CN1717251B - 用于治疗动脉粥样硬化的肽基被动免疫接种疗法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗或预防动脉粥样硬化的被动免疫接种，利用针对至少一种载脂蛋白B的氧化片断产生的分离人类抗体制造药物组合物，通过被动免疫接种方式治疗或预防性治疗动脉粥样硬化，以及制备这种抗体的方法，和用这种抗体为被动免疫接种做准备，治疗哺乳动物，优选人类的方法。

Description

用于治疗动脉粥样硬化的肽基被动免疫接种疗法

技术领域

本发明涉及对载脂蛋白B的衍生物肽产生的新分离的人类抗体，尤其涉及用于免疫接种疗法的抗体治疗动脉粥样硬化，它们的制备方法，以及用所述抗体进行被动免疫接种的方法。

本发明尤其包括：

对表1中列出的肽的氧化形式，特别是经MDA修饰的肽所产生的任何一种分离的抗体，优选与合适的载体和佐剂配合使用，作为预防和治疗局部缺血心血管性疾病的免疫疗法或抗动脉粥样硬化“疫苗”。

背景技术

已知体液免疫的保护效果是通过结构相关的糖蛋白一族称为抗体来调节。抗体通过与抗原结合启动它们的生物活性。抗体与抗原结合通常对一种抗原是特异的，并且这种结合通常有高的亲和性。抗体由B-淋巴细胞产生。血液中含有很多不同的抗体，一种源于B-细胞克隆，一种具有独特的结构并对抗原有特异性。抗体存在于B-淋巴细胞表面上，血浆中，组织间质液中，以及分泌液如唾液和黏膜表面上的黏液中。

所有抗体在整体结构上是相似的，这解释了物理化学特征如电荷和溶解度具有一定的相似性。所有抗体具有由两个相同的轻链，每个约24千道尔顿，和两个相同的重链，每个约55-70千道尔顿组成的共同的核结构。一个轻链连在每个重链上，两个重链相互连在一起。轻链和重链都包含一系列重复的同系单元，每个约有110个氨基酸残基长，以普通的球型独立折叠，叫做免疫球蛋白(Ig)域。两个重链结合形成的抗体区是疏水性的。已知抗体，特别是单克隆抗体，当它们处于相反的物理或化学条件时，轻链与重链的连接点处裂开。由于抗体含有许多半胱氨酸残基，它们有很多半胱氨酸-半胱氨酸二硫键。所有免疫球蛋白(Ig)域都包含两层具有三或四股反平行多肽链的β-折叠片。

尽管它们整体相似，根据物理化学特性如尺寸、电荷和溶解度以及它们与抗原结合的性能，抗体分子可分为少量的不同类和亚类。人类的抗体分子类别为：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM。每类中的个体称作相同的同型。IgA和IgG同型进一步细分为亚型，称作IgA1，IgA2及IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。在一个同型中所有抗体的重链共用氨基酸序列单元的广延区，但与属于其它同型或亚型的抗体不同。重链用希腊字母表的字母对应抗体全部的同型来命名，例如，IgA包含.α.，IgD包含.δ.(delta)，IgE包含.ε.(epsilon)，IgG包含.γ.(gamma)，及IgM包含.μ.(mu)重链。IgG，IgE和IgD以单体循环，而隐藏形式的IgA和IgM分别是二聚体或五聚体，并通过J链使其稳定。一些IgA分子以单体或三聚体存在。

在每个个体中有10⁸至10¹⁰个结构不同的抗体分子，每个在它们的抗原结合部位都有唯一的氨基酸序列。抗体中的序列差异主要存在于重链和轻链的氨基末端区称为可变(V)区以区别于更稳定的恒定(C)区里的三次短伸缩中。

动脉粥样硬化是一种慢性疾病，它引起大动脉和中等尺寸动脉的最内层(内膜)变厚。它使血流量降低，并能在含有受影响脉管的器官里引起局部缺血和组织损坏。动脉粥样硬化是心血管性疾病包括心肌梗塞，中风和末梢动脉疾病的主要原因。它在西方国家是导致死亡的主要原因，并预计在二十年内将变成全世界范围内导致死亡的原因。

脂蛋白，主要是低密度脂蛋白(LDL)在脉管的细胞外间质中的积聚作用引起了疾病。这些低密度脂蛋白(LDL)颗粒聚集并受到氧化变性。氧化的低密度脂蛋白是有害的，并引起血管损伤。

动脉粥样硬化在很多方面表现出对这种包括炎症和纤维化在内的损伤的应答。

1989年Palinski与其合作者在人类中识别出对氧化的低密度脂蛋白产生的循环自身抗体。这一观察表明动脉粥样硬化可能是由对氧化的脂蛋白产生的免疫反应所引起的一种自身免疫病。这时，一些实验室开始研究对氧化的低密度脂蛋白产生的抗体滴定度与心血管性疾病之间的联系。然而，这些研究中出现的图片很不清楚。对氧化的低密度脂蛋白中大量不同的抗原决定部位存在抗体，但这些抗原决定部位的结构并不知道。于是“氧化的低密度脂蛋白抗体”一词是指不同抗体的未知混合物，而并非一个特定的抗体。T细胞-非依赖性IgM抗体比T-细胞依赖性IgG抗体更常见。

对氧化的低密度脂蛋白产生的抗体在患心血管性疾病的病人和健康对比者中均出现。虽然有一些早期研究报道了氧化的低密度脂蛋白抗体滴定度与心血管性疾病之间的联系，其余的研究没有找到这种关联。这些研究的主要缺点是用于测定抗体滴定度的ELISA测试使用氧化的低密度脂蛋白颗粒作为配体。低密度脂蛋白组合物在不同个体中是不同的，氧化修饰的程度很难控制与评估，并且不能测定对氧化的低密度脂蛋白颗粒中不同抗原决定部位产生的抗体的水平。某种程度上，由于技术问题，用现有的技术评价对氧化的低密度脂蛋白产生的抗体响应作用迄今为止还是很困难的，然而，如果用完好的氧化的低密度脂蛋白颗粒不可能产生清晰的并可重现的疫苗成份。

另一方面研究对血管壁中氧化的低密度脂蛋白产生的自身免疫反应可能在动脉粥样硬化发展方面起着重要作用，使动物对自身氧化的低密度脂蛋白产生免疫。支持这一方法的思想是如果利用传统的免疫接种技术加强对氧化的低密度脂蛋白产生的自身免疫反应，将导致血管炎症加重且动脉粥样硬化加重。为验证这种假设，用同种氧化的低密度脂蛋白使兔子免疫，然后用高胆固醇食物喂养动物3个月而诱发动脉粥样硬化。

然而，与原始的假设相反，用氧化的低密度脂蛋白的免疫接种具有减少了约50％的动脉粥样硬化的保护效果。在随后的高胆固醇膳食与血管囊状损伤相结合产生更具攻击性斑块的研究中也获得了类似的结果。与我们的研究同时，一些其它实验室也报道了类似的观察结果。汇集现有的数据清楚地表明，存在防止动脉粥样硬化发展的免疫反应，并且这些免疫反应包括对氧化的低密度脂蛋白产生的自身免疫。

这些观察也说明了开发一种免疫疗法或“疫苗”用来治疗人类基于动脉粥样硬化的心血管性疾病的可能性。一种方法是自身的低密度脂蛋白通过暴露于例如铜中而被氧化之后，用其对个体进行免疫。然而，由于不知道在氧化的低密度脂蛋白中哪种结构负责诱发保护性免疫，以及是否氧化的低密度脂蛋白也可以包含能导致相反免疫反应的抗原决定部位，使这种方法变得复杂化。

识别氧化的低密度脂蛋白中的抗原决定部位在以下几个方面很重要：

首先，一个或几个这些抗原决定部位可能负责激活抗致动脉粥样化免疫应答，在用氧化的低密度脂蛋白进行免疫的动物身上可观察到这一点。因此含有这些抗原决定部位的肽提供了开发出用于人类的免疫疗法或“动脉粥样硬化疫苗”的可能性。进而，可用它们来治疗在人类中逐步扩展的动脉粥样硬化。

其次，含有识别的抗原决定部位的肽可用于开发ELISAs，它能检测出针对氧化的低密度脂蛋白中特定结构产生的抗体。这样的ELISAs将比目前使用氧化的低密度脂蛋白颗粒作抗原的ELISAs更精确更可靠。它还可以分析对氧化的低密度脂蛋白中不同的抗原决定部位产生的免疫应答与心血管性疾病之间的联系。

美国专利5,972,890涉及用肽诊断动脉粥样硬化。所述美国专利提供的技术原理上是一种放射物理诊断形式。肽序列被放射性标记并被注入血流中。如果这个肽序列与在载脂蛋白B中存在的序列相同，它将连接到为载脂蛋白B存在的受体的组织上。在脉管中，这在所有动脉粥样硬化斑块的上面。于是可以测定脉管壁中的放射性浓度，例如，用γ照相方法。因此该技术是放射物理诊断方法，它基于被放射性标记了的肽序列进入存在于动脉粥样硬化斑块中它们正常的组织受体中，并利用外部放射性分析对其进行检测。它是识别动脉粥样硬化斑块直接的分析方法。它需要给病人施加放射性化合物。

公开的研究成果(Palinski等，1995，和George等，1998)表明对氧化的低密度脂蛋白产生的免疫接种作用削减了动脉粥样硬化的发展。这表明对氧化的低密度脂蛋白产生的免疫反应通常具有防护效果。然而，在此给出的结果令人吃惊的是并非总是这样。例如，用肽#10，45，154，199和240的混合物进行免疫接种，导致动脉粥样硬化的发展加剧。用其它肽序列如肽序列#1，和30-34进行的免疫接种对动脉粥样硬化的发展根本没效果。结果令人吃惊是因为，它们为对氧化的低密度脂蛋白产生的免疫反应是能防止发展，还是促进动脉粥样硬化发展，还是根本没有效果取决于它们针对于氧化的低密度脂蛋白中的哪种结构这一事实提供了依据。这些发现使研发出能分离出保护的免疫反应活性的免疫接种方法成为可能。而且，它们显示如果所用颗粒含有能引起致动脉粥样化免疫反应的高水平结构，用完整氧化的低密度脂蛋白进行的免疫接种可能具有有害的效果。

本发明的技术是基于完全不同的原理和方法。根据权利要求1，本发明涉及对载脂蛋白B氧化片断产生的抗体，这种抗体用于对心血管性疾病的免疫接种。

作为主动免疫接种的替代，利用上述已识别的肽，用预先制备的针对相同的肽产生的抗体进行被动免疫接种是极有可能的。可以赋予这种抗体希望的特性，例如有关特异性和交叉反应性，同型，亲和性和血浆半衰期。随着单克隆抗体技术(Milstein和

，1975 Nature，256：495-7)的出现，开发具有预定特性抗体的可能性已变得很显然。这一技术使用鼠杂交瘤细胞产生大量相同的，但是鼠的抗体。实际上，使用鼠单克隆抗体来治疗例如癌症开始了大量临床前和临床试验。但是，由于抗体并非源自人类，病人的免疫系统将它们识别为外来物，并对它们产生抗体。因此，鼠抗体的功效和血浆半衰期降低，并经常由外来抗体引起过敏性的副作用，从而阻碍了成功治疗。

为解决这些问题，采用一些方法以减少特定的有治疗潜能抗体的鼠成分。第一种方法包括制造所谓嵌合抗体的技术，其中抗体的鼠可变区转化成人恒定区，产生主要是人类的抗体(Neuberger等，1985，Nature 314：268-70)。进一步改良该方法，开发出人源化抗体，其中接触抗原的鼠抗体区，即所说的互补性决定区(CDRs)转化成人类抗体构架。这种抗体几乎完全是人类的，当向病人给药时，很少会引起有害的抗体反应。一些嵌合或人源化抗体已经注册为治疗药物并且现在在各种指标中广泛使用(Borrebaeck和Carlsson，2001，Curr.Opin.Pharmacol.1：404-408)。

如今也可用重组技术产生完全的人类抗体。使用包括十亿不同抗体的典型大库。与以前使用嵌合或人源化的例如鼠抗体技术相反，本技术并不依赖于动物的免疫接种产生特定抗体。替代的，重组物库包含大量预先制备的抗体变异体，对于任何一种抗原库可能有至少一种特定的抗体。因而，使用这样的库，问题变成了一个，寻找库中已经存在的特定结合物，而并非通过免疫接种产生。为了在库中以有效的方式找到良好的结合物，已经发明了各种系统，其中表型即抗体或抗体片断被连接到它的基因型即编码基因上。最常用的这样的系统叫做噬菌体显示系统，其中抗体片断在丝状噬菌体颗粒表面与噬菌体覆盖蛋白融合时被表达，显示，同时携带遗传信息编码显示的分子(McCafferty等人，1990，Nature348：552-554)。可以通过与可怀疑的抗原结合，选择能显示对特殊抗原有特异性的抗体片断的噬菌体。分离出的噬菌体可被放大，并且基因编码选出抗体的可变区，可选择性地转化成其它抗体形式，如全长免疫球蛋白，并用现有技术中已知的合适的载体和宿主细胞以高量表达。

在噬菌体颗粒上表现出的抗体特异性形式可能不同。最常用的形式是Fab(Griffiths等人，1994.EMBO J.13：3245-3260)和单链(scFv)(Hoogenboom等人，1992，J Mol Biol.227：381-388)，两者都包括抗体的可变抗原结合区。单链形式由通过柔性接头连接到轻链可变区(VL)上的重链可变区(VH)组成(US 4,946,778)。在用作分析试剂或治疗剂之前，表现出的抗体特异性被转化成可溶形式，如Fab或scFv及分析的那些。在后续步骤中，被识别出具有需要特征的抗体片断还可以被转化成其它形式如全长抗体。

最近出现了一种在抗体库中生成变体的新技术(WO98/32845，Soderlind等，2000，Nature Bio Technol.18：852-856)。出自这个库的抗体片断都有相同的构架区，只是它们的CDRs不同。由于构架区是生殖系序列，预计来自这个库或类似库的抗体用相同的技术产生的免疫原性特别低(Soderlind等人，2000，NatureBioTechnol.18：852-856)。预计这种特性对于治疗抗体，大大降低了病人对给药抗体产生抗体的风险，从而减少了过敏性，出现封闭性抗体和使抗体有较长血浆半衰期的风险。来自重组物库的一些抗体现在已进入临床，并预计未来将提供治疗性药物。

因而，当遇到开发用于人类的治疗抗体挑战时，现有技术使人们认识到不能使用以前的杂交瘤技术，而应使用现代的重组物库技术(Soderlind等人，2001，Comb.Chem.&High Throughput Screen.4：409-416)。实现将识别的肽(PCT/SE02/00679)，并且是本发明的整体，能用作抗原产生具有预定特性的完全人类抗体。与以前的技术(US 6,225,070)相反，抗原结构即本发明使用的肽确定为与用于治疗抗体的靶序列特别相关(PCT/SE02/00679)。本发明中，抗体来自抗体库，不需要免疫接种脂蛋白缺乏的老鼠以产生鼠抗体(US 6,225,070)。此外，产生的抗体完全是人类的，并且当向病人给药时，预计不会产生任何不希望的免疫学反应。

使用的肽，且以前已识别(PCT/SE02/00679)如下：

表1

A.高IgG，有MDA-差异

P 11. FLDTVYGNCSTHFTVKTRKG

P 25. PQCSTHILQWLKRVHANPLL

P 74. VISIPRLQAEARSEILAHWS

B.高IgM，无MDA-差异

P 40. KLVKEALKESQLPTVMDFRK

P 68. LKFVTQAEGAKQTEATMTFK

P 94. DGSLRHKFLDSNIKFSHVEK

P 99. KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE

P 100. RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ

P 102. SLTSTSDLQSGIIKNTASLK

P 103. TASLKYENYELTLKSDTNGK

P 105. DMTFSKQNALLRSEYQADYE

P 177. MKVKIIRTIDQMQNSELQWP

C.高IgG，无MDA差异

P 143. IALDDAKINFNEKLSQLQTY

P 210. KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH

D.NHS/AHP，IgG-ak＞2，有MDA-差异

P1. EEEMLENVSLVCPKDATRFK

P 129. GSTSHHLVSRKSISAALEHK

P 148. IENIDFNKSGSSTASWIQNV

P 162. IREVTQRLNGEIQALELPQK

P 252. EVDVLTKYSQPEDSLIPFFE

E.NHS/AHP，IgM-ak＞2，有MDA-差异

P 301. HTFLIYITELLKKLQSTTVM

P 30. LLDIANYLMEQIQDDCTGDE

P 31. CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ

P 32. GNMGQTMEQLTPELKSSILK

P 33. SSILKCVQSTKPSLMIQKAA

P 34. IQKAAIQALRKMEPKDKDQE

P 100. RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ

P 107. SLNSHGLELNADILGTDKIN

P 149. WIQNVDTKYQIRIQIQEKLQ

P 169. TYISDWWTLAAKNLTDFAEQ

P 236. EATLQRIYSLWEHSTKNHLQ

F.NHS/AHP，IgG-ak＜0.5，无MDA-差异

P 10. ALLVPPETEEAKQVLFLDTV

P 45. IEIGLEGKGFEPTLEALFGK

P 111. SGASMKLTTNGRFREHNAKF

P 154. NLIGDFEVAEKINAFRAKVH

P 199. GHSVLTAKGMALFGEGKAEF

P 222. FKSSVITLNTNAELFNQSDI

P 240. FPDLGQEVALNANTKNQKIR

或一种或多种这些肽的活性部位。

在上面的表1中，下面是适合的：

(A)对经MDA修饰的肽产生高水平的IgG抗体的片段(n＝3)，

(B)产生高水平的IgM抗体的片段，但自然的和经MDA修饰的肽之间无差异(n＝9)，

(C)产生高水平的IgG抗体的片断，但自然的和经MDA修饰的肽之间无差异(n＝2)，

(D)对经MDA修饰的肽产生高水平的IgG抗体的片断，并且在NHP样品池中的抗体至少是AHP样品池中抗体的两倍(n＝5)，

(E)对经MDA修饰的肽产生高水平的IgM抗体的片断，并且在NHP样品池中的抗体至少是AHP样品池中抗体的两倍(n＝11)，以及

(F)产生高水平的IgG抗体的片断，但完整的与经MDA修饰的肽之间无差异，但在AHP样品池中的抗体至少是NHP样品池中抗体的两倍(n＝7)。

发明概述

本发明涉及使用针对至少一种载脂蛋白B的氧化片断产生的至少一种分离的人类抗体或其抗体片断制造药物组合物，通过被动免疫接种方法治疗或预防性治疗动脉粥样硬化。

另外，本发明涉及这些抗体的重组物制备，以及本发明涉及利用氧化的载脂蛋白B片断，特别是上述的片断作为抗原，产生这样的抗体进行被动免疫接种的方法。

本发明利用分离的抗体片断库生成针对氧化的特别是经MDA修饰的ApoB100肽的特定人类抗体片断。已识别的具有所需特性的抗体片断于是可以复原成全长人体免疫球蛋白，为治疗目的使用。

发明详述

下面以来自分离的抗体片断库中的人类抗体并针对ApoB 100的两个经MDA修饰的肽为例，但并不仅限于此，对本发明进行详细地描述。

实施例1

对经MDA修饰的肽IEIGL EGKGF EPTLE ALFGK(P45，表1)和KTTKQ SFDLS VKAQY KKNKH(P210，表1)产生的scFv进行选择。

靶抗原经化学修饰为在赖氨酸和组氨酸上携带丙二醛(MDA)(Malone-dialdehyde)集团。经修饰的肽表示为IEI(P45)和KTT(P210)。

利用BioInvent’s n-CoDeR^TMscFv库完成选择，组成和产生的原则已在Soderlind等2000，Nature Bio Technology.18，852-856中有所描述。简单的，CDRs从人体免疫球蛋白基因中分离出来，并被置于固定构架中。因此，形成的免疫球蛋白可变区的变化是六个CDRs全部进入固定构架重组的结果。构架区是全部的生殖系并在所有的抗体中都相同。因此，变化只限于全是自然的且来自人类的互补性决定区(CDRs)。该库包括大约2×10¹⁰个独立克隆并且超过2000倍的克隆作为每次选择的输入量。经过三轮完成选择。第1轮选择，用在PBS(137mMNaCl，2.7mM KCl，4.3mM Na₂HPO₄，1.4mM KH₂PO₄)中浓度为20μg/ml的经MDA修饰的靶肽1.2ml覆盖免疫试管(NUNC maxisorb 444202)，在+4℃颠倒搅动一夜。然后用TPBSB5％(5％BSA，0.05％Tween 20，在PBS中0.02％叠氮化钠)封闭试管30分钟，并在使用前用TPBSB3％(3％ BSA，0.05％ Tween 20，在PBS中0.02％叠氮化钠)洗涤两次。用来自n-CodeR^TM库的约2×10¹³个CFU噬菌体在1.8ml TPBSB3％中在室温下对每个靶试管孵育2小时，并颠倒性搅拌。然后，用15×3ml TPBSB3％和2×1ml PBS洗涤试管，之后用1ml/试管的2mg/ml胰蛋白胨(Roche，109819)在室温将结合噬菌体洗脱30分钟。这一过程利用了在scFv-融合蛋白中的特定胰蛋白胨部位，使噬菌体从靶中释放出来。加入100μlA蛋白(0.2mg/ml，Roche，cat.236624)使反应停止，并用300μl PBS，最终体积为1.4ml，洗涤免疫试管。

为扩增选出的噬菌体，E.Coli HB101F’细胞在10ml LB培养基(Merck，cat.1.10285)中按指数生长至OD₆₀₀＝0.5，用选出并洗脱的噬菌体主要按Soderlind等人，2000，Nature BioTechnol.18，852-856所述使细胞感染。然后通过按1/4体积加入在2.5M Nacl中浓度为20％PEG₆₀₀₀，使得到的噬菌体上清液沉淀，并在+4℃孵育5小时。通过13000×g离心沉淀30分钟，使噬菌体成球状，在500μlPBS中使噬菌体再悬浮，并在第2轮选择中使用。

扩增的噬菌体原料用于第2轮选择，最终体积为1.5ml的在PBS中5％BSA，0.05％Tween 20，0.02％叠氮化钠。未经MDA修饰的肽(4×10^-7M)也参与连接物连接到未经MDA修饰的靶肽上的竞争。混合物在用上述抗原准备好的免疫试管中孵育，除了用1％酪蛋白代替TPBSB3％封住试管。如第1次选择中描述的那样，孵育和洗涤免疫试管。然后用600μl 100mM Tris-甘氨酸缓冲液，pH 2.2洗脱结合噬菌体30分钟。另外用200μl甘氨酸缓冲液洗涤试管，收集洗脱物，然后用96μl 1M Tris-HCl，pH 8.0中和洗脱物。在室温下使样本复性1小时，并用于第3轮选择。

对于第3轮选择，向已复性的噬菌体池中加入BSA，Tween 20和叠氮化钠至最终浓度分别为3％，0.05％和0.02％。加入竞争肽，与经MDA修饰无关的肽，以及未经修饰的自然靶肽至浓度为1×10^-7M。向覆盖着如第1次选择中描述的靶抗原的免疫试管中加入噬菌体混合物(1100μl)，并在4℃搅拌孵育过夜。然后用3×3ml TPBSB 3％，5×3ml PBS洗涤试管，最后用如上述第1轮选择中描述的胰蛋白胨洗脱结合噬菌体。在含100μg/ml氨苄青霉素，15μg/ml四环素，0.1％葡萄糖的LB中成指数生长的HB101F’10ml中放入每份洗脱物受感染，并在30℃在200rpm的振动恒温箱中隔夜生长。

隔夜培养物用于使用Biorad微量制备试剂盒(Cat.732 6100)微量制备质粒DNA。为了从表达载体上去除噬菌体基因III部分，在厂商推荐的缓冲液中使用2.5U Eag-1(New England Biolabs，cat.R050)在37℃切割0.25μg质粒DNA两小时。然后加热样本在65℃失活20分钟，并在16℃用1U T4 DNA连接酶在30μl1×连接酶缓冲液(Gibco/BRL)中连接样本过夜。这一过程将位于噬菌体基因III片断相反面上的两个Eag-1部位连接起来，从而产生了末端为6xhis tag的游离scFv。经过连接作用后，在37℃在含有30μl连接混合物，3.6μl 10×REACT3原料，0.4μl 1M NaCl，5μl H₂O₂的溶液中消化材料2小时，以便破坏再次连接的噬菌体基因III片断的克隆。20ng最终产物转化成有化学反应能力的Top10F’，并涂敷在500cm² Q-tray LA-盘上(100μg/ml Amp，1％葡萄糖)，以便能为进一步的筛选挑选单一菌落。

筛选n-CoDeR^TMscFv库以得到与载脂蛋白B-100经MDA修饰的肽结合的特定抗体片断。

为了识别能分别区分经MDA修饰的IEI(P45)肽与自然的IEI，及经MDA修饰的KTT(P210)与自然的KTT的scFv，在选出的scFv表达克隆的细菌上清液上完成筛选。

根据标准方法，在BioInvent自动系统上完成菌落挑选单一克隆，表达scFv和对1号进行筛选。选出分别针对经MDA修饰的IEI和KTT肽的1088和831单一克隆，并在100μl含100μg氨苄青霉素/ml的LB的微量滴定盘中培养并表达。

为对1号进行筛选，用在覆盖缓冲液(0.1M碳酸钠，pH 9.5)中54pmol肽/孔，或用经MDA修饰的肽充当正靶，或用相应的未经修饰的肽充当非靶涂覆在白色测定盘(Greiner 655074)上。在ELISA中，通过scFv上的C-端myc-tag使用1μg/ml抗-c-myc单克隆(9E10 Roche 1667 149)在清洗缓冲液中侦测表达的scFv。将羊抗鼠碱性磷酸酶结合体(Applied Biosystems Cat#AC32ML)稀释25000倍使用，作为二级抗体。根据厂商的推荐使用CDP-Star Ready to use withEmerald II Tropix(Applied Biosystems Cat#MS100RY)进行发光侦测。

按上面描述的方法对结合经MDA修饰的肽但非自然肽的scFv克隆再次表达，并在发光ELISA中再次筛选(表2和图1)。对直接涂敷的肽(108pmol/孔 覆盖着PBS)和更多生理靶进行试验；包括经MDA修饰和未经MDA修饰的ApoB-100蛋白的低密度脂蛋白(LDL)颗粒(1μg/孔 覆盖在PBS+1mM EDTA中)当作靶使用。阳性克隆是那些结合氧化的低密度脂蛋白和经MDA修饰的肽而并非自然的低密度脂蛋白或肽。将抗-His抗体(MaB050 RαD)用作侦测抗体，如上面所述的方法完成ELISA。发现12个IEI克隆和2个KTT克隆对于肽和低密度脂蛋白的MDA修饰形式比它们的自然形式在700nm给出三倍以上高的发光信号。

为了评价scFv的剂量反应，通过对固定量(1μg/孔)的MDA低密度脂蛋白和自然的低密度脂蛋白进行滴定，进一步检测识别的克隆(图2)。

表2.筛选结果。在每步筛选步骤中针对每个靶被检验克隆的号数。括号中显示的是用百分数表示的中靶次数。

为了找到特殊克隆，测定挑出的scFv克隆的序列。用使用引物(5’-CCC AGTCAC GAC GTT GTA AAA CG-3’)和(5’-GAA ACA GCT ATG AAA TAC CTATTG C-3’)的Boeringer Mannheim Expand Kit与GeneAmp PCR system 9700(PEApplied system)使用温度循环程序94℃ 5分钟；94℃ 30秒，52℃ 30秒和68℃ 2分钟共循环30次；最后在68℃ 5分钟，完成细菌性PCR。用细菌性PCR产物(稀释5倍)作为模板，用购自PE Applied Biosystems的Big Dye Terminatormix和GeneAmp PCR system 9700(PE Applied system)和温度循环程序96℃ 10秒，50℃ 5秒和60℃ 4分钟循环25次，完成测序反应。根据厂商的说明书对延伸产物进行纯化，并用3100遗传分析仪(PE Applied Biosystems)分离并侦测延伸产物。用内部计算机程序对序列进行分析。从序列信息中排除同源克隆和具有不相称限制部位的克隆，剩下6个克隆用于IgG转化。最终挑选的克隆的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的DNA序列在图3中显示。

实施例2

基因编码洗出的scFv可变部分转移到全长的人类IgG1载体。

含scFv克隆转化成免疫球蛋白形式的细菌在补充100μg/ml氨苄青霉素的LB中隔夜生长。利用Quantum Prep，购自Biorad公司的质粒微量制备试剂盒(#732-6100)从隔夜培养物中制备质粒DNA。通过测量260nm处的吸光率来估算DNA浓度，并将DNA稀释至浓度为2ng/μl。

PCR扩增来自不同scFv-质粒的VH和VL，以便向这些片断提供与表达载体一致的限制部位(见下面)。5’引物包含一个BsmI，3’引物包含一个BsiWI限制性内切酶剪切部位(斜体所示)。3’引物还包含一个剪接供体部位(粗体所示)。

用于扩增VH-片断的引物：

5′VH：5′-GGTGTGCATTCCGAGGTGCAGCTGTTGGAG(SEQ.ID.NO：13)

3′VH：5′-GACGTACGACTCACCTGAGCTCACGGTGACCAG(SEQ.ID.NO：14)

用于扩增VL-片断的引物：

5′VL：5′-GGTGTGCATTCCCAGTCTGTGCTGACTCAG(SEQ.ID.NO：15)

3′VL：5′-GACGTACGTTCTACTCACCTAGGACCGTCAGCTT(SEQ.ID.NO：16)

在总体积为50μl，含10ng模板DNA，0.4μM 5’引物，0.4μM 3’引物和0.6mMdNTP(Roche，#1 969 064)中进行PCR。使用的聚合酶是Expand long templatePCR系统(Roche#1 759 060)，每次反应3.5u，与3次单独反应中填补缓冲液之一一起使用。每次PCR扩增循环包括，变性步骤在94℃经过30秒，退火步骤在55℃经过30秒，和延伸步骤在68℃经过1.5分钟。这样的扩增循环重复25次。每次反应开始于单一的变性步骤在94℃经过2分钟，结束于单一的延伸步骤在68℃经过10分钟。通过琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物是否存在，并收集含相同扩增材料(来自有不同缓冲液的反应)的反应液。随后通过自旋柱色谱法用S400-HR柱(Amersham-Pharmacia Biotech#27-5240-01)对PCR扩增产物进行纯化。

根据制造商的推荐，每次收集的PCR产物4μl用于TOPO TA克隆(pCR 2.1TOPO，InVitrogen#K4550-01)。含具有插入片断质粒的细菌菌落在补充100μg/ml氨苄青霉素和20μg/ml卡那霉素的LB中隔夜生长。由隔夜培养物用QuantumPrep，购自Biorad公司的质粒微量制备试剂盒(#732-6100)制备质粒DNA。通过自旋柱色谱法用S400-HR柱(Amersham-Pharmacia Biotech#27-5240-01)对质粒制备物进行纯化。使用BigDye循环测序仪(Perkin Elmer Applied Biosystem，#4303150)对来自每次单独的VH和VL克隆的三种质粒进行序列分析。循环测序程序包括，变性步骤在96℃经过10秒，退火步骤在50℃经过15秒，和延伸步骤在60℃经过4分钟。这样的循环重复25次。每次反应开始于单一的变性步骤在94℃经过1分钟。在体积为10μl含1μM引物(5’-CAGGAAACAGCTATGAC)，3μl质粒DNA和4μl Big Dye反应混合物中完成反应。根据制造商的推荐，使反应物沉淀，并在ABI PRISM 3100基因分析仪上运行样本。利用OMIGA序列分析软件(Oxford Molecular Ltd)的对齐功能，序列与原始的scFv序列比较序列。

含有VH和VL片断无突变的质粒经限制性内切酶消化。为了使pCR 2.1 TOPO载体断裂，质粒开始用DraI(Roche#1 417 983)在37℃消化2小时。消化液在70℃加热失活20分钟，并通过自旋柱色谱法用S400-HR柱(Amersham-PharmaciaBiotech#27-5240-01)纯化。纯化后的DraI消化液随后用BsmI(Roche#1 292307)和BsiWI(Roche#1 388 959)在55℃消化隔夜。消化液用酚提取并沉淀，以纯化。沉淀的DNA溶解在10μl H₂O中并用于连接作用。

从Lars Norderhaug(J.Immunol.Meth.204(1997)77-87)得到表达载体。经过一些修饰后，载体(图4)包括一个CMV启动子，一个Ig-前导肽，一个含BsmI和BsiWI限制部位的克隆接头用于克隆VH/VL，IgG1(重链(HC)载体)或λ(轻链(LC)载体)，新霉素(HC载体)或氨甲蝶呤(LC载体)抗性基因的基因组恒定区用于在真核生物细胞中选择，SV40和ColEI复制源，以及氨苄青霉素(HC载体)或卡那霉素(LC载体)抗性基因用于在细菌中选择。

HC和LC载体用BsmI和BsiWI消化，经过磷酸酶处理，并用酚提取并沉淀使其纯化。在16℃在体积为10μl含100ng消化后的载体，2μl消化后的VH/VL-pCR 2.1 TOPO载体(见上面)，1U T4 DNA连接酶(Life Technologies，# 15224-025)和填补缓冲液中隔夜进行连接。之后，将2μl连接混合物转化成50μl有化学性能的top10F’细菌，并涂覆在选择性的(100μg/ml氨苄青霉素或20μg/ml卡那霉素)琼脂板上。

含有带VH/VL插入片断的HC/LC质粒的菌落通过菌落PCR识别：

正向引物：5’-ATGGGTGACAATGACATC

反向引物：5’-AAGCTTGCTAGCGTACG

在总体积为20μl含细菌，0.5μM正向引物，0.5μM反向引物和0.5mM dNTP(Roche，#1 969 064)的溶液中进行PCR。使用的聚合酶是Expand long templatePCR system(Roche#1 759 060)，每次反应0.7U，和填补缓冲液#3一起使用。每次PCR扩增循环包括，变性步骤在94℃经过30秒，退火步骤在52℃经过30秒，和延伸步骤在68℃经过1.5分钟。这样的扩增循环重复30次。每次反应开始于单一的变性步骤在94℃经过2分钟，结束于单一的延伸步骤在68℃经过5分钟。通过琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物是否存在。含有带VH/VL插入片断的HC/LC质粒的菌落在补充有100μg/ml氨苄青霉素或20μg/ml卡那霉素的LB中生长隔夜。由隔夜培养物用Quantum Prep，购自Biorad公司的质粒微量制备试剂盒(#732-6100)制备质粒DNA。通过自旋柱色谱法用S400-HR柱(Amersham-Pharmacia Biotech#27-5240-01)对质粒制备物进行纯化。为确定完整的DNA序列，使用BigDye循环测序仪(Perkin Elmer Applied Biosystem，#4303150)对来自每种单独的VH和VL的三种质粒进行序列分析。循环测序程序包括，变性步骤在96℃经过10秒，退火步骤在50℃经过15秒，和延伸步骤在60℃经过4分钟。这样的循环重复25次。每次反应开始于单一的变性步骤在94℃经过1分钟。在体积为10μl含1μM引物(5’-AGACCCAAGCTAGCTTGGTAC)，3μl质粒DNA和4μl Big Dye反应混合物中完成反应。根据制造商的推荐，使反应物沉淀，并在ABI PRISM 3100基因分析仪上运行样本。利用OMIGA序列分析软件(Oxford Molecular Ltd)，分析序列。质粒DNA用于COS-7细胞的瞬间转染(见下面)并被消化以产生在同一质粒上含有重链和轻链基因的连接载体。

从同一scFv获得的含VH和VL片断的重链和轻链载体被限制性内切酶剪切并连接：HC-和LC-载体首先用MunI(Roche#1 441 337)消化，之后在70℃消化液被加热失活20分钟，并通过自旋柱色谱法用S200-HR柱(Amersham-Pharmacia Biotech#27-5120-01)对其进行纯化。随后用NruI(Roche#776 769)对HC-载体消化液进行消化，用Bst1107I(Roche#1 378 953)对LC-载体消化液进行消化。然后消化液在70℃被加热失活20分钟，并通过自旋柱色谱法用S400-HR柱(Amersham-Pharmacia Biotech#27-5240-01)对其进行纯化。每种消化后的质粒5μl在总体积为20μl含2U T4 DNA连接酶(LifeTechnologies，#15224-025)和填补缓冲液中在16℃隔夜进行连接。之后，将2μl连接混合物转化成50μl有化学性能的top10F’细菌，并涂覆在选择性的(100μg/ml氨苄青霉素和20μg/ml卡那霉素)琼脂板上。

细菌菌落在补充有100μg/ml氨苄青霉素和20μg/ml卡那霉素的LB中生长隔夜。由隔夜培养物用Quantum Prep，购自Biorad公司的质粒微量制备试剂盒(#732-6100)制备质粒DNA。通过限制性内切酶的消化作用并结合琼脂糖凝胶-电泳对片断尺寸的分析，识别出正确连接的载体。

质粒制备物通过自旋柱色谱法用S400-HR柱(Amersham-Pharmacia Biotech#27-5240-01)进行纯化，并用于COS-7细胞的瞬间转染。

用5％CO₂溶于Dulbeccos MEM，高葡萄糖+GlutamaxI(Invitrogen #31966021)，补充0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen#11140035)和10％胎牛血清(Invitrogen#12476-024，batch#1128016)在37℃培养COS-7细胞(ATCC#CRL-1651)。在转染前一天，按每孔1.5×10⁵个细胞的密度将细胞涂覆在12-孔培养盘(Nunc，#150628)中。

转染前，在70℃加热质粒DNA15分钟。根据制造商的推荐使用Lipofectamine2000Reagent(Invitrogen，#11668019)，细胞被每孔1μg HC-质粒+1μg LC-质粒，或2μg连接质粒转染。转染后24小时，改变细胞培养基，并让细胞生长5天。之后，收集培养基并用ELISA测定蛋白质产物。

向96-孔培养盘(Costar#9018，平底，高边)加入用覆盖缓冲液(0.1M碳酸钠，pH 9.5)稀释了4000倍的兔抗-人源λ轻链抗体(DAKO，#A0193)100μl/孔，在4℃隔夜。在含0.05％Tween 20的PBS中洗涤培养盘4次，之后在室温用100μl/孔PBS+3％ BSA(清蛋白，级分V，Roche#735108)封闭培养盘1小时。经过上述洗涤后，加入100μl/孔 样本，并在室温孵育1小时。使用人类纯化IgG1(Sigma，#I5029)作为估测浓度的标准。用样本缓冲液(1×PBS含2％BSA和0.5％兔血清(Sigma#R4505))稀释样本和标准。其后，如上述方法洗涤培养盘，加入用样本缓冲液稀释8000倍的兔抗人类IgG(γ-链)HARP-接合抗体(DAKO，#P214)100μl/孔，并在室温孵育1小时。用含0.05％Tween 20的PBS洗涤8次后，加入100μl/孔的底物溶液，其包括一片OPD片剂(10mg，Sigma#P8287)溶解于15ml柠檬酸缓冲液中和4.5μl H₂O₂(30％)。10分钟后，加入150μl/孔的1M HCl结束反应。在490-650nm处测量吸光率，并用Softmax软件分析数据。

含正确连接的HC-和LC-载体的细菌在补充氨苄青霉素和卡那霉素的LB溶液500ml中隔夜生长。由隔夜培养物用Quantum Prep，购自Biorad公司的质粒大量制备试剂盒(#732-6130)制备质粒DNA。用PvuI限制性内切酶(Roche #650 129)使载体线性化。在转染之前，通过自旋柱色谱法用S400-HR柱(Amersham-Pharmacia Biotech#27-5240-01)对线性化的DNA进行纯化，并在70℃加热15分钟。

实施例3

对载脂蛋白B-100经MDA修饰的肽产生的抗体进行表达的NS0细胞的稳 定转染。

在补充10％肽牛血清(cat no.12476-024，lot：1128016，Invitrogen)和1×NEAA(非必需氨基酸，cat no.11140-053，Invitrogen)的DMEM(cat nr31966-021，Invitrogen)中培养NS0细胞(ECACC no.85110503)。细胞培养物在37℃ 5％CO₂的湿润环境中保存。

被转染的DNA构造是四部分构造，IEI特定抗体(IEI-A8，IEI-D8，IEI-E3，IEI-G8)，两种KTT特定抗体(KTT-B8，KTT-D6)和一种对照抗体(JFPA12)。在转染前一天，将细胞胰蛋白酶化并计数，之后将它们置于一个T-75型烧瓶中，12×10⁶细胞/瓶。在转染当天，当细胞有85-90％汇合时，将细胞放入15mlDMEM+1×NEAA+10％FBS(如上)中。对于每瓶被转染的细胞，将35-40μg的DNA放入1.9ml的OPTI-MEM I Reduced Serum Medium(Cat no.51985-026，lot：3062314，Invitrogen)无血清稀释。对于每瓶细胞，114μl的Lipofectamine 2000Reagent(Cat nr.11668-019，lot：1116546，Invitrogen)放入另一试管中的1.9mlOPTI-MEM I Reduced Serum Medium中稀释，并在室温孵育5分钟。稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000Reagent(在30分钟内)合并，并在室温孵育20分钟，以形成DNA-LF2000 Reagent复合物。

用培养基洗涤细胞一次，并加入11ml DMEM+1×NEAA+10％FBS。然后向每个瓶中直接加入DNA-LF2000 Reagent复合物(3.8ml)并来回晃动烧瓶使其轻轻混合。细胞在37℃于5％ CO₂恒温箱孵育24小时。

然后将细胞胰蛋白酶化并计数，然后将其涂覆在96-孔培养盘中，2×10⁴细胞/孔，使用五个96-孔培养盘/构造。将细胞置于100μl/孔的DMEM+1×NEAA+10％FBS(如上)含G418-硫酸盐(cat nr.10131-027，lot：3066651，Invitrogen)600μg/ml。选择压力保持不变直到采集细胞。

让细胞生长12天，用ELISA检测其抗体产量。选自含IgG最高量的24个孔中的每种构造细胞被转移到24-孔培养盘上，并让其达到汇合。然后用ELISA测定这些孔中细胞的抗体产量并选择5-21池/构造用于再筛选(表3)。最终每种构造挑选出最好的1-4孔的细胞。这些细胞在细胞培养烧瓶中相继扩展，最后将其移至有200ml(DMEM+1×NEAA+10％超低IgG FBS(cat.no.16250-078，lot.No.113466，Invitrogen)+G418(600μg/ml))的三层烧瓶(500cm2)中，用于抗体生产。孵育细胞7-10天，通过ELISA测定上清夜，收集上清液并无菌过滤用于纯化。

实施例4

人类IgG1的生产与纯化

用不同的IgG1抗体转染NS0细胞得到的上清液用0.22μm的滤器无菌过滤并用亲和培养基MabSelect^TM与重组蛋白A(Cat.No.17519901 AmershamBiosciences)纯化。

结合人类IgG1用HCL-甘氨酸缓冲液pH 2.8洗脱。收集洗脱物为0.5ml馏分，用OD₂₈₀测定蛋白质的存在。将峰值馏分汇集，并在280nm和320nm处测量吸光度。通过透析阻挡大体积的PBS，改变缓冲液。用LAL测试(QCL-1000^R，cat.No.50-647U Bio Whittaker)检测在纯化的IgG-1制备物中是否存在内毒素。样本含有1-12EU/ml的内毒素。用PAGE分析，制备物的纯度估计超过98％。

表3 人类IgG1的生产与纯化总结

克隆名称	体积培养物上清液(ml)	上清液中IgG1总量(mg)	纯化的IgG1总量(mg)	产率(％)
					IEI-A8	600	68	42	61.8
IEI-D8	700	45	21	46.7
					IEI-E3	700	44.9	25.6	60
IEI-G8	600	74	42.4	57.3
					KTT-B8	1790	77.3	37.6	48.6
KTT-D6	1845	47.8	31.8	66.5
					JFPA12	2000	32.2	19.2	59.6

纯化的IgG1制备物在ELISA中检测对经MDA修饰和未经修饰的肽的反应性(图5)，然后用于体内和体外功能研究。

实施例5

在实验动物和细胞培养研究两方面对抗体可能的抗致动脉粥样化效果进行 分析。

1.在载脂蛋白E剔除(apo E-)鼠中抗体在动脉粥样硬化方面的效果。

五周大的apo E-小鼠用富含胆固醇的膳食喂食15周。已知经过这样处理，可在主动脉和颈动脉中产生大量的动脉粥样斑。然后分别给小鼠腹膜内注射含500μg的上述抗体。给对照鼠注射500μg不相关的对照抗体或单独注射PBS。经过1和2周后，重复进行这样的处理。在开始注射抗体后的4周小鼠死亡。通过油红O对扁平形成物染色，并测定瓣状动脉粥样斑的尺寸，来测定主动脉中动脉粥样硬化的严重程度。通过Masson trichrome染色及细胞-特异免疫组织化学，测定瓣状动脉粥样斑含胶原蛋白，巨噬细胞和T细胞量。利用计算机图象分析对油红O染色，瓣状动脉粥样斑的尺寸，trichrome染色及免疫组织化学染色进行量化。

在首次实验中，分析喂食高胆固醇膳食的apo E-/-小鼠抗体在动脉粥样硬化发展方面的效果。在小鼠21周大时开始隔周给小鼠腹膜内注射0.5mg的抗体共三次，用PBS作为对照。最后一次抗体注射后两周，它们死亡，用油红O染色缩小的主动脉扁平形成物，评定动脉粥样硬化的程度。用IEI-E3抗体处理过的小鼠观察到了显著的效果，与PBS组(P＝0.02)和接受人类IgG1抗体(FITC8)直接针对无关的荧光素异硫氰酸盐(FITC)抗原的对照组(P＝0.03)相比，动脉粥样硬化减少了50％以上(图6)。鼠耐人类抗体对普通健康状态的小鼠有无效果是很明显的。

为检验IEI-E3抗体在动脉粥样硬化发展方面的抑制效果，我们做了剂量-反应研究。该表与开始的研究一样。用IEI-E3抗体处理过的小鼠，与相应FITC抗体处理过的组相比，在0.25mg组(n.s.)中动脉粥样硬化减少了2％，在0.5mg组(n.s.)中减少了25％，在2.0mg组中减少了41％(P＝0.02)(图7)。

2.在apo E-小鼠中抗体在颈动脉机械损伤后新内膜的形成方面的效果。

动脉受到机械损伤在3周内导致肌肉纤维化新内膜斑块的发展。这种斑块形态上类似肌肉纤维化动脉粥样斑，并已用作研究出现的损伤发展的一种模型。围绕颈动脉放置塑料套圈引起机械损伤。五周大的apo E-小鼠用富含胆固醇的膳食喂食14周。然后分别用含500μg的抗体给小鼠进行腹膜内注射。给对照鼠注射500μg不相关的对照抗体或单独注射PBS。7天后重复这种处理并在1天后手术放置塑料套圈。手术后第6天进行最后一次注射抗体或PBS，动物15天后死亡。将受损的颈动脉包埋在石蜡中固定并进行切片。用计算机图象分析测量新内膜斑块的尺寸。

3.抗体在培养的人类巨噬细胞中摄取氧化的低密度脂蛋白方面的效果。

在动脉巨噬细胞中摄取氧化的低密度脂蛋白导致形成胆固醇负载的巨噬细胞泡沫细胞是动脉粥样斑最典型的特征之一。几种证据表明在动脉巨噬细胞中抑制对氧化的低密度脂蛋白的摄取为治疗动脉粥样硬化提出了一个可能的目标。为研究抗体在巨噬细胞摄取氧化的c方面的效果，用¹²⁵I-标记的人类氧化的低密度脂蛋白预孵育2小时。通过在Ficoll hypaque中的离心作用从供血者的血沉棕黄层中分离出人类巨噬细胞，随后在含有10％的血清中培养6天。然后用含抗体/氧化的低密度脂蛋白复合物的培养基孵育细胞6小时，洗涤细胞并在γ-计数器中对细胞进行细胞相关放射性测定。与FITC-8进入巨噬细胞中相比，加入IEI-E3抗体导致接合(P＝0.001)和摄取(P＝0.004)氧化的低密度脂蛋白增加五倍，但在结合或摄取自然的低密度脂蛋白方面无效果(图8a和8b)。

4.抗体在氧化的低密度脂蛋白-依赖细胞毒性方面的效果。

氧化的低密度脂蛋白具有高细胞毒性。人们认为动脉粥样斑块中的大量炎症活性可通过由氧化的低密度脂蛋白引起的细胞损伤来解释。因此抑制氧化的低密度脂蛋白的细胞毒性为治疗动脉粥样硬化提出了另一个可能的目标。为了研究抗体在氧化的低密度脂蛋白细胞毒性方面的效果，将培养的人类动脉平滑肌细胞暴露于以递增浓度存在的抗体(0-200ng/ml)的人类氧化的低密度脂蛋白100ng/ml中48小时。通过测量释放的酶LDH，测定细胞的受损率。

上述实验公开了对特殊肽产生的特殊抗体的效果，但对于本领域技术人员来说，很显然对公开的肽产生的所有其它抗体也以同样的方式表现。

本发明的抗体用在被动免疫接种的药物组合物中，其中药物组合物主要计划为注射用，包活单一抗体或本发明抗体混合物的溶液，悬液，或乳剂按一定剂量，在治疗体中提供一治疗或预防活性水平。组合物可以与通常使用的佐剂一起使用，以增强抗体或抗体混合物的吸收。给药的其它途径可以是鼻腔途径，通过吸入抗体/抗体混合物与可吸入的赋形剂给药。

这样的药物组合物可含活性抗体，其含量为0.5-99.5％(重量)，或5-90％(重量)，或10-90％(重量)，或25-80％(重量)，或40-90％(重量)。

通过被动免疫接种的方法，抗体的每日剂量或促升剂量在治疗体中提供了治疗或预防活性水平，以减少或防止动脉粥样硬化的信号和症状。根据本发明抗体剂量可以是1μg-1mg每kg体重，或更多。

抗体组合物可补充以其它治疗或防止动脉粥样硬化或心血管疾病的药物使用，如降低血压的药物，如β-受体阻断药，钙拮抗剂，利尿剂和其它抗高血压剂。

图9显示了分离的scFv与经MDA修饰的ApoB100衍生肽的结合，以及与不相关序列的经MDA修饰的对照肽的结合。也描述了scFv分别与经MDA修饰的和自然的ApoB100蛋白及人类低密度脂蛋白结合之间的比率。在右手栏内用相应的子图形从上到下对图中顺序出现的条柱加以定义。

参考文献：

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Claims (9)

1.针对一种载脂蛋白B的氧化片断产生的分离的人类抗体或抗体片断在制备通过被动免疫接种方法治疗或预防性治疗动脉粥样硬化的药物组合物中的应用，其中所述的氧化片断为IEIGLEGKGFEPTLEALFGK，其特征在于，所述的抗体或抗体片断包含SEQ.ID.NO：3所示核酸序列编码的重链可变区和SEQ.ID.NO：4所示核酸序列编码的轻链可变区。

2.根据权利要求1的应用，其中所述载脂蛋白B的氧化片断是经丙二醛氧化过的。

3.根据权利要求1或2的应用，其中所述载脂蛋白B的氧化片断是经铜氧化过的。

4.针对一种载脂蛋白B的氧化片断产生的抗体，其中所述的氧化片断为IEIGLEGKGFEPTLEALFGK，其特征在于，所述的抗体包含SEQ.ID.NO：3所示核酸序列编码的重链可变区和SEQ.ID.NO：4所示核酸序列编码的轻链可变区。

5.根据权利要求4的抗体，其中所述的抗体通过以下方法制备：

利用片断库生成针对氧化的Apo B100肽产生的特定人类抗体片断，其中将识别出的具有所需特征的抗体片断复原成全长的人类免疫球蛋白，为治疗目的使用。

6.根据权利要求5的抗体，其中氧化的Apo B100肽是经MDA修饰的。

7.根据权利要求5或6的抗体，其中所述的抗体通过以下方法进行扩增：

利用重组技术，包括利用PCR-扩增将基因编码选出的scFv可变部分转移到全长的人类IgG1载体，其中使用的引物是：

用来扩增VH-片断的引物：

5′VH：5′-GGTGTGCATTCCGAGGTGCAGCTGTTGGAG(SEQ.ID.NO：13)

3′VH：5′-GACGTACGACTCACCTGAGCTCACGGTGACCAG(SEQ.ID.NO：14)

和用来扩增VL-片断的引物：

5′VL：5′-GGTGTGCATTCCCAGTCTGTGCTGACTCAG(SEQ.ID.NO：15)

3′VL：5′-GACGTACGTTCTACTCACCTAGGACCGTCAGCTT(SEQ.ID.NO：16)。

8.根据权利要求7的抗体，其中通过菌落PCR用下列引物识别含有带重链可变区和可变轻链插入片断的重链区和轻链区质粒的菌落

正向引物：5′-ATGGGTGACAATGACATC(SEQ.ID.NO：17)

反向引物：5′-AAGCTTGCTAGCGTACG(SEQ.ID.NO：18)。

9.一种药物组合物，包括如权利要求4所述的针对一种载脂蛋白B的氧化片断产生的抗体，通过被动免疫接种方法治疗或预防性治疗动脉粥样硬化，其中抗体与药物赋形剂结合使用。

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