり、一方ＭＯＲ０３８５０を含む１２個の選択したバインダーは、Ｆａｂ又はＩｇＧ形式でエオタキシンに対する幾分かの交差反応性を示した（データ示さず）。
ビアコア抗体捕捉モードでの最適化抗体の特異性（ＣＮＴＯ）。選択されたＩｇＧで特異性評価を実施した。ビアコア内で、捕捉した最適化抗体に対して１００ｎＭのヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２、３、４及びヒトエオタキシン１、２及び３を添加した。ＭＯＲ０３７９０、ＭＯＲ０３７９１、ＭＯＲ０３７４７、ＭＯＲ０３８５０、ＭＯＲ０３７４４、ＭＯＲ０３８４９、ＭＯＲ０３８７８、ＭＯＲ０３８８５、ＭＯＲ３８９９及びＭＯＲ０３７８１ＩｇＧは、相同体ケモカインに対する有意な結合シグナルを全く示さず、特異性成功基準を満たした（表６）。
ＭＣＰ−２に結合するＦａｂは、Ｔｈｐ−１細胞（ＣＮＴＯ）に対する125ＩＭＣＰ２結合を阻害しない。ビアコア内で検出されたエオタキシン及びＭＣＰ−２に対するＦａｂ結合活性が中和活性に移行したか否かを分析するために、Ｃｅｎｔｏｃｏｒで放射線リガンド全細胞結合アッセイが開発された。Ｉ125ＭＣＰ−２は、Ｔｈｐ−１細胞に対する優れた結合を示し、結合は、ＭＣＰ−１特異的参照抗体Ｃ７７５の添加によってではなく未標識ＭＣＰ−２の添加によって阻害された。結果は、結合／中和特異性をテストするための重要な機能的アッセイを提供した。受容体結合アッセイにおいては１ｎｇ／ｍＬのＭＣＰ−１が使用されたのに対し、ＭＣＰ−２の標識が活性の損失をひき起こした可能性があるため、このアッセイでは約１００ｎｇ／ｍＬのＭＣＰ−２が必要であった。ＭＯＲ０３７５４は、Ｔｈｐ−１細胞上のＣＣＲ２受容体に対する１２５Ｉ標識されたＭＣＰ−２結合の有意な阻害を全く示さなかった（ＩＣ50≧２μＭ）。
成熟したＦａｂは、ＴＨＰ−１細胞（ＣＮＴＯ）に対するＩ125ＭＣＰ−１結合を強力に阻害する。必要とされるＭＣＰ−１が１ｎｇ／ｍＬと少量であるため、このアッセイは、アッセイＩＣ50限界が、Ｆａｂについては約１００ｐＭ、ＩｇＧについては実に２０ｐＭというこのプロジェクト中最も感度の高いアッセイであった（表５）。最適化の後、Ｆａｂは、基準ＦａｂＣ７７５より低いＩＣ50でＴｈｐ−１細胞上のそのヒト受容体ＣＣＲ２に対するヒトＭＣＰ−１結合を阻害することになった。親ＭＯＲ０３４７１Ｆａｂは１８０ｎＭのＩＣ50を示し、最適化ＭＯＲ０３４７１Ｆａｂ誘導体（１８０ｐＭのＭＯＲ０３７８１、２６０ｐＭのＭＯＲ０３７９０、１６０ｐＭのＭＯＲ０３８５０、１１０ｐＭのＭＯＲ０３８７８及び１３０ｐＭのＭＯＲ０３８９９）は、最大１０００倍の倍率で最適化中に活性の全体的な改善を示した。このアッセイはこのプロジェクトにおいて利用可能な最も感度の高い生物アッセイであったが、このアッセイにおいてさえ、最適化バインダーはアッセイ限界に達したようであった。
成熟したＩｇＧは、ＴＨＰ−１細胞（ＣＮＴＯ）に対するＩ125ＭＣＰ−１結合を強力に阻害する。無関係のヒトＩｇＧ１を添加することによるＦｃ受容体結合部位のブロックは、放射性リガンドの結合及びカルシウム可動化アッセイにとって重要であった。テストされた全てのＩｇＧ１は放射性リガンド結合アッセイにおける活性を保持した。最適化されたＭＯＲ０３７８１のＩＣ50値は２０ｐＭであり、ＭＯＲ０３７９０については３０ｐＭ、ＭＯＲ０３８５０については５０ｐＭ、ＭＯＲ０３８７８については３０ｐＭそしてＭＯＲ０３８９９については５０ｐＭであった。ＭＣＰ−１誘導型ＣＣＲ２受容体内在化の阻害ＦＡＣＳアッセイの開発。受容体内在化アッセイは、ＴＨＰ−１細胞よりも高いＣＣＲ２発現を示すＣＣＲ−２を発現する細胞を用いて実施され、より優れた信号対雑音比を導いた。第１に合成ヒトＭＣＰ−１をアッセイ内で滴定してＥＣ50値を決定した。ＭＣＰ−１についてのＥＣ50値は１１６ｎｇ／ｍＬであることがわかった。したがって、更なるＦＡＣＳアッセイのために１００ｎｇ／ｍＬ（約１１ｎＭ）のＭＣＰ−１を選択した。更に、完全な内在化を得るための最適なインキュベーション時間を３７℃で評価した。大部分の内在化は最初の３０分以内に発生した。したがって、全ての後続するアッセイにおいては、１時間のインキュベーション時間を用いた。ＩＣ50の判定を可能にするように、アッセイを開発することに成功した。ＭＣＰ−１誘導型受容体内在化を阻害するために用いられる０．００１〜２００μｇ／ｍＬの間のＦａｂ又はＩｇＧの活性及び等級を測定した。選択された最適化バインダーは、ＭＣＰ−１誘導型受容体内在化の優れた阻害を示した。（データ示さず）Ｆａｂの２つの異なるバッチを並行してテストし、再現性が実証された。
Ｆａｂを用いた内在化アッセイに関しては、ＭＯＲ０３７９０については５ｎＭのＩＣ50を、ＭＯＲ０３８５０については４ｎＭ、ＭＯＲ０３７８１については７ｎＭ、ＭＯＲ０３８７８については５．３ｎＭ、そしてＭＯＲ０３８９９については３．３ｎＭのＩＣ５０を検出した（表６）。ＭＯＲ０３７８１ＩｇＧ１も同様に７ｎＭを示し、これは、ＩｇＧ転換の後に活性が保持されたことを表わしていた。
カルシウム可動化の阻害（ＣＮＴＯ）。ＭＣＰ−１は、フルオロフォアの助けを借りて検出できるＴＨＰ−１細胞内のカルシウム可動化を誘導する。最適化された抗体は、カルシウム可動化の強力な阻害を示し、４つの最終的な候補ＭＯＲ０３７８１、ＭＯＲ０３７９０、ＭＯＲ０３８５０及びＭＯＲ０３８７８Ｆａｂは、１８〜２８ｎＭのＩＣ50値を示した。それぞれのＩｇＧはここでも活性を保持し、１つのＩｇＧにつき２つのＭＣＰ−１分子を中和するその能力のため、約６〜１０ｎＭよりもわずかに優れたＩＣ50値さえ示した。ここでもまた、約１０ｎＭでアッセイ限界に達したようであった。
ネイティブＭＣＰ−１誘導型カルシウム可動化の阻害。ＰＡＮＣ１上清からネイティブＭＣＰ−１を精製し、カルシウム放出の誘導のために使用した。最適化Ｆａｂは、参照抗体Ｃ７７５に比べて更に高い活性で、ネイティブＭＣＰ−１誘導型カルシウム可動化の阻害を示した。ここでもまた、アッセイ限界には約１０〜２０ｎＭのネイティブＭＣＰ−１で達するようであった。
走化性阻害。潜在的非特異性効果に起因して、親Ｆａｂを走化性アッセイにおいてテストすることはできなかったが、成熟後はテスト対象のＦａｂ全てが走化性を阻害し、これは活性の増大によるものであると考えられた。テスト対象の全ての最適化ＩｇＧは走化性アッセイにおいて活性であった。アッセイは半定量的であることから、適切なＩＣ50値は全く判定できなかった。
参照抗体Ｃ７７５での競合結合。ＭＯＲ０３５４８由来の全てのあらかじめ選択されたＦａｂは、競合固相形式でＣ７７５のＭＣＰ１に対する結合を完全に阻害した。７つのＭＯＲ０３４７１由来のあらかじめ選択されたＦａｂは全て、このアッセイにおいて部分的（約６０％）競合を示した。
要約データ
Figure 2011517548
実施例４：治療候補の選択
最終治療候補、ＣＮＴＯ８８８の選択と生成
その軽鎖ＣＤＲ３配列（表４Ｂ及びＤ、配列番号１５及び１６）のみが異なっている２つのｍＡｂ、３７８１及び３７９０は、アッセイにおいてほぼ同一の生物学的活性を示した。潜在的ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを同定し、候補がＨＬＡ結合エピトープに関して有意に異なっているか否かを判定するためにインシリコ免疫原性分析を実施した。分析は、ｍＡｂ３７９０が免疫原性についてｍＡｂ３７８１より低い潜在性を示すことを予測した。この分析そして表６に示したその他の生化学的及び生物学的分析に基づいて、重鎖ＶＨ１Ａフレームワーク領域（配列番号２）及び重鎖ＣＤＲ領域、配列番号６、７、及び９；及び軽鎖カッパ３フレームワーク（配列番号４）及びＣＤＲ領域、配列番号１３、１４及び１６を含む３７９０を最終的な治療用ｍＡｂとして選択した。
ｍＡｂ ３７９０のＮ−末端配列は、クローニング中に導入されたアミノ酸変化に起因して、ヒト生殖細胞株配列からの一定の変動。更に、アミノ酸コドン（すなわちＤＮＡ配列）は原核細菌細胞内での偏向された最大発現であった。生殖細胞株配列に対する不完全なＮ−末端整列を修正し、高度に発現されたヒトタンパク質において好まれるものに対するコドン偏向を変更するように、ＭＡｂ ＤＮＡを再合成した。配列修飾された３７９０ｍＡｂは、それぞれ配列番号２７及び２８の重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むＣＮＴＯ ８８８として命名され、以下に（ＣＤＲｓに下線付き）、ここで重鎖のＮ−末端残基は、ＱＶＱ（Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ）でありかつ／又は軽鎖はＥＩＶ（Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ）である。
ＣＮＴＯ８８８重鎖可変配列（配列番号：２７）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＤＧＩＹＧＥＬＤＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＣＮＴＯ８８８軽鎖可変（配列番号：２８）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＤＡＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＳＲＡＴＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＨＱＹＩＱＬＨＳＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＣＮＴＯ ８８８の生化学的及び生物物理化学的特徴づけ。ＣＮＴＯ ８８８は、完全ヒトＩｇＧ１カッパ抗体である。該配列中には、予測されたＮ−連結型グリコシル化部位は全く存在しない。ＣＮＴＯ ８８８（ＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現され、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーにより精製されたもの）の生化学的及び生物物理学的特性を、結合親和性（Ｋｄ）及び特異性について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、質量スペクトル（ＭＳ）及びビアコアにおいて特徴づけた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、ネイティブＣＮＴＯ ８８８は、約１５０ｋＤａで単一バンドとして移動する。還元され／アルカリ化されたＩｇＧは、約６０ｋＤａ及び３３ｋＤａで２バンドとして移行する。ＣＮＴＯ ８８８のサイズ排除クロマトグラフィーは、ＩｇＧが、レミケードＩｇＧ対照（データ示さず）について測定されたものと同じ溶出体積で単一ピークとして溶出することを実証した。最終的に、ＭＳ分析はＣＮＴＯ ８８８が１４７，０００Ｄａの質量を有することを示した（データ示さず）。ビアコア分析は、ヒト及びカニクイザルＣＣＬ−２に対するＣＮＴＯ８８８結合親和性（Ｋｄ）が、それぞれ３０及び１０ｐＭであることを実証した。ＣＮＴＯ８８８は、ＣＣＬ−２関連ケモカイン、すなわちＭＣＰ−２、３、４並びにエオタキシン１、２及び３に対しビアコア内での検出可能な結合を示さなかった。
ＣＮＴＯ８８８のインビトロ特徴づけ。ＣＮＴＯ８８８の生物活性を、細胞ベースの様々なアッセイにおいて評価した。全ての成功基準アッセイにおいて評価された過渡的に発現されたＣＮＴＯ８８８は、親ｍＡｂ ３７９０と区別不能な活性を有していた（表５）。
実施例５：抗ＭＣＰ−１抗体のクローニング及び発現
ＣＮＴＯ８８８プラスミドｐ２８４４及びｐ２８８２を伴う大腸菌のアリコートは、それぞれ抗体の重鎖及び軽鎖を含有する。プラスミドｐ２８４４は、抗ＣＤ４重鎖プロモーターの下でＣＮＴＯ８８８コーディング領域の最適化重鎖コード配列を含有し、プラスミドｐ２８８２は、抗ＣＤ４軽鎖プロモーターの下でＣＮＴＯ８８８コーディング領域の最適化軽鎖を含有する。両方の構成体とも、ｇｐｔ選択遺伝子を内含して、ＭＨＸ（ミコフェノール酸、ヒポキサンチン及びキサンチン）に対する化学的耐性を与えている。それぞれのプラスミドを精製し、特徴づけし、定量しかつ配列決定した。
Ｃ４６３Ａ宿主細胞株の指数関数培養由来の細胞、化学的に定義された培地（ＣＤ−ハイブリドーマ）中での増殖に適応させたＳｐ２／０誘導体を、線形化したｐ２８４４及びｐ２８８２で同時電気穿孔した。４８時間後、細胞を１倍のＭＨＸ（ミコフェノール酸０．５ｍｇ／Ｌ、ヒポキサンチン２．５ｍｇ／Ｌ及びキサンチン５０ｍｇ／Ｌ）に曝露した。選択から３日後に、細胞生存率は１３％未満に低下し、この時点で約９０，０００個の生存細胞をメチルセルロース中に蒔いた。細胞を８〜１３日間乱さないでインキュベートし、その後スクリーニングし、Ｈａｌｏ手順を用いて２４ウェルのプレート中に採取した。培養を拡大させ、２４ウェル過成長力価を得た。
最高の親細胞株（１Ｃ４）は、７０ｍｇ／Ｌの２４ウェル過成長力価及び振盪フラスコ中（ＣＤ−ハイブリドーマ培地中）で１０８．５ｍｇ／Ｌの力価を有していた。この親細胞株Ｃ１２６２Ａを、振盪フラスコ中での更なる評価のために選択した。Ｃ１２６２Ａを、開発細胞バンク（Development Cell Bank（DCB））作製のため細胞バンキンググループ（Cell Banking Group）に提出した。Ｃ１２６２Ａ：ＤＣＢ；０２ＳＥＰ０４と命名されたＤＣＢからの細胞を、マイコプラズマ及び無菌性についてテストし陰性であった。振盪フラスコ中（大豆ペプトンの添加を伴う）におけるＣ１２６２Ａ細胞からの更なる調査研究の支援を目的としたＣＮＴＯ８８８の生産は、２３０ｍｇ／Ｌの力価に達し、２Ｌの培養から３６６ｍｇの精製ＣＮＴＯ８８８を生み出した。並行して、Ｃ１２６２Ａ細胞の付加的な９−Ｌ培養により、初期精製及び処方物開発用の約２ｇの粗製ＣＮＴＯ８８８材料が生産された。
親細胞株、Ｃ１２６２Ａを、Ｈａｌｏ手順を用いてサブクローニングし、５つの高生産性サブクローン細胞株を生み出した。最良のサブクローン細胞株（４Ｄ５）は、１５０．５ｍｇ／Ｌの２４ウェル過成長力価及び振盪フラスコ中（ＣＤ−ハイブリドーマ中）の１６７ｍｇ／Ｌの力価を有していた。このサブクローンされた細胞株を、Ｃ１２６２Ｂとコード化した。
実施例６：ＣＮＴＯ８８８でのヒト膵臓腫瘍の治療
本研究は、（ヒト腫瘍由来細胞が生産した）腫瘍ＭＣＰ−１のブロックが、マウス異種移植片中での腫瘍成長を抑制するか否かを調査するものである。腫瘍並びに宿主ＭＣＰ−１相同体、ＪＥの、悪性疾患の成長及び進行における役割を測るために、抗ヒトＭＣＰ−１及び抗マウスＪＥ抗体の両方を、インビボでのヒト膵臓腫瘍の成長を抑制する能力についてテストした。
ＢｘＰＣ−３膵臓腫瘍を有するマウスを、ヒトＩｇＧ１定常領域に融合された可変領域配列（配列番号２７及び２８）含む、ＣＮＴＯ８８８と命名されたヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体で処理した。ＣＮＴＯ８８８のインビボ活性を、宿主効果の阻害に最も効果的であることがわかっている、以前にテストされたマウス抗体と比較するために、ＣＮＴＯ８８８及びマウス抗ヒトＭＣＰ−１（Ｃ７７５）の両方を抗ｍｕＪＥ（Ｃ１１４２）と組み合わせて投与した。最終的な腫瘍重量の測定に基づくと、ヒト（ＣＮＴＯ８８８）及びマウス（Ｃ７７５）の抗ヒトＭＣＰ−１Ｍａｂは両方とも、腫瘍成長を有意に阻害した。
材料及び方法
ＢｘＰＣ−３はヒト膵臓癌由来細胞である。Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）腫瘍から調製されたマトリゲル（商標）は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（０．２ＥＵ／ｍｇ、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手した。
Ｃ７７５は、マウス抗ヒトＭＣＰ−１Ｍａｂであり、Ｃ１１４２はラット／マウスキメラ抗マウスＪＥ抗体であり、ラット可変及びマウス定常領域の両方が出願人の同時係属特許出願であるＵ．Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．１１／１７０４５３及び関連出願中で記載されている。対照抗体ｃＶａＭは、Ｃ１１４２及びＣ７７５についてのイソタイプ対照として役立つラット可変及びマウス定常領域からなるラット／マウスキメラＩｇＧ2aｋである。臨床グレードのヒトＩｇＧをＢｅｃｋｅｔｔ Ａｐｏｔｈｅｃａｒｙ ａｎｄ Ｈｏｍｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｉｎｃ，（Sharon Hill, PA）から入手し、これはＣＮＴＯ８８８のための対照として役目を果たす。
本研究では、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Raleigh, NC）から入手した雌のＳＣＩＤマウス（６〜８週齢）を使用した。マウスを、フィルタートップのプラスチックケージ内に集団収容し、加圧殺菌した食餌及び水を供給した。
ＢｘＰＣ−３細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地（完全培地）中で培養した。実験開始の４８時間前に細胞を１：３に分割した。実験当日に、単一細胞懸濁液を作成するために細胞をトリプシン処理し、トリプシンを中和するために該細胞懸濁液を１０倍容積の完全培地で洗浄した。細胞を遠心沈降させ、無血清ＲＰＭＩ中で再懸濁させた。マトリゲル（商標）を一晩４℃で解凍した。等体積のマトリゲル（商標）溶液及びＢｘＰＣ−３細胞を混合することによってマトリゲル（商標）腫瘍細胞懸濁液を調製した。癌細胞懸濁液の最終濃度は５ｍｇ／ｍＬのマトリゲル（商標）中５×１０6細胞／ｍＬであった。
０日目に、８０匹の雌ＳＣＩＤマウスに０．２ｍＬのＢｘＰＣ−３細胞懸濁液を皮下注射した。０．２ｍＬの細胞懸濁液は、１×１０6のＢｘＰＣ−３細胞及び１．０ｍｇのマトリゲル（商標）を含有していた。マトリゲル（商標）の重合を避けるために低温のシリンジを使用した。
Figure 2011517548
全ての動物を、実験の開始時及び実験中は週に１回計量した。ひとたび腫瘍の成長が観察されたところで（３．０ｍｍ3）、キャリパを用いてミリメートル（ｍｍ）単位で２次元（長さ及び幅）で腫瘍を測定した。腫瘍の成長についてマウスを観察し、［長さ×幅×幅］／２、の公式に基づいて腫瘍の体積（ｍｍ3）を計算した。
腫瘍細胞の移植後１４日目に、約５０ｍｍ3の平均腫瘍体積を有するマウスを５つのグループにランダム化した（ｎ＝１０／グループ）。治療（表７）を１４日目に開始し、実験の残りの期間、治療は週に２回の投与であった（１４日目に治療を開始した後５２日間）。実験の残りの期間、週に１回腫瘍を測定した。実験の終了時点で、ＣＯ2窒息によりマウスを安楽死させた。腫瘍を切除し、デジタル天秤上で秤量し、固定した。腫瘍をデジタルカメラを用いて撮影した。５０日目に、グループ３内の１匹のマウスが実験ガイドラインに基づく許容可能な限度を超過する腫瘍を有しており、これを屠殺した。この動物の体積及び重量は最終分析に内含されている。
腫瘍の重量に関して、データを標準線形モデル及び分散分析（ＡＮＯＶＡ）を介して分析した。別途指示のある場合を除いて、全てのテスト及び比較について０．０５未満のＰ値が有意と見なされた。等分散及び正規分布形状の根底にある前提がより良く満たされることから、対数目盛りを用いた。腫瘍をもたないマウスについての半ダースのゼロ値を、小スプライン補間値（０．００７２４０５３８）で置き換え、これによりデータ構造の破壊なく対数目盛り中における統計分析を容易にした。
腫瘍体積に関しては、反復測定モデルを、一次自己相関共分散構造を仮定したデータに適合させた。時間プロファイルにおける傾向の曲率を柔軟にモデリングするために、自然スプラインを使用した。各時間点でグループ間における一対比較を行った。計算は、Ｒソフトウェア環境で実施した。
結果
ＰＢＳ及びｃＶａｍ／ｈｕＩｇＧの両方の負の対照群が、５１日後に約３５０ｍｍ3に達する類似の腫瘍成長を示した。このことは、不適切な抗体による抗体治療は腫瘍成長を阻害しないことを表している。３つのテスト群（Ｃ７７５／Ｃ１１４２及びＣＮＴＯ８８８／Ｃ１１４２）における腫瘍の成長が負の対照群よりも緩慢であったが、このことは抗ＣＣＬ２／抗ＪＥ治療が腫瘍の成長に対してインパクトをもつことを表わしていた。Ｃ７７５／Ｃ１１４２及びＣＮＴＯ８８８／Ｃ１１４２（２ｍｇ／ｋｇ）グループは、１８日目から実験終了まで腫瘍体積によって測定されるように、ＰＢＳ対照群と比較して有意な腫瘍の阻害を示した。ＣＮＴＯ８８８／Ｃ１１４２（２０ｍｇ／ｋｇ）群は、ＰＢＳ対照群と比較して、１８日目から３９日目まで有意な阻害を示した。
５１日目の実験終了時点で腫瘍重量を得た（表８）。ＰＢＳ群１（マウス１匹）、Ｃ７７５／Ｃ１１４２群３（マウス３匹）及びＣＮＴＯ８８８／Ｃ１１４２群４（マウス２匹）には腫瘍のないマウスがいた。腫瘍重量を比較した場合、ＣＮＴＯ８８８テスト群はそれぞれ、ＰＢＳ対照群と比較して腫瘍重量の有意な低減を示した（表８）。２ｍｇ／ｋｇで投薬されたＣＮＴＯ８８８／Ｃ１１４２群における阻害百分率は、８０％（Ｐ＝０．００６）であったが、一方２０ｍｇ／ｋｇで投薬されたＣＮＴＯ８８８／Ｃ１１４２群については、阻害は６８％（Ｐ＝０．０４６）であった。Ｃ７７５／Ｃ１１４２群も同様に腫瘍成長の有意な阻害を示した（Ｐ＝０．００４）。腫瘍体積対腫瘍重量の結果の統計的解釈に見られた差異はおそらく、動物から切除された腫瘍秤量の精密さに比較して、キャリパによる腫瘍の体積測定が不精確であることに起因すると思われる。
Figure 2011517548
総じて、これらの結果は、確立されたＢｘＰＣ−３モデルにおいて、ＭＣＰ−１及びマウスＪＥのブロックが腫瘍の成長を有意に阻害していること、及びＣＮＴＯ８８８が抗腫瘍活性を有することを表している。
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実施例７：エピトープ特異的ＭＣＰ−１抗体
エピトープマッピングの目的は、モノクローナル抗体によって認識される特異的抗原領域（エピトープ）を同定することである。非常に親和性の高い抗体に関するモノクローナル抗体の特異性は、きわめて特異的であり、一部の高特異性抗体では、アミノ酸１つが異なる２つのタンパク質分子、又は、２つの同一分子で三次元構造が異なるものを区別することができる。結合及び認識に関与する残基の同定により、モノクローナル抗体の作用機序に関する重要な情報が供給され得る。抗体に結合する抗原の結合エピトープの同定には、いくつかのアプローチがこれまでに使用されている。タンパク質−タンパク質の相互作用と薬剤標的評価の実験に関する一般的な方法が広く適用されている（Tribbick, J. Immunol. Methods, 267：27-35, 2002）。親和性に基づくプロテアーゼ消化（Kelly et al., Anal. Chem. 74：1-9, 2002）、ペプチドライブラリ走査（Geysen et al., J. Immunol. Methods, 102：259-274, 1987）、差分化学修飾（Hochleitner et al., Protein Sci. 9：487-496, 2000）、水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換（Baerga-Ortiz et al., Protein Sci. 11：1300-1308, 2002）及び部位特異的突然変異誘誘発（Perrin et al., J. Biol. Chem. 275：34393-34398, 2000）の方法が、結合エピトープのマッピングに適用されている。
単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）はＣ−Ｃケモカインリガンド−２（ＣＣＬ−２）としても知られ、４つの保存システイン残基を有するタンパク質群の一員である７６個のアミノ酸（配列ＩＤ番号１）ケモカインである。ＭＣＰ−１は、Ｇタンパク質結合受容体の活性化により、炎症性及び非炎症性の細胞が感染又は外傷の部位へ移動するよう作用する（Fernandez and Lolis, Annu.Rev. Pharmacol.Toxicol, 42:469-99, 2002）。受容体活性化は、ケモカインアゴニストが受容体に特異的に結合し、続いてケモカインの立体構造変化が起こるという２段階プロセスである。この立体構造変化によりＮ末端が受容体Ｉと相互作用し、活性化を可能にする（Fernandez and Lolis, Annu.Rev. Pharmacol.Toxicol, 42:469-99, 2002）。ＭＣＰ−１は、喘息、アテローム性動脈硬化症、及び自己免疫疾患を含む数多くの疾病に関与している（Jarnagin et al. Biochemistry, 38：16167-16177, 1999）。血管新生実験では、モノクローナル抗体でＣＣＬ−２活性をブロックすると、乳癌腫瘍モデルにおいて血管新生が阻害されることが示されている。
ＭＣＰ−１及びその受容体の構造−活性の関係により、受容体の結合及び活性に関与する主な残基の同定が可能になっている（Paavola et al., J of Biol Chem, 273：33157-33165, 1998）。ＣＣＲ２の結合及び活性化に関与するヒトＭＣＰ−１上の領域の同定、並びに、抗体を中和するＭＣＰ−１特異性のエピトープの同定により、これら抗体がＭＣＰ−１の生物活性をブロックする機序が定義される。抗ヒトＭＣＰ−１モノクローナル抗体の中和活性にとって肝要な領域をマッピングすることにより、新しい治療法候補の的確な標的に関する貴重な情報が提供され、作用機序を定義するのに役立つ。
Ｃｅｎｔｏｃｏｒでの血管新生実験では、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ−２）活性を特異的モノクローナル抗体でブロックすることにより、乳癌腫瘍モデルにおいて血管新生が阻害されることが示されている。この結果に基づき、ＣＮＴＯ８８８（ヒトＩｇＧ１ｋ）及びＣ７７５Ａ（マウスＩｇＧ１ｋ）の２つの抗ヒトＭＣＰ−１中和モノクローナル抗体が、治療用及び代替用の抗体の可能性がある候補として選択された。中和活性に必要なＣＮＴＯ８８８残基の同定は、阻害機序の理解及び知的財産権の支援開発に役立ち得る。
ＣＮＴＯ８８８はヒトＭＣＰ−１を認識するがＭＣＰ−２は認識しない。加えて、ＣＮＴＯ８８８はヒトＭＣＰ−１を認識するがマウス相同体は認識しない。ヒトＭＣＰ−１とマウスＭＣＰ−１とは、アミノ酸配列整列において約６０％の相同性を示す。ヒトのタンパク質とマウスのタンパク質間の特異的残基の交換に基づいてＭＣＰ−１変異体の設計を実現するため、配列分析を使用した。組換えＭＣＰ−１タンパク質は大腸菌において発現され、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて精製された。野生型ＭＣＰ−１及びその変異体の両方の大きさ及び純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定され、タンパク質二次構造は円偏光二色性によって評価した。表面プラズモン共鳴（ビアコア）及びＥＬＩＳＡを使用して、ＣＮＴＯ８８８又はＣ７７５Ａに対するＭＣＰ−１変異体の結合親和性が評価した。結合データでは、ＭＣＰ−１に関するＣＮＴＯ８８８の結合親和性は、Ｃ７７５Ａのそれよりもはるかに高いことが示されている（３９ｐＭ対３ｎＭ）。変異分析により、ＭＣＰ−１残基4ＡＩＮＡ7（Ｎ末端に位置）及び46ＩＶ47（β2鎖とβ3鎖の間のループ領域に位置）が、ヒトＭＣＰ−１におけるＣＮＴＯ８８８結合エピトープに寄与していることが明らかになった。突然変異誘発データとＭＣＰ−１の構造とを組み合わせることにより、出願人らは、ＣＮＴＯ８８８とｈＭＣＰ−１との間の相互作用に関するモデルを開発した。このモデルはＭＣＰ−１とＣＣＲ２との相互作用を説明する突然変異誘発及び構造データと良好に相関している。
さまざまな技法を用いて、ＣＮＴＯ８８８によって認識されるヒトＭＣＰ−１の結合エピトープの同定を行った。ＣＮＴＯ８８８は、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓとの協力によりファージディスプレイによって誘導されたヒトＩｇＧ１であり、Ｃｅｎｔｏｃｏｒにて生産された。この抗体のエピトープマッピング及び特徴づけを下記に示す：
ヒトＭＣＰ−１に対するＣＮＴＯ８８８の結合特異性
ヒトＭＣＰ−１及びＭＣＰ−２に対するＣＮＴＯ８８８の結合特異性を検証するため、結合ＥＬＩＳＡを実施した。ＭＣＰ−１又はＭＣＰ２タンパク質をＭＳＤハイバインドプレート（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD）に、ウェル当たり５μｌ（２０μｇ／ｍＬ）で、１時間室温でコーティングした。５％のＭＳＤブロッカーＡ緩衝液（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD）１５０マイクロリットルを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを０．１Ｍ、ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ緩衝液で３回洗浄し、発現ＩＬ−１３上清を２５μＬ加え、静かに振盪して室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ緩衝液で３回洗浄した。ＭＳＤ Ｓｕｌｆｏタグで標識されたＣＮＴＯ８８８及び／又はＣ７７５を段階希釈し（１μｇ／ｍＬから０まで）、２５μＬの量を指定のウェルに追加し、振盪しながら室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。ＭＳＤ Ｒｅａｄ緩衝液Ｔ（MSD Read Buffer T）を蒸留水で希釈し（４倍）、ウェル当たり１５０μＬの量を分注し、ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００で分析した。この結果、ＣＮＴＯ８８８とＣ７７５のｍＡｂのいずれもがヒトＭＣＰ−１に結合したが、ＭＣＰ−２タンパク質には結合しなかったことが示された。
変異分析によるＣＮＴＯ ８８８のエピトープマッピング
ＣＮＴＯ ８８８の結合に寄与している特異的残基を同定するため、変異分析を行った。位置する残基を、個別に、ＭＣＰ−２に対応する残基に置換した。この配列整列を表９に示す。
Figure 2011517548
部位特異的突然変異誘発により、９個のＭＣＰ−１変異体が構築された。更に、二量体形成面の核に寄与する２つの残基（Paavola et al., J of Biol Chem, 273：33157-33165, 1998）が、個別に、アラニンに置換された。変異分析の標的となった残基は表１０に例示されている。
Figure 2011517548
変異タンパク質は、クイック・チェンジ（Quik Change）部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）を使用して構築した。ＤＮＡ塩基配列決定法によって、全ての配列を確認した。次にプラスミドをＯｒｉｇａｍｉ ＤＥ３ ＰｌｙｓＳ細胞に形質転換した。全サンプルの５μｇを４〜１２％のビス・トリス・ニューページ・ゲル（Bis-Tris NuPage Gel）上で泳動することにより、ＭＣＰ−１変異体の発現を確認した。
適切なタンパク質折り畳みを確認するため、円偏光二色性（ＣＤ）を用いて、ＭＣＰ−１変異体の二次構造を、野生型ＭＣＰ−１のものと比較した。２８０ｎｍ（Ａ280）での吸光度を用いて濃度を測定した。変異体サンプルＨｕＭＣＰ−１−Ｈｉｓ６及びＨｕＭＣＰ−１−Ｈｉｓ６は希釈せずに使用した。Ｄ−ＰＢＳで機器のゼロ点調整を行った後、Ａ280測定を行った。使用された吸光係数は８７３０Ｍ-1ｃｍ-1であり、ただし変異体Ｙ１３Ａについては、吸光係数７４５０Ｍ-1ｃｍ-1を使用した。ＣＮＴＯ ８８８の濃度は、提供された濃度値に基づいて算出した。
ＣＤ実験は、モデル２１５ ＡＶＩＶ ＣＤ装置（AVIV Biomedical, Lakewood, NJ）を用いて実施した。全ての実験において、光路長０．１ｃｍの矩形キュベットを使用した。ＨｕＭＣＰ−１−Ｈｉｓ６変異体及びＨｕＭＣＰ−１−Ｈｉｓ６変異体は、Ｄ−ＰＢＳ中２０μＭの濃度で調製し、２６０〜１９３ｎｍでスペクトルを記録した。スペクトル分析のため、平均残基モル楕円率［θ（ｄｅｇ ｃｍ2ｄｍｏｌ-1）］を算出した。このデータでは、全ての変異体の一般的構造特性が類似していることが示されている。ＣＤスペクトルによると、変異体Ｐ８Ａ及び変異体Ｙ１３Ａはよりコンパクトとなり、変異体５、８及び９はあまりコンパクトでないが、ただし、これらは折り畳まれていない。折り畳まれていないサンプルは、活性（折り畳まれている）及び不活性（折り畳まれていない）な変異体３のスペクトルに示されているように、ランダムコイルのスペクトル特徴を有している。
野生型ＭＣＰ−１及び変異体に対するＣＮＴＯ８８８の結合特異性を評価するため、結合ＥＬＩＳＡを実施した。５μＬ（４０μｇ／ｍＬ）のヒトＭＣＰ−１又はＭＣＰ−２をＭＳＤハイバインドプレートにコーティングし、前述の手順を用いてＥＬＩＳＡを実施した。ＥＬＩＳＡデータは、変異体２、５、７、８及び９が、野生型及び他の変異体１、３、及び６に比べて結合活性が低く約３０％であることを示している。
光散乱を用いた単量体ＭＣＰ−１変異体の特徴づけ
Ｐ８Ａ及びＹ１３Ａの２つのＭＣＰ−１変異体が単量体であることを確認するため、静的光散乱法（ＳＬＳ）を実施した。ＳＬＳに接続したサイズ排除カラム（ＳＥＣ）を使用して、野生型及びＭＣＰ−１変異体の溶液中分子量値を測定した。変異体、Ｐ８Ａ及びＹ１３Ａ。このペプチドの予想単量体分子量値はおよそ１０ｋＤａである。野生型ＭＣＰ−１は、再現性を伴って、測定分子量が約２０ｋＤａである単一ピークとして表われ、これは二量体形状と一致する。回収率は、供給濃度に基づき、約６２％であった。変異体Ｐ８Ａは測定分子量が約１１ｋＤａである単一ピークとして表われ、これは単量体と一致する。回収率は６４％であった。変異体Ｙ１３Ａは２つのピークとして表われた。搭載量の主ピーク（約７３％）が、単量体と一致する約１２ｋＤａの測定濃度を有する。タンパク質搭載量の約５％を構成する第二ピークが約２４ｋＤａの分子量を有し、二量体であることを示唆している。全体の回収率は８０％であった。Ｐ８ＡとＹ１３Ａの両方とも実際に単量体であるが、Ｙ１３Ａはごく一部が二量体形状であることが示された。これらのデータは、参照文献と一致する（Paavola et al., J of Biol Chem, 273：33157-33165, 1998）。
更に、単量体変異体に対するＣＮＴＯ８８８ｍＡｂの結合活性を評価するため、ＥＬＩＳＡ結合が実施された。この結果、ＣＮＴＯ８８８は、単量体変異体よりも、ホモ二量体である野生型ＭＣＰ−１によく結合することが示されている。
さまざまなＭＣＰ−１変異体に対するＣＮＴＯ８８８の結合親和性の特徴づけ
結合親和性（ｋｄ）が、全ての変異体について、ビアコアによって野生型ＭＣＰ−１と比較して評価された。ビアコア３０００オプティカルバイオセンサー（Biacore AB, Piscataway, NJ）を用いて、表面プラズモン共鳴実験が実施された。センサー表面は下記の通り調製された。実験用グレードＣＭ−５センサーチップを、２×２０μＬｍＭ ＮａＯＨで前処理し、次に２×２０μＬの１００ｍＭ ＨＣｌ及び２×２０μＬの０．１％ＳＤＳで処理し、各試薬注入の間には脱イオン水の注入が行われた。１．８ｍｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異性を、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で１０１倍に希釈し、アミンカップリング化学のメーカー説明を用いて、ＣＭ−５チップのカルボキシメチル化されたデキストラン表面にカップリングさせた（Johnsson, et al., Anal Biochem 198：268-277, 1991）。まとめると、センサー表面のカルボキシル基が、流速１０μＬ／分で５０μＬのＮＨＳ／ＥＤＣ混合物によって活性化された。これに続き、５０μＬのマウス抗ヒトＩｇＧが注入された。表面上の残りの反応基は、流速１０μＬ／分で５０μＬのエタノールアミン−ＨＣｌを注入することにより不活性化された。
実験は２５℃で行われ、少なくとも二つ組で行った。実験はプログラム化手法によって実施された。動態実験を実施するため、変異体ＨｕＭＣＰ−１−Ｈｉｓ６及びＨｕＭＣＰ−１−Ｈｉｓ６のストック溶液が、Ｄ−ＰＢＳで希釈された。これらの試料を希釈し、０．３〜１０ｎＭの範囲の濃度とした。１０．５ｍｇ／ｍＬのＣＮＴＯ ８８８溶液を希釈して０．５μｇ／ｍＬとした。この溶液を、５μＬ／分の速度でフローセル２に注入し、ＣＮＴＯ８８８を捕捉した。フローセル１は参照として使用した。ＣＮＴＯ ８８８の注入後、１８０μＬのＨｕＭＣＰ−１−Ｈｉｓ６又はＨｕＭＣＰ−１−Ｈｉｓ６変異体を５０μＬ／分で注入し（結合段階）、次に６００秒又は１８００秒の緩衝液フローを行った（解離段階）。チップ表面は、１００ｍＭ Ｈ3ＰＯ4を２０μＬ注入し、次に５０ｍＭ ＮａＯＨを６０μＬ／分で１０μＬ注入することにより、再生した。データを分析するために、参照差し引きデータから、緩衝液注入（抗原注入の代わりに）によって作成したデータを差し引く、二重の参照差し引きを実施した（Myszka, D.G., J Mol. Recognit. , 12：279-284, 1999）。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．０．１）（Biacore, AB）を使用して、１：１結合モデルを用い、データの網羅的解析を実施した。データが表１１にまとめられている。
Figure 2011517548
ＣＮＴＯ８８８のＭＣＰ−１に対する結合親和性は、変異体−５及び変異体−９の変異によって顕著に低下した。これらの結果から、ＭＣＰ−１残基4ＡＩＮＡ7（Ｎ末端に位置）及び46ＩＶ47（β2鎖とβ3鎖の間のループ領域に位置）が、ＣＮＴＯ８８８結合エピトープに寄与していることが明らかになった。しかしながら、この結合親和性は、単量体Ｐ８Ａ及びＹ１３Ａについては影響が少なかった。
Ｅ．ＣＮＴＯ ８８８及びＣ７７５モノクローナル抗体の、ヒトＭＣＰ−１に対する結合特異性の比較
別のモノクローナル抗体Ｃ７７５について結合エピトープを更に調べ、その結合エピトープをＣＮＴＯ ８８８と比較するため、ビアコアによって、ＭＣＰ−１変異体に対するＣ７７５ｍＡｂの結合親和性を評価した。前述の手順を用いた動態解析が実施された。このデータにより、ＭＣＰ−１に対するＣＮＴＯ８８８とＣ７７５のエピトープは顕著に異なることが明らかになった。表１２において、変異体−６（２７．７ｎＭ）の結合親和性（Ｄ66→Ｋ）は、Ｃ７７５に対する結合が、野生型ＭＣＰ−１（３．１ｎＭ）のそれに比べ、約９分の１である。ホモ二量体ＭＣＰ−１タンパク質と単量体ＭＣＰ−１タンパク質との間には、結合親和性の違いはない。
Figure 2011517548
ＭＣＰ−１変異体に対するＣＮＴＯ ８８８ ｍＡｂ及びＣ７７５ ｍＡｂの結合特異性を比較するため、ＥＬＩＳＡ結合分析を実施し、このデータは、これら残基4ＡＩＮＡ7及び46ＩＶ47と、単量体変異体Ｐ８Ａ及びＹ１３Ａは、ＣＮＴＯ ８８８に対する結合が６０％を上回る低下を示したが、Ｃ７７５に対してはそうではなかった。残基Ａｓｐ６６（Ｃ末端α−へリックスに位置）が、Ｃ７７５ ｍＡｂの結合エピトープに顕著に寄与している。
Ｆ．光散乱法を用いたＣＮＴＯ ８８８／ＭＣＰ−１複合体の特性づけ
ＭＣＰ−１タンパク質に結合するＣＮＴＯ ８８８の化学量論的特徴づけのために、ＣＮＴＯ ８８８と、野生型及び単量型ＭＣＰ−１変異体Ｐ８Ａとの複合体が、光散乱法により特徴づけられた。ＣＮＴＯ ８８８と過剰な野生型ＭＣＰ−１又はＰ８Ａタンパク質との混合物を、ＳＬＳに接続したＳＥＣによって分析し、これによりｍＡｂ−ＭＣＰ１複合体の溶液中分子量を決定した。ＣＮＴＯ ８８８に関しては、試料の９０％が１５５ｋＤａのピーク（ＩｇＧ）からなる。６．７ｕＭ ｍＡｂ：２０２ｕＭ ＭＣＰ−１タンパク質比でＰＢＳに加えられた、ＣＮＴＯ ８８８及び野生型ＭＣＰ−１又はＰ８Ａの混合物は、タンパク質の結合状態の相違を反映し、その複合体の異なる分子量分布を示す。野生型ＭＣＰ−１とＣＮＴＯ ８８８との複合体は大きく、分子量が２３０ｋＤａ〜３６０ｋＤａである。変異型Ｐ８Ａ複合体は、大きい複合体（ピーク＞２３０ｋＤａ）が６０％、小さいピーク（＜１８０〜２３０ｋＤａ）が４０％の分子量分布を有する。３６０ｋＤａの複合体（主に野生型ＭＣＰ１との複合体で見られる）は２つの二量体が２つのＩｇＧ分子と結合してなっている可能性があり、一方、１８０ｋＤａの複合体（Ｐ８Ａのみに見られる）は２つの単量体が１つのＩｇＧ分子に結合してなっている可能性がある。
要約すると、これらの結果は、単量体Ｐ８Ａは、ＩｇＧ単分子を含む比較的低分子量の複合体を形成し、一方で野生型ＭＣＰ１は、２つの二量体を結合し得る最高２つのＩｇＧ分子を擁すると考えられる複合体を形成していることを示す。ＣＮＴＯ ８８８／ＭＣＰ−１複合体の結合データと光散乱分析を合わせて、出願人らは１つのモデルを提案する。この仮説的モデルは、ＣＮＴＯ ８８８がホモ二量体ＭＣＰ−１タンパク質に結合し、２つのＩｇＧ−２二量体ＭＣＰ−１複合体を形成することを示している。ＣＮＴＯ ８８８は、単量体ＭＣＰ−１（例えばＰ８Ａ）のホモ二量体への移行を促進している可能性があり、これにより２ＩｇＧ−１二量体Ｐ８Ａの複合体を形成する結果となっている可能性がある。
利点
本研究において、ｈＭＣＰ−１に対するＣＮＴＯ ８８８の結合エピトープを同定するために、ヒトＭＣＰ−１及びＭＣＰ−２に関するＣＮＴＯ ８８８の結合特異性に関する情報が、部位特異的突然変異誘発と関連させて使用された。この標的アプローチにより、変異体タンパク質とモノクローナル抗体との間の結合活性の完全な特徴づけが可能になり、ｈＭＣＰ−１の活性を中和する特定の残基を標的とする基盤をなしている。出願人らは、ｈＭＣＰ−１上の２セットの残基、4ＡＩＮＡ7（配列番号１のアミノ酸４〜７）及び46ＩＶ47（配列番号１のアミノ酸４６〜４７）が、ＣＮＴＯ ８８８の結合エピトープに寄与していることを同定した。更に出願人らは、ｈＭＣＰ−１の構造を用いて、ＣＮＴＯ ８８８とｈＭＣＰ−１との間の相互作用のモデルを開発し、ＣＮＴＯ ８８８によるｈＭＣＰ−１の阻害機序を支持する仮説を提供している。
エピトープ情報及び化学量論に基づき、ＭＣＰ−１アンタゴニストの設計が可能である。例えば、これらの主な残基は、他のＭＣＰ−１アンタゴニストを同定するためのストラテジーを展開することができる。このようなアンタゴニストは、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用によって媒介される疾患を緩和するために使用することができる。更に、ＭＣＰ−１における中和エピトープの知識を用いて、インビトロディスプレイ技術を使用し、他のＭＣＰ−１アンタゴニストの選択を可能にする試薬の設計を行うことができる。
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以上の記述及び実施例中で特に記されたものとは別な形で本発明を実施できるということは明白であろう。
以上の教示に照らして、本発明の数多くの修正及び変形形態が可能であり、したがってこれらは、添付の特許請求の範囲内に入るものである。

Claims (27)

  1. 少なくとも１つの重鎖可変領域及び少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む、少なくとも１つの可変領域を含む少なくとも１つの単離された哺乳類ＭＣＰ−１抗体であって、配列番号１のアミノ酸４、５、６、７、４〜７、４〜５、４〜６、５〜６、５〜７、６〜７、又は４６、４７、４６〜４７、又はこれらの任意の組み合わせを含む少なくとも１つのエピトープに結合する、前記ＭＣＰ−１抗体。
  2. 少なくとも１つの重鎖可変領域及び少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む、少なくとも１つの可変領域を含む少なくとも１つの単離された哺乳類ＭＣＰ−１抗体であって、配列番号１のアミノ酸４〜７及び４６〜４７を含む少なくとも１つのエピトープに結合する、前記ＭＣＰ−１抗体。
  3. 少なくとも１つの重鎖可変領域及び少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む、少なくとも１つの可変領域を含む請求項１に記載の少なくとも１つの単離された哺乳類ＭＣＰ−１抗体であって、配列番号２７及び２８を含む重鎖及び軽鎖可変領域の両方を含む、前記ＭＣＰ−１抗体。
  4. 少なくとも１つの重鎖可変領域及び少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む請求項１に記載の少なくとも１つの単離哺乳類ＭＣＰ−１抗体であって、配列番号６、７、９、１３、１４、及び１６の重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の全てを含む、前記ＭＣＰ−１抗体。
  5. 少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含む、少なくとも１つの可変領域を含む少なくとも１つの単離哺乳類ＭＣＰ−１抗体とＭＣＰ−１に対して競合的に結合する、請求項１に記載の少なくとも１つの単離された哺乳類ＭＣＰ−１抗体であって、
    配列番号２７及び２８を含む重鎖及び軽鎖可変領域の両方を含む、前記ＭＣＰ−１抗体。
  6. 少なくとも１つの重鎖可変領域及び少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む、少なくとも１つの単離哺乳類ＭＣＰ−１抗体とＭＣＰ−１に対して競合的に結合する、請求項１に記載の少なくとも１つの単離哺乳類ＭＣＰ−１抗体であって、配列番号６、７、９、１３、１４、及び１６の重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の全てを含む、前記抗体。
  7. 配列番号６、７、９、１３、１４、及び１６のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を有する少なくとも１つの重鎖、又は軽鎖ＣＤＲを含む抗体とＭＣＰ−１ポリペプチドの同一領域に特異的に結合する、請求項１に記載の少なくとも１つの単離哺乳類ＭＣＰ−１抗体。
  8. 請求項１に記載のＭＣＰ−１抗体であって、少なくとも１０-9Ｍ、少なくとも１０-10Ｍ、少なくとも１０-11Ｍ、又は少なくとも１０-12Ｍから選択される少なくとも１つの親和性でＭＣＰ−１と結合する、前記抗体。
  9. 請求項１に記載のＭＣＰ−１抗体であって、少なくとも１つのＭＣＰ−１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を実質的に調節する、前記抗体。
  10. 請求項１に記載の少なくとも１つの単離された哺乳類ＭＣＰ−１抗体をコードする、単離された核酸。
  11. 請求項１０に記載の単離された核酸を含む、単離された核酸のベクター。
  12. 請求項１０に記載の単離された核酸を含む、原核又は真核宿主細胞。
  13. 請求項１１に記載の宿主細胞であって、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、ＹＢ２／０、骨髄腫、リンパ腫細胞、又はこれらの任意の誘導体、不死化細胞若しくは形質転換細胞から選択される少なくとも１つの前記宿主細胞。
  14. 少なくとも１つのＭＣＰ−１抗体を生産する方法であって、前記ＭＣＰ−１抗体が検出可能な又は回収可能な量で発現するように、インビトロ、インビボ又はインサイチュ条件下で、請求項１０に記載の核酸を翻訳することを含む、前記方法。
  15. 少なくとも１つのヒトＣＤＲ、及び少なくとも１つの製薬上許容できる担体又は希釈剤を有する、請求項１に記載の少なくとも１つの単離された哺乳類ＭＣＰ−１を含む組成物。
  16. 検出可能な標識又はリポーター、ＴＮＦ拮抗薬、抗感染薬、循環器（ＣＶ）系薬、中枢神経系（ＣＮＳ）薬、自律神経系（ＡＮＳ）薬、呼吸器薬、胃腸（ＧＩ）管薬、ホルモン薬、体液又は電解質平衡薬、血管系作用薬、抗腫瘍薬、免疫調整薬、眼、耳又は鼻用薬、局所薬、栄養製品、サイトカイン、又はサイトカイン拮抗薬から少なくとも１つ選択された、少なくとも１つの化合物又はポリペプチドを更に含む、請求項１５に記載の組成物。
  17. 請求項１に記載の少なくとも１つのＭＣＰ−１抗体と特異的に結合する、抗イディオタイプ抗体又は断片。
  18. 細胞、組織、器官又は動物におけるＭＣＰ−１関連の状態を診断又は治療するための方法であって、請求項１に記載の少なくとも１つの抗体の有効量を含む組成物を前記細胞、組織、器官又は動物に接触させるか又は投与する方法。
  19. 請求項１８に記載の方法であって、前記有効量が、前記細胞、組織、器官又は動物１キログラム当たり０．００１〜５０ｍｇである、前記方法。
  20. 請求項１８に記載の方法であって、前記接触又は前記投与が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺臓内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮から選択される少なくとも１つの方法による、前記方法。
  21. 検出可能な標識又はリポーター、抗感染薬、循環器（ＣＶ）系薬、中枢神経系（ＣＮＳ）薬、自律神経系（ＡＮＳ）薬、呼吸器薬、胃腸（ＧＩ）管薬、ホルモン薬、体液又は電解質平衡薬、血管系作用薬、抗腫瘍薬、免疫調節薬、眼、耳、又は鼻用薬、局所薬、栄養製品、サイトカイン、又はサイトカイン拮抗薬から少なくとも１つ選択された、少なくとも１つの化合物又はポリペプチドの有効量を含む少なくとも１つの組成物を、前記（ａ）接触又は投与の、前、同時、又は後に投与することを更に含む、請求項１８に記載の方法。
  22. 非経口、皮下、筋内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺臓内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内又は経皮から選択された少なくとも１つの様式により、前記少なくとも１つのＭＣＰ−１抗体を投与又は接触させることに適している、請求項１に記載の少なくとも１つのＭＣＰ−１抗体を含む医療デバイス。
  23. 請求項１に記載の少なくとも１つのＭＣＰ−１抗体の、溶液又は凍結乾燥形態を含む、包装材及び容器を含む、ヒトの製薬又は診断用途向けの製造品。
  24. 請求項２２に記載の製造品であって、前記容器が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮的送達デバイス又はシステムの構成要素である、前記製造品。
  25. 請求項１に記載の１つの単離された哺乳動物ＭＣＰ−１抗体を生産する方法であって、前記抗体を回収可能な量で発現する能力をもつ宿主細胞若しくはトランスジェニック動物、又はトランスジェニック植物若しくは植物細胞を提供する前記方法。
  26. 請求項２５に記載の方法により生産された、少なくとも１つのＭＣＰ−１抗体。
  27. 本明細書に記載された任意の発明。
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