KR20000006190A

KR20000006190A - 사람장애진단용마커

Info

Publication number: KR20000006190A
Application number: KR1019990022247A
Authority: KR
Inventors: 셰나한미쉘알; 벤츄리니알버트제이; 다이스존엘; 프리드만알란이
Original assignee: 스타크 마이클; 오르토- 클리니컬 다이아그노스틱스, 인코포레이티드
Priority date: 1998-06-15
Filing date: 1999-06-15
Publication date: 2000-01-25
Also published as: CN1247984A; NO992902D0; EP0969015A2; NO992902L; CA2273683A1; EP0969015A3; JP2000221191A

Abstract

본 발명은 대사성 및 영양성 장애, 위장 장애, 중추 신경계 장애, 및 자가면역 또는 저하된 면역성 장애를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 사람 장애에 관한 것이다.

본 발명은 더욱 구체적으로는, 본래 사람 조직과 체액에서 발견되는 분리된 펩타이드 및 이의 유도체를 포함하는 진단용 마커에 관한 것이다. 이들 펩타이드는 일관되게 아편제-유사 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌고/졌거나 아편제-유사 활성을 나타내는 펩타이드의 유도체이다.

Description

사람 장애 진단용 마커{Diagnostic markers for human disorders}

본 발명은 더욱 구체적으로는, 본래 사람 조직과 체액에서 발견되는 분리된 펩타이드 및 이의 유도체를 포함하는 진단용 마커에 관한 것이다. 이들 펩타이드는 일관되게 아편제-유사 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌거나 아편제-유사 활성을 나타내는 펩타이드의 유도체이다.

또한, 본 발명은 이들 펩타이드를 동정함으로써 이들 장애를 진단하는 방법 뿐만 아니라 이들 펩타이드를 탐지하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법으로는 면역검정 시험과 질량 분광법이 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

특히, 본 발명은 상기 펩타이드를 탐지하거나 정량화함으로써 식이와 관련된 형태의 자폐증과 같은 사람 장애를 진단하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 프롤린-풍부한 펩타이드의 이화작용에 관여하는 효소에 관한 것이다. 이러한 효소의 한 예가 디펩티딜 펩티다제 Ⅳ이다.

본 발명은 또한, 사람 장애를 치료하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 "사람 장애"에 관한 것이다. 본원의 목적상, "사람 장애"은 "대사성 및 영양성 장애", "위장 장애", "중추 신경계 장애", "자가면역 또는 저하된면역성 장애" 및 암을 포함하는 것으로 정의된다.

본원의 목적상, "대사성 및 영양성 장애"는 식료품, 비타민, 미네랄 또는 원소, 조인자 또는 염, 건강에 필수적인 원소의 "과흡수" 또는 "저흡수"와 연관이 있거나, 또는 소화 장애, 영양 결핍 또는 독성과 연관이 있는 모든 증상 또는 발병으로 정의된다. 추가의 대사성 장애에는 조직 파열이 포함될 수도 있다. 통상적인 장애로는 페닐케톤뇨증(1), 신부전증(2), 간질(3), 골다공증(4), 과펩타이드뇨증(5) 등이 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

본원의 목적상, "위장 장애"는 소화관, 및 대장, 소장, 담낭 및 간을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 신체내에서 섭취물의 저작과 연관이 있는 모든 증상이나 발병으로서 정의된다. 통상적인 장애로는 궤양(7), 용종(8), 악성 빈혈(9), 크론병(10), 설사(11), 급성 장 장애(ABD)(12) 등이 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

본원의 목적상, "중추 신경계 장애"는 뇌, 척추, 신경 또는 신경 조직, 또는 신경 피복물, 및 신체내에서의 정보 전이나 프로세싱 또는 행위 변화와 연관이 있는 모든 증상 또는 발병으로서 정의된다. 통상적인 예로는 정신분열증(13), 치매(14), 파킨슨병(15), 다발성 경화증(16) 등이 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 중추 신경계 장애, 및 자폐증 스펙트랄 장애(Autism Spectral Disorders; ASD)는 특히, 의사 소통, 학습 및 사회성에 영향을 미치는 평생 지니는 증상이다. 자폐증 스펙트랄 장애로는 주의력 결핍 장애(ADD), 주의력 결핍 기능항진 장애(ADHD), 아스퍼거병(Asperger's Syndrome), 광범위한 발육상의 장애(PDD) 및 자폐증 등이 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

본원의 목적상, "자가면역 또는 저하된 면역성 장애"는 특히 자기 자신에 대한 반응을 개시하는 자신의 면역 시스템 상의 변화와 연관되는 모든 증상 또는 발병으로서 정의된다. 이러한 면역 반응은 내인성이거나 외래성인 어떠한 물질에 의해서 야기될 수 있으며 백신 접종이나 감염 후에 유발될 수 있다. 통상적인 장애로는 소아 지방변증(18), 당뇨병(19) 및 HIV-관련 장애(20) 등이 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 대부분의 경우에 ASD의 희생자들이 정신 지체 질환에 걸리지는 않지만, 이들은 심각한 발육상의 신체 장애를 앓고 있다.

본원의 목적상, 암(21)은 모든 사람 및 동물 집단에서 발생되고 잠재적으로분열 세포로 구성된 모든 조직에서 야기되는, 미확인되고 아마도 복합적인 원인의 큰 질병 그룹을 일컫는 "악성 신생물에 대하여 통상적으로 이용되는 총칭적인 용어"로서 정의된다. 암의 기본 특징은 침입적인 성장과 전이를 통하여 숙주에게 심각하게 불리한 영향을 미치는 성장 및 기능에 대한 제어 저하로써 나타나는, 유전성 세포 기형이다.

지금까지, 자폐증 스펙트랄 장애는 상당 부분은 이들 증상을 구성하는 수 많은 중복되는 장애로 인해, 치료와 진단 모두에 대해서 과학적으로 불가해한 것으로 여겨졌었다.

자폐증 스펙트랄 장애로 진단된 개개인의 임상적으로 나타난 특징으로는, 반복적인 신체 운동, 보속증, 극도의 자기 도취, 급성 감각성 판별력, 및 종종 카세인과 글루텐을 함유하는 생성물을 포함하는 심각하게 제한된 식이가 있다.

초기 연구는 이상한 행위(정신분열증, 자폐증)와 특정 음식, 특히 밀 및 우유의 섭취 간의 상관 관계를 제시하였다. 이들 연구 및 기타 연구에서, 많은 환자들이 이들 음식을 이들의 식이로부터 제거함으로써 개선되어지는 것으로 여겨졌다. ASD에 걸린 어린이로부터 수득된 뇨를 크로마토그래피한 결과, 공통의 피크가 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이들 과학자들은 추가의 동정없이, 이들 공통의 피크가 식품으로부터 유도된 작은 펩타이드의 존재로 인해 야기된 것이라고 제안하였다. 이와 같이 제안된 펩타이드는 공지된 아편제-유사 활성을 지니기 때문에, 이들 펩타이드가 환자의 이상 기능 행위의 한 원인이라는 이론이 대두되었다.

지금까지, 자폐증 스펙트랄 장애를 포함한 이들 장애는, 상당 부분은 이들증상을 구성하는 수 많은 중복되는 장애로 인해, 치료와 진단 모두에 대해서 과학적으로 불가해한 것으로 여겨졌었다. 예를 들면, 자폐증은 단지 행위 만에 근거를 둔 진단 증상이다. 이들 행위는 편의상 표지된 자폐증 또는 자폐증 스펙트랄 장애가 나타내는 수 많은 증상의 최종적인 신경학적 경로의 구성 요소가 된다.

최근에, PKU, 란다우-클레프너(Landau-Kleffner) 증상, 프라자일(Fragile) X 증상, 렛트병(Rett's syndrome) 및 퓨린 자폐증과 같은 특정한 증상들을 ASD로부터 추려내었다. 몇몇 증상은 각종 방법을 통하여 치료될 수 있다. 추가로, 많은 형태의 자폐증이 루벨라(Rubella) 자폐증, CMV-관련된 자폐증 및 HIV-관련된 자폐증 현상에 의해 지시된 바와 같이, 면역 시스템 이상 기능과 관련이 있을 수 있다는 명백한 증거가 있다.

ASD는 복잡한 병인학을 지니고 있기 때문에, 특정한 진단 방법을 개발하는 것이 어렵다. 상당 비율의 자폐증 환자를 잠재적으로 포괄하고 있는 한 형태의 ASD는 글루텐/카세인 과민성과 관련이 있어 왔다. 글루텐/카세인이 없는 식이를 제공할 경우, 명백하게 이러한 형태의 ASD에 걸린 어린이들은 중간 내지는 상당 수준의 개선을 나타내었다. 글루텐/카세인이 없는 식이가 제공되었던 보다 나이가 어린 아이들(통상적으로 2살 미만)은 완전히 회복되었다는 논문이 간간히 보고된 바 있다.

특정한 형태의 ASD를 포함한 이들 많은 사람 장애를 진단하기 위한 생화학적 방법은 이용된 바 없다. 특히, 다발성 경화증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 및 글루텐/카세인 과민성과 관련된 ASD와 같은 사람 장애를 특이적으로 진단하기 위한 생화학적 방법을 제공하는 것이 유용할 수 있다. 가능한 한 초기에 효과적인 치료가 시작될 수 있도록 식이-관련된 자폐증에 걸릴 수 있는 어린이들을 확인하여 분류하는 것이 중요하다.

본 발명은 광범위하게는, 대사성 및 영양성 장애, 위장 장애, 중추 신경계 장애, 및 자가면역 또는 저하된 면역성 장애 또는 암을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 사람 장애에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 이들 펩타이드를 동정함으로써 이들 장애를 진단하는 방법 뿐만 아니라 이들 펩타이드를 탐지하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법으로는 면역검정법과 질량 분광법이 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

특히, 본 발명은 상기 연관된 펩타이드를 탐지하거나 정량화함으로써 식이와 관련된 형태의 자폐증과 같은 사람 장애를 진단하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로 언급하면, 자폐증 스펙트랄 장애와 같은 중추 신경계 장애의 진단은 통상적으로 행위 분석을 기초로 하여 이루어진 것이다. 상기 장애에 걸린 사람으로부터 유도된 생물학적 샘플 내에 존재하는, 특정한 유형의 사람 장애에 특이적인 물질을 탐지 및/또는 정량화함으로써 이들 사람 장애를 진단할 필요성이 있다. 앞서 언급된 바와 같이, 글루텐/카세인 과민성과 관련된 자폐증 스펙트랄 질환을 진단 및/또는 치료할 수 있는 생화학적 방법을 제공하는 것이 특히 유용하다. 이러한 필요성은 본 발명에 의해 충족되었다. 본 발명자들은 자폐증으로 진단되었거나 자폐증 스펙트랄 장애가 있는 것으로 분류된 환자의 아셋트로부터의 체 조직 및 체액, 특히 뇨 샘플이 각종 아편제-유사 및/또는 아편제 유도된 펩타이드를 함유한다는 사실을 밝혀내었다.

본 발명의 목적상, "자폐증 스펙트랄 장애"는 자폐증, 광범위한 발육상의 장애, 아스퍼거병, 주의력 결핍 장애(ADD) 및 주의력 결핍 기능항진 장애(ADHD)와 관련된 그룹 중에서 선택된 모든 장애로서 정의된다.

본원의 목적상, "진단용 마커"는 다음 특징들을 나타내는 마커로서 정의된다:

a) 소정의 집단에 대해 특이적이고;

b) 측정 가능해야 하고 이러한 측정치가 재생될 수 있으며;

c) 생물학적 샘플 내에서 탐지되기에 필요한 시간 동안 안정적이어야 한다.

본원의 목적상, "수용체"는 피부, 심부 조직, 내장 또는 특수한 감각 기관(이에 제한되지는 않는다)에서 각종 감각성 신경 말단 중의 어느 하나로서 정의된다.

본원의 목적상, "아편제-유사 펩타이드"는 아편제 또는 "아편제-유사" 수용체에 결합되는 아미노-말단 및 카복실-말단을 포함하는, 단백질성 또는 비-단백질성 분자로서 정의된다. "아편제-유사" 펩타이드는 효능제이거나 길항제일 수 있다. 아편제-유사 펩타이드의 예로는 모르핀, 카소모르핀, 더모르핀, 날록손, 프로엔케팔린, 엔케팔린 및 엔도르핀이 있지만, 이에 제한되지 않는다.

본원의 목적상, "아편제-유도된 펩타이드"는 반드시 아편제 및/또는 아편제-유사 활성을 나타낼 수는 없는 아편제-유사 펩타이드의 유도체인 모든 펩타이드로서 정의된다.

본원의 목적상, "아편제-유사" 수용체는 "아편제-유사" 및/또는 아편제 유도된 펩타이드와 결합하여 체내에서 국부적 또는 원격적으로 특정 반응을 종종 유발시키는, 세포 표면화되었거나 내부일 수 있는 단백질성 또는 비-단백질성 물질로서 정의된다. "아편제-유사 수용체"의 정의에는 아편제 수용체가 포함될 수 있다. "아편제-유사 수용체"의 예로는 뮤(m), 카파(k) 및 델타(d) 아편제 수용체가 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 이들을 G-단백질에 커플링시키면, 이는 호모렙틱(homoleptic) 또는 키메릭일 수 있다. 추가로, 각 수용체 유형의 아유형들이 있다. m, d 및 k 아편제 수용체 서열 간의 아미노산 동질성은 대략 60% 정도이다. 추정상의 막에 걸쳐있는 절편의 서열과 이들 절편을 연결하는 3가지 세포내 루프들은 고도로 보존된 반면, 세포외 NH2-말단 절편 두 번째 및 세 번째 루프의 서열과 세포내 COOH-말단은 다양하다. 이들 다양한 세포외 영역이 m, d 및 k 아편제 수용체에 대한 별개의 리간드 결합에 관여한다고 간주하는 것이 합리적이다.

뮤(m) 수용체는 모르핀과 길항제 날록손에 대한 친화도가 높다. 델타(d) 수용체는 내인성 신경전달자, 엔케팔린 및 길항제 날트린돌의 생물학적 효과를 매개한다. 카파(k) 수용체는 내인성 신경전달자, 디노르핀 및 길항제 노르-BNI의 생리학적 작용을 매개한다. 상이한 유형의 아편제 수용체는 별개의 CNS 영역에서 발현되고 행위상의 증거는 이들이 아편제 및 "아편제-유사" 펩타이드의 약리학적 작용을 선택적으로 매개할 수 있다는 것을 지시해준다.

본원의 목적상, "효능제"는 약물 작용을 개시시키기 위해 수용체와 결합할 수 있는 약물 또는 결합제로서 정의되고; 이는 친화성과 고유 활성을 지니고 있다.

본원의 목적상, "길항제"는 다른 물질의 작용을 길항시킬 수 있는 약물 또는 결합제로서 정의된다. 이는 효능제의 작용 또는 효과를 중화시키거나 방해한다.

본 발명자들은 앞서 논의된 바와 같은 펩타이드 중의 일부가 신경학적으로 활성이 있는 것으로 공지되어 있다는 사실을 확인하였다. 또한 본 발명자들은 이러한 펩타이드의 아미노산 서열을 결정하였다.

제1 양태에서, 본 발명은 뇨와 같은 체액에 특정 펩타이드가 존재하는지 또는 부재하는지에 따라서 특징화되는, 대사성 및 영양성 장애, 위장 장애, 중추 신경계 장애, 자가면역 또는 저하된 면역성 장애, 및 암을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 광범위한 잠재적인 장애에 대한 진단용 마커를 임상의에게 제공해준다.

본 발명의 제2 양태에서, 본 발명은 뇨와 같은 체액에 특정 펩타이드가 존재하는지 또는 부재하는지에 따라서 특징화되는, 대사성 및 영양성 장애, 위장 장애, 중추 신경계 장애, 자가면역 또는 저하된 면역성 장애, 및 암을 포함하지만, 이에제한되지는 않는 광범위한 사람 장애를 진단하는 방법에 관한 것이다.

제3 양태에서는, 본 발명은 아편제-유사 펩타이드를 포함하는 진단용 마커를 탐지하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법에는 면역검정법, ELISA 검정법, 키트, 및 생물학적 샘플 중에서의 아편제-유사 펩타이드의 존재 여부 및/또는 양을 탐지하기 위한 시험 장치가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 목적상, "생물학적 샘플"은 상피액, 조직, 혈청, 전혈, 배설물, 눈물, 뇌척수액 및 뇨로 정의되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

더욱 구체적으로 언급하면, 본 발명은 글루텐/카세인 과민성과 연관된 식이-관련된 형태의 자폐증과 연관된 펩타이드의 존재 여부를 특히 뇨 샘플에서 결정하기 위한 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 이들 아편제-유사 펩타이드를 명백하게 동정하고 생물학적 대표 샘플의 특징을 확인하기 위해 질량 분광법을 이용하는 방법에 관한 것이다. 생화학적 지시제, 특히 아편제-유사 활성을 나타내는 펩타이드를 탐지할 수 있다. 이들 펩타이드 중의 몇몇은 신경학적으로 활성인 것으로 공지되어 있으며 자폐증과 같은 특정한 사람 장애와 연관된 것으로 관찰된 행위 중의 몇몇 행위에 대해 책임이 있을 수 있다. 자폐증으로 확인된 환자로부터 수득된 뇨 샘플의 아셋트에서 동정되었고 신경학적으로 활성인 것으로 공지되어 있는 펩타이드로는 β-카소모르핀(13), α-글리아딘(14), 더모르핀(15), 델토르핀 Ⅰ, 델토르핀 Ⅱ(16) 및 모르핀 조절성 뉴로펩타이드(17)이 있다.

제4 양태에서, 본 발명은 이들 사람 장애, 예를 들면, 자폐증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

제5 양태에서, 본 발명은 이들 장애를 치료하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

제6 양태에서, 본 발명은 "아편제-유사" 수용체의 길항제 및 효능제, 및 길항제 및 효능제에 대해 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 정상적인 뇨 샘플의 고압 액체 크로마토그램을 도시한 것이다. A, B 및 C로 명명된 피크는 정상적인 뇨 샘플에 대한 참조 프로필을 포함하고 있다.

도 2는 자폐증 환자의 뇨 샘플에 대한 고압 액체 크로마토그램을 도시한 것이다. "아편제-유사" 및/또는 "아편제-유도된" 진단용 마커 피크가 15 내지 30분의 범위에 존재하는 것으로 나타났고, 도 1과 비교해서 참조 프로필 피크 상의 변화가 해당 환자가 자폐증 환자라는 것을 확인시켜 준다.

도 3은 자폐증 환자의 뇨 샘플에 대한 고압 액체 크로마토그램을 도시한 것이다. 상기 진단용 마커 피크가 15 내지 30분의 범위에 존재하는 것으로 나타났다.

도 4는 임상적으로 확인된 "회복된" 자폐증 환자의 고압 액체 크로마토그램을 도시한 것이다. 참조 프로필 피크가 도시될 뿐만 아니라 진단용 마커 피크가 부재하는 것으로 나타났다.

도 5 내지 8은 역상 HPLC로부터 수득된, 환자 뇨 샘플 분획에 대한 전기분무 질량 분광측정 분석을 도시한 것이다. 각 스파이크는 명시된 분자량의 단일 펩타이드를 나타내고, 각 수치로 확인된 뉴로펩타이드가 이에 상응하게 표지된다.

도 9는 해당 분획에 대한 역상 HPLC와 ES-MS 분석을 조합하여, 바이오마커 영역에서 용출되는 펩타이드를 동정한 것을 도시한 것이다.

도 10 내지 13은 모노클로날 항체에 대한 ELISA 데이타를 도시한 것이다.

도 14는 D-더모르핀에 대한 면역검정을 도시한 것이다. 본문에 기재된 항원-다운(antigen-down) 면역검정을 이용하여 D-더모르핀(사각형) 및 L-더모르핀(삼각형)에 대한 용량-반응 곡선을 작성한다. B/B₀는 각 펩타이드 농도에서 측정된 A₄₁₄를 펩타이드의 농도가 제로일 때 측정된 A₄₁₄로 나눈 값이다.

도 15는 β-카소모르핀에 대한 면역검정을 도시한 것이다. 본문에 기재된 항원-다운 면역검정을 이용하여 β-카소모르핀(사각형), 및 반전된 첫 번째 2개의 아미노산을 지닌 β-카소모르핀인 Tyr2caso(삼각형)에 대한 용량-반응 곡선을 만든다. B/B₀는 각 펩타이드 농도에서 측정된 A₄₁₄를 펩타이드의 농도가 제로일 때 측정된 A₄₁₄로 나눈 값이다.

도 16은 Derm 1.1.1.의 교차 반응성을 도시한 것이다. 본문에 기재된 항원-다운 검정을 수행함으로써 각종 펩타이드 각각에 대한 K_obs를 결정한다. K_obs는 측정된 A₄₁₄값을 억제성 펩타이드의 농도가 제로일 때 측정된 A₄₁₄의 값의 50%로 감소시키는데 필요한 펩타이드의 농도이다. Derm 1.1.1은 D-더모르핀의 아미노-말단 4개 아미노산(두 번째 위치에서의 D-알라닌을 제외한 모든 L-아미노산)에 대해 고도로 특이적이고, 델토르핀 Ⅱ와 고도로 교차 반응성이며, L-더모르핀(모든 L-아미노산)과는 반응성이 거의 없으며, β-카소모르핀 또는 α-글리아딘과도 본질적으로 반응성이 전혀 없다.

도 17은 Caso 4.2.2.의 교차 반응성을 도시한 것이다. 본문에 기재된 항원-다운 검정을 수행함으로써 각종 펩타이드 각각에 대한 K_obs를 결정한다. K_obs는 측정된 A₄₁₄값을 억제성 펩타이드의 농도가 제로일 때 측정된 A₄₁₄의 값의 50%로 감소시키는데 필요한 펩타이드의 농도이다. Caso 4.2.2.는 소의 β-카소모르핀의 아미노-말단 4개 아미노산에 대해 고도로 특이적이고, α-글리아딘, 더모르핀 또는 사람 카소모르핀과는 거의 교차 반응성이 나타내지 않는다.

"아편제-유사" 펩타이드 및/또는 "아편제-유도된" 펩타이드에 관한 다음 목록은 자폐증으로 진단된 환자로부터 수득된 뇨 샘플의 아셋트에서 동정된 것이다. 이들은 다음에 기재된 바와 같이 결정된, 모 단백질 또는 모 펩타이드 명으로 열거되어 있다. 다음 목록은 대표적인 "아편제-유사 펩타이드" 및 "아편제-유도된 펩타이드"이지만, 어떠한 방식으로든 이에 제한되지는 않는다.

모 단백질 또는 모 펩타이드 명으로 열거되고 관찰된 펩타이드 뿐만 아니라 본원에 열거된 기타 펩타이드는, 몇몇 경우에 있어서는 모 단백질 또는 펩타이드를 세균적으로 및/또는 효소적으로 분해시킴으로써 생성된 것일 수 있다. 신선한 뇨 샘플에는 단지 모 펩타이드(또는 단백질)만이 나타날 수 있다. 또 다른 한편, 상기 펩타이드는 내인성 대사작용으로부터 발생된 것일 수 있다. 현재, 이들 펩타이드 몇몇의 기원은 공지되지 않았다. 하이드록시프롤린[HYP](3-하이드록시프롤린 및 4-하이드록시프롤린)이 서열 목록(CRF)에서 Xaa로서 제시된 것이라는 것을 인지해야 한다.

본원의 목적상, "유도체"는 내인성 및 샘플 분해를 포함한, 모 펩타이드의 천연 분해 산물을 지시한다. 또 다른 한편, 유도체는 모 펩타이드에 대한 DNA 서열 암호화 영역을 적절하게 변형시켜 특정 변이체를 생성시킴으로써 모 펩타이드로부터 유도된 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 유도체는 또한, 본래의 아미노산 서열의 C-말단 및 N-말단 중의 어느 한 말단이나 양 말단에 하나 이상의 아미노산을 부가하거나, 본래의 아미노산 서열 중의 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 아미노산을 치환시키거나, 본래의 아미노산 서열의 어느 한 말단 또는 양 말단, 또는 본래의 아미노산 서열 중의 하나 이상의 부위에서 결실시키거나, 또는 모든 측쇄 결실 또는 형태상 변화를 포함한, 본래의 서열 중에서의 하나 이상의 아미노산의 삽입에 의해 발생될 수도 있다. 따라서, 이러한 유도체는 "아편제-유사 펩타이드" 또는 "아편제-유도된 펩타이드"일 수 있다.

다음 차트는 상기 펩타이드 서열 및 이들의 실질적인 분석에 관한 것이다. 이 차트에 열거된 것은 M+1 질량 값이라는 것을 인지해야 한다.

다음 분자량(분자 이온 ± 1)은 본 연구 과정 동안에 밝혀진 화합물에 대한 것이다. 질량 분광 분획화 패턴을 정립한 결과, 많은 자폐증 환자의 샘플에서 일관되게 나타나는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이들 화합물의 정체는 아직까지 밝혀지지 않았다.

733MW

755MW

511MW

488MW

463MW

458MW

441MW

479MW

상기 열거된 질량이 상응하는 펩타이드의 질량을 지니고 있긴 하지만, 다른 화합물도 이러한 질량 값을 공유할 수 있다는 사실을 인지해야 한다.

당해 분야의 숙련인은 본 발명의 양태가 어느 한 키랄 형태 또는 양 키랄 형태를 포함하는 것으로 인지할 것이다. D-Ala 및 L-Ala 중의 어느 한 형태 또는 양 형태가 동등하거나 필수적으로 등량으로 존재하거나, 또는 D 또는 L 이성체 형태 중의 단지 한 형태만이 혼합물 내에 존재하거나 우세할 수 있다. 그러나, 이러한 국면은 키랄 차이를 기준으로 하여 구별되지 않는 방법을 사용하여 이들을 탐지한다는 점에서 중요하지 않다.

자폐증 어린이의 뇨에 이들 아편제-유사 및/또는 아편제-유도된 펩타이드가 풍부하게 존재한다는 사실은 이들 어린이에게서 공통적으로, 정상적으로는 작은 펩타이드의 이화작용에 관여할 수도 있는 효소가 결핍되어 있다는 것을 제시해준다. 이러한 이론에 대해 상세히 설명하면, 결핍되는 효소가 이의 활성에 있어서 독특하고(다른 어떠한 효소도 유사하거나 중복되는 기질 특이성을 나타내지 않는다), 단일 유전자의 생성물(다중 이소엔자임이 존재하지 않는다)이며 정상적인 조건하에서는 생존에 필수적이지 않는 이화 사건에 주로 관련되는 것으로 여겨진다.

종합적으로 언급하면, 상기 언급된 펩타이드는 몇몇 독특한 특징들을 나타낸다. 구체적으로 언급하면, 대부분은 6 내지 8개 아미노산 길이이고, 많은 펩타이드가 N-말단 티로신 및 끝에서 두 번째 프롤린을 가지며, 몇몇은 다중의 반복되는 프롤린을 함유한다. 이와 같이 프롤린이 두드러지는 것은 프롤린-풍부한 소형 펩타이드의 소화에 관련된 효소가 몇몇 ASD 어린이에게서 결핍될 수 있다는 것을 제시해준다.

디펩티딜 펩티다제 Ⅳ/(DPPⅣ)CD26은 상기와 같이 예상되는 특징들 모두를 지니고 있으며, 몇몇 다른 성질들은 상기 효소가 1차적으로 결핍된 것이라는 사실을 제시하고 있다. DPPⅣ/CD26은 일반적으로, 장 쇄모 경계, 간의 담즙 캐니쿨라 막 영역 및 신장 피질을 포함한, 소형 펩타이드의 흡수와 관련된 조직 상에 발현된 융합 세포 표면 효소이다. 이는 끝에서 두 번째 프롤린을 함유하는 많은 펩타이드로부터의 N-말단 디펩타이드를 특이적으로 절단시킨다[참조: Yaron and Naider, 1993]. 사실상, 이의 특징적인 기질 중의 하나가 β-카소모르핀이다[참조: Kreilet al., 1983; Heymann and Mentlein, 1986].

DPPⅣ/CD26의 몇몇 다른 성질들은 자폐증 어린이에게서의 이의 잠재적이고 결정적인 역할과 일치한다. 이는 세포 표면-연관되는 효소들 중에서 이의 활성에 있어서 독특하고, 이는 염색체 2 위에 위치된 단일 유전자에 의해 암호화되며[참조: Mathew et al., 1994], DPPⅣ/CD26에서 동형접합체성 유전적 결핍을 지닌 랫트는 어떠한 명백한 병리학적 현상을 나타내지 않는다[참조: Erickson et al., 1992; Tirrupathi et al., 1993]. DPPⅣ/CD26의 또 다른 현저한 성질은 HIV에 의해 표적화된 집단인 CD4-양성 T 헬퍼 세포를 포함한 T-임파구 상에서 발현되는 것이다. 몇몇 HIV-감염된 환자는 눈에 띠는 HIV-연관된 자폐증을 나타낸다[참조: Moss et al., 1994; Brouwers et al., 1995]. 추가로, DPPⅣ/CD26는 또한, 자폐증과 연관된 또 다른 효소인 아데노신 데아미나제[참조: De Meester et al., 1994; Kameoka et al., 1993]에 대한 세포 표면 결합 단백질이다.

DPPⅣ/CD26의 결핍은 각종 기전에 의해 야기될 수 있다. 첫 번째로는 암호화된 효소가 몇몇 이유로 인해 발현되지 않거나 이상 기능을 나타내는 1차적인 유전적 결핍이 있다. 두 번째로는 자가면역 반응이 정상적인 효소의 기능을 억제시키는 항체를 포함할 수 있다는 것이다. 최종적으로, 감염성 제제, 가능하게는 심지어 소화관상 중의 하나도 DPPⅣ/CD26의 활성을 억제시키는 화합물을 생성시킬 수 있다.

이들 기전 중의 어떠한 것이 자폐증 어린이에게서 작동되는 경우에는, 락토즈를 락토즈 과민성인 사람에게 투여하는 것과 동일한 방식으로, 포유류 또는 비-포유류 DPPⅣ를 경구 보충함으로써 추정상 원인이 되는 소화관 결핍 영향으로부터 자폐증 어린이를 치료하는 것은 완벽하게 가능할 것이다. 따라서, 본 발명은 DPPⅣ/CD26를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 다음 실시예에서 추가로 예시되며, 이로써 본원의 특허 청구의 범위에 청구된 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다.

실시예 1

"아편제-유사" 펩타이드 및 "아편제-유도된" 펩타이드의 분리

생물학적 샘플 수거

주의력 결핍 장애(ADD), 주의력 결핍 기능항진 장애(ADHD), 아스퍼거병, 광범위한 발육상의 장애(PDD) 또는 자폐증 환자로 임상적으로 진단된 어린이로부터 뇨로 대표되는 생물학적 샘플을 수거하고 또한, ASD와 특이적으로 관련된 뇨 조성의 차이를 결정하는데 있어서 참조 샘플로서 사용할 "정상적인" 어린이(어린이는 상이한 속도로 발육하기 때문에, 발육상 또는 사회성이 지체되지 않고 비정상적인 식이 섭생을 하지 않는 그룹으로부터 전형적인 어린이를 무작위로 선별한다)로부터도 생물학적 샘플(뇨)을 수거한다.

멸균성 폴리프로필렌 표본 용기 내에 티몰(Sigma T-0501) 0.5g을 방부제로서 가하고 각 환자로부터 뇨 약 40ml를 수집한다. 샘플을 즉시 동결시키거나 처리한다.

고체 상 추출 방법:

동결시킨 샘플을 냉장고 또는 실온에서 해동시키지만, 37℃ 수욕에서는 결코 해동시키면 안되는데, 이는 이러한 온도에서의 해동시 샘플 분해가 야기되는 것으로 입증되었기 때문이다. 해동되었거나 신선한 각 샘플을 테이블 모양의 원심분리기에서 5분 동안 1000rpm으로 회전시킨 다음, 0.22㎛ 시린지 필터 및 10ml 시린지로 여과시키는데, 샘플 용량은 10ml을 초과한다.

Sep-Pak 카트릿지를 다중의 용매 플러쉬와 함께 준비한다. 2개의 메탄올 10ml 분취량을 먼저 점적 형식으로 공급하여, 상기 용매가 상기 카트릿지에서 평형화 되도록 이를 세정한다. 이어서, 메탄올을 2개의 물 10ml 플러쉬로 세정하고 또한 적가한다. 이어서, 수성인 0.1% TFA 10ml 분취량 1개를 서서히 공급하여, 샘플 부하 동안에 펩타이드 결합을 증진시키는데 필요한 조건으로 상기 칼럼이 평형이 되도록 한다. 공기를 상기 카트릿지로부터 취입하여 각각의 연속되는 플러쉬 간의 과량의 유체를 제거하는데, 단 0.1% TFA의 최종 플러쉬는 제외하고, 용매 몇 방울을 시린지 내에 잔존시켜 공기가 칼럼 내로 주입되는 것을 방지시킨다. 상기 샘플을 카트릿지에 즉시 공급하는데, 이때 카트릿지는 앞서의 0.1% TFA 플러쉬로부터 습윤된 상태로 유지되어 카트릿지 매트릭스와의 펩타이드 상호작용을 최대화시킨다.

상기와 같이 여과된 뇨 샘플 10ml를 상기와 같이 준비된 카트릿지에 적가함으로써 부가하는데, 이때 생물학적으로 해로운 폐기물로서 함유되어 처분되는 폐기물로 흐르기 시작한다. 수성인 2개의 0.1% TFA 5ml 분취량을 공급하여 결합되지않은 모든 물질의 카트릿지를 플러쉬시키는데, 각 용매 플러쉬 사이에 공기가 플러쉬되어 상기 매트릭스를 건조시킨다. 이어서, 수성인 0.15% CH₃CN+0.1% TFA 약 8ml를, CH₃CN이 상기 매트릭스와 상호작용하여 느슨하게 결합된 물질을 제거하는 시간 동안, 상기 카트릿지를 통하여 서서히 공급한다. 8ml 용량을 적용시킨 후에도 이러한 카트릿지 용출물이 여전히 색상을 띠는 경우에는, 용출물이 청정해질 때까지 1ml 씩 증량시키면서 더 많은 용매를 가하는데, 이러한 용출물이 청정하다는 것은 용출된 모든 펩타이드가 소수성 수준에서 탈착될 수 있다는 것을 지시해준다. 이어서, 공기에 의한 버블이 형성되지 않을 때까지 상기 카트릿지를 완전하게 건조 취입시킨다. 최종 펩타이드 용출을 100% CH₃CN 중의 2개의 0.1% TFA 5ml 플러쉬를 사용하여 수행하고 용출물을 수거한다. 이러한 플러쉬를 매우 느리게 수행하는데, 여기서 상기 용매를 평형이 되게하여 펩타이드를 완전하게 탈착시킨다(이러한 카트릿지는 플러쉬를 수행하지 않은 몇 분 동안 용매에 잔존해 있다). 최종 플러쉬가 끝날 무렵에 카트릿지를 건조 취입시켜 모든 펩타이드가 제거되었다는 것을 보장해준다.

최종 용출물을 질소 기체하에 40℃ 수욕에 놓아두고 증발 건고시킨다. 이어서, 이와 같이 처리된 샘플을 수성인 15% CH₃CN+0.1% TFA 500㎕로 재구성시키고, 진동 혼합기를 이용하여 격렬하게 진탕시켜 펩타이드 샘플을 완전하게 용해시킨다. 역상 HPLC 분석을 위해 100㎕ 분취량을 제거한다.

고압 액체 크로마토그래피 실험 조건:

워터스 시메트리(Waters Symmetry) C18 칼럼 상의 역상 크로마토그래피를 이용하여 ASD 증상에 대한 생화학적 마커로서 사용될 수 있는 펩타이드에 대한 뇨 샘플을 분석한다. 용매 A는 0.1% TFA 수성(V/V)으로 구성되고 용매 B는 95% 아세토니트릴/5% 물 중의 0.1% TFA이다. 용출 구배는 다음과 같다:

시간(분) %A %B

0 100 0

8 95 5

40 50 50

60 0 100

70 95 5

80 100 0

90 100 0

상기 구배에 대한 유속은 1.4ml/min이고, 샘플 주사 용량은 20㎕이며 UV 탐지는 215nm로 설정되었다.

HPLC 실험 결과

5개의 생활성 펩타이드를 표준물로서 사용하고 이들의 체류 시간을 결정한다: β-카소모르핀(Sigma C-5900), 옥시토신(Sigma O-4375), 글루카곤(Sigma G-3157), 루이신 엔케팔린(Sigma L-9133) 및 소마토스타틴(Sigma S-9129). 이들 펩타이드에 대한 재생산 가능한 체류 시간을 정립하였기 때문에, 뇨 샘플을 분석하고, 표준 펩타이드와 동일한 시간에 용출되는 피크를 추가의 분석에 고려한다. 이러한 HPLC 방법은 펩타이드의 탐지를 위해 특정하게 고안되었기 때문에, 표준물과 유사한 체류 시간을 갖는 뇨 샘플 중의 물질이 펩타이드인 것으로 여겨진다.

HPLC가 실체에 대한 명확한 증거를 제공하지는 못한다. 그러나, 전기분무 질량 분광법(ES-MS)은 화학적 실체를 명확하게 정립시켜줄 수 있다. 표준 펩타이드의 영역 내에서 용출되는, 펩타이드로 예상되는 물질을 펩타이드로서 명확하게 동정하고 다음에 기재된 바와 같은 ES-MS를 사용하여 이들의 아미노산 서열을 결정한다. 이러한 펩타이드의 아미노산 서열이 정립되면, 본 발명자들은 이들의 기원, 즉 다음에 논의된 바와 같이 이들이 명백하게 유도되는 모 분자(들)을 결정하기 위해 노력하였다.

몇몇 특징적인 프로필을 나타내는 일련의 피크가 정상인으로부터의 샘플에서 나타났으며 모든 환자가 자폐증인 것으로 진단되었다(정상적인 참조용 피크 또는 프로필로서 후술됨). 가장 큰 참조용 프로필은 16 내지 19분의 보유 시간을 나타내는 사중선 피크이다(도 1A). 이러한 피크 그룹이 모든 샘플에서 나타났으며, 이러한 피크의 상대적 높이에서는 약간의 편차가 있었다. 23±1 분의 용출 시간을 갖는 두 번째 단일 참조용 피크가 관찰되었으며(도 1B), 이의 높이는 샘플 마다 다양하다. 25±1분의 용출 시간을 갖는 세 번째 피크가 관찰되었으며, 이러한 높이는 사중선 영역에 대해 다양하다(도 1C). 이들 피크 모두를 조합하여 참조용 프로필을 형성하였다.

뇨 샘플을 이들의 공급원 및 크로마토그래피 행위를 기준으로 하여 3가지 그룹으로 분류하였다. 관찰된 첫 번째 그룹은 참조용 피크 프로필을 나타내는 정상적인 샘플이다. 관찰된 두 번째 그룹은 ASD로 진단된 환자로부터의 샘플의 아셋트이다. 이러한 그룹으로부터의 크로마토그램은 정상인의 것과 구별되지 않는다. ASD로 진단된 환자로부터의 샘플로 구성된 세 번째 그룹은 정상적인 참조용 피크에 덧붙여서 15 내지 30분 범위에서 용출된 바이오마커 피크를 나타내었다. 이러한 바이오마커 피크는 상기 언급된 표준 펩타이드와 동일한 영역에서 용출되었다(도 2 및 3).

연속적으로 글루텐 및 유제품이 없는 식이가 공급된, 자폐증으로 진단된 어린이로부터의 하나의 뇨 샘플은 바이오마커 피크의 부재를 나타내었다. 이러한 샘플은 정상적인 뇨에서 관찰되는 참조용 피크 프로필을 포함한다(도 4). 이러한 샘플에서의 바이오마커 피크의 부재가 ASD 증후군의 존재 또는 부재와 상관이 있을 경우에는, 이러한 부재가, 상기 환자가 ASD와 연관된 행위적 증상을 더 이상 나타내지 말아야 한다는 결론에 이르게된다. 사실상, 이러한 어린이는 임상적으로 ASD로 분류되지 않았었고 자폐증이 치유된 것으로 간주되고 있다.

뇨 샘플의 세 번째 그룹에서 바이오마커 피크와 연관된 펩타이드 모두가 생활성과 연계되지는 않았다. 그러나, 이들이 ASD로 진단된 환자의 뇨에서는 존재하지만 정상적인 샘플에서는 존재하지 않기 때문에, 상기 언급된 HPLC 방법은, 표면상으로 글루텐/카세인 과민성과 연관된 식이-관련 형태의 ASD에 대한 바이오마커로서 이들 펩타이드를 동정하는 수단으로 이용될 수 있다. HPLC/ES-MS 조합 방법(다음에 논의됨)은 이러한 형태의 자폐증과 생화학적으로 상관이 있기 때문에 이들 펩타이드 및 이의 계열 펩타이드를 특이적으로 동정하기 위한 수단(이들의 선형 아미노산 서열을 기준으로 함)을 제공해준다. 펩타이드 델토르핀 Ⅱ, 더모르핀 및 모르핀 조절성 뉴로펩타이드(및 이들의 유도체)의 존재가 식이와 관련되었는지의 여부가 공지되어 있진 않지만, 이들은 카세인과 글루텐 관련된 종과 연관되어 항상 발견되었다. 따라서, 뇨에 이들이 존재한다는 것이 글루텐/카세인 과민성 형태의 자폐증을 진단하는데 도움이 된다.

더모르핀, 델토르핀 Ⅱ 및 모르핀 조절성 뉴로펩타이드(및 이들의 유도체)가 환자의 샘플 내에서 발견되었다는 사실은 극도로 놀라운 일이다. 이들 펩타이드는 카세인/글루텐 계열과 함께 존재하기 때문에, 앞서 언급된 바와 같이 글루텐/카세인 과민성 형태의 ASD를 진단하는데 도움을 준다. 그러나, 이들의 존재가 또한 다발성 경화증(MS)과 같은 다른 신경학적 장애와 관련될 수도 있다. 이들은 또한, HIV 감염과 관련있을 수 있고/있거나 소화관 스트레스와 연관될 수도 있다. 본 발명자들은 이들 펩타이드가 글루텐/카세인 관련된 펩타이드 보다 뇨에서 보다 더 안정하다는 것을 관찰하였다(그러나, 본 발명자들이 이를 체계적인 방식으로 연구하지는 못하였다). 따라서, 이들 펩타이드는 카세인/글루텐 과민성 형태의 ASD를 진단하는데 특히 유용한 바이오마커로 간주된다.

전기분무 질량 분광법 실험 결과

ES-MS를 사용하여 펩타이드 성질을 확인하고 HPLC를 사용하여 관찰된 바이오마커 피크로 나타낸 종의 아미노산 서열을 결정한다.

ES-MS는 상기 펩타이드의 정확한 분자량과 이들의 아미노산 서열 모두를 제공한다. 제조 등급의 역상 크로마토그래피(상기 언급된 HPLC 조건하)를 이용하여 바이오마커 영역 내에 체류 시간을 갖는 특이적 분획을 수득한 다음, ES-MS를 이용하여 분석한다(도 5 내지 8). 일단, 해당 펩타이드의 화학적 실체가 정립되면, 이러한 펩타이드의 아미노산 서열을 단백질 데이타 베이스에서 입수 가능한 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 잠재적인 모 단백질을 결정함으로써 이러한 펩타이드의 잠재적인 기원을 결정한다. "펩타이드 스캔"(Perkin Elmer/Sciex 제공)으로 불리우는 조사 엔진을 비교 분석에 이용한다(유럽 분자 생물학 랩(EMBL) 비-중복성 데이타베이스(NRDB)를 활용한다). 생활성 영역에서 용출되는 펩타이드 단편의 조합물이 상기 샘플에서 동시에 생성되고 이러한 방식으로 용이하게 동정된다(도 9).

ES-MS를 사용하여, 본 발명자들은 정상적인 뇨 샘플(첫 번째 그룹)과 뇨 샘플의 두 번째 그룹이 바이오마커 용출 영역에 어떠한 펩타이드도 함유하고 있지 않지만, 세 번째 그룹으로부터의 샘플은 이러한 영역에 다중의 펩타이드를 함유하고 있다는 사실을 밝혀내었다. 식품 단백질 글루텐 및 카세인(각각 밀 및 우유 단백질)의 펩타이드 단편 뿐만 아니라 델토르핀 Ⅱ, 더모르핀 및 모르핀 조절성 뉴로펩타이드와 같은 공지되지 않은 기원의 펩타이드가 세 번째 그룹으로부터의 샘플에 존재한다. 이러한 식품 단백질의 펩타이드 단편은 풍부하지만, 모든 세 번째 그룹 샘플에 델토르핀 Ⅱ, 더모르핀 및 모르핀 조절성 뉴로펩타이드가 존재한다는 것은앞서 언급된 바와 같이 놀라운 사실이다. 정상적인 샘플이나 두 번째 그룹 샘플 어느 것도 이러한 식품 단백질 단편을 함유하고 있지 않을 뿐만 아니라 본원에 기술된 바와 같은 예상하지 못한 어떠한 펩타이드도 함유하지 않는다.

요약하면, HPLC 및 전기분무 질량 분광법을 이용하여, 본 발명자들은 25명의 ASD 환자의 뇨로부터 많은 고농도의 펩타이드를 분리하여 동정하였다. 상당 비율의 ASD 샘플(25명 중의 13명 샘플)에서, 본 발명자들은 고농도의 저분자량 아편제-유사 펩타이드, 특히 밀 글루텐으로부터의 α-글리아딘(NH₄-TyrProGlnProGlnProPhe-COOH) 및 소의 카세인으로부터의 β-카소모르핀(NH₄-TyrProPheProGlyProIle-COOH)를 발견하였다. 또한, 이들의 N-말단 사량체 및 오량체 뿐만 아니라 이들의 des-Tyr 형태를 포함한, α-글리아딘 및 β-카소모르핀의 추가의 파쇄 생성물은 명백하게 풍부하다. 본 발명자들은 또한, 모르핀의 아편 활성의 1000배인 더모르핀(NH₄-TyrAlaPheGlyTyrProSer-COOH), 델토르핀 Ⅱ(NH₄-TyrAlaPheGluValValGly-COOH) 및 모르핀-조절성 뉴로펩타이드(NH₄-PheLeuPheGlnProGlnArgPhe-COOH)를 포함한, 식품 공급원으로부터 명백하게 유도되지 않은 다른 아편제-유사 펩타이드를 발견하였다.

전술한 펩타이드를 ASD 환자의 뇨에서 발견한 것은 구체적으로 글루텐/카세인 과민성과 관련된 식이-유도된 형태의 ASD의 진단을 확인해주는 생화학적 수단을 제공해준다. 본 발명자들의 발견으로 인해, 임상의들은 적당한 어떠한 생화학적 방법을 이용하여 이러한 특정한 식이-관련된 ASD를 용이하게 진단할 수 있다. 따라서, 지금까지 동정된 펩타이드는 공지된 아편제-유사 활성을 지니고 있으며 모르핀 및 기타 아편제 효능에 의해 유도된 것과 유사한 행위를 자극할 수 있다. 이러한 모르핀 수용체의 자극으로 ASD와 연관된 이상한 행위가 나올 수 있다.

환자 뇨에서 바이오마커 펩타이드를 동정하는 경우, 행위에 대한 식이 영향을 예견할 수 있다. 특정 음식물을 배제시킴으로써, 환자가 발육상 장애로부터 회복되는데 도움을 줄 수 있다. 비-특이적이거나 규정되지 않은 기원의 다른 펩타이드의 존재는 부가의 발육상 장애 뿐만 아니라 효과적인 치료법을 지시할 수 있다.

실시예 2

마커 펩타이드에 대한 면역검정 개발

펩타이드 합성. 통상적인 방법에 의해 자동화 펩타이드 합성기 상에서 β-카소모르핀 및 D-더모르핀을 합성한다. 각각을 두 가지 형태로 준비한다: 1) 모델 항원 및 눈금 검사기로서의 본래의 펩타이드(Caso 및 Derm으로 후술됨) 및 2) 카복실 말단 상에 부가의 시스테인 잔기를 갖는 본래의 펩타이드(Caso-Cys 및 Derm-Cys로 후술됨). 각 합성 펩타이드의 순도 및 서열은 전기분무 질량 분광법으로 결정한다.

단백질 담체에 대한 펩타이드의 접합. 면역화, 스크리닝 및 면역검정 빌딩을 위해, Caso-Cys 및 Derm-Cys 펩타이드를 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소의 혈청 알부민(BSA) 및 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 각각에 접합시킨다. 간략하게 언급하면, 각 단백질을 하나의 말단에 말레이미드 그룹을 갖고 다른 말단에 N-하이드록시석신이미드 에스테르를 갖는 이종 이작용성 가교결합제와 반응시킨다(50배 몰 과량, 0.1M KPO₄, pH 7.5, 2시간, RT). 5mM EDTA로 0.1M KPO₄(pH 7.0)에 대하여 철저하게 투석시킨 후, 활성화된 단백질을 50배 몰 과량의 Caso-cys 또는 Derm-cys(0.1M KPO₄, pH 7.0, 5mM EDTA, RT, 20시간)와 반응시킨다. 과량의 유리 펩타이드를 세파덱스 G-25 상에서 크기 배척 크로마토그래피하여 제거한다. SDS-PAGE에서의 분자량 이동에 의해 접합 정도를 평가한다.

마우스의 면역화. 리비 보조액 중의 Caso-cys-KLH 또는 Derm-cys-KLH 100㎍을, 6주 내지 12주생 암컷 CAFI 마우스에게 3주 간격으로 복강내 주사함으로써 투여한다. 3회 주사한 후, 하이브리도마 제조를 위해 희생시키기 3 내지 5일 전에 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 면역원 100㎍을 최종적으로 복강내 주사한다. 항원을 각각 투여한지 1주 후에, 각 마우스를 출혈시키고, 다음에 기재된 ELISA 시험에 의해 항-펩타이드 항체에 대하여 이의 혈청을 스크리닝한다.

하이브리도마의 제조 및 스크리닝. 선별된 동물을 희생시키고 이들의 비장을 무균적으로 꺼낸다. 비장 세포를 분산시키고, 적혈구를 저장성 용해시켜 제거하고, 생성된 백혈구를, 필수적으로 문헌[참조: Lane RD 1985, J. Immunol Meth 81, 223-228]의 방법에 의해 SP2/0-Ag14 세포와 융합시키기 전에 둘벡코 변형된 이글스 배지로 광범위하게 세척한다. 생성된 하이브리도마를 96웰 미세배양판에 분배하고, HAT-배지에서 성장시킨지 10 내지 14일 후에 생성된 배양물을 대상으로 하여 스크리닝한다.

모노클로날 항체의 선별. 각 미세배양 웰을 대상으로 하여, 통상적인 효소연결된 면역흡착성 면역검정(ELISA)에 의해 항-Caso 또는 항-Derm 항체의 존재 여부에 대해 스크리닝한다. 96웰 미세검정판의 웰을 Caso-cys-BSA 또는 Derm-cys-BSA(2㎍/ml)를 함유하는 PBS 100㎕로 피복한 다음, PBS 중의 1% 오브알부민으로 차단시킨다. 세척 완충액(0.05% 트윈 20를 갖는 PBS)으로 세척한 후, 상기 판을 -20℃에서 동결 저장하거나 스크리닝에 사용한다. 각 미세배양물로부터의 50㎕를 피복된 미세검정판 중의 상응하는 웰에 옮기고 지속적으로 진탕시키면서 RT에서 45 내지 60분 동안 배양한다. 이어서, 상기 판을 세척 완충액으로 5회 세척하고 HRP-접합된 고우트 항마우스 중쇄 및 경쇄 항체(HRP-GAM)를 함유하는 50㎕를 각 웰에 가한다. 45 내지 60분 동안 배양한 후, 상기 판을 5회 세척하고 ABTS 기질 50㎕를 각 웰에 가한다. 미세판 판독기 상에서 414nm에서의 흡광도를 모니터함으로써 항-Caso 또는 항-Derm 항체의 존재를 나타내는 HRP 활성을 탐지한다. 2회 초과의 배경 흡광도를 나타내는 웰을 추가의 검사를 위해 선택한다.

가용성 유리 펩타이드와의 반응성. 유리 펩타이드 뿐만 아니라 이의 접합된 형태와 반응하는 각 항체의 능력은 상기 기재된 ELISA 포맷에서 간단히 경쟁시킴으로써 평가한다. 선별된 하이브리도마 배양 상등액을 3가지 희석물로 준비한다: 0.1% 오브알부민을 함유하는 PBS(PBS-OA)로 희석시킴으로써, 순수함, 1:5 및 1:50 희석물. 이어서, 각 샘플을 2mM, 2μM 또는 2nM의 Caso 또는 Derm 펩타이드를 함유하는 등용량의 PBS-OA와 혼합한다. 이로써 생성된 혼합물을 바로 앞서 기재된 바와 같은, Caso-BSA 또는 Derm-BSA 피복된 ELISA 판 상에서 검정한다. 보다 큰 희석물에서 높은 흡광도를 나타내고 가용성 펩타이드에 의해 완전하게 경쟁하는 상등액을 추가의 특징 확인을 위해 선별한다.

선별된 Derm 및 Caso 항체의 아이소타입. 각 샘플을 8개의 별개의 웰에서 배양한 다음 각 웰을 HRP-GAM, 항마우스 μ, γ₁, γ_2a, γ_2b, γ₃및 α 중쇄 및 κ 및 λ 경쇄를 포함한 상이한 HRP 접합체로 전개시키는 것을 제외하고는 상기 언급된 바와 동일한 ELISA 포맷을 이용하여, 각 항체의 중쇄 및 경쇄 아이소타입을 결정한다. γ 중쇄 중의 어느 하나를 갖는 웰을 추가의 분석을 위해 선별한다.

항펩타이드 항체의 친화성 분석. 이의 동종 펩타이드에 대한 각 Mab의 대략적인 친화도를 결정하기 위하여, 각각의 선별된 배양 상등액을 먼저, 상기 언급된 ELISA 포맷으로 적정하여, 포화 효과가 고정화 펩타이드 접합체와 유리 가용성 펩타이드 간의 경쟁을 전혀 차단시킬 수 없도록 충분히 묽은 농도에서 각 Mab를 시험할 수 있게 해준다. 앞서 기재된 바와 같이, 적절하게 희석되어 선별된 배양 상등액을 2mM 내지 2nM의 농도에서 PBS-OA 중의 등용량의 펩타이드와 혼합한다. 414nm에서의 흡광도를 50% 감소시키는 유리 펩타이드의 농도가 유리 펩타이드에 대한 명백한 친화도, 또는 k_obs로 간주된다. k_obs< 1μM인 항체를 추가의 분석을 위해 선별한다.

교차 반응성 분석. 각 mAb의 특이성을 결정하기 위하여, Caso 또는 Derm를 각종의 기타 펩타이드로 대체하면서 상기 언급된 친화성 시험을 반복한다. 카소모르핀 면역검정의 경우에는, Derm, α-글리아딘 또는 델토르핀 Ⅱ와의 교차 반응성(k_obs< 0.1mM)이 허용되지 않는다. 더모르핀 면역검정의 경우에는, Caso 및α-글리아딘과의 교차 반응성(k_obs< 0.1mM)이 허용되지 않지만, 델토르핀 Ⅱ와의 상당한 교차 반응성이 허용되는 것으로 간주되는데, 이는 이들 두 분자의 구조가 유사하기 때문이다.

선별된 하이브리도마 세포주의 클로닝 및 안정화. 항-Derm 분비성 하이브리도마를 함유하는 4개의 웰 및 항-Caso 분비성 하이브리도마를 함유하는 3개의 웰로부터의 세포를 연질 아가로즈에서 클로닝시킨다. 개개의 콜로니를 96웰 미세배양판에 옮기고, 2 내지 5일 동안 성장시킨 다음, ELISA에 의해 항-Derm 또는 항-Caso 항체의 분비에 대해 재스크리닝한다. 각 세포주로부터의 3개의 클론을 액체 질소하의 장기간 저장을 위해 동결시킨다.

면역검정 고안. 생물학적 유체 중의 Derm 및 Caso를 정량화하기 위해 두 가지 유형의 면역검정을 작제한다. 항원 다운 포맷츠로 지칭된 첫 번째 유형은 상기 언급된 ELISA와 동일하다. 펩타이드-BSA 접합체를 96웰 미세역가판의 웰 상에 흡착시킨다. 판을 PBS-1% OA로 차단시키고, 세척한 다음 동결 저장한다. 프로세스되지 않은 배양 상등액에서 불순하거나 단백질-A-세파로즈 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 항-펩타이드 항체를 상기 언급된 바와 같이 적정하여, 포화 효과가 샘플 중의 고정화 펩타이드-BSA와 유리 펩타이드 간의 경쟁을 차단할 수 없도록 한다. 2mM 내지 2nM 범위의 농도에서 PBS-OA 중의 펩타이드 희석물을 제조하여 표준 샘플을 제조한다. 등용량의 적절하게 희석된 항-펩타이드를 펩타이드 표준물과 혼합하고, 각 혼합물 50㎕를 상기와 같이 제조된 펩타이드-BSA 피복된 판 중의 하나의 판에 옮긴다. 45 내지 60분 동안 배양한 후(진탕기 상에서 RT), 상기판을 세척 완충액으로 5회 세척한다. HRP-GAM 50㎕을 각 웰에 가하고, 45 내지 60분 더 배양하며, 세척한 다음, 50㎕ ABTS 기질을 각 웰에 가하고 표준 미세판 판독기 상에서 414nm하의 색상 전개를 모니터함으로써 상기 판을 전개시킨다. 이로써 생성된 표준 곡선은 10nM 이하의 농도가 용이하게 탐지될 수 있으며 1μM 이상의 농도는, 항-펩타이드 항체가 상기 판에 흡착된 펩타이드-BSA 접합체와 전혀 결합되지 못하게 해준다는 사실을 지시해준다. 항원 다운 포맷은 1nM 내지 1μM 의 농도에서 Caso 또는 Derm을 탐지할 수 있는 간단하고도 확실한 포맷이다.

두 번째 포맷은 RaMFc 포맷으로 불리운다. 미세역가판을 래빗트 항-마우스 IgG Fc 폴리클로날 항체(RaMFc)로 피복한 다음, 상기 판을 PBS-1% OA로 차단시키고, 세척한 다음, 동결 저장한다. 해동된 판을 세척한 다음, 각 웰을 항-펩타이드 mAb(프로세스되지 않은 배양 상등액에서 불순하거나 단백질-A-세파로즈 상에서의 친화 크로마토그래피에 의해 정제된다) 50㎕와 배양한다. 항-펩타이드 mAb를 고정화 RaMFc에 결합시킨지 약 30분 내지 60분 후에, 상기 판을 세척한다. 샘플을 펩타이드-HRP(1nM)와 혼합하고 상기와 같이 준비된 미세역가판에 옮긴다. 30 내지 60분 동안 배양한 후(진탕기 상에서 RT), 상기 판을 세척한다. 50㎕ ABTS 기질을 가함으로써 상기 검정을 전개하고, 표준 미세판 판독기 상의 414nm에서 흡광도를 모니터함으로써 정량화한다. RaMFc 포맷은 약 1nM에서는 펩타이드를 탐지하고 0.1 내지 1μM에서는 완전하게 억제시키는 면역검정을 수반한다.

본원에 인용된 참조문헌

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자폐증 스펙트랄 장애를 포함하는 수많은 사람 장애는 치료 및 진단 모두에 대해서 과학적으로 불가해한 것이었으나 본 발명의 진단용 마커로 이를 진단하고 자폐증 유발 펩타이드에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 이를 치료할 수 있게 되었다.

Claims

(a) 아편제-유사 펩타이드; 및

(b) 아편제-유도된 펩타이드

로 이루어진 그룹 중에서 선택된 펩타이드를 포함하는, 사람 장애 진단용 마커.
제1항에 있어서, 사람 장애가 자폐증 스펙트랄 장애(autism spectral disorder)인 진단용 마커.
제1항에 있어서, 자폐증 스펙트랄 장애가 자폐증, 광범위한 발육상의 장애, 아스퍼거병(Asperger's syndrome), 주의력 결핍 장애(ADD) 및 주의력 결핍 기능항진 장애(ADHD)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 진단용 마커.
제1항에 있어서, 사람 장애가 다발성 경화증, 파킨슨병 및 알츠하이머 치매로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 진단용 마커.
제1항에 있어서, 펩타이드가 카세인으로부터 유도되는 진단용 마커.
제2항에 있어서, 펩타이드가 β-카소모르핀 또는 이의 유도체인 진단용 마커.
서열 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
서열 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 지닌 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
서열 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 지닌 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
서열 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 30% 이상의 상동성을 지닌 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
제1항에 있어서, 펩타이드가 글루텐으로부터 유도되는 진단용 마커.
제11항에 있어서, 펩타이드가 α-글리아딘 또는 이의 유도체인 진단용 마커.
서열 7, 8, 9, 10, 11 및 12로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
서열 7, 8, 9, 10, 11 및 12로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 지닌 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
서열 7, 8, 9, 10, 11 및 12로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 지닌 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
서열 7, 8, 9, 10, 11 및 12로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 30% 이상의 상동성을 지닌 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
제1항에 있어서, 펩타이드가 더모르핀 또는 이의 유도체인 진단용 마커.
서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 지닌 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 지닌 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 30% 이상의 상동성을 지닌 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
제1항에 있어서, 펩타이드가 델토르핀 Ⅱ 또는 이의 유도체인 진단용 마커.
서열 19, 20, 21, 22 및 23으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
서열 19, 20, 21, 22 및 23으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 지닌 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
서열 19, 20, 21, 22 및 23으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 지닌 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
서열 19, 20, 21, 22 및 23으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 30% 이상의 상동성을 지닌 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
제1항에 있어서, 펩타이드가 모르핀 조절성 뉴로펩타이드 또는 이의 유도체인 진단용 마커.
서열 24, 25, 26, 27, 28 및 29로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
서열 24, 25, 26, 27, 28 및 29로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 지닌 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
서열 24, 25, 26, 27, 28 및 29로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 지닌 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
서열 24, 25, 26, 27, 28 및 29로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 30% 이상의 상동성을 지닌 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
제1항에 있어서, 펩타이드가 델토르핀 Ⅰ 또는 이의 유도체인 진단용 마커.
제32항에 있어서, 서열 30을 포함하는 진단용 마커.
제1항에 있어서, 펩타이드가 신규한 자폐증 펩타이드 Ⅰ인 진단용 마커.
제1항에 있어서, 펩타이드가 신규한 자폐증 펩타이드 Ⅱ인 진단용 마커.
서열 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 및 43으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 진단용 마커.
(a) 아편제-유사 활성을 지닌 펩타이드;

(b) 카세인으로부터 유도된 펩타이드; 및

(c) 글루텐으로부터 유도된 펩타이드

로 이루어진 그룹 중에서 선택된 2개 이상의 펩타이드를 포함하는 진단용 마커.
제1항에 있어서, 체액이 혈청, 전혈, 배설물 및 눈물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 진단용 마커.
제1항에 있어서, 체액이 뇨인 진단용 마커.
체 조직 또는 체액 중에서 아편제-유사 활성을 지닌 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
제40항에 있어서, 펩타이드가 카세인으로부터 유도되는 진단 방법.
제41항에 있어서, 펩타이드가 β-카소모르핀 또는 이의 유도체인 진단 방법.
펩타이드 서열이 서열 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
서열 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 지닌 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
서열 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 지닌 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
서열 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 30% 이상의 상동성을 지닌 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
제40항에 있어서, 펩타이드가 글루텐으로부터 유도되는 진단 방법.
제47항에 있어서, 펩타이드가 α-글리아딘 또는 이의 유도체인 진단 방법.
펩타이드 서열이 서열 7, 8, 9, 10, 11 및 12로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 아편제-유사 활성을 지닌 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
서열 7, 8, 9, 10, 11 및 12로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 지닌 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
서열 7, 8, 9, 10, 11 및 12로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 지닌 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
서열 7, 8, 9, 10, 11 및 12로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 30% 이상의 상동성을 지닌 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
제40항에 있어서, 더모르핀 또는 이의 유도체인 펩타이드를 동정하는 것을 포함하는 진단 방법.
펩타이드 서열이 서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 지닌 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 지닌 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
서열 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 30% 이상의 상동성을 지닌 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
제40항에 있어서, 펩타이드가 델토르핀 Ⅱ 또는 이의 유도체인 진단 방법.
서열 19, 20, 21, 22 및 23으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
서열 19, 20, 21, 22 및 23으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 지닌 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
서열 19, 20, 21, 22 및 23으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 지닌 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여,사람 장애를 진단하는 방법.
서열 19, 20, 21, 22 및 23으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 30% 이상의 상동성을 지닌 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
제40항에 있어서, 펩타이드가 모르핀 조절성 뉴로펩타이드 또는 이의 유도체인 진단 방법.
서열 24, 25, 26, 27, 28 및 29로 이루어진 그룹 중에서 선택된 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
서열 24, 25, 26, 27, 28 및 29로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 지닌 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
서열 24, 25, 26, 27, 28 및 29로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 지닌 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
서열 24, 25, 26, 27, 28 및 29로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 30% 이상의 상동성을 지닌 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 사람 장애를 진단하는 방법.
제40항에 있어서, 펩타이드가 델토르핀 Ⅰ 또는 이의 유도체인 진단 방법.
제40항에 있어서, 서열 30을 포함하는 진단 방법.
제40항에 있어서, 펩타이드가 신규한 자폐증 펩타이드 Ⅰ인 진단 방법.
제40항에 있어서, 펩타이드가 신규한 자폐증 펩타이드 Ⅱ인 진단 방법.
제65항에 있어서, 펩타이드 서열이 서열 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 및 43으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 진단 방법.
(a) 아편제-유사 활성을 지닌 펩타이드;

(b) 카세인으로부터 유도된 펩타이드; 및

(c) 글루텐으로부터 유도된 펩타이드

로 이루어진 그룹 중에서 선택된 2개 이상의 펩타이드를 동정하는 것을 포함하여, 자폐증 스펙트랄 장애를 진단하는 방법.
제40항에 있어서, 체액이 혈청, 전혈, 배설물 및 눈물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
제40항에 있어서, 체액이 뇨인 방법.
제40항에 있어서, 사람 장애가 자폐증 스펙트랄 장애인 방법.
제76항에 있어서, 자폐증 스펙트랄 장애가 자폐증, 광범위한 발육상의 장애, 아스퍼거병, 주의력 결핍 장애(ADD) 및 주의력 결핍 기능항진 장애(ADHD)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
제40항에 있어서, 사람 장애가 다발성 경화증, 파킨슨병 및 알츠하이머 치매로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
(a) 분리 수단을 사용함으로써 체액으로부터 하나 이상의 펩타이드를 분리하는 단계; 및

(b) 탐지 수단을 사용하여 각각의 펩타이드를 동정하는 단계를 포함하는, 제1항에 따르는 진단용 마커를 탐지하는 방법.
제79항에 있어서, 분리 수단이 기체 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토그래피 및 전기영동으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
제79항에 있어서, 탐지 수단이 MALDI 질량 분광법 및 전기분무 질량 분광법으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
(a) 분리 수단을 사용함으로써 체액 중에서 제1항에 따르는 하나 이상의 펩타이드를 동정하는 단계; 및

(b) 탐지 수단을 사용하여 각각의 펩타이드를 동정하는 단계를 포함하는, 사람에게서 사람 장애를 진단하는 방법.
제82항에 있어서, 분리 수단이 기체 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토그래피 및 전기영동으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
제79항에 있어서, 탐지 수단을 추가로 포함하는 방법.
제84항에 있어서, 탐지 수단이 MALDI 질량 분광법 및 전기분무 질량 분광법으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
(a) 프롤린-풍부한 펩타이드의 이화작용에 관련된 효소를 동정하는 단계; 및

(b) 단계(a)의 효소로 사람을 치료하는 단계를 포함하는, 장애를 나타내는 사람을 치료하는 방법.
제86항에 있어서, 효소가 디펩티딜 펩티다제 Ⅳ인 방법.
제86항의 효소를 포함하는 진단용 마커.
제86항의 효소를 포함하는 약제학적 조성물.
(a) 제1항에 따르는 하나 이상의 펩타이드를 동정하는 단계; 및

(b) 단계(a)의 펩타이드의 약제학적 작용을 예방하는 단계를 포함하는, 사람 장애를 치료하는 방법.
(a) 체액을 면역원성 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항체-항원 복합체가 형성되는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 아편제-유사 또는 아편제-유도된 펩타이드에 대한 항체를 탐지하는 면역검정법.
아편제-유사 펩타이드 또는 아편제-유도된 펩타이드의 항원 결정기와 특이적으로 결합될 수 있는, 하이브리드 세포주에 의해 생성된 모노클로날 항체.
아편제-유사 수용체 또는 아편제-유도된 펩타이드와 결합될 수 있는 효능제.
제93항의 효능제의 작용을 방해할 수 있는 길항제.