CN112714795A

CN112714795A - 酶促rna加帽方法

Info

Publication number: CN112714795A
Application number: CN202080004546.8A
Authority: CN
Inventors: G·B·罗伯; 陈少康; B·罗伊
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 2019-08-23
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2021-04-27
Also published as: EP4017995A1; WO2021041260A1; WO2021041267A1

Abstract

本文提供了在体外有效地对RNA加帽的方法。在一些实施方式中，可使用痘苗加帽酶或其变体在高温下进行加帽反应。在其它实施方式中，加帽反应可包括来自阿米巴的巨大病毒，例如浮病病毒(Faustovirus)、拟菌病毒或姆姆病毒(moumouvirus)的加帽酶、或其变体。还提供了用于实践所述方法的组合物和试剂盒。

Description

酶促RNA加帽方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年8月23日提交的美国临时申请号62/890,821(在此通过引用以其全部并入本申请中)的优先权。

背景技术

向未加帽的合成RNA中加入帽对于许多真核细胞中蛋白质的有效表达是重要的。此外，未加帽的RNA(至少具有5’-三磷酸的RNA)据报道激活先天免疫反应(Pichlmair等,Science 2006 314:997-1001；Diamond等,Cytokine&Growth Factor Reviews,2014 25:543-550)。因此，在许多治疗应用(例如，蛋白质替代疗法以及预防性或治疗性疫苗接种)中向合成RNA添加帽是非常理想的。

目前，有两种方法被用来对RNA加帽。在第一种方法中，使用RNA加帽酶将合成的RNA(例如，体外转录的RNA)转变为加帽的RNA。在另一种方法(通常被称为“共转录加帽”)中，将诸如反转录帽类似物(ARCA)的帽类似物和加帽的二核苷酸加入到体外转录反应中。在共转录方法中，帽在体外转录过程中以共转录方式并入到RNA分子中。

与共转录加帽法相比，酶促RNA加帽法可以获得更高得率的加帽的RNA。然而，酶促RNA加帽反应是非常低效的，因此，或是使用大量酶，或是必须将加帽的RNA从未加帽的RNA中纯化。此外，酶促RNA加帽反应的效率(表示为加帽反应完成后加帽的RNA的百分比)可从一条RNA序列到另一条RNA序列变化，这一差异通常归因于RNA结构(参见，例如Fuchs,RNA.2016 22:1454-66)。

因此，仍然需要一种更有效的将帽添加到合成RNA中的方法。

发明内容

本公开除此之外提供了在体外有效地使RNA加帽的方法。在一些实施方式中，方法可包括使(i)包含未加帽的目标RNA的RNA样品，(ii)包含与SEQ ID NO:1、7或20至少90％同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列的RNA加帽酶，(iii)鸟苷三磷酸(GTP)或修饰的GTP，(iv)缓冲剂，和任选地(v)甲基供体在40℃-60℃范围内的温度下接触以形成(例如，有效地形成)加帽的目标RNA。与37℃下酶的加帽效率相比，由加帽的RNA的得率(50％)/酶浓度(nM)确定的效率可提高至少2倍或至少3倍。任选地，未加帽的目标RNA可以不含经修饰的核苷酸或者可以包含一种或多种经修饰的核苷酸(例如，假尿苷)。

在一些实施方式中，方法可包括使(i)包含未加帽的目标RNA的RNA样品，(ii)具有RNA三磷酸酯酶(TPase)、鸟苷酸转移酶(GTase)和鸟嘌呤-N7甲基转移酶(N7 MTase)活性的单链RNA加帽酶，(iii)GTP或修饰的GTP，(iv)缓冲剂，和任选地(v)甲基供体在37℃-60℃范围内的温度下接触以形成(例如，有效地形成)加帽的目标RNA。单链RNA加帽酶(例如，来自诸如浮病病毒(Faustovirus)、拟菌病毒(Mimivirus)或姆姆病毒(Moumouvirus)的巨大病毒的RNA加帽酶)可包括：(a)与(x)SEQ ID NO:2、(y)SEQ ID NO:3、和/或(z)SEQ ID NO:4至少90％同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列，或(b)与(x)SEQ ID NO:5和/或(y)SEQ ID NO:6至少90％同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。例如，诸如浮病病毒、拟菌病毒或姆姆病毒的巨大病毒的RNA加帽酶可包括与(a)SEQ ID NO:2、(b)SEQ ID NO:3、(c)SEQ ID NO:4、(d)SEQ ID NO:5、和/或(e)SEQ ID NO:6至少90％同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。来自浮病病毒(Faustovirus)的RNA加帽酶(其为单链RNA加帽酶的实例)可包含与(a)SEQ ID NO:7、(b)SEQ ID NO:8、(c)SEQ ID NO:9、(d)SEQ ID NO:10、(e)SEQ ID NO:11、和/或(f)SEQ ID NO:12至少90％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，未加帽的目标RNA在长度上可以是至少200nt(例如，至少300nt、至少500nt或至少1000nt)，并且可以编码多肽，如治疗性蛋白质或疫苗。使用本公开的方法可以更有效地对具有二级结构的目标RNA(包括治疗性RNA)加帽。效率可被定义为加帽的RNA的得率(50％)/酶浓度(nM)。在任意实施方式中，方法可包括在第一温度(例如，37℃-60℃)下接触并将温度升高或降低(例如，至37℃-60℃)，其中第二温度不同于第一温度。例如，方法可包括在37℃的第一温度下接触1到120分钟并将温度升高到45℃或50℃持续1到120分钟。在一些实施方式中，方法可包括将温度升高或降低至37℃-60℃的第三温度持续1到120分钟。在一些实施方式中，加帽方法可在一小时或更短时间内在体外产生(例如，可共转录产生)多于70％的帽0RNA。

在一些实施方式中，这些组分和/或其组合可以不含RNase并且接触可任选地进一步包括(v)一种或多种RNase抑制剂。

可利用固相寡核苷酸合成化学或通过在体外转录反应中使用聚合酶(例如，T7RNA聚合酶或Hi-T7 RNA聚合酶)，例如，通过使编码未加帽的目标RNA的DNA模板与聚合酶接触，使DNA模板转录来合成未加帽的RNA。

在任意实施方式中，接触可进一步包括接触SAM和/或帽2’O甲基转移酶(2’OMTase)。

在任意实施方式中，接触可包括在单个位置(例如，在单个微流体表面、单个反应管或其它反应容器中)使(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)接触。

本文还提供包含未加帽的目标RNA、具有TPase、GTase和N7 MTase活性的单链RNA加帽酶、GTP和缓冲剂的组合物。在一些实施方式中，组合物的温度可在37℃-60℃的范围内。在一些实施方式中，组合物可以不含RNase并且可任选地包含一种或多种RNase抑制剂。在一些实施方式中，单链RNA加帽酶可包含：(a)与(x)SEQ ID NO:2、(y)SEQ ID NO:3、和/或(z)SEQ ID NO:4至少90％同一性的氨基酸序列，或(b)与(x)SEQ ID NO:5和/或(y)SEQ IDNO:6至少90％同一性的氨基酸序列。单链RNA加帽酶可包含与FaustovirusD5b(SEQ ID NO:7)、FaustovirusE12(SEQ ID NO:8)、FaustovirusST1(SEQ ID NO:9)、FaustovirusLC9(SEQID NO:10)、拟菌病毒(SEQ ID NO:11)、或姆姆病毒(SEQ ID NO:12)的RNA加帽酶至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，组合物可进一步包含DNA模板、聚合酶(例如，噬菌体聚合酶)和核糖核苷酸，以用于转录RNA。在一些实施方式中，组合物可进一步包含SAM和/或帽2’OMTase。在一些实施方式中，单个未加帽的目标RNA在长度上可以是至少200nt(至少300nt、至少500nt或至少1000nt)，并且可编码多肽，如治疗性蛋白质或疫苗。

还提供了试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒可包含：具有TPase、GTase和N7MTase活性的单链RNA加帽酶，其中该酶在存储缓冲剂中；和浓缩的反应缓冲剂。在一些实施方式中，试剂盒可进一步包括DNA模板、聚合酶和核糖核苷酸，以用于转录RNA。在一些实施方式中，试剂盒可进一步包括SAM和/或帽2’OMTase。利用甲基转移酶的方法、组合物和试剂盒的实例也可在反应混合物中包括SAM。单链RNA加帽酶可包含：(a)与(x)SEQ ID NO:2、(y)SEQ ID NO:3、和/或(z)SEQ ID NO:4至少90％同一性的氨基酸序列，或(b)与(x)SEQ IDNO:5和/或(y)SEQ ID NO:6至少90％同一性的氨基酸序列。单链RNA加帽酶可包括与FaustovirusD5b(SEQ ID NO:7)、FaustovirusE12(SEQ ID NO:8)、FaustovirusST1(SEQ IDNO:9)、FaustovirusLC9(SEQ ID NO:10)、拟菌病毒(SEQ ID NO:11)或moumuvirus(SEQ IDNO:12)的RNA加帽酶至少90％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，RNA加帽酶可具有与SEQ ID NO:20至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，RNA加帽酶融合物(fusion)可包含：(a)与SEQ ID NO:7至少90％同一性的氨基酸序列，和(b)与SEQ ID NO:20的位置1419至1587至少90％同一性的氨基酸序列。

附图说明

图1显示了所用模型RNA分子的预测二级结构。RNA1被设计成在5’端具有最少的二级结构。RNA2、RNA3和RNA4被设计成在其5’端包含平端、一碱基突出端或两碱基突出端的同时表现出相同的预测的解折叠的最小自由能(MFE)。利用RNAFold网络服务器(维也纳大学，维也纳，奥地利)计算了37℃和45℃下的二级结构和解折叠的最小自由能。模型化的RNA分子具有以下序列：RNA1：SEQ ID NO:13，RNA2：SEQ ID NO:14，RNA3：SEQ ID NO:15，RNA4：SEQID NO:16。

图2显示了不同反应温度下H3C2和VCE对RNA1的RNA加帽活性。加帽m7Gppp的RNA的量是这些酶的RNA加帽活性的度量。每个条代表4个独立实验的平均值的结果，其中误差棒表示标准偏差。如图所示，H3C2和VCE在45℃下表现出最大的RNA加帽活性。虽然VCE加帽活性在50℃和更高温度下陡然下降，但H3C2在50℃、52℃和55℃下仍保持显著的加帽活性。

图3A-3B显示了在37℃、45℃、50℃和55℃下作为加帽酶浓度函数的RNA加帽活性。图3A显示了VCE的活性。图3B显示了H3C2的活性。各条件下加帽活性的定量比较见表1。

图4A-4E显示了在各种温度下假定的RNA加帽酶对150nt RNA的加帽活性。泳道1到6显示了使用AMN83561(H3C2)(泳道1)、AIB52055(泳道2)、SME65026(泳道3)、SMH63629(泳道4)、AAV50651氨基酸1-668(拟菌病毒加帽酶N-端区域)(泳道5)、或VP_007354410(姆姆病毒加帽酶)(泳道6)的体外翻译产物的加帽反应。在泳道7中，使用纯化的H3C2(20nM)。这些实验中使用的150nt RNA的核糖核苷酸序列为：GGGAGUCUUCGCCGAGAGGGCCAUCGCCAGUUGCCGCAACCUGUGGGAAUUUCUCUUCCAGUUUAUCCGGAUGCUCAACGGUGACUUUAAUUCCGGUAUCUUUCUCGAAUUUCUUACCGACUUCAGCGAGCUCGACAAUGCUCUUCCCUA(SEQ ID NO:17)。图4A显示了37℃下的加帽活性。图4B显示了45℃下的加帽活性。图4C显示了50℃下的加帽活性。图4D显示了55℃下的加帽活性。图4E显示了60℃下的加帽活性。

图5显示了在映射到AMH83561(H3C2)的Faustovirus D5b、E12、ST1和LC9(SEQ IDNO:7-10)加帽酶氨基酸序列之间表现出90％或更高序列同一性的保守区域。这些保守区域被命名为Fausto_CR_01、Fausto_CR_03和Fausto_CR_05。指示了H3C2加帽酶(即TPase、GTase和N7MTase)的功能结构域。

图6显示了在映射到YP_007354410(多噬棘阿米巴(Acanthanomeba polyphaga)姆姆病毒加帽酶；moumou CE(SEQ ID NO:12)的多噬棘阿米巴拟菌病毒(AAV50651，SEQ IDNO:11)和多噬棘阿米巴姆姆病毒加帽酶氨基酸序列之间表现出90％或更高序列同一性的保守区域。这些保守区域被命名为moumou_CR_03(SEQ ID NO:6)和moumou_CR_04(SEQ IDNO:7)。在该比对中，在所比对序列上方用虚线指示了moumou-CE(即TPase、GTase和N7MTase)的功能结构域。突出显示了保守区域。

图7显示了在45℃下进行的RNA加帽反应促进发夹RNA的有效加帽。在37℃(白色条)下，H3C2和VCE均有效地对RNA1加帽，RNA1具有至少5’二级结构(参见图1)。在37℃下具有稳定的5’二级结构的RNA2、RNA3和RNA4(参见图1)在37℃下未被加帽或被低程度加帽(白色条)。然而，在45℃(灰色条)下，H3C2将全部四种RNA有效加帽。在45℃下，VCE对RNA1和RNA2有效加帽，而对RNA3和RNA4部分加帽(灰色条)。

图8显示了在45℃下进行的RNA加帽反应促进长RNA的有效加帽。在10μL 1x RNA加帽缓冲剂(50mM Tris-HCl,5mM KCl,1mM MgCl₂,1mM DTT,pH 8)中的0.5mM GTP和0.1mMSAM的存在下，将增加浓度的H3C2或VCE与400nM的fluc RNA(1.7kb)于37℃或45℃温育30分钟。然后通过寡聚物引导的(oligo-guided)RNaseH切割将flucRNA的前24nt切割下来。通过15％尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析所切割的24nt片段中的加帽程度。条带强度被定量并用于计算在每种条件下的加帽分数。将计算值对酶浓度作图并拟合为修正的希尔方程(Hillequation)，得出达到50％加帽的酶浓度(帽₅₀)。对于H3C2，37℃或45℃下的帽₅₀值分别为33.6nM和0.96nM。对于VCE，37℃或45℃下的帽₅₀值分别为103nM和2.97nM。对于H3C2和VCE两者，与在37℃下相比，在45℃下反应显著减少了对50％底物RNA加帽所需的酶的量。

图9显示了，与在37℃下相比，在45℃下进行的RNA加帽反应促进对长RNA(除flucRNA外)更有效地加帽。在10μL 1x RNA加帽缓冲剂(50mM Tris-HCl,5mM KCl,1mM MgCl₂,1mM DTT,pH 8)中的0.5mM GTP和0.1mM SAM的存在下，将100nM H3C2或VCE与500nM clucRNA(1.8kb)或CFTR RNA(4.0kb)于37℃或45℃下温育30分钟。使用热稳定RNaseH(新英格兰生物实验室,伊普斯威奇,马萨诸塞州)切割所限定的5’片段，并使用

XP珠(Beckman Coulter,印第安纳波利斯,印第安纳州)和链霉亲和素

(赛默飞世尔科技,沃尔瑟姆,马萨诸塞州)的组合进行纯化。纯化的5’片段的完整质量分析通过NovatiaLLC(纽镇,宾夕法尼亚州)使用高分辨率LC/MS工作流程执行。利用加帽和未加帽种属(species)的质量强度计算加帽的RNA的分数。

图10显示了高反应温度增强痘苗病毒RNA 帽2’O甲基转移酶(MTase)的酶活性。在20μL 1x RNA加帽缓冲剂中的100U痘苗痘苗帽2’O MTase(新英格兰生物实验室,伊普斯威奇,马萨诸塞州)的存在下，使5μM化学合成的帽-0 25nt RNA(m7Gppp25聚物)与200μM SAM在指定温度下反应30分钟。通过在70℃下加热10分钟使反应停止。从反应组分中纯化RNA，将其消化成核苷和帽结构，并通过UPLC进行分析。在45℃和50℃下进行反应可产生比在37℃下产生的更多的帽-1RNA。

图11显示了与在37℃下相比，在45℃下“一锅”生成帽-1(Cap-1)结构更有效。在本实验中，在40μL 1x RNA加帽缓冲剂中50nM H3C2或VCE、1mM GTP和0.2mM SAM的存在下，将5μM化学合成的5’三磷酸核糖核苷酸寡聚物(ppp25聚物)与200U痘苗病毒帽2’OMTase于37℃或45℃温育30分钟。从直接的LC/MS分析得到反应物和产物的相对量。如图所示，在45℃下进行一锅酶促反应比在37℃下生成更多的帽-1(Cap-1)结构RNA。

图12显示了使用商业可获得的酶和推荐的反应温度对1.7kb fluc转录物的一步加帽的RNA合成不生成显著量的帽-0(Cap-0)或帽-1(Cap-1)RNA。在推荐的酶浓度下使用所指示的组分于37℃进行反应1小时(详见实施例7)。使用量子比特(Qubit)RNA BR试剂盒测量DNase I处理后的转录输出。通过LC/MS分析加帽的RNA合成反应的产物。用相应质量的质量强度估计含有不同5’基团的转录物的分数。除非另有说明，否则数据点是三次实验的平均值。

图13显示了使用高浓度H3C2加帽酶和升高温度合成加帽的fluc转录物的一步方法。在37或45℃下使用T7 RNA聚合酶和0.5μM H3C2 RNA加帽酶进行一步加帽的RNA合成1小时。利用毛细管电泳估计ppp-、pp-、Gppp-和m7Gppp-加帽的RNA的分数。数据点是重复实验的平均值。

图14显示了在45或50℃下使用高加帽酶浓度的一步帽-0(Cap-0)或帽-1(Cap-1)RNA合成。通过LC/MS分析加帽的RNA合成反应的产物。用相应质量的质量强度估计含有不同5’基团的转录物的分数。除非另有说明，否则数据点是三次实验的平均值。

图15显示了在37℃或45℃下使用H3C2:T7融合蛋白的一步帽-0RNA合成。融合蛋白在45℃下1小时内生成98％的帽-0转录物。通过LC/MS分析加帽的RNA合成反应的产物。用相应质量的质量强度估计含有不同5’基团的转录物的分数。除非另有说明，否则数据点是重复实验的平均值。

图16显示了VCE和H3C2加帽酶有效地对1.8kb cluc/A120转录物加帽。在10mL 1xRNA加帽缓冲剂(50mM Tris-HCl,5mM KCl,1mM MgCl₂,1mM DTT,pH 8)中的0.5mM GTP和0.1mM SAM的存在下，将500nM未修饰的或假尿苷cluc/A120转录物与100nM H3C2或VCE于37℃温育30min。通过RNaseH/完整的LC/MS工作流程分析加帽反应，如实施例9中描述的。VCE和H3C2分别生成68.4％或100％m7Gppp加帽的含有假尿苷的cluc/A120转录物。显而易见地，与尿苷对应物相比，这两种加帽酶对含有假尿苷的cluc/A120转录物的加帽分数更高。

图17显示了较大RNA量的帽-1形成效率。在含有1x RNA加帽缓冲剂(50mM Tris-HCl,pH 8.0,5mM KCl,1mM MgCl₂,1mM DTT)、0.5mM GTP、0.1mM SAM、10U/μL痘苗帽2’O甲基转移酶和500nM H3C2的500μL反应中，在45℃下将总共250pmol(145μg)的约1800nt cluc/A120体外转录物加帽1小时。通过RNaseH/完整的LC/MS评估帽-1形成的效率，如实施例10中描述的。在这些反应条件下，含有假尿苷的cluc/A120转录物中54.8％是帽-1，而尿苷对应物的cluc/A120转录物中47.7％是帽-1。优化反应条件(如实施例10中描述的)可提高帽-1形成的得率。结果是重复实验的平均值。

图18显示了帽-1cluc/A120转录物在体内具有功能活性。将含有尿苷或假尿苷的帽-1cluc/A120转录物转染HEK293细胞。转染后4小时，加帽的cluc/A120转录物的翻译效率被测量为与未加帽的cluc/A120转录物相比的用加帽的cluc/A120转录物所转染的HEK293细胞的相对萤光素酶活性。萤光素酶测定显示，含有rU和假尿苷的加帽的转录物表现出的萤光素酶活性分别是未加帽对照的10倍或20倍，这表明在45℃下用H3C2和痘苗2’O甲基转移酶加帽的RNA具有功能活性。

图19显示了多个温度步骤可以提高单容器加帽的RNA合成的转录输出和加帽效率。使用T7 RNA聚合酶配合VCE或H3C2加帽酶，对1.7kb fluc转录物进行单容器加帽的RNA合成反应，如实施例11中描述的，其中在37℃下使反应温育30min，随后在28℃和50℃之间的温度下进行第二次30分钟的温育。使用DNase I/量子比特法评估转录输出。通过RNaseH/克列诺(Klenow)填充(fill-in)和尿素PAGE法估计加帽分数。对显示最高加帽分数的样品进行完整的LC/MS分析。对于VCE，m7Gppp转录物形成效率在45℃的第二反应温度下达到峰值，而对于H3C2，m7Gppp形成效率在50℃的第二反应温度下达到峰值。另一方面，T7 RNAP转录输出在与VCE或H3C2配合时于45℃达到峰值，反映了在测试温度(分别为28℃和50℃)的上端和下端的低转录活性。因此，在该实施例中，37℃30min，然后45℃30min的串联温度步骤获得了转录输出和加帽效率的最佳平衡。对诸如反应时间、反应温度和温度步骤数之类的反应条件的修改可进一步提高m7G加帽的转录物的转录得率和分数。

具体实施方式

可以根据实施方式、部分标题、附图、描述和实例进一步理解本公开的各个方面，其中任何一个都不应被解释为以任何方式限制本公开的整个范围。因此，应根据本公开的全部广度和精神来解释下文所列出的权利要求。

本文所描述和示例的单独实施方式中的每一个都具有离散的组分和特征，这些组分和特征可以容易地与任意其它若干实施方式的特征分离或组合，而不脱离本教导的范围或精神。任何叙述的方法都可以按照所叙述的事件的顺序或以逻辑上可能的任意其它顺序来执行。所公开的反应条件，包括但不限于反应温度、反应持续时间、反应组分(例如，酶、底物)和/或反应物浓度可以进行变化。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管如此，为了清楚和便于参考，本文关于本公开的实施方式对某些术语进行了定义。

通常所理解的术语和符号的来源可包括：标准论文和文本，如Kornberg和Baker,DNA Replication,第二版(W.H.Freeman,纽约,1992)；Lehninger,Biochemistry,第二版(Worth Publishers,纽约,1975)；Strachan和Read,Human Molecular Genetics,第二版(Wiley-Liss,纽约,1999)；Eckstein,编者,Oligonucleotides and Analogs:A PracticalApproach(牛津大学出版社,纽约,1991)；Gait,编者,Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach(IRL出版社,牛津,1984)；Singleton等,Dictionary ofMicrobiology and Molecular biology,第二版,John Wiley和Sons,纽约(1994),以及Hale&Markham,the Harper Collins Dictionary of Biology,Harper Perennial,N.Y.(1991)等。

如本文和所附权利要求中使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个”和“一种”包括复数指代。例如，术语“蛋白质”是指一种或多种蛋白质，即单个蛋白质和多个蛋白质。还应注意的是，权利要求的撰写可以排除任意任选要素。因此，本声明旨在充当与权利要求要素的限定或“否定”限制的使用有关的如“仅”、“只”等此种排他性术语的先行基础。

数字范围包括定义该范围的数字。所有数字都应理解为涵盖整数以上和以下的整数的中点，即数字2涵盖1.5-2.5。数字2.5涵盖2.45-2.55等。当提供样品数值时，除非另有规定，例如，每一个独自可代表数值范围内的中间值，并且在一起时可代表范围内的极值。

在本公开的上下文中，“缓冲剂”是指当向溶液中添加酸或碱时允许溶液抵抗pH变化的试剂。可在本发明的组合物、试剂盒、和方法中使用的合适的非天然存在的缓冲剂的实例包括，例如Tris、HEPES、TAPS、MOPS、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、或MES。

在本公开的上下文中，“加帽”是指将Nppp-部分酶促添加到RNA的5’端，其中N是诸如是G或修饰的G的核苷酸。修饰的G在鸟嘌呤环的N7位置处可具有甲基，或在核糖的2或3位置处具有添加的标签，并且在一些实施方式中，该标签可以是寡核苷酸、可检测标签(如荧光团)、或捕获部分(如生物素或脱硫生物素)，例如，其中该标签可任选地通过连接体连接到核苷酸的核糖。参见，例如WO2015/085142。帽可具有帽-0结构、帽-1结构或帽2结构(如Ramanathan,Nucleic Acids Res.2016 44:7511–7526中评述的)，这取决于加帽反应中存在哪些酶和/或SAM是否存在。

在本公开的上下文中，“DNA模板”是指在体外转录反应中转录的双链DNA分子。DNA模板具有启动子(例如，T7、T3或SP6启动子)，由所转录区域上游的RNA聚合酶识别。

在本公开的上下文中，“融合”是指两种或更多种多肽、亚单位、或蛋白质彼此共价连接(例如，通过肽键)。例如，蛋白质融合可指代包含共价连接到报告蛋白的感兴趣蛋白质的非天然存在的多肽。可选地，融合可包含非天然存在的组合多肽链，该组合多肽链包含通过肽键彼此直接连接或通过肽连接体连接的两种蛋白质或两种蛋白质结构域。

在本公开的上下文中，“体外转录”(IVT)是指这样的无细胞反应，其中双链DNA(dsDNA)模板被DNA引导的RNA聚合酶(通常是噬菌体聚合酶)复制以产生包含从模板复制的RNA分子的产物。

在本公开的上下文中，“FaustovirusRNA加帽酶”是指能够对RNA加帽的单链RNA加帽酶(例如，具有可检测的TPase、GTase和N7 MTase活性)，包括例如，与faustovirus D5b(SEQ ID NO:7)、FaustovirusE12(SEQ ID NO:8)、FaustovirusST1(SEQ ID NO:9)、或Faustovirus LC9(SEQ ID NO:10)具有至少90％同一性的酶。“H3C2 RNA加帽酶”、“H3C2加帽酶”或“H3C2”是指来自faustovirus D5b的RNA加帽酶(SEQ ID NO:7)。除非另有明确说明，否则出于本文公开的示例和实例的目的，FaustovirusRNA加帽酶可以类似特性、效果、和/或益处彼此可互换的。

在本公开的上下文中，“H3C2融合物”是指能够从模板多核苷酸合成RNA并且能够对RNA加帽的双功能酶，该融合物包含RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶)和FaustovirusRNA加帽酶，该加帽酶相对于聚合酶被布置在N-端或C-端。H3C2融合物可进一步包含前导区(leader)和/或连接体(例如，在聚合酶和H3C2之间)。H3C2融合物可具有例如与SEQ ID NO:20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。H3C2:T7 RNA聚合酶融合物是H3C2融合物的实例。

在本公开的上下文中，“H3C2变体”是指H3C2、H3C2融合物、和能够对RNA加帽的酶，在每种情况下，其都包含与SEQ ID NO:7、8、9、10、11、和/或12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。

在本公开的上下文中，“修饰的核苷酸”(包括对修饰的NTP、修饰的ATP、修饰的GTP、修饰的CTP、和修饰的UTP的指代)是指任何非标准核苷、核苷酸或其相应的磷酸化版本。修饰的核苷酸可以包括一种或多种骨架或碱基修饰。修饰核苷酸的实例包括dI、dU、8-氧代-dG、dX、和THF。修饰的核苷酸的其它实例包括在美国专利公开号US20170056528A1、US20160038612A1、US2015/0167017A1、和US20200040026A1中公开的修饰的核苷酸。修饰的核苷酸可包括天然或非天然存在的核苷酸。

在本公开的上下文中，“非天然存在的”是指自然界中不存在的多核苷酸、多肽、碳水化合物、脂质、或组合物。这种多核苷酸、多肽、碳水化合物、脂质、或组合物可在一个或多个方面不同于天然存在的多核苷酸、多肽、碳水化合物、脂质、或组合物。例如，聚合物(例如，多核苷酸、多肽、或碳水化合物)可在组分构建区块(例如，核苷酸序列、氨基酸序列、或糖分子)的种类和布置方面不同。聚合物可与天然存在的聚合物在其所连接的分子(一个或多个)方面不同。例如，“非天然存在的”蛋白质可通过与多肽(例如，融合蛋白)、脂质、碳水化合物、或任意其它分子具有化学键(例如，共价键，包括肽键、磷酸酯键、二硫键、酯键、和醚键以及其它键)而在其二级、三级、或四级结构方面不同于天然存在的蛋白质。类似地，“非天然存在的”多核苷酸或核酸可包含对该核酸的5’-端、3’端、和/或5’-端与3’-端之间(例如，甲基化)的一种或多种其它修饰(例如，添加的标签或其它部分)。“非天然存在的”组合物可在以下一个或多个方面不同于天然存在的组合物：(a)具有在自然界中未结合的成分，(b)具有在自然界中未发现的浓度的组分，(c)省略了以其他方式在天然存在的组合物中发现的一种或多种组分，(d)具有在自然界中未发现的形式，例如，干燥、冻干、结晶、水性，以及(e)具有一种或多种其它组分，其超出在自然界中发现的那些组分(例如，缓冲剂、洗涤剂、染料、溶剂或防腐剂)。本说明书中提及的所有出版物、专利、和专利申请都通过引用以与好似每个单独的出版物、专利、或专利申请通过引用而具体且单独所示并入的程度相同的程度并入本文中。

在本公开的上下文中，“RNA样品”或“样品”是指可包含或可不包含目标RNA的组合物。例如，RNA样品可已知包括或疑似包括此类目标RNA，和/或RNA样品可以是评估目标RNA的存在的组合物。RNA样品可包含天然存在的目标RNA(例如，从细胞、组织、或生物体中提取的)、通过体外转录产生的目标RNA、和/或化学合成的RNA。

在本公开的上下文中，“单链RNA加帽酶”是指其中单个多肽链包括TPase、GTase和N7 MTase活性的加帽酶。Faustovirus、拟菌病毒和姆姆病毒加帽酶是单链RNA加帽酶的实例。H3C2融合物是单链RNA加帽酶的另一个实例。VCE是异二聚体，因此不是单链RNA加帽酶。

在本公开的上下文中，“单一未加帽的RNA目标种属(种类，species)”是指具有基本相同序列的目标RNA分子的混合物。通过体外转录产生的转录物和通过固相合成产生的RNA寡核苷酸是单一未加帽的RNA目标种属的实例。众所周知，这种混合物中一定量的RNA产物可能被截短。单一未加帽的RNA目标种属有时可含有修饰的核苷酸(例如，在自然界中未发现的非标准核苷酸)。来自细胞的RNA的制剂包含具有不同序列的天然存在的RNA分子的复杂混合物；这种制剂不仅包含所靶向的未加帽的RNA种属，而且还包含多种非目标RNA。在一些实施方式中，所靶向的未加帽的RNA种属是单一RNA种属。

在本公开的上下文中，“目标RNA”是指感兴趣的多核糖核苷酸。多核糖核苷酸可以是或者包含治疗性RNA或其前体(例如，加帽的治疗性RNA的未加帽前体)。目标RNA可由细胞转录或体外转录产生。目标RNA可存在于混合物，例如，体外转录反应混合物、细胞、或细胞裂解物中。目标RNA可以是未加帽的。如果期望或需要，可将目标RNA与脱帽酶接触，例如，作为对加帽的共处理或加帽前的预处理。

在本公开的上下文中，“未加帽的”是指(a)不具有帽并且(b)可用作加帽酶的底物的RNA。未加帽的RNA通常有三磷酸化或二磷酸化的5’端。体外转录的RNA在5’端有三磷酸基团。

在本公开的上下文中，“变体”是指这样的蛋白质，其具有不同于天然存在的氨基酸序列(即，与天然存在的蛋白质的氨基酸序列具有小于100％的同一性)但与天然存在的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列。

本文提供了多种体外RNA加帽方法。该方法的一些实施方式部分基于以下发现，即SEQ IDNO:1的VCE在45℃下比在37℃下显著更具活性(参见下面的图2以及表1和表2)——特别是对于具有二级结构的RNA。例如，当用于向编码蛋白质的体外转录的RNA添加帽物时，与在37℃下相比，在45℃下使用少于酶量的三十分之一(1/30)就可产生相同量的加帽产物(参见表6)。此外，在45℃下的反应下进行温育允许VCE有效地将帽添加到在5’端(例如，预测与分子中的另一序列碱基配对以产生平端或者1个或2个核苷酸的3’或5’突出端的5’端，如图1中所示)具有二级结构的未加帽的RNA寡核苷酸。这种RNA在37℃下用VCE加帽效率很低(参见图9)。因此，在一些实施方式中，该方法可包括在42℃-47℃范围内的温度(例如44℃-46℃)温育包含RNA、VCE或其变体、GTP或修饰的GTP、SAM和缓冲剂的反应混合物，以有效地将帽结构添加到未加帽的RNA目标。该方法的这些实施方式对于具有或预测具有二级结构的RNA(如在体外转录的长度超过200nt的RNA，以及在5’端具有二级结构的RNA寡核苷酸)特别有用。

该方法的其它实施方式部分基于以下发现：来自faustovirus D5b的RNA加帽酶(SEQ ID NO:7，H3C2加帽酶的实例并且本文以缩写“H3C2”来提及)能够在几乎所有测试温度下比VCE显著更有效地对RNA加帽(参见下面的图2以及表1和表6)，并且与VCE一样，可用于在45℃下有效地向体外转录的RNA添加帽。例如，与在37℃下相比，在45℃下使用少于faustovirus D5b(H3C2)的量的三十分之一(1/30)就可产生相同量的加帽产物(参见表6)。此外，在45℃反应下进行温育允许faustovirus D5b(H3C2)有效地将帽添加到在5’端具有二级结构的未加帽的RNA寡核苷酸。这种RNA在37℃下用faustovirus D5b(H3C2)加帽效率很低(参见图9)。也对来自阿米巴的其它巨大病毒的加帽酶，包括faustovirusST1、faustovirusLC9、faustovirusE12、拟菌病毒(mimivirus)、和姆姆病毒进行了测试，并发现它们在较高温度下具有活性。因此，在一些实施方式中，方法可包括在37℃-60℃的范围内的温度(例如，37℃-42℃、42℃-47℃、47℃-52℃或52℃-60℃)温育包括含有RNA、单链加帽酶、GTP或修饰的GTP以及缓冲剂的样品的反应混合物，以在体外有效地将帽结构添加到未加帽的RNA目标。方法的这些实施方式对于具有或预测具有二级结构的RNA(如在体外转录的长度超过200nt的RNA，以及在5’端具有二级结构的RNA寡核苷酸)特别有用。

更有效地对RNA底物加帽可支持：使用添加到加帽反应中的较少酶进行加帽、使用相同量的酶产生更多加帽的RNA(作为反应中RNA的百分比)、更早地使反应终止、和/或更有效地对在5’端具有二级结构的RNA加帽。

所公开的反应条件可以是变化的，不限制地包括反应温度、反应持续时间、反应组分浓度(例如SAM、无机焦磷酸酶、NTP、转录物模板)和酶(例如，加帽酶、聚合酶、及其融合物)。例如，H3C2:T7 RNA聚合酶融合蛋白可在帽-0转录物的分数和转录输出方面进一步提高帽-0RNA合成的效率。此外，在反应中包含帽2’O甲基转移酶，如痘苗帽2’O甲基转移酶，可以高效地生成帽-1转录物。取决于使用的是哪种酶和反应混合物中的其它组分，所公开的方法可用于制备这样的RNA：具有Gppp帽、7-甲基鸟苷酸帽(即，m7Gppp帽或“帽-0”)，或这样的RNA：所具有的m7Gppp帽在该RNA的第一和/或第二核苷酸中具有添加修饰(即，“帽-1”和“帽-2”；参见Fechter J.Gen.Vir.2005 86:1239–49)。例如，如果反应混合物中没有SAM，则可能产生具有Gppp帽的RNA。如果反应混合物除了加帽酶外还包含SAM，则可产生帽-0RNA。如果反应混合物除了SAM外还包含其它酶，例如，帽2’OMTase，则可产生帽-1和/或帽-2RNA。除上述明确描述的组分外，反应混合物可包含其它组分。

在一些实施方式中，反应混合物中未加帽的RNA可通过固相寡核苷酸合成化学制备(参见，例如，Li等J.Org.Chem.2012 77:9889–9892)，在这种情况下，样品中的RNA可以是可具有10-500碱基范围内的长度，例如20-200碱基)。在其它实施方式中，反应混合物中未加帽的RNA可在无细胞体外转录(IVT)反应中制备，其中在所转录区域上游含有RNA聚合酶启动子(例如T7、T3或SP6启动子)的双链DNA模板被DNA指导的RNA聚合酶(通常是噬菌体聚合酶)复制以产生包含从模板复制的RNA分子的产物。在任一实施方式中，在本方法中加帽的RNA样品包含单一种属的RNA(合成的寡核苷酸或转录物)。此外，反应混合物可以不含RNase并且可任选包含一种或多种RNase抑制剂。样品中的RNA可包含非天然核苷酸序列，并且在一些实施方式中，可包含非天然存在的核苷酸。在一些实施方式中，体外转录反应可采用T7、T3和SP6 RNA聚合酶的热稳定变体(参见，例如PCT/US2017/013179和美国申请系列号15/594,090)。在这些实施方式中，RNA可在大于44℃的温度(例如，至少45℃、至少50℃、至少55℃或至少60℃、高达约70℃或75℃的温度)下转录以降低RNA的免疫原性(参见，例如WO2018/236617)。在某些情况下，未加帽的RNA可在其被制备后立即加帽，例如通过在体外转录反应已经运行其过程之后根据需要向该反应添加RNA加帽酶和GTP/修饰的GTP。在一些实施方式中，在体外转录反应中制备的RNA可在加帽之前纯化。

在一些实施方式中，样品中的RNA可以是治疗性RNA。在这些实施方式中，本方法的产物可在不从未加帽的RNA纯化加帽的RNA的情况下使用。在这些实施方式中，本反应的产物可与药学上可接受的赋形剂组合以产生制剂，其中“药学上可接受的赋形剂”是与通过经皮、经口、静脉内、或本领域使用的其它给予手段对活体哺乳动物有机体进行给予兼容的任意溶剂。药学上可接受的赋形剂的实例包括例如在US 2017/0119740中描述的那些。制剂可在体内给予，例如，向对象给予，对象的实例包括人类或任何非人类动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。取决于对象，可以通过注射RNA(修饰的或未修饰的)将RNA直接导入细胞，或者通过周围的培养基将RNA间接导入细胞。给予可通过标准化方法执行。RNA可以是裸的或以适用于向对象(例如，人)给予的形式配制。制剂可包括液体制剂(溶液、悬浮液、分散体)、局部制剂(凝胶、软膏、滴剂、乳膏)、脂质体制剂(如：US 9,629,804 B2；US 2012/0251618 A1；WO 2014/152211；US 2016/0038432 A1中描述的)。RNA产物所导入的细胞可以是体外的(即在合成培养基上体外培养的细胞)。因此，RNA产物可以被转染到细胞中。RNA产物所导入的细胞可以是体内的(作为哺乳动物的部分的细胞)。因此，导入可通过在体内向对象给予RNA产物来完成。RNA产物所导入的细胞可以离体存在(作为组织的部分的细胞，例如，已从哺乳动物移除或从哺乳动物的血液中分离的软组织)。

为了制备用于治疗应用的mRNA，可能期望或需要以可扩展地支持多克数合成(克级合成，multi-gram synthesis)的经济高效且流线型的方式来合成大量均匀加帽的mRNA转录物。目前制备mRNA的方法是在体外转录反应中使用昂贵的mRNA帽类似物。可选地，需要单独的反应，以通过体外转录产生5’-三磷酸RNA，然后使用酶对mRNA进行加帽，这是一个更复杂的过程，更难扩展。利用T7 RNA聚合酶和加帽酶在体外一步合成加帽的RNA可以简化制备过程。用这两种酶的单容器反应可降低或消除合成mRNA帽类似物的过高成本，并且可降低扩展此工作流程以支持多克数(和更多)合成的复杂性。

方法

本文提供了用于有效产生加帽的RNA的方法。在一些实施方式中，方法包括热活性Hi-T7 RNA聚合酶和H3C2 RNA加帽酶以及出乎意料地热活性的痘苗mRNA帽2’O甲基转移酶。令人惊讶的是，大大高于37℃的反应温度能够实现单反应加帽的mRNA的合成。在一些实施方式中，可在较高温度(例如，40℃至60℃)下在单反应中执行RNA转录和加帽活性。例如，RNA聚合酶和具有或没有痘苗帽2’O甲基转移酶的单独的加帽酶可同时用于加帽的RNA的合成反应。可例如通过包含H3C2、单亚单位RNA加帽酶、和T7 RNA聚合酶或Hi-T7 RNA聚合酶的融合蛋白实现RNA转录和加帽活性的结合。本文描述的方法可实现高水平的帽-0或帽-1RNA合成。

在一些实施方式中，加帽方法可包括任选地在SAM存在或不存在的情况下使RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶、热活性Hi-T7 RNA聚合酶和/或H3C2融合物)、编码目标RNA的多核苷酸(例如，DNA或RNA)、加帽酶(例如，VCE、H3C2、H3C2融合物)、NTP、缓冲剂接触。核苷三磷酸(NTP)可包括未修饰的ATP、修饰的ATP(m6ATP、m1ATP)、未修饰的CTP、修饰的CTP(例如，m5CTP)、未修饰的GTP、修饰的GTP、未修饰的UTP、修饰的UTP(例如，假尿苷三磷酸、m1假尿苷三磷酸)、含2’O甲基化的NTP、和/或其组合。在一些实施方式中，加帽方法可包括使加帽酶(例如，VCE、H3C2、H3C2融合物)、目标RNA、和鸟苷三磷酸(GTP)、和/或修饰的GTP接触。在一些实施方式中，加帽方法可包括在SAM存在或不存在的情况下使加帽酶(例如，VCE、H3C2、H3C2融合物)、目标RNA、和鸟苷三磷酸(GTP)和/或修饰的GTP、O-甲基转移酶(例如，热活性痘苗mRNA帽2’O-甲基转移酶)接触。

根据一些实施方式，接触可例如在任意表面(例如，板或珠)上或在任意容器(例如，管、烧瓶、小瓶、柱、容器、生物反应器或其它空间)中的单个位置(例如，在一步中)中执行。在一些实施方式中，接触可以包括以任意期望的顺序或同时地使一些或所有对象元素接触。在一些实施方式中，接触可包括在缓冲剂存在下使一些或所有对象元素接触。例如，接触可包括在SAM存在或不存在的情况下以任意顺序或同时地使加帽酶(例如，VCE、H3C2、H3C2融合物)、目标RNA、GTP、和缓冲剂接触。在一些实施方式中，接触可进一步包括在40℃到60℃(例如，在40℃、42℃、44℃、45℃、46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、55℃、56℃、58℃、或60℃下)的温度下接触任意期望的时间段，例如，1分钟到120分钟(例如，1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟、105分钟、或120分钟)。在本文公开的任意实施方式中，接触可进一步包括在25℃到60℃的第一温度下接触和冷却或加热到25℃到60℃的不同于第一温度的第二温度，其中，任选地，第一温度或第二温度中的至少一个不低于40℃。可选择第一温度以产生、稳定和/或保持所期望量的未加帽的目标RNA，并且可选择第二温度以产生、稳定和/或保持所期望量的加帽的目标RNA。各温度可维持任意期望的时间段(例如，1分钟到120分钟)。例如，第一温度可以是37℃持续1到30分钟的第一时段，而第二温度可以是28℃、32℃、37℃、45℃、或50℃持续1到30分钟的第二时段。在所公开的任意实施方式中，接触可包括将一个项目放置成与另一个项目直接接触，将两个项目一起放置在表面上或容器中，使其足够接近，以便它们在具有或没有进一步搅拌或混合的情况下可以物理和/或化学地相互作用。接触可包括将一个项目放置成直接接触或接近另一个项目和/或维持允许或有利于这两个项目相互接触的条件的初始行为。

在一些实施方式中，方法可包括在体外合成RNA(例如，由模板指导或不由模板指导的)以产生未加帽的目标RNA和对目标RNA加帽(例如，在一步反应中)。由模板合成RNA可包括，例如，使RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶、热活性Hi-T7 RNA聚合酶和/或H3C2融合物)与模板(例如，RNA模板或DNA模板)和用于产生未加帽的目标RNA的一种或多种NTP、缓冲剂、和任选地存在或不存在SAM的情况下接触。核苷三磷酸(NTP)可包括未修饰的ATP、修饰的ATP(m6ATP、m1ATP)、未修饰的CTP、修饰的CTP(例如m5CTP)、未修饰的GTP、修饰的GTP、未修饰的UTP、修饰的UTP(例如，假尿苷三磷酸、m1假尿苷三磷酸)、含2’O甲基化的NTP、和/或它们的组合。对目标RNA加帽可包括例如使H3C2(例如，H3C2或H3C2融合物)与目标RNA和鸟苷三磷酸(GTP)和/或修饰的GTP接触以产生加帽的目标RNA。在一些实施方式中，加帽方法可包括在25℃到60℃的温度下使目标RNA与H3C2融合物接触。在一些实施方式中，加帽方法可包括使目标RNA与脱帽酶接触以去除现有的帽和/或确保其未被加帽。

加帽可包括，例如，使加帽酶(例如，VCE、H3C2、H3C2融合物)与目标RNA、O-甲基转移酶(例如，热活性痘苗mRNA帽2’O甲基转移酶)、SAM、鸟苷三磷酸(GTP)、修饰的GTP、和/或缓冲剂接触。例如，加帽可包括使加帽酶、目标RNA、GTP(任选地，具有或不具有修饰的GTP)、和任选地缓冲剂接触。加帽可包括在单个容器中(例如，在一步中)使加帽酶、目标RNA、GTP(任选地，具有或不具有修饰的GTP)、O-甲基转移酶、SAM、和任选地缓冲剂接触。加帽可包括在单个容器中(例如，在一步中)例如通过使编码目标RNA的目标RNA模板(DNA或RNA)、聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶、热活性Hi-T7 RNA聚合酶和/或H3C2融合物)、NTP(任选地包括或不包括一种或多种修饰的NTP)、加帽酶(例如，VCE、H3C2、H3C2融合物)、和/或缓冲剂接触而对预先存在的目标RNA加帽和/或合成并对目标RNA加帽。

组合物

还提供了与所公开的方法有关的各种组合物。在一些实施方式中，组合物(例如，反应混合物)可包含目标RNA(例如，在RNA样品中)和/或编码目标RNA的DNA模板。在一些实施方式中，组合物可包含具有TPase、GTase和N7 MTase活性的单链RNA加帽酶、GTP、SAM和缓冲剂。组合物的温度可在37℃-60℃范围内，例如，37℃-42℃、42℃-47℃、47℃-52℃或52℃-60℃。在一些实施方式中，由于RNase被抑制、失活或缺失，因此组合物可不具有RNase活性。例如，无RNase组合物可包含一种或多种RNase抑制剂。在一些实施方式中，组合物可进一步包含可操作地连接到启动子的DNA模板、在启动子处启动转录的噬菌体聚合酶、和NTP，用于转录RNA。在一些实施方式中，组合物可包括帽2’OMTase。单链RNA加帽酶可包含(a)与SEQ ID NO:2、3、或4至少90％同一性的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:5或6至少90％同一性的氨基酸序列。根据一些实施方式，组合物可包含H3C2融合物，其以N-端到C-端的顺序包含(a)FaustovirusRNA加帽酶(例如，H3C2 RNA加帽酶)和RNA聚合酶或(b)RNA聚合酶和H3C2RNA加帽酶，其中H3C2融合物任选地可进一步包含前导区(例如，可操作地定位在融合物内)和/或定位在H3C2和RNA聚合酶之间的连接体。在一些实施方式中，本段落中提及的任何或所有组分都可以组合或以其它方式包含在单个容器中。组分，例如单个容器中的组分，可以以干燥(例如，无水和/或冻干)形式存在。含有所提及的组分中的一种或多种的容器也可含有水性介质。

试剂盒

如上文所述，本公开还提供了用于实践主题方法的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒可以包含上面列举的组分中的任意一种或多种。例如，试剂盒可包含具有TPase、GTase和N7 MTase活性的单链RNA加帽酶，其中该酶在储存缓冲剂和反应缓冲剂(例如，其可以是5×或10×的浓缩反应缓冲剂)中。在一些实施方式中，试剂盒可包含噬菌体聚合酶和NTP，用于从DNA模板转录RNA。试剂盒可另外包括SAM和帽2’OMTase。如将从上面的讨论中可以明显看出的，该酶可包含(a)与SEQ ID NO:2、3、或4至少90％同一性的氨基酸序列，或(b)与SEQID NO:5或6至少90％同一性的氨基酸序列。

试剂盒的各种组分都可以存在于单独的容器中，或者可以根据需要将某些兼容组分预先组合到单个容器中。除了上述组分之外，主题试剂盒还可以包括使用试剂盒的组分来实践主题方法的说明书，即，关于对RNA加帽的说明书。

实施例

所有试剂均可从新英格兰生物实验室(伊普斯威奇,马萨诸塞州)和/或指定供应商处获得。

实施例1：H3C2和VCE在高温下的RNA加帽活性

在10μL 1×RNA加帽缓冲剂(50mM Tris-HCl,5mM KCl,1mM MgCl₂,1mM DTT,pH8.0)中0.5mM GTP和0.1mM SAM的存在下，在23℃至65℃范围内的温度下将10nM纯化的VCE或H3C2 RNA加帽酶与500nM RNA1(图1)温育30分钟，RNA1在其3’端含有荧光基团(FAM)。通过添加1μL 50mM EDTA，然后在70℃下加热灭活10分钟，使反应猝灭。使用应用生物系统(Applied Biosystem)3730×l基因分析仪，通过毛细管电泳分析猝灭的反应。与m7Gppp-、未甲基化的Gppp-、未加帽的pp-和ppp-RNA1对应的峰面积被定量并用于计算30分钟加帽反应结束时m7Gppp-的分数。在图2中，每个条代表4个独立实验的平均值。误差棒代表4次重复的标准偏差。很明显，在低酶浓度(10nM)下，H3C2和VCE在45℃下均表现出最高的加帽活性，而H3C2在50℃和55℃下保持了比VCE更高的加帽活性。

为了更好地量化VCE和H3C2在不同反应温度下的RNA加帽活性，将酶的稀释液分别在37℃、45℃、50℃或55℃的相同反应条件下温育30分钟。将分数m7Gppp-RNA1的计算值对酶浓度作图并拟合为希尔方程导数，得出达到50％加帽的酶浓度(帽50)。如图3A-3B和表1所示，在30分钟内分别于37℃、45℃、50℃或55℃下将50％的0.5μm ppp-RNA1转变为m7Gppp-RNA1需要3.06nM、0.94nM、4.08nM和30.00nM的VCE。此外，在50℃及以下，在30分钟内，400nM或更多VCE对>90％的0.5μmRNA加帽。对于H3C2，0.69nM、0.67nM、2.15nM或21.3nM的酶可在30分钟内分别于37℃、45℃、50℃或55℃下将50％的ppp-RNA1转变为m7Gppp-RNA1。此外，50nM的H3C2在30分钟内在高达55℃下对>90％的ppp-RNA1有效地加帽。

表1.各种温度下以帽50值表示的VCE和H3C2的RNA加帽活性，以nM(A)或毫单位/μl反应(B)计。

实施例2：H3C2直向同源物的鉴定和测试

在体外条件下，来自faustovirus D5b(

登录号AMN83561)的纯化的RNA加帽酶H3C2在高达60℃具有活性。通过序列同源性，鉴定了其它faustovirus株中的几个假定的直向同源物。发现来自其它faustovirus株和相关巨大病毒多噬棘阿米巴拟菌病毒和多噬棘阿米巴姆姆病毒的假定的RNA加帽酶的基因产物在高达55-60℃的RNA加帽中具有活性。将所鉴定的直向同源基因的ORF合成并插入到T7表达载体中，使得目标基因的表达处于T7启动子的控制下。根据制造商的建议，使用

高保真2×Master Mix(新英格兰生物实验室,伊普斯威奇,马萨诸塞州)通过PCR扩增T7表达盒。根据制造商的说明，使用

PCR&DNA清理试剂盒(cleanup kit)(新英格兰生物实验室,伊普斯威奇,马萨诸塞州)纯化扩增的T7表达盒。根据制造商的说明，使用

体外蛋白质合成试剂盒(新英格兰生物实验室,伊普斯威奇,马萨诸塞州)对纯化的T7表达盒进行体外转录/翻译。包含具有指示的Genbank登录号的基因产物(图4A-4E)的PURExpress反应产物用于RNA加帽测定。简而言之，在冰上组装由1×RNA加帽缓冲剂(50mM Tris-HCl,5mM KCl,1mM MgCl₂,1mM DTT,pH8.0)中的2μL PURExpress产物、0.4μM 150nt体外转录物RNA、4μM GTP、0.1mM SAM、和微量³²P-α-GTP组成的50μL RNA加帽反应。反应分为5等份，每一份在指示温度下温育30分钟。通过向反应中添加10μL 2×RNA荷载染料(新英格兰生物实验室,伊普斯威奇,马萨诸塞州)使反应停止，并通过变性聚丙烯酰胺电泳和放射自显影分析。如所示，在底物RNA的位置迁移的放射显影信号表明了加帽活性。如图4A-4E所示，来自faustovirus ST1(Genbank登录号SME65026；泳道3)和faustovirus LC9(SMH63629；泳道4)的假定的RNA加帽酶，拟菌病毒加帽酶的N-端部分(Genbank登录号AAV50651的氨基酸1-668；Benarroch等,2008；泳道5)和姆姆病毒加帽酶(Genbank登录号YP_007354410；泳道6)在高达55℃的温度下加帽了150聚物的RNA，而来自Faustovirus D5b(Genbank登录号AMN83561；H3C2；泳道1)、Faustovirus E12(Genbank登录号AIB52055；泳道2)和纯化的H3C2(泳道7)的RNA加帽酶在高达60℃的温度下加帽了150聚物的RNA。

实施例3：序列分析

序列比对分析显示，在高达55℃具有活性的四种FaustovirusRNA加帽酶中，三个60个氨基酸或111个氨基酸长的区域表现出90％或更高的氨基酸序列同一性(图5)。保守区Fausto_CR_01在H3C2的TPase结构域内跨越60个氨基酸。Fausto_CR_03在鸟苷N7甲基转移酶结构域的N-端跨越111个氨基酸。Fausto_CR_05在H3C2的鸟苷N7甲基转移酶结构域的C-端侧跨越60个氨基酸。Fausto_CR_01的氨基酸序列(其对应于H3C2序列的氨基酸43-102)是FDKLKPDGEITTTMRVSNADGMAREITFGGGVKTGEMFVKKQNICVFDVVDIFSYKVAVS(SEQ ID NO:2)。Fausto_CR_03的氨基酸序列(其对应于H3C2序列的氨基酸537-647)是GFYGNNYKIASDIYLNYIDVFNFDDLWKYNPGYFEKNKSDIYIAPNKYRRYLIKSLFNKYIKNAKWVIDAAAGRGADLHLYKAECVENLLAIDIDPTAISELIRRRNEITG(SEQ ID NO:3)。Fausto_CR_05的氨基酸序列(其对应于H3C2序列的氨基酸778-873)是KYSIKRLYDSDKLTKTGQKIAVLLPMSG EMKEEPLCNIKNIISMARKMGLDLVESANFSV(SEQ ID NO:4)。

下表总结了Faustovirus加帽酶的氨基酸序列之间的序列同一性。

表2

表3

图6显示了各种Faustovirus RNA加帽酶序列的比对，显示了保守结构域以及TPase、GTase和MTase区域的序列。

序列比对分析还显示了两个67个氨基酸或111个氨基酸长的区域在高达55℃具有活性的多噬棘阿米巴拟菌病毒和多噬棘阿米巴姆姆病毒RNA加帽酶之间表现出90％或更高的序列同一性(图7)。保守区moumou_CR_03(其对应于姆姆病毒序列的氨基酸576-642)在GTase和鸟苷N7甲基转移酶结构域之间跨越67个氨基酸。Moumou_CR_04(其对应于姆姆病毒序列的氨基酸672-782)在鸟苷N7甲基转移酶结构域的N-端跨越111个氨基酸。moumou_CR_03的氨基酸序列是INDNTVVEFIFDNFKIDMDDPYKWIPIRTRYDKTESVQKYHKKYGNNLHIANRIWKTITNPITEDII(SEQ ID NO:5)。moumou_CR_04的氨基酸序列是YYQKNTSNAAGMRAFNNFIKSNMITTYCKDGDKVLDIGCGRGGDLIKFIHAGIEEYVGIDIDNNGLYVINDSAFNRYKNLKKTIKNIPPMTFINADARGLFNLEAQEKILP(SEQ ID NO:6)。

下表总结了拟菌病毒和姆姆病毒RNA加帽酶的氨基酸序列之间的序列同一性。

表4

表5

图8显示了拟菌病毒和moumou病毒序列的比对，显示了保守结构域以及TPase、GTase和MTase区域的序列。

实施例4：45℃下的RNA加帽反应提高了短模型发夹RNA的加帽效率

图1所示的短RNA如本文所描述被设计用于评估加帽效率。对照RNA(RNA1)被设计成具有较短的发夹结构和非结构的5’端，在37℃下具有-1.5kcal/mol的MFE或在45℃下具有-0.73kcal/mol的MFE(图1)。RNA2、RNA3和RNA4被设计成形成稳定的发夹结构，在37℃下具有-7.2kcal/mol或在45℃下具有-5.4kcal/mol的理论解折叠的最小自由能(MFE)(RNAFold server rna.tbi.univie.ac.at)。RNA2、RNA3和RNA4进一步被设计成在各自最小自由能结构的5’端具有平端、一碱基或两碱基突出端(图1)。使用T7 RNA聚合酶通过体外转录产生RNA。对于加帽反应，在10μL 1×RNA加帽缓冲剂(50mM Tris-HCl,5mM KCl,1mMMgCl₂,1mM DTT,pH 8.0)中0.5mM GTP和0.1mM SAM的存在下，将50nM H3C2或VCE与500nMRNA底物于37℃或45℃下温育30min。在37℃下，H3C2使100％的RNA1加帽，预测RNA1具有非结构的5’端；并且使22％的RNA4加帽，预测RNA4在5’端具有两碱基突出端结构(图9)。在这些条件下，H3C2不能对RNA2和RNA3加帽。在45℃下，H3C2对所有四种RNA底物100％加帽。在37℃下，VCE只能对80％的RNA1加帽。在45℃下，VCE对100％的RNA1和RNA2和大约60％的RNA3和RNA4加帽。

实施例5：45℃下的RNA加帽反应提高了长RNA的加帽效率

通过用T7 RNA聚合酶体外转录产生了含有萤火虫萤光素酶基因(flucfluc)的1766nt RNA。在10μL 1×RNA加帽缓冲剂(50mM Tris-HCl,5mM KCl,1mM MgCl₂,1mM DTT,pH8)中0.5mM GTP和0.1mM SAM的存在下，将400nM的flucRNA与指示浓度的H3C2或VCE于37℃或45℃下温育30分钟。然后将被设计以引导RNaseH切割出25nt的5’片段的终浓度为2.5μM的目标寡聚物(TO)添加到各加帽反应中，然后在80℃下对加帽反应加热30s以使加帽酶失活，然后缓慢冷却至室温。以0.5U/μL的终浓度将热稳定的RNaseH(新英格兰生物实验室,伊普斯威奇,马萨诸塞州)添加到各反应中，然后在37℃下温育1小时。然后通过15％尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析RNaseH反应。使用

Gold(赛默飞世尔科技,沃尔瑟姆,马萨诸塞州)将凝胶染色(根据制造商的说明)，然后使用

RGB(GE医疗,马尔堡,马萨诸塞州)扫描仪利用Cy2通道扫描。将加帽的带和未加帽的带的强度标准化为同一泳道的TO的强度。标准化的值用于计算在每种条件下被加帽的RNA的分数。将计算值对酶浓度作图并拟合成希尔方程导数，得出达到50％加帽的酶浓度(帽50)。对于H3C2，37℃或45℃下的帽50值分别是33.6nM和0.96nM。对于VCE，37℃或45℃下的帽50值分别是103nM和2.97nM(以下图10和表6)。对于这两种酶，当在45℃下进行加帽反应时，达到50％加帽所需的酶大大减少。

表6.37℃和45℃下VCE和H3C2对1.7kb fluc体外转录物的RNA加帽活性，以帽50值表示。

这些酶的活性可以用毫单位/μL反应表示，如下所示：

为了显示在其它长RNA分子上可以实现温度增强的加帽效率，利用海萤属(cypridina)萤光素酶(cluc；1823nt)和囊性纤维化跨膜受体(CFTR；4712nt)的体外转录物，通过质谱法读出研究了H3C2和VCE的加帽效率。简而言之，在100μL的反应体积中0.1mMSAM和0.5mM GTP的存在下，将0.5μM的cluc或CFTR体外转录物与100nM的H3C2或VCE于37℃或45℃下温育30分钟。在2.5μM的目标寡聚物(由5’脱氧核苷酸和3’核糖核苷酸组成)和TEG-脱硫生物素基团的存在下，通过在80℃下加热30秒使反应停止。以0.1℃/s的速率将反应冷却至25℃。然后通过在37℃下与终浓度为0.5U/μL的热稳定RNaseH(新英格兰生物实验室,伊普斯威奇,马萨诸塞州)温育1小时，对反应进行RNaseH切割。然后利用使用

XP珠的尺寸选择和使用链霉亲和素磁珠的目标选择来纯化RNaseH切割反应的5’片段。简而言之，将100μL的RNaseH切割反应添加到200μL的

XP珠中并在室温下温育5分钟。然后将珠置于磁场中，并取回澄清的上清液并将其添加至得自200μL珠悬浮液的预清理的

XP珠中。在室温下温育5分钟后，将珠置于磁场中。将澄清的上清液添加至得自200μL

MyOne链霉亲和素C1的预清理的珠中。在用200μL洗涤缓冲剂(5mM Tris,pH 7.5,0.5mM EDTA,1M NaCl)洗涤4次后，通过在37℃下将澄清的珠与50μL生物素洗脱缓冲剂(1mM生物素,5mM Tris,pH 7.5,0.1M NaCl,0.1M NaCl)温育1小时来洗脱结合的RNA。然后由外承包商Novatia LLC对洗脱的RNA进行LC/MS分析，以确定目标质量的相对量。RNA加帽的程度通过加帽和未加帽的RNA种属的质量强度比来评估。

如图11中所示，H3C2和VCE两者在45℃下均比在37℃下对cluc RNA和CFTR RNA表现出更多的加帽活性。

实施例6：升高温度下在三磷酸RNA上有效地一锅式酶促合成帽-1结构

为了验证痘苗病毒帽2’OMTase在升高温度下是否具有活性，在37℃、45℃或50℃下预热含有5μM化学合成的帽-0RNA1(25nt)和20μL 1×RNA加帽缓冲剂(50mM Tris-HCl,5mM KCl,1mM MgCl₂,1mM DTT,pH 8.0)中的200μM SAM的反应1分钟，之后添加100U的痘苗病毒帽2’OMTase(新英格兰生物实验室,伊普斯威奇,马萨诸塞州)。使反应在预热温度下进行30分钟，然后通过在70℃下加热10分钟使反应停止。使用寡聚物清理和浓缩试剂盒(Oligo Clean-up and Concentration Kit)(Norgen Biotek,索罗尔德,加拿大)从反应组分中纯化RNA。然后通过与2μL核苷酸消化混合物(新英格兰生物实验室,伊普斯威奇,马萨诸塞州)在含有核苷消化混合物反应缓冲剂(50mM乙酸钠,pH 5.4,1mM ZnCl₂)的20μL反应中于37℃下温育1小时来使纯化的RNA消化成核苷和帽结构。然后用Agilent 1290Infinity II UHPLC(安捷伦科技,圣克拉拉,加利福尼亚州)在Waters XSelect^TMHSS T3 XP柱(沃特世公司,米尔福德,马萨诸塞州)(2.1×100mm,2.5μm)上分析核苷消化反应，其中梯度流动相由甲醇和10mM磷酸钾缓冲剂(pH 7.0)组成。如图12中所示，比起在37℃下，在45℃和50℃下更多的帽-0RNA被甲基化。

为了证明升高温度下在5’三磷酸RNA上一锅式酶促合成帽-1结构，在含有1×RNA加帽缓冲剂(50mM Tris-HCl,5mM KCl,1mM MgCl₂,1mM DTT,pH 8.0)的40μL反应中50nMH3C2或VCE、1mM GTP和0.2mM SAM的存在下，将5μM化学合成的5’三磷酸RNA1与200U的痘苗病毒帽2’OMTase(终浓度5U/μL)于37℃或45℃下温育30分钟。通过LC/MS直接分析反应以测定质量和质量的相对量。当与50nM VCE配合时，尽管5U/μL的2’OMTase在37℃下仅生成约50％的帽-01RNA，但其在45℃下生成100％的帽-1RNA(图13)。当与50nM H3C2配合时，5U/μL的痘苗2’OMTase在37℃下生成约90％的帽-1RNA，而在45℃下生成100％的帽-1RNA(图13)。因此，在VCE的存在下于45℃进行反应使帽-1RNA的得率大致加倍，而在H3C2的存在下于45℃进行反应提高了帽-1RNA的得率。

实施例7：使用单独的RNA聚合酶、RNA加帽酶和帽2’O甲基转移酶帽-0帽-1的一步帽-0和帽-1RNA合成

A.用痘苗加帽酶一步合成加帽的RNA效率低

根据制造商对相应反应的建议，如关于1.7kb fluc转录物(SEQ ID NO:18)的转录和加帽所指示的，使用5U/μl的T7 RNA聚合酶(新英格兰生物实验室；目录号M0251)、Hi-T7RNA聚合酶(新英格兰生物实验室；目录号M0658)、1U/μl的痘苗加帽酶(新英格兰生物实验室；目录号M2080)和5U/μl的痘苗mRNA帽2’O甲基转移酶(新英格兰生物实验室；目录号M0366)。当使用T7 RNA聚合酶时，反应包含1×T7 RNA聚合酶缓冲剂(40mM Tris-HCl,pH7.9,10mM NaCl,1mM DTT,2mM亚精胺)，或当使用Hi-T7 RNA聚合酶时，反应包含1×Hi-T7RNA聚合酶缓冲剂(40mM Tris-HCl,pH 7.9,60mM NaCl,1mM DTT,2mM亚精胺)。用19mMMgCl₂和ATP、UTP、GTP、CTP各自5mM以及0.5mM SAM来补充反应。在37℃下使反应进行1小时，这是T7 RNA聚合酶和痘苗加帽酶的推荐反应温度和持续时间。

为了评估体外转录的得率，在温育1小时后，对于各反应而言，将1μL反应混合物添加到含有1×DNase I反应缓冲剂(10mM Tris-HCl,pH 7.6,2.5mM MgCl₂,0.5mM CaCl₂)和0.5U/μL DNase I(新英格兰生物实验室)的4μL溶液中并在37℃下温育30分钟。然后根据制造商的说明，使用量子比特RNA宽范围试剂盒(赛默飞)分析DNase I反应的总RNA浓度。为了验证转录物的大小和完整性，使用2％的E-Gel(赛默飞)，利用Typhoon RGB扫描仪(GE医疗)拍摄图像来分析DNase I反应。结果在图14中显示为转录输出。

为了分析RNA加帽的程度，通过RNaseH切割，随后进行完整的LC/MS分析，对一步加帽的RNA合成反应进行分析。简而言之，在2.5μM的目标寡聚物(TO-1)(由5’脱氧核苷酸和3’核糖核苷酸组成)和TEG-脱硫生物素基团(SEQ ID NO:19)的存在下，通过在80℃下加热30s使一步加帽的RNA合成反应停止。以0.1℃/s的速率将反应冷却至25℃。然后通过在37℃下与终浓度为0.5U/μL的热稳定RNaseH(新英格兰生物实验室；目录号M0523)温育1h，对反应进行RNaseH切割。为了促进使用毛细管电泳对5’基团进行分析，向RNaseH切割片段的3’端添加FAM标记的核苷酸。简而言之，收回5μL的RNaseH反应并添加到含有2×NEBuffer 2、0.5mM dATP、0.05mM FAM-12-dCTP(Perkin Elmer)和0.25U/μL DNA聚合酶I大(Klenow(克列诺))片段(新英格兰生物实验室)的5μL溶液中。在37℃下将反应温育1小时。在某些情况下，在尿素PAGE上分析一小部分克列诺反应以验证加帽的成功性。简而言之，收回2μL的克列诺反应并将其添加到8μL的2×RNA荷载染料(新英格兰生物实验室)中。然后通过尿素-15％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析混合物。凝胶图像通过Typhoon RGB扫描仪(GE医疗)使用Cy2通道获取。

为了使用毛细管电泳或质谱法分析偶联的转录/加帽反应产物的5’基团状态，然后通过使用

XP珠(赛默飞)的尺寸选择，并且随后使用链霉亲和素磁珠进行选择来纯化克列诺(Klenow)反应产物(RNase H-切割产物仍然退火到脱硫生物素化的(desthiobiotinylated)目标寡聚物)。简而言之，将45μL无核酸酶的水添加到5μL RNaseH切割反应中，然后将该切割反应添加到100μL

样品纯化珠(新英格兰生物实验室)中并在室温下温育5分钟。然后将珠置于磁铁旁于室温下2分钟。收回澄清的上清液并将其添加到得自100μL珠悬浮液的预清理的

样品纯化珠中。在室温下温育5min后，然后将珠置于磁铁旁于室温下2分钟。将澄清的上清液添加到得自50μL

MyOne链霉亲和素C1(赛默飞)的预清理的珠中。在用50μL低盐洗涤缓冲剂(5mM Tris,pH 7.5,0.5mMEDTA,60mM NaCl)洗涤4次后，通过在10μL无核酸酶的水中温育澄清后的珠来洗脱结合的RNA。然后使用

120LIZ染料尺寸标准(应用生物系统)在应用生物系统(AppliedBiosystems)3130xl基因分析仪(16毛细管阵列)或应用生物系统3730xl基因分析仪(96毛细管阵列)上通过毛细管电泳分析洗脱的RNA。使用PeakScanner软件(赛默飞世尔科技)和内部软件套件(in-house software suite)分析反应产物。与m7Gppp-、未甲基化的Gppp-、未加帽的pp-和ppp-RNaseH切割的转录物对应的峰面积被定量并用于计算加帽的RNA合成反应中ppp-、pp-、Gppp-和m7Gppp-转录物的分数。

为了使用质谱法测定m7GpppGm-(帽-1)、m7G-(帽-0)、非甲基-G-加帽的和未加帽的RNA的相对量，利用由外承包商Novatia LLC(纽镇,宾夕法尼亚州)或内部设施进行的LC/MS测定相关种属的完整质量。RNA加帽的程度通过相关RNase H切割的产物的质量强度的比来评估。

图14显示了利用当前商业可获得的反应条件的一步转录的结果。将条1和条2进行比较，VCE的存在未显著影响T7 RNA聚合酶的转录输出，但并未生成可检测的m7GpppG-(帽-0)转录物。检测到一小部分(5.4％)未甲基化-G加帽的RNA——这是不期望的加帽反应中间体。此外，约50％的转录物含有5’二磷酸基团——另一种加帽反应中间体。如条3所示，当痘苗帽2’O甲基转移酶被包括在反应中时，转录输出未受显著影响，并且未检测到m7GpppGm-(帽-1)转录物。大约50％的转录物具有5’二磷酸基团，并且约15％的转录物具有非甲基-G加帽的中间体。当用Hi-T7 RNA聚合酶代替T7 RNA聚合酶时，观察到类似于T7 RNA聚合酶反应的结果——VCE的存在对Hi-T7 RNA聚合酶的转录没有显著影响，但并未生成可检测水平的帽-0转录物。在反应中加入痘苗帽-2’O甲基转移酶不产生任何帽-1转录物。从这些结果来看，作为目前体外mRNA合成(即RNA合成后进行mRNA加帽)的标准的酶试剂和反应条件不支持在单个反应(即一步加帽的RNA合成)中体外产生加帽的mRNA。

B.Faustovirus RNA加帽酶H3C2在体外一步反应中有效地对转录物加帽

由于实施例7A的试剂和条件在体外一步反应中对于产生加帽的转录物是无效的，因此测试了新的酶和反应条件对体外一步加帽的RNA合成进行合成的能力。图13显示了在37℃或45℃下使用高浓度H3C2加帽酶的一步加帽的RNA合成的结果。

在37℃下，0.5μM的H3C2加帽酶生成了通过毛细管电泳测量的12％的m7Gppp加帽的转录物和高达24.1％的未甲基化-G加帽的转录物。另一方面，在45℃下，高达61％的转录物具有m7Gppp-帽，而只有1.4％的转录物具有未甲基化-G帽。在这两种温度下，转录输出是不含H3C2加帽酶的转录输出的50-60％。因此，增加H3C2浓度和反应温度提高了使用T7 RNA聚合酶和H3C2RNA加帽酶在一步加帽的RNA合成中帽-0转录产生的得率。

进一步扩大酶试剂和反应温度的范围的影响通过使用T7 RNA聚合酶、Hi-T7 RNA聚合酶、VCE、H3C2和痘苗帽2’O甲基转移酶的不同组合，在45℃和50℃帽-0下进行一步加帽的RNA合成来测试。具体地，在5U/μL痘苗mRNA帽2’O甲基转移酶存在或不存在的情况下，使用0.5μM VCE或H3C2加帽酶结合5U/μL T7 RNA聚合酶或Hi-T7 RNA聚合酶如所示在其各自的反应缓冲剂中，如实施例7A中描述进行一步加帽的RNA合成反应。在45或50℃下使反应进行1小时。

图14总结了这次扩大测量的结果。在条1-5中，使用T7 RNA聚合酶在45℃下进行加帽的RNA合成反应。在H3C2加帽酶的存在下，84％的转录物被m7Gppp加帽(帽-0)，而8％的转录物被未甲基化-G加帽(条2)。在H3C2和帽2’O甲基转移酶存在的情况下，87％的转录物具有m7GpppGm帽(帽-1)，6％的转录物具有未甲基化-G帽，并且未检测到帽-0(条3)。当使用VCE时，76％的转录物具有帽-0结构，24％的转录物具有未甲基化-G帽结构(条4)。在VCE和帽2’O甲基转移酶两者都存在的情况下，55％的转录物具有帽-1结构，36％的转录物具有帽-0结构，并且8％的转录物具有未甲基化-G帽结构。在45℃下，当H3C2或VCE存在于反应中时，RNA得率未受到显著影响。然而，当存在帽2’O甲基转移酶和任一种加帽酶时，RNA得率从0.14μg/μL降低至0.09μg/μL。在45℃下使用Hi-T7 RNA聚合酶的加帽的RNA合成反应中(条6-10)，与使用T7 RNA聚合酶的反应(条1-5)相比，更小部分的转录物被加帽。H3C2加帽酶和VCE分别生成45％(条7)和50％的帽-0转录物(条9)。H3C2结合帽2’O甲基转移酶生成44％的帽-1转录物、39％的未甲基化-G加帽的转录物和不可检测到的帽-0转录物(条8)。VCE结合帽2’O甲基转移酶生成19％的帽-1转录物、22％的帽-0转录物和42％的未甲基化-G加帽的转录物(条10)。有趣的是，在45℃下使用Hi-T7 RNA聚合酶进行的反应的转录输出在加帽酶或帽2’O甲基转移酶存在的情况下未受显著影响(条6-10)。当在50℃下使用Hi-T7 RNA聚合酶进行加帽的RNA合成反应时，H3C2加帽酶生成80％的帽-0转录物和20％的未甲基化-G加帽的转录物(条12)。在H3C2和帽2’O甲基转移酶两者都存在的情况下，71％的转录物含有帽-1结构，2％的转录物含有帽-0结构，并且26％的转录物含有未甲基化-G帽结构(条13)。当使用VCE时，55％的转录物具有未甲基化-G加帽的结构，并且未检测到帽-0转录物。当VCE和帽2’O甲基转移酶两者都存在时，23％的转录物具有帽-0结构，并且31％的转录物具有未甲基化-G帽结构。

总之，本实施例提供了一步反应条件，这些反应条件利用H3C2 RNA加帽酶结合T7RNA聚合酶或Hi-T7 RNA聚合酶以高达80％的效率生成体外帽-0RNA(表7)。该实施例还描述了可使用H3C2 RNA加帽酶、痘苗mRNA帽2’O甲基转移酶结合T7 RNA聚合酶或Hi-T7 RNA聚合酶以70-80％的效率生成帽-1RNA的一步反应条件(表8)。

表7

表8

实施例8：使用H3C2:T7 RNA聚合酶融合蛋白的一步帽-0RNA合成

制备融合构建体以产生由通过假定的柔性连接体序列(SEQ ID NO:20)连接的H3C2RNA加帽酶和T7 RNA聚合酶组成的蛋白质。在T7启动子或tac启动子的控制下，融合蛋白由DNA序列(SEQIDNO:21)编码，在大肠杆菌中表达，并用标准层析技术纯化。

在0.5μM H3C2:T7 RNA聚合酶融合物的存在下，在用19mM MgCl₂和ATP、UTP、GTP、CTP各5mM以及0.1mM SAM补充的1×T7 RNA聚合酶缓冲剂中，如实施例7中指示的对1.7kbfluc转录物进行一步加帽的RNA合成反应。为了比较，进行含有5U/μL T7 RNA聚合酶与0.5μM H3C2加帽酶或含有5U/μL T7 RNA聚合酶但不含0.5μM H3C2加帽酶的反应。在37或45℃下将反应进行1小时。如实施例7中指示的，测量并分析RNA得率和加帽与未加帽的转录的分数。

结果如图15中所示。当在37℃下进行反应时，H3C2:T7融合蛋白生成75％的m7Gppp加帽的(帽-0)转录物和20％的未甲基化-G加帽的转录物(条1)。在相同的条件下，单独的酶H3C2和T7 RNA聚合酶仅生成12％的帽-0转录物和27％的未甲基化-G加帽的转录物(条2)。转录输出从当仅存在T7 RNA聚合酶时(条3)的0.45μg/μL降低到当添加H3C2时的0.39μg/μL，并进一步降低到当使用H3C2:T7融合物进行转录时的0.19μg/μL。在45℃下，相比使用单独的酶时生成60％的帽-0和6％的非甲基-G加帽的转录物(条5)，H3C2:T7 RNA聚合酶融合物生成95％的帽-0转录物和5％的未甲基化-G加帽的转录物(条4)。与在37℃下进行的反应类似，转录输出从当仅存在T7 RNA聚合酶时(条6)的0.31μg/μL降低到当添加H3C2时的0.18μg/μL，或降低到当使用H3C2:T7融合物进行转录时的0.12μg/μL。

因此，在所描述的反应条件下，本实施例证明了使用H3C2:T7 RNA聚合酶融合蛋白的有效的(例如，高达98％)一步体外帽-0RNA合成。

实施例9：RNA加帽酶有效地对含有假尿苷的体外转录物加帽

在假尿苷三磷酸(Trilink生物技术)或未修饰的尿苷三磷酸(新英格兰生物实验室公司)的存在下，利用使用T7 RNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)的体外转录合成编码海萤属萤光素酶蛋白的约1800nt RNA，其具有120nt poly(A)尾(cluc/A120)。在10mL 1×RNA加帽缓冲剂(50mM Tris-HCl,5mM KCl,1mM MgCl₂,1mM DTT,pH8)中0.5mM GTP和0.1mM SAM的存在下，将500nM未修饰的或假尿苷cluc/A120转录物与100nM H3C2或VCE于37℃下温育30分钟。然后将被设计以引导RNase H切割出5’片段的目标寡聚物(TO)添加到各加帽反应中，以达到2.5μM的最终TO浓度。然后在80℃下将各反应加热30s以将TO退火到转录物并使加帽酶失活并缓慢冷却到室温。将热稳定RNaseH(新英格兰生物实验室公司)以0.5U/mL的终浓度添加到各反应中，并在37℃下温育1h。然后通过如实施例7中描述的完整的LC/MS纯化并分析反应产物。如图16中所示，VCE和H3C2对含有假尿苷的cluc/A120转录物分别m7Gppp加帽了68.4％或100％。值得注意的是，与尿苷对应物相比，这两种加帽酶对含有假尿苷的cluc/A120转录物加帽的分数更高。

实施例10：扩大的帽-1加帽和功能测定

总共250pmol(145μg)的约1800nt cluc/A120体外转录物在含有1×RNA加帽缓冲剂(50mM Tris-HCl,pH 8.0,5mM KCl,1mM MgCl₂,1mM DTT)、0.5mM GTP、0.1mM SAM、10U/μL痘苗帽2’O甲基转移酶(NEB M0366)和500nM H3C2的500μL反应中于45℃下被加帽1h。通过RNaseH/完整的LC/MS评估帽-1形成的效率，如实施例7中描述的。RNA用酸性苯酚和氯仿纯化，然后用乙醇沉淀，并在无核酸酶的水中再水合。用量子比特(Qubit)RNA(宽范围)试剂盒(赛默飞)估计RNA浓度。加帽的cluc/A120转录物的翻译效率被测量为来自用加帽的cluc/A120转录物相对于未加帽的cluc/A120转录物转染的HEK293细胞的相对萤光素酶活性。用脂质转染胺信使最大转染试剂(Lipofectamine MessengerMax transfection reagent)(赛默飞)将250ng纯化的cluc/A120转录物转染HEK293细胞。转染后4小时，使用

海萤属萤光素酶测定试剂盒(新英格兰生物实验室公司Ipswich)在10μL培养基上清液上测定萤光素酶活性。萤光是用伯托科技(Berthold technologies)的Centro LB960微板发光计测量的。如图17中所示，扩大加帽反应在含有rU和假尿苷的cluc/A120上分别实现了47.7％和54.8％的帽-1形成，与实施例5和图11中的结果一致。萤光素酶测定结果(三次重复)显示，含有rU和假尿苷的纯化加帽转录物的翻译效率表现出高萤光素酶活性(图18)，这表明在45℃下用H3C2加帽的RNA具有功能活性。应当注意的是，对诸如反应体积、酶和反应组分的浓度、反应时间和反应温度之类的反应条件的修改可提高大量RNA的帽-1形成效率和所得的帽-1RNA的翻译效率。

实施例11：采用多个温度步骤的单容器加帽的RNA合成

如实施例7中指示的，对1.7kb fluc转录物进行单容器加帽的RNA合成反应，即，将5U/ul的T7 RNA聚合酶(新英格兰生物实验室；目录号M0251)与或不与500nM痘苗加帽酶(新英格兰生物实验室；目录号M2080)或H3C2加帽酶在37℃下温育30分钟，然后在28℃、32℃、37℃、45℃、或50℃下再温育30分钟。该反应包含1×T7 RNA聚合酶缓冲剂(40mM Tris-HCl,pH 7.9,10mM NaCl,1mM DTT,2mM亚精胺)，并用19mM MgCl₂和ATP、UTP、GTP、CTP各5mM以及0.5mM SAM补充。如实施例7中描述的，通过DNase I/量子比特定量来分析转录输出。如实施例7中指示的，通过RNaseH切割，随后用FAM-dCTP的克列诺(Klenow)填充和尿素PAGE来评估反应的加帽效率。通过完整的质谱仪进一步分析所选择的反应。如图19中所示，对于VCE，m7Gppp形成效率在45℃的第二反应温度下达到峰值，而对于H3C2，m7Gppp形成效率在50℃的第二反应温度下达到峰值。另一方面，T7 RNAP转录输出在与VCE或H3C2配合时于45℃达到峰值，反映了处于测试温度的下端和上端(分别为28℃和50℃)的低转录活性。因此，在本实施例中，37℃30分钟，然后45℃30分钟的串联温度步骤产生了转录输出和加帽效率的最佳平衡。对诸如反应时间、反应温度和温度步骤数之类的反应条件的修改可进一步提高m7G加帽的转录物的转录得率和分数。

序列表

<110> 新英格兰生物实验室公司

<120> 酶促RNA加帽方法

<130> NEB-423

<150> 62/890,821

<151> 2019-08-23

<160> 21

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 844

<212> PRT

<213> 痘苗病毒

<220>

<221> 各式各样的_特征(misc_feature)

<223> FL VCE加帽酶；>YP_232988.1 mRNA加帽酶的大亚单位

<400> 1

Met Asp Ala Asn Val Val Ser Ser Ser Thr Ile Ala Thr Tyr Ile Asp

1 5 10 15

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20 25 30

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50 55 60

Arg Phe Thr Val Thr Asn Lys Glu Gly Val Lys Ile Arg Thr Lys Ile

65 70 75 80

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Asn Arg Leu His Lys Glu Cys Leu Leu Arg Leu Ser Thr Glu Glu Arg

115 120 125

His Ile Phe Leu Asp Tyr Lys Lys Tyr Gly Ser Ser Ile Arg Leu Glu

130 135 140

Leu Val Asn Leu Ile Gln Ala Lys Thr Lys Asn Phe Thr Ile Asp Phe

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Lys Leu Lys Tyr Phe Leu Gly Ser Gly Ala Gln Ser Lys Ser Ser Leu

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Leu His Ala Ile Asn His Pro Lys Ser Arg Pro Asn Thr Ser Leu Glu

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Ile Glu Phe Thr Pro Arg Asp Asn Glu Thr Val Pro Tyr Asp Glu Leu

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210 215 220

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Tyr Leu Pro Lys Gln Pro Glu Gly Val Ile Leu Phe Tyr Ser Lys Gly

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Pro Lys Ser Asn Ile Asp Phe Lys Ile Lys Lys Glu Asn Thr Ile Asp

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Thr Met Lys Tyr Ile Asn Ser Glu Asp Tyr Tyr Gly Asn Gln His Asn

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<210> 2

<211> 60

<212> PRT

<213> 浮病病毒（Faustovirus）

<220>

<221> 各式各样的_特征（MISC_FEATURE）

<223> Fausto_CR_01

<400> 2

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Val Val Asp Ile Phe Ser Tyr Lys Val Ala Val Ser

50 55 60

<210> 3

<211> 111

<212> PRT

<213> 浮病病毒（Faustovirus）

<220>

<221> 各式各样的_特征（misc_feature）

<223> Fausto_CR_03

<400> 3

Gly Phe Tyr Gly Asn Asn Tyr Lys Ile Ala Ser Asp Ile Tyr Leu Asn

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Tyr Ile Asp Val Phe Asn Phe Asp Asp Leu Trp Lys Tyr Asn Pro Gly

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Tyr Lys Ala Glu Cys Val Glu Asn Leu Leu Ala Ile Asp Ile Asp Pro

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<210> 4

<211> 60

<212> PRT

<213> 浮病病毒(Faustovirus)

<220>

<221> 各式各样的_特征(MISC_FEATURE)

<223> Fausto_CR_05

<400> 4

Lys Tyr Ser Ile Lys Arg Leu Tyr Asp Ser Asp Lys Leu Thr Lys Thr

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Gly Gln Lys Ile Ala Val Leu Leu Pro Met Ser Gly Glu Met Lys Glu

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35 40 45

Gly Leu Asp Leu Val Glu Ser Ala Asn Phe Ser Val

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<210> 5

<211> 67

<212> PRT

<213> 拟菌病毒(Mimivirus)

<220>

<221> 各式各样的_特征(MISC_FEATURE)

<223> 5: mimi_CR_03

<400> 5

Ile Asn Asp Asn Thr Val Val Glu Phe Ile Phe Asp Asn Phe Lys Ile

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<210> 6

<211> 111

<212> PRT

<213> 拟菌病毒

<220>

<221> 各式各样的_特征

<223> mimi_CR_04

<400> 6

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1 5 10 15

Asn Phe Ile Lys Ser Asn Met Ile Thr Thr Tyr Cys Lys Asp Gly Asp

20 25 30

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100 105 110

<210> 7

<211> 873

<212> PRT

<213> 浮病病毒(Faustovirus)

<220>

<221> 各式各样的_特征

<223> 浮病病毒D5b RNA加帽酶 Genbank登录号AMN83561

<400> 7

Met Ala Lys Arg Leu Gln Arg Cys Gln Asp Val Asn Gln Val Cys Glu

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755 760 765

Val Asn Ser Pro Asp Ser Thr Val Pro Lys Tyr Ser Ile Arg Arg Leu

770 775 780

Tyr Asp Ser Asp Lys Leu Thr Lys Thr Gly Gln Gln Ile Glu Val Leu

785 790 795 800

Leu Pro Met Ser Gly Glu Met Lys Ala Glu Pro Leu Cys Asn Ile Lys

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Asn Ile Ile Ser Met Ala Arg Lys Met Gly Leu Asp Leu Val Glu Ser

820 825 830

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<210> 8

<211> 890

<212> PRT

<213> 浮病病毒(Faustovirus)

<220>

<221> 各式各样的_特征

<223> 浮病病毒E12 RNA加帽酶;Genbank登录号

AIB52055

<400> 8

Met Arg Arg Val Phe Asn Ser Ala Lys Lys Gln Gln Arg Cys Asp Ser

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Ile Arg Leu Ser Cys Asp Thr Leu Ile Pro Asp Trp Arg Ile Asp Leu

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Thr Ala Val Lys Val Ala Asp Leu Gly Lys Ile Ala Gln His Thr Ser

145 150 155 160

Thr Val Val Leu Gln Thr Phe Pro Glu Asn Leu Leu Arg Met Lys Gly

165 170 175

Ala Glu Val Ala Ala Leu Ala Thr Asn Ser Tyr Glu Leu Glu Leu Glu

180 185 190

Tyr Ile Gly Lys Ser Ala Ala Ser Lys Glu Lys Val Leu Ala Ala Ala

195 200 205

Glu Tyr Ala Met Glu Leu Leu Thr Asn Ser Arg Asn Ala Ile Ser Pro

210 215 220

Ala Ala Ala Thr Leu Gly Glu Ser Val Ser Asp Ile Cys Arg Ile Ala

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Thr Asp Gly Val Arg Ala Leu Val Leu Cys Glu Asn Gly Val Ala Lys

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<213> 浮病病毒(Faustovirus)

<220>

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885 890

<210> 10

<211> 901

<212> PRT

<213> 浮病病毒（Faustovirus）

<220>

<221> 各式各样的_特征

<223> 浮病病毒ST1 RNA加帽酶；Genbank登录号

SMH63629

<400> 10

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<213> 多噬棘状阿米巴

<220>

<221> 各式各样的_特征

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Asn Lys Ile Tyr Ser Asp Thr Asp Lys Val Gly Leu Gly Met Ala Ile

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Tyr Lys Asn Tyr Phe Lys Lys Thr Tyr Asn Glu Tyr Gly Met Thr Asp

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Val Ser Ser Lys Lys His Ser Glu Ile Arg Glu Phe Tyr Leu Ser Leu

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<211> 1162

<212> PRT

<213> 多噬棘状阿米巴

<220>

<221> 各式各样的_特征

<223> 姆姆病毒（moumouvirus）RNA加帽酶；Genbank登录号

YP_007354410

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Arg Glu Lys Ile Leu Tyr Arg Tyr Lys Asn Arg Tyr Ser Phe Ile Ile

165 170 175

Asp Asp Ile Thr Arg Ile Asp Ile Thr Asp Val Lys Glu Thr Pro Asn

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Ile Trp Glu Leu Ser Arg Lys Ile Ser Asn Tyr Glu Ile Glu Leu Glu

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Phe Thr Asn Asn Lys Ile Lys Ser Asn Gln Val Phe Glu Lys Ile Phe

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245 250 255

Ser Ser Asn His Leu Asp Ser Arg Asn Val Val Ser Ile Glu Thr Gln

260 265 270

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275 280 285

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Leu Ser Thr Asn Leu Thr Val Lys Lys Val Asn Ile Pro Val Leu Gln

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Lys Asp Phe Gln Asn Met Leu Leu Asp Gly Glu Leu Ile Asp Ile Asp

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Gly Lys Glu Leu Phe Met Val Phe Asp Val Val Tyr His Asn Gly Ile

340 345 350

Asp Tyr Arg Tyr Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Thr His Arg Ile Ile Ile

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660 665 670

Tyr Gln Lys Asn Thr Ser Asn Ala Ile Gly Met Arg Ala Phe Asn Asn

675 680 685

Phe Ile Lys Ser Asn Met Ile Thr Thr Tyr Cys Lys Asp Lys Asp Ser

690 695 700

Val Leu Asp Ile Gly Cys Gly Arg Gly Gly Asp Leu Ile Lys Phe Ile

705 710 715 720

His Ala Asn Ile Arg Glu Tyr Val Gly Leu Asp Ile Asp Asn Asn Gly

725 730 735

Leu Tyr Val Ile Asn Asp Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Lys Asn Leu Lys

740 745 750

Lys Thr Asn Lys Asn Val Pro Pro Met Thr Phe Ile Asn Ala Asp Ala

755 760 765

Arg Gly Leu Phe Asn Val Glu Ala Gln Glu Lys Ile Leu Pro Asn Met

770 775 780

Ser Glu Ser Asn Lys Lys Leu Ile Asn Asn Tyr Leu Ser Ser Asn Lys

785 790 795 800

Lys Tyr Asp Ala Ile Asn Cys Gln Phe Thr Ile His Tyr Tyr Leu Ser

805 810 815

Asp Asp Ile Ser Trp Asn Asn Phe Cys Gln Asn Ile Asn Asn His Ile

820 825 830

Lys Asp Asn Gly Tyr Leu Leu Ile Thr Cys Phe Asp Gly Gln Leu Ile

835 840 845

Tyr Asp Lys Leu Lys Gly Lys Gln Lys Tyr Ser Ser Ser Tyr Thr Asp

850 855 860

Asn Phe Gly Lys Lys Asn Ile Phe Phe Glu Ile Asn Lys Ile Tyr Ser

865 870 875 880

Asp Glu Glu Ile Lys Pro Val Gly Met Ala Ile Asp Ile Tyr Asn Ser

885 890 895

Leu Ile Ser Asn Pro Gly Thr Tyr Gln Arg Glu Tyr Leu Val Phe Pro

900 905 910

Asp Phe Leu Gln Lys Ser Leu Lys Asp Gln Cys Gly Leu Glu Leu Val

915 920 925

Glu Thr Asp Met Phe Tyr Asn Ile Phe Asn Leu Tyr Arg Asn Tyr Phe

930 935 940

Thr Ile Asn Asn Gly Thr Phe Ser Thr Gly Glu Ile Ser Ser Lys Arg

945 950 955 960

Tyr Asn Glu Ile Lys Asp Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Gly Lys Ser Ser

965 970 975

Ser Val Thr Glu Ser Asp Ile Ala Phe Ala Ser Phe Lys Leu Ala Met

980 985 990

Leu Asn Arg Tyr Tyr Ile Phe Lys Lys Lys Thr Val Ile Asn Ile Thr

995 1000 1005

Glu Pro Ser His Ile Val Ser Gly Val Asn Lys Lys Thr Asp Leu

1010 1015 1020

Gly Lys Val Leu Met Pro Tyr Phe Ile Thr Asn Asn Met Ile Ile

1025 1030 1035

Asp Tyr Ser Leu Gly Asn Asn Asp Val Asn Lys Ile Tyr His Phe

1040 1045 1050

Ile Arg Lys Lys Tyr Ser Pro Ile Lys Pro Ser Val Tyr Leu Val

1055 1060 1065

Arg His Asn Ile Ile Asp Asn Pro Met Asp Gly Ile Thr Phe Ser

1070 1075 1080

Arg Asn Lys Leu Glu Phe Ile Lys Ile Lys Asn Gly Thr Asp Pro

1085 1090 1095

Lys Val Leu Leu Ile Tyr Lys Ser Pro Glu Lys Ile Phe Tyr Pro

1100 1105 1110

Phe Tyr Tyr Gln Arg Leu Glu Asn His Asp Tyr Ser Glu Asp Tyr

1115 1120 1125

Leu Lys Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Asp Asn Gly Thr Tyr Leu Leu

1130 1135 1140

Asp Ser Asn Lys Ile Ile Asn Asp Leu Asn Met Leu Val Asn Ile

1145 1150 1155

Ser Gly Lys Val

1160

<210> 13

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> 各式各样的_特征

<223> RNA1

<400> 13

guagaacuuc gucgaguacg cucaa 25

<210> 14

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> 各式各样的_特征

<223> RNA2

<400> 14

gcaagucuuc gucgaguacu ugc 23

<210> 15

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> 各式各样的_特征

<223> RNA3

<400> 15

ggcaagucuu cgucgaguac uugc 24

<210> 16

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> 各式各样的_特征

<223> RNA4

<400> 16

gggcaagucu ucgucgagua cuugc 25

<210> 17

<211> 150

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 17

gggagucuuc gccgagaggg ccaucgccag uugccgcaac cugugggaau uucucuucca 60

guuuauccgg augcucaacg gugacuuuaa uuccgguauc uuucucgaau uucuuaccga 120

cuucagcgag cucgacaaug cucuucccua 150

<210> 18

<211> 1753

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> 各式各样的_特征

<223> fluc转录物的序列

<400> 18

gggucuagaa auaauuuugu uuaacuuuaa gaaggagaua uaaccaugaa aaucgaagaa 60

gguaaagguc accaucacca ucaccacgga uccauggaag acgccaaaaa cauaaagaaa 120

ggcccggcgc cauucuaucc ucuagaggau ggaaccgcug gagagcaacu gcauaaggcu 180

augaagagau acgcccuggu uccuggaaca auugcuuuua cagaugcaca uaucgaggug 240

aacaucacgu acgcggaaua cuucgaaaug uccguucggu uggcagaagc uaugaaacga 300

uaugggcuga auacaaauca cagaaucguc guaugcagug aaaacucucu ucaauucuuu 360

augccggugu ugggcgcguu auuuaucgga guugcaguug cgcccgcgaa cgacauuuau 420

aaugaacgug aauugcucaa caguaugaac auuucgcagc cuaccguagu guuuguuucc 480

aaaaaggggu ugcaaaaaau uuugaacgug caaaaaaaau uaccaauaau ccagaaaauu 540

auuaucaugg auucuaaaac ggauuaccag ggauuucagu cgauguacac guucgucaca 600

ucucaucuac cucccgguuu uaaugaauac gauuuuguac cagaguccuu ugaucgugac 660

aaaacaauug cacugauaau gaauuccucu ggaucuacug gguuaccuaa ggguguggcc 720

cuuccgcaua gaacugccug cgucagauuc ucgcaugcca gagauccuau uuuuggcaau 780

caaaucauuc cggauacugc gauuuuaagu guuguuccau uccaucacgg uuuuggaaug 840

uuuacuacac ucggauauuu gauaugugga uuucgagucg ucuuaaugua uagauuugaa 900

gaagagcugu uuuuacgauc ccuucaggau uacaaaauuc aaagugcguu gcuaguacca 960

acccuauuuu cauucuucgc caaaagcacu cugauugaca aauacgauuu aucuaauuua 1020

cacgaaauug cuucuggggg cgcaccucuu ucgaaagaag ucggggaagc gguugcaaaa 1080

cgcuuccauc uuccagggau acgacaagga uaugggcuca cugagacuac aucagcuauu 1140

cugauuacac ccgaggggga ugauaaaccg ggcgcggucg guaaaguugu uccauuuuuu 1200

gaagcgaagg uuguggaucu ggauaccggg aaaacgcugg gcguuaauca gagaggcgaa 1260

uuauguguca gaggaccuau gauuaugucc gguuauguaa acaauccgga agcgaccaac 1320

gccuugauug acaaggaugg auggcuacau ucuggagaca uagcuuacug ggacgaagac 1380

gaacacuucu ucauaguuga ccgcuugaag ucuuuaauua aauacaaagg auaucaggug 1440

gcccccgcug aauuggaauc gauauuguua caacacccca acaucuucga cgcgggcgug 1500

gcaggucuuc ccgacgauga cgccggugaa cuucccgccg ccguuguugu uuuggagcac 1560

ggaaagacga ugacggaaaa agagaucgug gauuacgucg ccagucaagu aacaaccgcg 1620

aaaaaguugc gcggaggagu uguguuugug gacgaaguac cgaaaggucu uaccggaaaa 1680

cucgacgcaa gaaaaaucag agagauccuc auaaaggcca agaagggcgg aaaguccaaa 1740

cucgaguaag guu 1753

<210> 19

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> 各式各样的_特征

<223> 用于fluc转录物的目标寡聚物

<220>

<221> 各式各样的_特征

<222> (44)..(44)

<223> C是TEG-脱硫生物素

<400> 19

gttaaarcra rarararuru rarurururc rurargrarc rcrc 44

<210> 20

<211> 1778

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> 各式各样的_特征

<223> H3C2:T7 RNA聚合酶融合蛋白的氨基酸序列

<400> 20

Met Lys Ile Glu Glu His His His His His His His His Gly Ala Ser

1 5 10 15

Thr Ala Lys Arg Leu Gln Arg Cys Gln Asp Val Asn Gln Val Cys Glu

20 25 30

Ile Tyr Asn Ser Lys Gly Gly Ile Gly Glu Leu Glu Leu Arg Phe Asp

35 40 45

Lys Leu Pro Gln Asn Leu Phe Ala Gly Val Phe Asp Lys Leu Lys Pro

50 55 60

Asp Gly Glu Ile Gln Thr Thr Met Arg Val Ser Asn Arg Asp Gly Val

65 70 75 80

Ala Arg Glu Ile Thr Phe Gly Gly Gly Val Lys Thr Asn Glu Ile Phe

85 90 95

Val Lys Lys Gln Asn Ile Cys Val Phe Asp Val Val Asp Ile Phe Ser

100 105 110

Tyr Lys Val Ala Val Ser Thr Glu Glu Thr Val Val Glu Lys Pro Thr

115 120 125

Met Glu Thr Thr Ala Gly Val Arg Phe Lys Ile Arg Leu Ser Val Glu

130 135 140

Asp Val Val Lys Asp Trp Arg Ile Asp Leu Thr Ala Val Lys Thr Ala

145 150 155 160

Glu Leu Gly Lys Ile Ala Gln His Thr Ala Ser Ile Val Gln Arg Thr

165 170 175

Phe Pro Asp Asn Leu Leu Lys Leu Thr Gly Ala Glu Val Ala Lys Leu

180 185 190

Ala Ala Asp Ser Tyr Glu Leu Glu Leu Glu Tyr Thr Gly Lys Ser Pro

195 200 205

Ala Thr Asn Glu Lys Val Asn Val Ala Ala Lys Tyr Ala Val Glu Leu

210 215 220

Leu Ser Ser Val Arg Asn Ala Asn Ser Thr Ala Ala Ala Ser Phe Gly

225 230 235 240

Glu Ser Val Ser Asp Leu Cys Arg Val Ala Lys Ile Ile His Thr His

245 250 255

Glu Tyr Ala Asn Val Val Cys Arg Thr Pro Ser Phe Lys Met Leu Leu

260 265 270

Pro Gln Val Val Ser Leu Thr Lys Ser Ser Tyr Tyr Gly Gly Leu Tyr

275 280 285

Pro Pro Glu Asn Leu Trp Leu Ala Gly Lys Thr Asp Gly Val Arg Ala

290 295 300

Leu Val Val Cys Glu Asp Gly Val Ala Lys Val Ile Thr Ala Glu Ser

305 310 315 320

Val Asp Ile Thr His Gly Val Cys Ser Ala Thr Thr Ile Leu Asp Cys

325 330 335

Glu Leu Asn Val Asp Ala Lys Ile Leu Tyr Val Phe Asp Val Ile Ile

340 345 350

Ser Asn Asn Thr Gln Val Tyr Thr Gln Pro Phe Ser Thr Arg Ile Thr

355 360 365

Thr Asp Ile Ser Asp Ile Lys Ile Asp Gly Tyr Lys Ile Glu Met Lys

370 375 380

Pro Phe Val Lys Val Val Lys Ala Asp Glu Ala Thr Phe Lys Ser Ala

385 390 395 400

Tyr Lys Ala Pro His Asn Glu Gly Leu Ile Met Ile Glu Asp Gly Ala

405 410 415

Ala Tyr Ala Ala Thr Lys Thr Tyr Lys Trp Lys Pro Leu Ser His Asn

420 425 430

Thr Ile Asp Phe Leu Ile Lys Ala Cys Pro Lys Gln Leu Ile Asn Val

435 440 445

Asp Pro Tyr Lys Pro Arg Ala Gly Tyr Lys Leu Trp Leu Leu Phe Thr

450 455 460

Thr Ile Ser Leu Asp Gln Gln Arg Glu Leu Gly Ile Glu Phe Ile Pro

465 470 475 480

Ala Trp Lys Ile Leu Phe Thr Asp Ile Asn Met Phe Gly Ser Arg Val

485 490 495

Pro Ile Gln Phe Gln Pro Ala Ile Asn Pro Leu Ala Tyr Val Cys Tyr

500 505 510

Leu Pro Glu Asp Val Asn Val Asn Asp Gly Asp Ile Val Glu Met Arg

515 520 525

Ala Val Asp Gly Tyr Asp Thr Ile Pro Lys Trp Glu Leu Val Arg Ser

530 535 540

Arg Asn Asp Arg Lys Asn Glu Pro Gly Phe Tyr Gly Asn Asn Tyr Lys

545 550 555 560

Ile Ala Ser Asp Ile Tyr Leu Asn Tyr Ile Asp Val Phe His Phe Glu

565 570 575

Asp Leu Tyr Lys Tyr Asn Pro Gly Tyr Phe Glu Lys Asn Lys Ser Asp

580 585 590

Ile Tyr Val Ala Pro Asn Lys Tyr Arg Arg Tyr Leu Ile Lys Ser Leu

595 600 605

Phe Gly Arg Tyr Leu Arg Asp Ala Lys Trp Val Ile Asp Ala Ala Ala

610 615 620

Gly Arg Gly Ala Asp Leu His Leu Tyr Lys Ala Glu Cys Val Glu His

625 630 635 640

Leu Leu Ala Ile Asp Ile Asp Pro Thr Ala Ile Ser Glu Leu Val Arg

645 650 655

Arg Arg Asn Glu Ile Thr Gly Tyr Asn Lys Ser His Arg Gly Gly Arg

660 665 670

Asn Met His Ser His Arg Gly Gln Ser His Cys Ala Lys Ser Thr Ser

675 680 685

Leu His Ala Leu Val Ala Asp Leu Arg Glu Asn Pro Asp Val Leu Ile

690 695 700

Pro Lys Ile Ile Gln Ser Arg Pro His Glu Arg Cys Tyr Asp Ala Ile

705 710 715 720

Val Ile Asn Phe Ala Ile His Tyr Leu Cys Asp Thr Asp Glu His Ile

725 730 735

Arg Asp Phe Leu Ile Thr Val Ser Arg Leu Leu Ala Pro Asn Gly Val

740 745 750

Phe Ile Phe Thr Thr Met Asp Gly Glu Ser Ile Val Lys Leu Leu Ala

755 760 765

Asp His Lys Val Arg Pro Gly Glu Ala Trp Thr Ile His Thr Gly Asp

770 775 780

Val Asn Ser Pro Asp Ser Thr Val Pro Lys Tyr Ser Ile Arg Arg Leu

785 790 795 800

Tyr Asp Ser Asp Lys Leu Thr Lys Thr Gly Gln Gln Ile Glu Val Leu

805 810 815

Leu Pro Met Ser Gly Glu Met Lys Ala Glu Pro Leu Cys Asn Ile Lys

820 825 830

Asn Ile Ile Ser Met Ala Arg Lys Met Gly Leu Asp Leu Val Glu Ser

835 840 845

Ala Asn Phe Ser Val Leu Tyr Glu Ala Tyr Ala Arg Asp Tyr Pro Asp

850 855 860

Ile Tyr Ala Arg Met Thr Pro Asp Asp Lys Leu Tyr Asn Asp Leu His

865 870 875 880

Thr Tyr Ala Val Phe Lys Arg Lys Lys Gly Ala Ser Thr Ala Ser Thr

885 890 895

Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu Ala

900 905 910

Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu Ala

915 920 925

Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu Ala

930 935 940

Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val Ala

945 950 955 960

Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys Met

965 970 975

Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg Gly

980 985 990

Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu Ala

995 1000 1005

Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser

1010 1015 1020

Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg

1025 1030 1035

Ala Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu

1040 1045 1050

Ala Lys His Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg

1055 1060 1065

Val Gly His Val Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala

1070 1075 1080

Asp Met Leu Ser Lys Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser

1085 1090 1095

Trp His Lys Glu Asp Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu

1100 1105 1110

Met Leu Ile Glu Ser Thr Gly Met Val Ser Leu His Arg Gln Asn

1115 1120 1125

Ala Gly Val Val Gly Gln Asp Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro

1130 1135 1140

Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gly

1145 1150 1155

Ile Ser Pro Met Phe Gln Pro Cys Val Val Pro Pro Lys Pro Trp

1160 1165 1170

Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala Asn Gly Arg Arg Pro

1175 1180 1185

Leu Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala Leu Met Arg Tyr

1190 1195 1200

Glu Asp Val Tyr Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile Asn Ile Ala

1205 1210 1215

Gln Asn Thr Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala Val Ala

1220 1225 1230

Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile Pro

1235 1240 1245

Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp

1250 1255 1260

Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala

1265 1270 1275

Val Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu

1280 1285 1290

Glu Phe Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala

1295 1300 1305

Ile Trp Phe Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala

1310 1315 1320

Val Ser Met Phe Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu

1325 1330 1335

Leu Thr Leu Ala Lys Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr

1340 1345 1350

Trp Leu Lys Ile His Gly Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val

1355 1360 1365

Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn

1370 1375 1380

Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro Leu Glu Asn Thr Trp Trp Ala

1385 1390 1395

Glu Gln Asp Ser Pro Phe Cys Phe Leu Ala Phe Cys Phe Glu Tyr

1400 1405 1410

Ala Gly Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr Asn Cys Ser Leu Pro

1415 1420 1425

Leu Ala Phe Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln His Phe Ser Ala

1430 1435 1440

Met Leu Arg Asp Glu Val Gly Gly Arg Ala Val Asn Leu Leu Pro

1445 1450 1455

Ser Glu Thr Val Gln Asp Ile Tyr Gly Ile Val Ala Lys Lys Val

1460 1465 1470

Asn Glu Ile Leu Gln Ala Asp Ala Ile Asn Gly Thr Asp Asn Glu

1475 1480 1485

Val Val Thr Val Thr Asp Glu Asn Thr Gly Glu Ile Ser Glu Lys

1490 1495 1500

Val Lys Leu Gly Thr Lys Ala Leu Ala Gly Gln Trp Leu Ala Tyr

1505 1510 1515

Gly Val Thr Arg Ser Val Thr Lys Arg Ser Val Met Thr Leu Ala

1520 1525 1530

Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gln Gln Val Leu Glu Asp

1535 1540 1545

Thr Ile Gln Pro Ala Ile Asp Ser Gly Lys Gly Leu Met Phe Thr

1550 1555 1560

Gln Pro Asn Gln Ala Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu Ile Trp Glu

1565 1570 1575

Ser Val Ser Val Thr Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met Asn Trp

1580 1585 1590

Leu Lys Ser Ala Ala Lys Leu Leu Ala Ala Glu Val Lys Asp Lys

1595 1600 1605

Lys Thr Gly Glu Ile Leu Arg Lys Arg Cys Ala Val His Trp Val

1610 1615 1620

Thr Pro Asp Gly Phe Pro Val Trp Gln Glu Tyr Lys Lys Pro Ile

1625 1630 1635

Gln Thr Arg Leu Asn Leu Met Phe Leu Gly Gln Phe Arg Leu Gln

1640 1645 1650

Pro Thr Ile Asn Thr Asn Lys Asp Ser Glu Ile Asp Ala His Lys

1655 1660 1665

Gln Glu Ser Gly Ile Ala Pro Asn Phe Val His Ser Gln Asp Gly

1670 1675 1680

Ser His Leu Arg Lys Thr Val Val Trp Ala His Glu Lys Tyr Gly

1685 1690 1695

Ile Glu Ser Phe Ala Leu Ile His Asp Ser Phe Gly Thr Ile Pro

1700 1705 1710

Ala Asp Ala Ala Asn Leu Phe Lys Ala Val Arg Glu Thr Met Val

1715 1720 1725

Asp Thr Tyr Glu Ser Cys Asp Val Leu Ala Asp Phe Tyr Asp Gln

1730 1735 1740

Phe Ala Asp Gln Leu His Glu Ser Gln Leu Asp Lys Met Pro Ala

1745 1750 1755

Leu Pro Ala Lys Gly Asn Leu Asn Leu Arg Asp Ile Leu Glu Ser

1760 1765 1770

Asp Phe Ala Phe Ala

1775

<210> 21

<211> 5337

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> 各式各样的_特征

<223> H3C2:T7 RNA聚合酶融合蛋白的核苷酸序列

<400> 21

atgaagattg aggagcatca tcatcatcat catcatcatg gcgcgagcac cgcgaagcgt 60

ctgcagcgtt gccaggacgt gaaccaagtg tgcgaaatct acaacagcaa gggtggcatt 120

ggcgagctgg aactgcgttt cgataaactg ccgcagaacc tgttcgcggg cgtttttgat 180

aagctgaaac cggacggcga gattcaaacc accatgcgtg ttagcaaccg tgacggtgtg 240

gcgcgtgaaa tcacctttgg tggcggtgtt aagaccaacg agatcttcgt gaagaaacag 300

aacatttgcg ttttcgacgt ggttgatatc tttagctaca aggtggcggt tagcaccgag 360

gaaaccgtgg ttgaaaagcc gaccatggag accaccgcgg gcgtgcgttt taaaattcgt 420

ctgagcgttg aagacgtggt taaggattgg cgtatcgatc tgaccgcggt gaagaccgcg 480

gagctgggta aaatcgcgca gcacaccgcg agcattgttc aacgtacctt cccggataac 540

ctgctgaagc tgaccggtgc ggaagtggcg aaactggcgg cggacagcta cgagctggaa 600

ctggagtata ccggcaagag cccggcgacc aacgaaaagg tgaacgttgc ggcgaaatac 660

gcggttgagc tgctgagcag cgtgcgtaac gcgaacagca ccgcggcggc gagctttggt 720

gaaagcgtta gcgacctgtg ccgtgtggcg aaaatcattc acacccacga gtacgcgaac 780

gtggtttgcc gtaccccgag cttcaaaatg ctgctgccgc aggtggttag cctgaccaag 840

agcagctact atggcggtct gtatccgccg gaaaacctgt ggctggcggg caagaccgat 900

ggcgtgcgtg cgctggttgt gtgcgaagac ggcgtggcga aagttatcac cgcggagagc 960

gttgatatta cccacggtgt gtgcagcgcg accaccattc tggattgcga gctgaacgtt 1020

gacgcgaaga tcctgtacgt gtttgacgtt atcattagca acaacaccca ggtgtatacc 1080

caaccgttca gcacccgtat caccaccgac attagcgata tcaagatcga tggttacaag 1140

atcgaaatga agccgtttgt taaggtggtt aaggcggacg aggcgacctt caagagcgcg 1200

tataaagcgc cgcacaacga aggcctgatc atgattgaag atggtgcggc gtacgcggcg 1260

accaagacct ataagtggaa accgctgagc cacaacacca tcgatttcct gattaaggcg 1320

tgcccgaaac agctgattaa cgtggacccg tacaagccgc gtgcgggtta taaactgtgg 1380

ctgctgttta ccaccatcag cctggatcag caacgtgaac tgggcatcga gttcattccg 1440

gcgtggaaaa tcctgttcac cgacattaac atgtttggta gccgtgtgcc gatccagttt 1500

caaccggcga ttaacccgct ggcgtacgtt tgctatctgc cggaagacgt gaacgttaac 1560

gacggcgata ttgttgagat gcgtgcggtg gacggttacg ataccatccc gaaatgggaa 1620

ctggttcgta gccgtaacga tcgtaagaac gagccgggtt tctacggcaa caactataaa 1680

atcgcgagcg acatttacct gaactatatt gatgttttcc actttgaaga cctgtacaaa 1740

tataacccgg gctacttcga gaagaacaag agcgatatct acgtggcgcc gaacaagtac 1800

cgtcgttatc tgatcaaaag cctgttcggt cgttacctgc gtgatgcgaa gtgggtgatt 1860

gatgcggcgg cgggtcgtgg cgcggacctg cacctgtata aagcggaatg cgttgagcac 1920

ctgctggcga tcgacattga tccgaccgcg atcagcgaac tggtgcgtcg tcgtaacgag 1980

attaccggct acaacaagag ccaccgtggc ggtcgtaaca tgcacagcca ccgtggtcag 2040

agccactgcg cgaaaagcac cagcctgcac gcgctggttg cggatctgcg tgaaaacccg 2100

gacgttctga ttccgaagat cattcaaagc cgtccgcacg agcgttgcta cgatgcgatc 2160

gttattaact ttgcgatcca ctatctgtgc gacaccgatg aacacatccg tgacttcctg 2220

attaccgtga gccgtctgct ggcgccgaac ggtgttttca tctttaccac catggatggt 2280

gaaagcattg tgaagctgct ggcggaccac aaagttcgtc cgggtgaagc gtggaccatc 2340

cacaccggtg atgtgaacag cccggacagc accgttccga aatacagcat tcgtcgtctg 2400

tatgacagcg ataagctgac caaaaccggc cagcaaatcg aggttctgct gccgatgagc 2460

ggtgaaatga aggcggagcc gctgtgcaac attaaaaaca tcattagcat ggcgcgtaag 2520

atgggtctgg atctggtgga aagcgcgaac tttagcgttc tgtacgaggc gtatgcgcgt 2580

gactacccgg atatctatgc gcgtatgacc ccggacgata agctgtacaa cgacctgcac 2640

acctatgcgg tgttcaagcg taagaaaggc gcgagcaccg cgagcaccaa caccatcaac 2700

attgcgaaga acgactttag cgatatcgag ctggcggcga ttccgttcaa caccctggcg 2760

gaccactacg gtgaacgtct ggcgcgtgag cagctggcgc tggaacacga gagctatgaa 2820

atgggcgagg cgcgtttccg taagatgttt gaacgtcaac tgaaagcggg tgaggttgcg 2880

gataacgcgg cggcgaaacc gctgattacc accctgctgc cgaagatgat cgcgcgtatt 2940

aacgactggt tcgaggaagt taaggcgaaa cgtggtaaac gtccgaccgc gttccagttt 3000

ctgcaagaaa tcaaaccgga ggcggtggcg tacatcacca ttaaaaccac cctggcgtgc 3060

ctgaccagcg cggacaacac caccgtgcag gcggttgcga gcgcgattgg tcgtgcgatt 3120

gaagatgagg cgcgttttgg tcgtatccgt gacctggaag cgaagcactt caagaaaaac 3180

gttgaggaac agctgaacaa acgtgtgggc cacgtttata agaaagcgtt catgcaagtg 3240

gttgaggcgg atatgctgag caagggtctg ctgggcggtg aagcgtggag cagctggcac 3300

aaagaggaca gcatccacgt gggcgttcgt tgcatcgaaa tgctgattga gagcaccggt 3360

atggttagcc tgcaccgtca gaacgcgggt gtggttggcc aagatagcga aaccatcgag 3420

ctggcgccgg aatacgcgga ggcgattgcg acccgtgcgg gtgcgctggc gggtatcagc 3480

ccgatgtttc aaccgtgcgt ggttccgccg aagccgtgga ccggtattac cggcggtggc 3540

tactgggcga acggtcgtcg tccgctggcg ctggtgcgta cccacagcaa gaaagcgctg 3600

atgcgttacg aagacgttta tatgccggaa gtgtataagg cgatcaacat tgcgcaaaac 3660

accgcgtgga aaattaacaa gaaagtgctg gcggttgcga acgtgatcac caagtggaaa 3720

cactgcccgg ttgaagatat cccggcgatt gagcgtgagg aactgccgat gaaaccggaa 3780

gacatcgata tgaacccgga agcgctgacc gcgtggaaac gtgcggcggc ggcggtgtac 3840

cgtaaggaca aagcgcgtaa aagccgtcgt attagcctgg aattcatgct ggagcaggcg 3900

aacaagtttg cgaaccacaa agcgatctgg ttcccgtaca acatggattg gcgtggccgt 3960

gtttatgctg tgagcatgtt caacccgcaa ggcaacgaca tgaccaaggg cctgctgacc 4020

ctggcgaagg gtaaaccgat tggcaaggaa ggctactatt ggctgaaaat ccacggtgcg 4080

aactgcgcgg gcgttgataa agtgccgttc ccggaacgta tcaagtttat tgaggaaaac 4140

cacgagaaca tcatggcgtg cgcgaaaagc ccgctggaaa acacctggtg ggcggagcag 4200

gacagcccgt tctgctttct ggcgttctgc tttgagtacg cgggtgttca acaccacggc 4260

ctgagctata actgcagcct gccgctggcg tttgatggta gctgcagcgg catccagcac 4320

ttcagcgcga tgctgcgtga cgaagttggt ggccgtgcgg tgaacctgct gccgagcgag 4380

accgtgcagg atatctacgg tattgttgcg aagaaagtga acgagatcct gcaagcggat 4440

gcgattaacg gcaccgacaa cgaagtggtt accgtgaccg acgagaacac cggtgaaatc 4500

agcgagaagg ttaaactggg taccaaagcg ctggcgggcc agtggctggc gtacggtgtt 4560

acccgtagcg tgaccaagcg tagcgttatg accctggcgt atggtagcaa agaattcggc 4620

tttcgtcagc aagtgctgga ggataccatc caaccggcga ttgacagcgg caagggcctg 4680

atgtttaccc agccgaacca agcggcgggt tacatggcga aactgatctg ggaaagcgtg 4740

agcgttaccg tggttgcggc ggttgaggcg atgaactggc tgaagagcgc ggcgaaactg 4800

ctggcggcgg aagtgaaaga taagaaaacc ggcgagattc tgcgtaagcg ttgcgcggtt 4860

cactgggtga ccccggacgg tttcccggtt tggcaggaat ataagaaacc gatccaaacc 4920

cgtctgaacc tgatgttcct gggccagttt cgtctgcaac cgaccatcaa caccaacaaa 4980

gatagcgaaa ttgacgcgca caagcaggag agcggcattg cgccgaactt tgtgcacagc 5040

caagacggta gccacctgcg taaaaccgtg gtttgggcgc acgaaaagta cggcatcgag 5100

agcttcgcgc tgattcacga tagctttggt accattccgg cggatgcggc gaacctgttc 5160

aaggcggttc gtgaaaccat ggtggatacc tacgagagct gcgacgtgct ggcggacttc 5220

tatgatcagt ttgcggatca actgcacgag agccagctgg acaaaatgcc ggcgctgccg 5280

gcgaagggta acctgaacct gcgtgacatt ctggagagcg attttgcgtt tgcgtaa 5337

Claims

1.在体外对RNA加帽的方法，包括：

使

(i)包含未加帽的目标RNA的RNA样品；

(ii)包含与SEQ ID NO:1、7或20至少90％同一性的氨基酸序列的RNA加帽酶；

(iii)鸟苷三磷酸(GTP)或修饰的GTP

(iv)缓冲剂；和

(v)甲基供体，

在40℃-60℃的温度下接触以形成加帽的目标RNA。

2.在体外有效地对RNA加帽的方法，包括：

使

(i)包含未加帽的目标RNA的RNA样品；

(ii)具有RNA三磷酸酯酶(TPase)、鸟苷酸转移酶(GTase)和鸟嘌呤-N7甲基转移酶(N7MTase)活性的单链RNA加帽酶；

(iii)鸟苷三磷酸(GTP)或修饰的GTP

(iv)缓冲剂；和

(v)甲基供体，

在37℃-60℃的温度下接触以形成加帽的目标RNA。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述未加帽的RNA目标在长度上是至少200nt。

4.权利要求1或2或3所述的方法，其中接触进一步包括将所述温度升高或降低至37℃-60℃的第二温度，其中所述第二温度不同于所述第一温度。

5.权利要求2所述的方法，其中所述单链RNA加帽酶包含：

(a)与(x)SEQ ID NO:2、(y)SEQ ID NO:3、和/或(z)SEQ ID NO:4至少90％同一性的氨基酸序列，或

(b)与(x)SEQ ID NO:5和/或(y)SEQ ID NO:6至少90％同一性的氨基酸序列。

6.权利要求2所述的方法，其中所述单链RNA加帽酶包含与(a)SEQ ID NO:7、(b)SEQ IDNO:8、(c)SEQ ID NO:9、(d)SEQ ID NO:10、(e)SEQ ID NO:11或(f)SEQ ID NO:12至少90％同一性的氨基酸序列。

7.任一项前述权利要求所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)、和(iv)不含RNase，并且接触任选地进一步包括接触(v)一种或多种RNase抑制剂。

8.任一项前述权利要求所述的方法，进一步包括利用固相寡核苷酸合成化学合成所述未加帽的RNA。

9.任一项前述权利要求所述的方法，进一步包括通过使编码所述未加帽的RNA的DNA模板与聚合酶接触合成所述未加帽的RNA来产生所述未加帽的RNA。

10.任一项前述权利要求所述的方法，其中所述甲基供体是S-腺苷甲硫氨酸，并且接触进一步包括接触(vi)帽2’O甲基转移酶。

11.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述未加帽的目标RNA包含一种或多种假尿苷。

12.任一项前述权利要求所述的方法，其中接触进一步包括在单个位置使(i)、(ii)、(iii)、(iv)和任选地(v)接触。

13.组合物，包含：

(i)未加帽的目标RNA；

(iii)鸟苷三磷酸(GTP)；

(iv)缓冲剂；和

(v)甲基供体。

14.权利要求13所述的组合物，其中所述组合物具有在37℃-60℃范围内的温度。

15.权利要求12所述的组合物，其中所述组合物不含RNase并且任选地包含(v)一种或多种RNase抑制剂。

16.权利要求13-15中任一项所述的组合物，其中所述单链RNA加帽酶包含：

17.权利要求13-16中任一项所述的组合物，其中所述单链RNA加帽酶包含与(a)SEQ IDNO:7、(b)SEQ ID NO:8、(c)SEQ ID NO:9、(d)SEQ ID NO:10、(e)SEQ ID NO:11或(f)SEQ IDNO:12至少90％同一性的氨基酸序列。

18.权利要求13-17中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含DNA模板、噬菌体聚合酶和三磷酸核糖核苷酸，用于转录所述RNA。

19.权利要求13-18中任一项所述的组合物，其中所述组合物任选地包含(vi)S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和(vii)帽2’O甲基转移酶。

20.权利要求13-19中任一项所述的组合物，其中所述未加帽的目标RNA包含一种或多种假尿苷。

21.试剂盒，包含：

具有RNA三磷酸酯酶(TPase)、鸟苷酸转移酶(GTase)和鸟嘌呤-N7甲基转移酶(N7MTase)活性的单链RNA加帽酶，其中所述酶在存储缓冲剂中；和

反应缓冲剂。

22.权利要求20所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含噬菌体聚合酶和核糖核苷酸，以用于转录编码目标RNA的模板多核苷酸。

23.权利要求21或22所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、帽2’O甲基转移酶(2’OMTase)、或SAM和2’OMTase两者。

24.权利要求20-23中任一项所述的试剂盒，其中所述单链RNA加帽酶包含：

25.权利要求20-23中任一项所述的试剂盒，其中所述单链RNA加帽酶包含与(a)SEQ IDNO:7、(b)SEQ ID NO:8、(c)SEQ ID NO:9、(d)SEQ ID NO:10、(e)SEQ ID NO:11或(f)SEQ IDNO:12至少90％同一性的氨基酸序列。

26.RNA加帽酶，包含与SEQ ID NO:20至少90％同一性的氨基酸序列。

27.RNA加帽酶融合物，包含：(a)与SEQ ID NO:7至少90％同一性的氨基酸序列，和(b)与SEQ ID NO:20的位置1419至1587至少90％同一性的氨基酸序列。