JP2024518546A - 修飾されたｍＲＮＡ、修飾された非コードＲＮＡ、およびその使用 - Google Patents

修飾されたｍＲＮＡ、修飾された非コードＲＮＡ、およびその使用 Download PDF

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Abstract

修飾されたヌクレオチドおよび／または二次構造を含有するポリ（Ａ）テールを有する修飾されたｎｉＲＮＡおよび修飾された非コードＲＮＡが本願において開示され、これらはＲＮＡの３’末端の端へのテーリング核酸のライゲーションによって作られ得る。本願において提供される１つ以上の修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを含む組成物、および治療薬または農業用途のために前記の組成物を用いる方法もまた提供される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、「MODIFIED MRNA AND USES THEREOF」と題する２０２１年５月１２日出願のＵ．Ｓ．仮出願Ｎｏ．６３／１８７，７５２、および「MODIFIED MRNA AND USES THEREOF」と題する２０２１年１２月１０日出願のＵ．Ｓ．仮出願Ｎｏ．６３／２８８，５２２の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条（ｅ）による利益を主張する。これらのそれぞれの開示全体はそれらの全体が参照によってここに組み込まれる。
ＥＦＳ－ＷＥＢからテキストファイルとして提出された配列表の参照
本願は配列表を含有し、これはＥＦＳ－ＷｅｂからＡＳＣＩＩフォーマットで提出されており、その全体が参照によってここに組み込まれる。２０２２年５月１０日に作成された前記のＡＳＣＩＩコピーはＢ１１９５７０１３０ＷＯ００－ＳＥＱ－ＪＱＭの名称であり、サイズが９，８５４バイトである。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）テクノロジーは、従来の低分子治療薬およびワクチンアプローチの新興の代替である。なぜなら、それは強力であり、プログラム可能であり、所望の配列を有するｍＲＮＡの急速な産生ができるからである。ｍＲＮＡ治療薬は急速に発達しつつある分野であり、血管再生因子からＣＯＶＩＤ－１９、インフルエンザ、およびジカウイルスのワクチンに及ぶ治療薬蛋白質の発現のために用いられている。最近の臨床的な成功にもかかわらず、ｍＲＮＡ治療薬は依然として不安定性、毒性、短期的有効性、および可能性としてのアレルギー応答という難題に直面している。インビボのそれらの有効性を向上させるためにｍＲＮＡの安定性を増大させることは、臨床用途のためのｍＲＮＡ治療薬のフィジビリティを増大させるために解決されなければならない重要な課題のままである。
細胞における安定性を改善するおよびそれによって蛋白質産生を向上させるための修飾されたヌクレオチドおよび／または構造的特徴を有する修飾されたｍＲＮＡ、ならびにかかる修飾されたｍＲＮＡを作るおよび用いる方法が、本願において提供される。従来のｍＲＮＡは３’端に複数のアデノシンヌクレオチドを有するポリＡテールを含み、これらは３’ヌクレオチドを除去する細胞のエキソヌクレアーゼによって分解され得る。ひとたびエキソヌクレアーゼがポリＡテールを除去し、オープンリーディングフレームのヌクレオチドを除去し始めると、ｍＲＮＡは、コードされる蛋白質に翻訳される能力がない。３’エキソヌクレアーゼ活性に対してより耐性であるｍＲＮＡは、より低速で分解され、それゆえにより安定であり、細胞における増大した半減期を有し、より多くの蛋白質が所与のｍＲＮＡ分子から産生され得る。ｍＲＮＡの核酸塩基、糖、またはリン酸連結部に対する１つ以上の構造修飾を含有する修飾されたヌクレオチドは、３’エキソヌクレアーゼ活性に干渉し、ｍＲＮＡをより安定にし得る。しかしながら、３’エキソヌクレアーゼを阻害する同じ構造修飾は、それらをポリＡテール上に組み込むポリアデニル化酵素の能力をもまた妨害し、修飾されたヌクレオチドをポリＡテール上に組み込むことを困難にし得る。驚くべきことに、既存のポリＡテールを含有するｍＲＮＡの３’端にたった３つの修飾されたヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドをライゲーションすることは、オリゴヌクレオチドセルフライゲーションを防止するための３’末端ブロッキングヌクレオチド以外には修飾されたヌクレオチドを有さないオリゴヌクレオチドのライゲーションと比較して、ｍＲＮＡ安定性の著しい改善をもたらす（図５）。安定性の類似の改善が、Ｇ四重鎖またはアプタマーなどの二次構造を形成することができる構造配列を含有するオリゴヌクレオチドのライゲーションによって観察された。かかる構造配列は、エキソヌクレアーゼが３’末端ヌクレオチドにアクセスすることを防止すると考えられる。複数の型の修飾されたヌクレオチドおよび構造配列は、単独でおよび互いとの組み合わせでの両方で、３’末端に追加されたときに改善された安定性をｍＲＮＡに付与し、修飾されたｍＲＮＡをＲＮａｓｅによって媒介される分解に対してより耐性にした。これは、対照ｍＲＮＡに対して相対的に、これらの修飾されたｍＲＮＡからの増大した蛋白質産生をもたらした。これらの結果は、エキソヌクレアーゼ活性を妨害するためにｍＲＮＡのポリＡテールを修飾するというこのアプローチが、修飾されたｍＲＮＡの産生において幅広い実用性を提供するということを指示している。加えて、本願において提供される方法によって産生される修飾されたｍＲＮＡは、環状ｍＲＮＡを産生するために直鎖ｍＲＮＡの末端の端をライゲーションすることによって環状化され得る。非コードＲＮＡもまた３’エキソヌクレアーゼ活性に対して脆弱であるという理由から、ｍＲＮＡの安定性を改善するための本願に記載される技術は、非コードＲＮＡの安定性を改善することにとってもまた好適であり得る。
従って、本開示は、いくつかの側面において、以下を含む修飾されたｍＲＮＡを提供する：
（ｉ）蛋白質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；および
（ｉｉ）ポリＡ領域、
ここで、ポリＡ領域はオープンリーディングフレームの３’にあり、１０ヌクレオチド以上を含み、ここで、ポリＡ領域のヌクレオチドの１％から９０％は修飾されたヌクレオチドであり、ここで、ポリＡ領域の最後の１０ヌクレオチドの３つ以上は修飾されたヌクレオチドである。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は２５個以上のアデノシンヌクレオチドを含み、ここで、ポリＡ領域のヌクレオチドの１％から９０％は修飾されたヌクレオチドであり、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの３つ以上は修飾されたヌクレオチドである。
いくつかの態様において、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの４つ以上は修飾されたヌクレオチドである。
いくつかの態様において、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの一続きの２ヌクレオチド以上は、修飾されたヌクレオチド間連結部によって連結される。
いくつかの態様において、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの一続きの３ヌクレオチド以上は修飾されたヌクレオチドであり、デオキシリボヌクレオチド、２’修飾されたヌクレオチド、およびホスホロチオエート連結ヌクレオチドから独立して選択される。
いくつかの態様において、３つ以上の修飾されたヌクレオチドは、ポリＡ領域の３’末端に所在する一続きのヌクレオチドである。
いくつかの態様において、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの一続きの６ヌクレオチド以上は同じ型のヌクレオチドまたはヌクレオシド間修飾を含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域の最後の１０ヌクレオチドの３つ以上は修飾されたヌクレオチドである。
いくつかの態様において、ポリＡ領域のヌクレオチドの少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１６％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％は、修飾されたヌクレオチドである。
いくつかの態様において、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５個は修飾されたヌクレオチドである。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含み、ここで、ＯＲＦは５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの間にあり、ここで、３’ＵＴＲはＯＲＦおよびポリＡ領域の間にある。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは環状ｍＲＮＡであり、ここで、ポリＡ領域は３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲの間にある。
いくつかの側面において、本開示は以下を含む修飾されたｍＲＮＡを提供する：
（ｉ）蛋白質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；
（ｉｉ）ポリＡ領域；
（ｉｉｉ）二次構造を形成することができる少なくとも２つのヌクレオチドを含む構造配列の１コピー以上、
ここで、ポリＡ領域はオープンリーディングフレームの３’にあり、１０ヌクレオチド以上を含み、ここで、構造配列の１コピー以上はポリＡ領域の３’にあり、ここで、修飾されたｍＲＮＡは二次構造を含み、ここで、二次構造は構造配列の１コピー以上を含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域はオープンリーディングフレームの３’にあり、２５ヌクレオチド以上を含み、ここで、構造配列の１コピー以上はポリＡ領域の３’にあり、ここで、修飾されたｍＲＮＡは二次構造を含み、ここで、二次構造は構造配列の１コピー以上を含む。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含み、ここで、ＯＲＦは５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの間にあり、ここで、３’ＵＴＲはＯＲＦおよびポリＡ領域の間にある。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは環状ｍＲＮＡであり、ここで、構造配列の１コピー以上はポリＡ領域および５’ＵＴＲの間にある。
いくつかの態様において、構造配列はＧ四重鎖配列である。
いくつかの態様において、Ｇ四重鎖はＲＮＡのＧ四重鎖配列である。
いくつかの態様において、ＲＮＡのＧ四重鎖配列は配列番号２の核酸配列を含む。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは配列番号２の核酸配列の少なくとも３コピーを含む。
いくつかの態様において、Ｇ四重鎖はＤＮＡのＧ四重鎖配列である。
いくつかの態様において、ＤＮＡのＧ四重鎖配列は配列番号３の核酸配列を含む。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは配列番号３の核酸配列の少なくとも３コピーを含む。
いくつかの態様において、構造配列はテロメアリピート配列である。
いくつかの態様において、テロメアリピート配列は配列番号４の核酸配列を含む。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは配列番号４の核酸配列の少なくとも３コピーを含む。
いくつかの態様において、ｍＲＮＡの二次構造は、標的分子に結合することができるアプタマーである。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された核酸塩基を含む。
いくつかの態様において、修飾された核酸塩基は以下からなる群から選択される：キサンチン、アリアミノウラシル、アリアミノチミジン、ヒポキサンチン、ジゴキシゲニン化アデニン、ジゴキシゲニン化シトシン、ジゴキシゲニン化グアニン、ジゴキシゲニン化ウラシル、６－クロロプリンリボシド、Ｎ６－メチルアデニン、メチルシュードウラシル、２－チオシトシン、２－チオウラシル、５－メチルウラシル、４－チオチミジン、４－チオウラシル、５，６－ジヒドロ－５－メチルウラシル、５，６－ジヒドロウラシル、５－［（３－インドリル）プロピオンアミド－Ｎ－アリル］ウラシル、５－アミノアリルシトシン、５－アミノアリルウラシル、５－ブロモウラシル、５－ブロモシトシン、５－カルボキシシトシン、５－カルボキシメチルエステルウラシル、５－カルボキシウラシル、５－フルオロウラシル、５－ホルミルシトシン、５－ホルミルウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ヒドロキシウラシル、５－ヨードシトシン、５－ヨードウラシル、５－メトキシシトシン、５－メトキシウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－プロパルギルアミノシトシン、５－プロパルギルアミノウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、６－アザシトシン、６－アザウラシル、６－クロロプリン、６－チオグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノアデニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、８－アザアデニン、８－アジドアデニン、８－クロロアデニン、８－オキソアデニン、８－オキソグアニン、アラアデニン、アラシトシン、アラグアニン、アラウラシル、ビオチン－１６－７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、ビオチン－１６－アミノアリルシトシン、ビオチン－１６－アミノアリルウラシル、シアニン３－５－プロパルギルアミノシトシン、シアニン３－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン３－アミノアリルシトシン、シアニン３－アミノアリルウラシル、シアニン５－６－プロパルギルアミノシトシン、シアニン５－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン５－アミノアリルシトシン、シアニン５－アミノアリルウラシル、シアニン７－アミノアリルウラシル、ダブシル－５－３－アミノアリルウラシル、デスチオビオチン－１６－アミノアリル－ウラシル、デスチオビオチン－６－アミノアリルシトシン、イソグアニン、Ｎ１－エチルシュードウラシル、Ｎ１－メトキシメチルシュードウラシル、Ｎ１－メチルアデニン、Ｎ１－メチルシュードウラシル、Ｎ１－プロピルシュードウラシル、Ｎ２－メチルグアニン、Ｎ４－ビオチン－ＯＢＥＡ－シトシン、Ｎ４－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｏ６－メチルグアニン、シュードイソシトシン、シュードウラシル、チエノシトシン、チエノグアニン、チエノウラシル、キサントシン、３－デアザアデニン、２，６－ジアミノアデニン、２，６－ジアミノ（damino）グアニン、５－カルボキサミド－ウラシル、５－エチニルウラシル、Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｉ６Ａ）、２－メチル－チオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン（ｍ６２Ａ）、およびＮ６－アセチルアデニン（ａｃ６Ａ）。
いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された糖を含む。
いくつかの態様において、修飾された糖は以下からなる群から選択される：２’－チオリボース、２’，３’－ジデオキシリボース、２’－アミノ－２’－デオキシリボース、２’デオキシリボース、２’－アジド－２’－デオキシリボース、２’－フルオロ－２’－デオキシリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、２’－Ｏ－メチルデオキシリボース、３’－アミノ－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－アジド－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－デオキシリボース、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－２’－デオキシリボース、３’－Ｏ－メチルリボース、５’－アミノリボース、５’－チオリボース、５－ニトロ－１－インドリル－２’－デオキシリボース、５’－ビオチン－リボース、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン連結、２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノ連結リボース、および２’－Ｏ，４’－Ｃ－チオ連結リボース。
いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは２’修飾を含む。
いくつかの態様において、２’修飾は以下からなる群から選択される：ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾（すなわち、リボースの２’酸素および４’炭素に結合した追加の炭素原子を含むヌクレオチド）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、および２’－Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾されたリン酸を含む。
いくつかの態様において、修飾されたリン酸は以下からなる群から選択される：ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホロジチオエート、チオリン酸、５’－Ｏ－メチルホスホネート、３’－Ｏ－メチルホスホネート、５’－ヒドロキシホスホネート、ヒドロキシホスファネート、ホスホロセレノアート、セレノホスフェート、ホスホロアミダート、カルボホスホネート、メチルホスホネート、フェニルホスホネート、エチルホスホネート、Ｈ－ホスホネート、グアニジニウム環、トリアゾール環、ボラノホスフェート（ＢＰ）、メチルホスホネート、およびグアニジノプロピルホスホロアミダート。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６つのホスホロチオエートを含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも６つのホスホロチオエートを含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも３つのグアニンヌクレオチドおよび少なくとも３つのホスホロチオエートを含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は２’修飾を含む少なくとも６ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも３つのデオキシリボース糖を含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２３個のデオキシリボース糖を含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも２３個のデオキシリボース糖を含む。
いくつかの態様において、ｍＲＮＡの３’末端ヌクレオチドは３’末端ヌクレオチドの３’位置にヒドロキシを含まない。
いくつかの態様において、ｍＲＮＡの３’末端ヌクレオチドは反転ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、ｍＲＮＡの３’末端ヌクレオチドはジデオキシアデノシン、ジデオキシシチジン、ジデオキシグアノシン、ジデオキシチミジン、ジデオキシウリジン、または反転デオキシチミジンを含む。
いくつかの態様において、ｍＲＮＡの３’末端ヌクレオチドはジデオキシシチジンを含む。
いくつかの態様において、ｍＲＮＡはペプチド結合配列を含む。いくつかの態様において、ペプチド結合配列はポリＡ結合蛋白質（ＰＡＢＰ）結合配列である。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは第１の修飾されたヌクレオチドおよび第２の修飾されたヌクレオチドを含み、ここで、第１および第２の修飾されたヌクレオシドは異なる構造を含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも２５～５００ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、または少なくとも２００ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域のヌクレオチドの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％はアデノシンヌクレオチドである。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは直鎖ｍＲＮＡであり、ここで、直鎖ｍＲＮＡは５’キャップを含む。
いくつかの態様において、５’キャップは７－メチルグアノシンを含む。
いくつかの態様において、５’キャップは、さらに、修飾されたｍＲＮＡの隣接するヌクレオチドに７－メチルグアノシンを接続する１つ以上のリン酸を含む。
いくつかの態様において、５’キャップは３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含む。
いくつかの態様において、５’キャップの１つ以上のリン酸は、以下からなる群から選択される修飾されたリン酸である：ホスホロチオエート、トリアゾール環、ジハロゲンメチレンビスホスホネート、イミド二リン酸、およびメチレンビス（ホスホネート）。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは、１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む５’ＵＴＲを含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは、１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含むＯＲＦを含む。
いくつかの側面において、本開示は以下を含む修飾された非コードＲＮＡを提供する：
（ｉ）非コードＲＮＡ配列；および
（ｉｉ）ポリＡ領域、
ここで、ポリＡ領域は非コードＲＮＡ配列の３’にあり、１０ヌクレオチド以上を含み、ここで、ポリＡ領域のヌクレオチドの１％から９０％は修飾されたヌクレオチドであり、ここで、ポリＡ領域の最後の１０ヌクレオチドの３つ以上は修飾されたヌクレオチドである。
いくつかの態様において、ポリＡ領域はオープンリーディングフレームの３’にあり、２５個以上のアデノシンヌクレオチドを含み、ここで、ポリＡ領域のヌクレオチドの１％から９０％は修飾されたヌクレオチドであり、ここで、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの３つ以上は修飾されたヌクレオチドである。
いくつかの態様において、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの４つ以上は修飾されたヌクレオチドである。
いくつかの態様において、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの一続きの２ヌクレオチド以上は、修飾されたヌクレオチド間連結部によって連結される。
いくつかの態様において、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの一続きの３ヌクレオチド以上は修飾されたヌクレオチドであり、デオキシリボヌクレオチド、２’修飾されたヌクレオチド、およびホスホロチオエート連結ヌクレオチドから独立して選択される。
いくつかの態様において、３つ以上の修飾されたヌクレオチドは、ポリＡ領域の３’末端に所在する一続きのヌクレオチドである。
いくつかの態様において、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの一続きの６ヌクレオチド以上は、同じ型のヌクレオチドまたはヌクレオシド間修飾を含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域のヌクレオチドの少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１６％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％は修飾されたヌクレオチドである。
いくつかの態様において、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５個は修飾されたヌクレオチドである。
いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは環状の非コードＲＮＡであり、ここで、ポリＡ領域は非コードＲＮＡ配列の５’にある。
いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは、さらに、二次構造を形成することができる少なくとも２つのヌクレオチドを含む構造配列の１コピー以上を含み、ここで、構造配列の１コピー以上はポリＡ領域の３’にあり、ここで、修飾された非コードＲＮＡは二次構造を含み、ここで、二次構造は構造配列の１コピー以上を含む。
いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは環状ｍＲＮＡであり、ここで、構造配列の１コピー以上はポリＡ領域および非コードＲＮＡ配列の間にある。
いくつかの態様において、構造配列はＧ四重鎖配列である。
いくつかの態様において、Ｇ四重鎖はＲＮＡのＧ四重鎖配列である。
いくつかの態様において、ＲＮＡのＧ四重鎖配列は配列番号２の核酸配列を含む。
いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは配列番号２の核酸配列の少なくとも３コピーを含む。
いくつかの態様において、Ｇ四重鎖はＤＮＡのＧ四重鎖配列である。
いくつかの態様において、ＤＮＡのＧ四重鎖配列は配列番号３の核酸配列を含む。
いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは配列番号３の核酸配列の少なくとも３コピーを含む。
いくつかの態様において、構造配列はテロメアリピート配列である。
いくつかの態様において、テロメアリピート配列は配列番号４の核酸配列を含む。
いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは配列番号４の核酸配列の少なくとも３コピーを含む。
いくつかの態様において、非コードＲＮＡの二次構造は、標的分子に結合することができるアプタマーである。
いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された核酸塩基を含む。
いくつかの態様において、修飾された核酸塩基は以下からなる群から選択される：キサンチン、アリアミノウラシル、アリアミノチミジン、ヒポキサンチン、ジゴキシゲニン化アデニン、ジゴキシゲニン化シトシン、ジゴキシゲニン化グアニン、ジゴキシゲニン化ウラシル、６－クロロプリンリボシド、Ｎ６－メチルアデニン、メチルシュードウラシル、２－チオシトシン、２－チオウラシル、５－メチルウラシル、４－チオチミジン、４－チオウラシル、５，６－ジヒドロ－５－メチルウラシル、５，６－ジヒドロウラシル、５－［（３－インドリル）プロピオンアミド－Ｎ－アリル］ウラシル、５－アミノアリルシトシン、５－アミノアリルウラシル、５－ブロモウラシル、５－ブロモシトシン、５－カルボキシシトシン、５－カルボキシメチルエステルウラシル、５－カルボキシウラシル、５－フルオロウラシル、５－ホルミルシトシン、５－ホルミルウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ヒドロキシウラシル、５－ヨードシトシン、５－ヨードウラシル、５－メトキシシトシン、５－メトキシウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－プロパルギルアミノシトシン、５－プロパルギルアミノウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、６－アザシトシン、６－アザウラシル、６－クロロプリン、６－チオグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノアデニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、８－アザアデニン、８－アジドアデニン、８－クロロアデニン、８－オキソアデニン、８－オキソグアニン、アラアデニン、アラシトシン、アラグアニン、アラウラシル、ビオチン－１６－７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、ビオチン－１６－アミノアリルシトシン、ビオチン－１６－アミノアリルウラシル、シアニン３－５－プロパルギルアミノシトシン、シアニン３－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン３－アミノアリルシトシン、シアニン３－アミノアリルウラシル、シアニン５－６－プロパルギルアミノシトシン、シアニン５－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン５－アミノアリルシトシン、シアニン５－アミノアリルウラシル、シアニン７－アミノアリルウラシル、ダブシル－５－３－アミノアリルウラシル、デスチオビオチン－１６－アミノアリル－ウラシル、デスチオビオチン－６－アミノアリルシトシン、イソグアニン、Ｎ１－エチルシュードウラシル、Ｎ１－メトキシメチルシュードウラシル、Ｎ１－メチルアデニン、Ｎ１－メチルシュードウラシル、Ｎ１－プロピルシュードウラシル、Ｎ２－メチルグアニン、Ｎ４－ビオチン－ＯＢＥＡ－シトシン、Ｎ４－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｏ６－メチルグアニン、シュードイソシトシン、シュードウラシル、チエノシトシン、チエノグアニン、チエノウラシル、キサントシン、３－デアザアデニン、２，６－ジアミノアデニン、２，６－ジアミノ（damino）グアニン、５－カルボキサミド－ウラシル、５－エチニルウラシル、Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｉ６Ａ）、２－メチル－チオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン（ｍ６２Ａ）、およびＮ６－アセチルアデニン（ａｃ６Ａ）。
いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された糖を含む。
いくつかの態様において、修飾された糖は以下からなる群から選択される：２’－チオリボース、２’，３’－ジデオキシリボース、２’－アミノ－２’－デオキシリボース、２’デオキシリボース、２’－アジド－２’－デオキシリボース、２’－フルオロ－２’－デオキシリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、２’－Ｏ－メチルデオキシリボース、３’－アミノ－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－アジド－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－デオキシリボース、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－２’－デオキシリボース、３’－Ｏ－メチルリボース、５’－アミノリボース、５’－チオリボース、５－ニトロ－１－インドリル－２’－デオキシリボース、５’－ビオチン－リボース、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン連結、２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノ連結リボース、および２’－Ｏ，４’－Ｃ－チオ連結リボース。
いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは２’修飾を含む。
いくつかの態様において、２’修飾は以下からなる群から選択される：ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾（すなわち、リボースの２’酸素および４’炭素に結合した追加の炭素原子を含むヌクレオチド）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、および２’－Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）。
いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、修飾されたリン酸を含む。
いくつかの態様において、修飾されたリン酸は以下からなる群から選択される：ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホロジチオエート、チオリン酸、５’－Ｏ－メチルホスホネート、３’－Ｏ－メチルホスホネート、５’－ヒドロキシホスホネート、ヒドロキシホスファネート、ホスホロセレノアート、セレノホスフェート、ホスホロアミダート、カルボホスホネート、メチルホスホネート、フェニルホスホネート、エチルホスホネート、Ｈ－ホスホネート、グアニジニウム環、トリアゾール環、ボラノホスフェート（ＢＰ）、メチルホスホネート、およびグアニジノプロピルホスホロアミダート。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６つのホスホロチオエートを含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも６つのホスホロチオエートを含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも３つのグアニンヌクレオチドおよび少なくとも３つのホスホロチオエートを含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は、２’修飾を含む少なくとも６ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも３つのデオキシリボース糖を含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２３個のデオキシリボース糖を含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも２３個のデオキシリボース糖を含む。
いくつかの態様において、非コードＲＮＡの３’末端ヌクレオチドは３’末端ヌクレオチドの３’位置にヒドロキシを含まない。
いくつかの態様において、非コードＲＮＡの３’末端ヌクレオチドは反転ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、ｍＲＮＡの３’末端ヌクレオチドはジデオキシアデノシン、ジデオキシシチジン、ジデオキシグアノシン、ジデオキシチミジン、ジデオキシウリジン、または反転デオキシチミジンを含む。
いくつかの態様において、ｍＲＮＡの３’末端ヌクレオチドはジデオキシシチジンを含む。
いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは第１の修飾されたヌクレオチドおよび第２の修飾されたヌクレオチドを含み、ここで、第１および第２の修飾されたヌクレオシドは異なる構造を含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも２５～５００ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、または少なくとも２００ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域のヌクレオチドの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％はアデノシンヌクレオチドである。
いくつかの側面において、本開示は、修飾されたｍＲＮＡを産生する方法を提供し、方法は、ＲＮＡリガーゼの存在下において、１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含むテーリング核酸に、蛋白質をコードするオープンリーディングフレームを含む第１のＲＮＡをライゲーションすることを含み、それによって、ＲＮＡリガーゼはＲＮＡの３’ヌクレオチドおよびテーリング核酸の５’ヌクレオチドの間の共有結合を形成して、修飾されたｍＲＮＡを産生する。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含み、ここで、ＯＲＦは５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの間にあり、ここで、３’ＵＴＲはＯＲＦおよびポリＡ領域の間にある。
いくつかの態様において、方法は、さらに、リボザイムの存在下において修飾されたｍＲＮＡを環状化することを含み、ここで、修飾されたｍＲＮＡは３’イントロンおよび５’イントロンを含み、ここで、３’イントロンは５’ＵＴＲの５’にあり、ここで、５’イントロンはポリＡ領域の３’にあり、それによって、リボザイムは３’イントロンの３’にあるヌクレオチドおよび５’イントロンの５’にあるヌクレオチドの間の共有結合を形成して、５’イントロンまたは３’イントロンを含まない環状ｍＲＮＡを産生し、ここで、ポリＡ領域は環状ｍＲＮＡの３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲの間にある。
いくつかの態様において、方法はさらに以下のステップを含む：
（ｉ）修飾されたｍＲＮＡの第１のヌクレオチドに５’末端リン酸基を導入すること；
（ｉｉ）修飾されたｍＲＮＡの１つ以上の３’末端ヌクレオチドを切断して、３’末端ヒドロキシル基を有する修飾されたｍＲＮＡを産生すること；および
（ｉｉｉ）環状化リガーゼの存在下において、ステップ（ｉｉ）で産生された修飾されたｍＲＮＡを環状化すること；
それによって、環状化リガーゼは修飾されたｍＲＮＡの３’ヌクレオチドおよび修飾されたｍＲＮＡの５’ヌクレオチドの間の共有結合を形成して、環状の修飾されたｍＲＮＡを産生し、ここで、ポリＡ領域は３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲの間にある。
いくつかの側面において、本開示は、修飾されたｍＲＮＡを産生する方法を提供し、方法は、ＲＮＡリガーゼの存在下において、構造配列の１コピー以上を含むテーリング核酸に、蛋白質をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡをライゲーションすることを含み、それによって、リガーゼはＲＮＡの３’ヌクレオチドおよびテーリング核酸の５’ヌクレオチドの間の共有結合を形成して、修飾されたｍＲＮＡを産生する。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含み、ここで、ＯＲＦは５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの間にあり、ここで、３’ＵＴＲはＯＲＦおよびポリＡ領域の間にあり、ここで、ポリＡ領域は３’ＵＴＲおよび構造配列の１コピー以上の間にある。
いくつかの態様において、方法は、さらに、リボザイムの存在下において修飾されたｍＲＮＡを環状化することを含み、ここで、修飾されたｍＲＮＡは３’イントロンおよび５’イントロンを含み、ここで、３’イントロンは５’ＵＴＲの５’にあり、ここで、５’イントロンは構造配列の１コピー以上の３’にあり、それによって、リボザイムは、３’イントロンの３’にあるヌクレオチドおよび５’イントロンの５’にあるヌクレオチドの間の共有結合を形成して、５’イントロンまたは３’イントロンを含まない環状ｍＲＮＡを産生し、ここで、構造配列の１コピー以上は環状ｍＲＮＡのポリＡ領域および５’ＵＴＲの間にある。
いくつかの態様において、方法はさらに以下のステップを含む：
（ｉ）修飾されたｍＲＮＡの第１のヌクレオチドに５’末端リン酸基を導入すること；
（ｉｉ）修飾されたｍＲＮＡの１つ以上の３’末端ヌクレオチドを切断して、３’末端ヒドロキシル基を有する修飾されたｍＲＮＡを産生すること；および
（ｉｉｉ）環状化リガーゼの存在下において、ステップ（ｉｉ）で産生された修飾されたｍＲＮＡを環状化すること；
それによって、環状化リガーゼは修飾されたｍＲＮＡの３’ヌクレオチドおよび修飾されたｍＲＮＡの５’ヌクレオチドの間の共有結合を形成して、環状の修飾されたｍＲＮＡを産生し、ここで、構造配列の１コピー以上は３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲの間にある。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは骨格核酸の存在下において環状化され、ここで、骨格核酸は、修飾されたｍＲＮＡとハイブリダイゼーションすることができる核酸であり、ここで、修飾されたｍＲＮＡは、骨格核酸に結合したときに環状の二次構造を形成する。
いくつかの態様において、骨格核酸は以下を含む：
（ａ）５ヌクレオチド以上を含む第１のハイブリダイゼーション配列であって、ここで、第１のハイブリダイゼーション配列は、修飾されたｍＲＮＡの少なくとも最初の五（５）ヌクレオチドに対して相補的である；および
（ｂ）５ヌクレオチド以上を含む第２のハイブリダイゼーション配列であって、ここで、第２のハイブリダイゼーション配列は、修飾されたｍＲＮＡの少なくとも最後の五（５）ヌクレオチドに対して相補的である；
ここで、修飾されたｍＲＮＡの少なくとも最初の五（５）ヌクレオチドは第１のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイゼーションし、修飾されたｍＲＮＡの少なくとも最後の五（５）ヌクレオチドは第２のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイゼーションする。
いくつかの態様において、第１のハイブリダイゼーション配列の最後のヌクレオチドおよび第２のハイブリダイゼーション配列の最初のヌクレオチドは骨格核酸上で隣接し、いずれかの他のヌクレオチドによって離間されない。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは以下を含む：
（ｉ）オープンリーディングフレームの５’にある第１のセルフハイブリダイゼーション配列；
（ｉｉ）オープンリーディングフレームの３’にある第２のセルフハイブリダイゼーション配列；
（ｉｉｉ）第１のセルフハイブリダイゼーション配列の５’にある第１の非ハイブリダイゼーション配列；および
（ｉｖ）第２のセルフハイブリダイゼーション配列の３’にある第２の非ハイブリダイゼーション配列、
ここで、第１および第２のセルフハイブリダイゼーション配列は互いとハイブリダイゼーションすることができ、
ここで、第１および第２のセルフハイブリダイゼーション配列は互いとハイブリダイゼーションすることができない。
いくつかの態様において、第１および第２のセルフハイブリダイゼーション配列のハイブリダイゼーションは二次構造を形成し、これにおいて、修飾されたｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドは１００Å未満の距離だけ離間される。
いくつかの態様において、５’末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドは９０Å未満、８０Å未満、７０Å未満、６０Å未満、５０Å未満、４０Å未満、３０Å未満、２０Å未満、または１０Å未満の距離だけ離間される。
いくつかの態様において、環状化リガーゼはＴ４ＲＮＡリガーゼである。
いくつかの態様において、構造配列はＧ四重鎖配列である。
いくつかの態様において、Ｇ四重鎖はＲＮＡのＧ四重鎖配列である。
いくつかの態様において、ＲＮＡのＧ四重鎖配列は配列番号２の核酸配列を含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は配列番号２の核酸配列の少なくとも３コピーを含む。
いくつかの態様において、Ｇ四重鎖はＤＮＡのＧ四重鎖配列である。
いくつかの態様において、ＤＮＡのＧ四重鎖配列は配列番号３の核酸配列を含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は配列番号３の核酸配列の少なくとも３コピーを含む。
いくつかの態様において、構造配列はテロメアリピート配列である。
いくつかの態様において、テロメアリピート配列は配列番号４の核酸配列を含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は配列番号４の核酸配列の少なくとも３コピーを含む。
いくつかの態様において、構造配列は、相互作用してアプタマーを形成することができる少なくとも２つのヌクレオチドを含むアプタマー配列であり、ここで、アプタマーは、標的分子に結合することができる二次構造である。
いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、ＲＮＡの５’ヌクレオチドは５’末端リン酸基を含まず；
ここで、ＲＮＡの３’ヌクレオチドは３’末端ヒドロキシル基を含み；
ここで、テーリング核酸の５’ヌクレオチドは５’末端リン酸基を含み；
ここで、テーリング核酸の３’ヌクレオチドは３’末端ヒドロキシル基を含まない。
いくつかの態様において、ＲＮＡの５’ヌクレオチドは５’末端ヒドロキシル基を含まず；
ここで、ＲＮＡの３’ヌクレオチドは３’末端リン酸基を含み；
ここで、テーリング核酸の５’ヌクレオチドは５’末端ヒドロキシル基を含み；
ここで、テーリング核酸の３’ヌクレオチドは３’末端リン酸基を含まず；
ここで、ＲＮＡリガーゼはＲｔｃＢリガーゼである。
いくつかの態様において、テーリング核酸のヌクレオチドの少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１６％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％は修飾されたヌクレオチドである。
いくつかの態様において、テーリング核酸の最後の２５ヌクレオチドの少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５個は修飾されたヌクレオチドである。
いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された核酸塩基を含む。
いくつかの態様において、修飾された核酸塩基は以下からなる群から選択される：キサンチン、アリアミノウラシル、アリアミノチミジン、ヒポキサンチン、ジゴキシゲニン化アデニン、ジゴキシゲニン化シトシン、ジゴキシゲニン化グアニン、ジゴキシゲニン化ウラシル、６－クロロプリンリボシド、Ｎ６－メチルアデニン、メチルシュードウラシル、２－チオシトシン、２－チオウラシル、５－メチルウラシル、４－チオチミジン、４－チオウラシル、５，６－ジヒドロ－５－メチルウラシル、５，６－ジヒドロウラシル、５－［（３－インドリル）プロピオンアミド－Ｎ－アリル］ウラシル、５－アミノアリルシトシン、５－アミノアリルウラシル、５－ブロモウラシル、５－ブロモシトシン、５－カルボキシシトシン、５－カルボキシメチルエステルウラシル、５－カルボキシウラシル、５－フルオロウラシル、５－ホルミルシトシン、５－ホルミルウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ヒドロキシウラシル、５－ヨードシトシン、５－ヨードウラシル、５－メトキシシトシン、５－メトキシウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－プロパルギルアミノシトシン、５－プロパルギルアミノウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、６－アザシトシン、６－アザウラシル、６－クロロプリン、６－チオグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノアデニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、８－アザアデニン、８－アジドアデニン、８－クロロアデニン、８－オキソアデニン、８－オキソグアニン、アラアデニン、アラシトシン、アラグアニン、アラウラシル、ビオチン－１６－７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、ビオチン－１６－アミノアリルシトシン、ビオチン－１６－アミノアリルウラシル、シアニン３－５－プロパルギルアミノシトシン、シアニン３－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン３－アミノアリルシトシン、シアニン３－アミノアリルウラシル、シアニン５－６－プロパルギルアミノシトシン、シアニン５－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン５－アミノアリルシトシン、シアニン５－アミノアリルウラシル、シアニン７－アミノアリルウラシル、ダブシル－５－３－アミノアリルウラシル、デスチオビオチン－１６－アミノアリル－ウラシル、デスチオビオチン－６－アミノアリルシトシン、イソグアニン、Ｎ１－エチルシュードウラシル、Ｎ１－メトキシメチルシュードウラシル、Ｎ１－メチルアデニン、Ｎ１－メチルシュードウラシル、Ｎ１－プロピルシュードウラシル、Ｎ２－メチルグアニン、Ｎ４－ビオチン－ＯＢＥＡ－シトシン、Ｎ４－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｏ６－メチルグアニン、シュードイソシトシン、シュードウラシル、チエノシトシン、チエノグアニン、チエノウラシル、キサントシン、３－デアザアデニン、２，６－ジアミノアデニン、２，６－ジアミノ（damino）グアニン、５－カルボキサミド－ウラシル、５－エチニルウラシル、Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｉ６Ａ）、２－メチル－チオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン（ｍ６２Ａ）、およびＮ６－アセチルアデニン（ａｃ６Ａ）。
いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された糖を含む。
いくつかの態様において、修飾された糖は以下からなる群から選択される：２’－チオリボース、２’，３’－ジデオキシリボース、２’－アミノ－２’－デオキシリボース、２’デオキシリボース、２’－アジド－２’－デオキシリボース、２’－フルオロ－２’－デオキシリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、２’－Ｏ－メチルデオキシリボース、３’－アミノ－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－アジド－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－デオキシリボース、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－２’－デオキシリボース、３’－Ｏ－メチルリボース、５’－アミノリボース、５’－チオリボース、５－ニトロ－１－インドリル－２’－デオキシリボース、５’－ビオチン－リボース、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン連結、２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノ連結リボース、および２’－Ｏ，４’－Ｃ－チオ連結リボース。
いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは２’修飾を含む。
いくつかの態様において、２’修飾は以下からなる群から選択される：ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾（すなわち、リボースの２’酸素および４’炭素に結合した追加の炭素原子を含むヌクレオチド）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、および２’－Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）。
いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾されたリン酸を含む。
いくつかの態様において、修飾されたリン酸は以下からなる群から選択される：ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホロジチオエート、チオリン酸、５’－Ｏ－メチルホスホネート、３’－Ｏ－メチルホスホネート、５’－ヒドロキシホスホネート、ヒドロキシホスファネート、ホスホロセレノアート、セレノホスフェート、ホスホロアミダート、カルボホスホネート、メチルホスホネート、フェニルホスホネート、エチルホスホネート、Ｈ－ホスホネート、グアニジニウム環、トリアゾール環、ボラノホスフェート（ＢＰ）、メチルホスホネート、およびグアニジノプロピルホスホロアミダート。
いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６つのホスホロチオエートを含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも６つのホスホロチオエートを含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも３つのグアニンヌクレオチドおよび少なくとも３つのホスホロチオエートを含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は２’修飾を含む少なくとも６ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも３つのデオキシリボース糖を含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２３個のデオキシリボース糖を含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも２３個のデオキシリボース糖を含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸の３’末端ヌクレオチドはジデオキシアデノシン、ジデオキシシチジン、ジデオキシグアノシン、ジデオキシチミジン、ジデオキシウリジン、または反転デオキシチミジンを含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は第１の修飾されたヌクレオチドおよび第２の修飾されたヌクレオチドを含み、ここで、第１および第２の修飾されたヌクレオチドは異なる構造を含む。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡのポリＡ領域の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％はアデノシンヌクレオチドである。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも２５～５００ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、または少なくとも２００ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは直鎖ｍＲＮＡであり、ここで、直鎖ｍＲＮＡは５’キャップを含む。
いくつかの態様において、５’キャップは７－メチルグアノシンを含む。
いくつかの態様において、５’キャップは、さらに、修飾されたｍＲＮＡの隣接するヌクレオチドに７－メチルグアノシンを接続する１つ以上のリン酸を含む。
いくつかの態様において、５’キャップは３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含む。
いくつかの態様において、５’キャップの１つ以上のリン酸は、以下からなる群から選択される修飾されたリン酸である：ホスホロチオエート、トリアゾール環、ジハロゲンメチレンビスホスホネート、イミド二リン酸、およびメチレンビス（ホスホネート）。
いくつかの態様において、ＲＮＡリガーゼはＴ４ＲＮＡリガーゼである。
いくつかの側面において、本開示は、修飾された非コードＲＮＡを産生する方法を提供し、方法は、ＲＮＡリガーゼの存在下において、１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含むテーリング核酸に、非コードＲＮＡ配列を含む第１のＲＮＡをライゲーションすることを含み、それによって、ＲＮＡリガーゼはＲＮＡの３’ヌクレオチドおよびテーリング核酸の５’ヌクレオチドの間の共有結合を形成して、修飾された非コードＲＮＡを産生する。
いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは、非コードＲＮＡ配列の３’にあるポリＡ領域を含む。
いくつかの態様において、方法は、さらに、リボザイムの存在下において修飾された非コードＲＮＡを環状化することを含み、ここで、修飾された非コードＲＮＡは３’イントロンおよび５’イントロンを含み、ここで、３’イントロンは非コードＲＮＡ配列の５’にあり、ここで、５’イントロンはポリＡ領域の３’にあり、ここで、リボザイムは、３’イントロンの３’にあるヌクレオチドおよび５’イントロンの５’にあるヌクレオチドの間の共有結合を形成して、５’イントロンまたは３’イントロンを含まない環状の非コードＲＮＡを産生し、ここで、ポリＡ領域は非コードＲＮＡの３’および５’ヌクレオチドの間にある。
いくつかの態様において、方法はさらに以下のステップを含む：
（ｉ）修飾された非コードＲＮＡの第１のヌクレオチドに５’末端リン酸基を導入すること；
（ｉｉ）修飾された非コードＲＮＡの１つ以上の３’末端ヌクレオチドを切断して、３’末端ヒドロキシル基を有する修飾された非コードＲＮＡを産生すること；および
（ｉｉｉ）環状化リガーゼの存在下において、ステップ（ｉｉ）で産生された修飾された非コードＲＮＡを環状化すること；
それによって、環状化リガーゼは、修飾された非コードＲＮＡの３’ヌクレオチドおよび修飾された非コードＲＮＡの５’ヌクレオチドの間の共有結合を形成して、環状の修飾された非コードＲＮＡを産生し、ここで、ポリＡ領域は非コードＲＮＡの３’および５’ヌクレオチドの間にある。
いくつかの態様において、テーリング核酸はさらに構造配列の１コピー以上を含む。
いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡはポリＡ領域を含み、非コードＲＮＡ配列および構造配列の１コピー以上の間にある。
いくつかの態様において、方法は、さらに、リボザイムの存在下において修飾された非コードＲＮＡを環状化することを含み、ここで、修飾された非コードＲＮＡは、３’イントロンおよび５’イントロンを含み、ここで、３’イントロンは非コードＲＮＡ配列の５’にあり、ここで、５’イントロンは構造配列の１コピー以上の３’にあり、それによって、リボザイムは、３’イントロンの３’にあるヌクレオチドおよび５’イントロンの５’にあるヌクレオチドの間の共有結合を形成して、５’イントロンまたは’イントロンを含まない環状の非コードＲＮＡを産生し、ここで、構造配列の１コピー以上は環状の非コードＲＮＡのポリＡ領域および非コードＲＮＡ配列の間にある。
いくつかの態様において、方法はさらに以下のステップを含む：
（ｉ）修飾された非コードＲＮＡの第１のヌクレオチドに５’末端リン酸基を導入すること；
（ｉｉ）修飾された非コードＲＮＡの１つ以上の３’末端ヌクレオチドを切断して、３’末端ヒドロキシル基を有する修飾された非コードＲＮＡを産生すること；および
（ｉｉｉ）環状化リガーゼの存在下において、ステップ（ｉｉ）で産生された修飾された非コードＲＮＡを環状化すること；
それによって、環状化リガーゼは、修飾された非コードＲＮＡの３’ヌクレオチドおよび修飾された非コードＲＮＡの５’ヌクレオチドの間の共有結合を形成して、環状の修飾された非コードＲＮＡを産生し、ここで、構造配列の１コピー以上はポリＡ領域および非コードＲＮＡ配列の間にある。
いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは骨格核酸の存在下において環状化され、ここで、骨格核酸は、修飾された非コードＲＮＡとハイブリダイゼーションすることができる核酸であり、ここで、修飾された非コードＲＮＡは、骨格核酸に結合したときに環状の二次構造を形成する。
いくつかの態様において、骨格核酸は以下を含む：
（ａ）５ヌクレオチド以上を含む第１のハイブリダイゼーション配列であって、ここで、第１のハイブリダイゼーション配列は、修飾された非コードＲＮＡの少なくとも最初の五（５）ヌクレオチドに対して相補的である；および
（ｂ）５ヌクレオチド以上を含む第２のハイブリダイゼーション配列であって、ここで、第２のハイブリダイゼーション配列は、修飾された非コードＲＮＡの少なくとも最後の五（５）ヌクレオチドに対して相補的である；
ここで、修飾された非コードＲＮＡの少なくとも最初の五（５）ヌクレオチドは第１のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイゼーションし、修飾された非コードＲＮＡの少なくとも最後の五（５）ヌクレオチドは第２のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイゼーションする。
いくつかの態様において、第１のハイブリダイゼーション配列の最後のヌクレオチドおよび第２のハイブリダイゼーション配列の最初のヌクレオチドは骨格核酸上で隣接し、いずれかの他のヌクレオチドによって離間されない。
いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは以下を含む：
（ｉ）オープンリーディングフレームの５’にある第１のセルフハイブリダイゼーション配列；
（ｉｉ）オープンリーディングフレームの３’にある第２のセルフハイブリダイゼーション配列；
（ｉｉｉ）第１のセルフハイブリダイゼーション配列の５’にある第１の非ハイブリダイゼーション配列；および
（ｉｖ）第２のセルフハイブリダイゼーション配列の３’にある第２の非ハイブリダイゼーション配列、
ここで、第１および第２のセルフハイブリダイゼーション配列は互いとハイブリダイゼーションすることができ、
ここで、第１および第２のセルフハイブリダイゼーション配列は互いとハイブリダイゼーションすることができない。
いくつかの態様において、第１および第２のセルフハイブリダイゼーション配列のハイブリダイゼーションは二次構造を形成し、これにおいて、修飾された非コードＲＮＡの５’末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドは１００Å未満の距離だけ離間される。
いくつかの態様において、５’末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドは９０Å未満、８０Å未満、７０Å未満、６０Å未満、５０Å未満、４０Å未満、３０Å未満、２０Å未満、または１０Å未満の距離だけ離間される
いくつかの態様において、環状化リガーゼはＴ４ＲＮＡリガーゼである。
いくつかの態様において、構造配列はＧ四重鎖配列である。
いくつかの態様において、Ｇ四重鎖はＲＮＡのＧ四重鎖配列である。
いくつかの態様において、ＲＮＡのＧ四重鎖配列は配列番号２の核酸配列を含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は配列番号２の核酸配列の少なくとも３コピーを含む。
いくつかの態様において、Ｇ四重鎖はＤＮＡのＧ四重鎖配列である。
いくつかの態様において、ＤＮＡのＧ四重鎖配列は配列番号３の核酸配列を含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は配列番号３の核酸配列の少なくとも３コピーを含む。
いくつかの態様において、構造配列はテロメアリピート配列である。
いくつかの態様において、テロメアリピート配列は配列番号４の核酸配列を含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は配列番号４の核酸配列の少なくとも３コピーを含む。
いくつかの態様において、構造配列は、相互作用してアプタマーを形成することができる少なくとも２つのヌクレオチドを含むアプタマー配列であり、ここで、アプタマーは、標的分子に結合することができる二次構造である。
いくつかの態様において、ＲＮＡの５’ヌクレオチドは５’末端リン酸基を含まず；
ここで、ＲＮＡの３’ヌクレオチドは３’末端ヒドロキシル基を含み；
ここで、テーリング核酸の５’ヌクレオチドは５’末端リン酸基を含み；
ここで、テーリング核酸の３’ヌクレオチドは３’末端ヒドロキシル基を含まない。
いくつかの態様において、ＲＮＡの５’ヌクレオチドは５’末端ヒドロキシル基を含まず；
ここで、ＲＮＡの３’ヌクレオチドは３’末端リン酸基を含み；
ここで、テーリング核酸の５’ヌクレオチドは５’末端ヒドロキシル基を含み；
ここで、テーリング核酸の３’ヌクレオチドは３’末端リン酸基を含まず；
ここで、ＲＮＡリガーゼはＲｔｃＢリガーゼである。
いくつかの態様において、テーリング核酸のヌクレオチドの少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１６％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％は修飾されたヌクレオチドである。
いくつかの態様において、テーリング核酸の最後の２５ヌクレオチドの少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５個は修飾されたヌクレオチドである。
いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された核酸塩基を含む。
いくつかの態様において、修飾された核酸塩基は以下からなる群から選択される：キサンチン、アリアミノウラシル、アリアミノチミジン、ヒポキサンチン、ジゴキシゲニン化アデニン、ジゴキシゲニン化シトシン、ジゴキシゲニン化グアニン、ジゴキシゲニン化ウラシル、６－クロロプリンリボシド、Ｎ６－メチルアデニン、メチルシュードウラシル、２－チオシトシン、２－チオウラシル、５－メチルウラシル、４－チオチミジン、４－チオウラシル、５，６－ジヒドロ－５－メチルウラシル、５，６－ジヒドロウラシル、５－［（３－インドリル）プロピオンアミド－Ｎ－アリル］ウラシル、５－アミノアリルシトシン、５－アミノアリルウラシル、５－ブロモウラシル、５－ブロモシトシン、５－カルボキシシトシン、５－カルボキシメチルエステルウラシル、５－カルボキシウラシル、５－フルオロウラシル、５－ホルミルシトシン、５－ホルミルウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ヒドロキシウラシル、５－ヨードシトシン、５－ヨードウラシル、５－メトキシシトシン、５－メトキシウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－プロパルギルアミノシトシン、５－プロパルギルアミノウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、６－アザシトシン、６－アザウラシル、６－クロロプリン、６－チオグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノアデニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、８－アザアデニン、８－アジドアデニン、８－クロロアデニン、８－オキソアデニン、８－オキソグアニン、アラアデニン、アラシトシン、アラグアニン、アラウラシル、ビオチン－１６－７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、ビオチン－１６－アミノアリルシトシン、ビオチン－１６－アミノアリルウラシル、シアニン３－５－プロパルギルアミノシトシン、シアニン３－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン３－アミノアリルシトシン、シアニン３－アミノアリルウラシル、シアニン５－６－プロパルギルアミノシトシン、シアニン５－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン５－アミノアリルシトシン、シアニン５－アミノアリルウラシル、シアニン７－アミノアリルウラシル、ダブシル－５－３－アミノアリルウラシル、デスチオビオチン－１６－アミノアリル－ウラシル、デスチオビオチン－６－アミノアリルシトシン、イソグアニン、Ｎ１－エチルシュードウラシル、Ｎ１－メトキシメチルシュードウラシル、Ｎ１－メチルアデニン、Ｎ１－メチルシュードウラシル、Ｎ１－プロピルシュードウラシル、Ｎ２－メチルグアニン、Ｎ４－ビオチン－ＯＢＥＡ－シトシン、Ｎ４－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｏ６－メチルグアニン、シュードイソシトシン、シュードウラシル、チエノシトシン、チエノグアニン、チエノウラシル、キサントシン、３－デアザアデニン、２，６－ジアミノアデニン、２，６－ジアミノ（damino）グアニン、５－カルボキサミド－ウラシル、５－エチニルウラシル、Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｉ６Ａ）、２－メチル－チオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン（ｍ６２Ａ）、およびＮ６－アセチルアデニン（ａｃ６Ａ）。
いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された糖を含む。
いくつかの態様において、修飾された糖は以下からなる群から選択される：２’－チオリボース、２’，３’－ジデオキシリボース、２’－アミノ－２’－デオキシリボース、２’デオキシリボース、２’－アジド－２’－デオキシリボース、２’－フルオロ－２’－デオキシリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、２’－Ｏ－メチルデオキシリボース、３’－アミノ－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－アジド－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－デオキシリボース、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－２’－デオキシリボース、３’－Ｏ－メチルリボース、５’－アミノリボース、５’－チオリボース、５－ニトロ－１－インドリル－２’－デオキシリボース、５’－ビオチン－リボース、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン連結、２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノ連結リボース、および２’－Ｏ，４’－Ｃ－チオ連結リボース。
いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは２’修飾を含む。
いくつかの態様において、２’修飾は以下からなる群から選択される：ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾（すなわち、リボースの２’酸素および４’炭素に結合した追加の炭素原子を含むヌクレオチド）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、および２’－Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）。
いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾されたリン酸を含む。
いくつかの態様において、修飾されたリン酸は以下からなる群から選択される：ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホロジチオエート、チオリン酸、５’－Ｏ－メチルホスホネート、３’－Ｏ－メチルホスホネート、５’－ヒドロキシホスホネート、ヒドロキシホスファネート、ホスホロセレノアート、セレノホスフェート、ホスホロアミダート、カルボホスホネート、メチルホスホネート、フェニルホスホネート、エチルホスホネート、Ｈ－ホスホネート、グアニジニウム環、トリアゾール環、ボラノホスフェート（ＢＰ）、メチルホスホネート、およびグアニジノプロピルホスホロアミダート。
いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６つのホスホロチオエートを含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも６つのホスホロチオエートを含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも３つのグアニンヌクレオチドおよび少なくとも３つのホスホロチオエートを含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は２’修飾を含む少なくとも６ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも３つのデオキシリボース糖を含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２３個のデオキシリボース糖を含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも２３個のデオキシリボース糖を含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸の３’末端ヌクレオチドはジデオキシアデノシン、ジデオキシシチジン、ジデオキシグアノシン、ジデオキシチミジン、ジデオキシウリジン、または反転デオキシチミジンを含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸は第１の修飾されたヌクレオチドおよび第２の修飾されたヌクレオチドを含み、ここで、第１および第２の修飾されたヌクレオチドは異なる構造を含む。
いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡのポリＡ領域の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％はアデノシンヌクレオチドである。
いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも２５～５００ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、または少なくとも２００ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、ＲＮＡリガーゼはＴ４ＲＮＡリガーゼである。
いくつかの側面において、本開示は、本願において提供される方法のいずれか１つによって産生される修飾されたｍＲＮＡを提供する。
いくつかの態様において、ｍＲＮＡは抗原または治療薬蛋白質をコードする。
いくつかの態様において、抗原はウイルス抗原、細菌抗原、原生動物抗原、または真菌抗原である。
いくつかの態様において、治療薬蛋白質は酵素、転写因子、細胞表面受容体、成長因子、または凝固因子である。
いくつかの態様において、オープンリーディングフレームは細胞における発現のためにコドン最適化される。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化される。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡはヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。
いくつかの側面において、本開示は、本願において提供される方法のいずれか１つによって産生される修飾された非コードＲＮＡを提供する。
いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）、または長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である。
いくつかの側面において、本開示は、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡのいずれか１つを含む脂質ナノ粒子を提供する。
いくつかの側面において、本開示は、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡのいずれか１つを含む細胞を提供する。
いくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞である。
いくつかの態様において、細胞はヒト細胞である。
いくつかの側面において、本開示は、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡ、修飾された非コードＲＮＡ、脂質ナノ粒子、または細胞のいずれかを含む組成物を提供する。
いくつかの側面において、本開示は、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡ、修飾された非コードＲＮＡ、脂質ナノ粒子、または細胞のいずれかと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
いくつかの側面において、本開示は、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡ、修飾された非コードＲＮＡ、または脂質ナノ粒子のいずれかを細胞に導入することを含む方法を提供する。
いくつかの側面において、本開示は、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡ、修飾された非コードＲＮＡ、脂質ナノ粒子、細胞、または組成物のいずれかを対象に導入することを含む方法を提供する。
いくつかの側面において、本開示は、対象にワクチン接種する方法を提供し、方法は、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡ、脂質ナノ粒子、細胞、または組成物のいずれかを対象に導入することを含み、ここで、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームは抗原をコードする。
いくつかの側面において、本開示は、対象において酵素を補充する方法を提供し、方法は、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡ、脂質ナノ粒子、細胞、または組成物のいずれかを対象に導入することを含み、ここで、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームは酵素をコードする。
いくつかの側面において、本開示は、対象のゲノムを改変する方法を提供し、方法は、本願において提供される修飾された非コードＲＮＡまたは組成物のいずれかを対象に導入することを含む。
いくつかの態様において、対象は哺乳動物である。
いくつかの態様において、対象はヒトである。
いくつかの側面において、本開示は、医薬としての使用のための、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡ、修飾された非コードＲＮＡ、脂質ナノ粒子、細胞、または組成物のいずれかを提供する。
いくつかの側面において、本開示は、本願において提供される方法のいずれかのＲＮＡおよびテーリング核酸を含むキットを提供する。
いくつかの態様において、キットはさらにＲＮＡリガーゼを含む。
いくつかの側面において、本開示は、本願において提供される医薬組成物のいずれかと送達デバイスとを含むキットを提供する。
いくつかの側面において、本開示は、以下を含む修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを精製するための方法を提供する：修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを含む混合物を精製媒体と接触させ、ここで、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは精製媒体と相互作用して、修飾されたＲＮＡ－精製媒体コンジュゲートを形成すること、修飾されたＲＮＡ－精製媒体コンジュゲートを混合物から分離すること、および修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを、修飾されたＲＮＡ－精製媒体コンジュゲートから溶媒によって溶出すること。
いくつかの態様において、精製媒体は常磁性ビーズを含む。
図１は、ｍ６Ａｍ、ｍ１Ａ、シュードウリジン、ｍ６Ａ、ｍ７Ｇ、ａｃ４Ｃ、Ｎｍ、およびｍ５Ｃを包含する天然に生起する修飾されたヌクレオシドの構造を示す。これらは、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾されたｍＲＮＡを作る方法に用いられ得る。
図２Ａは、修飾された直鎖ｍＲＮＡ（設計Ａ）および修飾された環状ｍＲＮＡ（設計Ｂ）の設計を示す。中実の丸は、蛋白質産生を改善するオープンリーディングフレーム上の修飾されたヌクレオチドを表す。中空の丸は、ＲＮＡ安定性を改善するポリ（Ａ）領域上の修飾されたヌクレオチドを表す。図２Ｂは典型的なｍＲＮＡ上の要素の配置を示し、これは、５’から３’の順序で、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ、およびポリＡテールを含有する。
図３は、未修飾のｍＲＮＡに対して相対的に、修飾されたｍＲＮＡからの蛋白質産生の相対的効率に関するデータを示す。緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をコードする修飾されたｍＲＮＡが合成され、ポリ（Ａ）テールを追加するためにポリアデニル化された。ポリアデニル化反応は、指示されている通り、限定された量（５％または２５％）の修飾されたアデノシン三リン酸を包含した。ｍＣｈｅｒｒｙをコードする未修飾のｍＲＮＡが合成され、古典的なヌクレオチドを用いてポリアデニル化された。修飾されたおよび未修飾のｍＲＮＡの混合物が細胞にトランスフェクションされ、ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙの比がトランスフェクション後の第１～３日に測定された。
図４Ａは、コード配列を変調しないままで残す特定のポリ（Ａ）テール修飾に用いられる実験スキームの概観を示す。細胞のエキソヌクレアーゼはポリ（Ａ）テールを脱アデニル化するが、ポリ（Ａ）ポリメラーゼによる修飾されたヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）のランダムな組み込みは、ｍＲＮＡ（配列番号１）の３’端の分解を低速化し得る。図４Ｂは、ｍＲＮＡの３’端における化学的に定まった構造の設置に用いられる実験スキームの概観を示す。定まった組成を有する化学合成オリゴヌクレオチドが、鋳型によってコードされるポリ（Ａ）配列を含有するＧＦＰをコードするｍＲＮＡの３’端にライゲーションされた。化学合成オリゴヌクレオチドのライゲーションは、非天然のヌクレオチド間連結部の産生と各ｍＲＮＡの端への定まった数量の修飾されたヌクレオチドの組み込みとを許した。
図５は、修飾されたｍＲＮＡによってコードされたＧＦＰの存在量の棒グラフを示す。未修飾のｍＲＮＡによってコードされたｍＣｈｅｒｒｙの存在量に対して正規化された。ＨｅＬａ細胞への両方のｍＲＮＡのトランスフェクションの２４、４８、および７２時間後。平均＋／－ＳＤ。Ｐ値は、対応のないｔ検定によって、一貫したＳＤを仮定することなしに、Graphpad Prism 7.01によって計算された。＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．００００１。
図６Ａは、いくつかのＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオチドにライゲーションされたｍＲＮＡに対するＲＮａｓｅＨ活性を示す代表的なＲＮａｓｅＨアッセイを示す。方法の項に記載される通り、ライゲーションはインビトロ転写されたｍＲＮＡに対して行われ、これはそれからAMPureビーズクリーンアップによって精製された。全てのサンプルは、別個のゲルによってインテグリティについてキャラクタリゼーションされた。ゲル上の示されているサンプルは、全て、方法の項に記載されるＲＮａｓｅＨアッセイプロトコールを用いて処置された。示されているラダーは４００ｎｇのCentury－PlusＲＮＡマーカーである。図６Ｂは、ライゲーションにおける基質として用いられた選ばれたＲＮＡ／ＤＮＡオリゴに対して行われたＥ．コーライＲＮａｓｅＲ消化アッセイを示す。鎖終結ヌクレオチドはＲＮａｓｅＲ消化を防止しないが、２３個のデオキシアデノシンヌクレオチドおよび末端ジデオキシシチジンを含有するｍＲＮＡは、ＲＮａｓｅＲ分解に対するロバストな安定性を見せた。ラダーは、左に列記されている長さを有するｓｓＤＮＡプライマーを含有する。
図７Ａは、ライゲーションに用いられる合成オリゴの化学修飾および構造の概観とともに、メッセンジャー－オリゴヌクレオチドコンジュゲート化ＲＮＡ（ｍｏｃＲＮＡ）合成の概略図を示す。定まった組成を有する化学合成オリゴが、翻訳可能なｍｏｃＲＮＡを産生するために、鋳型によってコードされる６０ｎｔポリ（Ａ）配列を含有するヒト化モンスター緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）ｍＲＮＡ（ＧＦＰ－６０Ａ）の３’端にライゲーションされた。 図７Ｂは、ｍｏｃＲＮＡのライゲーション反応効率を定量するために用いられるＲＮａｓｅＨアッセイの概略図を示す。ライゲーションに用いられたオリゴヌクレオチドは３０ｎｔであった。ＤＮＡプローブは、プローブの５’端がポリ（Ａ）テールの１０６ｎｔ上流にあるようにして、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲを標的化する。これは５’ｍＲＮＡ断片（８２４ｎｔ）および３’ｍＲＮＡ断片（未ライゲーションｍＲＮＡでは６０ｎｔポリ（Ａ）テールを包含する１６６ｎｔ；ライゲーションされたｍＲＮＡでは～２００ｎｔ）を生成する。３’切断産物はライゲーションによって変性ゲル上でバンドシフトを呈示する。Ｍ、マーカーのCentury－PlusＲＮＡマーカー。
図８Ａは、トランスフェクションの２４時間、４８時間、および７２時間後の、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光シグナルおよびモックライゲーション対照に対して正規化されたＧＦＰ蛍光シグナルの棒グラフを示す。灰色の破線、ｙ＝１。平均±ｓ．ｄ。ｎ視野（ＦＯＶ）がそれぞれのバーの下に指示されている。各条件は少なくとも３つの生物学的レプリケートを有し、それらの４つのＦＯＶがそれぞれからイメージングされた。Ｐ値は、通常の二元配置ＡＮＯＶＡ（ダネットの多重比較検定、時点間の平均の比較）によって、サンプル２９ｒＡ＿ｄｄＣとの多重比較によって計算された。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 図８Ｂは、ＨｅＬａ細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光、ＧＦＰ蛍光、およびヘキスト核染色の代表的な別個のおよびオーバーレイの画像を示す。同じ共焦点イメージング設定において、指示されているＲＮＡコンストラクトのトランスフェクションの４８時間後。スケールバー２５μｍ。 図８Ｃは、トランスフェクションの４８時間後の、バルクのＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙＲＮＡ比（ＲＴ－ｑＰＣＲ、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、表７をもまた参照）およびバルクＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光比（平均±ｓ．ｄ．）の平均の相関を示す。 図８Ｄは、ＨｅＬａ細胞におけるインサイチュのＧＦＰＲＮＡおよびｍＣｈｅｒｒｙＲＮＡを表すＳＴＡＲｍａｐアンプリコンの代表的な画像を示す。指示されているｍＲＮＡベクターによるトランスフェクションの４８時間後に固定され、同じ共焦点イメージング設定においてアクイジションされた。核がＤＡＰＩ染色によって指示されている。共局在したＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙアンプリコン（差し込み図に示されている；右カラム）は可能性として脂質トランスフェクションベシクルであり（白色の矢印）、それゆえにＲＮＡ種の下流ＳＴＡＲｍａｐ定量からは排除した。
図９Ａは、タグなしのルシフェラーゼと比較されたホタルルシフェラーゼ－デグロンの速度論的キャラクタリゼーションを示す。各蛋白質をコードするｍＲＮＡがＨｅＬａ細胞にトランスフェクションされ、これらはシクロヘキシミド（ＣＨＸ）によって時間＝０に処置された。もたらされた相対的な発光単位（ＲＬＵ）が、蛋白質の減衰半減期を概算するためにＣＨＸ処置後に２時間インターバルで細胞において測定された。図９Ｂは、モックライゲーションシグナルに対して正規化されたホタルルシフェラーゼ－デグロンＲＬＵを示す（トランスフェクションの８時間後）。各時点における対応する正規化されたホタルＲＬＵ値が、有意性について、通常の一元配置ＡＮＯＶＡ検定を用いて、モックライゲーションと比較して、各時点について検定された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図９Ｃは、ｍｏｃＲＮＡをトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞からの２４、４８、および７２時間時点に取られた代表的なＳＴＡＲｍａｐ画像（チャンネルオーバーレイ）を示す。画像は、各視野から得られたＺスタックからシングルスライスとして取られた。モックライゲーション２４時間サンプルにおける白色の矢印は、代表的なトランスフェクションベシクルを示す（大きいサイズのかつオーバーラップするＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙシグナルの領域）。灰色の斑点はＧＦＰｍＲＮＡまたはｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡを指示する。核がＤＡＰＩ染色によって指示されている。画像コントラストはImageJにおいて画像間で等しく調整された。 図９Ｄは、ｍｏｃＲＮＡをトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞におけるＳＴＡＲｍａｐｍＲＮＡカウントおよび定量のタイムコースを示す。ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡ種がカウントされ、大きい凝集体（すなわちトランスフェクションベシクル）の排除をしている。各実験条件について３つの生物学的レプリケート。４つのＦＯＶが各サンプルから取られている。バイオリンプロットの要素：線、下側の／上側の隣接値；バー、四分位範囲；白色のドット、メジアン。単一細胞数が対応する分布の上に列記されている。統計検定は、ウェルチのｔ検定を用いて２９ｒＡ＿ｄｄＣと比較して各それぞれの時点において行われている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
図１０Ａは、修飾されたヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）の組み込みによってｍＲＮＡエキソおよびエンドヌクレアーゼ耐性を増大させるための一般的な化学的戦略の概略図を示す。Ｘ、修飾されたヌクレオシド。図１０Ｂは、Ｅ－ＰＡＰおよびＩＶＴスパイクイン反応に用いられたアデノシン－５’－Ｏ（１－チオ三リン酸）（Ｓ－ＡＴＰ）の化学構造を示す。アルファリン酸の硫黄修飾は、ＲＮＡに組み込まれたときには、ホスホロチオエート（ＰＳ）連結部（図７Ｂに示されている）と同一である。 図１０Ｃは、ｍＲＮＡ上へのホスホロチオエート（ＰＳ）連結部の組み込みの異なる戦略を図示する概略図を示す。アデノシン－５’－Ｏ－（１－チオ三リン酸）（Ｓ－ＡＴＰ）のＲＮＡポリメラーゼ（すなわち、共転写的）およびポリ（Ａ）ポリメラーゼ組み込みが、ｍＲＮＡ上にヌクレアーゼ耐性のＰＳ連結部を設置するために用いられた。差し込み図：ｍＲＮＡの長さ分布に対する各修飾戦略の効果を示す変性ゲル。灰色のＡ：化学修飾されたアデノシン、黒色のＡ：未修飾のアデノシン。Ｍ、マーカーのCentury－PlusＲＮＡマーカー。 図１０Ｄは、種々の戦略が生成した修飾されたＧＦＰｍＲＮＡからのＧＦＰ蛋白質存在量の棒グラフを示す。ＨｅＬａ細胞へのトランスフェクション後の各時点（２４時間、４８時間、および７２時間）におけるｍＣｈｅｒｒｙおよび無処置のｍＲＮＡ対照の平均に対して正規化された。平均±ｓ．ｄ．；ｎ、ＦＯＶの数がそれぞれのバーの下に指示されている。各条件は少なくとも３つの生物学的レプリケートからなり、それらの４つのＦＯＶがそれぞれからイメージングされた。破線：ｙ＝１。図中で指定されない限り、Ｐ値は、通常の二元配置ＡＮＯＶＡ（ダネットの多重比較検定、時点間の平均の比較）によって、無処置のｍＲＮＡとの多重比較によって計算されている。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
図１１Ａは、トランスフェクションの２４時間および４８時間後のニューロンにおけるｍＣｈｅｒｒｙおよび「無処置の」対照に対して正規化されたＧＦＰ蛋白質存在量の棒グラフを示す。平均±ｓ．ｄ．、ｎ（ＦＯＶ）＝１８。各条件は少なくとも３つの生物学的レプリケートからなり、それらの６つのＦＯＶ／スタックがそれぞれからイメージングされた。灰色の破線：ｙ＝１。Ｐ値は、通常の二元配置ＡＮＯＶＡ（ダネットの多重比較検定）によって、無処置のサンプルと比較して、各別個の時点について計算された。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。図１１Ｂは、トランスフェクションの２４時間後のニューロンにおけるＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の代表的な画像を示す。同じ共焦点顕微鏡法設定でイメージングされている。核がヘキスト染色によって指示されている。スケールバー２５μｍ。
図１２は代表的なＲＮａｓｅＨアッセイを示し、ＩＶＴのＧＦＰ－６０ＡｍＲＮＡおよび合成オリゴのライゲーションによって調製されたｍｏｃＲＮＡベクターを示す。ＤＮＡプローブは、プローブの５’端がポリ（Ａ）テールの１０６ｎｔ上流にあるようにしてｍＲＮＡの３’ＵＴＲを標的化する。これは５’ｍＲＮＡ断片（８２４ｎｔ）および３’ｍＲＮＡ断片（６０ｎｔポリ（Ａ）を包含する１６６ｎｔ、レーン１＆２）を生成する。３’切断産物はライゲーションによって変性ゲル上でバンドシフトを呈示する。Ｍ、Century－PlusＲＮＡマーカーであるマーカー。ライゲーションされたおよび未ライゲーションのテールは然るべく標識されている。
図１３Ａは、指示されているｍＲＮＡベクターによってトランスフェクションされた２４時間、４８時間、および７２時間後のＨｅＬａ細胞におけるＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光比（ｌｎ［１＋比］）の単一細胞定量のバイオリンプロットを示す。バイオリンプロットの要素：線、下側の／上側の隣接値；バー、四分位範囲；白色のドット、メジアン；ｎは括弧内に指示されている。Ｐ値は、ウェルチのｔ検定（対応のない両側）によって、対照としてのサンプル２９ｒＡ＿ｄｄＣと比較して計算されている。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 図１３Ｂは、lipofectamineによって媒介されるトランスフェクションの４８時間後のＨｅＬａ細胞におけるＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙＲＮＡのＳＴＡＲｍａｐキャラクタリゼーションの代表的な画像スタック最大値投影を示す。lipofectamineによって媒介されるベシクルにトラップされたＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡ種は、オーバーラップして見え、大きいマージしたフォーカスを形成した。ベシクルから放出されたｍＲＮＡ種はサイトゾル中の個々のドットとして見えた。それぞれが単一のｍＲＮＡ分子を表す。スケールバー２０μｍ。 図１３Ｃは、ＳＴＡＲｍａｐによって定量されたＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡコピー数（アンプリコン）の単一細胞分析を示す。バイオリンプロットの要素：線、下側の／上側の隣接値；バー、四分位範囲；白色のドット、メジアン。括弧内は細胞の数。灰色の破線、サンプル２９ｒＡ＿ｄｄＣのメジアン。Ｐ値は、ウェルチのｔ検定（対応のない両側）によって、対照としてのサンプル２９ｒＡ＿ｄｄＣと比較して計算されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 図１３Ｄは、トランスフェクションの４８時間後の単一細胞ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙＲＮＡ比および単一細胞ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光比のメジアンの相関を示す。
図１４Ａは、長さを調整されたＰＳ＋Ｇ４オリゴ（２６ｒＡ＿Ｇ４＿Ｃ９ｏｒｆ７２＿ＲＮＡ＿６ｘＳｒＧ、２６ｒＡ＿Ｇ４＿Ｃ９ｏｒｆ７２＿ＤＮＡ＿６ｘＳＧ、および２６ｒＡ＿Ｇ４＿ｔｅｌｏ＿ＤＮＡ＿６ｘＳＧ）にライゲーションされたＧＦＰ－６０ＡｍｏｃＲＮＡを示す。蛍光タイムコース測定が、ｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡ内部対照と併せてＨｅＬａ細胞へのＧＦＰｍｏｃＲＮＡのトランスフェクションの後に行われた。各サンプルのもたらされたＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光値は、さらに、各時点における６ｘＳｒ（ＡＧ）についての平均値に対して正規化された。統計検定は通常の二元配置ＡＮＯＶＡ（ダネットの多重比較検定、時点間の平均の比較）を用いて行われ、比較は６ｘＳｒ（ＡＧ）に対して行われた。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 図１４Ｂはホタル－ＰＥＳＴｍｏｃＲＮＡコンストラクトのインビトロ翻訳を示す。ウサギ網状赤血球ライセートが、未修飾の内部ウミシイタケルシフェラーゼ対照と併せてホタル－ＰＥＳＴｍｏｃＲＮＡコンストラクトのためのインビトロ翻訳系として用いられた。ホタルＲＬＵ／ウミシイタケＲＬＵが各反応から測定されて、異なるｍｏｃＲＮＡによって提供される翻訳向上の可能なモードを比較した。統計検定は一元配置ＡＮＯＶＡ（ノンパラメトリック、クラスカル・ウォリス、ダンの多重比較検定）を用いて行われ、比較は「モックライゲーション」サンプルに対してなされた。＊Ｐ＜０．０５。図１４Ｃは、ホタル－デグロンをコードするｍｏｃＲＮＡコンストラクトの速度論的キャラクタリゼーションを示す。トランスフェクションの８時間後のモックライゲーション値に対して正規化されたウミシイタケ（内部対照）ＲＬＵ。各時点における対応するｍｏｃＲＮＡ値が、有意性について、一元配置ＡＮＯＶＡ（クラスカル・ウォリス検定、ダンの多重比較検定）を用いて、モックライゲーションと比較して検定された。内部対照シグナルは、異なるサンプル間で一貫しているように見えた。
図１５は、Ｅ．コーライポリ（Ａ）ポリメラーゼ（Ｅ－ＰＡＰ）によるポリ（Ａ）テーリングに付されたＧＦＰｍＲＮＡを示し、様々な量の化学修飾されたＡＴＰ誘導体がスパイクインされている。テール修飾されたＧＦＰｍＲＮＡが、テール未修飾のｍＣｈｅｒｒｙトランスフェクション対照（Ｅ－ＰＡＰテーリング、１００％ＡＴＰ）と併せてＨｅＬａ細胞にトランスフェクションされた。バーは、各対応する時点における１００％ＡＴＰのＥ－ＰＡＰテーリングされたＧＦＰｍＲＮＡサンプルの平均によって正規化されたＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を表す。パーセンテージは、各反応における修飾されたおよび未修飾のＡＴＰの間の用いられた相対的モル比を指示する。化学修飾されたＧＦＰｍＲＮＡが、未修飾のｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡと共トランスフェクションされ、もたらされたＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光比が、ＨｅＬａ細胞培養物におけるトランスフェクションの２４、４８、および７２時間後に測定された。ＡＴＰ：アデノシン５’三リン酸；ｍ６ＡＴＰ：Ｎ６－メチルアデノシン５’三リン酸；２’－Ｏ－ｍｅＡＴＰ：２’Ｏ－メチルアデノシン－５’－三リン酸；Ｓ－ＡＴＰ：アデノシン－５’－Ｏ－（１－チオ三リン酸）；ｄＡＴＰ：２’－デオキシアデノシン５’－三リン酸；アミノｄＡＴＰ：２’－アミノ－２’－デオキシアデノシン－５’－三リン酸。平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝４。灰色の破線：ｙ＝１。Ｐ値は通常の二元配置ＡＮＯＶＡ（ダネットの多重比較検定、時点間の平均の比較）によって計算され、比較がＥ－ＰＡＰテーリング（１００％ＡＴＰ）に対して行われている。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
図１６Ａは図８の共焦点顕微鏡法画像からのＨｅＬａ細胞数の定量を示す。ヘキスト染色された核がCellProfilerにおいてセグメンテーションされ、各視野（ＦＯＶ）の細胞数が各ｍｏｃＲＮＡ条件および時点について計算された。細胞数はあらゆる時点においてモックライゲーション条件についての平均細胞数に対して正規化された。比較は、「ライゲーションなし」サンプルに対して、通常の二元配置ＡＮＯＶＡ（ダネットの多重比較検定、時点間の平均の比較）を用いて行われた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 図１６Ｂは、トランスフェクションされたＨｅＬａ細胞における自然免疫応答のＲＴ－ｑＰＣＲ定量を示す。各ＧＦＰ－６０ＡライゲーションコンストラクトによってトランスフェクションされたサンプルにおけるＩＦＮＢ１ｍＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ。ヒトＡＣＴＢｍＲＮＡに対して正規化され、モックライゲーションサンプルに対して再び正規化されている。値は、さらに、有意性検定およびグラフ化に先立ってｌｏｇ１０変換された。各条件は少なくとも３つの生物学的レプリケートからなり、生物学的サンプルあたり３つの技術的レプリケートによる。３つの技術的レプリケートの平均（各生物学的条件について）が、各データ点が特定の生物学的レプリケートに対応するようにして個々の点として示されている（生物学的レプリケートの平均＋ｓ．ｅ．ｍ）。未修飾のＧＦＰｍＲＮＡは、Ｎ１－メチルシュードウリジン置換なしのＩＶＴのｈＭＧＦＰｍＲＮＡ（Ｅ－ＰＡＰポリ（Ａ）テーリング）を言う（すなわち、１００％ウリジンを含有する）。Ｌｏｇ１０正規化されたサンプルが、有意性について、ウェルチのｔ検定（対応のない両側パラメトリック）を用いて分析された。サンプルはペアワイズ比較のために２９ｒＡ＿ｄｄＣｍｏｃＲＮＡを参照とした。各条件に用いられた生物学的レプリケートの数（ｎ）が対応するサンプルの上の括弧内に指示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図１６Ｃは、ｍｏｃＲＮＡトランスフェクションから決定された死んだラット皮質ニューロンの割合を示す。初代ラット皮質ニューロン培養物が、２５０ｎｇのｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡ内部対照とともに、２５０ｎｇのＧＦＰ－６０ＡｍｏｃＲＮＡによってトランスフェクションされた。細胞は、それから、トランスフェクションの２４または４８時間後に、生きているおよび死んだ核を染色するためのヘキストならびに死んだ核を染色するためのNucRed Dead（６４７）を用いて、イメージングされた。トータルに対する死んだ核の相対的な数が、各トランスフェクション条件における死細胞パーセンテージを提供するために計算された。５０ｎｇにおけるポリ（Ｉ：Ｃ）が毒性についての正の対照として用いられた。比較は、通常の二元配置ＡＮＯＶＡ（ダネットの多重比較検定、時点間の平均の比較）を用いて、トランスフェクションのみサンプルと比較して行われた。＊＊Ｐ＜０．０１。
図１７は、「モックライゲーション」サンプル値の平均に対して正規化された７２時間のホタルＲＬＵ／ウミシイタケＲＬＵを示す。各条件についてｎ＝９、ただし２９ｒＡ＿ｄｄＣについてはｎ＝１８による。これは、３つの生物学的レプリケート×３つの技術的レプリケート（生物学的レプリケートあたり）、または２９ｒＡ＿ｄｄＣでは６つの生物学的レプリケート×３つの技術的レプリケートに対応する。ｍｏｃＲＮＡコンストラクトが、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを用いて調製された。ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（２５０ｎｇ）および未ライゲーションウミシイタケルシフェラーゼｍＲＮＡ（２５０ｎｇ）が、ＨｅＬａ細胞に、Lipofectamine MessengerMax（ＬＭＲＮＡ００１）を用いて、製造者のプロトコールに従って共トランスフェクションされた。ＨｅＬａ細胞が６時間インキュベーション後に再播種され、発光がPromega Dual－Gloルシフェラーゼアッセイ系（Ｅ２９２０）を用いてトランスフェクションの７２時間後に測定された。
図１８Ａはインビボ生物発光イメージングの実験手続きを示す。無処置のまたは６ｘＳｒ（ＡＧ）＿ｉｎｖｄＴコンジュゲート化されたホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（２μｇ）が、左大腿または右大腿どちらかに、in vivo－jetRNA（Polyplus：１０１００００１３）を用いて、製造者のプロトコールに従って筋肉内注射された。ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ、VivoGlo（商標））がｍＲＮＡ注射の６時間後に腹腔内注射された。１５分後に、インビボ生物発光イメージングが行われた。「ｕｇ」はμｇを言う。図１８Ｂは、インビボ生物発光が３分の露出時間で測定されたということを示す。無処置のおよび６ｘＳｒ（ＡＧ）＿ｉｎｖｄＴコンジュゲート化されたホタルルシフェラーゼｍＲＮＡの注射の側は画像の下部に指示されている。 図１８Ｃは、無処置のまたは６ｘＳｒ（ＡＧ）＿ｉｎｖｄＴコンジュゲート化されたホタルルシフェラーゼｍＲＮＡによって産生されたインビボの生物発光の統計結果を示す。＊ｐ＜０．０５、対応のあるＴ検定。
細胞における安定性を改善するおよびそれによって蛋白質産生を向上させるためのｍＲＮＡのポリＡテール上のまたはその下流の修飾されたヌクレオチドおよび／または構造的特徴を有する修飾されたｍＲＮＡが、本願において提供される。修飾されたｍＲＮＡを作る方法もまた提供され、ｍＲＮＡの３’末端にテーリング核酸をライゲーションして、ライゲーションによって産生される修飾されたｍＲＮＡの３’に定まった数の修飾された核酸または構造配列を導入することによる。加えて、本開示は、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡの１つ以上を含む医薬組成物と、本願に記載される修飾されたｍＲＮＡを産生するための試薬を含有するキットとを提供する。従来のｍＲＮＡは、３’端に複数のアデノシンヌクレオチドを有するポリＡテールを含み、これは３’ヌクレオチドを除去する細胞のエキソヌクレアーゼによって分解され得る。ひとたびエキソヌクレアーゼがポリＡテールを除去し、オープンリーディングフレームのヌクレオチドを除去し始めると、ｍＲＮＡは、コードされる蛋白質に翻訳される能力がない。細胞におけるｍＲＮＡ安定性の一次的な決定因子の１つはポリＡテールを分解するために要求される時間であるので、３’エキソヌクレアーゼ活性に対してより耐性であるｍＲＮＡは、より低速で分解される。本開示の修飾されたｍＲＮＡはより長い半減期を有し、それゆえに細胞においてより安定である。ｍＲＮＡが細胞においてより安定であるほど、それは分解されることにより長くかかるであろう。それゆえに、より多くの蛋白質が、より長い半減期を有する所与のＲＮＡ分子から翻訳され得る。ｍＲＮＡの核酸塩基、糖、および／またはリン酸連結部に１つ以上の構造的変更を含有する修飾されたヌクレオチドは、３’エキソヌクレアーゼ活性に干渉し、ｍＲＮＡをより安定にし得る。しかしながら、３’エキソヌクレアーゼを阻害する同じ構造修飾は、それらをポリＡテール上に組み込むポリアデニル化酵素の能力にもまた干渉し、従来のポリアデニル化法によるポリＡテールへの修飾されたヌクレオチドの追加を妨害し得る。驚くべきことに、既存のポリＡテールを含有するｍＲＮＡの３’端に、たった３つの修飾されたヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドをライゲーションすることは、ｍＲＮＡ安定性の著しい改善をもたらした。エキソヌクレアーゼが３’末端ヌクレオチドにアクセスすることを防止するＧ四重鎖またはアプタマーなどの二次構造を形成することができる構造配列を含有するオリゴヌクレオチドのライゲーションもまた、かかる二次構造なしのＲＮＡに対して相対的にｍＲＮＡ安定性を著しく改善した。複数のクラスの修飾されたヌクレオチドおよび構造配列は、単独でおよび互いとの組み合わせでの両方で、３’末端に追加されたときにｍＲＮＡの安定性を増大させ、ｍＲＮＡのポリＡテールを修飾してエキソヌクレアーゼ活性を妨害することが、修飾されたｍＲＮＡの産生において幅広い実用性を提供するということを示唆した。細胞における増大した安定性と、それゆえに所与のＲＮＡ分子からより多くのコードされる蛋白質を産生する能力とを有する修飾されたｍＲＮＡは、ワクチンおよび他のＲＮＡに基づく治療、例えば必須酵素、凝固因子、転写因子、または細胞表面受容体をコードするｍＲＮＡの送達における使用にとって有用である。
定義
本願において用いられる「メッセンジャーＲＮＡ」（「ｍＲＮＡ」）は、蛋白質をコードするオープンリーディングフレームとポリＡ領域とを含む核酸を言う。ｍＲＮＡは、オープンリーディングフレームの５’（上流）にある５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）およびオープンリーディングフレームの３’（下流）にある３’非翻訳領域をもまた含み得る。
本願において用いられる「蛋白質をコードするオープンリーディングフレーム」は、オープンリーディングフレームが翻訳されるときに蛋白質の産生に至るコード配列を含む核酸配列を言う。核酸配列はＲＮＡ配列でもまたあり得る。このケースでは、ＲＮＡ配列の翻訳は、蛋白質のアミノ酸配列を有するポリペプチドを産生する。核酸配列はＤＮＡ配列であり得る。このケースでは、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ配列を用いて、ＤＮＡ配列に対して相補的であるＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子を転写し、ＲＮＡ配列の翻訳が、蛋白質のアミノ酸配列を有するポリペプチドを産生するときに、蛋白質は産生される。オープンリーディングフレームは、典型的には、スタートコドン、例えばＲＮＡ配列上のＡＵＧ（ＤＮＡ配列ではＡＴＧ）で始まり、ストップコドン、例えばＲＮＡ配列上のＵＡＧ、ＵＡＡ、またはＵＧＡ（ＤＮＡ配列ではＴＡＧ、ＴＡＡ、またはＴＧＡ）で終わり、スタートコドンのＧおよびストップコドンのＴまたはＵの間の塩基の数は３の倍数（例えば３、６、９）である。
翻訳され得るＲＮＡ分子はメッセンジャーＲＮＡまたはｍＲＮＡと言われる。ＤＮＡまたはＲＮＡ配列はコドンによって遺伝子をコードする。コドンは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸配列上の３つのヌクレオチドの群を言う。アンチコドンは、コドンに対して相補的である転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）などの核酸上の３つのヌクレオチドの群を言う。その結果、第１の核酸のコドンは、コドンおよびアンチコドンの塩基間の水素結合によって第２の核酸のアンチコドンと会合する。例えば、ｍＲＮＡ上のコドン５’－ＡＵＧ－３’は、対応するアンチコドン３’－ＵＡＣ－５’をｔＲＮＡ上に有する。翻訳の間に、翻訳されるべきコドンに対して相補的なアンチコドンを有するｔＲＮＡは、ｍＲＮＡ上のコドンと会合して、一般的には、翻訳されるべきコドンに対応するアミノ酸を送達するか、または翻訳の終結およびリボソームからの翻訳されたポリペプチドの放出を助長する。
翻訳は、ＲＮＡコード配列が用いられてポリペプチドの産生を導くプロセスである。翻訳の第１ステップは開始であり、これにおいては、リボソームがｍＲＮＡと会合し、第１のアミノ酸を担持する第１の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）が第１のコドンまたはスタートコドンと会合する。翻訳の次段階の伸長には３つのステップが関わる。第１に、スタートコドンに後続するコドンまたは第２のコドンに対して相補的であるアンチコドンを有しかつ第２のアミノ酸を担持する第２のｔＲＮＡが、ｍＲＮＡと会合する。第２に、第１のアミノ酸の末端の非側鎖カルボン酸部分の炭素原子は、担持された第２のアミノ酸の末端の非側鎖アミノ部分の窒素と反応し、２つのアミノ酸間のペプチド結合を形成し、第２のアミノ酸は第２のｔＲＮＡに結合され、第１のアミノ酸は第１のｔＲＮＡではなく第２のアミノ酸に結合される。第３に、第１のｔＲＮＡはｍＲＮＡから解離し、リボソームはｍＲＮＡに沿って前進する。その結果、第１のｔＲＮＡがリボソームと会合した位置は今や第２のｔＲＮＡによって占有され、第２のｔＲＮＡによって先に占有された位置は、今や追加のアミノ酸を担持する追加のｔＲＮＡがｍＲＮＡと会合するために使える。１）アミノ酸を担持するｔＲＮＡの会合、２）成長しているポリペプチドに追加のアミノ酸を追加するペプチド結合の形成、および３）ｍＲＮＡに沿ったリボソームの前進というこれらの３つのステップは、リボソームがストップコドンに到達し、これが翻訳を終結をもたらすまで続いていく。一般的に、ストップコドンと会合するｔＲＮＡはアミノ酸を担持しない。そのため、伸長ステップの間のアミノ酸を担持しないｔＲＮＡの会合は、ポリペプチドとポリペプチド上の最後のアミノ酸を担持するｔＲＮＡとの間の結合の切断をもたらし、その結果、ポリペプチドはリボソームから放出される。代替的には、ｔＲＮＡがストップコドンと会合しない場合に、リボソームはｍＲＮＡから解離し、ポリペプチドを放出し得る。
本願において用いられる「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、２つ以上の共有結合したヌクレオチドを含む有機分子を言う。本願において用いられる「ヌクレオチド」は、以下を含む有機分子を言う：１）窒素塩基（核酸塩基）に共有結合した糖を含むヌクレオシド；および２）ヌクレオシドの糖に共有結合しているリン酸基。ポリヌクレオチド上のヌクレオチドは典型的にはホスホジエステル結合によって繋がれ、これにおいて、第１のヌクレオチドの糖の３’炭素は橋かけリン酸基によって第２の核酸の糖の５’炭素に連結される。典型的には、橋かけリン酸は、リン酸のリン原子のみに結合されている２つの非橋かけ酸素原子と、それぞれがリン原子を第１のヌクレオチドの３’炭素または第２のヌクレオチドの５’炭素どちらかに接続する２つの橋かけ酸素原子とを含む。核酸上のヌクレオチドの順序を記載する核酸配列において、第１のヌクレオチドは、第１のヌクレオチドの３’炭素が第２のヌクレオチドの５’炭素に接続されている場合には、第２のヌクレオチドの５’（上流）にあると言われる。類似に、第２のヌクレオチドは、第２のヌクレオチドの５’炭素が第１のヌクレオチドの３’炭素に接続されている場合には、第１のヌクレオチドの３’（下流）にあると言われる。核酸配列は典型的には５’－＞３’の順序で読まれ、５’ヌクレオチドからスタートし、３’ヌクレオチドで終わる。
本願において用いられる「修飾されたヌクレオチド」は、アデノシンヌクレオチド、シチジンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、またはウラシルヌクレオチドの古典的構造ではない構造を有するヌクレオチドを言う。分子の古典的構造は、分子の名称によって指される構造であることが当分野において一般的に公知である構造を言う。本願において用いられる「修飾されたヌクレオチド」は、古典的ではない核酸塩基または糖（リボースもしくはデオキシリボース）を含むヌクレオチドをもまた言い得る。「修飾されたヌクレオチド」は、古典的なヌクレオシド間連結部ではないヌクレオシド間連結部（すなわちホスホジエステルヌクレオシド間連結部ではない、例えばホスホロチオエートヌクレオシド間連結部）によって第２のヌクレオチドに共有結合的に連結されているヌクレオチドをもまた言い得る。アデニン塩基、リボース糖、および１つ以上のリン酸基を含むアデノシンリボヌクレオチドの古典的構造が、アデノシン一リン酸の形態で下に示されている：
（ＡＭＰ）。
ＡＭＰの古典的構造は、リン酸の１つ以上のヒドロキシル基および／または糖の１つ以上のヒドロキシル基が脱プロトン化されている構造、ならびにリン酸の酸素原子および／または糖の３’酸素原子が核酸配列上の隣接するヌクレオチドに結合されている構造をもまた言う。
シトシン塩基、リボース糖、および１つ以上のリン酸基を含むシトシンヌクレオチドの古典的構造が、シチジン一リン酸の形態で下に示されている：
（ＣＭＰ）。
ＣＭＰの古典的構造は、リン酸の１つ以上のヒドロキシル基および／または糖の１つ以上のヒドロキシル基が脱プロトン化されている構造、ならびにリン酸の酸素原子および／または糖の３’酸素原子が核酸配列上の隣接するヌクレオチドに結合されている構造をもまた言う。
グアニン塩基、リボース糖、および１つ以上のリン酸基を含むグアニンヌクレオチドの古典的構造は、グアノシン一リン酸の形態で下に示されている：
（ＧＭＰ）。
ＧＭＰの古典的構造は、リン酸の１つ以上のヒドロキシル基および／または糖の１つ以上のヒドロキシル基が脱プロトン化されている構造、ならびにリン酸の酸素原子および／または糖の３’酸素原子が核酸配列上の隣接するヌクレオチドに結合されている構造をもまた言う。
ウラシル塩基、リボース糖、および１つ以上のリン酸基を含むウラシルヌクレオチドの古典的構造は、ウリジン一リン酸の形態で下に示されている：
（ＵＭＰ）。
ＵＭＰの古典的構造は、リン酸の１つ以上のヒドロキシル基および／または糖の１つ以上のヒドロキシル基が脱プロトン化されている構造、ならびにリン酸の酸素原子および／または糖の３’酸素原子が核酸配列上の隣接するヌクレオチドに結合されている構造をもまた言う。
修飾されたヌクレオチドの構造は、ヌクレオチドの糖、窒素塩基、またはリン酸における１つ以上の修飾を原因として、古典的なヌクレオチドの構造とは異なり得る。いくつかの態様において、修飾されたヌクレオチドは、アデニンヌクレオシド、シトシンヌクレオシド、グアニンヌクレオシド、またはウラシルヌクレオシドの古典的構造ではない修飾されたヌクレオシドを含む。本願において用いられる通りである。
アデノシンの古典的構造の例、アデニンヌクレオシドが下に再掲されている：
（アデノシン）。
アデノシンの古典的構造は、リン酸の１つ以上のヒドロキシル基および／または糖の１つ以上のヒドロキシル基が脱プロトン化されている構造、５’炭素が核酸配列上の５’リン酸に結合されている構造、ならびに３’酸素原子が核酸配列上の隣接するヌクレオチドの５’リン酸基に結合されている構造をもまた言う。
シチジンの古典的構造の例、シトシンヌクレオシドが下に再掲されている：
（シチジン）。
シチジンの古典的構造は、リン酸の１つ以上のヒドロキシル基および／または糖の１つ以上のヒドロキシル基が脱プロトン化されている構造、５’炭素が核酸配列上の５’リン酸に結合されている構造、ならびに３’酸素原子が核酸配列上の隣接するヌクレオチドの５’リン酸基に結合されている構造をもまた言う。
グアノシンの古典的構造の例、グアニンヌクレオシドが下に再掲されている：
（グアノシン）。
グアノシンの古典的構造は、リン酸の１つ以上のヒドロキシル基および／または糖の１つ以上のヒドロキシル基が脱プロトン化されている構造、５’炭素が核酸配列上の５’リン酸に結合されている構造、ならびに３’酸素原子が核酸配列上の隣接するヌクレオチドの５’リン酸基に結合されている構造をもまた言う。
ウリジンの古典的構造の例、ウラシルヌクレオシドが下に再掲されている：
（ウリジン）。
ウリジンの古典的構造は、リン酸の１つ以上のヒドロキシル基および／または糖の１つ以上のヒドロキシル基が脱プロトン化されている構造、５’炭素が核酸配列上の５’リン酸に結合されている構造、ならびに３’酸素原子が核酸配列上の隣接するヌクレオチドの５’リン酸基に結合されている構造をもまた言う。
本願において用いられる「構造配列」は、互いと相互作用して、構造配列を含む核酸上の二次構造を形成することができる少なくとも２つのヌクレオチドを含む核酸配列を言う。
本願において用いられる「アプタマー」は、標的分子に結合することができる二次構造を含む核酸を言う。
本願において用いられる「リガーゼ」は、２つのヌクレオチド間の共有結合を形成することができる酵素を言い、「ライゲーション」のプロセスは、２つのヌクレオチド間の共有結合の形成を言う。
本願において用いられる「テーリング核酸」は、別の核酸の３’端にライゲーションされる核酸を言う。
修飾されたｍＲＮＡ
いくつかの側面において、本開示は、ｉ）１つ以上の修飾されたヌクレオチド；および／またはｉｉ）構造配列の１コピー以上（繰り返し単位）を含む修飾されたｍＲＮＡを提供し、修飾されたヌクレオチドおよび／または構造配列はｍＲＮＡのポリＡ領域の一部であるかまたは３’にある。ｍＲＮＡのポリ（Ａ）領域またはポリ（Ａ）テールともまた呼ばれるポリＡ領域は、複数の一続きのアデノシンヌクレオチド、典型的には５０～３００個の一続きのアデノシンヌクレオチドを含むオープンリーディングフレームの３’（下流）にあるｍＲＮＡの領域であり、一続きのアデノシンヌクレオチドの下流の複数の非アデノシンヌクレオチドを包摂し得る。細胞においては、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）を産生するＤＮＡ配列の転写後に、ポリＡテールはポリＡポリメラーゼ（ＰＡＰ）などのポリアデニル化酵素によって追加され、ＲＮＡの３’端に複数の一続きのアデノシンヌクレオチドの長い配列をもたらす。ポリＡ領域は、ｍＲＮＡによってコードされる蛋白質の産生に重要である複数の役割を演ずる。第１に、ポリＡ領域はポリＡ結合蛋白質（ＰＡＢＰ）のための取り付け部位を提供する。これは核においてｍＲＮＡと会合し、細胞質への搬出を促進する（例えば、Tudek et al. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2018. 373(1762): 20180169参照）。加えて、ｍＲＮＡ上のポリＡテールの存在は翻訳の開始を助長する（例えば、Gallie. Genes ＆ Dev. 1991. 5:2108－2116およびMunroe et al. Mol Cell Biol. 1990. 10(7): 3441－3455参照）。最後に、ポリＡテールは、ｍＲＮＡから３’ヌクレオチドを除去するポリヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰａｓｅ）などのエキソヌクレアーゼの活性からオープンリーディングフレームを保護することによって、ｍＲＮＡを安定化する。エキソヌクレアーゼがヌクレオチドを除去すると、ｍＲＮＡは次第に短くなって来る。ひとたびオープンリーディングフレームの下流のヌクレオチドの全てが除去されると、エキソヌクレアーゼによって除去されるヌクレオチドはオープンリーディングフレームのヌクレオチドであろう。オープンリーディングフレームからのヌクレオチドの除去は、コードされる蛋白質の翻訳を防止する。加えて、オープンリーディングフレームの近くでのｍＲＮＡとのエキソヌクレアーゼの会合は、リボソームおよびｔＲＮＡがｍＲＮＡと会合することを立体構造的に妨害することによって翻訳を阻害し得る。ポリＡテールの除去は多くの場合にＲＮＡ分解の律速ステップとして引用され、細胞におけるｍＲＮＡのライフスパンは、そのポリＡテールを除去するために要求される時間によって決定される（例えば、Dreyfus et al., Cell. 2002. 111(5): 611－613参照）。ｍＲＮＡのポリＡテールの組成は様々であるが、酵母細胞ではおよそ７５個のアデノシンヌクレオチド、哺乳動物細胞では２５０個のアデノシンヌクレオチドを含有する。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡのいくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは、１つ以上の修飾されたヌクレオチドをポリＡ領域にまたはｍＲＮＡのポリＡ領域の３’（下流）に含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は古典的なアデノシンヌクレオチドではない１つ以上のヌクレオチドを包含する。いくつかの態様において、ポリＡ領域はアデノシンヌクレオチドではない１つ以上のヌクレオチドを包含する。いくつかの態様において、ポリＡ領域は、複数の一続きのアデノシンヌクレオチドを含む核酸配列の３’（下流）にある１つ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも２５個の一続きのアデノシンヌクレオチドを含み、これらは古典的なアデノシンヌクレオチドまたは修飾されたアデノシンヌクレオチドであり得る。いくつかの態様において、ポリＡ領域は２５～５００個の一続きのアデノシンヌクレオチドを含み、これらは古典的なアデノシンヌクレオチドまたは修飾されたアデノシンヌクレオチドであり得る。いくつかの態様において、ポリＡ領域は２５～３００個の一続きのアデノシンヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、または少なくとも２００個の一続きのアデノシンヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡの修飾されたヌクレオチドの１つ以上は、修飾されたリン酸基を含む。修飾されたリン酸基は、リン酸の古典的構造とは異なるリン酸基である。リン酸の古典的構造の例が下に示されている：
式中、Ｒ５およびＲ３は、古典的なリン酸が結合される原子または分子である。例えば、核酸配列上のリン酸では、Ｒ５は核酸の上流ヌクレオチドを言い得、Ｒ３は核酸の下流ヌクレオチドを言い得る。リン酸の古典的構造は、リン酸の１つ以上のヒドロキシル基が脱プロトン化されているか、またはリン酸の酸素原子が核酸配列上の隣接するヌクレオチドに結合されている構造をもまた言う。核酸上の古典的なリン酸と置換され得る修飾されたリン酸基の限定しない例は以下を包含する：ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホロジチオエート、チオリン酸、５’－Ｏ－メチルホスホネート、３’－Ｏ－メチルホスホネート、５’－ヒドロキシホスホネート、ヒドロキシホスファネート、ホスホロセレノアート、セレノホスフェート、ホスホロアミダート、カルボホスホネート、メチルホスホネート、フェニルホスホネート、エチルホスホネート、Ｈ－ホスホネート、グアニジニウム環、トリアゾール環、ボラノホスフェート（ＢＰ）、メチルホスホネート、およびグアニジノプロピルホスホロアミダート。
本願において提供される修飾されたヌクレオチドを含む修飾されたｍＲＮＡのいくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された核酸塩基を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された糖を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾されたリン酸を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、以下からなる群から選択される修飾された核酸塩基を含む：キサンチン、アリアミノウラシル、アリアミノチミジン、ヒポキサンチン、ジゴキシゲニン化アデニン、ジゴキシゲニン化シトシン、ジゴキシゲニン化グアニン、ジゴキシゲニン化ウラシル、６－クロロプリンリボシド、Ｎ６－メチルアデニン、メチルシュードウラシル、２－チオシトシン、２－チオウラシル、５－メチルウラシル、４－チオチミジン、４－チオウラシル、５，６－ジヒドロ－５－メチルウラシル、５，６－ジヒドロウラシル、５－［（３－インドリル）プロピオンアミド－Ｎ－アリル］ウラシル、５－アミノアリルシトシン、５－アミノアリルウラシル、５－ブロモウラシル、５－ブロモシトシン、５－カルボキシシトシン、５－カルボキシメチルエステルウラシル、５－カルボキシウラシル、５－フルオロウラシル、５－ホルミルシトシン、５－ホルミルウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ヒドロキシウラシル、５－ヨードシトシン、５－ヨードウラシル、５－メトキシシトシン、５－メトキシウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－プロパルギルアミノシトシン、５－プロパルギルアミノウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、６－アザシトシン、６－アザウラシル、６－クロロプリン、６－チオグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノアデニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、８－アザアデニン、８－アジドアデニン、８－クロロアデニン、８－オキソアデニン、８－オキソグアニン、アラアデニン、アラシトシン、アラグアニン、アラウラシル、ビオチン－１６－７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、ビオチン－１６－アミノアリルシトシン、ビオチン－１６－アミノアリルウラシル、シアニン３－５－プロパルギルアミノシトシン、シアニン３－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン３－アミノアリルシトシン、シアニン３－アミノアリルウラシル、シアニン５－６－プロパルギルアミノシトシン、シアニン５－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン５－アミノアリルシトシン、シアニン５－アミノアリルウラシル、シアニン７－アミノアリルウラシル、ダブシル－５－３－アミノアリルウラシル、デスチオビオチン－１６－アミノアリル－ウラシル、デスチオビオチン－６－アミノアリルシトシン、イソグアニン、Ｎ１－エチルシュードウラシル、Ｎ１－メトキシメチルシュードウラシル、Ｎ１－メチルアデニン、Ｎ１－メチルシュードウラシル、Ｎ１－プロピルシュードウラシル、Ｎ２－メチルグアニン、Ｎ４－ビオチン－ＯＢＥＡ－シトシン、Ｎ４－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｏ６－メチルグアニン、シュードイソシトシン、シュードウラシル、チエノシトシン、チエノグアニン、チエノウラシル、キサントシン、３－デアザアデニン、２，６－ジアミノアデニン、２，６－ジアミノ（damino）グアニン、５－カルボキサミド－ウラシル、５－エチニルウラシル、Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｉ６Ａ）、２－メチル－チオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン（ｍ６２Ａ）、およびＮ６－アセチルアデニン（ａｃ６Ａ）。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、以下からなる群から選択される修飾された糖を含む：２’－チオリボース、２’，３’－ジデオキシリボース、２’－アミノ－２’－デオキシリボース、２’デオキシリボース、２’－アジド－２’－デオキシリボース、２’－フルオロ－２’－デオキシリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、２’－Ｏ－メチルデオキシリボース、３’－アミノ－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－アジド－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－デオキシリボース、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－２’－デオキシリボース、３’－Ｏ－メチルリボース、５’－アミノリボース、５’－チオリボース、５－ニトロ－１－インドリル－２’－デオキシリボース、５’－ビオチン－リボース、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン連結、２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノ連結リボース、および２’－Ｏ，４’－Ｃ－チオ連結リボース。ある種の態様において、少なくとも１つの修飾された核酸塩基は２’－Ｏ－（無置換のＣ１－６アルコキシ）－（無置換のＣ１－６アルキル）核酸塩基である（例えば、２’－Ｏ－（無置換のＣ１－６アルコキシ）－（無置換のＣ１－６アルキル）ＲＮＡ核酸塩基）。ある種の態様において、少なくとも１つの修飾された核酸塩基は２’－Ｏ－メトキシエチル核酸塩基である（例えば、２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡ核酸塩基）。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは２’修飾を含む。いくつかの態様において、２’修飾は以下からなる群から選択される：ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾（すなわち、リボースの２’酸素および４’炭素に結合した追加の炭素原子を含むヌクレオチド）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、および２’－Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）。
いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、以下からなる群から選択される修飾されたリン酸を含む：ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホロジチオエート、チオリン酸、５’－Ｏ－メチルホスホネート、３’－Ｏ－メチルホスホネート、５’－ヒドロキシホスホネート、ヒドロキシホスファネート、ホスホロセレノアート、セレノホスフェート、ホスホロアミダート、カルボホスホネート、メチルホスホネート、フェニルホスホネート、エチルホスホネート、Ｈ－ホスホネート、グアニジニウム環、トリアゾール環、ボラノホスフェート（ＢＰ）、メチルホスホネート、およびグアニジノプロピルホスホロアミダート。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは１つよりも多くの型の修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは、少なくとも、第１の修飾されたヌクレオチド、および第１の修飾されたヌクレオチドとは異なる構造を有する第２の修飾されたヌクレオチドを含む。ヌクレオチドは、核酸塩基、糖、および／またはリン酸基の違いを原因として構造が異なり得る。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは、少なくとも、第１の修飾されたリン酸、および第１の修飾されたリン酸とは異なる構造を有する第２の修飾されたリン酸を含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは第１の修飾されたヌクレオシドおよび第２の修飾されたヌクレオシドを含む。
本開示の側面は、２５個以上のアデニンヌクレオチドを有するポリＡ領域を含む修飾されたｍＲＮＡに関する。ある種の態様において、ポリＡ領域はオープンリーディングフレームの３’にあり、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、または５０以上のアデノシンヌクレオチドを含む。ある種の態様において、ポリＡ領域はオープンリーディングフレームの３’にあり、両端を含めて、１０および１５の間の、１５および２０の間の、２０および２５の間の、２５および３５の間の、３５および５０の間の、５０および７０の間の、または７０および１００の間のアデノシンヌクレオチドを含む。アデニンヌクレオチドは、アデニンヌクレオシドおよびリン酸基を含むヌクレオチドである。アデニンヌクレオシドは糖およびアデニン塩基を含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は２５個以上の古典的なアデニンヌクレオチドを含む。古典的なアデノシンヌクレオチドはアデニン塩基、リボース糖、およびリン酸基を含む。下のアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の構造で配置される通りである：
いくつかの態様において、リン酸のヒドロキシル基の１つ以上および／またはリボースの３’ヒドロキシル基は脱プロトン化され、－ＯＨ基の代わりに酸素イオンを含む。構造：
によって示される通りである。ｍＲＮＡの核酸配列上に存在するときに、古典的なアデノシンは次の構造を含み、隣接するヌクレオチドに次の様式で接続される：
式中、Ｒ５は、ｍＲＮＡ上のアデノシンヌクレオチドの５’（上流）にある隣接するヌクレオチドであり、Ｒ３は、ｍＲＮＡ上のアデノシンヌクレオチドの３’（下流）にある隣接するヌクレオチドである。いくつかの態様において、古典的なアデノシンヌクレオチドは直鎖ｍＲＮＡの３’末端ヌクレオチド（最後のヌクレオチド）であり、Ｒ３は水素であり、３’末端ヌクレオチドは３’末端ヒドロキシル（－ＯＨ）基を含む。いくつかの態様において、古典的なアデノシンヌクレオチドは、直鎖ｍＲＮＡの３’末端ヌクレオチド（最後のヌクレオチド）であり、Ｒ３は電子である。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡのいくつかの態様において、ｍＲＮＡは５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む。５’および３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡによってコードされる蛋白質のアミノ酸をコードしないｍＲＮＡ上の配列であり、それゆえにオープンリーディングフレームの一部ではない。５’ＵＴＲはオープンリーディングフレームの５’（上流）にある。３’ＵＴＲはオープンリーディングフレームの３’（下流）にある。いくつかの態様において、３’ＵＴＲは、オープンリーディングフレームの３’かつｍＲＮＡのポリＡ領域の５’（上流）にある１つ以上のヌクレオチドを含む。
本願において提供されるｍＲＮＡのいくつかの態様において、ｍＲＮＡは５’から３’の順序で以下を含む：１）５’ＵＴＲ；２）オープンリーディングフレーム；３）３’ＵＴＲ；および４）ポリＡ領域（図２Ｂ）。いくつかの態様において、５’ＵＴＲの最後のヌクレオチドは、オープンリーディングフレームの最初のヌクレオチドの５’（上流）にある。いくつかの態様において、オープンリーディングフレームの最初のヌクレオチドは、５’ＵＴＲの最後のヌクレオチドの３’（下流）にあり、オープンリーディングフレームの最後のヌクレオチドは、３’ＵＴＲの最初の塩基の５’（上流）にある。いくつかの態様において、オープンリーディングフレームは５’ＵＴＲの最後のヌクレオチドおよび３’ＵＴＲの最初のヌクレオチドの間にある。いくつかの態様において、３’ＵＴＲの最初のヌクレオチドは、オープンリーディングフレームの最後のヌクレオチドの３’（下流）にあり、３’ＵＴＲの最後のヌクレオチドは、ポリＡ領域の最初の塩基の５’（上流）にある。いくつかの態様において、３’ＵＴＲはオープンリーディングフレームの最後のヌクレオチドおよびポリＡ領域の最初のヌクレオチドの間にある。いくつかの態様において、ポリＡ領域の最初のヌクレオチドは３’ＵＴＲの最後のヌクレオチドの３’（下流）にある。
いくつかの態様において、ｍＲＮＡは直鎖ｍＲＮＡである。直鎖ｍＲＮＡは５’末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドを有するｍＲＮＡである。直鎖ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは、ｍＲＮＡの１つのみの隣接するヌクレオチドに共有結合され、隣接するヌクレオチドは、ｍＲＮＡの核酸配列上で５’末端ヌクレオチドの３’に生起する。直鎖ｍＲＮＡの３’末端ヌクレオチドは、ｍＲＮＡの１つのみの隣接するヌクレオチドに共有結合され、隣接するヌクレオチドは、ｍＲＮＡの核酸配列上で３’末端ヌクレオチドの５’に生起する。５’から３’の順序で直鎖ｍＲＮＡのあらゆるヌクレオチドを含む核酸配列において、５’末端ヌクレオチドは配列上の最初のヌクレオチドであり、３’末端ヌクレオチドは配列上の最後のヌクレオチドである。
本願において提供される直鎖ｍＲＮＡのいくつかの態様において、ｍＲＮＡは５’キャップを含む。真核細胞において産生されるほとんどのｍＲＮＡは、成熟ｍＲＮＡへのプレｍＲＮＡのプロセシングの間に追加される５’キャップを包含する。５’キャップはｍＲＮＡ産生、搬出、および翻訳のプロセスにおいて複数の役割を演ずる。第１に、プレｍＲＮＡからのイントロンの除去を媒介するスプライソソームのアセンブリは、５’キャップに対する核のキャップ結合複合体（ＣＢＣ）の結合を要求する。さらにその上、ＣＢＣおよび核膜孔の間の相互作用は、５’端から始まる細胞質へのｍＲＮＡの搬出を媒介する。最後に、５’キャップに結合したＣＢＣは、複数の因子、例えばＣＢＰ８０、ＣＴＩＦ、ｅＩＦ３ｇ、ｅＩＦ４ＩＩＩ、Ｍｅｔ－ｔＲＮＡｉ、およびリボソームサブユニットのリクルートを媒介し、これらは翻訳の開始に要求される（例えば、Ramanathan et al. Nucleic Acids Res. 2016. 44(16): 7511－7526参照）。いくつかの態様において、５’キャップは７－メチルグアノシンを含む。いくつかの態様において、７－メチルグアノシンは構造：
を含む。
いくつかの態様において、５’キャップは、修飾されたｍＲＮＡの隣接するヌクレオチドに７－メチルグアノシンを接続する１つ以上のリン酸を含む。いくつかの態様において、５’キャップの１つ以上のリン酸は、以下からなる群から選択される修飾されたリン酸である：ホスホロチオエート、トリアゾール環、ジハロゲンメチレンビスホスホネート、イミド二リン酸、およびメチレンビス（ホスホネート）。いくつかの態様において、７－メチルグアノシンは、５’から５’の三リン酸橋かけによってｍＲＮＡの隣接するヌクレオチドに接続される。いくつかの態様において、５’キャップは構造：
を含み、ＲはｍＲＮＡの最初に転写されるヌクレオチドの５’炭素である。いくつかの態様において、５’キャップは３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含む。
いくつかの態様において、ｍＲＮＡは環状ｍＲＮＡである。環状ｍＲＮＡは、５’末端ヌクレオチドまたは３’末端ヌクレオチドを有さないｍＲＮＡである。環状ｍＲＮＡ上のあらゆるヌクレオチドは１）５’の隣接するヌクレオチド；および２）３’の隣接するヌクレオチド両方に共有結合されている。５’から３’の順序で環状ｍＲＮＡのあらゆるヌクレオチドを含む核酸配列を有する環状ｍＲＮＡにおいて、核酸配列の最後のヌクレオチドは、核酸配列の最初のヌクレオチドに共有結合される。５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、およびポリＡ領域を有する環状ｍＲＮＡのいくつかの態様において、ポリＡ領域は３’ＵＴＲの３’（下流）かつ５’ＵＴＲの５’（上流）にある。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡのいくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは、ｍＲＮＡのポリＡ領域の３’にある構造配列の１コピー以上を含む。いくつかの態様において、二次構造のヌクレオチドは水素結合によって相互作用する。いくつかの態様において、二次構造はＧ四重鎖である。Ｇ四重鎖またはＧ四重鎖は、グアニンリッチな核酸配列によって形成される二次構造である。グアニンリッチな核酸配列は複数のグアニンヌクレオチドを含む。典型的には、グアニンリッチな核酸配列上のヌクレオチドの少なくとも５０％はグアニンヌクレオチドである。Ｇ四重鎖は、４つのグアニン（Ｇテトラド）を含有する少なくとも１つの平面を含み、各グアニンはフーグスティーン水素結合によって２つの他のグアニンに結合する。フーグスティーン水素結合は、古典的な塩基対形成（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、およびＧ：Ｃ）以外のヌクレオチドまたはヌクレオシドの窒素塩基間の水素結合を言う。Ｇテトラドのグアニンは空の空間を取り囲み、これはＧテトラドを安定化するためのカリウムイオンなどの陽カチオンを含み得る。Ｇ四重鎖は、平行な向きで配置された少なくとも２つのＧテトラドを含む。
１つ以上の構造配列を含む修飾されたｍＲＮＡのいくつかの態様において、構造配列はＧ四重鎖配列である。Ｇ四重鎖配列を含む核酸は、Ｇ四重鎖配列の１つ以上のヌクレオチドを含むＧ四重鎖を形成することができる。いくつかの態様において、Ｇ四重鎖配列は、グアニンヌクレオチドではない１つ以上のスペーサーヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、Ｇ四重鎖配列はＲＮＡのＧ四重鎖配列である。いくつかの態様において、ＲＮＡのＧ四重鎖配列は核酸配列ＧＧＧＧＣＣ（配列番号２）を含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは配列番号２のヌクレオチド配列の少なくとも３コピーを含む。いくつかの態様において、Ｇ四重鎖配列はＤＮＡのＧ四重鎖配列である。いくつかの態様において、ＤＮＡのＧ四重鎖配列は核酸配列ＧＧＧＧＣＣ（配列番号３）を含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは配列番号３のヌクレオチド配列の少なくとも３コピーを含む。いくつかの態様において、構造配列はテロメアリピート配列を含む。いくつかの態様において、テロメアリピート配列は配列番号４または５の１つとして提出される核酸配列を含む。いくつかの態様において、テロメアリピート配列は配列番号４として提出される核酸配列を含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは配列番号４のヌクレオチド配列の少なくとも３コピーを含む。
いくつかの態様において、構造配列は、相互作用してアプタマーを形成することができる少なくとも２つのヌクレオチドを含むアプタマー配列である。アプタマーによって結合され得る標的分子の限定しない例はサイトカイン、細胞表面受容体、および転写因子を包含する。いくつかの態様において、構造配列の１コピー以上によって形成される二次構造は、標的分子に結合することができるアプタマーである。例示的なアプタマーは当分野において公知であり、細胞表面受容体、例えばＣＤ４、ＣＴＬＡ－４、ＴＧＦ－β受容体、および受容体チロシンキナーゼに結合することができる複数のＲＮＡ構造を包含する。例えば、Germer et al. Int J Biochem Mol Biol., 2013. 4(1): 27－40参照。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは構造配列の１～２０コピーを含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは構造配列の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９コピーを含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは構造配列の約４コピーを含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは複数の異なる構造配列を含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは、少なくとも、第１の構造配列、および第１の構造配列とは異なる核酸配列を含む第２の構造配列を含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは少なくとも１つのＧ四重鎖配列および少なくとも１つのテロメアリピート配列を含む。
本願において提供される構造配列の１コピー以上を含む修飾されたｍＲＮＡのいくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された核酸塩基を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された糖を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾されたリン酸を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、以下からなる群から選択される修飾された核酸塩基を含む：キサンチン、アリアミノウラシル、アリアミノチミジン、ヒポキサンチン、ジゴキシゲニン化アデニン、ジゴキシゲニン化シトシン、ジゴキシゲニン化グアニン、ジゴキシゲニン化ウラシル、６－クロロプリンリボシド、Ｎ６－メチルアデニン、メチルシュードウラシル、２－チオシトシン、２－チオウラシル、５－メチルウラシル、４－チオチミジン、４－チオウラシル、５，６－ジヒドロ－５－メチルウラシル、５，６－ジヒドロウラシル、５－［（３－インドリル）プロピオンアミド－Ｎ－アリル］ウラシル、５－アミノアリルシトシン、５－アミノアリルウラシル、５－ブロモウラシル、５－ブロモシトシン、５－カルボキシシトシン、５－カルボキシメチルエステルウラシル、５－カルボキシウラシル、５－フルオロウラシル、５－ホルミルシトシン、５－ホルミルウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ヒドロキシウラシル、５－ヨードシトシン、５－ヨードウラシル、５－メトキシシトシン、５－メトキシウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－プロパルギルアミノシトシン、５－プロパルギルアミノウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、６－アザシトシン、６－アザウラシル、６－クロロプリン、６－チオグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノアデニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、８－アザアデニン、８－アジドアデニン、８－クロロアデニン、８－オキソアデニン、８－オキソグアニン、アラアデニン、アラシトシン、アラグアニン、アラウラシル、ビオチン－１６－７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、ビオチン－１６－アミノアリルシトシン、ビオチン－１６－アミノアリルウラシル、シアニン３－５－プロパルギルアミノシトシン、シアニン３－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン３－アミノアリルシトシン、シアニン３－アミノアリルウラシル、シアニン５－６－プロパルギルアミノシトシン、シアニン５－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン５－アミノアリルシトシン、シアニン５－アミノアリルウラシル、シアニン７－アミノアリルウラシル、ダブシル－５－３－アミノアリルウラシル、デスチオビオチン－１６－アミノアリル－ウラシル、デスチオビオチン－６－アミノアリルシトシン、イソグアニン、Ｎ１－エチルシュードウラシル、Ｎ１－メトキシメチルシュードウラシル、Ｎ１－メチルアデニン、Ｎ１－メチルシュードウラシル、Ｎ１－プロピルシュードウラシル、Ｎ２－メチルグアニン、Ｎ４－ビオチン－ＯＢＥＡ－シトシン、Ｎ４－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｏ６－メチルグアニン、シュードイソシトシン、シュードウラシル、チエノシトシン、チエノグアニン、チエノウラシル、キサントシン、３－デアザアデニン、２，６－ジアミノアデニン、２，６－ジアミノ（damino）グアニン、５－カルボキサミド－ウラシル、５－エチニルウラシル、Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｉ６Ａ）、２－メチル－チオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン（ｍ６２Ａ）、およびＮ６－アセチルアデニン（ａｃ６Ａ）。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、以下からなる群から選択される修飾された糖を含む：２’－チオリボース、２’，３’－ジデオキシリボース、２’－アミノ－２’－デオキシリボース、２’デオキシリボース、２’－アジド－２’－デオキシリボース、２’－フルオロ－２’－デオキシリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、２’－Ｏ－メチルデオキシリボース、３’－アミノ－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－アジド－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－デオキシリボース、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－２’－デオキシリボース、３’－Ｏ－メチルリボース、５’－アミノリボース、５’－チオリボース、５－ニトロ－１－インドリル－２’－デオキシリボース、５’－ビオチン－リボース、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン連結、２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノ連結リボース、および２’－Ｏ，４’－Ｃ－チオ連結リボース。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは２’修飾を含む。いくつかの態様において、２’修飾は以下からなる群から選択される：ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾（すなわち、リボースの２’酸素および４’炭素に結合した追加の炭素原子を含むヌクレオチド）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、および２’－Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）。
いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、以下からなる群から選択される修飾されたリン酸を含む：ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホロジチオエート、チオリン酸、５’－Ｏ－メチルホスホネート、３’－Ｏ－メチルホスホネート、５’－ヒドロキシホスホネート、ヒドロキシホスファネート、ホスホロセレノアート、セレノホスフェート、ホスホロアミダート、カルボホスホネート、メチルホスホネート、フェニルホスホネート、エチルホスホネート、Ｈ－ホスホネート、グアニジニウム環、トリアゾール環、ボラノホスフェート（ＢＰ）、メチルホスホネート、およびグアニジノプロピルホスホロアミダート。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのグアニンヌクレオチドおよび少なくとも３つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのデオキシリボース糖を含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも２０個のデオキシリボース糖を含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域はＧ四重鎖配列の少なくとも３コピーを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つの連続したホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つのホスホロチオエートおよび３つのグアニンヌクレオシドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域はＧ四重鎖配列の少なくとも３コピーおよび少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域はテロメアリピート配列の少なくとも３コピーおよび少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、３’末端ヒドロキシルを含まない３’末端ヌクレオチドはジデオキシシチジンまたは反転デオキシチミジンである。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは１つよりも多くの型の修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは、少なくとも、第１の修飾されたヌクレオシド、および第１の修飾されたヌクレオシドとは異なる構造を有する第２の修飾されたヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは、少なくとも、第１の修飾されたリン酸、および第１の修飾されたリン酸とは異なる構造を有する第２の修飾されたリン酸を含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオシドを含む。
本願において提供される二次構造を含む修飾されたｍＲＮＡのいくつかの態様において、ｍＲＮＡは５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む。いくつかの態様において、５’ＵＴＲはオープンリーディングフレームの５’（上流）にある。いくつかの態様において、ｍＲＮＡは５’から３’の順序で以下を含む：１）５’ＵＴＲ；２）オープンリーディングフレーム；３）３’ＵＴＲ；４）ポリＡ領域；および５）構造配列の１コピー以上。いくつかの態様において、３’ＵＴＲはオープンリーディングフレームの３’（下流）にある。いくつかの態様において、ポリＡ領域は３’ＵＴＲの３’（下流）にある。いくつかの態様において、構造配列の１コピー以上、および構造配列によって形成される二次構造は、ポリＡ領域の３’（下流）にある。いくつかの態様において、ｍＲＮＡは直鎖ｍＲＮＡである。いくつかの態様において、直鎖ｍＲＮＡは５’キャップを含む。いくつかの態様において、５’キャップは７－メチルグアノシンを含む。いくつかの態様において、５’キャップは、修飾されたｍＲＮＡの隣接するヌクレオチドに７－メチルグアノシンを接続する１つ以上のリン酸を含む。いくつかの態様において、７－メチルグアノシンは、５’から５’の三リン酸橋かけによってｍＲＮＡの隣接するヌクレオチドに接続される。いくつかの態様において、５’キャップの１つ以上のリン酸は、以下からなる群から選択される修飾されたリン酸である：ホスホロチオエート、トリアゾール環、ジハロゲンメチレンビスホスホネート、イミド二リン酸、およびメチレンビス（ホスホネート）。いくつかの態様において、５’キャップは３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含む。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのグアニンヌクレオチドおよび少なくとも３つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのデオキシリボース糖を含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも２０個のデオキシリボース糖を含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域はＧ四重鎖配列の少なくとも３コピーを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は２’修飾を含む少なくとも６つの連続したヌクレオチドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つの連続したホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つのホスホロチオエートおよび３つのグアニンヌクレオシドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域はＧ四重鎖配列の少なくとも３コピーおよび少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域はテロメアリピート配列の少なくとも３コピーおよび少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、３’末端ヒドロキシルを含まない３’末端ヌクレオチドはジデオキシシチジンまたは反転デオキシチミジンである。
本願において提供される二次構造を含む修飾されたｍＲＮＡのいくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは５’から３’の順序で以下を含む：１）５’ＵＴＲ；２）オープンリーディングフレーム；３）３’ＵＴＲ；４）ポリＡ領域；および５）構造配列の１コピー以上。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡは環状ｍＲＮＡである。環状ｍＲＮＡのいくつかの態様において、構造配列の１コピー以上はポリＡ領域および５’ＵＴＲの間にある。いくつかの態様において、二次構造はポリＡ領域および５’ＵＴＲの間にある。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡのいくつかの態様において、ポリＡ領域のヌクレオチドの１％から９０％は修飾されたヌクレオチドである。いくつかの態様において、ポリＡ領域のヌクレオチドの少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１６％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％は修飾されたヌクレオチドである。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡのいくつかの態様において、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの３つ以上は修飾されたヌクレオチドである。いくつかの態様において、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、または２５個は修飾されたヌクレオチドである。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡのいくつかの態様において、ポリＡ領域のヌクレオチドの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％はアデノシンヌクレオチドである。ポリＡ領域の１つ以上のアデノシンヌクレオチドは、古典的なアデノシンヌクレオチド、または古典的なアデノシンヌクレオチドとは異なる構造を含む修飾されたアデノシンヌクレオチドであり得る。修飾されたアデノシンヌクレオチドの限定しない例は、以下を包含する：Ｎ６－イソペンテニルアデノシン（ｉ６Ａ）、２－メチル－チオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン（ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン（ｍｓ２ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、２’－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸）（Ａｒ（ｐ））、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，Ｏ－２’－トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ１Ａｍ）、Ｎ６－アセチルアデノシン（ａｃ６Ａ）、２’－チオアデノシン（２’ＳＡ）、５’－チオアデノシン（５’ＳＡ）、２’－Ｏ－（２－アジドエチル）－アデノシン、２’－アジドアデノシン、デオキシアデノシン（ｄＡ）、ジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）、およびアミノデオキシアデノシン（アミノｄＡ）。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡのいくつかの態様において、ポリＡ領域のヌクレオチドの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％は古典的なアデノシンヌクレオチドである。いくつかの態様において、ポリＡ領域は、さらに、アデノシンヌクレオチド（例えば、古典的なまたは非古典的なアデノシンヌクレオチド）ではない１つ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域のヌクレオチドの少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１６％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％は、アデノシンヌクレオチドではないヌクレオチドである。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡのいくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも２５～５００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、または少なくとも２００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、少なくとも２４０、少なくとも２５０、少なくとも２６０、少なくとも２７０、少なくとも２８０、少なくとも２９０、または少なくとも３００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は約２００から約３００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は約２５０ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのグアニンヌクレオチドおよび少なくとも３つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのデオキシリボース糖を含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも２０個のデオキシリボース糖を含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域はＧ四重鎖配列の少なくとも３コピーを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は２’修飾を含む少なくとも６ヌクレオチドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は２’修飾を含む少なくとも６つの連続したヌクレオチドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つの連続したホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つのホスホロチオエートおよび３つのグアニンヌクレオシドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域はＧ四重鎖配列の少なくとも３コピーおよび少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡのポリＡ領域はテロメアリピート配列の少なくとも３コピーおよび少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、３’末端ヒドロキシルを含まない３’末端ヌクレオチドはジデオキシシチジンまたは反転デオキシチミジンである。
修飾された非コードＲＮＡ
当業者は、細胞におけるｍＲＮＡの安定性を改善するための本願において開示される技術のいずれか（例えば、３’エキソヌクレアーゼ活性に対するｍＲＮＡの耐性を改善することによる）は、細胞における蛋白質をコードしないＲＮＡ（「非コード」ＲＮＡ）の安定性を改善することにとってもまた好適であり得るということを難なく認識するであろう。従って、いくつかの側面において、本開示は、ｉ）１つ以上の修飾されたヌクレオチド；および／またはｉｉ）構造配列の１コピー以上（繰り返し単位）を含む修飾された非コードＲＮＡを提供し、修飾されたヌクレオチドおよび／または構造配列はＲＮＡの一部であるかまたは３’にある。本願に記載される非コードＲＮＡはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含まない。非コードＲＮＡは３’ポリＡ領域を含み得るかまたは得ない。３’ポリＡ領域を含まない非コードＲＮＡは、３’ポリＡ領域を含むように修飾され得る（例えば、本願において開示されるかまたは別様に当分野において公知の方法によって、ポリＡ領域を含むオリゴヌクレオチドに非コードＲＮＡをライゲーションすることによる）。非コードＲＮＡは、細胞のｍＲＮＡ転写物またはゲノム配列の一部との相補性の領域を含むＲＮＡであり得る。非コードＲＮＡはゲノム編集にとって好適である非コードＲＮＡであり得る。非コードＲＮＡの例は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９ゲノム編集のためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｇＲＮＡ（例えば、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）リクルートｇＲＮＡ）、またはプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を包含するが、これらに限定されない。例えば、Chen, et al., Acta Pharm Sin B. 2021; 11(2): 340－354；Chen, et al., Adv Drug Deliv Rev. 2021; 168: 246－258；Hendel, et al., Nat Biotechnol. 2015; 33: 985－989；Qu, et al., Nat Biotechnol. 2019; 37(9): 1059－1069；Yi, et al., Nat Biotechnol. 2022. Epub ahead of print；およびNelson, et al, Nat Biotechnol. 2022; 40(3): 402－410参照。修飾されたｍＲＮＡを生成するための本願に記載されるいずれかの技術は、特定して別様に言及されない限り、修飾された非コードＲＮＡを生成するためにもまた用いられ得る。
いくつかの態様において、本願において提供される修飾された非コードＲＮＡは、３’ポリＡ領域を含む非コードＲＮＡを含む。いくつかの態様において、本願において提供される修飾された非コードＲＮＡは、典型的には３’ポリＡ領域を含まない非コードＲＮＡを含む（例えばｇＲＮＡ）。いくつかの態様において、本願において提供される修飾された非コードＲＮＡは、その３’端において、ポリＡ領域を含むオリゴヌクレオチドの５’端にライゲーションされている非コードＲＮＡを含み、それによって本願に記載されるポリＡ領域を含む修飾された非コードＲＮＡを産生する。非コードＲＮＡは、本願において開示されるかまたは別様に当分野において公知のいずれかの方法によって、ポリＡ領域を含むオリゴヌクレオチドにライゲーションされ得る。
本願において提供される修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは、非コードＲＮＡ上に存在するポリＡ領域にまたはポリＡ領域の３’（下流）に１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は、古典的なアデノシンヌクレオチドではない１つ以上のヌクレオチドを包含する。いくつかの態様において、ポリＡ領域は、アデノシンヌクレオチドではない１つ以上のヌクレオチドを包含する。いくつかの態様において、ポリＡ領域は、複数の一続きのアデノシンヌクレオチドを含む核酸配列の３’（下流）にある１つ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも２５個の一続きのアデノシンヌクレオチドを含み、これらは古典的なアデノシンヌクレオチドまたは修飾されたアデノシンヌクレオチドであり得る。いくつかの態様において、ポリＡ領域は２５～５００個の一続きのアデノシンヌクレオチドを含み、これらは古典的なアデノシンヌクレオチドまたは修飾されたアデノシンヌクレオチドであり得る。いくつかの態様において、ポリＡ領域は２５～３００個の一続きのアデノシンヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、または少なくとも２００個の一続きのアデノシンヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡの修飾されたヌクレオチドの１つ以上は、修飾されたリン酸基を含む。修飾されたリン酸基は、リン酸の古典的構造とは異なるリン酸基である。リン酸の古典的構造の例が下に示されている：
式中、Ｒ５およびＲ３は、古典的なリン酸が結合される原子または分子である。例えば、核酸配列上のリン酸では、Ｒ５は核酸の上流ヌクレオチドを言い得、Ｒ３は核酸の下流ヌクレオチドを言い得る。リン酸の古典的構造は、リン酸の１つ以上のヒドロキシル基が脱プロトン化されているか、またはリン酸の酸素原子が核酸配列上の隣接するヌクレオチドに結合されている構造をもまた言う。核酸上の古典的なリン酸と置換され得る修飾されたリン酸基の限定しない例は、以下を包含する：ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホロジチオエート、チオリン酸、５’－Ｏ－メチルホスホネート、３’－Ｏ－メチルホスホネート、５’－ヒドロキシホスホネート、ヒドロキシホスファネート、ホスホロセレノアート、セレノホスフェート、ホスホロアミダート、カルボホスホネート、メチルホスホネート、フェニルホスホネート、エチルホスホネート、Ｈ－ホスホネート、グアニジニウム環、トリアゾール環、ボラノホスフェート（ＢＰ）、メチルホスホネート、およびグアニジノプロピルホスホロアミダート。
本願において提供される修飾されたヌクレオチドを含む修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された核酸塩基を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された糖を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾されたリン酸を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、以下からなる群から選択される修飾された核酸塩基を含む：キサンチン、アリアミノウラシル、アリアミノチミジン、ヒポキサンチン、ジゴキシゲニン化アデニン、ジゴキシゲニン化シトシン、ジゴキシゲニン化グアニン、ジゴキシゲニン化ウラシル、６－クロロプリンリボシド、Ｎ６－メチルアデニン、メチルシュードウラシル、２－チオシトシン、２－チオウラシル、５－メチルウラシル、４－チオチミジン、４－チオウラシル、５，６－ジヒドロ－５－メチルウラシル、５，６－ジヒドロウラシル、５－［（３－インドリル）プロピオンアミド－Ｎ－アリル］ウラシル、５－アミノアリルシトシン、５－アミノアリルウラシル、５－ブロモウラシル、５－ブロモシトシン、５－カルボキシシトシン、５－カルボキシメチルエステルウラシル、５－カルボキシウラシル、５－フルオロウラシル、５－ホルミルシトシン、５－ホルミルウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ヒドロキシウラシル、５－ヨードシトシン、５－ヨードウラシル、５－メトキシシトシン、５－メトキシウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－プロパルギルアミノシトシン、５－プロパルギルアミノウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、６－アザシトシン、６－アザウラシル、６－クロロプリン、６－チオグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノアデニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、８－アザアデニン、８－アジドアデニン、８－クロロアデニン、８－オキソアデニン、８－オキソグアニン、アラアデニン、アラシトシン、アラグアニン、アラウラシル、ビオチン－１６－７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、ビオチン－１６－アミノアリルシトシン、ビオチン－１６－アミノアリルウラシル、シアニン３－５－プロパルギルアミノシトシン、シアニン３－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン３－アミノアリルシトシン、シアニン３－アミノアリルウラシル、シアニン５－６－プロパルギルアミノシトシン、シアニン５－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン５－アミノアリルシトシン、シアニン５－アミノアリルウラシル、シアニン７－アミノアリルウラシル、ダブシル－５－３－アミノアリルウラシル、デスチオビオチン－１６－アミノアリル－ウラシル、デスチオビオチン－６－アミノアリルシトシン、イソグアニン、Ｎ１－エチルシュードウラシル、Ｎ１－メトキシメチルシュードウラシル、Ｎ１－メチルアデニン、Ｎ１－メチルシュードウラシル、Ｎ１－プロピルシュードウラシル、Ｎ２－メチルグアニン、Ｎ４－ビオチン－ＯＢＥＡ－シトシン、Ｎ４－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｏ６－メチルグアニン、シュードイソシトシン、シュードウラシル、チエノシトシン、チエノグアニン、チエノウラシル、キサントシン、３－デアザアデニン、２，６－ジアミノアデニン、２，６－ジアミノ（damino）グアニン、５－カルボキサミド－ウラシル、５－エチニルウラシル、Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｉ６Ａ）、２－メチル－チオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン（ｍ６２Ａ）、およびＮ６－アセチルアデニン（ａｃ６Ａ）。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、以下からなる群から選択される修飾された糖を含む：２’－チオリボース、２’，３’－ジデオキシリボース、２’－アミノ－２’－デオキシリボース、２’デオキシリボース、２’－アジド－２’－デオキシリボース、２’－フルオロ－２’－デオキシリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、２’－Ｏ－メチルデオキシリボース、３’－アミノ－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－アジド－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－デオキシリボース、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－２’－デオキシリボース、３’－Ｏ－メチルリボース、５’－アミノリボース、５’－チオリボース、５－ニトロ－１－インドリル－２’－デオキシリボース、５’－ビオチン－リボース、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン連結、２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノ連結リボース、および２’－Ｏ，４’－Ｃ－チオ連結リボース。ある種の態様において、少なくとも１つの修飾された核酸塩基は２’－Ｏ－（無置換のＣ１－６アルコキシ）－（無置換のＣ１－６アルキル）核酸塩基である（例えば、２’－Ｏ－（無置換のＣ１－６アルコキシ）－（無置換のＣ１－６アルキル）ＲＮＡ核酸塩基）。ある種の態様において、少なくとも１つの修飾された核酸塩基は２’－Ｏ－メトキシエチル核酸塩基である（例えば、２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡ核酸塩基）。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは２’修飾を含む。いくつかの態様において、２’修飾は以下からなる群から選択される：ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾（すなわち、リボースの２’酸素および４’炭素に結合した追加の炭素原子を含むヌクレオチド）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、および２’－Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）。
いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、以下からなる群から選択される修飾されたリン酸を含む：ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホロジチオエート、チオリン酸、５’－Ｏ－メチルホスホネート、３’－Ｏ－メチルホスホネート、５’－ヒドロキシホスホネート、ヒドロキシホスファネート、ホスホロセレノアート、セレノホスフェート、ホスホロアミダート、カルボホスホネート、メチルホスホネート、フェニルホスホネート、エチルホスホネート、Ｈ－ホスホネート、グアニジニウム環、トリアゾール環、ボラノホスフェート（ＢＰ）、メチルホスホネート、およびグアニジノプロピルホスホロアミダート。
いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは１つよりも多くの型の修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは、少なくとも、第１の修飾されたヌクレオチド、第１の修飾されたヌクレオチドとは異なる構造を有する第２の修飾されたヌクレオチドを含む。ヌクレオチドは、核酸塩基、糖、および／またはリン酸基の違いを原因として構造が異なり得る。いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは、少なくとも、第１の修飾されたリン酸、および第１の修飾されたリン酸とは異なる構造を有する第２の修飾されたリン酸を含む。いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは第１の修飾されたヌクレオシドおよび第２の修飾されたヌクレオシドを含む。
本開示の側面は、２５個以上のアデニンヌクレオチドを有するポリＡ領域を含む修飾された非コードＲＮＡに関する。ある種の態様において、ポリＡ領域は非コードＲＮＡの３’端にあり、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、または５０以上のアデノシンヌクレオチドを含む。ある種の態様において、ポリＡ領域は非コードＲＮＡの３’端にあり、両端を含めて、１０および１５の間の、１５および２０の間の、２０および２５の間の、２５および３５の間の、３５および５０の間の、５０および７０の間の、または７０および１００の間のアデノシンヌクレオチドを含む。アデニンヌクレオチドは、アデニンヌクレオシドおよびリン酸基を含むヌクレオチドである。アデニンヌクレオシドは糖およびアデニン塩基を含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は２５個以上の古典的なアデニンヌクレオチドを含む。古典的なアデノシンヌクレオチドはアデニン塩基、リボース糖、およびリン酸基を含む。下のアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の構造で配置される通りである：
いくつかの態様において、リン酸のヒドロキシル基の１つ以上および／またはリボースの３’ヒドロキシル基は脱プロトン化され、－ＯＨ基の代わりに酸素イオンを含む。構造：
によって示される通りである。非コードＲＮＡの核酸配列上に存在するときに、古典的なアデノシンは次の構造を含み、隣接するヌクレオチドに次の様式で接続される：
式中、Ｒ５は、非コードＲＮＡ上のアデノシンヌクレオチドの５’（上流）にある隣接するヌクレオチドであり、Ｒ３は、非コードＲＮＡ上のアデノシンヌクレオチドの３’（下流）にある隣接するヌクレオチドである。いくつかの態様において、古典的なアデノシンヌクレオチドは直鎖非コードＲＮＡの３’末端ヌクレオチド（最後のヌクレオチド）であり、Ｒ３は水素であり、３’末端ヌクレオチドは３’末端ヒドロキシル（－ＯＨ）基を含む。いくつかの態様において、古典的なアデノシンヌクレオチドは、直鎖非コードＲＮＡの３’末端ヌクレオチド（最後のヌクレオチド）であり、Ｒ３は電子である。
本願において提供される非コードＲＮＡのいくつかの態様において、非コードＲＮＡは５’から３’の順序で以下を含む：１）非コードＲＮＡ；および２）非コードＲＮＡ１の３’端上に存在するかまたはそれにライゲーションされたポリＡ領域。いくつかの態様において、非コードＲＮＡにライゲーションされるポリＡ領域の最初のヌクレオチドは、非コードＲＮＡの最後のヌクレオチドの３’（下流）にある。
いくつかの態様において、非コードＲＮＡは直鎖非コードＲＮＡである。直鎖非コードＲＮＡは、５’末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドを有する非コードＲＮＡである。直鎖非コードＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは、非コードＲＮＡの１つのみの隣接するヌクレオチドに共有結合され、隣接するヌクレオチドは、非コードＲＮＡの核酸配列上の５’末端ヌクレオチドの３’に生起する。直鎖非コードＲＮＡの３’末端ヌクレオチドは、非コードＲＮＡの１つのみの隣接するヌクレオチドに共有結合され、隣接するヌクレオチドは、非コードＲＮＡの核酸配列上の３’末端ヌクレオチドの５’に生起する。５’から３’の順序で直鎖非コードＲＮＡのあらゆるヌクレオチドを含む核酸配列において、５’末端ヌクレオチドは配列上の最初のヌクレオチドであり、３’末端ヌクレオチドは配列上の最後のヌクレオチドである。
本願において提供される直鎖非コードＲＮＡのいくつかの態様において、非コードＲＮＡは５’キャップを含む。いくつかの態様において、５’キャップは、修飾された非コードＲＮＡの隣接するヌクレオチドに７－メチルグアノシンを接続する１つ以上のリン酸を含む。いくつかの態様において、５’キャップの１つ以上のリン酸は、以下からなる群から選択される修飾されたリン酸である：ホスホロチオエート、トリアゾール環、ジハロゲンメチレンビスホスホネート、イミド二リン酸、およびメチレンビス（ホスホネート）。いくつかの態様において、７－メチルグアノシンは５’から５’の三リン酸橋かけによって非コードＲＮＡの隣接するヌクレオチドに接続される。いくつかの態様において、５’キャップは構造：
を含み、Ｒは、非コードＲＮＡの最初に転写されるヌクレオチドの５’炭素である。いくつかの態様において、５’キャップは３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含む。
いくつかの態様において、直鎖非コードＲＮＡは５’キャップを含まない。
いくつかの態様において、非コードＲＮＡは環状の非コードＲＮＡである。環状の非コードＲＮＡは、５’末端ヌクレオチドまたは３’末端ヌクレオチドを有さない非コードＲＮＡである。環状の非コードＲＮＡ上のあらゆるヌクレオチドは、１）５’の隣接するヌクレオチド；および２）３’の隣接するヌクレオチド両方に共有結合される。５’から３’の順序で環状の非コードＲＮＡのあらゆるヌクレオチドを含む核酸配列を有する環状の非コードＲＮＡにおいて、核酸配列の最後のヌクレオチドは核酸配列の最初のヌクレオチドに共有結合される。環状の非コードＲＮＡのいくつかの態様において、非コードＲＮＡの３’端上のまたはそれにライゲーションされたポリＡ領域の最後のヌクレオチドは、非コードＲＮＡの第１のヌクレオチドの５’にある。
本願において提供される修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは、非コードＲＮＡ上のまたはそれにライゲーションされたポリＡ領域の３’にある構造配列の１コピー以上を含む。いくつかの態様において、二次構造のヌクレオチドは水素結合によって相互作用する。いくつかの態様において、二次構造はＧ四重鎖である。Ｇ四重鎖またはＧ四重鎖は、グアニンリッチな核酸配列によって形成される二次構造である。
１つ以上の構造配列を含む修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、構造配列はＧ四重鎖配列である。Ｇ四重鎖配列を含む核酸は、Ｇ四重鎖配列の１つ以上のヌクレオチドを含むＧ四重鎖を形成することができる。いくつかの態様において、Ｇ四重鎖配列は、グアニンヌクレオチドではない１つ以上のスペーサーヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、Ｇ四重鎖配列はＲＮＡのＧ四重鎖配列である。いくつかの態様において、ＲＮＡのＧ四重鎖配列は核酸配列ＧＧＧＧＣＣ（配列番号２）を含む。いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは配列番号２のヌクレオチド配列の少なくとも３コピーを含む。いくつかの態様において、Ｇ四重鎖配列はＤＮＡのＧ四重鎖配列である。いくつかの態様において、ＤＮＡのＧ四重鎖配列は核酸配列ＧＧＧＧＣＣ（配列番号３）を含む。いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは配列番号３のヌクレオチド配列の少なくとも３コピーを含む。いくつかの態様において、構造配列はテロメアリピート配列を含む。いくつかの態様において、テロメアリピート配列は、配列番号４または５の１つとして提出される核酸配列を含む。いくつかの態様において、テロメアリピート配列は配列番号４として提出される核酸配列を含む。いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは配列番号４のヌクレオチド配列の少なくとも３コピーを含む。
いくつかの態様において、構造配列は、相互作用してアプタマーを形成することができる少なくとも２つのヌクレオチドを含むアプタマー配列である。アプタマーによって結合され得る標的分子の限定しない例はサイトカイン、細胞表面受容体、および転写因子を包含する。いくつかの態様において、構造配列の１コピー以上によって形成される二次構造は、標的分子に結合することができるアプタマーである。例示的なアプタマーは当分野において公知であり、細胞表面受容体、例えばＣＤ４、ＣＴＬＡ－４、ＴＧＦ－β受容体、および受容体チロシンキナーゼに結合することができる複数のＲＮＡ構造を包含する。例えば、Germer et al. Int J Biochem Mol Biol., 2013. 4(1): 27－40参照。
いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは構造配列の１～２０コピーを含む。いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは、構造配列の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９コピーを含む。いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは構造配列の約４コピーを含む。いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは複数の異なる構造配列を含む。いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは、少なくとも、第１の構造配列、および第１の構造配列とは異なる核酸配列を含む第２の構造配列を含む。いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは少なくとも１つのＧ四重鎖配列および少なくとも１つのテロメアリピート配列を含む。
本願において提供される構造配列の１コピー以上を含む修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された核酸塩基を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された糖を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾されたリン酸を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、以下からなる群から選択される修飾された核酸塩基を含む：キサンチン、アリアミノウラシル、アリアミノチミジン、ヒポキサンチン、ジゴキシゲニン化アデニン、ジゴキシゲニン化シトシン、ジゴキシゲニン化グアニン、ジゴキシゲニン化ウラシル、６－クロロプリンリボシド、Ｎ６－メチルアデニン、メチルシュードウラシル、２－チオシトシン、２－チオウラシル、５－メチルウラシル、４－チオチミジン、４－チオウラシル、５，６－ジヒドロ－５－メチルウラシル、５，６－ジヒドロウラシル、５－［（３－インドリル）プロピオンアミド－Ｎ－アリル］ウラシル、５－アミノアリルシトシン、５－アミノアリルウラシル、５－ブロモウラシル、５－ブロモシトシン、５－カルボキシシトシン、５－カルボキシメチルエステルウラシル、５－カルボキシウラシル、５－フルオロウラシル、５－ホルミルシトシン、５－ホルミルウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ヒドロキシウラシル、５－ヨードシトシン、５－ヨードウラシル、５－メトキシシトシン、５－メトキシウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－プロパルギルアミノシトシン、５－プロパルギルアミノウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、６－アザシトシン、６－アザウラシル、６－クロロプリン、６－チオグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノアデニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、８－アザアデニン、８－アジドアデニン、８－クロロアデニン、８－オキソアデニン、８－オキソグアニン、アラアデニン、アラシトシン、アラグアニン、アラウラシル、ビオチン－１６－７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、ビオチン－１６－アミノアリルシトシン、ビオチン－１６－アミノアリルウラシル、シアニン３－５－プロパルギルアミノシトシン、シアニン３－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン３－アミノアリルシトシン、シアニン３－アミノアリルウラシル、シアニン５－６－プロパルギルアミノシトシン、シアニン５－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン５－アミノアリルシトシン、シアニン５－アミノアリルウラシル、シアニン７－アミノアリルウラシル、ダブシル－５－３－アミノアリルウラシル、デスチオビオチン－１６－アミノアリル－ウラシル、デスチオビオチン－６－アミノアリルシトシン、イソグアニン、Ｎ１－エチルシュードウラシル、Ｎ１－メトキシメチルシュードウラシル、Ｎ１－メチルアデニン、Ｎ１－メチルシュードウラシル、Ｎ１－プロピルシュードウラシル、Ｎ２－メチルグアニン、Ｎ４－ビオチン－ＯＢＥＡ－シトシン、Ｎ４－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｏ６－メチルグアニン、シュードイソシトシン、シュードウラシル、チエノシトシン、チエノグアニン、チエノウラシル、キサントシン、３－デアザアデニン、２，６－ジアミノアデニン、２，６－ジアミノ（damino）グアニン、５－カルボキサミド－ウラシル、５－エチニルウラシル、Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｉ６Ａ）、２－メチル－チオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン（ｍ６２Ａ）、およびＮ６－アセチルアデニン（ａｃ６Ａ）。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、以下からなる群から選択される修飾された糖を含む：２’－チオリボース、２’，３’－ジデオキシリボース、２’－アミノ－２’－デオキシリボース、２’デオキシリボース、２’－アジド－２’－デオキシリボース、２’－フルオロ－２’－デオキシリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、２’－Ｏ－メチルデオキシリボース、３’－アミノ－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－アジド－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－デオキシリボース、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－２’－デオキシリボース、３’－Ｏ－メチルリボース、５’－アミノリボース、５’－チオリボース、５－ニトロ－１－インドリル－２’－デオキシリボース、５’－ビオチン－リボース、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン連結、２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノ連結リボース、および２’－Ｏ，４’－Ｃ－チオ連結リボース。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは２’修飾を含む。いくつかの態様において、２’修飾は以下からなる群から選択される：ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾（すなわち、リボースの２’酸素および４’炭素に結合した追加の炭素原子を含むヌクレオチド）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、および２’－Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、以下からなる群から選択される修飾されたリン酸を含む：ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホロジチオエート、チオリン酸、５’－Ｏ－メチルホスホネート、３’－Ｏ－メチルホスホネート、５’－ヒドロキシホスホネート、ヒドロキシホスファネート、ホスホロセレノアート、セレノホスフェート、ホスホロアミダート、カルボホスホネート、メチルホスホネート、フェニルホスホネート、エチルホスホネート、Ｈ－ホスホネート、グアニジニウム環、トリアゾール環、ボラノホスフェート（ＢＰ）、メチルホスホネート、およびグアニジノプロピルホスホロアミダート。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのグアニンヌクレオチドおよび少なくとも３つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのデオキシリボース糖を含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも２０個のデオキシリボース糖を含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域はＧ四重鎖配列の少なくとも３コピーを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は２’修飾を含む少なくとも６ヌクレオチドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は２’修飾を含む少なくとも６つの連続したヌクレオチドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つの連続したホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つのホスホロチオエートおよび３つのグアニンヌクレオシドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域はＧ四重鎖配列の少なくとも３コピーおよび少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域はテロメアリピート配列の少なくとも３コピーおよび少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、３’末端ヒドロキシルを含まない３’末端ヌクレオチドはジデオキシシチジンまたは反転デオキシチミジンである。
いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは１つよりも多くの型の修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは、少なくとも、第１の修飾されたヌクレオシド、および第１の修飾されたヌクレオシドとは異なる構造を有する第２の修飾されたヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは、少なくとも、第１の修飾されたリン酸、および第１の修飾されたリン酸とは異なる構造を有する第２の修飾されたリン酸を含む。いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオシドを含む。
本願において提供される二次構造を含む修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは５’から３’の順序で以下を含む：１）５’非コードＲＮＡ；２）非コードＲＮＡの３’端上のまたはそれにライゲーションされたポリＡ領域；および３）構造配列の１コピー以上。いくつかの態様において、構造配列の１コピー以上および構造配列によって形成される二次構造は、ポリＡ領域の３’（下流）にある。いくつかの態様において、非コードＲＮＡは直鎖非コードＲＮＡである。いくつかの態様において、直鎖非コードＲＮＡは５’キャップを含む。いくつかの態様において、５’キャップは７－メチルグアノシンを含む。いくつかの態様において、５’キャップは、修飾された非コードＲＮＡの隣接するヌクレオチドに７－メチルグアノシンを接続する１つ以上のリン酸を含む。いくつかの態様において、７－メチルグアノシンは５’から５’の三リン酸橋かけによって非コードＲＮＡの隣接するヌクレオチドに接続される。いくつかの態様において、５’キャップの１つ以上のリン酸は、以下からなる群から選択される修飾されたリン酸である：ホスホロチオエート、トリアゾール環、ジハロゲンメチレンビスホスホネート、イミド二リン酸、およびメチレンビス（ホスホネート）。いくつかの態様において、５’キャップは３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含む。いくつかの態様において、直鎖非コードＲＮＡは５’キャップを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのグアニンヌクレオチドおよび少なくとも３つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのデオキシリボース糖を含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも２０個のデオキシリボース糖を含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域はＧ四重鎖配列の少なくとも３コピーを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は２’修飾を含む少なくとも６ヌクレオチドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は２’修飾を含む少なくとも６つの連続したヌクレオチドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つの連続したホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つのホスホロチオエートおよび３つのグアニンヌクレオシドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域はＧ四重鎖配列の少なくとも３コピーおよび少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域はテロメアリピート配列の少なくとも３コピーおよび少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、３’末端ヒドロキシルを含まない３’末端ヌクレオチドはジデオキシシチジンまたは反転デオキシチミジンである。
本願において提供される二次構造を含む修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは５’から３’の順序で以下を含む：１）非コードＲＮＡ；２）非コードＲＮＡ上のまたはそれにライゲーションされたポリＡ領域；および３）構造配列の１コピー以上。いくつかの態様において、修飾された非コードＲＮＡは環状の非コードＲＮＡである。環状の非コードＲＮＡのいくつかの態様において、構造配列の１コピー以上は、非コードＲＮＡ上のまたはそれにライゲーションされたポリＡ領域と非コードＲＮＡの５’ヌクレオチドとの間にある。
本願において提供される修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、ポリＡ領域のヌクレオチドの１％から９０％は修飾されたヌクレオチドである。いくつかの態様において、ポリＡ領域のヌクレオチドの少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１６％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％は修飾されたヌクレオチドである。
本願において提供される修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの３つ以上は修飾されたヌクレオチドである。いくつかの態様において、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、または２５個は修飾されたヌクレオチドである。
本願において提供される修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、ポリＡ領域のヌクレオチドの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％はアデノシンヌクレオチドである。ポリＡ領域の１つ以上のアデノシンヌクレオチドは、古典的なアデノシンヌクレオチド、または古典的なアデノシンヌクレオチドとは異なる構造を含む修飾されたアデノシンヌクレオチドであり得る。修飾されたアデノシンヌクレオチドの限定しない例は以下を包含する：Ｎ６－イソペンテニルアデノシン（ｉ６Ａ）、２－メチル－チオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン（ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン（ｍｓ２ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、２’－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸）（Ａｒ（ｐ））、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，Ｏ－２’－トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ１Ａｍ）、Ｎ６－アセチルアデノシン（ａｃ６Ａ）、２’－チオアデノシン（２’ＳＡ）、５’－チオアデノシン（５’ＳＡ）、２’－Ｏ－（２－アジドエチル）－アデノシン、２’－アジドアデノシン、デオキシアデノシン（ｄＡ）、ジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）、およびアミノデオキシアデノシン（アミノｄＡ）。
本願において提供される修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、ポリＡ領域のヌクレオチドの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％は古典的なアデノシンヌクレオチドである。いくつかの態様において、ポリＡ領域は、さらに、アデノシンヌクレオチド（例えば、古典的なまたは非古典的なアデノシンヌクレオチド）ではない１つ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域のヌクレオチドの少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１６％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％は、アデノシンヌクレオチドではないヌクレオチドである。
本願において提供される修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも２５～５００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、または少なくとも２００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、少なくとも２４０、少なくとも２５０、少なくとも２６０、少なくとも２７０、少なくとも２８０、少なくとも２９０、または少なくとも３００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は約２００から約３００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は約２５０ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのグアニンヌクレオチドおよび少なくとも３つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのデオキシリボース糖を含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも２０個のデオキシリボース糖を含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域はＧ四重鎖配列の少なくとも３コピーを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は２’修飾を含む少なくとも６ヌクレオチドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は２’修飾を含む少なくとも６つの連続したヌクレオチドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つの連続したホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つのホスホロチオエートおよび３つのグアニンヌクレオシドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域はＧ四重鎖配列の少なくとも３コピーおよび少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、非コードＲＮＡのポリＡ領域はテロメアリピート配列の少なくとも３コピーおよび少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、３’末端ヒドロキシルを含まない３’末端ヌクレオチドはジデオキシシチジンまたは反転デオキシチミジンである。
修飾されたｍＲＮＡおよび修飾された非コードＲＮＡを産生する方法
いくつかの側面において、本開示は、修飾されたｍＲＮＡを産生する方法を提供し、ＲＮＡ、例えば蛋白質をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡまたは非コードＲＮＡを、１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含むテーリング核酸に、リガーゼの存在下においてライゲーションすることを含み、それによって、リガーゼはＲＮＡの３’ヌクレオチドおよびテーリング核酸の５’ヌクレオチドの間の共有結合を形成して、修飾されたＲＮＡ（例えば、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡ）を産生する。リガーゼが２つの直鎖核酸間の共有結合を形成するときには、新たな核酸が産生され、産生された核酸は両方の核酸の核酸配列を含む。第２の核酸の５’末端ヌクレオチドへの第１の核酸の３’末端ヌクレオチドのライゲーションは第３の核酸を産生し、第３の核酸は第１の核酸および第２の核酸の配列を含み、第２の核酸配列は第１の核酸配列の３’（下流）にある。ＲＮＡリガーゼによるライゲーションは数ステップで生起する。第１に、リガーゼのアミノ酸（例えばリジン）のアミノ（－ＮＨ２）基がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のリン酸基に結合し、その結果、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）基がＲＮＡリガーゼに結合される。第２に、第２の核酸の５’末端リン酸が、ＲＮＡリガーゼに結合したＡＭＰのリン酸に取って代わる。最後に、第１の核酸の３’末端ヒドロキシル基の酸素が第２の核酸の５’末端リン酸のリン原子に結合する。この最終ステップは核酸の末端ヌクレオチド間のホスホジエステル結合を形成し、それによって、続いている糖－リン酸バックボーンを有する単一の核酸を形成する。いくつかの態様において、リガーゼはＲＮＡリガーゼである。いくつかの態様において、ＲＮＡリガーゼはＴ４ＲＮＡリガーゼである。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを産生する方法のいくつかの態様において、テーリング核酸がライゲーションされるＲＮＡはインビトロ転写（ＩＶＴ）によって合成される。ＩＶＴは、ＲＮＡ、例えば前駆体ｍＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、または非コードＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鋳型の転写によって生成されるプロセスである。一般的に、ＤＮＡ鋳型は、転写されるべきＤＮＡ配列の上流にあるバクテリオファージプロモーターなどのプロモーターを含む。ＲＮＡポリメラーゼはプロモーターに結合し、ＤＮＡ配列の転写を始め、鋳型に存在する核酸配列を有するＲＮＡ転写物を産生する。ただし、ＤＮＡ配列上のチミジン（Ｔ）ヌクレオチドはＲＮＡ配列ではウラシル（Ｕ）ヌクレオチドによって置き換えられている。ＩＶＴによって産生されたＲＮＡ転写物は、テーリング核酸のライゲーションに先立って修飾され得る。例えば、５’キャップの追加、ＲＮＡからの１つ以上のヌクレオチドの切断、またはポリＡ領域を延長するためのポリアデニル化による。いくつかの態様において、ＤＮＡ鋳型はポリＡ領域を含み、その結果、ＩＶＴはポリＡ領域を有するｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡを産生する。例えば、Becker et al. Methods Mol Biol., 2011. 703: 29－41参照。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを産生する方法のいくつかの態様において、ＲＮＡの３’ヌクレオチドは３’末端ヒドロキシル基を含み、テーリング核酸の５’ヌクレオチドは５’末端リン酸基を含む。ＲＮＡ上の３’末端ヒドロキシル基およびテーリング核酸上の５’末端リン酸基の組み合わせは、２つの核酸の効率的なライゲーションを許す。いくつかの態様において、ＲＮＡは５’末端リン酸基を含まない。ＲＮＡは、５’キャップの追加または別の化学修飾を原因として５’末端リン酸基を欠如し得る。５’末端リン酸は、ホスファターゼ酵素によってもまたＲＮＡから除去されて、５’末端リン酸を欠如するＲＮＡを産生し得る。ＲＮＡ上の５’末端リン酸基の欠如は、ＲＮＡリガーゼがｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡの複数のコピーを一緒にライゲーションすることを防止する。いくつかの態様において、テーリング核酸は３’末端ヒドロキシル基を含まない。テーリング核酸の最後のヌクレオチドが、３’ヒドロキシル基を含有しない修飾されたヌクレオチド、例えばジデオキシアデノシン、ジデオキシシチジン、ジデオキシグアノシン、ジデオキシチミジン、または反転デオキシチミジンを含む場合には、ＲＮＡは３’末端ヒドロキシル基を欠如し得る。テーリング核酸上の３’末端ヒドロキシル基の欠如は、ＲＮＡリガーゼが複数のテーリング核酸を一緒にライゲーションすることを防止する。いくつかの態様において、ＲＮＡの５’ヌクレオチドは５’末端リン酸基を含まず；ＲＮＡの３’ヌクレオチドは３’末端ヒドロキシル基を含み；テーリング核酸の５’ヌクレオチドは５’末端リン酸基を含み；テーリング核酸の３’ヌクレオチドは３’末端ヒドロキシル基を含まない。いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも３つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも３つのグアニンヌクレオチドおよび少なくとも３つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも３つのデオキシリボース糖を含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも２０個のデオキシリボース糖を含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、テーリング核酸はＧ四重鎖配列の少なくとも３コピーを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、テーリング核酸は２’修飾を含む少なくとも６ヌクレオチドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、テーリング核酸は２’修飾を含む少なくとも６つの連続したヌクレオチドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも６つの連続したホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも６つのホスホロチオエートおよび３つのグアニンヌクレオシドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、テーリング核酸はＧ四重鎖配列の少なくとも３コピーおよび少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、テーリング核酸はテロメアリピート配列の少なくとも３コピーおよび少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、３’末端ヒドロキシルを含まない３’末端ヌクレオチドはジデオキシシチジンまたは反転デオキシチミジンである。いくつかの態様において、ＲＮＡにテーリング核酸をライゲーションするために用いられるリガーゼはＲＮＡリガーゼである。いくつかの態様において、ＲＮＡリガーゼはＴ４ＲＮＡリガーゼである。いくつかの態様において、Ｔ４ＲＮＡリガーゼはＴ４ＲＮＡリガーゼ１である。いくつかの態様において、Ｔ４ＲＮＡリガーゼはＴ４ＲＮＡリガーゼ２である。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを産生する方法のいくつかの態様において、ＲＮＡの５’ヌクレオチドは５’末端ヒドロキシル基を含まず、ＲＮＡの３’ヌクレオチドは３’末端リン酸基を含み、テーリング核酸の５’ヌクレオチドは５’末端ヒドロキシル基を含み、テーリング核酸の３’ヌクレオチドは３’末端リン酸基を含まず、ＲＮＡリガーゼはＲｔｃＢリガーゼであり、これは、５’末端ヒドロキシル基を含む第２のヌクレオチドに３’末端リン酸基を含む第１のヌクレオチドをライゲーションする。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを作る方法のいくつかの態様は、さらに、環状ｍＲＮＡまたは環状の非コードＲＮＡを産生することを含む。直鎖の修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡが、ＲＮＡおよびテーリング核酸をライゲーションすることによって産生された後に、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの環状化は追加の数ステップを含む。第１に、５’末端リン酸が、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの最初のヌクレオチドに導入される。リン酸化として公知のプロセスである。いくつかの態様において、５’末端リン酸はキナーゼによって導入される。「キナーゼ」は、「リン酸化」と言われるプロセスにおいて、分子にリン酸基を導入し、リン酸基および分子の間の共有結合を形成する酵素を言う。第２に、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、３’末端ヒドロキシル基を有する修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを産生するように操作される。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、修飾されたＲＮＡの最後のヌクレオチドの１つ以上を切断することによって操作されて、３’末端ヒドロキシル基を有する修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを産生する。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、制限酵素、リボザイム、またはエンドリボヌクレアーゼによって切断される。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの最後の１ヌクレオチド以上の切断は、修飾されたＲＮＡの最初のヌクレオチドのリン酸化の前に生起する。いくつかの態様において、切断はリン酸化の後に生起する。末端リン酸基を１つの端に、末端ヒドロキシル基を他方の端に含む修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、両方の末端ヌクレオチドのライゲーションによって環状化され得る。直鎖核酸の末端ヌクレオチドをライゲーションして環状の核酸を産生するＲＮＡリガーゼは「環状化リガーゼ」と呼ばれ得る。いくつかの態様において、環状化リガーゼはＲＮＡリガーゼである。いくつかの態様において、環状化リガーゼはＳｐｌｉｎｔＲリガーゼである。いくつかの態様において、環状化リガーゼはＴ４ＲＮＡリガーゼである。いくつかの態様において、環状化リガーゼはＴ４ＲＮＡリガーゼ１である。いくつかの態様において、環状化リガーゼはＴ４ＲＮＡリガーゼ２である。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは５’末端ヒドロキシル基および３’末端リン酸基を含み、環状化リガーゼはＲｔｃＢリガーゼであり、これは、３’末端リン酸および５’末端ヒドロキシル基を有するヌクレオチドをライゲーションすることができる。ライゲーションが生起するためには、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの５’および３’末端ヌクレオチドは、ＲＮＡリガーゼが両方のヌクレオチド間の結合を形成するために十分に近くなくてはならない。ライゲーションが生起するために十分に近く直鎖核酸の両方のヌクレオチドを置き、ＲＮＡを環状化する方法は、当分野において一般的に公知である（例えば、Petkovic et al., Nucleic Acids Res., 2015. 43(4): 2454－2465参照）。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、修飾されたＲＮＡにハイブリダイゼーションする（水素結合する）ことができる骨格核酸とインキュベーションされる。その結果、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡが、骨格核酸にハイブリダイゼーションした（結合した）ときに環状の二次構造を形成する。
ＲＮＡが環状の二次構造を形成するときには、５’および３’末端ヌクレオチドは物理的に密接である。これはＲＮＡリガーゼがそれらの間の共有結合を形成するために要求される。ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡを環状化する方法のいくつかの態様において、ＲＮＡの最後のヌクレオチドの１つ以上は骨格核酸上の第１のハイブリダイゼーション配列に結合され、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡの最初のヌクレオチドの１つ以上は、第１のハイブリダイゼーション配列の３’（下流）にある骨格核酸上の第２のハイブリダイゼーション配列に結合される。いくつかの態様において、第１のハイブリダイゼーション配列は５ヌクレオチド以上を含み、第１のハイブリダイゼーション配列は、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの少なくとも最初の五（５）ヌクレオチドに対して相補的である。いくつかの態様において、第１のハイブリダイゼーション配列は１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、または５０以上のヌクレオチドを含み、第１のハイブリダイゼーション配列のヌクレオチドの少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％までは、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの最後のＮヌクレオチドに対して相補的である。そこでは、Ｎは第１のハイブリダイゼーション配列の長さである。いくつかの態様において、第２のハイブリダイゼーション配列は５ヌクレオチド以上を含み、第２のハイブリダイゼーション配列は、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの少なくとも最後の五（５）ヌクレオチドに対して相補的である。いくつかの態様において、第２のハイブリダイゼーション配列は１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、または５０以上のヌクレオチドを含み、第２のハイブリダイゼーション配列のヌクレオチドの少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％までは、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの最後のＮヌクレオチドに対して相補的である。そこでは、Ｎは第２のハイブリダイゼーション配列の長さである。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの少なくとも最初の五（５）ヌクレオチドは第１のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイゼーションする。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの少なくとも最後の五（５）ヌクレオチドは第２のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイゼーションする。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの少なくとも最初の五（５）ヌクレオチドは第１のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイゼーションし、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの少なくとも最後の五（５）ヌクレオチドは第２のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイゼーションする。いくつかの態様において、第１のハイブリダイゼーション配列の最後のヌクレオチドおよび第２のハイブリダイゼーション配列の最初のヌクレオチドは骨格核酸上で隣接し、いずれかの他のヌクレオチドによって離間されない。
本願において提供される環状のＲＮＡを産生する方法のいくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡによる環状の二次構造の形成を促進するための骨格核酸は用いられない。代わりに、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、３’端における第２のハイブリダイゼーション配列に対して相補的である５’端における第１のハイブリダイゼーション配列を含む。いくつかの態様において、各ハイブリダイゼーション配列は少なくとも五（５）ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、各ハイブリダイゼーション配列は少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０ヌクレオチドを含む。
本願において提供される環状のＲＮＡを産生する方法のいくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、骨格核酸および環状化リガーゼの使用によっては環状化されず、むしろ、２つのヌクレオチド間の共有結合の形成などの反応を触媒する核酸のリボザイムによって環状化される。いくつかの態様においては、環状化に先立って、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲまたは非コードｍＲＮＡの最初のヌクレオチドの５’（上流）にある３’イントロンと、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡのポリＡ領域および／または１つ以上の構造配列の３’（下流）にある５’イントロンとを含む。イントロンを除去するためのプレｍＲＮＡのスプライシングを触媒するリボザイムおよび他の酵素は、５’イントロンの５’にあるヌクレオチドおよび３’イントロンの３’にあるヌクレオチドの間の共有結合の形成を触媒し、環状のｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡの形成をもたらし得る。例えば、Wesselhoeft et al., Nat Commun. 2018. 9: 2629参照。
本願において提供される環状のＲＮＡを産生する方法のいくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、骨格核酸の使用によっては環状化されず、むしろ、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡの５’および３’末端ヌクレオチドを密接に置く非コードＲＮＡのｍＲＮＡによる二次構造の形成を促進する相補的な配列の使用によって環状化される。いくつかの態様において、環状化に先立って、修飾されたｍＲＮＡは以下を含む：（ｉ）オープンリーディングフレームの５’または非コードＲＮＡの５’にある第１のセルフハイブリダイゼーション配列；（ｉｉ）オープンリーディングフレームの３’または非コードＲＮＡの３’にある第２のセルフハイブリダイゼーション配列；（ｉｉｉ）第１のセルフハイブリダイゼーション配列の５’にある第１の非ハイブリダイゼーション配列；および（ｉｖ）第２のセルフハイブリダイゼーション配列の３’にある第２の非ハイブリダイゼーション配列。第１および第２のセルフハイブリダイゼーション配列は互いとハイブリダイゼーションすることができるが、第１および第２のセルフハイブリダイゼーション配列は互いとハイブリダイゼーションすることができない。いくつかの態様において、第１および第２のセルフハイブリダイゼーション配列のハイブリダイゼーションは二次構造を形成し、これにおいて、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの５’末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドは１００Å未満の距離だけ離間される。いくつかの態様において、５’末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドは９０Å未満、８０Å未満、７０Å未満、６０Å未満、５０Å未満、４０Å未満、３０Å未満、２０Å未満、または１０Å未満の距離だけ離間される。例えば、Carmona, Ellese Marie. 2019. Circular RNA: Design Criteria for Optimal Therapeutical Utility. 博士論文, ハーバード大学, 文理大学院；Petkovic et al. Nucleic Acids Res., 2015. 43(4):2454－2465；およびＷＯ２０２０／２３７２２７参照。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを産生する方法のいくつかの態様において、方法によって産生される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡのポリＡ領域の３’にある構造配列の１コピー以上を含む。いくつかの態様において、テーリング核酸は構造配列の１コピー以上を含む。いくつかの態様において、構造配列のヌクレオチドは水素結合によって相互作用する。いくつかの態様において、二次構造はＧ四重鎖である。いくつかの態様において、構造配列はＧ四重鎖配列である。いくつかの態様において、Ｇ四重鎖配列は、グアニンヌクレオチドではない１つ以上のスペーサーヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、Ｇ四重鎖配列はＲＮＡのＧ四重鎖配列である。いくつかの態様において、ＲＮＡのＧ四重鎖配列は核酸配列ＧＧＧＧＣＣ（配列番号２）を含む。いくつかの態様において、テーリング核酸は配列番号２の核酸配列の少なくとも３コピーを含む。いくつかの態様において、Ｇ四重鎖配列はＤＮＡのＧ四重鎖配列である。いくつかの態様において、ＤＮＡのＧ四重鎖配列は核酸配列ＧＧＧＧＣＣ（配列番号３）を含む。いくつかの態様において、テーリング核酸は配列番号３のＧ四重鎖配列の少なくとも３コピーを含む。いくつかの態様において、構造配列はテロメアリピート配列を含む。いくつかの態様において、テロメアリピート配列は、配列番号４または５（それぞれＴＡＧＧＧＴまたはＴＡＣＣＣＴ）の１つとして提出される核酸配列を含む。いくつかの態様において、テロメアリピート配列は、配列番号４として提出される核酸配列を含む。いくつかの態様において、テーリング核酸は配列番号４の核酸配列の少なくとも３コピーを含む。いくつかの態様において、構造配列は、相互作用してアプタマーを形成することができる少なくとも２つのヌクレオチドを含むアプタマー配列である。いくつかの態様において、構造配列の１コピー以上によって形成される二次構造は、標的分子に結合することができるアプタマーである。ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡによるアプタマーの形成は、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡが、受容体などの標的分子を含有する細胞の所与の領域に局在することを許す。
本願において提供される方法によって産生される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは構造配列の１～２０コピーを含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、構造配列の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９コピーを含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは構造配列の約４コピーを含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは複数の異なる構造配列を含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、少なくとも、第１の構造配列、および第１の構造配列とは異なる核酸配列を含む第２の構造配列を含む。
本願において提供される方法によって産生される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された核酸塩基を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された糖を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾されたリン酸を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、以下からなる群から選択される修飾された核酸塩基を含む：キサンチン、アリアミノウラシル、アリアミノチミジン、ヒポキサンチン、ジゴキシゲニン化アデニン、ジゴキシゲニン化シトシン、ジゴキシゲニン化グアニン、ジゴキシゲニン化ウラシル、６－クロロプリンリボシド、Ｎ６－メチルアデニン、メチルシュードウラシル、２－チオシトシン、２－チオウラシル、５－メチルウラシル、４－チオチミジン、４－チオウラシル、５，６－ジヒドロ－５－メチルウラシル、５，６－ジヒドロウラシル、５－［（３－インドリル）プロピオンアミド－Ｎ－アリル］ウラシル、５－アミノアリルシトシン、５－アミノアリルウラシル、５－ブロモウラシル、５－ブロモシトシン、５－カルボキシシトシン、５－カルボキシメチルエステルウラシル、５－カルボキシウラシル、５－フルオロウラシル、５－ホルミルシトシン、５－ホルミルウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ヒドロキシウラシル、５－ヨードシトシン、５－ヨードウラシル、５－メトキシシトシン、５－メトキシウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－プロパルギルアミノシトシン、５－プロパルギルアミノウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、６－アザシトシン、６－アザウラシル、６－クロロプリン、６－チオグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノアデニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、８－アザアデニン、８－アジドアデニン、８－クロロアデニン、８－オキソアデニン、８－オキソグアニン、アラアデニン、アラシトシン、アラグアニン、アラウラシル、ビオチン－１６－７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、ビオチン－１６－アミノアリルシトシン、ビオチン－１６－アミノアリルウラシル、シアニン３－５－プロパルギルアミノシトシン、シアニン３－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン３－アミノアリルシトシン、シアニン３－アミノアリルウラシル、シアニン５－６－プロパルギルアミノシトシン、シアニン５－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン５－アミノアリルシトシン、シアニン５－アミノアリルウラシル、シアニン７－アミノアリルウラシル、ダブシル－５－３－アミノアリルウラシル、デスチオビオチン－１６－アミノアリル－ウラシル、デスチオビオチン－６－アミノアリルシトシン、イソグアニン、Ｎ１－エチルシュードウラシル、Ｎ１－メトキシメチルシュードウラシル、Ｎ１－メチルアデニン、Ｎ１－メチルシュードウラシル、Ｎ１－プロピルシュードウラシル、Ｎ２－メチルグアニン、Ｎ４－ビオチン－ＯＢＥＡ－シトシン、Ｎ４－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｏ６－メチルグアニン、シュードイソシトシン、シュードウラシル、チエノシトシン、チエノグアニン、チエノウラシル、キサントシン、３－デアザアデニン、２，６－ジアミノアデニン、２，６－ジアミノ（damino）グアニン、５－カルボキサミド－ウラシル、５－エチニルウラシル、Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｉ６Ａ）、２－メチル－チオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン（ｍ６２Ａ）、およびＮ６－アセチルアデニン（ａｃ６Ａ）。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、以下からなる群から選択される修飾された糖を含む：２’－チオリボース、２’，３’－ジデオキシリボース、２’－アミノ－２’－デオキシリボース、２’デオキシリボース、２’－アジド－２’－デオキシリボース、２’－フルオロ－２’－デオキシリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、２’－Ｏ－メチルデオキシリボース、３’－アミノ－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－アジド－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－デオキシリボース、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－２’－デオキシリボース、３’－Ｏ－メチルリボース、５’－アミノリボース、５’－チオリボース、５－ニトロ－１－インドリル－２’－デオキシリボース、５’－ビオチン－リボース、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン連結、２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノ連結リボース、および２’－Ｏ，４’－Ｃ－チオ連結リボース。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは２’修飾を含む。いくつかの態様において、２’修飾は以下からなる群から選択される：ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾（すなわち、リボースの２’酸素および４’炭素に結合した追加の炭素原子を含むヌクレオチド）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、および２’－Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、以下からなる群から選択される修飾されたリン酸を含む：ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホロジチオエート、チオリン酸、５’－Ｏ－メチルホスホネート、３’－Ｏ－メチルホスホネート、５’－ヒドロキシホスホネート、ヒドロキシホスファネート、ホスホロセレノアート、セレノホスフェート、ホスホロアミダート、カルボホスホネート、メチルホスホネート、フェニルホスホネート、エチルホスホネート、Ｈ－ホスホネート、グアニジニウム環、トリアゾール環、ボラノホスフェート（ＢＰ）、メチルホスホネート、およびグアニジノプロピルホスホロアミダート。いくつかの態様において、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのグアニンヌクレオチドおよび少なくとも３つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも３つのデオキシリボース糖を含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも２０個のデオキシリボース糖を含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡのポリＡ領域はＧ四重鎖配列の少なくとも３コピーを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡのポリＡ領域は２’修飾を含む少なくとも６ヌクレオチドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡのポリＡ領域は２’修飾を含む少なくとも６つの連続したヌクレオチドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つの連続したホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも６つのホスホロチオエートおよび３つのグアニンヌクレオシドを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡのポリＡ領域はＧ四重鎖配列の少なくとも３コピーおよび少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡのポリＡ領域はテロメアリピート配列の少なくとも３コピーおよび少なくとも６つのホスホロチオエートを含み、３’末端ヒドロキシルを含まない。いくつかの態様において、３’末端ヒドロキシルを含まない３’末端ヌクレオチドはジデオキシシチジンまたは反転デオキシチミジンである。
本願において提供される方法によって産生される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、１つよりも多くの型の修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、少なくとも、第１の修飾されたヌクレオシド、および第１の修飾されたヌクレオシドとは異なる構造を有する第２の修飾されたヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、少なくとも、第１の修飾されたリン酸、および第１の修飾されたリン酸とは異なる構造を有する第２の修飾されたリン酸を含む。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオシドを含む。
本願において提供される方法によって産生される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、ポリＡ領域のヌクレオチドの１％から９０％は修飾されたヌクレオチドである。いくつかの態様において、ポリＡ領域のヌクレオチドの少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１６％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％は修飾されたヌクレオチドである。
本願において提供される方法によって産生される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの３つ以上は、修飾されたヌクレオチドである。いくつかの態様において、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、または２５個は修飾されたヌクレオチドである。
本願において提供される方法によって産生される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、ポリＡ領域のヌクレオチドの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％はアデノシンヌクレオチドである。ポリＡ領域の１つ以上のアデノシンヌクレオチドは、古典的なアデノシンヌクレオチド、または古典的なアデノシンヌクレオチドとは異なる構造を含む修飾されたアデノシンヌクレオチドであり得る。
本願において提供される方法によって産生される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、ポリＡ領域のヌクレオチドの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％は古典的なアデノシンヌクレオチドである。
本願において提供される方法によって産生される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡのいくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも２５～５００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、または少なくとも２００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、少なくとも２４０、少なくとも２５０、少なくとも２６０、少なくとも２７０、少なくとも２８０、少なくとも２９０、または少なくとも３００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は約２００から約３００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は約２５０ヌクレオチドを含む。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡを産生する方法のいくつかの態様において、テーリング核酸のライゲーションに先立って、ＲＮＡはテーリング核酸のライゲーションに先立ってオープンリーディングフレームおよびポリＡ領域を含む。本願において提供される修飾された非コードＲＮＡを産生する方法のいくつかの態様において、テーリング核酸のライゲーションに先立って、ＲＮＡは非コードＲＮＡを含み、テーリング核酸のライゲーションに先立ってポリＡ領域を含み得るかまたは得ない。いくつかの態様においては、テーリング核酸のライゲーションに先立って、ＲＮＡのポリＡ領域は少なくとも２５～５００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、または少なくとも２００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、少なくとも２４０、少なくとも２５０、少なくとも２６０、少なくとも２７０、少なくとも２８０、少なくとも２９０、または少なくとも３００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は約２００から約３００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は約２５０ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸のライゲーションに先立って、テーリング核酸は少なくとも１０～５００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、または少なくとも２００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、テーリング核酸は少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、または少なくとも２００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域は約１０から約５０ヌクレオチドを含む。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡを産生する方法のいくつかの態様において、テーリング核酸のライゲーションに先立って、ＲＮＡは５’から３’の順序で５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ、およびポリＡ領域を含む。いくつかの態様において、オープンリーディングフレームは５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの間にある。いくつかの態様において、３’ＵＴＲはオープンリーディングフレームおよびポリＡ領域の間にある。
本願において提供される修飾された非コードＲＮＡを産生する方法のいくつかの態様においては、テーリング核酸のライゲーションに先立って、ＲＮＡは５’から３’の順序で非コードＲＮＡおよび任意にポリＡ領域を含む。いくつかの態様において、ポリＡ領域の最初のヌクレオチドは非コードＲＮＡの最後のヌクレオチドの３’にある。いくつかの態様において、テーリング核酸のライゲーションに先立って、非コードＲＮＡはポリＡテールを含まない。従って、いくつかの態様において、テーリング核酸は、非コードＲＮＡの３’端にテーリング核酸をライゲーションすることによって非コードＲＮＡの３’端に追加される本願に記載されるポリＡ領域を含み、それによって、ポリＡ領域を含む修飾された非コードＲＮＡを産生する。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを産生する方法のいくつかの態様においては、テーリング核酸のライゲーションに先立って、ＲＮＡは５’キャップを含まない。いくつかの態様において、５’キャップは７－メチルグアノシンを含む。いくつかの態様において、５’キャップは、ＲＮＡの隣接するヌクレオチドに７－メチルグアノシンを接続する１つ以上のリン酸を含む。いくつかの態様において、５’キャップはテーリング核酸のライゲーション後に追加される。いくつかの態様において、テーリング核酸のライゲーションに先立って、ＲＮＡは５’キャップを含まない（例えば、ＲＮＡは、５’キャップを含まないｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡである）。
ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡにテーリング核酸をライゲーションすることを含む本願において提供される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを産生する方法のいくつかの側面において、テーリング核酸は１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、テーリング核酸は、修飾されたヌクレオシドを含む少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、修飾された核酸塩基および／または修飾された糖を含む修飾されたヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、修飾された核酸塩基および修飾された糖を含む修飾されたヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された核酸塩基を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾された糖を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは修飾されたリン酸を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、以下からなる群から選択される修飾された核酸塩基を含む：キサンチン、アリアミノウラシル、アリアミノチミジン、ヒポキサンチン、ジゴキシゲニン化アデニン、ジゴキシゲニン化シトシン、ジゴキシゲニン化グアニン、ジゴキシゲニン化ウラシル、６－クロロプリンリボシド、Ｎ６－メチルアデニン、メチルシュードウラシル、２－チオシトシン、２－チオウラシル、５－メチルウラシル、４－チオチミジン、４－チオウラシル、５，６－ジヒドロ－５－メチルウラシル、５，６－ジヒドロウラシル、５－［（３－インドリル）プロピオンアミド－Ｎ－アリル］ウラシル、５－アミノアリルシトシン、５－アミノアリルウラシル、５－ブロモウラシル、５－ブロモシトシン、５－カルボキシシトシン、５－カルボキシメチルエステルウラシル、５－カルボキシウラシル、５－フルオロウラシル、５－ホルミルシトシン、５－ホルミルウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ヒドロキシウラシル、５－ヨードシトシン、５－ヨードウラシル、５－メトキシシトシン、５－メトキシウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－プロパルギルアミノシトシン、５－プロパルギルアミノウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、６－アザシトシン、６－アザウラシル、６－クロロプリン、６－チオグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノアデニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、８－アザアデニン、８－アジドアデニン、８－クロロアデニン、８－オキソアデニン、８－オキソグアニン、アラアデニン、アラシトシン、アラグアニン、アラウラシル、ビオチン－１６－７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、ビオチン－１６－アミノアリルシトシン、ビオチン－１６－アミノアリルウラシル、シアニン３－５－プロパルギルアミノシトシン、シアニン３－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン３－アミノアリルシトシン、シアニン３－アミノアリルウラシル、シアニン５－６－プロパルギルアミノシトシン、シアニン５－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン５－アミノアリルシトシン、シアニン５－アミノアリルウラシル、シアニン７－アミノアリルウラシル、ダブシル－５－３－アミノアリルウラシル、デスチオビオチン－１６－アミノアリル－ウラシル、デスチオビオチン－６－アミノアリルシトシン、イソグアニン、Ｎ１－エチルシュードウラシル、Ｎ１－メトキシメチルシュードウラシル、Ｎ１－メチルアデニン、Ｎ１－メチルシュードウラシル、Ｎ１－プロピルシュードウラシル、Ｎ２－メチルグアニン、Ｎ４－ビオチン－ＯＢＥＡ－シトシン、Ｎ４－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｏ６－メチルグアニン、シュードイソシトシン、シュードウラシル、チエノシトシン、チエノグアニン、チエノウラシル、キサントシン、３－デアザアデニン、２，６－ジアミノアデニン、２，６－ジアミノ（damino）グアニン、５－カルボキサミド－ウラシル、５－エチニルウラシル、Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｉ６Ａ）、２－メチル－チオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン（ｍ６２Ａ）、およびＮ６－アセチルアデニン（ａｃ６Ａ）。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、以下からなる群から選択される修飾された糖を含む：２’－チオリボース、２’，３’－ジデオキシリボース、２’－アミノ－２’－デオキシリボース、２’デオキシリボース、２’－アジド－２’－デオキシリボース、２’－フルオロ－２’－デオキシリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、２’－Ｏ－メチルデオキシリボース、３’－アミノ－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－アジド－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－デオキシリボース、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－２’－デオキシリボース、３’－Ｏ－メチルリボース、５’－アミノリボース、５’－チオリボース、５－ニトロ－１－インドリル－２’－デオキシリボース、５’－ビオチン－リボース、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン連結、２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノ連結リボース、および２’－Ｏ，４’－Ｃ－チオ連結リボース。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは２’修飾を含む。いくつかの態様において、２’修飾は以下からなる群から選択される：ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾（すなわち、リボースの２’酸素および４’炭素に結合した追加の炭素原子を含むヌクレオチド）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、および２’－Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）。いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドは、以下からなる群から選択される修飾されたリン酸を含む：ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホロジチオエート、チオリン酸、５’－Ｏ－メチルホスホネート、３’－Ｏ－メチルホスホネート、５’－ヒドロキシホスホネート、ヒドロキシホスファネート、ホスホロセレノアート、セレノホスフェート、ホスホロアミダート、カルボホスホネート、メチルホスホネート、フェニルホスホネート、エチルホスホネート、Ｈ－ホスホネート、グアニジニウム環、トリアゾール環、ボラノホスフェート（ＢＰ）、メチルホスホネート、およびグアニジノプロピルホスホロアミダート。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを産生する方法のいくつかの態様において、テーリング核酸は、１つよりも多くの型の修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、テーリング核酸は、少なくとも、第１の修飾されたヌクレオシド、および第１の修飾されたヌクレオシドとは異なる構造を有する第２の修飾されたヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、テーリング核酸は、少なくとも、第１の修飾されたリン酸、および第１の修飾されたリン酸とは異なる構造を有する第２の修飾されたリン酸を含む。いくつかの態様において、テーリング核酸は修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオシドを含む。
いくつかの態様において、テーリング核酸のヌクレオチドの１％から９０％は修飾されたヌクレオチドである。いくつかの態様において、テーリング核酸のヌクレオチドの少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１６％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％は修飾されたヌクレオチドである。いくつかの態様において、テーリング核酸の最後の２５ヌクレオチドの３つ以上は修飾されたヌクレオチドである。いくつかの態様において、テーリング核酸の最後の２５ヌクレオチドの少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５個は修飾されたヌクレオチドである。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを産生する方法のいくつかの態様において、テーリング核酸は１つ以上の構造配列を含む。いくつかの態様において、テーリング核酸はＧ四重鎖配列の１コピー以上を含む。いくつかの態様において、Ｇ四重鎖配列はＲＮＡのＧ四重鎖配列である。いくつかの態様において、ＲＮＡのＧ四重鎖配列は核酸配列ＧＧＧＧＣＣ（配列番号２）を含む。いくつかの態様において、Ｇ四重鎖配列はＤＮＡのＧ四重鎖配列である。いくつかの態様において、ＤＮＡのＧ四重鎖配列は核酸配列ＧＧＧＧＣＣ（配列番号３）を含む。いくつかの態様において、テーリング核酸はテロメアリピート配列の１コピー以上を含む。いくつかの態様において、テロメアリピート配列は、配列番号４または５（それぞれＴＡＧＧＧＴまたはＴＡＣＣＣＴ）の１つとして提出される核酸配列を含む。いくつかの態様において、テロメアリピート配列は配列番号４として提出される核酸配列を含む。いくつかの態様において、構造配列は、相互作用してアプタマーを形成することができる少なくとも２つのヌクレオチドを含むアプタマー配列である。いくつかの態様において、構造配列の１コピー以上によって形成される二次構造は、標的分子に結合することができるアプタマーである。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを産生する方法のいくつかの態様において、テーリング核酸は構造配列の１～２０コピーを含む。いくつかの態様において、テーリング核酸は構造配列の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９コピーを含む。いくつかの態様において、テーリング核酸は構造配列の約４コピーを含む。いくつかの態様において、テーリング核酸は複数の異なる構造配列を含む。いくつかの態様において、テーリング核酸は、少なくとも、第１の構造配列、および第１の構造配列とは異なる核酸配列を含む第２の構造配列を含む。異なる第１および第２の構造配列のそれぞれは、本願において提供される構造配列または異なる配列のいずれかであり得る。さらなる態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを産生する方法は、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを単離する（例えば、精製する、濃縮する）ための方法にもまた関する。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを単離する（例えば、精製する、濃縮する）方法は、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを含む混合物（例えばライゲーション混合物）を精製媒体と接触させることを含み、ここで、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、精製媒体と相互作用して、修飾されたＲＮＡ－精製媒体コンジュゲートを形成する。いくつかの態様において、修飾されたＲＮＡ－精製媒体コンジュゲートを形成した精製媒体は、例えばサイズ（質量）または電荷だがこれらに限定されない１つ以上の物理的または化学的特性の手段によって、混合物から分離される。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、修飾されたＲＮＡ－精製媒体コンジュゲートを溶媒によって処置することによって精製媒体から溶出される（すなわち、精製媒体から分離される）。いくつかの態様において、溶媒は水系の溶媒（例えば水）である。ある種の態様において、溶媒は２つ以上の（例えば３つの）溶媒の混合物である。ある種の態様において、溶媒は水および有機溶媒（例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン）の混合物である。ある種の態様において、溶媒はさらに移動相改変物質を含む。ある種の態様において、移動相改変物質は酸（例えば、トリフルオロ酢酸、酢酸、ギ酸、リン酸）、塩基（アンモニア、水酸化アンモニウム、重炭酸アンモニウム）、または塩（リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、ギ酸アンモニウム、もしくはホウ酸塩）である。いくつかの態様において、精製媒体は固体の精製媒体である。いくつかの態様において、精製媒体はビーズを含む。いくつかの態様において、精製媒体は樹脂を含む。いくつかの態様において、精製媒体は常磁性ビーズを含む。ＲＮＡの精製にとって好適な精製媒体の例は当業者には周知であり、例えば、種々の市販の精製媒体を包含する（例えば、Beckman Coulter Life Sciencesの＃Ａ６３９８７参照）。ある種の態様において、このパラグラフに記載されるステップは、両端を含めて、０および２０の間の、２０および２５の間の、２５および３６の間の、３６および３８℃の間の温度で行われる。ある種の態様において、このパラグラフに記載されるステップは、両端を含めて０．９および１．１ａｔｍの間の圧力で行われる。
修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを含む組成物および使用の方法
いくつかの側面において、本開示は、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡのいずれか１つを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、ＲＮＡにテーリング核酸をライゲーションすることを含む本願において提供される方法のいずれかによって作られる。修飾されたｍＲＮＡを含む組成物は、外来性の抗原に対して対象にワクチン接種するかまたは状態もしくは障害を処置するための治療薬蛋白質を発現するために、修飾されたｍＲＮＡを細胞に送達することに有用である。修飾された非コードＲＮＡを含む組成物は、細胞もしくは対象の遺伝子の発現を調節することにまたは細胞もしくは対象のゲノムを編集することに有用であり、状態または障害を処置するために用いられ得る。修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを含む組成物は、例えば農業使用のために、疾患の非存在下において、対象における所望の効果を行使することにもまた有用である。例えば、生物学的農薬もしくは成長増強因子をコードするｍＲＮＡまたはゲノム編集のための非コードＲＮＡが、それぞれ、害虫に対する植物の抵抗性を増大させるかまたは作物収量を増大させる様式で成長を調節するために用いられ得る。本願に記載される修飾されたｍＲＮＡもしくは修飾された非コードＲＮＡのいずれかまたはその組成物は、植物または植物細胞へのｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの送達および／または安定性を向上させるために用いられ得、当分野において良く確立されている植物ゲノム操作のための技術を増強するために用いられ得る。例えば、Stoddard, et al. PLoS One. 2016； 11(5): e0154634参照。
いくつかの態様において、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームは対象の細胞における発現のためにコドン最適化される。本願において用いられる「コドン最適化される」は、細胞においてより効率的に翻訳されるコドンの選好的使用を言う。複数のコドンが同じアミノ酸をコードし得、各コドンの翻訳速度および効率は、相補的なアンチコドンを含むアミノアシルｔＲＮＡの細胞内濃度などの複数の因子によって決定される。核酸配列のコドン最適化は、置き換えられるコドンと同じアミノ酸をコードするがそれよりも効率的に翻訳されるコドンによって、１つ以上のコドンを置き換えることを包含し得る。例えば、アミノ酸のスレオニン（Ｔｈｒ）はＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、またはＡＣＴ（ＲＮＡではＡＣＵ）によってコードされ得るが、哺乳動物ホスト細胞では、ＡＣＣが最も普通に用いられるコドンである；他の種では、異なるＴｈｒコドンがコドン最適化のために好まれ得る。コドン最適化されたオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡは、それゆえに、コドン最適化されていないオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡよりも、所与の量の時間で、効率的に翻訳され、多くのポリペプチドを産生することが予想される。いくつかの態様において、オープンリーディングフレームはヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。
本願において提供される修飾されたｍＲＮＡのいくつかの態様において、オープンリーディングフレームは抗原または治療薬蛋白質をコードする。本願において用いられる「治療薬蛋白質」は、疾患または障害を有するかまたはそれを発生するリスクがあるヒト対象などの対象において発現されるときに、疾患の１つ以上の徴候または症状を防止、縮減、または緩和する蛋白質を言う。治療薬蛋白質は、対象においては変異している遺伝子によってコードされる必須酵素または転写因子であり得る。例えば、ヒトにおけるＩＰＥＸ症候群はＦＯＸＰ３遺伝子の変異によって引き起こされ、これはＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞の発生を妨害し、自己免疫性および炎症性障害に対する増大した感受性をもたらす。ｍＲＮＡからの必須酵素または転写因子の発現は、よって、対象において酵素または転写因子をコードする遺伝子の変異を補償し得る。本願において用いられる「抗原」は、対象において発現されるときに、抗原に結合する対象の抗体の生成を誘起する分子（例えば蛋白質）を言う。いくつかの態様において、抗原はウイルスに由来する蛋白質（ウイルス抗原）またはその断片である。いくつかの態様において、抗原は細菌に由来する蛋白質（細菌抗原）またはその断片である。いくつかの態様において、抗原は原生動物に由来する蛋白質（原生動物抗原）またはその断片である。いくつかの態様において、抗原は真菌に由来する蛋白質（真菌抗原）またはその断片である。全長蛋白質の断片は、全長蛋白質のアミノ酸配列に存在するがそれよりも短いアミノ酸配列を有する蛋白質を言う。
いくつかの側面において、本開示は、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡのいずれかを含む脂質ナノ粒子を提供する。脂質ナノ粒子は、内側表面および外側表面を有する封じ込められた構造または脂質の凝集体を形成する１つ以上の脂質を含む組成物を言う。ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子の製剤に用いられる脂質は、当分野において一般的に公知であり、イオン化可能なアミノ脂質、非カチオン性脂質、ステロール、およびポリエチレングリコール修飾された脂質を包含する。例えば、Buschmann et al. Vaccines. 2021. 9(1): 65参照。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは脂質ナノ粒子の脂質によって取り囲まれ、脂質ナノ粒子の内側に存在する。いくつかの態様において、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡは脂質ナノ粒子の脂質中に分散される。いくつかの態様において、脂質ナノ粒子は、イオン化可能なアミノ脂質、非カチオン性脂質、ステロール、および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾された脂質を含む。
いくつかの側面において、本開示は、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡのいずれかを含む細胞を提供する。いくつかの態様において、細胞は、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡのいずれか１つを含むヒト細胞である。「細胞」は、全ての公知の独立生活生物の基本的な構造的および機能的単位である。それは、生き物として分類される生命の最も小さい単位である。いくつかの生物、例えばほとんどの細菌は単細胞である（単一細胞からなる）。他の生物、例えば植物、真菌、ならびに牛、馬、鶏、七面鳥、羊、豚、犬、猫、およびヒトを包含する動物は、多細胞である。いくつかの態様において、細胞における修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの半減期は１５～９００分である。いくつかの態様において、細胞における修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの半減期は３０～６００分である。いくつかの態様において、細胞における修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの半減期は６０～３００分である。いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの半減期は少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０分である。いくつかの態様において、細胞における修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの半減期は少なくとも３０、少なくとも６０、少なくとも９０、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも１８０、少なくとも２１０、少なくとも２４０、少なくとも２７０、少なくとも３００、少なくとも３３０、少なくとも３６０、少なくとも３９０、少なくとも４２０、少なくとも４５０、少なくとも４８０、少なくとも５１０、少なくとも５４０、少なくとも５７０、少なくとも６００、少なくとも６３０、少なくとも６６０、少なくとも６９０、少なくとも７２０、少なくとも７５０、少なくとも７８０、少なくとも８１０、少なくとも８４０、または少なくとも８７０分である。
いくつかの側面において、本開示は、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡ、修飾された非コードＲＮＡ、脂質ナノ粒子、または細胞のいずれかを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡ、修飾された非コードＲＮＡ、脂質ナノ粒子、または細胞のいずれか１つと薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物である。薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、等張化剤、保存料もしくは抗酸化剤、または他の材料は当業者に周知である。かかる材料は非毒性であるべきであり、活性成分の有効性に干渉するべきではない。担体または他の材料の精確な性質は、投与経路、例えば静脈、筋肉内、皮内、舌下、バッカル、眼、鼻腔内、皮下、髄腔内、腫瘍内、経口、膣、または直腸に依存し得る。
いくつかの側面において、本開示は、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡ、修飾された非コードＲＮＡ、脂質ナノ粒子、細胞、組成物、または医薬組成物のいずれかを対象に投与する方法を提供する。いくつかの態様において、本願に記載される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡのいずれかは、以下と共に用いられ得る：種々の試薬もしくは材料（例えば、１つ以上の脂質ナノ粒子、細胞、組成物、もしくは医薬組成物）、または当分野において公知のある種の産生、精製、製剤、および送達プロセスおよび技術、例えば、これらに限定されないがＵ．Ｓ．特許Ｎｏ．９９５００６５、１０５７６１４６、１１０４５４１８、８７５４０６２、１０８０８２４２、９９５７４９９、１０１５５７８５、１１０５９８４１、１０８７６１０４、１０９７５３６９、９５８０７１１、９６７０１５２、９８５０２０２、９８９６４１３、１０３９９９３７、１００５２２８４、１０９５９９５３、および１０９６１１８４に例示されているもの。これらのそれぞれは参照によって本願に組み込まれる。
いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、投与は静脈、筋肉内、皮内、舌下、バッカル、眼、鼻腔内、皮下、髄腔内、腫瘍内、経口、膣、または直腸である。
いくつかの態様において、組成物は５０℃よりも下で、４０℃よりも下で、３０℃よりも下で、２０℃よりも下で、１０℃よりも下で、０℃よりも下で、－１０℃よりも下で、－２０℃よりも下で、－３０℃よりも下で、－４０℃よりも下で、－５０℃よりも下で、－６０℃よりも下で、－７０℃よりも下で、または－８０℃よりも下で保存されるべきであり、その結果、核酸は経時的に比較的安定である。
いくつかの態様において、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは、インビボエレクトロポレーションによって対象の細胞に導入される。インビボエレクトロポレーションは、電気のパルスを用いて対象の細胞に核酸または他の分子を導入するプロセスであり、これらは、細胞膜および／または細胞壁の核酸または他の分子の通過を促進する。例えば、Somiari et al. Molecular Therapy., 2000. 2(3): 178－187参照。送達されるべき核酸または分子は例えば注射によって対象に投与され、電気のパルスが注射部位にかけられ、それによって、電気は投与部位における細胞への核酸の進入を促進する。いくつかの態様において、核酸は、エレクトロポレーションの効率を増大させる緩衝液および／または賦形剤などの他の要素とともに投与される。
いくつかの側面において、本開示は、本願において提供されるＲＮＡのいずれかおよびテーリング核酸のいずれかを含むキットを提供する。ＲＮＡおよびテーリング核酸はＲＮＡリガーゼの存在下において組み合わせられて、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡ、例えば本願において提供される修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡの１つを産生し得る。いくつかの態様において、キットはリガーゼを含む。いくつかの態様において、キットはＲＮＡリガーゼを含む。いくつかの態様において、キットはＴ４ＲＮＡリガーゼを含む。いくつかの態様において、キットはＴ４ＲＮＡリガーゼ１を含む。いくつかの態様において、キットはＴ４ＲＮＡリガーゼ２を含む。いくつかの態様において、キットはＲｔｃＢＲＮＡリガーゼを含む。いくつかの態様において、キットは、さらに、ライゲーションを実施するための緩衝液を含む。いくつかの態様において、キットは、さらに、リガーゼによって要求されるエネルギーを提供するためのＡＴＰなどのヌクレオチド三リン酸を含む。いくつかの態様において、キットは５０℃よりも下で、４０℃よりも下で、３０℃よりも下で、２０℃よりも下で、１０℃よりも下で、０℃よりも下で、－１０℃よりも下で、－２０℃よりも下で、－３０℃よりも下で、－４０℃よりも下で、－５０℃よりも下で、－６０℃よりも下で、－７０℃よりも下で、または－８０℃よりも下で保存されるべきであり、その結果、核酸は経時的に比較的安定である。
いくつかの側面において、本開示は、本願において提供される医薬組成物のいずれかおよび送達デバイスを含むキットを提供する。送達デバイスは、シリンジまたは針などの対象に組成物を投与することにとって好適な機械または器具を言う。いくつかの態様において、キットは５０℃よりも下で、４０℃よりも下で、３０℃よりも下で、２０℃よりも下で、１０℃よりも下で、０℃よりも下で、－１０℃よりも下で、－２０℃よりも下で、－３０℃よりも下で、－４０℃よりも下で、－５０℃よりも下で、－６０℃よりも下で、－７０℃よりも下で、または－８０℃よりも下で保存されるべきであり、その結果、医薬組成物の核酸は経時的に比較的安定である。
本開示がより詳しく理解され得るために、次の例が提出される。例は、本願において提供される修飾されたｍＲＮＡ、医薬組成物、キット、および方法を例解するために提供され、決してそれらの範囲を限定すると解釈されるべきではない。
例１：修飾されたｍＲＮＡの産生．
修飾されたｍＲＮＡを、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、所望の蛋白質をコードするオープンリーディングフレーム、および３’ＵＴＲをコードするＤＮＡ鋳型のインビトロ転写（ＩＶＴ）によって産生する。ＤＮＡ鋳型は、３’ＵＴＲをコードする鋳型の下流の繰り返しのチミジン塩基（ポリ（Ｔ）配列）を含有する核酸配列をもまた含有し得る。ポリ（Ｔ）ＤＮＡ配列からＲＮＡを転写するときに、ＲＮＡポリメラーゼはスタッタリングし、必ずしもＤＮＡ鋳型に沿って進行することなしに、転写されたＲＮＡに複数のアデノシン塩基を追加する。これは、ＲＮＡの３’端に追加されるポリ（Ａ）テールとして公知のアデノシン塩基のみを含有する長いＲＮＡ配列の追加をもたらす（図１）。
代替的には、ポリ（Ａ）テールなしのＲＮＡ転写物を、ポリ（Ｔ）配列を含有しないＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって産生し得、ポリ（Ａ）テールをテーリング反応において別個にこれらの転写物に追加し得る。ＲＮＡ分子を、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）などのＲＮＡ分子の３’端にヌクレオチドを追加することができる酵素の存在下において、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）または修飾されたＡＴＰとインキュベーションする。ＡＴＰおよび１つ以上の修飾されたＡＴＰの混合物とのＲＮＡおよびポリアデニル化酵素のインキュベーションは、ポリ（Ａ）テールの追加をもたらす。上に記載されたこれらの方法のどちらかによって産生された修飾されたｍＲＮＡは直鎖ｍＲＮＡであり、これらは５’および３’末端ヌクレオチドを有する。
修飾されたｍＲＮＡは環状ｍＲＮＡであり得、これらは５’または３’端なしの一本鎖ｍＲＮＡ分子である（図２Ａ）。環状ｍＲＮＡは、以下を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドなどの別の一本鎖核酸と、環状化されるべき直鎖ｍＲＮＡをインキュベーションすることによって産生される：ｉ）ｍＲＮＡの３’端における配列に対して相補的であるヌクレオチド配列（３’ＤＮＡ相補物）、およびｉｉ）ｍＲＮＡの５’端における配列に対して相補的であるヌクレオチド配列（５’ＤＮＡ相補物）。ここで、３’ＤＮＡ相補物はＤＮＡオリゴヌクレオチド上の５’ＤＮＡ相補物の直ちに下流（３’）にある。ｍＲＮＡは相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションし、その結果、ｍＲＮＡの３’末端ヌクレオチドはｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドの５’にある。ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼなどのリガーゼはｍＲＮＡの２つの末端塩基間のホスホジエステル結合を形成し、末端ヌクレオチドを有さない環状ｍＲＮＡ分子の形成をもたらす。
例２：ｍＲＮＡからの蛋白質産生効率に対する修飾された塩基の影響．
ＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙどちらかをコードしかつポリ（Ａ）テールを欠如するＲＮＡを、インビトロ転写によって産生した。ＲＮＡを、ヌクレオチドの異なる組成物を用いて例１に記載された通りポリアデニル化して、異なるポリ（Ａ）テールを有するｍＲＮＡを産生した。ＧＦＰをコードするＲＮＡを以下によってポリアデニル化した：ａ）ＡＴＰ、ｂ）９５％のＡＴＰおよび５％の修飾されたＡＴＰの混合物、ｃ）７５％のＡＴＰおよび２５％の修飾されたＡＴＰの混合物、またはｄ）負の対照としてＡＴＰなし（テーリングなし）。試験された修飾されたＡＴＰは、ｍ６ＡＴＰ、２’ＯＭｅＡＴＰ、チオＡＴＰ、ｄＡＴＰ、およびアミノｄＡＴＰを包含した。ｍＣｈｅｒｒｙをコードするＲＮＡをＡＴＰによってポリアデニル化して、古典的なポリ（Ａ）テールを有する対照ｍＲＮＡを産生した。ＧＦＰをコードするｍＲＮＡおよび対照のｍＣｈｅｒｒｙをコードするｍＲＮＡの混合物を、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの１、２、および３日後に、各細胞集団において産生されたＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ蛋白質の量を蛍光顕微鏡法によって定量し、産生されたＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙの比を計算した。ポリ（Ａ）テール上に修飾されたＡＴＰを含有するＧＦＰをコードするｍＲＮＡのそれぞれは、ＡＴＰのみによるポリアデニル化によって産生されたＧＦＰをコードするｍＲＮＡに対して相対的に、より多大なＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ比をもたらした（図３）。一般的に、ポリアデニル化反応における２５％の修飾されたＡＴＰの使用は、５％のみの修飾されたＡＴＰの使用よりも顕著なＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ比の増大をもたらし、ポリ（Ａ）テール上への修飾されたアデノシンのより高頻度の包含が、修飾されたｍＲＮＡからの蛋白質産生効率をさらに改善するということを指示した。
例３：修飾されたｍＲＮＡの生化学的および機能的キャラクタリゼーション．
修飾されたｍＲＮＡを、以下を包含する複数の生化学的パラメータに従ってキャラクタリゼーションする：ｍＲＮＡの純度、および修飾された塩基であるポリ（Ａ）テールなどの所与の領域における塩基の比率。ＮＭＲ分光を用いて、組成物中のｍＲＮＡのアイデンティティーを評価する。ゲル電気泳動を用いて、ｍＲＮＡを含有する組成物の純度を評価する。単一のｍＲＮＡ種を含有する純粋な組成物はゲル上で単一のバンドを産生し、異なるサイズの複数のｍＲＮＡ分子を含有する不純な組成物はゲル上で複数のバンドまたはスメアなバンドを産生する。液体カラム質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を用いて、修飾されたヌクレオチドの組み込みを評価する。修飾されたヌクレオチドは古典的なヌクレオチドとは異なる一般的にはより大きい分子量を有し、そのため、ｍＲＮＡ上へのより多くの修飾されたヌクレオチドの組み込みは、ｍＲＮＡ分子の質量のより多大なシフト、通常は増大をもたらすであろう。
細胞に基づくスクリーニングを用いて、蛋白質翻訳に対する修飾された塩基の効果を評価する。修飾されたｍＲＮＡを、古典的な塩基を含む未修飾のｍＲＮＡと平行して、ヒト細胞の別個の集団にトランスフェクションする。トランスフェクション後に、蛋白質産生の速度を、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡを包含する当分野において公知の複数の方法の１つによって評価する。トランスフェクションされた細胞内の修飾されたまたは未修飾のｍＲＮＡの安定性を、以下によって評価する：トランスフェクション後の所望の時点においてトランスフェクションされた細胞をリシスすること、核酸を単離すること、逆転写によってライセート中のｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製すること、および定量的ＰＣＲを用いてトランスフェクションされたｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡの量を定量すること。トランスフェクションされたｍＲＮＡによる自然免疫応答の誘導を、当分野において公知の複数の方法の１つを用いて定量する。例えば、Ｔｏｌｌ様受容体もしくはアダプター蛋白質のリン酸化されたシグナル伝達ドメインについてのＥＬＩＳＡ、またはＯＡＳ１などの外来性のＲＮＡの検出によって活性化される遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲに基づく定量などである。
治療薬アプローチでは、修飾されたｍＲＮＡをヒトまたは動物対象に投与し、その結果、対象の細胞のリボソームがｍＲＮＡによってコードされる蛋白質（単数または複数）を産生する。ｍＲＮＡはルシフェラーゼなどの生物発光蛋白質をコードし得、その結果、対象における蛋白質産生の効率がルシフェラーゼイメージング系を用いて測定され得る。ｍＲＮＡは抗原をコードし得、その結果、対象の細胞における抗原の産生は、対象が抗原に特異的な抗体および／またはＴ細胞を産生することをもたらす。抗原に対して対象によって生成される免疫応答を、以下を包含する当分野において公知の方法によって評価する：抗原に特異的な抗体を定量するためのＥＬＩＳＡ、中和抗体を定量するための中和アッセイ、およびＴ細胞または抗原特異的Ｔ細胞を包含する複数の型の免疫細胞を定量するためのフローサイトメトリー。
例４：ライゲーションによる修飾されたｍＲＮＡの産生．
序論
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のためのｍＲＮＡワクチンの最近の治験および承認によって証明されている通り、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）治療薬およびワクチンは薬物の新たなクラスとして迅速に確立されて来ている１，２。それらのプログラム可能性、インビボの蛋白質の急速な産生、比較的低コストの製造、および複数の蛋白質を同時に標的化するという可能性としてのスケーラビリティを原因として、ｍＲＮＡベクターは従来の蛋白質に基づく薬物の有望な代替と思われる３－５。ｍＲＮＡはインビボのトランスジェニック蛋白質をロバストに生成することが示されているが、ｍＲＮＡの比較的短い半減期は、この治療薬プラットフォームの臨床用途を限定し得る３，６。この問題は、いくつかのワクチン研究のケースのように、先には、動物研究の間にＲＮＡの複数の注射（例えば「ブースター」用量）によって回避されているが７－９、この戦略は可能性として治療薬用途および広範な分布を限定し得る。
化学修飾は、インビボ用途のためのｍＲＮＡの翻訳ポテンシャルをブーストおよび毒性を縮減するための有効な戦略である。修飾されたＵＴＰ誘導体（例えばシュードウリジン＆Ｎ１－メチルシュードウリジン）の組み込みは、ＲＮＡトランスフェクションによる自然免疫毒性を減少させるために広く用いられている１０－１２。環状ｍＲＮＡは、分解可能な５’および３’ＲＮＡ端のそれらの欠如をおそらくは原因として、それらの直鎖カウンターパートと比べて向上した半減期を有することが報告されている１３－１５。しかしながら、環状ｍＲＮＡは、修飾されたヌクレオチドの組み込みをロバストには忍容しないＩＲＥＳ要素へのそれらの依拠を原因とする総体的により低い発現レベルを被っている１５。加えて、エキソヌクレアーゼ耐性のヌクレオチドがｍＲＮＡ本体およびｍＲＮＡポリ（Ａ）テール上に組み込まれ、ＲＮＡ半減期の可変的な増大が報告されている１６，１７。ｍＲＮＡ本体へのＲＮＡポリメラーゼによる修飾されたヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）のランダムな組み込みは有望さを示すが、この戦略は試験され得るＮＴＰの化学空間を劇的に縮減する。なぜなら、多くの修飾されたＮＴＰはリボソーム機構によって良く忍容されるわけではなく、それゆえに総体的な翻訳効率を縮減するからである１８－２０。代替的な戦略は、酵素的なポリ（Ａ）テーリングの間に修飾されたＮＴＰを選択的に組み込むことである１６，１７。有望だが、この戦略はポリ（Ａ）ポリメラーゼ酵素に依拠し、これらは、酵素によって忍容される小さい化学的レパートリー、および部位特異的な様式で修飾されたヌクレオチドを組み込む能力のなさという限定に直面する。
合成の修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチドの３’端ライゲーションによって向上した蛋白質産生能を有するｍＲＮＡベクターを作出するための代替的な戦略を、本願において提示する。真核生物における古典的なｍＲＮＡ分解経路は、典型的には３’脱アデニル化から始まると考えられ、次に、デキャッピング複合体のリクルートおよび細胞の５’および３’エキソヌクレアーゼに対するｍＲＮＡの暴露をする２１。エキソヌクレアーゼ耐性のポリ（Ａ）テールを持つｍＲＮＡを、細胞において、未修飾のポリ（Ａ）テールを有するｍＲＮＡに対して相対的に、脱アデニル化に耐えかつより多くの蛋白質を産生するそれらの能力について試験した。
結果
ポリ（Ａ）テーリングの間の予備的な修飾されたＡＴＰ組み込み
複数の化学修飾されたＡＴＰ誘導体を、それらのポリ（Ａ）安定化活性についてスクリーニングした。具体的には、修飾されたＡＴＰを、ＧＦＰｍＲＮＡ鋳型を用いるポリ（Ａ）テーリング反応に、先に記載された類似のテーリングプロトコールを用いてスパイクした（図４Ａ）１７。修飾されたポリ（Ａ）テールを有するＧＦＰをコードするｍＲＮＡおよび未修飾のポリ（Ａ）テールを有するｍＣｈｅｒｒｙをコードするｍＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞に共トランスフェクションした。各トランスフェクションは、１つの型のみの修飾されたＧＦＰをコードするｍＲＮＡと対照のｍＣｈｅｒｒｙをコードするｍＲＮＡとを含有した。３日のタイムコースに渡って相対的なＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光比を測定することによって、ポリ（Ａ）テール上への修飾されたＮＴＰ組み込みの結果としてｍＲＮＡ翻訳半減期の大きくない違いが観察された。
３日に渡ってＨｅＬａ細胞において蛍光をモニタリングすることは、特にｄＡＴＰ（２’－デオキシアデノシン）およびアルファ－チオールＡＴＰ（アデノシン－５’－Ｏ－（１－チオ三リン酸））について、修飾されたＡＴＰスパイクインありのポリ（Ａ）テーリング反応の結果としての蛍光蛋白質産生の増大を明らかにした（図１）。Ｅ．コーライポリ（Ａ）ポリメラーゼは、蓋然的には、修飾されたＡＴＰを散発的にかつ準化学量論的なレベルで組み込んだ。Ｅ．コーライポリ（Ａ）ポリメラーゼはいくつかの修飾されたヌクレオチドを全く排除し、ポリアデニル化反応における修飾されたＡＴＰの存在にもかかわらず未修飾のポリ（Ａ）テールを産生したということもまた可能である。
化学修飾されたオリゴヌクレオチドのライゲーションは翻訳寿命を向上させる
異なる設計の部位特異的な化学修飾を試験し、代替的なヌクレオチド間連結部を組み込むために、代替的な修飾戦略を追求した。これにおいては、合成オリゴヌクレオチドを、既存のポリ（Ａ）テールを含有するｍＲＮＡの３’端にライゲーションした（図４Ｂ）。ＧＦＰコード配列およびポリ（Ａ）テールをコードする配列を含有するＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写を用いて、均一な長さを有するＧＦＰをコードするｍＲＮＡの集団を作出した。３’オリゴヌクレオチドライゲーションの効率を、３’ＵＴＲを標的化するＲＮａｓｅＨ反応を用いて決定した。これは、ゲル上において、ライゲーションされたおよび未ライゲーションのｍＲＮＡ３’端の明瞭な分離をもたらした（図６Ａ）。Ｔ４ＲＮＡリガーゼＩ（Promega）を用いるライゲーションは、ＲＮａｓｅＨ反応によって証明される通り１００％近い効率で働くことが観察された（図６Ａ）。
異なる化学修飾の有効性を比較するために、全てのオリゴヌクレオチドは２９ヌクレオチドの長さであるように設計した。各オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの３’端へのライゲーションを助長するための５’リン酸と、オリゴヌクレオチドのセルフライゲーションを防止するための３’ヒドロキシル基を欠如する３’ブロッキング基（ジデオキシＣ［ｄｄＣ］または反転ｄＴ［ＩｎｖｄＴ］）とを含有した。これは、ライゲーションがオリゴヌクレオチドのただ１コピーのみをｍＲＮＡに取り付けるであろうということを保証した。さらにその上、オリゴヌクレオチドの５’端における少なくとも６～８ヌクレオチドは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼＩ反応のための非構造化ハンドルを提供するための未修飾のｒＡヌクレオチドであった。修飾されたＲＮＡおよびＤＮＡオリゴヌクレオチド配列は表１に見出され得る。オリゴヌクレオチドを、先に記載されたＲＮａｓｅＨプロトコールを用いるキャラクタリゼーションの容易さのために、～６０ヌクレオチド鋳型によってコードされるポリ（Ａ）テールを含有する先行するパラグラフに記載されたＧＦＰをコードするｍＲＮＡの３’端にライゲーションした。
ライゲーションされた修飾されたＧＦＰをコードするｍＲＮＡを、トランスフェクションの内部対照としての用をなす未ライゲーションｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡ（Ｅ－ＰＡＰポリ（Ａ）テーリングされた）と併せて、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクションした。細胞サンプルをイメージングして、トランスフェクションの２４時間、４８時間、および７２時間後に相対的なＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度比を定量して、翻訳寿命に対する具体的な３’端修飾の効果を概算した。
２９個の未修飾のｒＡ連結部および３’ｄｄＣを含有する対照オリゴヌクレオチド（２９ｘｒＡ＿ｄｄＣ）のライゲーションは、未ライゲーションおよびモックライゲーション対照と比較して、ＨｅＬａ細胞培養におけるＧＦＰ蛍光をやや増大させた（５０～５５％の間、表２）。これは、蓋然的には、ポリ（Ａ）テールの２８ヌクレオチドの延長を原因とし、ことによると部分的には、鎖終結ｄｄＣヌクレオチドの存在を原因とした。加えて、３つの連続したホスホロチオエート（ＰＳ）連結部を含有するオリゴヌクレオチド（３ｘＳｒＡ＿ｄｄＣ、３ｘＳｒＡ＿ＩｎｖｄＴ、および３ｘＳｒＧ＿ＩｎｖｄＴ）のライゲーション産物は、各時点において２９ｎｔポリ（ｒＡ）対照オリゴのものと比較して、１４０％～２１０％増大したＧＦＰ産生を示した（図５）。この観察は、一般的に、ホスホロチオエート連結部がアンチセンスオリゴヌクレオチド治療に用いられる通りヌクレアーゼ耐性の活性を持つことと一貫している２２。
詳細なＰ値をサンプル１対サンプル２のフォーマットで列記する：７２時間比較。モックライゲーション対２９ｒＡ＿ｄｄＣ：４ｅ－７；２９ｒＡ＿ｄｄＣ対３ＸＳｒＡ＿ｄｄＣ：２ｅ－６；２９ｒＡ＿ｄｄＣ対３ＸＳｒＡ＿ＩｎｖｄＴ：０．００５；２９ｒＡ＿ｄｄＣ対３ＸＳｒＧ＿ＩｎｖｄＴ：１ｅ－５；２９ｒＡ＿ｄｄＣ対６ＸＳｒ（ＡＧ）：＜１ｅ－１５；２９ｒＡ＿ｄｄＣ対Ｇ４＿ｔｅｌｏ＿ＤＮＡ＿ＷＴ：９ｅ－６。２９ｒＡ＿ｄｄＣ対Ｇ４＿Ｃ９ｏｒｆ７２＿ＲＮＡ＿６ｘＳｒＧ：０．００３；２９ｒＡ＿ｄｄＣ対Ｇ４＿Ｃ９ｏｒｆ７２＿ＤＮＡ＿６ｘＳｒＧ：８ｅ－５；２９ｒＡ＿ｄｄＣ対Ｇ４＿ｔｅｌｏ＿ＤＮＡ＿６ｘＳＧ：０．００２。
驚くべきことに、３ｘｔｈｉｏ－ｒＧ＿ｉｎｖｄＴ連結部は、あらゆる時点において３ｘｔｈｉｏ－ｒＡ＿ｉｎｖｄＴよりもやや多大なＧＦＰ蛍光を実証したが（１７０％～２００％対１４０％～１８０％正規化されたＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ）、この違いは比較的小さかった（表２；図５）。この結果は、グアノシンと比べてアデニンに対するｍＲＮＡ脱アデニル化酵素の特異性に関係し得る２３，２４。しかしながら、これらの短い非構造化配列の違いは、ｍＲＮＡ翻訳寿命を変調させることにおいて比較的大きくない役割を演じた。さらにその上、３ｘＳｒＡ＿ｄｄＣおよび３ｘＳｒＡ＿ＩｎｖｄＴは、それぞれ１７０％～２１０％および１４０％～１８０％の正規化されたＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ産生を実証した（全ての時点を考慮する；表２）。これは、ライゲーションに用いられる小さい鎖終結ヌクレオチドのアイデンティティー（３’ジデオキシ－Ｃ＆３’反転ｄＴ）を変更することが、ｍＲＮＡ安定性の大きくない向上をもたらし得るということを示唆する。
ＲＮａｓｅ耐性のホスホロチオエート連結部の成功から、オリゴヌクレオチド上のＲＮＡヌクレオチドをＲＮａｓｅ耐性のＤＮＡヌクレオチドによって置き換えて、蛋白質翻訳収量に対するそれらの効果を決定した。予想外に、２３個のデオキシアデノシンを含有するオリゴヌクレオチド（２３ｘｄＡ＿ｄｄＣ）は、インビトロＲＮａｓｅＲ消化に対するオリゴヌクレオチドの耐性にもかかわらず（図６Ｂ）、翻訳半減期を実質的には向上させなかった（図５）。しかしながら、ＤＮＡ四重鎖（テロメア由来）ｓｓＤＮＡ配列は、２３個の非構造化デオキシアデノシンおよび「ＧｔｏＣ」ｓｓＤＮＡオリゴ対照ライゲーションよりも一貫して多大である安定化効果を呈示した（図５）。非構造化３’ｓｓＤＮＡ端を所持するｍＲＮＡは、細胞のｓｓＤＮＡエキソヌクレアーゼに対して敏感であり得るか、または代替的にはそれらがｍＲＮＡに対する相同性を所持する場合にはＲＮａｓｅＨ活性を誘発し得るという仮説が立てられた２５－２７。
最後に、増大した数のホスホロチオエート修飾を有するオリゴヌクレオチドとのライゲーション、および四重鎖（Ｇ４）二次構造との組み合わせを探って、これらの修飾が相乗的に作用して修飾されたｍＲＮＡを安定化し得るかどうかを決定した。非構造化ｓｓＲＮＡオリゴ上の６つの連続したホスホロチオエート連結部（６ｘＳｒ（ＡＧ））は、全ての時点において０．２６～０．６の標準偏差で最も一貫したレベルの安定化を提供した（表２；図５）。６つの連続したホスホロチオエート連結部を含有するｓｓＤＮＡおよびｓｓＲＮＡのＧ４オリゴ（Ｇ４＿Ｃ９ｏｒｆ７２＿ＲＮＡ＿６ｘＳｒＧ、Ｇ４＿Ｃ９ｏｒｆ７２＿ＤＮＡ＿６ｘＳｒＧ、およびＧ４＿ｔｅｌｏ＿ＤＮＡ＿６ｘＳＧ）もまた、対照オリゴと比べて向上した翻訳をもたらしたが、これらのコンストラクトの性能は異なるレプリケート間でより可変的であり、それぞれ０．７～１；０．８～１．１；および１．０～１．３のＳ．Ｄ．範囲を実証した（表２；図５）。
ＨｅＬａ細胞タイムコース実験は、ホスホロチオエート連結部を組み込むｍＲＮＡが、経時的に増大したＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙシグナルを有するということを実証した（図５）。これらの化学修飾は、ｍＲＮＡあたりの翻訳効率を増大させることによって直接的に、またはｍＣｈｅｒｒｙをコードする内部対照ｍＲＮＡに対して相対的にＲＮＡ分解の速度を縮減することによって間接的に作用し、それによって、観察されるＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙシグナルを増大させ得る。
考察
細胞質のｍＲＮＡ減衰の先の研究は、主要なｍＲＮＡ分解経路（例えば、脱アデニル化依存的な減衰）における律速ステップとしてポリ（Ａ）テール短縮化を同定した。このモデルに従って、ポリ（Ａ）テールの短縮化をｍＲＮＡベクターの脱活性化における律速ステップとして検討した。
ｍＲＮＡの３’端へのヌクレアーゼ耐性の化学的連結部を含有するオリゴヌクレオチドのライゲーションは、数日（２４～７２時間）の過程に渡ってｍＲＮＡ翻訳活性を増大させるために十分であり、６ｘＳｒ（ＡＧ）コンストラクトのケースでは細胞培養において１７０％～２２０％多くまでの蛋白質発現をもたらす。この戦略は、多様な目的のためのｍＲＮＡベクターにおける修飾されたヌクレオチド誘導体の化学空間を拡げ得る。
これらの結果は、ポリ（Ａ）短縮化が治療薬ｍＲＮＡの翻訳有効性の主要な決定因子であるということを示唆し、細胞質のｍＲＮＡ分解の先のモデルと整合する。これらの結果は、向上したｍＲＮＡ安定化のためのヌクレアーゼ耐性のポリ（Ａ）結合蛋白質（ＰＡＢＰ）結合アプタマー／オリゴヌクレオチドによるｍＲＮＡテールの置き換えのための情報となる。本願において詳述される戦略は、他の型の修飾、例えば加水分解耐性の７－メチルグアノシン５’キャップ２８，２９、修飾された５’ＵＴＲ領域３０、またはｍＲＮＡ本体上のエンドヌクレアーゼ／加水分解耐性の修飾されたヌクレオチドにもまた適合性である。このライゲーション戦略は、ｍＲＮＡ治療薬を、容易に合成される化学修飾されたアプタマー、例えばペプチド核酸31、ロックド核酸32、または他の化学基と組み合わせるために一般的に好適である。
方法
プラスミドクローニング、キャラクタリゼーション、および精製
ｐＣＳ２ベクター上にｈＭＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙをコードするプラスミド（それぞれＷＸ２８およびＷＸ２６）を得た。これらのプラスミドは以下を含有した（５’－３’の順序で）：ＳＰ６プロモーター配列、５’ＵＴＲ、蛍光蛋白質コード配列（ＣＤＳ）、３’ＵＴＲ、およびＮｏｔＩ制限部位。
Ｑ５（登録商標）部位特異的変異導入キット（ＮＥＢ）を用いて、フォワードプライマー上のポリ（Ａ）＆リバースプライマー上のポリ（Ｔ）をコードするプライマーを用いて、プラスミドに対するＰＣＲを行った。これの次に、ＫＬＤ酵素処置、それから、ZymoPUREプラスミドミニプレップキットを用いる単離のためのNEB Stabl細胞への形質転換、およびGenewizによるサンガーシーケンシングをした。
ｍＲＮＡ合成およびキャラクタリゼーション
ＧＦＰｍＲＮＡを、ＳＰ６プロモーター、次にｈＭＧＦＰのＣＤＳおよび鋳型によってコードされるポリ（Ａ）テールを含有するＷＸ２８ｘＥｓｐ３ｉプラスミドから合成した。プラスミドを、ポリ（Ａ）領域の直ちに３’に所在する単一のＥｓｐ３ｉ部位によって直鎖化した。直鎖化されたプラスミドをそれからZymo ResearchからのDNA Clean ＆ Concentrator－25キットを用いて精製した。
５’キャッピングされた修飾されたｍＲＮＡをmMESSAGE mMACHINE（商標）ＳＰ６転写キットからのＳＰ６酵素および反応緩衝液を用いて調製した。キットによって提供される２×ＮＴＰ／キャップ溶液は、以下を含有する２×ＮＴＰ／キャップ調製物によって置き換えた：１０ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＣＴＰ、２ｍＭのＧＴＰ、８ｍＭの３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧＲＮＡキャップ構造アナログ、および１０ｍＭのＮ１－メチルシュードウリジン－５’－三リン酸。Superase－InＲＮａｓｅ阻害剤を１：２０（ｖ／ｖ）の最終濃度で追加した。ＩＶＴ反応アセンブリおよび２～４時間に渡る３７℃におけるインキュベーションの後に、反応を、MEGAclear（商標）転写クリーンアップキットを用いる反応精製に先立って、３７℃で１時間に渡って１～２μｌのTURBO DNAseによって処置した。
Superase－InＲＮａｓｅ阻害剤が、精製されたｍＲＮＡサンプルに１：５０（ｖ／ｖ）の最終濃度で追加され、長期保存のために－８０℃でサンプルを保存した。精製されたｍＲＮＡはライゲーションに先立ってNanodropによって測定して濃度を概算したが、ｍＲＮＡは細胞に基づく試験のためのトランスフェクションに直ちに先立って正規化のためにQubit RNA HSアッセイを用いて測定した。
未修飾のポリ（Ａ）ポリメラーゼテーリングされたｍＲＮＡの調製のために、ｄｓＤＮＡ鋳型をＮｏｔＩ－ＨＦを用いてＷＸ２８およびＷＸ２６プラスミドの直鎖化によって生成し、Zymo DNA Clean ＆ Concentrator－25を用いて消化産物をカラム精製した。インビトロ転写を上に記載されたプロトコールを用いて行った。ただし、TURBO DNAse消化後に、Ｅ－ＰＡＰポリ（Ａ）テーリングキットを用いるポリ（Ａ）テーリングの余分のステップを包含した。ｍＲＮＡの精製および保存は上に記載された通りであった（例えば、MEGAclear転写クリーンアップキットを用いる）。
修飾されたＥ．コーライポリ（Ａ）ポリメラーゼテーリング
修飾されたＥ－ＰＡＰテーリング実験では、基質は、直鎖化されたＷＸ２８鋳型によるＩＶＴから生成されたテーリングなしのＧＦＰｍＲＮＡであった。プロトコールはＥ－ＰＡＰポリ（Ａ）テーリングキットからの酵素および緩衝液を利用した。「１０ｍＭトータル」ＡＴＰストック溶液を、各修飾されたＡＴＰスパイクインについて調製し、その結果、特定のパーセンテージのＡＴＰを修飾されたＡＴＰ誘導体（ＸＡＴＰ）によって置き換えた。例えば、２５％ｄＡＴＰサンプルは２．５ｍＭのｄＡＴＰ、７．５ｍＭのＡＴＰストック溶液のアセンブリを要求するであろう。テーリング反応を次の通りアセンブリした：
１．５μｇ テーリングなしのＧＦＰｍＲＮＡ
５μｌ ５×Ｅ－ＰＡＰ緩衝液
２．５μｌ １０ｍＭのＸＡＴＰ：ＡＴＰストック溶液（各サンプルについて異なる）
２．５μｌ ２５ｍＭのＭｎＣ１２
１μｌ Superase－InＲＮａｓｅ阻害剤
１μｌ Ｅ－ＰＡＰ酵素
ヌクレアーゼフリー水によって２５μｌトータル体積まで
反応を３７℃で１時間に渡ってインキュベーションし、それから、０．５μｌの５００ｍＭのＥＤＴＡの追加によってクエンチした。これらのテーリングされたｍＲＮＡを、それから、MonarchＲＮＡクリーンアップキット（５０μｇ）を用いてカラム精製した。Superase－InＲＮａｓｅ阻害剤を、精製されたｍＲＮＡに１：５０（ｖ／ｖ）の最終希釈で追加し、ｍＲＮＡをトランスフェクションに先立って－８０℃で保存した。
次の修飾されたＡＴＰ誘導体（ＸＡＴＰ）をポリアデニル化実験に用いた：アデノシン５’－三リン酸（ＡＴＰ）；Ｎ６－メチルアデノシン－５’－三リン酸（ｍ６Ａ）；２’－Ｏ－メチルアデノシン－５’－三リン酸；アデノシン－５’－Ｏ－（１－チオ三リン酸）；デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）；２’－アミノ－２’－デオキシアデノシン－５’－三リン酸。
修飾されたオリゴヌクレオチドの３’端ライゲーション
ライゲーション反応をＴ４ＲＮＡリガーゼＩを用いて行った。反応を次の通りアセンブリした：
２μｇ キャッピングされたｍＲＮＡ
２００ｐｍｏｌ 化学修飾オリゴ
２μｌ Superase－InＲＮａｓｅ阻害剤
２０μｌ ５０％ＰＥＧ－８０００
５μｌ １００％ＤＭＳＯ
５μｌ １０×Ｔ４ＲＮＡリガーゼ緩衝液
５μｌ Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（Promega）
５０μｌのトータル体積まで（ヌクレアーゼフリー水によって）
反応を３７℃で３０分に渡ってインキュベーションし、次に、１μｌの５００ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の追加による反応の不活性化をした。反応を、１体積のヌクレアーゼフリー水（例えば５０μｌ）の追加、次に、１μｌのSuperase－Inを含有する０．５体積のAMPure XP（例えば２５μｌ）の追加によって希釈した。反応を製造者のプロトコールに従って精製し、ｍＲＮＡを、１：５０（ｖ／ｖ）比でSuperase－Inを含有するヌクレアーゼフリー水を用いてAMPureビーズから溶出した。
ＲＮａｓｅＨゲルに基づくアッセイに従うと不完全であったライゲーションについては、ライゲーションを、ＤＭＳＯを反応から省いた改変された条件を用いて行った。必要なときには、これは一般的にはより効率的なライゲーションをもたらした。
ＲＮａｓｅＨアッセイ
塩化カリウム（ＫＣｌ）ストック溶液を調製し、ＲＮａｓｅＨアッセイに先立ってｍＲＮＡにｓｓＤＮＡオリゴをアニーリングするために用いた。ＫＣｌトック溶液は以下を含有した：５０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、１：２００（ｖ／ｖ）のSuperase－InＲＮａｓｅ阻害剤。ヌクレアーゼフリー水を用いてその最終体積に合わせた。ｓｓＤＮＡプローブはＩＤＴに発注され、配列ＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣ（配列番号１８）を有した。
次の反応を調製して、ｍＲＮＡを前述のｓｓＤＮＡプローブにアニーリングした：
２００ｎｇ ｍＲＮＡサンプル（精製された）
２ｐｍｏｌ ｓｓＤＮＡプローブ
２μｌ ストック溶液：５０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、１：２００のSuperase－In
ヌクレアーゼフリー水を用いて１０μｌ体積まで
反応を７０℃で５分に渡って変性させ、次に、ベンチトップサーモサイクラーによって０．２℃／ｓｅｃの速度で室温（２５℃）への冷却をした。プローブアニーリング後に、１μｌの耐熱性ＲＮａｓｅＨおよび１μｌの１０×緩衝液を各反応に追加し、これを５０℃で３０ｍｉｎに渡ってインキュベーションした。反応インキュベーション後に、サンプルを１μｌプロテイナーゼＫの追加によって消化し、室温で５分に渡ってインキュベーションした。爾後に、サンプルを、５０ｍＭの最終濃度でＥＤＴＡを足しておいた１体積のゲルローディング緩衝液ＩＩと混合した。
１×ローディング緩衝液中のサンプルを、６％のNovex（商標）ＴＢＥ－尿素ゲル上でのローディングおよび分解に先立って３～５分に渡って７０℃で変性させた。
オリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅＲ消化
２００ｎｇのオリゴを、１×ＲＮａｓｅＲ反応緩衝液および１０単位のＲＮａｓｅＲを含有する１０μｌのトータル反応体積でインキュベーションした。反応を３７℃で１時間に渡ってインキュベーションし、それから１μｌプロテイナーゼＫによって消化し、１×ゲルローディング緩衝液ＩＩ中で変性させた。それらを１５％のNovexＴＢＥ－尿素ゲルで流した。
哺乳動物細胞培養およびｍＲＮＡトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞（ＣＣＬ－２、ＡＴＣＣ）は、１０％ＦＢＳを含有するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）培養培地によって３７℃インキュベータにおいて５％ＣＯ２で維持し、３日毎に１：８の比で継代した。細胞培養物は、ヘキスト染色および顕微鏡法イメージングによって定期的にマイコプラズマコンタミネーションを不含だと確認された。
ｍＲＮＡトランスフェクションの前の日に、細胞を１２ウェルプレート上の個々のウェルに７５％コンフルエンスで播種した。翌日に、５００ｎｇのｍＣｈｅｒｒｙ（内部対照）ｍＲＮＡおよび合成テールを有する５００ｎｇのＧＦＰｍＲＮＡ（濃度はQubitによって決定した）を、３ｕＬのLipofectamine MessengerMAXトランスフェクション試薬を用いて各ウェルにトランスフェクションした。ｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡのみまたはトランスフェクション試薬のみまたはトランスフェクションされていない細胞を含有する追加の対照を包含した。６時間のインキュベーション後に、Lipofectamine／ｍＲＮＡトランスフェクション混合物を除去し、細胞をＤＰＢＳによって１回リンスし、トリプシン処理して、トランスフェクションの２４時間、４８時間、および７２時間後の蛍光蛋白質定量のためにそれぞれ６：４：３の比で３つのガラス底２４ウェルプレート（ポリＤ－リジンコーティング）に再播種した。
蛍光蛋白質の共焦点イメージングおよび定量
蛍光蛋白質イメージングの前に、培養培地を除去し、細胞を、核染色培地（１：２０００希釈のヘキスト３３３４２を有するFluoroBriteＤＭＥＭ）中において３７℃で１０ｍｉｎに渡ってインキュベーションする前に、ＤＰＢＳによって１回リンスした。
核（ヘキスト）、ＧＦＰ、およびｍＣｈｅｒｒｙの共焦点画像を、１０×空気対物を有するLeica Stellaris 8によって９００ｎｍ＊９００ｎｍのピクセルサイズで取った。各四分円から１つの４つの代表的な視野を各ウェルについて取った。同じイメージング設定を、比較されるべき全てのサンプルに用いた。励起／検出波長は「励起波長／～［検出波長範囲］」フォーマットで以下であった：ヘキスト：ダイオード４０５ｎｍ／～［４３０～４８０］ｎｍ；ＧＦＰ：ＷＬＬ４８９ｎｍ／～［５００～５７６］ｎｍ；ｍＣｈｅｒｒｙ：ＷＬＬ５８７ｎｍ／～［６０２～６７６］ｎｍ。
ＳＴＡＲｍａｐを用いるトランスフェクションされた細胞培養物におけるｍＲＮＡ定量
ｍＣｈｅｒｒｙおよびＧＦＰｍＲＮＡの数量を、バーコーディングされたＤＮＡコロニーとして個々のｍＲＮＡ分子を検出するイメージングに基づく方法ＳＴＡＲｍａｐ３３を用いて、トランスフェクションされた細胞において測定した。ワン（Wang）らによって記載された細胞培養のためのＳＴＡＲｍａｐ手続きを踏襲した３３。
簡潔には、蛍光蛋白質イメージング後に、次ステップの前の－２０℃（１週まで）における予冷メタノールによるさらなる固定および透過処理の前に、細胞を１．６％ＰＦＡ／１×ＰＢＳによって室温で１０ｍｉｎに渡って固定した。爾後に、メタノールを除去し、細胞を、ＰＢＳＴＲ／グリシン／ｔＲＮＡ（０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．５％SUPERaseIn、１００ｍＭグリシン、１％酵母ｔＲＮＡを有するＰＢＳ）によって室温で１５ｍｉｎに渡って再水和し、次にＰＢＳＴＲによる１回の洗浄をした。サンプルを、それから、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＧＦＰｍＲＮＡ配列を標的化するＳＮＡＩＬプローブと、ハイブリダイゼーション緩衝液（２×ＳＳＣ、１０％ホルムアミド、１％Ｔｗｅｅｎ－２０、２０ｍＭのＲＶＣ、０．５％SUPERaseIn、１％酵母ｔＲＮＡ、１００ｎＭの各プローブ）中において４０℃で一晩ハイブリダイゼーションした。細胞を、それから、室温におけるＰＢＳＴＲによる１回のリンスの前に、３７℃で２回ＰＢＳＴＲ（各洗浄２０ｍｉｎ）および３７℃で１回高塩濃度洗浄緩衝液（４×ＳＳＣを有するＰＢＳＴＲ）によって洗浄した。ライゲーション反応を２時間に渡って室温で行って、プライマーに隣接するパドロックプローブを環状化した。ＰＢＳＴＲによる２つの洗浄の後に、ローリングサークル増幅を２時間に渡って３０℃でＰｈｉ２９を用いてプライマーから開始した。アミノｄＵＴＰをスパイクインした。ＰＢＳＴＲによるもう２つの洗浄後に、ＤＮＡアンプリコンを、２時間に渡って室温でＰＢＳＴ緩衝液中の２０ｍＭのＭＡ－ＮＨＳによって重合可能であるように修飾した。一晩の室温における蛍光蛋白質のプロテイナーゼＫ消化の前に、サンプルをそれからハイドロゲル－細胞ハイブリッドに変換した。蛍光検出オリゴヌクレオチドによって洗浄およびイメージング緩衝液（２×ＳＳＣ、１０％ホルムアミド）中において３７℃で１時間に渡って染色する前に、サンプルをＰＢＳＴによって３回洗浄した。最後に、サンプルを室温で洗浄およびイメージング緩衝液によって３回洗浄し、洗浄およびイメージング緩衝液中におけるイメージング前にＤＡＰＩによって染色した。
共焦点イメージングスタックを、４０×油浸対物を有するLeica Stellaris 8によって２８３ｎｍ＊２８３ｎｍのピクセルサイズで取った。１４ｕｍスタックを１ｕｍ／ステップで１５ステップについてイメージングした。各四分円から１つの４つの代表的な視野を各ウェルについて取った。
蛍光検出プローブ配列
ｍＣｈｅｒｒｙアンプリコン検出プローブ：／５Ａｌｅｘａ６４７Ｎ／ＣＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＧＡＴＡＡＣＡＴ（配列番号３１）
ｈＭＧＦＰアンプリコン検出プローブ：／５Ａｌｅｘ５４６Ｎ／ＴＣＧＴＡＧＡＣＴＡＡＧＡＴＡＡＣＡＴ（配列番号３２）
参照
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例５：哺乳動物細胞における高度に効率的な蛋白質発現のための化学修飾されたｍｏｃＲＮＡ．
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のためのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ワクチンの最近の治験および承認によって証明されている通り１，２、ｍＲＮＡは従来の蛋白質に基づく薬物の新興のかつ有望な代替である。これは、主に、そのプログラム可能性、インビボの蛋白質の急速な産生、比較的低コストの製造、および複数の蛋白質を同時に産生するための可能性としてのスケーラビリティを原因とする３－５。しかしながら、ｍＲＮＡはインビボの治療薬蛋白質をロバストに生成することが示されているが３，６－８、それらの比較的短い寿命は、高い数量の蛋白質産生が要求されるそれらの臨床用途を限定し得る３，９。治療薬蛋白質の意図される機能に依存して、ｍＲＮＡ薬物の投与量および処置継続期間は桁が様々であり得る。ワクチンでは、ナノグラムからマイクログラムの範囲の抗原の発現が免疫応答を誘起するために十分であり得る３。しかしながら、成長因子、ホルモン、または抗体では、治療薬の用量は、蛋白質のマイクログラムからミリグラム、または可能性としてはグラム数量までに及び得る３。高い蛋白質産生を達成するためにｍＲＮＡ数量を単純にスケールアップすることは、ｍＲＮＡのトランスフェクションに固有の自然免疫刺激を原因として用量依存的な毒性に至り得る３。因子のこの組み合わせは、特にｍＲＮＡの寿命および／または翻訳効率の向上によって、投与量を増大させることなしに、トランスジェニック蛋白質産生をブーストするようにｍＲＮＡベクターを操作する必要を駆動する。
化学修飾は、ｍＲＮＡベクターの性能を向上させるための有効なやり方である。「未修飾の」アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、およびウリジン（Ｕ）からなるインビトロ転写（ＩＶＴ）によって調製された外来性のｍＲＮＡは、蛋白質発現を抑制する自然免疫毒性を強く誘発する１０－１２。シュードウリジンおよびＮ１－メチルシュードウリジンなどの修飾されたＵ誘導体の組み込みは、具体的にはＴｏｌｌ様受容体認識をブロッキングすることによって自然免疫毒性を減少させることによって、翻訳を増大させるために広く用いられている１０－１４。しかしながら、この戦略は、現行では、組み込みのために利用可能なｍＲＮＡ修飾の化学空間を限定する。なぜなら、多くの修飾されたヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）はＲＮＡポリメラーゼまたはリボソーム機構によって忍容されないからである。その上、ｍＲＮＡの蛋白質コード領域上のある種の化学修飾は、可能性として、損なわれた翻訳を引き起こし得る１４－１６。コード領域を修飾することなしにｍＲＮＡ安定性を増大させるための代替的な戦略は、細胞のエキソヌクレアーゼに対して特に弱いｍＲＮＡポリ（Ａ）テールの酵素的延長の間に、修飾されたＮＴＰを選択的に組み込むことである１７，１８。有望だが、この戦略はポリ（Ａ）ポリメラーゼに依拠し、これらは、再び、限定された化学的レパートリー、酵素的組み込みの可変的な効率、およびポリ（Ａ）テール長の可変的な分布の生成に直面する１８。
前述の限定を克服するために、増強された蛋白質産生能を有するｍＲＮＡに基づく発現系のメッセンジャー－オリゴヌクレオチドコンジュゲート化ＲＮＡ（ｍｏｃＲＮＡ）を効率的に構築するための、ライゲーションに基づく戦略を開発した。このアプローチでは、合成オリゴヌクレオチド（オリゴ）を、鋳型によってコードされるポリ（Ａ）テールを含有するｍＲＮＡの３’端とライゲーションする（図７Ａおよび７Ｂ）。これは、ＲＮＡベクター上への化学修飾の精確なかつモジュール化されたエンコードを可能にする。これは、ＲＮＡポリメラーゼによって媒介される組み込みを用いては可能ではない。ポリ（Ａ）テールの短縮化は細胞のｍＲＮＡ減衰における重大なステップとして同定されており、ポリ（Ａ）テールはキャップ依存的な翻訳に不可欠である１９，２０。それゆえに、ｍｏｃＲＮＡ系の概念実証として、種々のヌクレアーゼ耐性のモチーフ２１を設計し、ポリ（Ａ）テールを保護するための合成オリゴヌクレオチドにおいて試験した。これはｍＲＮＡベクターの代替的なバリアントと比較して優れた蛋白質発現を実証した。
結果および考察
ライゲーションによるｍｏｃＲＮＡの高度に効率的な合成
インビトロ転写された（ＩＶＴ）ｍＲＮＡおよび合成オリゴの間のコンジュゲート化を可能にするために、次の要素を有する各オリゴを設計した（図７Ａ、表４）：（１）Ｔ４ＲＮＡリガーゼＩによってＩＶＴｍＲＮＡの３’末端とライゲーションするための、オリゴの５’端における５’リン酸および少なくとも６つの非構造化ＲＮＡヌクレオチド；（２）オリゴセルフライゲーションを防止するための３’ブロッキング基（２’－３ジデオキシシチジン［ｄｄＣ］または反転２’－デオキシチミジン［ＩｎｖｄＴ］）；（３）翻訳向上の信頼できる比較を可能にするためのポリ（Ａ）領域の同等の長さ。オリゴの３’ブロッキング基は、反応中における大モル過剰のオリゴを可能にして、ＩＶＴｍＲＮＡからｍｏｃＲＮＡ産物への１００％近い変換を保証する（図７Ａおよび７Ｂ、表４）。
ｍｏｃＲＮＡ発現系を実証するために、ヒト化モンスター緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、次に鋳型によってコードされるポリ（Ａ）テールを含有するプラスミド鋳型をクローニングした（プラスミド：ｐＣＳ２＿ＧＦＰ－６０Ａ）。これは、均一なポリ（Ａ）長を有する翻訳可能なｍＲＮＡを保証する。５’アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）およびＮ１－メチルシュードウリジンによるウリジンの１００％置き換えを有するＧＦＰをコードするｍＲＮＡ（ＧＦＰ－６０Ａ）を、ＳＰ６ポリメラーゼによるＩＶＴを用いて合成した。ＩＶＴｍＲＮＡを、Ｔ４ＲＮＡリガーゼＩを用いる３’オリゴライゲーションによってｍｏｃＲＮＡへとさらに修飾した。コンジュゲート化効率は、ＲＮａｓｅＨおよび３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を標的化するＤＮＡオリゴを用いる配列特異的なＲＮＡ切断、次に、コンジュゲート化されたおよびコンジュゲート化されていないｍＲＮＡ３’端を分解するためのゲル電気泳動によって決定した。ＲＮａｓｅＨアッセイは、前述のＧＦＰ－６０ＡｍＲＮＡを用いる全てのｍｏｃＲＮＡコンストラクトについて１００％近いコンジュゲート化効率を示し（図７Ｂ、１２Ａ）、このコンジュゲート化戦略の一般的な応用性を示唆した。
ヌクレアーゼ耐性のｍｏｃＲＮＡはヒト細胞における蛋白質産生およびＲＮＡ安定性を増大させる
内在性の脱アデニル化機構が３’から５’のエキソヌクレアーゼ複合体であり、脱アデニル化が細胞内の古典的なＲＮＡ減衰の律速ステップであるということから、ポリ（Ａ）テールの後に３’末端におけるヌクレアーゼ耐性の要素を導入することは、ポリ（Ａ）テールを無傷に保つことによってＲＮＡ翻訳能を増大させるための有効なやり方であろうという仮説が立てられた。このために、ｍｏｃＲＮＡコンストラクトを、合成オリゴ（３ｘＳｒＡ＿ｄｄＣ、３ｘＳｒＡ＿ＩｎｖｄＴ、および３ｘＳｒＧ＿ＩｎｖｄＴ、ならびに６ｘＳｒ（ＡＧ）、表４）を用いて合成し、３’末端脱アデニル化酵素耐性の修飾、例えばホスホロチオエートＰＳ連結部１８およびＡからＧの置換２２を含有した。ＧＦＰをコードするｍｏｃＲＮＡコンストラクトを、トランスフェクションの内部対照としての用をなすＥ－ＰＡＰポリ（Ａ）テーリングされたｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡと併せてＨｅＬａ細胞にトランスフェクションした。ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度比を、トランスフェクション後の２４時間、４８時間、および７２時間時点で、共焦点顕微鏡法によって定量した。蛍光定量は、２９ｎｔ長のポリ（Ａ）トラクト、次に３’ｄｄＣ（２９ｒＡ＿ｄｄＣ）を含有する対照ｍｏｃＲＮＡコンストラクトが、モックライゲーション対照（修飾されたオリゴなしでリガーゼによって処置されたＧＦＰ－６０ＡｍＲＮＡ）と比較してＧＦＰ蛍光を６９％まで増大させるということを示した。この増大は、蓋然的には、ポリ（Ａ）テールの延長およびことによると鎖終結ヌクレオチドの存在を原因とした。末端のＰＳ連結部を含有する全てのオリゴのうち、６つの連続したホスホロチオエートを有する非構造化一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡオリゴ（６ｘＳｒ（ＡＧ）、配列は表４）は、試験された他の修飾されたオリゴと比較して、ＧＦＰの最も高い発現（「モックライゲーション」に対して正規化して２４～７２時間で２９０％～３７７％）を一貫して提供した（図８Ａ～８Ｂ；表６）。
ＰＳ修飾されたｍｏｃＲＮＡの成功から、３’末端のＲＮａｓｅ耐性のＤＮＡ連結部が蛋白質翻訳を類似に増大させ得るという仮説が立てられた。テロメア由来のＤＮＡ四重鎖（Ｇ４＿ｔｅｌｏ＿ＤＮＡ＿ＷＴ）配列は、非構造化「ＧｔｏＣ」ＤＮＡオリゴ対照ライゲーションと比較して蛋白質翻訳を有意に（２４～７２時間で１５０％～ｌ７０％）向上させた（図８Ａおよび８Ｂ；表６）。これらの結果は、それらの３’端に非構造化ｓｓＤＮＡを含有するｍｏｃＲＮＡが、細胞のヌクレアーゼ、例えばｓｓＤＮＡ特異的ヌクレアーゼ２３，２４および少々のｓｓＤＮＡｓｅ活性を含有するＣＣＲ４（脱アデニル化複合体のコンポーネント）２５に対して敏感なままであり得るということを示唆する。代替的な可能性は、非構造化ｓｓＤＮＡは、それらがｍＲＮＡ配列に対して部分的に相補的である場合にはＲＮａｓｅＨによるｍＲＮＡ分解を誘発し得るということである２６。まとめると、これらの結果は、３’末端に構造化ＤＮＡ四重鎖を含有するｍｏｃＲＮＡは蛋白質発現を最も有効に増大させ得るが、非構造化ｓｓＤＮＡテールは発現を幾分少ない程度に向上させ得るということを指示している。
ＰＳ修飾をＧ４二次構造と組み合わせることがｍｏｃＲＮＡを相乗的に安定化し得るかどうかをさらに探った。６つの連続したＰＳ連結部を含有するｓｓＤＮＡおよびｓｓＲＮＡのＧ４オリゴ（Ｇ４＿Ｃ９ｏｒｆ７２＿ＲＮＡ＿６ｘＳｒＧ、Ｇ４＿Ｃ９ｏｒｆ７２＿ＤＮＡ＿６ｘＳｒＧ、およびＧ４＿ｔｅｌｏ＿ＤＮＡ＿６ｘＳｒＧ）は、非構造化６ｘＳｒ（ＡＧ）オリゴを含有するｍｏｃＲＮＡと類似に、向上した翻訳のレベルをもたらした（図８Ａおよび８Ｂ；表６）。
ｍｏｃＲＮＡの向上した翻訳は、縮減されたＲＮＡ分解速度、またはｍＲＮＡ分解速度論に影響することなしにｍＲＮＡあたりの翻訳効率の直接的な増大どちらかを原因とし得た。翻訳向上のメカニズムを検証するために、ＲＴ－ｑＰＣＲ定量を、種々のｍｏｃＲＮＡライゲーションコンストラクトによってトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞に対して、トランスフェクションの４８時間後に行った（表７）。相対的なＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙＲＮＡ比は、各コンストラクトについて観察されたバルクＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ蛋白質蛍光比と良く相関するということが見出され（図８Ｃ、ピアソンｒ＝０．８４、Ｐ＝２ｅ－４；図１３Ｂおよび１３Ｃ）、修飾されたオリゴが、主として細胞におけるｍＲＮＡ数量を安定化することによって蛋白質翻訳を向上させるということを示唆した。
脂質によって媒介されるトランスフェクションおよびエンドソーム崩壊の確率論的性質から、個々の細胞間においてトランスフェクションされたｍＲＮＡの数の大きいばらつきがあり得る２７。ｍｏｃＲＮＡの観察された翻訳向上が細胞集団全体に渡る翻訳の一般的な増大を表すのかどうか、またはそれが高発現細胞の小さいセットからもたらされるのかどうかをキャラクタリゼーションするために、ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ蛋白質蛍光およびＲＮＡコピー数の比を単一細胞レベルで定量した。ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光比の単一細胞蛍光分析（図１３Ａ）は、バルク測定で観察された傾向を再現した（図８Ａ）。トランスフェクションされた細胞におけるｍＲＮＡ存在量を、インサイチュトランスクリプトーム法のＳＴＡＲｍａｐ２８を用いてさらに定量した。細胞内分解度で、固定された細胞または組織サンプルにおける標的ｍＲＮＡ配列のコピー数を同定することができる（図８Ｄ、１３Ｂ）。ＳＴＡＲｍａｐ画像において、蛍光の斑点はそれぞれ遊離の「サイトゾル」ＧＦＰ－ｍｏｃＲＮＡまたはｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡに対応する。大きい細胞内顆粒は、蓋然的には、ＧＦＰ－ｍｏｃＲＮＡおよびｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡの多くのコピーを含有する脂質トランスフェクションベシクルに対応する（図８Ｄ）。ＲＴ－ｑＰＣＲは（サイトゾルの、およびトランスフェクション試薬に含有される）ｍＲＮＡのバルク測定を提供するが、ＳＴＡＲｍａｐは、大きい凝集体からのシグナルをフィルターアウトすることによって、これらの２つのシグナルの空間的分離を可能にし、個々のサイトゾルｍＲＮＡの直接的定量を可能にする。重要なことに、単一細胞レベルでのサイトゾルＲＮＡ画分の定量は、ｍｏｃＲＮＡの安定化効果が細胞集団全体に渡ってもまた生起するということを指示している（図１３Ｃおよび１３Ｄ）。
蛋白質およびＲＮＡ速度論は、細胞におけるｍｏｃＲＮＡの増大した安定性を示す
ＰＳ＋Ｇ４オリゴの初期スクリーニングから観察された翻訳には、可能性として、異なる長さによるポリ（Ａ）テールの延長による交絡があり得るということはもっともらしく見えた（６ｘＳｒ（ＡＧ）では２６個のＡ、Ｇ４＿Ｃ９ｏｒｆ７２＿ＲＮＡ＿６ｘＳｒＧ、Ｇ４＿Ｃ９ｏｒｆ７２＿ＤＮＡ＿６ｘＳｒＧ、およびＧ４＿ｔｅｌｏＪＤＮＡ＿６ｘＳｒＧでは６つのＡ）。直接的にこの点に迫るために、比較を、６ｘＳｒ（ＡＧ）と類似の数のＡを含有する再設計されたより長いＰＳ＋Ｇ４オリゴとの間で行った：２６ｒＡ＿Ｇ４＿Ｃ９ｏｒｆ７２＿ＲＮＡ＿６ｘＳｒＧ、２６ｒＡ＿Ｇ４＿Ｃ９ｏｒｆ７２＿ＤＮＡ＿６ｘＳｒＧ、および２６ｒＡ＿Ｇ４＿ｔｅｌｏ＿ＤＮＡ＿６ｘＳｒＧ。ＨｅＬａ発現タイムコースは、６ｘＳｒ（ＡＧ）が発現向上において２６Ａ含有Ｃ９ｏｒｆ７２オリゴを上回る性能であるということを指示した。しかしながら、２６ｒＡ＿Ｇ４＿ｔｅｌｏ＿ＤＮＡ＿６ｘＳｒＧは、６ｘＳｒ（ＡＧ）と比べてそこそこの翻訳向上を実証した（２４～７２時間の間に１７～２４％、図１４Ａ）。これらのデータは、特定のテロメア構造が、ＰＳ連結部によって提供される安定化を越えて、比較的低いレベルの追加の安定化を追加し得るということを示唆する。６ｘＳｒ（ＡＧ）および２６ｒＡ＿Ｇ４＿ｔｅｌｏ＿ＤＮＡ＿６ｘＳｒＧｍｏｃＲＮＡの間の発現の類似のレベルを原因として、これらの２つのオリゴを蛋白質発現の下流の速度論的分析によって調べた。
様々な時点におけるｍｏｃＲＮＡ翻訳の速度論をキャラクタリゼーションするために、デグロンタグ付きのホタルルシフェラーゼをコードするｍｏｃＲＮＡを生成した。デグロン（マウスオルニチンデカルボキシラーゼに由来するＰＥＳＴ２９）は、ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ半減期を２０．４時間から概算で０．９２時間に縮減した（図９Ａ）。２つの最も良い性能のオリゴ６ｘＳｒ（ＡＧ）および２６ｒＡ＿Ｇ４＿ｔｅｌｏ＿ＤＮＡ＿６ｘＳｒＧのどちらかを含有するルシフェラーゼ－ＰＥＳＴｍｏｃＲＮＡを生成し、発光を、ＨｅＬａ細胞へのｍＲＮＡトランスフェクション後の時間の関数として記録した。トランスフェクションの８時間後に、６ｘＳｒ（ＡＧ）および２６ｒＡ＿Ｇ４＿ｔｅｌｏ＿ＤＮＡ＿６ｘＳｒＧｍｏｃＲＮＡ（ルシフェラーゼ－デグロンをコードする）は、モックライゲーションよりもやや多大なレベルの翻訳を実証した（それぞれ４４％および３９％多大なシグナル）。しかしながら、４８および７２時間までには、両方のｍｏｃＲＮＡはモックライゲーションを実質的に上回る性能であった。６ｘＳｒ（ＡＧ）はそれぞれ１０倍および１５倍多くのシグナルを実証し、２６ｒＡ＿Ｇ４＿ｔｅｌｏ＿ＤＮＡ＿６ｘＳｒＧは１５倍および２５倍多くのシグナルを実証した（図９Ｂ）。この翻訳向上はサンプル間のトランスフェクション効率の違いを原因としなかった。なぜなら、同等の有意な違いが、共トランスフェクションされたウミシイタケルシフェラーゼｍＲＮＡ内部対照の翻訳においては観察されなかったからである（図１４Ｃ）。ｍｏｃＲＮＡ翻訳の観察された速度論は、モックライゲーションとは対照的に、６ｘＳｒ（ＡＧ）および２６ｒＡ＿Ｇ４＿ｔｅｌｏ＿ＤＮＡ＿６ｘＳｒＧが、（翻訳を可能にする）これらの時点において無傷のポリ（Ａ）テールを所持することと整合する。さらにその上、ｍｏｃＲＮＡに対して行われたインビトロ翻訳実験は、ｍｏｃＲＮＡおよび対照の間の翻訳効率の実質的な違いを示さなかった（図１４Ｂ）。これは、ｍｏｃＲＮＡからの増大した蛋白質発現が、主として、向上した翻訳開始効率よりもむしろ向上したｍＲＮＡ寿命に帰せられるということを指示している。
ｍｏｃＲＮＡ減衰の速度論を、ＨｅＬａ細胞へのトランスフェクションの２４、４８、および７２時間後にＳＴＡＲｍａｐを用いるインサイチュｍＲＮＡ可視化を行うことによって、細胞においてさらに検証した（図９Ｃ）。２９ｒＡ＿ｄｄＣ、６ｘＳｒ（ＡＧ）、または２６ｒＡ＿Ｇ４＿ｔｅｌｏ＿ＤＮＡ＿６ｘＳｒＧを含有するＧＦＰ－６０ＡｍｏｃＲＮＡをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、相対的なｍＲＮＡ存在量を経時的に定量した。６ｘＳｒ（ＡＧ）ｍｏｃＲＮＡサンプルは、各時点において２９ｒＡ＿ｄｄＣよりも１．７～２．５倍高いＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡカウント比（単一細胞から平均された）を呈示した。加えて、２６ｒＡ＿Ｇ４＿ｔｅｌｏ＿ＤＮＡ＿６ｘＳｒＧは、各時点において２９ｒＡ＿ｄｄＣ対照と比較して１．７～３．１倍高いＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡカウント比を有した（図９Ｄ）。
ｍｏｃＲＮＡはｍＲＮＡ修飾のための代替的な戦略を上回る性能である
先の仕事は、ポリ（Ａ）テール上にＥ．コーライポリ（Ａ）ポリメラーゼ（Ｅ－ＰＡＰ）によって組み込まれたＰＳ連結部がｍＲＮＡ安定性を向上させ得るということを報告している１８。よって、ポリ（Ａ）テールのＥ－ＰＡＰ修飾戦略をもまた探った。化学修飾されたＡＴＰ誘導体（ＸＡＴＰ）のパネルを、ウリジンの代わりにＮ１－メチルシュードウリジンを含有するキャッピングされたＧＦＰｍＲＮＡに対するポリ（Ａ）テーリング反応にＸＡＴＰスパイクインを導入することによってスクリーニングした（図１５）。ＨｅＬａ細胞を、トランスフェクションの内部対照のテール未修飾のｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡ（１００％ＡＴＰ、Ｅ－ＰＡＰテーリング）と併せて、種々のテール修飾されたＧＦＰｍＲＮＡによって共トランスフェクションし、３日のタイムコースに渡ってＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光比をモニタリングした。ＨｅＬａ細胞実験における初期スクリーニングは、ＸＡＴＰスパイクインによるポリ（Ａ）修飾が、正規化されたＧＦＰ産生を、未修飾のポリ（Ａ）コンストラクトと比較して、特にｄＡＴＰ（２’－デオキシアデノシン三リン酸、正規化されたＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙの２５～６２％増大）およびＳ－ＡＴＰ（アデノシン－５’－Ｏ－（１－チオ三リン酸）、４２～９１％増大）について、増大させるということを明らかにした（図１５）。Ｓ－ＡＴＰスパイクインはＧＦＰ発現の最も多大な向上をもたらし（先に報告された仕事と整合する１８）、それゆえに、異なるｍＲＮＡ修飾戦略を比較するために用いられた（図１０Ａ）。
Ｓ－ＡＴＰによって機能化されたＧＦＰ－６０ＡｍＲＮＡに対する６ｘＳｒ（ＡＧ）を、ＩＶＴまたはＥ－ＰＡＰ組み込みによって（図１０Ａから１０Ｃ）ＲＮＡ長均一性および蛋白質産生において比較した。ｍｏｃＲＮＡおよびＩＶＴ修飾されたコンストラクトは一様な長さ分布を示したが、Ｅ－ＰＡＰテーリングされたｍＲＮＡは広い分布のテーリング長さを有し、Ｓ－ＡＴＰスパイクインのパーセンテージが増大すると、より短い長さを有した（図１０Ｃ）。ｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡ（１００％ＡによってＥ－ＰＡＰテーリングされた）をトランスフェクションの内部対照として用いて、ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光比をＨｅＬａ細胞においてトランスフェクションの２４、４８、および７２時間後に定量した。無処置のＧＦＰ－６０Ａ対照に対する正規化の後に、６ｘＳｒ（ＡＧ）ｍｏｃＲＮＡはトランスフェクション後の種々の時間におけるＧＦＰ発現の最も高い向上をもたらした（２４時間：２１４±４５％；４８時間：２８９±６８％；７２時間：２８６±３２％；平均±ｓ．ｄ．）（図１０Ｄ）。全てのＥ－ＰＡＰテーリングされたｍＲＮＡコンストラクトのうち、２５％Ｓ－ＡＴＰスパイクインは、無処置のＧＦＰ－６０Ａ対照と比較してＧＦＰ発現の最も高い向上を有した（２４時間、９３±２１％増大）。Ｓ－ＡＴＰのＩＶＴによって媒介される組み込みは、小さいパーセンテージの修飾されたＡＴＰでは有益だと判明した（２４時間、５％Ｓ－ＡＴＰ：１６０±７％）。２５％Ｓ－ＡＴＰにおけるレポーターの減少した翻訳（５４±５％）が、無処置のＧＦＰ－６０ＡｍＲＮＡと比較して観察された。総体的に、ｍＲＮＡテールの異なる修飾方法間のこの体系的な比較は、Ｅ－ＰＡＰおよびＩＶＴ修飾されたｍＲＮＡと比べてｍｏｃＲＮＡの優れた性能を実証した（図１０Ｄ）。
ｍｏｃＲＮＡコンストラクトは初代ラット皮質ニューロン培養物における蛋白質発現を向上させる
ニューロンは種々の脳および神経系に関係する疾患において主な治療薬標的である３０，３１。ＤＮＡプラスミドの化学的な／脂質によって媒介されるトランスフェクションはニューロンなどの有糸分裂後の細胞において限定された発現効率を実証するが、ｍＲＮＡトランスフェクションは、より高い効率でニューロンにおいてトランスジェニック蛋白質発現を導入するための代替である３２。ｍｏｃＲＮＡが初代細胞培養における蛋白質産生を増大させ得るかどうかを探るために、修飾されたコンストラクトをラット皮質ニューロンの初代培養物において試験した。
６ｘＳｒ（ＡＧ）オリゴによって調製されたＧＦＰｍｏｃＲＮＡおよび未ライゲーション対照を、ｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡ（１００％ｒＡによってＥ－ＰＡＰテーリング、トランスフェクション対照）と、トランスフェクションの２４時間および４８時間後の比較のために、共トランスフェクションした（図１１Ａ）。未ライゲーションＧＦＰサンプルと比較して、６ｘＳｒ（ＡＧ）ｍｏｃＲＮＡサンプルのＧＦＰ発現は両方の時点において一桁高い発現を示した（２４時間：１０１５±１９０％；４８時間：１０６１±２１０）（図１１Ａ～１１Ｂ、表８）。これらの結果は、ｍｏｃＲＮＡが従来のｍＲＮＡベクターと比較してニューロン細胞培養における蛋白質発現のロバストな向上を提供し得るということを実証した。
ｍｏｃＲＮＡは治療薬ｍＲＮＡと類似の毒性プロファイルを保持する
未修飾のＩＶＴｍＲＮＡはトランスフェクションによって強い免疫応答を誘発し、これらはその蛋白質産生を抑制する１０－１２。Ｎ１－メチルシュードウリジンによるウリジンのは１００％置き換えは、免疫毒性を最小化するために治療薬ｍＲＮＡ（およびｍｏｃＲＮＡ）調製物に用いられるが１２、ｍｏｃＲＮＡ上に合成オリゴによって導入された鎖終結ヌクレオチド、ＰＳ連結部、またはＤＮＡ－ＲＮＡ共有結合が、追加の細胞毒性を誘発するであろうかどうかをさらに評価した。第１に、細胞数を図８に呈示されているイメージングデータから定量して、細胞増殖および生存率の実質的な減少についてチェックした。ＨｅＬａ細胞数の有意な減少は、いずれかのｍｏｃＲＮＡ条件および未ライゲーションｍＲＮＡ対照の間において観察されなかった（図１６Ａ）。加えて、ＨｅＬａ細胞における自然免疫刺激を、図８に示されているトランスフェクションの４８時間後のサンプルに対するＩＦＮＢ１ｍＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ測定によって測定した。ＩＦＮＢ１上方制御はＲＩＧ－ＩおよびＭＤＡ５活性化の帰結であり、これらは外来性のＲＮＡ種を認識する自然免疫センサーである３３－３５。未修飾のＧＦＰｍＲＮＡ（１００％ウリジン）およびポリ（Ｉ：Ｃ）トランスフェクション（強力なＲＩＧ－Ｉアゴニスト３６）の正の対照は、２９ｒＡ＿ｄｄＣｍｏｃＲＮＡ対照と比較したときに統計的に有意なＩＦＮＢ１ｍＲＮＡ上方制御を誘導した（ウェルチのｔ検定）。しかしながら、有意な違いは、いずれかのｍｏｃＲＮＡ、未ライゲーションｍＲＮＡ、およびトランスフェクションのみの対照の間においては観察されなかった（図１６Ｂ）。これらの結果は、少なくともこの研究において探られたコンストラクトでは、ｍｏｃＲＮＡが無処置のｍＲＮＡを越えて自然免疫応答を固有に増大させないということを指示している。
最後に、ｍｏｃＲＮＡによって媒介される毒性を、ニューロンにおいて、トランスフェクションされたラット皮質ニューロン培養物に対する生－死細胞染色を用いて分析した（ヘキスト染色およびNucRed Dead 647による）。死んだニューロンのパーセンテージを、ｍｏｃＲＮＡおよび従来のｍＲＮＡトランスフェクションの間の細胞毒性の違いについて試験するための各培養条件において計算した。６ｘＳｒ（ＡＧ）ライゲーションによって引き起こされるニューロン毒性の有意な違いは、トランスフェクション対照と比較して観察されなかった（図１６Ｃ）。一緒にすると、これらの結果は、この研究において同定された修飾が、試験された細胞培養物におけるｍＲＮＡの毒性プロファイルを実質的には変調させなかったということを示唆する。
概要および結論
ポリ（Ａ）ポリメラーゼを利用して化学修飾されたポリ（Ａ）テールを合成する存在する方法は、多くの場合に、バッチ間の均一性を困難化させ得る広い分布のテール長をもたらし、修飾部位を精確にコントロールし得ない。対照的に、ｍｏｃＲＮＡ合成は１００％近い収量を実証し、ｍＲＮＡ均一性を完全に保全し得る。これは、それをｍＲＮＡ治療薬の開発のための存在するパイプラインと適合性にする。より重要なことに、ｍｏｃＲＮＡ発現系は、ＲＮＡポリメラーゼによって組み込まれ得ない化学修飾を導入し得、ＲＮＡ修飾の効果を最大化するための修飾部位の精確なコントロールを可能にする。第１の実証として、３’末端にクラスター化したヌクレアーゼ耐性モチーフを有するｍｏｃＲＮＡは、ｍＲＮＡベクターのポリ（Ａ）テールを保護することによって蛋白質発現を向上させた。蛍光蛋白質測定は、３’末端ＰＳ連結部を含有するｍｏｃＲＮＡが、ヒトＨｅＬａ細胞株においては２～４の係数だけ（図８Ａ）、初代ラット皮質ニューロン培養物においては１０倍だけ（図１１Ａ）、蛋白質産生を増大させるということを実証した。組み合わせられたバルクＲＴ－ｑＰＣＲ測定および単一細胞分解インサイチュＳＴＡＲｍａｐ測定は、３’末端ＰＳ修飾および特定のテロメア配列を含有するｍｏｃＲＮＡが主としてＲＮＡを安定化することによって蛋白質発現を改善するということを指示している（図８Ａ、１４Ａ）３７。これらのｍｏｃＲＮＡコンストラクトは、ＩＶＴおよびポリアデニル化の間の修飾されたＮＴＰのランダムな組み込みに依拠するｍＲＮＡベクターの存在するバリアントよりも高い翻訳能を有する１４，１５，１８（図１０Ｄ）。
概要として、ｍｏｃＲＮＡを合成するためのモジュール的な、プログラム可能な、かつ有効な戦略が開発され、蛋白質翻訳能およびＲＮＡ安定性を向上させるためのＲＮＡベクターの多様化されたかつ精確な化学修飾を可能にした。ｍｏｃＲＮＡは、可能性として、他の型の修飾戦略、例えばポリ（Ａ）結合蛋白質（ＰＡＢＰ）結合オリゴ（例えば、Barragan－Iglesias, et al. Nat Commun, 9(1): 10参照）３８、加水分解耐性の７－メチルグアノシンキャップ３９，４０、修飾された５’ＵＴＲ領域４１、およびｍＲＮＡ本体上の他の型の修飾されたヌクレオチド４２と組み合わせられ得る。ｍｏｃＲＮＡ設計は、化学的な部分を多様化しＲＮＡに基づく蛋白質発現系の機能的な有効性をブーストするための、有機合成を酵素的合成と統合するための一般化可能なプラットフォームとしての用をなし得る。
方法
プラスミドクローニング、キャラクタリゼーション、および精製
ｈＭＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙをコードするプラスミド（それぞれｐＣＳ２＿ｈＭＧＦＰおよびｐＣＳ２＿ｍＣｈｅｒｒｙ）はシャオ・ワン（Xiao Wang）から得た。これらのプラスミドは（順序として）ＳＰ６プロモーター配列、５’ＵＴＲ、蛍光蛋白質コード配列（ＣＤＳ）、３’ＵＴＲ、およびＮｏｔＩ制限カット部位を含有した。配列は元の参照中に見出され得る４３。
Ｑ５（登録商標）部位特異的変異導入キット（ＮＥＢ：Ｅ０５５４Ｓ）を用いて、部位特異的な修飾を含有するプライマー（表４）を用いて鋳型プラスミドに対するＰＣＲを行った。これの次に、ＫＬＤ酵素処置、それから、ZymoPUREプラスミドミニプレップキットを用いる単離のためのNEB Stabl細胞（ＮＥＢ：Ｃ３０４０Ｈ）への形質転換、およびGenewizによるサンガーシーケンシングをした。
Ｅｓｐ３Ｉ部位の前側における６０ｘＡ鋳型によってコードされるポリ（Ａ）テールの部位特異的な設置のために、クローニングの２つの連続したラウンドを、Ｑ５部位特異的変異導入を用いて行った。クローニングの第１ラウンドは、Ｅｓｐ３Ｉ制限部位を先のＮｏｔＩ制限部位の５’に設置した（Ｅｓｐ３ｉ＿ｉｎｓｅｒｔ＿ＦおよびＥｓｐ３ｉ＿ｉｎｓｅｒｔ＿Ｒ）。もたらされたサンガーシーケンシング検証されたプラスミドを、６０ｘＡポリ（Ａ）テールの設置のための鋳型として用いた（６０Ａ＿ｉｎｓｅｒｔ＿Ｆおよび６０Ａ＿ｉｎｓｅｒｔ＿Ｒ）。クローニングの第２ラウンドから選択されたクローンを、サンガーシーケンシングを用いて検証した。プライマー配列については補足表４参照。Ｅｓｐ３Ｉ部位に先立って～６０ｎｔ長の鋳型によってコードされるテールを含有するコンストラクトの名称はｐＣＳ２＿ｈＭＧＦＰ－６０Ａであった。
ホタルルシフェラーゼコンストラクトを、ＰＣＲを用いるｐＣＳ２＿ｈＭＧＦＰ－６０ＡベクターからのｈＭＧＦＰコード領域の欠失によって最初に生成した。次に、ホタルルシフェラーゼコード配列を、pmirGLO DualルシフェラーゼｍｉＲＮＡ標的発現ベクター（Promega：Ｅｌ３３０）から、目当てのベクターに対する１５～２０ヌクレオチドの相補的なオーバーハング領域を含有するように設計されたＰＣＲプライマーによって、ＰＣＲ増幅した。ベクターおよびインサートをNEBuilder HiFi DNAアセンブリマスターミックス（ＮＥＢ：Ｅ２６２１Ｓ）を用いてアセンブリし、Stabl細胞に形質転換し、サンガーシーケンシングによって配列検証した。ウミシイタケルシフェラーゼコンストラクトを、ホタルルシフェラーゼと同様のプロセスによってクローニングした。ただし、pmirGLOベクターからのウミシイタケルシフェラーゼコード配列を有した。
不安定化したホタルルシフェラーゼコンストラクト（すなわち、ホタル－ＰＥＳＴ）は、マウスオルニチンデカルボキシラーゼに由来するデグロンを含有する２９。前述のホタルルシフェラーゼベクターをストップコドンの周囲でＰＣＲ直鎖化し、これに、ＰＥＳＴ配列をコードするGeneBlock（ＩＤＴ、ヒトコドン最適化）をNEBuilder HiFi法を用いて挿入した。
ｍＲＮＡ合成およびキャラクタリゼーション
ＧＦＰｍＲＮＡをｐＣＳ２＿ｈＭＧＦＰ－６０Ａプラスミドから合成した。これは、ＳＰ６プロモーター、次に、ｈＭＧＦＰのＣＤＳおよび鋳型によってコードされるポリ（Ａ）テールを含有した。プラスミドを、ポリ（Ａ）領域の直ちに３’に所在する単一のＥｓｐ３Ｉ部位によって直鎖化した。これはクローニングの間に設置された。直鎖化されたプラスミドを、それから、Zymo ResearchからのDNA Clean ＆ Concentrator－25キット（Ｄ４０３３）を用いて精製し、アガロースゲル電気泳動によって純度についてチェックした。キャッピングされた修飾されたｍＲＮＡを、mMESSAGE mMACHINE（商標）ＳＰ６転写キット（ThermoFisher Scientific：ＡＭＩ３４０）からのＳＰ６酵素および反応緩衝液を用いて調製した。キットによって提供される２×ＮＴＰ／キャップ溶液を、以下を含有する２×ＮＴＰ／キャップ調製物によって置き換えた：１０ｍＭのＡＴＰ（ＮＥＢ：Ｎ０４５１ＡＶＩＡＬ）、１０ｍＭのＣＴＰ（ＮＥＢ：Ｎ０４５４ＡＶＩＡＬ）、２ｍＭのＧＴＰ（ＮＥＢ：Ｎ０４５２ＡＶＩＡＬ）、８ｍＭの３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧＲＮＡキャップ構造アナログ（ＮＥＢ：Ｓ１４１１Ｓ）、および１０ｍＭのＮ１－メチルシュードウリジン－５’－三リン酸（TriLink Biotechnologies：Ｎ－１０８１－１）。Superase－InＲＮａｓｅ阻害剤（ThermoFisher Scientific：ＡＭ２６９４）を１：２０（ｖ／ｖ）の最終濃度で追加した。ＩＶＴ反応のアセンブリおよび２～４時間に渡る３７℃におけるインキュベーションの後に、反応を、MEGAclear（商標）転写クリーンアップキット（ThermoFisher Scientific：ＡＭＩ９０８）を用いる反応精製に先立って、３７℃で１時間に渡って１～２μｌのTURBO DNAse（ＡＭＩ３４０で提供される）によって処置した。Superase－InＲＮａｓｅ阻害剤を精製されたｍＲＮＡサンプルに１：５０（ｖ／ｖ）の最終濃度で追加し、サンプルを長期保存のために－８０℃で保存した。精製されたｍＲＮＡをNanodropによって測定して、ライゲーションに先立って濃度を概算し、ｍＲＮＡおよびｍｏｃＲＮＡを、細胞に基づく試験のためのトランスフェクションに直ちに先立って正規化のためにQubit RNA HSアッセイ（ThermoFisher Scientific：Ｑ３２８５２）を用いて測定した。
ポリ（Ａ）ポリメラーゼテーリングされたｍＲＮＡの調製では（図１５）、ＮｏｔＩ－ＨＦ（ＮＥＢ：Ｒ３１８９Ｓ）を用いるｐＣＳ２＿ｈＭＧＦＰおよびｐＣＳ２＿ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドの直鎖化によって生成されたｄｓＤＮＡ鋳型を用い、Zymo DNA Clean ＆ Concentrator－25を用いて消化産物をカラム精製した。インビトロ転写を上に記載されたプロトコールを用いて行った。ただし、TURBO DNAse消化後に、ポリ（Ａ）テーリングの余分のステップを包含し、Ｅ－ＰＡＰポリ（Ａ）テーリングキット（ThermoFisher Scientific：ＡＭＩ３５０）を用いた。ｍＲＮＡの精製および保存は上に記載された通りであった（例えば、MEGAclear転写クリーンアップキットを用いた）。
図１０では、アデノシン－５’－Ｏ－（１－チオ三リン酸）スパイクインｍＲＮＡを、上に列記されたものの改変されたプロトコールを用いて合成した。アデノシン－５’－Ｏ－（１－チオ三リン酸）（Ｓ－ＡＴＰ）を共転写的組み込み実験に用いた。Ｓ－ＡＴＰ組み込みの定性的な違いが、先に開けられたストックチューブが用いられたときに、ことによると酸化を原因として観察された。この理由から、新たなチューブをあらゆるテーリング実験に先立って用いて、これらの実験における交絡因子としての可能な酸化の効果を限定した。Ｓ－ＡＴＰインビトロ転写反応を上に列記された同じセットアップで行ったが、反応中の最終５ｍＭのＡＴＰは、４．７５ｍＭのＡＴＰ＋０．２５ｍＭのＳ－ＡＴＰ（５％Ｓ－ＡＴＰ組み込み）によってまたは３．７５ｍＭのＡＴＰ＋１．２５ｍＭのＳ－ＡＴＰ（２５％Ｓ－ＡＴＰ）によってどちらかで置き換えた。６０ｘＡ鋳型によってコードされるポリ（Ａ）テールを有するＧＦＰコード配列を含有するＩＶＴ鋳型を用いた。
改変されたＥ．コーライポリ（Ａ）ポリメラーゼテーリング
図１５の改変されたＥ－ＰＡＰテーリング実験では、基質は、ＮｏｔＩ－ＨＦ直鎖化されたｐＣＳ２＿ｈＭＧＦＰ鋳型に対するＩＶＴから生成されたテーリングなしのＧＦＰｍＲＮＡであった（上のＩＶＴプロトコール参照）。このプロトコールはＥ－ＰＡＰポリ（Ａ）テーリングキットからの酵素および緩衝液を利用した（ThermoFisher Scientific：ＡＭＩ３５０）。「１０ｍＭトータル」ＡＴＰストック溶液を、各修飾されたＡＴＰスパイクインのために調製し、その結果、特定のパーセンテージのＡＴＰを修飾されたＡＴＰ誘導体（ＸＡＴＰ）によって置き換えた。例えば、２５％ｄＡＴＰサンプルは、２．５ｍＭのｄＡＴＰ、７．５ｍＭのＡＴＰストック溶液のアセンブリを要求するであろう。テーリング反応を次の通りアセンブリした：１．５μｇのテーリングなしのＧＦＰｍＲＮＡ；５μｌの５×Ｅ－ＰＡＰ緩衝液；２．５μｌの１０ｍＭのＸＡＴＰ：ＡＴＰストック溶液（各サンプルについて異なる）；２．５μｌの２５ｍＭのＭｎＣｌ２；１μｌのSuperase－InＲＮａｓｅ阻害剤；１μｌのＥ－ＰＡＰ酵素；および２５μｌのトータル体積までヌクレアーゼフリー水。反応を３７℃で１時間に渡ってインキュベーションし、それから、０．５μｌの５００ｍＭのＥＤＴＡの追加によってクエンチした。これらのテーリングされたｍＲＮＡを、それから、MonarchＲＮＡクリーンアップキット（５０μｇ）（ＮＥＢ：Ｔ２０４０Ｓ）を用いてカラム精製した。Superase－InＲＮａｓｅ阻害剤を精製されたｍＲＮＡに１：５０（ｖ／ｖ）の最終希釈で追加し、ｍＲＮＡをトランスフェクションに先立って－８０℃で保存した。
次の修飾されたＡＴＰ誘導体（ＸＡＴＰ）をこれらの実験に用いた：アデノシン５’－三リン酸（ＡＴＰ）（ＮＥＢ：Ｐ０７５６Ｓ）；Ｎ６－メチルアデノシン－５’－三リン酸（TriLink Biotechnologies：Ｎ－１０１３－１）；２’－Ｏ－メチルアデノシン－５’－三リン酸（TriLink Biotechnologies：Ｎ－１０１５－１）；アデノシン－５’－Ｏ－（１－チオ三リン酸）（TriLink Biotechnologies：Ｎ－８００５－１）；ｄＡＴＰ溶液（ＮＥＢ：Ｎ０４４０Ｓ）；２’－アミノ－２’－デオキシアデノシン－５’－三リン酸（TriLink Biotechnologies：Ｎ－１０４６－１）。
図１０に見られる修飾されたＥ－ＰＡＰテーリングでは（方法比較）、Ｅ－ＰＡＰテーリングを、鋳型によってコードされる６０Ａテールを含有するｈＭＧＦＰをコードするｍＲＮＡを用いて行った（図１５とは対照的に）。アデノシン－５’－Ｏ－（１－チオ三リン酸）（Ｓ－ＡＴＰ）を共転写的なまたは修飾されたポリ（Ａ）テーリング実験に用いた。先に開けられたストックチューブを用いたときには、可能性として酸化を原因として、定性的な違いがＳ－ＡＴＰ組み込みにおいて観察された。この理由から、新たなチューブをあらゆるテーリング実験に先立って用いて、これらの実験における交絡因子としての可能な酸化の効果を限定した。ＥＰＡＰテーリング反応（Ｓ－ＡＴＰスパイクインあり）は、別様には、上に記載されたプロトコールと一貫してセットアップされた。
修飾されたオリゴの３’端ライゲーション
ライゲーション反応をＴ４ＲＮＡリガーゼＩ（Promega：Ｍ１０５１）を用いて行った。反応を次の通りアセンブリした：２μgのＧＦＰｍＲＮＡ；２００ｐｍｏｌの合成オリゴ；２μｌのSuperase－InＲＮａｓｅ阻害剤；２０μｌの５０％ＰＥＧ－８０００；５μｌの１００％ＤＭＳＯ；５μｌの１０×Ｔ４ＲＮＡリガーゼ緩衝液；５～７．５μｌのＴ４ＲＮＡリガーゼ（Promega）；および５０μｌのトータル反応体積にヌクレアーゼフリー水。反応を３７℃で３０分に渡ってインキュベーションし、次に、１μｌの５００ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の追加による反応の不活性化をした。反応を、１体積のヌクレアーゼフリー水（例えば５０μｌ）の追加、次に１μｌのSuperase－Inを含有する０．５体積のAMPure XP（Beckman Coulter：Ａ６３８８０）（例えば２５μｌ）の追加によって希釈した。反応を製造者のプロトコールに従って精製し、ｍＲＮＡを、１：５０（ｖ／ｖ）比でSuperase－Inを含有するヌクレアーゼフリー水を用いてAMPureビーズから溶出した。ゲル上で残留オリゴを含有するように見えたｍＲＮＡサンプルは、AMPure XPビーズを用いて２回目に精製した。
ＲＮａｓｅＨゲルに基づくアッセイに従うと不完全であったライゲーションについては、ライゲーションを、ＤＭＳＯを反応から省いた改変された条件を用いて行った。これは、一般的に、より効率的なライゲーションをもたらした。図９から１１に示されるライゲーション調製サンプルでは、改変されたプロトコールをライゲーションに用いた。なぜなら、これは一般的により効率的であったからである。ホタルルシフェラーゼおよびホタル－ＰＥＳＴｍＲＮＡライゲーションでは、これらを、２×の順次のAmpure XPビーズクリーンアップを用いて、ｍＲＮＡ体積に対する１：１ビーズ体積を用いて精製した。例えば、５０μｌライゲーション反応を５０μｌのAmpure XPビーズを用いてクリーンアップした。産物ｍＲＮＡの溶出後に、第２のクリーンアップを、溶出されたｍＲＮＡ産物に対する等体積のビーズを用いて行った。
ＲＮａｓｅＨアッセイ
塩化カリウム（ＫＣｌ）ストック溶液を、ＲＮａｓｅＨアッセイに先立ってｍＲＮＡにｓｓＤＮＡオリゴをアニーリングするために用いた。アニーリングストック溶液は以下を含有した：５０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、１：２００（ｖ／ｖ）のSuperase－InＲＮａｓｅ阻害剤。ヌクレアーゼフリー水を用いてその最終体積に合わせた。ｓｓＤＮＡプローブ（ＲＮａｓｅＨ＿ｐｒｏｂｅ＿ＧＦＰ）はIntegrated DNA Technologies（ＩＤＴ）に発注した。配列を表５に列記する。
次の反応を調製して、ｍＲＮＡを前述のｓｓＤＮＡプローブにアニーリングした：２００ｎｇの精製されたｍＲＮＡサンプル（ライゲーションされたかまたは未ライゲーション）；２ｐｍｏｌのＲＮａｓｅＨ＿ｐｒｏｂｅ＿ＧＦＰ、２μｌのアニーリングストック溶液（５０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、１：２００のSuperase－In）；および１０μｌのトータル体積までヌクレアーゼフリー水。反応を７０℃で５分に渡って変性し、次に、ベンチトップサーモサイクラーによって０．２℃／ｓｅｃの速度で室温への冷却をした。プローブアニーリング後に、１μｌの耐熱性ＲＮａｓｅＨ（ＮＥＢ：Ｍ０５２３Ｓ）および１μｌの１０×緩衝液を各反応に追加し、これを５０℃で３０ｍｉｎに渡ってインキュベーションした。反応インキュベーション後に、サンプルを１μｌプロテイナーゼＫ（ThermoFisher Scientific：２５５３００４９）の追加によって消化し、室温で５分に渡ってインキュベーションした。爾後に、サンプルを、５０ｍＭの最終濃度でＥＤＴＡを足しておいた１体積のゲルローディング緩衝液ＩＩ（ThermoFisher Scientific：ＡＭ８５４６Ｇ）と混合した。１×ローディング緩衝液中のサンプルを、１×Ｔｒｉｓ－ホウ酸－ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液中で流される６％のNovex（商標）ＴＢＥ－尿素ゲル（ThermoFisher Scientific：ＥＣ６８６５５ＢＯＸ）上のローディングおよび分解に先立って７０℃で３～５分に渡って変性させた。ゲルに用いられたラダーはCentury－PlusＲＮＡマーカーであった（ThermoFisher Scientific：ＡＭ７１４５）。BioRad ChemiDoc MPイメージング系（１２００３１５４）またはＭＰイメージャー（Universal Hood III）を用いる可視化に先立って、全てのゲルを、１×ＴＢＥ緩衝液中の１×SYBR Gold（ThermoFisher Scientific：ＳＩ１４９４）中において５～１５分に渡って染色し、画像を対応するImage Labソフトウェアを用いてエクスポートした。
哺乳動物細胞培養およびｍＲＮＡトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞（ＣＣＬ－２、ＡＴＣＣ）は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培養培地（ThermoFisher、１１９９５）によって３７℃インキュベータにおいて５％ＣＯ２で維持し、３日毎に１：８の比で継代する。細胞培養物は、ヘキスト染色および顕微鏡法イメージングによって定期的にマイコプラズマコンタミネーションを不含だと確認された。
ｍＲＮＡトランスフェクションの前の日に、細胞を７５％コンフルエンスで１２ウェルプレート上の個々のウェルに播種した。翌日に、５００ｎｇのｍＣｈｅｒｒｙ（内部対照）ｍＲＮＡおよび合成テールまたは他の修飾を有する５００ｎｇのＧＦＰｍＲＮＡ（濃度はQubitによって決定した）を、３μＬのLipofectamine（商標）MessengerMAX（商標）トランスフェクション試薬（ThermoFisher、ＬＭＲＮＡ００３）を用いて各ウェルにトランスフェクションした。ｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡのみ、またはトランスフェクション試薬のみ、またはトランスフェクションされていない細胞を含有する追加の対照を包含する。６時間インキュベーション後に、lipofectamine／ｍＲＮＡトランスフェクション混合物を除去し、細胞をＤＰＢＳによって１回リンスし、トリプシン処理して、３つのガラス底２４ウェルプレート（MatTek、Ｐ２４Ｇ－１．５－１３－Ｆ、ポリＤ－リジンコーティング）に、それぞれ６：４：３の比で、トランスフェクションの２４時間、４８時間、および７２時間後の蛍光蛋白質定量のために再播種した。
新しく解離されたラット初代皮質ニューロンがブロード研究所のシェンのラボ（Sheng Lab）の厚意により提供された。簡潔には、ラット皮質ニューロン培養を、ＣＯ２安楽死した妊娠スプラーグドーリーラット（Charles River Laboratories）からの胎生１８日（Ｅ１８）胚から調製した。胚皮質を、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco、１５１４０－１２２）を足した氷冷ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、Gibco、１４１７５－０９５）中において解剖した。皮質組織を４℃ＰＢＳ（Sigma、Ｄ８５３７）によって３×洗浄し、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Gibco、２５２００－０５６）によって２０ｍｉｎに渡って３７℃で消化し、それから、室温ＰＢＳによって３×洗浄した。皮質組織を３７℃のNBActiv4培地（Brainbits、ＮＢ４－５００）中において慎重に解離させ、３００×ｇで５ｍｉｎに渡って遠心した。ペレットを新しいNBActiv4に再懸濁し、７０μｍフィルター（Corning、３５２３５０）に通した。
ニューロンを、１×１０５／ｃｍ２の密度で、ポリＤ－リジンコーティング（Sigma、Ａ－００３－Ｅ、５０μｇ／ｍＬ、室温で少なくとも１時間、次に滅菌蒸留Ｈ２Ｏによる３つのリンスをし、風乾された）２４ウェルガラス底プレート（MatTek、Ｐ２４Ｇ－１．５－１３－Ｆ）上において０．５ｍＬのNBActiv4培地中に播種し、培地の半分は４日毎に交換した。５ＤＩＶに、２４ウェルプレート上のニューロンを、１．５μＬのLipofectamine（商標）MessengerMAX（商標）トランスフェクション試薬（ThermoFisher、ＬＭＲＮＡ００３）と混合された２５０ｎｇのｍＣｈｅｒｒｙ（内部対照）ｍＲＮＡおよび合成テールを有する２５０ｎｇのＧＦＰｍＲＮＡ（濃度はQubitによって決定した）によってトランスフェクションした。正常な培養培地（半分は古く、半分は新しい）に再び交換する前に、ニューロンを２時間に渡ってトランスフェクション混合物とインキュベーションした。ラットニューロン培養のための手続きは、ブロード研究所動物実験委員会によって使用について審査および承認された。動物が関わる全ての手続きはＵＳ国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針に従った。
蛍光蛋白質の共焦点イメージングおよび定量
蛍光蛋白質イメージングの前に、培養培地を除去し、核染色培地（１：２０００希釈のヘキスト３３３４２［ThermoFisher、６２２４９］を有するFluoroBrite（商標）ＤＭＥＭ［ThermoFisher、Ａ１８９６７０１］）中において３７℃で１０ｍｉｎに渡ってインキュベーションする前に、細胞をＤＰＢＳによって１回リンスした。
ＨｅＬａ細胞について、核（ヘキスト）、ＧＦＰ、およびｍＣｈｅｒｒｙの共焦点画像を、１０×空気対物を有するLeica Stellaris 8によって、９００ｎｍ×９００ｎｍのピクセルサイズで取った。各四分円から１つの４つの代表的な視野を各ウェルについて取った。ニューロンについて、核（ヘキスト）、ＧＦＰ、およびｍＣｈｅｒｒｙの共焦点画像スタックを、２５×水浸対物を有するLeica Stellaris 8によって、４５０ｎｍ＊４５０ｎｍのピクセルサイズおよび１μｍのステップサイズで９ステップについて取った。６つの代表的な視野を各ウェルについて取る（図１１）。ニューロンにおける毒性測定では、NucRed Dead 647（Invitrogen：Ｒ３７１１３）をイメージングに先立ってFluoroBrite染色培地に追加し、対応するチャンネルを用いて死細胞の核の画像を得た。同じイメージング設定を、比較されるべき全てのサンプルに用いた。励起／検出波長は次の通りである：ヘキスト：ダイオード４０５ｎｍ／～［４３０～４８０］ｎｍ；ＧＦＰ：ＷＬＬ４８９ｎｍ／～［５００～５７６］ｎｍ；ｍＣｈｅｒｒｙ：ＷＬＬ５８７ｎｍ／～［６０２～６７６］ｎｍ。CellProfiler 4.0.744を用いて、ヘキスト（例えば核のトータル数）対NucRed Deadチャンネル（例えば死んだ核）におけるオブジェクト数を計算して、各視野における死んだニューロン割合を得た。
培養ニューロンにおけるバルク分析では（図８Ａ）、第１に、各画像のｍＣｈｅｒｒｙ強度およびＧＦＰ強度を測定した。「トランスフェクションのみ」サンプルのｍＣｈｅｒｒｙチャンネルおよびＧＦＰチャンネルにおける平均蛍光シグナルはバックグラウンドシグナルと見なされた。バックグラウンドシグナルは各図から差し引かれた。最後に、各画像におけるＧＦＰ強度およびｍＣｈｅｒｒｙ強度の間の比を計算した。そして、GraphPad Prism 9によって決定された各サンプル内の外れ値を除去した。全ての「無処置のｍＲＮＡ」サンプルにおけるＧＦＰ強度およびｍＣｈｅｒｒｙ強度の間の比の平均を計算し、１に対して正規化した。
分析を生画像スタックの最大値投影画像に対して行った。CellProfiler 4.0.7を単一細胞蛋白質定量に用いる（図１３Ａ）。ＨｅＬａ細胞における単一細胞分析では、最初に、ヘキスト染色された核を一次的なオブジェクトとして同定した。それから、ヘキストチャンネル、ｍＣｈｅｒｒｙチャンネル、およびＧＦＰチャンネルをマージし、爾後にグレースケール画像に変換した。細胞をこのグレースケール画像上で二次的なオブジェクトとして同定した。細胞セグメンテーション後に、各細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ強度およびＧＦＰ強度を測定した。最後に、各細胞におけるＧＦＰ強度およびｍＣｈｅｒｒｙ強度の間の比を計算した。バッチ効果を除去するために、異なるバッチにおける全ての「モックライゲーション」サンプルのＧＦＰ強度およびｍＣｈｅｒｒｙ強度の間の平均の比を計算し、１に正規化した。仮定は、全ての「モックライゲーション」サンプルにおけるＧＦＰ強度およびｍＣｈｅｒｒｙ強度の間の平均の比が同じであるということであった。対照サンプル（トランスフェクション試薬のみ、またはトランスフェクションされていない細胞）のものと類似の強度を含有する細胞は、不首尾にトランスフェクションされたと見なされ、それゆえにこの分析から排除された。
ホタルルシフェラーゼデグロンキャラクタリゼーション
ＨｅＬａ細胞を、ホタル－６０Ａまたはホタル－デグロン－６０ＡｍＲＮＡによって、ＧＦＰｍＲＮＡトランスフェクションのための前述のプロトコールを用いてトランスフェクションした。ルシフェラーゼ減衰測定では、細胞を２４時間に渡って成長させ、それから１００ｕｇ／ｍＬシクロヘキシミド（ＣＨＸ）を含有する培地に移して翻訳を止めた。ＣＨＸ追加後の種々の時点において、細胞をリシスし、ルシフェラーゼ活性をPromega Dual－Gloルシフェラーゼアッセイ系（Promega：Ｅ２９２０）を用いて測定した。ルシフェラーゼ－デグロンｍｏｃＲＮＡタイムコースでは、ｍｏｃＲＮＡを先に記載された通り生成した。２５０ｎｇのホタル－ＰＥＳＴｍｏｃＲＮＡを、２４ウェルプレート上のＨｅＬａ細胞に、内部対照としての２５０ｎｇのウミシイタケルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｅ－ＰＡＰテーリング）と併せて共トランスフェクションした。トランスフェクションの６時間後に、細胞を、指定される通り様々な時点におけるリシスのために４つの別個の不透明白色プレートに再播種した。
インビトロ翻訳実験では、１００ｎｇの各ホタル－ＰＥＳＴｍｏｃＲＮＡを、内部対照としての用をなすための２００ｎｇのウミシイタケｍＲＮＡ（Ｅ－ＰＡＰテーリング）と混合した。これらを６５℃で５ｍｉｎに渡って変性させ、氷上に置き、５０μｌウサギ網状赤血球ライセート反応のための鋳型としての用をなすように追加し（Promega：Ｌ４９６０）、アセンブリし、製造者のプロトコールに従ってインキュベーションした。１．５時間インキュベーション後に、２μｌの各反応を２０μｌの１×ＰＢＳによって希釈し、Promega Dual－Gloアッセイを用いて測定した。３つの技術的レプリケートを、試験された各条件の３つの生物学的レプリケートのそれぞれについて取った。
ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ調製
ＨｅＬａ細胞を～７５％コンフルエンシーで１２ウェルプラスチックプレートに播種し、以前に記載されたプロトコールを用いてｍＲＮＡによってトランスフェクションした。正の対照の調製では、２００ｎｇポリ（Ｉ：Ｃ）、５００ｎｇのポリ（Ｉ：Ｃ）（InvivoGen：ｔｌｒｌ－ｐｉｃｗ）、または５００ｎｇの未修飾のＧＦＰｍＲＮＡ（ウリジンによるＮ１－メチルシュードウリジンの１００％置き換えを含有し、１００％ｒＡＴＰを用いてＥ－ＰＡＰポリ（Ａ）テーリングされた）どちらかを、３μｌのLipofectamine MessengerMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いて細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションおよび細胞再播種の後に、細胞をトランスフェクションの４８時間後に収集し、培地を除去し、３５０μｌのTrizolを－８０℃におけるＲＮＡ保存のために各ウェルに分注した。未修飾のＧＦＰｍＲＮＡをｐＣＳ２＿ｈＭＧＦＰ鋳型から調製した。これは６０Ａ鋳型によってコードされるテールを含有しなかった。未修飾のＧＦＰｍＲＮＡはＮ１－メチルシュードウリジンの代わりに１００％ＵＴＰを含有し、それをＥ－ＰＡＰテーリングを用いてポリ（Ａ）テーリングした。
トータルＲＮＡをTrizol保存サンプルからDirect－zolＲＮＡミニプレップキット（Zymo Research：Ｒ２０５１）を用いて製造者のプロトコールに従って抽出した。任意のＤＮＡｓｅ消化もまた製造者のプロトコールに従って行った。単離されたＲＮＡを、それから、RNA Clean ＆ Concentrator－5（Zymo Research：Ｒ１０１３）を用いて濃縮し、１：１００のSuperase－Inを含有するヌクレアーゼフリー水によって溶出した。ＲＮＡを、それから、－８０℃における保存に先立ってNanodropを用いて定量した。
トータルＲＮＡの逆転写をSuperScript IV逆転写酵素（ThermoFisher Scientific：１８０９０２００）を用いて行った。５００ｎｇのトータルＲＮＡを１μｌのランダムプライマーミックス（ＮＥＢ：Ｓ１３３０Ｓ）と混合し、１３μｌのトータル体積まで合わせた。この混合物を５ｍｉｎに渡って６５℃で加熱し、それから直ちに反応アセンブリの次ステップの間は氷上に置いた。次の試薬および体積を、それから、１３μｌのアニーリングされた混合物に追加した：４μｌの５×ＳＳＩＶ反応緩衝液；１μｌ（最終０．５ｍＭ）の１０ｍＭのｄＮＴＰミックス（ThermoFisher Scientific：１８４２７０１３）；１μｌの１００ｍＭのＤＴＴ；０．５μｌのSuperase RNAse－In；および１μｌのSuperScript IV RT酵素（２００Ｕ／μｌ）。
反応を混合し、それから、１０ｍｉｎに渡って２３℃でインキュベーションし、次に１０ｍｉｎに渡って５０℃におけるインキュベーションをし、１０ｍｉｎに渡って８０℃におけるインキュベーションによって終結させた。選ばれたｃＤＮＡ反応の一部分を取り分け、検量／希釈曲線のための標準として用いた。しかしながら、ＲＴ－ｑＰＣＲによって定量されるべき全てのサンプルについて、これらのｃＤＮＡ反応からの５×希釈をヌクレアーゼフリー水の追加によって調製し、使用に先立って－８０℃で保存した。
ＲＴ－ｑＰＣＲ
ＲＴ－ｑＰＣＲを透明LightCycler３８４ウェルプレート（Roche：０４７２９７４９００１）上でPower SYBR Green PCRマスターミックス（ThermoFisher Scientific：４３６７６５９）を用いて行った。各反応は以下を含有した：１μｌのｃＤＮＡ鋳型（先に５×希釈された）；各５００ｎＭ（最終濃度）のフォワードおよびリバースプライマー（配列については表５参照）；および１０μｌの２×Power SYBR Greenマスターミックス。反応トータル体積を、Bio－Rad CFX384 TouchリアルタイムＰＣＲ検出系による処理に先立って２０μｌトータルまで合わせた。ｈＭＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、およびｈＡｃｔｂに用いられたサイクル設定は以下であった：９５℃で１０ｍｉｎ．（×１）；９５℃で１０ｓｅｃ．、６０℃で３０ｓｅｃ．、［プレートリード］（×４０）、次に融解曲線分析（６５．０℃から９５．０℃、インクリメント０．５℃＋［プレートリード］）。ＩＦＮＢ１のｑＰＣＲでは、用いられたサイクル設定は以下であった：９５℃で１０ｍｉｎ.（×１）；９５℃で１０ｓｅｃ．、５７℃で１５ｓｅｃ、６０℃で３０ｓｅｃ．、［プレートリード］（×４０）、次に融解曲線分析（６５．０℃から９５．０℃、インクリメント０．５℃＋［プレートリード］）。
相対的なｍＲＮＡ数量を相対的定量法を用いて計算した。これは標準曲線を要求する。「正の対照」サンプルを標準として選択し、２倍希釈系列を行って標準曲線を産生した。これから、各測定された遺伝子について反応効率（Ｅ）を計算した（ｌｏｇ－ｌｏｇスケールで直線当てはめを用いる）。ＧＦＰ＆ｍＣｈｅｒｒｙ定量では、標準として、未ライゲーションＧＦＰ－６０ｍＲＮＡ＋ｍＣｈｅｒｒｙトランスフェクションの生物学的レプリケートの１つに対応するｃＤＮＡストック溶液を選択した。ＩＦＮＢ１定量では、５００ｎｇのポリ（Ｉ：Ｃ）トランスフェクション条件の生物学的レプリケートの１つを標準として用いた。ｈＡｃｔｂ定量では、「トランスフェクション条件のみ」サンプルの１つからのｃＤＮＡを標準として用いた。未知のサンプルの全てのｃＤＮＡ測定が、標準曲線によって決定される直線性の範囲内であろうということを保証するために、全てのｃＤＮＡストックを、ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定することに先立って５×希釈した（先に述べた通り）。
標準曲線の直線当てはめ後に（各希釈について３×技術的レプリケート）、ＰＣＲ反応効率を計算した（ＧＦＰ：２．０５；ｍＣｈｅｒｒｙ：２．２４；ＩＦＮＢ１：２．１１；ｈＡｃｔｂ：２．０９）。３つの技術的レプリケートを試験されるべき各ｃＤＮＡサンプルについて行って、技術的レプリケートＣｑ値を平均して、各生物学的レプリケートに対応する値を得た。特定のサンプル（例えば「モックライゲーション」）に対する正規化を行うためには、正規化標準の生物学的レプリケートのＣｑ値を平均して「標準Ｃｑ」を与えた。それから、各試験サンプルのＣｑ値をこの「標準Ｃｑ」から差し引いてｄＣｑ値を与えた。反応効率（Ｅ）をこれらのｄＣｑ値を指数として累乗して、各生物学的試験サンプルの個々の「～倍の変化」を与えた。ｍＣｈｅｒｒｙ＆ｈＡｃｔｂ両方によってＧＦＰを正規化するためには、先に計算されたｍＣｈｅｒｒｙ＆ｈＡｃｔｂの「～倍の変化」の幾何平均を取った。ＧＦＰの「～倍の変化」をそれからこれらの正規化係数によって除算して、ＧＦＰの定量に用いられる最終的な値を産生した（図８Ｃ、表７）。ＩＦＮＢ１の正規化では、各サンプルのｈＡｃｔｂ値を直接的に用いた（幾何平均計算なし）（表７）。各グラフに示されているデータ点は、あらゆる生物学的レプリケートについて、行われた３つの技術的レプリケートの平均に対応する。特定の条件についての負の対照（例えば、Ｎ．Ｔ．Ｃ．およびトランスフェクションのみ）は、それらがＣｑ値を産生しなかったときには計算から省いた。
ＳＴＡＲｍａｐを用いるトランスフェクションされた細胞培養物におけるｍＲＮＡ定量
ｍＣｈｅｒｒｙおよびＧＦＰｍＲＮＡ数量を、バーコーディングされたＤＮＡコロニーとして個々のｍＲＮＡ分子を読み取るイメージングに基づく方法ＳＴＡＲｍａｐ２８を用いて、トランスフェクションされた細胞において測定した。細胞培養のためのＳＴＡＲｍａｐ手続きを公開された通り踏襲した２８。簡潔には、蛍光蛋白質イメージング後に、次ステップの前の－２０℃（１週まで）における予冷メタノールによるさらなる固定および透過処理の前に、細胞を１．６％ＰＦＡのＰＦＡ（Electron Microscope Sciences、１５７１０－Ｓ）／１×ＰＢＳ（Gibco、１００１０－０２３）によって室温で１０ｍｉｎに渡って固定した。爾後に、メタノールを除去し、細胞を、ＰＢＳＴＲ／グリシン／ＹｔＲＮＡ（０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０［TEKNOVA INC、１００２１６－３６０］、０．５％SUPERaseIn［Invitrogen（商標）、ＡＭ２６９６］、１００ｍＭグリシン、１％酵母ｔＲＮＡを有するＰＢＳ）によって室温で１５ｍｉｎに渡って再水和し、次に１回のＰＢＳＴＲ洗浄をした。サンプルを、それから、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＧＦＰｍＲＮＡ配列を標的化するＳＮＡＩＬプローブと、ハイブリダイゼーション緩衝液（２×ＳＳＣ［Sigma－Aldrich、Ｓ６６３９］、１０％ホルムアミド［Calbiochem、６５５２０６］、１％Ｔｗｅｅｎ－２０、２０ｍＭのＲＶＣ［リボヌクレオシドバナジル複合体、New England Biolabs、Ｓ１４０２Ｓ］、０．５％SUPERaseIn、１％酵母ｔＲＮＡ、１００ｎＭの各プローブ）中において４０℃で一晩ハイブリダイゼーションした（「ＳＮＡＩＬプローブ」配列については表５参照）。細胞を、それから、室温におけるＰＢＳＴＲによるリンス前に、３７℃で２回ＰＢＳＴＲ（２０ｍｉｎ各洗浄）および３７℃で１回高塩濃度洗浄緩衝液（４×ＳＳＣを有するＰＢＳＴＲ）によって洗浄した。ライゲーション反応を２時間に渡って室温で行って、プライマーに隣接するパドロックプローブを環状化した。ＰＢＳＴＲによる２つの洗浄の後に、ローリングサークル増幅を２時間に渡って３０℃でＰｈｉ２９（ThermoFisher、ＥＰ００９４）を用いてプライマーから開始した。アミノｄＵＴＰ（Invitrogen（商標）、ＡＭ８４３９）をスパイクインした。ＰＢＳＴＲによるもう２つの洗浄後に、ＤＮＡアンプリコンを、２時間に渡って室温でＰＢＳＴ緩衝液中の２０ｍＭのＭＡ－ＮＨＳ（Sigma－Aldrich、７３０３００－１Ｇ）によって重合可能であるように修飾した。一晩の室温における蛍光蛋白質のプロテイナーゼＫ（Invitrogen（商標）、２５５３００４９）クリアランス前に、サンプルをそれからハイドロゲル－細胞ハイブリッドに変換した。蛍光検出オリゴによって洗浄およびイメージング緩衝液（２×ＳＳＣ、１０％ホルムアミド）中において３７℃で１時間に渡って染色する前に、サンプルをＰＢＳＴによって３回洗浄した（「蛍光検出プローブ」配列については表５参照）。最後に、サンプルを室温で洗浄およびイメージング緩衝液によって３回洗浄し、洗浄およびイメージング緩衝液中におけるイメージングの前にＤＡＰＩによって染色した。共焦点イメージングスタックを、４０×油浸対物を有するLeica Stellaris 8またはSP8によって２８３ｎｍ＊２８３ｎｍのピクセルサイズで取った。１４μｍスタックを１μｍ／ステップ＊１５ステップでイメージングする。各四分円から１つの４つの代表的な視野を各ウェルについて取った。同じイメージング設定を、比較されるべき全てのサンプルに用いた。励起／検出波長は次の通りである：ＤＡＰＩ：ダイオード４０５ｎｍ／～［４２０～４８９］ｎｍ；Alexa546：ＷＬＬ５５７ｎｍ／～［５６９～６１２］ｎｍ；Alexa647：ＷＬＬ６５３ｎｍ／～［６６８～７３８］ｎｍ。
MATLAB 2021aおよびCellProfiler 4.0.7を、アンプリコンカウントに基づくＳＴＡＲｍａｐ蛍光画像分析に用いた（図８Ｃ）。第１に、各蛍光チャンネル（ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ）におけるアンプリコンの重心を、画像上の拡大された最大値（extended maxima）を見出すことによって同定した。それから、各蛍光ドットの重心を中心とする３＊３＊３ボクセル体積を定めた。各ボクセル体積内で、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＧＦＰチャンネルの統合された強度を計算し、ｍＣｈｅｒｒｙ強度およびＧＦＰ強度の間の比をアンプリコン分類に用いた。これらの測定がバッチの全ての画像について行われた後に、全ての測定を一緒にプールし、ｌｏｇ（ｍＣｈｅｒｒｙ／ＧＦＰ）値の分布をプロットした。分布プロット上の最小値（極小値）における対応する比の値をカットオフ値として同定した。０未満の第１のカットオフ値はカットオフ１として言及され、０よりも多大な第１のカットオフ値はカットオフ２として言及された。カットオフ１よりも小さいｌｏｇ（ｍＣｈｅｒｒｙ／ＧＦＰ）値を有するいずれかのアンプリコンはＧＦＰアンプリコンとして同定された。カットオフ２よりも大きいｌｏｇ（ｍＣｈｅｒｒｙ／ＧＦＰ）値を有するいずれかのアンプリコンはｍＣｈｅｒｒｙアンプリコンとして同定された。カットオフ１およびカットオフ２の間のｌｏｇ（ｍＣｈｅｒｒｙ／ＧＦＰ）値を有するいずれかのアンプリコンは顆粒として同定された。アンプリコン分類情報およびあらゆるアンプリコンの所在をファイルにセーブした。バルクＳＴＡＲｍａｐ定量では、各図において、ＧＦＰアンプリコンの数およびｍＣｈｅｒｒｙアンプリコンの数の間の比を計算し、ＧＦＰｍＲＮＡの量を反映するために用いた。単一細胞ＳＴＡＲｍａｐ定量では、細胞セグメンテーションを単一細胞蛋白質定量における細胞セグメンテーションと同じ方法を用いて行い、セグメンテーションマスクをｕｉｎｔ１６画像としてセーブした。アンプリコンは、それらがマスク上でどこに所在するかに従って細胞に割り当てられた。各細胞におけるＧＦＰアンプリコンの数およびｍＣｈｅｒｒｙアンプリコンの数の間の比を計算し、単一細胞におけるＧＦＰｍＲＮＡの量を反映するために用いた。ＧＦＰアンプリコンなしまたはｍＣｈｅｒｒｙアンプリコンなしの細胞は、不首尾にトランスフェクションされたと見なされ、それゆえにこれらの分析から排除された。
参照
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例６：化学修飾されたｍｏｃＲＮＡはインビボの効率的な蛋白質発現を提供する．
化学修飾されたオリゴヌクレオチドにライゲーションされた治療薬ｍＲＮＡであるメッセンジャー－オリゴヌクレオチドコンジュゲート化ＲＮＡ（ｍｏｃＲＮＡ）を記載する。治療薬ｍＲＮＡは以下を含有する（５’から３’に）：（１）ｍＲＮＡキャップアナログ（ＮＥＢ：Ｓ１４１１）；（２）５’非翻訳領域（ＵＴＲ）；（３）蛋白質コード領域（ルシフェラーゼレポーター）；（４）３’ＵＴＲ；および（５）ポリ（Ａ）テール（２０から２００ｎｔ）。ｍＲＮＡは、発現を増大させるためのＮ１－メチルシュードウリジン（Trilink Biotechnologies：Ｎ１０８１）によるウリジンの１００％置換を含有する。
ｍｏｃＲＮＡを、治療薬ｍＲＮＡの３’端に化学合成オリゴヌクレオチド（表９）をライゲーションすることによって合成する。ヌクレアーゼ耐性の基を含有するオリゴヌクレオチドが、ポリ（Ａ）テールを脱アデニル化から保護し、ＨｅＬａ細胞培養ではより長い時点において発現を増大させる（図１７）。さらにその上、マウスへのｍｏｃＲＮＡ注射は、無処置のｍＲＮＡと比較してルシフェラーゼレポーターの発現を増大させる（図１８Ａ～１８Ｃ）。
これらのオリゴヌクレオチドは、類似に、非蛋白質コードＲＮＡの３’端に、細胞におけるかかるＲＮＡの安定性を向上させるためにライゲーションされ得る。
均等物および範囲
当業者は、せいぜい慣例的な実験作業を用いて、本願に記載される発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識するかまたは確かめる能力があるであろう。本発明の範囲は上の記載に限定されることを意図されず、むしろ、添付の請求項において提出される通りである。
それと反対に指示されないかまたは文脈から別様に明らかでない限り、請求項において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、１つまたは１つよりも多くを意味し得る。それと反対に指示されないかまたは文脈から別様に明らかでない限り、ある群の１つ以上のメンバーの間に「または」を包含する請求項または記載は、群のメンバーの１つ、１つよりも多く、または全てが所与の産物またはプロセスにおいて存在するか、使用されるか、または別様に該当する場合には満たされていると見なされる。本発明は、群の厳密に１つのメンバーが所与の産物またはプロセスにおいて存在するか、使用されるか、または別様に該当する態様を包含する。本発明は、群のメンバーの１つよりも多くまたは全てが所与の産物またはプロセスにおいて存在するか、使用されるか、または別様に該当する態様をもまた包含する。
さらにその上、本発明は、請求項の１つ以上からのまたは明細書の該当する部分からの１つ以上の限定、要素、クローズ、記述用語などが別の請求項に導入される全ての変形、組み合わせ、および順列を包摂するということは理解されるべきである。例えば、別の請求項に従属するいずれかの請求項は、同じ元の請求項に従属するいずれかの他の請求項に見出される１つ以上の限定を包含するように改変され得る。さらにその上、別様に指示されない限りまたは矛盾もしくは非一貫性が生じるであろうということが当業者に明らかでない限り、請求項が組成物を記載するところでは、本願において開示される目的のいずれかのために組成物を用いる方法が包含され、本願において開示される作る方法または当分野において公知の他の方法のいずれかに従って組成物を作る方法が包含されるということは理解されるべきである。
要素が列記として、例えばマーカッシュ群フォーマットで提示されるところでは、要素の各下位群もまた開示され、いずれかの要素（単数または複数）が群から除去され得るということとは理解されるべきである。用語「含む」は開放的であることを意図され、追加の要素またはステップの包含を許可するということもまた言及される。一般的に、本発明または本発明の側面が具体的な要素、特徴、ステップなどを含むと言われるところでは、ある種の本発明の態様または本発明の側面はかかる要素、特徴、ステップなどからなるかまたは本質的にそれらからなるということは理解されるべきである。平易の目的のために、それらの態様は本願においては具体的にこの通りの言葉で提出されてはいない。それゆえに、１つ以上の要素、特徴、ステップなどを含む本発明の各態様について、本発明は、それらの要素、特徴、ステップなどからなるかまたは本質的にそれらからなる態様をもまた提供する。
範囲が与えられているところでは、エンドポイントが包含される。さらにその上、別様に指示されないかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から別様に明らかでない限り、範囲として表現される値は、文脈が明瞭に別様に述べていない限り、本発明の異なる態様において、申し立てられている範囲内のいずれかの特定の値を、範囲の下限の単位の十分の一までとり得るということは理解されるべきである。別様に指示されないかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から別様に明らかでない限り、範囲として表現される値は所与の範囲内のいずれかの部分範囲をとり得、ここで、部分範囲のエンドポイントは範囲の下限の単位の十分の一と同じ正確度で表現されるということもまた理解されるべきである。
加えて、本発明のいずれかの具体的な態様が請求項のいずれか１つ以上から明示的に排除され得るということは理解されるべきである。範囲が与えられているところでは、範囲内のいずれかの値は請求項のいずれか１つ以上から明示的に排除され得る。本発明の組成物および／または方法のいずれかの態様、要素、特徴、用途、または側面は、いずれかの１つ以上の請求項から排除され得る。簡潔さの目的で、１つ以上の要素、特徴、目的、または側面が排除される態様の全てが、本願において明示的に提出されているわけではない。

Claims (241)

  1. 以下を含む、修飾されたｍＲＮＡ：
    （ｉ）蛋白質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；および
    （ｉｉ）ポリＡ領域、
    ここで、ポリＡ領域はオープンリーディングフレームの３’にあり、１０ヌクレオチド以上を含み、ここで、ポリＡ領域のヌクレオチドの１％から９０％は修飾されたヌクレオチドであり、ここで、ポリＡ領域の最後の１０ヌクレオチドの３つ以上は修飾されたヌクレオチドである。
  2. ポリＡ領域がオープンリーディングフレームの３’にあり、２５個以上のアデノシンヌクレオチドを含み、ここで、ポリＡ領域のヌクレオチドの１％から９０％は修飾されたヌクレオチドであり、ここで、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの３つ以上は修飾されたヌクレオチドである、請求項１に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  3. ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの４つ以上が修飾されたヌクレオチドである、請求項１または２に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  4. ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの一続きの２ヌクレオチド以上が、修飾されたヌクレオチド間連結部によって連結される、請求項１～３のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  5. ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの一続きの３ヌクレオチド以上が修飾されたヌクレオチドであり、デオキシリボヌクレオチド、２’修飾されたヌクレオチド、およびホスホロチオエート連結ヌクレオチドから独立して選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  6. ３つ以上の修飾されたヌクレオチドが、ポリＡ領域の３’末端に所在する一続きのヌクレオチドである、請求項１～５のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  7. ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの一続きの６ヌクレオチド以上が、同じ型のヌクレオチドまたはヌクレオシド間修飾を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  8. ポリＡ領域のヌクレオチドの少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１６％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％が修飾されたヌクレオチドである、請求項１～７のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  9. ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５個が修飾されたヌクレオチドである、請求項１～８のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  10. 修飾されたｍＲＮＡが５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含み、ここで、ＯＲＦは５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの間にあり、ここで、３’ＵＴＲはＯＲＦおよびポリＡ領域の間にある、請求項１～９のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  11. 修飾されたｍＲＮＡが環状ｍＲＮＡであり、ここで、ポリＡ領域が３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲの間にある、請求項１～１０のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  12. 以下を含む、修飾されたｍＲＮＡ：
    （ｉ）蛋白質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；
    （ｉｉ）ポリＡ領域；
    （ｉｉｉ）二次構造を形成することができる少なくとも２つのヌクレオチドを含む構造配列の１コピー以上、
    ここで、ポリＡ領域はオープンリーディングフレームの３’にあり、１０ヌクレオチド以上を含み、ここで、構造配列の１コピー以上はポリＡ領域の３’にあり、ここで、修飾されたｍＲＮＡは二次構造を含み、ここで、二次構造は構造配列の１コピー以上を含む。
  13. ポリＡ領域が２５個以上のアデノシンヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  14. 修飾されたｍＲＮＡが５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含み、ここで、ＯＲＦは５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの間にあり、ここで、３’ＵＴＲはＯＲＦおよびポリＡ領域の間にある、請求項１２または請求項１３に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  15. 修飾されたｍＲＮＡが環状ｍＲＮＡであり、ここで、構造配列の１コピー以上はポリＡ領域および５’ＵＴＲの間にある、請求項１４に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  16. 構造配列がＧ四重鎖配列である、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  17. Ｇ四重鎖がＲＮＡのＧ四重鎖配列である、請求項１６に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  18. ＲＮＡのＧ四重鎖配列が配列番号２の核酸配列を含む、請求項１７に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  19. 修飾されたｍＲＮＡが配列番号２の核酸配列の少なくとも３コピーを含む、請求項１８に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  20. Ｇ四重鎖がＤＮＡのＧ四重鎖配列である、請求項１６に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  21. ＤＮＡのＧ四重鎖配列が配列番号３の核酸配列を含む、請求項２０に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  22. 修飾されたｍＲＮＡが配列番号３の核酸配列の少なくとも３コピーを含む、請求項２１に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  23. 構造配列がテロメアリピート配列である、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  24. テロメアリピート配列が配列番号４の核酸配列を含む、請求項２３に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  25. 修飾されたｍＲＮＡが配列番号４の核酸配列の少なくとも３コピーを含む、請求項２４に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  26. ｍＲＮＡの二次構造が、標的分子に結合することができるアプタマーである、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  27. 修飾されたｍＲＮＡのポリＡ領域が少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１２～２６のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  28. 少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドが修飾された核酸塩基を含む、請求項１～１１または２７のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  29. 修飾された核酸塩基が以下からなる群から選択される、請求項２８に記載の修飾されたｍＲＮＡ：キサンチン、アリアミノウラシル、アリアミノチミジン、ヒポキサンチン、ジゴキシゲニン化アデニン、ジゴキシゲニン化シトシン、ジゴキシゲニン化グアニン、ジゴキシゲニン化ウラシル、６－クロロプリンリボシド、Ｎ６－メチルアデニン、メチルシュードウラシル、２－チオシトシン、２－チオウラシル、５－メチルウラシル、４－チオチミジン、４－チオウラシル、５，６－ジヒドロ－５－メチルウラシル、５，６－ジヒドロウラシル、５－［（３－インドリル）プロピオンアミド－Ｎ－アリル］ウラシル、５－アミノアリルシトシン、５－アミノアリルウラシル、５－ブロモウラシル、５－ブロモシトシン、５－カルボキシシトシン、５－カルボキシメチルエステルウラシル、５－カルボキシウラシル、５－フルオロウラシル、５－ホルミルシトシン、５－ホルミルウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ヒドロキシウラシル、５－ヨードシトシン、５－ヨードウラシル、５－メトキシシトシン、５－メトキシウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－プロパルギルアミノシトシン、５－プロパルギルアミノウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、６－アザシトシン、６－アザウラシル、６－クロロプリン、６－チオグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノアデニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、８－アザアデニン、８－アジドアデニン、８－クロロアデニン、８－オキソアデニン、８－オキソグアニン、アラアデニン、アラシトシン、アラグアニン、アラウラシル、ビオチン－１６－７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、ビオチン－１６－アミノアリルシトシン、ビオチン－１６－アミノアリルウラシル、シアニン３－５－プロパルギルアミノシトシン、シアニン３－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン３－アミノアリルシトシン、シアニン３－アミノアリルウラシル、シアニン５－６－プロパルギルアミノシトシン、シアニン５－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン５－アミノアリルシトシン、シアニン５－アミノアリルウラシル、シアニン７－アミノアリルウラシル、ダブシル－５－３－アミノアリルウラシル、デスチオビオチン－１６－アミノアリル－ウラシル、デスチオビオチン－６－アミノアリルシトシン、イソグアニン、Ｎ１－エチルシュードウラシル、Ｎ１－メトキシメチルシュードウラシル、Ｎ１－メチルアデニン、Ｎ１－メチルシュードウラシル、Ｎ１－プロピルシュードウラシル、Ｎ２－メチルグアニン、Ｎ４－ビオチン－ＯＢＥＡ－シトシン、Ｎ４－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｏ６－メチルグアニン、シュードイソシトシン、シュードウラシル、チエノシトシン、チエノグアニン、チエノウラシル、キサントシン、３－デアザアデニン、２，６－ジアミノアデニン、２，６－ジアミノ（damino）グアニン、５－カルボキサミド－ウラシル、５－エチニルウラシル、Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｉ６Ａ）、２－メチル－チオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン（ｍ６２Ａ）、およびＮ６－アセチルアデニン（ａｃ６Ａ）。
  30. 少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドが修飾された糖を含む、請求項２８または２９に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  31. 修飾された糖が以下からなる群から選択される、請求項３０に記載の修飾されたｍＲＮＡ：２’－チオリボース、２’，３’－ジデオキシリボース、２’－アミノ－２’－デオキシリボース、２’デオキシリボース、２’－アジド－２’－デオキシリボース、２’－フルオロ－２’－デオキシリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、２’－Ｏ－メチルデオキシリボース、３’－アミノ－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－アジド－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－デオキシリボース、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－２’－デオキシリボース、３’－Ｏ－メチルリボース、５’－アミノリボース、５’－チオリボース、５－ニトロ－１－インドリル－２’－デオキシリボース、５’－ビオチン－リボース、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン連結、２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノ連結リボース、および２’－Ｏ，４’－Ｃ－チオ連結リボース。
  32. 少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドが２’修飾を含む、請求項２７～３１のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  33. ２’修飾が以下からなる群から選択される、請求項３２に記載の修飾されたｍＲＮＡ：ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、および２’－Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）。
  34. 少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドが修飾されたリン酸を含む、請求項２７～３３のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  35. 修飾されたリン酸が以下からなる群から選択される、請求項３４に記載の修飾されたｍＲＮＡ：ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホロジチオエート、チオリン酸、５’－Ｏ－メチルホスホネート、３’－Ｏ－メチルホスホネート、５’－ヒドロキシホスホネート、ヒドロキシホスファネート、ホスホロセレノアート、セレノホスフェート、ホスホロアミダート、カルボホスホネート、メチルホスホネート、フェニルホスホネート、エチルホスホネート、Ｈ－ホスホネート、グアニジニウム環、トリアゾール環、ボラノホスフェート（ＢＰ）、メチルホスホネート、およびグアニジノプロピルホスホロアミダート。
  36. ポリＡ領域が少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６つのホスホロチオエートを含む、請求項２７～３５のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  37. ポリＡ領域が少なくとも６つのホスホロチオエートを含む、請求項３６に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  38. ポリＡ領域が少なくとも３つのグアニンヌクレオチドおよび少なくとも３つのホスホロチオエートを含む、請求項２７～３５のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  39. ポリＡ領域が２’修飾を含む少なくとも６ヌクレオチドを含む、請求項２７～３８のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  40. ポリＡ領域が少なくとも３つのデオキシリボース糖を含む、請求項２７～３９のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  41. ポリＡ領域が少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２３個のデオキシリボース糖を含む、請求項４０に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  42. ポリＡ領域が少なくとも２３個のデオキシリボース糖を含む、請求項４１に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  43. ｍＲＮＡの３’末端ヌクレオチドが３’末端ヌクレオチドの３’位置にヒドロキシを含まない、請求項１～４２のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  44. ｍＲＮＡの３’末端ヌクレオチドが反転ヌクレオチドを含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  45. ｍＲＮＡの３’末端ヌクレオチドがジデオキシアデノシン、ジデオキシシチジン、ジデオキシグアノシン、ジデオキシチミジン、ジデオキシウリジン、または反転デオキシチミジンを含む、請求項１～４４のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  46. ｍＲＮＡの３’末端ヌクレオチドがジデオキシシチジンを含む、請求項４５に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  47. ｍＲＮＡがペプチド結合配列を含む、請求項１～４６のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  48. ペプチド結合配列がポリＡ結合蛋白質（ＰＡＢＰ）結合配列である、請求項４７に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  49. 修飾されたｍＲＮＡが第１の修飾されたヌクレオチドおよび第２の修飾されたヌクレオチドを含み、ここで、第１および第２の修飾されたヌクレオシドは異なる構造を含む、請求項１～１１または２７～４８のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  50. ポリＡ領域が少なくとも２５～５００ヌクレオチドを含む、請求項１～４６のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  51. ポリＡ領域が少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、または少なくとも２００ヌクレオチドを含む、請求項５０に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  52. ポリＡ領域のヌクレオチドの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％がアデノシンヌクレオチドである、請求項１～５１のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  53. 修飾されたｍＲＮＡが直鎖ｍＲＮＡであり、ここで、直鎖ｍＲＮＡは５’キャップを含む、請求項１～１０、１２、１４、または１６～５２のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  54. ５’キャップが７－メチルグアノシンを含む、請求項５３に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  55. ５’キャップが、さらに、修飾されたｍＲＮＡの隣接するヌクレオチドに７－メチルグアノシンを接続する１つ以上のリン酸を含む、請求項５４に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  56. ５’キャップが３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含む、請求項５３に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  57. ５’キャップの１つ以上のリン酸が、以下からなる群から選択される修飾されたリン酸である、請求項５５または５６に記載の修飾されたｍＲＮＡ：ホスホロチオエート、トリアゾール環、ジハロゲンメチレンビスホスホネート、イミド二リン酸、およびメチレンビス（ホスホネート）。
  58. 修飾されたｍＲＮＡが、１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む５’ＵＴＲを含む、１～５７に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  59. 修飾されたｍＲＮＡが、１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含むＯＲＦを含む、１～５８に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  60. 以下を含む、修飾された非コードＲＮＡ：
    （ｉ）非コードＲＮＡ配列；および
    （ｉｉ）ポリＡ領域、
    ここで、ポリＡ領域は非コードＲＮＡ配列の３’にあり、１０ヌクレオチド以上を含み、ここで、ポリＡ領域のヌクレオチドの１％から９０％は修飾されたヌクレオチドであり、ここで、ポリＡ領域の最後の１０ヌクレオチドの３つ以上は修飾されたヌクレオチドである。
  61. ポリＡ領域がオープンリーディングフレームの３’にあり、２５個以上のアデノシンヌクレオチドを含み、ここで、ポリＡ領域のヌクレオチドの１％から９０％は修飾されたヌクレオチドであり、ここで、ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの３つ以上は修飾されたヌクレオチドである、請求項６０に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  62. ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの４つ以上が修飾されたヌクレオチドである、請求項６０または請求項６１に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  63. ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの一続きの２ヌクレオチド以上が、修飾されたヌクレオチド間連結部によって連結される、請求項６０～６２のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  64. ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの一続きの３ヌクレオチド以上が修飾されたヌクレオチドであり、デオキシリボヌクレオチド、２’修飾されたヌクレオチド、およびホスホロチオエート連結ヌクレオチドから独立して選択される、請求項６０～６３のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  65. ３つ以上の修飾されたヌクレオチドが、ポリＡ領域の３’末端に所在する一続きのヌクレオチドである、請求項６０～６４のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  66. ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの一続きの６ヌクレオチド以上が、同じ型のヌクレオチドまたはヌクレオシド間修飾を含む、請求項６０～６５のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  67. ポリＡ領域のヌクレオチドの少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１６％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％が修飾されたヌクレオチドである、請求項６０～６６のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  68. ポリＡ領域の最後の２５ヌクレオチドの少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５個が修飾されたヌクレオチドである、請求項６０～６７のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  69. 修飾された非コードＲＮＡが環状の非コードＲＮＡであり、ここで、ポリＡ領域は非コードＲＮＡ配列の５’にある、請求項６０～６８のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  70. 修飾された非コードＲＮＡが、さらに、二次構造を形成することができる少なくとも２つのヌクレオチドを含む構造配列の１コピー以上を含み、
    ここで、構造配列の１コピー以上はポリＡ領域の３’にあり、ここで、修飾された非コードＲＮＡは二次構造を含み、
    ここで、二次構造は構造配列の１コピー以上を含む、
    請求項６０～６９のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  71. 修飾された非コードＲＮＡが環状ｍＲＮＡであり、ここで、構造配列の１コピー以上はポリＡ領域および非コードＲＮＡ配列の間にある、請求項７０に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  72. 構造配列がＧ四重鎖配列である、請求項７０または７１に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  73. Ｇ四重鎖がＲＮＡのＧ四重鎖配列である、請求項７２に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  74. ＲＮＡのＧ四重鎖配列が配列番号２の核酸配列を含む、請求項７３に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  75. 修飾された非コードＲＮＡが配列番号２の核酸配列の少なくとも３コピーを含む、請求項７４に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  76. Ｇ四重鎖がＤＮＡのＧ四重鎖配列である、請求項７２に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  77. ＤＮＡのＧ四重鎖配列が配列番号３の核酸配列を含む、請求項７６に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  78. 修飾された非コードＲＮＡが配列番号３の核酸配列の少なくとも３コピーを含む、請求項７７に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  79. 構造配列がテロメアリピート配列である、請求項７０または７１に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  80. テロメアリピート配列が配列番号４の核酸配列を含む、請求項７９に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  81. 修飾された非コードＲＮＡが配列番号４の核酸配列の少なくとも３コピーを含む、請求項８０に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  82. 非コードＲＮＡの二次構造が、標的分子に結合することができるアプタマーである、請求項７０または７１に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  83. 少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドが修飾された核酸塩基を含む、請求項６０～８２のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  84. 修飾された核酸塩基が以下からなる群から選択される、請求項８３に記載の修飾された非コードＲＮＡ：キサンチン、アリアミノウラシル、アリアミノチミジン、ヒポキサンチン、ジゴキシゲニン化アデニン、ジゴキシゲニン化シトシン、ジゴキシゲニン化グアニン、ジゴキシゲニン化ウラシル、６－クロロプリンリボシド、Ｎ６－メチルアデニン、メチルシュードウラシル、２－チオシトシン、２－チオウラシル、５－メチルウラシル、４－チオチミジン、４－チオウラシル、５，６－ジヒドロ－５－メチルウラシル、５，６－ジヒドロウラシル、５－［（３－インドリル）プロピオンアミド－Ｎ－アリル］ウラシル、５－アミノアリルシトシン、５－アミノアリルウラシル、５－ブロモウラシル、５－ブロモシトシン、５－カルボキシシトシン、５－カルボキシメチルエステルウラシル、５－カルボキシウラシル、５－フルオロウラシル、５－ホルミルシトシン、５－ホルミルウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ヒドロキシウラシル、５－ヨードシトシン、５－ヨードウラシル、５－メトキシシトシン、５－メトキシウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－プロパルギルアミノシトシン、５－プロパルギルアミノウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、６－アザシトシン、６－アザウラシル、６－クロロプリン、６－チオグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノアデニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、８－アザアデニン、８－アジドアデニン、８－クロロアデニン、８－オキソアデニン、８－オキソグアニン、アラアデニン、アラシトシン、アラグアニン、アラウラシル、ビオチン－１６－７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、ビオチン－１６－アミノアリルシトシン、ビオチン－１６－アミノアリルウラシル、シアニン３－５－プロパルギルアミノシトシン、シアニン３－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン３－アミノアリルシトシン、シアニン３－アミノアリルウラシル、シアニン５－６－プロパルギルアミノシトシン、シアニン５－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン５－アミノアリルシトシン、シアニン５－アミノアリルウラシル、シアニン７－アミノアリルウラシル、ダブシル－５－３－アミノアリルウラシル、デスチオビオチン－１６－アミノアリル－ウラシル、デスチオビオチン－６－アミノアリルシトシン、イソグアニン、Ｎ１－エチルシュードウラシル、Ｎ１－メトキシメチルシュードウラシル、Ｎ１－メチルアデニン、Ｎ１－メチルシュードウラシル、Ｎ１－プロピルシュードウラシル、Ｎ２－メチルグアニン、Ｎ４－ビオチン－ＯＢＥＡ－シトシン、Ｎ４－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｏ６－メチルグアニン、シュードイソシトシン、シュードウラシル、チエノシトシン、チエノグアニン、チエノウラシル、キサントシン、３－デアザアデニン、２，６－ジアミノアデニン、２，６－ジアミノ（damino）グアニン、５－カルボキサミド－ウラシル、５－エチニルウラシル、Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｉ６Ａ）、２－メチル－チオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン（ｍ６２Ａ）、およびＮ６－アセチルアデニン（ａｃ６Ａ）。
  85. 少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドが修飾された糖を含む、６０～８４のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  86. 修飾された糖が以下からなる群から選択される、請求項８５に記載の修飾された非コードＲＮＡ：２’－チオリボース、２’，３’－ジデオキシリボース、２’－アミノ－２’－デオキシリボース、２’デオキシリボース、２’－アジド－２’－デオキシリボース、２’－フルオロ－２’－デオキシリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、２’－Ｏ－メチルデオキシリボース、３’－アミノ－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－アジド－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－デオキシリボース、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－２’－デオキシリボース、３’－Ｏ－メチルリボース、５’－アミノリボース、５’－チオリボース、５－ニトロ－１－インドリル－２’－デオキシリボース、５’－ビオチン－リボース、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン連結、２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノ連結リボース、および２’－Ｏ，４’－Ｃ－チオ連結リボース。
  87. 少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドが２’修飾を含む、請求項６０～８６のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  88. ２’修飾が以下からなる群から選択される、請求項８７に記載の修飾された非コードＲＮＡ：ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、および２’－Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）。
  89. 少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドが修飾されたリン酸を含む、請求項５７～８８のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  90. 修飾されたリン酸が以下からなる群から選択される、請求項８９に記載の修飾された非コードＲＮＡ：ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホロジチオエート、チオリン酸、５’－Ｏ－メチルホスホネート、３’－Ｏ－メチルホスホネート、５’－ヒドロキシホスホネート、ヒドロキシホスファネート、ホスホロセレノアート、セレノホスフェート、ホスホロアミダート、カルボホスホネート、メチルホスホネート、フェニルホスホネート、エチルホスホネート、Ｈ－ホスホネート、グアニジニウム環、トリアゾール環、ボラノホスフェート（ＢＰ）、メチルホスホネート、およびグアニジノプロピルホスホロアミダート。
  91. ポリＡ領域が少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６つのホスホロチオエートを含む、請求項６０～９０のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  92. ポリＡ領域が少なくとも６つのホスホロチオエートを含む、請求項９１に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  93. ポリＡ領域が少なくとも３つのグアニンヌクレオチドおよび少なくとも３つのホスホロチオエートを含む、請求項６０～９２のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  94. ポリＡ領域が２’修飾を含む少なくとも６ヌクレオチドを含む、請求項６０～９３のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  95. ポリＡ領域が少なくとも３つのデオキシリボース糖を含む、請求項６０～９４のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  96. ポリＡ領域が少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２３個のデオキシリボース糖を含む、請求項９５に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  97. ポリＡ領域が少なくとも２３個のデオキシリボース糖を含む、請求項９６に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  98. 非コードＲＮＡの３’末端ヌクレオチドが３’末端ヌクレオチドの３’位置にヒドロキシを含まない、請求項６０～９７のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  99. 非コードＲＮＡの３’末端ヌクレオチドが反転ヌクレオチドを含む、請求項６０～９８のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  100. ｍＲＮＡの３’末端ヌクレオチドがジデオキシアデノシン、ジデオキシシチジン、ジデオキシグアノシン、ジデオキシチミジン、ジデオキシウリジン、または反転デオキシチミジンを含む、請求項９８または９９に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  101. ｍＲＮＡの３’末端ヌクレオチドがジデオキシシチジンを含む、請求項１００に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  102. 修飾された非コードＲＮＡが第１の修飾されたヌクレオチドおよび第２の修飾されたヌクレオチドを含み、ここで、第１および第２の修飾されたヌクレオシドは異なる構造を含む、請求項６０～１０１のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  103. ポリＡ領域が少なくとも２５～５００ヌクレオチドを含む、請求項６０～１０２のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  104. ポリＡ領域が少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、または少なくとも２００ヌクレオチドを含む、請求項１０３に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  105. ポリＡ領域のヌクレオチドの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％がアデノシンヌクレオチドである、請求項６０～１０４のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  106. 方法が、ＲＮＡリガーゼの存在下において、１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含むテーリング核酸に、蛋白質をコードするオープンリーディングフレームを含む第１のＲＮＡをライゲーションすることを含み、それによって、ＲＮＡリガーゼはＲＮＡの３’ヌクレオチドおよびテーリング核酸の５’ヌクレオチドの間の共有結合を形成して、修飾されたｍＲＮＡを産生する、請求項１～１１または２７～５９のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡを産生する方法。
  107. 修飾されたｍＲＮＡが５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含み、ここで、ＯＲＦは５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの間にあり、ここで、３’ＵＴＲはＯＲＦおよびポリＡ領域の間にある、請求項１０６に記載の方法。
  108. さらに、リボザイムの存在下において修飾されたｍＲＮＡを環状化することを含み、ここで、修飾されたｍＲＮＡは３’イントロンおよび５’イントロンを含み、ここで、３’イントロンは５’ＵＴＲの５’にあり、ここで、５’イントロンはポリＡ領域の３’にあり、それによって、リボザイムは、３’イントロンの３’にあるヌクレオチドおよび５’イントロンの５’にあるヌクレオチドの間の共有結合を形成して、５’イントロンまたは３’イントロンを含まない環状ｍＲＮＡを産生し、ここで、ポリＡ領域は環状ｍＲＮＡの３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲの間にある、請求項１０７に記載の方法。
  109. さらに、以下のステップを含む、請求項１０７に記載の方法：
    （ｉ）修飾されたｍＲＮＡの第１のヌクレオチドに５’末端リン酸基を導入すること；
    （ｉｉ）修飾されたｍＲＮＡの１つ以上の３’末端ヌクレオチドを切断して、３’末端ヒドロキシル基を有する修飾されたｍＲＮＡを産生すること；および
    （ｉｉｉ）環状化リガーゼの存在下において、ステップ（ｉｉ）で産生された修飾されたｍＲＮＡを環状化すること；
    それによって、環状化リガーゼは、修飾されたｍＲＮＡの３’ヌクレオチドおよび修飾されたｍＲＮＡの５’ヌクレオチドの間の共有結合を形成して、環状の修飾されたｍＲＮＡを産生し、ここで、ポリＡ領域は３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲの間にある。
  110. 方法が、ＲＮＡリガーゼの存在下において、構造配列の１コピー以上を含むテーリング核酸に、蛋白質をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡをライゲーションすることを含み、それによって、リガーゼはＲＮＡの３’ヌクレオチドおよびテーリング核酸の５’ヌクレオチドの間の共有結合を形成して、修飾されたｍＲＮＡを産生する、請求項１２～５９のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡを産生する方法。
  111. 修飾されたｍＲＮＡが５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含み、ここで、ＯＲＦは５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの間にあり、ここで、３’ＵＴＲはＯＲＦおよびポリＡ領域の間にあり、ここで、ポリＡ領域は３’ＵＴＲおよび構造配列の１コピー以上の間にある、請求項１１０に記載の方法。
  112. さらに、リボザイムの存在下において修飾されたｍＲＮＡを環状化することを含み、ここで、修飾されたｍＲＮＡは３’イントロンおよび５’イントロンを含み、ここで、３’イントロンは５’ＵＴＲの５’にあり、ここで、５’イントロンは構造配列の１コピー以上の３’にあり、それによって、リボザイムは、３’イントロンの３’にあるヌクレオチドおよび５’イントロンの５’にあるヌクレオチドの間の共有結合を形成して、５’イントロンまたは３’イントロンを含まない環状ｍＲＮＡを産生し、ここで、構造配列の１コピー以上は環状ｍＲＮＡのポリＡ領域および５’ＵＴＲの間にある、請求項１１１に記載の方法。
  113. さらに、以下のステップを含む、請求項１１１に記載の方法：
    （ｉ）修飾されたｍＲＮＡの第１のヌクレオチドに５’末端リン酸基を導入すること；
    （ｉｉ）修飾されたｍＲＮＡの１つ以上の３’末端ヌクレオチドを切断して、３’末端ヒドロキシル基を有する修飾されたｍＲＮＡを産生すること；および
    （ｉｉｉ）環状化リガーゼの存在下において、ステップ（ｉｉ）で産生された修飾されたｍＲＮＡを環状化すること；
    それによって、環状化リガーゼは、修飾されたｍＲＮＡの３’ヌクレオチドおよび修飾されたｍＲＮＡの５’ヌクレオチドの間の共有結合を形成して、環状の修飾されたｍＲＮＡを産生し、ここで、構造配列の１コピー以上は３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲの間にある。
  114. 修飾されたｍＲＮＡが骨格核酸の存在下において環状化され、ここで、骨格核酸は、修飾されたｍＲＮＡとハイブリダイゼーションすることができる核酸であり、ここで、修飾されたｍＲＮＡは、骨格核酸に結合したときに環状の二次構造を形成する、請求項１０９または１１３に記載の方法。
  115. 骨格核酸が以下を含む、請求項１１４に記載の方法：
    （ａ）５ヌクレオチド以上を含む第１のハイブリダイゼーション配列であって、ここで、第１のハイブリダイゼーション配列は、修飾されたｍＲＮＡの少なくとも最初の五（５）ヌクレオチドに対して相補的である；および
    （ｂ）５ヌクレオチド以上を含む第２のハイブリダイゼーション配列であって、ここで、第２のハイブリダイゼーション配列は、修飾されたｍＲＮＡの少なくとも最後の五（５）ヌクレオチドに対して相補的である；
    ここで、修飾されたｍＲＮＡの少なくとも最初の五（５）ヌクレオチドは、第１のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイゼーションし、修飾されたｍＲＮＡの少なくとも最後の五（５）ヌクレオチドは第２のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイゼーションする。
  116. 第１のハイブリダイゼーション配列の最後のヌクレオチドおよび第２のハイブリダイゼーション配列の最初のヌクレオチドが骨格核酸上で隣接し、いずれかの他のヌクレオチドによって離間されない、請求項１１４または１１５に記載の方法。
  117. 修飾されたｍＲＮＡが以下を含む、請求項１０９または１１３に記載の方法：
    （ｉ）オープンリーディングフレームの５’にある第１のセルフハイブリダイゼーション配列；
    （ｉｉ）オープンリーディングフレームの３’にある第２のセルフハイブリダイゼーション配列；
    （ｉｉｉ）第１のセルフハイブリダイゼーション配列の５’にある第１の非ハイブリダイゼーション配列；および
    （ｉｖ）第２のセルフハイブリダイゼーション配列の３’にある第２の非ハイブリダイゼーション配列、
    ここで、第１および第２のセルフハイブリダイゼーション配列は互いとハイブリダイゼーションすることができ、
    ここで、第１および第２のセルフハイブリダイゼーション配列は互いとハイブリダイゼーションすることができない。
  118. 第１および第２のセルフハイブリダイゼーション配列のハイブリダイゼーションが二次構造を形成し、これにおいて、修飾されたｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドは１００Å未満の距離だけ離間される、請求項１１７に記載の方法。
  119. ５’末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドが９０Å未満、８０Å未満、７０Å未満、６０Å未満、５０Å未満、４０Å未満、３０Å未満、２０Å未満、または１０Å未満の距離だけ離間される、請求項１１８に記載の方法。
  120. 環状化リガーゼがＴ４ＲＮＡリガーゼである、請求項１０９または１１３～１１９のいずれか１項に記載の方法。
  121. 構造配列がＧ四重鎖配列である、請求項１１０～１２０のいずれか１項に記載の方法。
  122. Ｇ四重鎖がＲＮＡのＧ四重鎖配列である、請求項１２１に記載の方法。
  123. ＲＮＡのＧ四重鎖配列が配列番号２の核酸配列を含む、請求項１２２に記載の方法。
  124. テーリング核酸が配列番号２の核酸配列の少なくとも３コピーを含む、請求項１２３に記載の方法。
  125. Ｇ四重鎖がＤＮＡのＧ四重鎖配列である、請求項１２１に記載の方法。
  126. ＤＮＡのＧ四重鎖配列が配列番号３の核酸配列を含む、請求項１２５に記載の方法。
  127. テーリング核酸が配列番号３の核酸配列の少なくとも３コピーを含む、請求項１２６に記載の方法。
  128. 構造配列がテロメアリピート配列である、請求項１１０～１２０のいずれか１項に記載の方法。
  129. テロメアリピート配列が配列番号４の核酸配列を含む、請求項１２８に記載の方法。
  130. テーリング核酸が配列番号４の核酸配列の少なくとも３コピーを含む、請求項１２９に記載の方法。
  131. 構造配列が、相互作用してアプタマーを形成することができる少なくとも２つのヌクレオチドを含むアプタマー配列であり、ここで、アプタマーは、標的分子に結合することができる二次構造である、請求項１１０～１２０のいずれか１項に記載の方法。
  132. テーリング核酸が少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１１０～１３１のいずれか１項に記載の方法。
  133. ＲＮＡの５’ヌクレオチドが５’末端リン酸基を含まず；
    ここで、ＲＮＡの３’ヌクレオチドは３’末端ヒドロキシル基を含み；
    ここで、テーリング核酸の５’ヌクレオチドは５’末端リン酸基を含み；
    ここで、テーリング核酸の３’ヌクレオチドは３’末端ヒドロキシル基を含まない、
    請求項１０６、１０７、または１３２のいずれか１項に記載の方法。
  134. ＲＮＡの５’ヌクレオチドが５’末端ヒドロキシル基を含まず；
    ここで、ＲＮＡの３’ヌクレオチドは３’末端リン酸基を含み；
    ここで、テーリング核酸の５’ヌクレオチドは５’末端ヒドロキシル基を含み；
    ここで、テーリング核酸の３’ヌクレオチドは３’末端リン酸基を含まず；
    ここで、ＲＮＡリガーゼはＲｔｃＢリガーゼである、
    請求項１０６、１０７、または１３２のいずれか１項に記載の方法。
  135. テーリング核酸のヌクレオチドの少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１６％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％が修飾されたヌクレオチドである、請求項１０６、１０７、または１３２～１３４のいずれか１項に記載の方法。
  136. テーリング核酸の最後の２５ヌクレオチドの少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５個が修飾されたヌクレオチドである、請求項１０６、１０７、または１３２～１３５のいずれか１項に記載の方法。
  137. 少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドが修飾された核酸塩基を含む、請求項１０６、１０７、または１３２～１３６のいずれか１項に記載の方法。
  138. 修飾された核酸塩基が以下からなる群から選択される、請求項１３７に記載の方法：キサンチン、アリアミノウラシル、アリアミノチミジン、ヒポキサンチン、ジゴキシゲニン化アデニン、ジゴキシゲニン化シトシン、ジゴキシゲニン化グアニン、ジゴキシゲニン化ウラシル、６－クロロプリンリボシド、Ｎ６－メチルアデニン、メチルシュードウラシル、２－チオシトシン、２－チオウラシル、５－メチルウラシル、４－チオチミジン、４－チオウラシル、５，６－ジヒドロ－５－メチルウラシル、５，６－ジヒドロウラシル、５－［（３－インドリル）プロピオンアミド－Ｎ－アリル］ウラシル、５－アミノアリルシトシン、５－アミノアリルウラシル、５－ブロモウラシル、５－ブロモシトシン、５－カルボキシシトシン、５－カルボキシメチルエステルウラシル、５－カルボキシウラシル、５－フルオロウラシル、５－ホルミルシトシン、５－ホルミルウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ヒドロキシウラシル、５－ヨードシトシン、５－ヨードウラシル、５－メトキシシトシン、５－メトキシウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－プロパルギルアミノシトシン、５－プロパルギルアミノウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、６－アザシトシン、６－アザウラシル、６－クロロプリン、６－チオグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノアデニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、８－アザアデニン、８－アジドアデニン、８－クロロアデニン、８－オキソアデニン、８－オキソグアニン、アラアデニン、アラシトシン、アラグアニン、アラウラシル、ビオチン－１６－７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、ビオチン－１６－アミノアリルシトシン、ビオチン－１６－アミノアリルウラシル、シアニン３－５－プロパルギルアミノシトシン、シアニン３－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン３－アミノアリルシトシン、シアニン３－アミノアリルウラシル、シアニン５－６－プロパルギルアミノシトシン、シアニン５－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン５－アミノアリルシトシン、シアニン５－アミノアリルウラシル、シアニン７－アミノアリルウラシル、ダブシル－５－３－アミノアリルウラシル、デスチオビオチン－１６－アミノアリル－ウラシル、デスチオビオチン－６－アミノアリルシトシン、イソグアニン、Ｎ１－エチルシュードウラシル、Ｎ１－メトキシメチルシュードウラシル、Ｎ１－メチルアデニン、Ｎ１－メチルシュードウラシル、Ｎ１－プロピルシュードウラシル、Ｎ２－メチルグアニン、Ｎ４－ビオチン－ＯＢＥＡ－シトシン、Ｎ４－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｏ６－メチルグアニン、シュードイソシトシン、シュードウラシル、チエノシトシン、チエノグアニン、チエノウラシル、キサントシン、３－デアザアデニン、２，６－ジアミノアデニン、２，６－ジアミノ（damino）グアニン、５－カルボキサミド－ウラシル、５－エチニルウラシル、Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｉ６Ａ）、２－メチル－チオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン（ｍ６２Ａ）、およびＮ６－アセチルアデニン（ａｃ６Ａ）。
  139. 少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドが修飾された糖を含む、請求項１０６、１０７、または１３２～１３８のいずれか１項に記載の方法。
  140. 修飾された糖が以下からなる群から選択される、請求項１３９に記載の方法：２’－チオリボース、２’，３’－ジデオキシリボース、２’－アミノ－２’－デオキシリボース、２’デオキシリボース、２’－アジド－２’－デオキシリボース、２’－フルオロ－２’－デオキシリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、２’－Ｏ－メチルデオキシリボース、３’－アミノ－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－アジド－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－デオキシリボース、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－２’－デオキシリボース、３’－Ｏ－メチルリボース、５’－アミノリボース、５’－チオリボース、５－ニトロ－１－インドリル－２’－デオキシリボース、５’－ビオチン－リボース、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン連結、２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノ連結リボース、および２’－Ｏ，４’－Ｃ－チオ連結リボース。
  141. 少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドが２’修飾を含む、請求項１０６、１０７、または１３２～１４０のいずれか１項に記載の方法。
  142. ２’修飾が以下からなる群から選択される、請求項１４１に記載の方法：ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、および２’－Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）。
  143. 少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドが修飾されたリン酸を含む、請求項１０６、１０７、または１３２～１４２のいずれか１項に記載の方法。
  144. 修飾されたリン酸が以下からなる群から選択される、請求項１４３に記載の方法：ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホロジチオエート、チオリン酸、５’－Ｏ－メチルホスホネート、３’－Ｏ－メチルホスホネート、５’－ヒドロキシホスホネート、ヒドロキシホスファネート、ホスホロセレノアート、セレノホスフェート、ホスホロアミダート、カルボホスホネート、メチルホスホネート、フェニルホスホネート、エチルホスホネート、Ｈ－ホスホネート、グアニジニウム環、トリアゾール環、ボラノホスフェート（ＢＰ）、メチルホスホネート、およびグアニジノプロピルホスホロアミダート。
  145. テーリング核酸が少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６つのホスホロチオエートを含む、請求項１０６、１０７、または１３２～１４４のいずれか１項に記載の方法。
  146. テーリング核酸が少なくとも６つのホスホロチオエートを含む、請求項１４５に記載の方法。
  147. テーリング核酸が少なくとも３つのグアニンヌクレオチドおよび少なくとも３つのホスホロチオエートを含む、請求項１０６、１０７、または１３２～１４５のいずれか１項に記載の方法。
  148. テーリング核酸が２’修飾を含む少なくとも６ヌクレオチドを含む、請求項１０６、１０７、または１３２～１４７のいずれか１項に記載の方法。
  149. テーリング核酸が少なくとも３つのデオキシリボース糖を含む、請求項１０６、１０７、または１３２～１４８のいずれか１項に記載の方法。
  150. テーリング核酸が少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２３個のデオキシリボース糖を含む、請求項１４９に記載の方法。
  151. テーリング核酸が少なくとも２３個のデオキシリボース糖を含む、請求項１４０に記載の方法。
  152. テーリング核酸の３’末端ヌクレオチドがジデオキシアデノシン、ジデオキシシチジン、ジデオキシグアノシン、ジデオキシチミジン、ジデオキシウリジン、または反転デオキシチミジンを含む、請求項１０６、１０７、１１０、１１１、または１３２～１５１のいずれか１項に記載の方法。
  153. テーリング核酸が第１の修飾されたヌクレオチドおよび第２の修飾されたヌクレオチドを含み、ここで、第１および第２の修飾されたヌクレオチドは異なる構造を含む、請求項１０６～１５２のいずれか１項に記載の方法。
  154. 修飾されたｍＲＮＡのポリＡ領域の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％がアデノシンヌクレオチドである、請求項１０６～１５３のいずれか１項に記載の方法。
  155. 修飾されたｍＲＮＡのポリＡ領域が少なくとも２５～５００ヌクレオチドを含む、請求項１０６～１５４のいずれか１項に記載の方法。
  156. 修飾されたｍＲＮＡのポリＡ領域が少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、または少なくとも２００ヌクレオチドを含む、請求項１５５に記載の方法。
  157. 修飾されたｍＲＮＡが直鎖ｍＲＮＡであり、ここで、直鎖ｍＲＮＡは５’キャップを含む、請求項１０６、１０７、１１０、１１１、または１２１～１５６のいずれか１項に記載の方法。
  158. ５’キャップが７－メチルグアノシンを含む、請求項１５７に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  159. ５’キャップが、さらに、修飾されたｍＲＮＡの隣接するヌクレオチドに７－メチルグアノシンを接続する１つ以上のリン酸を含む、請求項１５８に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  160. ５’キャップが３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含む、請求項１５７に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  161. ５’キャップの１つ以上のリン酸が、以下からなる群から選択される修飾されたリン酸である、請求項１５９または１６０に記載の修飾されたｍＲＮＡ：ホスホロチオエート、トリアゾール環、ジハロゲンメチレンビスホスホネート、イミド二リン酸、およびメチレンビス（ホスホネート）。
  162. ＲＮＡリガーゼがＴ４ＲＮＡリガーゼである、請求項１０６～１６１のいずれか１項に記載の方法。
  163. 方法が、ＲＮＡリガーゼの存在下において、１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含むテーリング核酸に、非コードＲＮＡ配列を含む第１のＲＮＡをライゲーションすることを含み、それによって、ＲＮＡリガーゼは、ＲＮＡの３’ヌクレオチドおよびテーリング核酸の５’ヌクレオチドの間の共有結合を形成して、修飾された非コードＲＮＡを産生する、請求項６０～１０５のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡを産生する方法。
  164. 修飾された非コードＲＮＡが、非コードＲＮＡ配列の３’にあるポリＡ領域を含む、請求項１６３に記載の方法。
  165. さらに、リボザイムの存在下において修飾された非コードＲＮＡを環状化することを含み、ここで、修飾された非コードＲＮＡは３’イントロンおよび５’イントロンを含み、ここで、３’イントロンは非コードＲＮＡ配列の５’にあり、ここで、５’イントロンはポリＡ領域の３’にあり、それによって、リボザイムは、３’イントロンの３’にあるヌクレオチドおよび５’イントロンの５’にあるヌクレオチドの間の共有結合を形成して、５’イントロンまたは３’イントロンを含まない環状の非コードＲＮＡを産生し、ここで、ポリＡ領域は非コードＲＮＡの３’および５’ヌクレオチドの間にある、請求項１６４に記載の方法。
  166. さらに、以下のステップを含む、請求項１６４に記載の方法：
    （ｉ）修飾された非コードＲＮＡの第１のヌクレオチドに５’末端リン酸基を導入すること；
    （ｉｉ）修飾された非コードＲＮＡの１つ以上の３’末端ヌクレオチドを切断して、３’末端ヒドロキシル基を有する修飾された非コードＲＮＡを産生すること；および
    （ｉｉｉ）環状化リガーゼの存在下において、ステップ（ｉｉ）で産生された修飾された非コードＲＮＡを環状化すること；
    それによって、環状化リガーゼは修飾された非コードＲＮＡの３’ヌクレオチドおよび修飾された非コードＲＮＡの５’ヌクレオチドの間の共有結合を形成して、環状の修飾された非コードＲＮＡを産生し、ここで、ポリＡ領域は非コードＲＮＡの３’および５’ヌクレオチドの間にある。
  167. テーリング核酸がさらに構造配列の１コピー以上を含む、請求項１６３～１６６のいずれか１項に記載の方法。
  168. 修飾された非コードＲＮＡがポリＡ領域を含み、非コードＲＮＡ配列および構造配列の１コピー以上の間にある、請求項１６７に記載の方法。
  169. さらに、リボザイムの存在下において修飾された非コードＲＮＡを環状化することを含み、ここで、修飾された非コードＲＮＡは３’イントロンおよび５’イントロンを含み、ここで、３’イントロンは非コードＲＮＡ配列の５’にあり、ここで、５’イントロンは構造配列の１コピー以上の３’にあり、それによって、リボザイムは、３’イントロンの３’にあるヌクレオチドおよび５’イントロンの５’にあるヌクレオチドの間の共有結合を形成して、５’イントロンまたは３’イントロンを含まない環状の非コードＲＮＡを産生し、ここで、構造配列の１コピー以上は環状の非コードＲＮＡのポリＡ領域および非コードＲＮＡ配列の間にある、請求項１６８に記載の方法。
  170. さらに、以下のステップを含む、請求項１６８に記載の方法：
    （ｉ）修飾された非コードＲＮＡの第１のヌクレオチドに５’末端リン酸基を導入すること；
    （ｉｉ）修飾された非コードＲＮＡの１つ以上の３’末端ヌクレオチドを切断して、３’末端ヒドロキシル基を有する修飾された非コードＲＮＡを産生すること；および
    （ｉｉｉ）環状化リガーゼの存在下において、ステップ（ｉｉ）で産生された修飾された非コードＲＮＡを環状化すること；
    それによって、環状化リガーゼは、修飾された非コードＲＮＡの３’ヌクレオチドおよび修飾された非コードＲＮＡの５’ヌクレオチドの間の共有結合を形成して、環状の修飾された非コードＲＮＡを産生し、ここで、構造配列の１コピー以上はポリＡ領域および非コードＲＮＡ配列の間にある。
  171. 修飾された非コードＲＮＡが骨格核酸の存在下において環状化され、ここで、骨格核酸は、修飾された非コードＲＮＡとハイブリダイゼーションすることができる核酸であり、ここで、修飾された非コードＲＮＡは、骨格核酸に結合したときに環状の二次構造を形成する、請求項１６６または１７０に記載の方法。
  172. 骨格核酸が以下を含む、請求項１７１に記載の方法：
    （ａ）５ヌクレオチド以上を含む第１のハイブリダイゼーション配列であって、ここで、第１のハイブリダイゼーション配列は、修飾された非コードＲＮＡの少なくとも最初の五（５）ヌクレオチドに対して相補的である；および
    （ｂ）５ヌクレオチド以上を含む第２のハイブリダイゼーション配列であって、ここで、第２のハイブリダイゼーション配列は、修飾された非コードＲＮＡの少なくとも最後の五（５）ヌクレオチドに対して相補的である；
    ここで、修飾された非コードＲＮＡの少なくとも最初の五（５）ヌクレオチドは第１のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイゼーションし、修飾された非コードＲＮＡの少なくとも最後の五（５）ヌクレオチドは第２のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイゼーションする。
  173. 第１のハイブリダイゼーション配列の最後のヌクレオチドおよび第２のハイブリダイゼーション配列の最初のヌクレオチドが骨格核酸上で隣接し、いずれかの他のヌクレオチドによって離間されない、請求項１７１または１７２に記載の方法。
  174. 修飾された非コードＲＮＡが以下を含む、請求項１６６または１７０に記載の方法：
    （ｉ）オープンリーディングフレームの５’にある第１のセルフハイブリダイゼーション配列；
    （ｉｉ）オープンリーディングフレームの３’にある第２のセルフハイブリダイゼーション配列；
    （ｉｉｉ）第１のセルフハイブリダイゼーション配列の５’にある第１の非ハイブリダイゼーション配列；および
    （ｉｖ）第２のセルフハイブリダイゼーション配列の３’にある第２の非ハイブリダイゼーション配列、
    ここで、第１および第２のセルフハイブリダイゼーション配列は互いとハイブリダイゼーションすることができ、
    ここで、第１および第２のセルフハイブリダイゼーション配列は互いとハイブリダイゼーションすることができない。
  175. 第１および第２のセルフハイブリダイゼーション配列のハイブリダイゼーションが二次構造を形成し、これにおいて、修飾された非コードＲＮＡの５’末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドは１００Å未満の距離だけ離間される、請求項１７４に記載の方法。
  176. ５’末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドが９０Å未満、８０Å未満、７０Å未満、６０Å未満、５０Å未満、４０Å未満、３０Å未満、２０Å未満、または１０Å未満の距離だけ離間される、請求項１７５に記載の方法。
  177. 環状化リガーゼがＴ４ＲＮＡリガーゼである、請求項１６６または１７０～１７６のいずれか１項に記載の方法。
  178. 構造配列がＧ四重鎖配列である、請求項１６８～１７７のいずれか１項に記載の方法。
  179. Ｇ四重鎖がＲＮＡのＧ四重鎖配列である、請求項１７８に記載の方法。
  180. ＲＮＡのＧ四重鎖配列が配列番号２の核酸配列を含む、請求項１７９に記載の方法。
  181. テーリング核酸が配列番号２の核酸配列の少なくとも３コピーを含む、請求項１８０に記載の方法。
  182. Ｇ四重鎖がＤＮＡのＧ四重鎖配列である、請求項１７８に記載の方法。
  183. ＤＮＡのＧ四重鎖配列が配列番号３の核酸配列を含む、請求項１８２に記載の方法。
  184. テーリング核酸が配列番号３の核酸配列の少なくとも３コピーを含む、請求項１８３に記載の方法。
  185. 構造配列がテロメアリピート配列である、請求項１６８～１７７のいずれか１項に記載の方法。
  186. テロメアリピート配列が配列番号４の核酸配列を含む、請求項１８５に記載の方法。
  187. テーリング核酸が配列番号４の核酸配列の少なくとも３コピーを含む、請求項１８６に記載の方法。
  188. 構造配列が、相互作用してアプタマーを形成することができる少なくとも２つのヌクレオチドを含むアプタマー配列であり、ここで、アプタマーは、標的分子に結合することができる二次構造である、請求項１６８～１７７のいずれか１項に記載の方法。
  189. ＲＮＡの５’ヌクレオチドが５’末端リン酸基を含まず；
    ここで、ＲＮＡの３’ヌクレオチドは３’末端ヒドロキシル基を含み；
    ここで、テーリング核酸の５’ヌクレオチドは５’末端リン酸基を含み；
    ここで、テーリング核酸の３’ヌクレオチドは３’末端ヒドロキシル基を含まない、
    請求項１６３～１８８のいずれか１項に記載の方法。
  190. ＲＮＡの５’ヌクレオチドが５’末端ヒドロキシル基を含まず；
    ここで、ＲＮＡの３’ヌクレオチドは３’末端リン酸基を含み；
    ここで、テーリング核酸の５’ヌクレオチドは５’末端ヒドロキシル基を含み；
    ここで、テーリング核酸の３’ヌクレオチドは３’末端リン酸基を含まず；
    ここで、ＲＮＡリガーゼはＲｔｃＢリガーゼである、
    請求項１６３～１８８のいずれか１項に記載の方法。
  191. テーリング核酸のヌクレオチドの少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１６％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％が修飾されたヌクレオチドである、請求項１６３～１９０のいずれか１項に記載の方法。
  192. テーリング核酸の最後の２５ヌクレオチドの少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５個が修飾されたヌクレオチドである、請求項１６３～１９１のいずれか１項に記載の方法。
  193. 少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドが、修飾された核酸塩基を含む、請求項１６３～１９２のいずれか１項に記載の方法。
  194. 修飾された核酸塩基が以下からなる群から選択される、請求項１９３に記載の方法：キサンチン、アリアミノウラシル、アリアミノチミジン、ヒポキサンチン、ジゴキシゲニン化アデニン、ジゴキシゲニン化シトシン、ジゴキシゲニン化グアニン、ジゴキシゲニン化ウラシル、６－クロロプリンリボシド、Ｎ６－メチルアデニン、メチルシュードウラシル、２－チオシトシン、２－チオウラシル、５－メチルウラシル、４－チオチミジン、４－チオウラシル、５，６－ジヒドロ－５－メチルウラシル、５，６－ジヒドロウラシル、５－［（３－インドリル）プロピオンアミド－Ｎ－アリル］ウラシル、５－アミノアリルシトシン、５－アミノアリルウラシル、５－ブロモウラシル、５－ブロモシトシン、５－カルボキシシトシン、５－カルボキシメチルエステルウラシル、５－カルボキシウラシル、５－フルオロウラシル、５－ホルミルシトシン、５－ホルミルウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ヒドロキシウラシル、５－ヨードシトシン、５－ヨードウラシル、５－メトキシシトシン、５－メトキシウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－プロパルギルアミノシトシン、５－プロパルギルアミノウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、６－アザシトシン、６－アザウラシル、６－クロロプリン、６－チオグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノアデニン、７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、８－アザアデニン、８－アジドアデニン、８－クロロアデニン、８－オキソアデニン、８－オキソグアニン、アラアデニン、アラシトシン、アラグアニン、アラウラシル、ビオチン－１６－７－デアザ－７－プロパルギルアミノグアニン、ビオチン－１６－アミノアリルシトシン、ビオチン－１６－アミノアリルウラシル、シアニン３－５－プロパルギルアミノシトシン、シアニン３－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン３－アミノアリルシトシン、シアニン３－アミノアリルウラシル、シアニン５－６－プロパルギルアミノシトシン、シアニン５－６－プロパルギルアミノウラシル、シアニン５－アミノアリルシトシン、シアニン５－アミノアリルウラシル、シアニン７－アミノアリルウラシル、ダブシル－５－３－アミノアリルウラシル、デスチオビオチン－１６－アミノアリル－ウラシル、デスチオビオチン－６－アミノアリルシトシン、イソグアニン、Ｎ１－エチルシュードウラシル、Ｎ１－メトキシメチルシュードウラシル、Ｎ１－メチルアデニン、Ｎ１－メチルシュードウラシル、Ｎ１－プロピルシュードウラシル、Ｎ２－メチルグアニン、Ｎ４－ビオチン－ＯＢＥＡ－シトシン、Ｎ４－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｏ６－メチルグアニン、シュードイソシトシン、シュードウラシル、チエノシトシン、チエノグアニン、チエノウラシル、キサントシン、３－デアザアデニン、２，６－ジアミノアデニン、２，６－ジアミノ（damino）グアニン、５－カルボキサミド－ウラシル、５－エチニルウラシル、Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｉ６Ａ）、２－メチル－チオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン（ｍ６２Ａ）、およびＮ６－アセチルアデニン（ａｃ６Ａ）。
  195. 少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドが修飾された糖を含む、請求項１６３～１９４のいずれか１項に記載の方法。
  196. 修飾された糖が以下からなる群から選択される、請求項１９５に記載の方法：２’－チオリボース、２’，３’－ジデオキシリボース、２’－アミノ－２’－デオキシリボース、２’デオキシリボース、２’－アジド－２’－デオキシリボース、２’－フルオロ－２’－デオキシリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、２’－Ｏ－メチルデオキシリボース、３’－アミノ－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－アジド－２’，３’－ジデオキシリボース、３’－デオキシリボース、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－２’－デオキシリボース、３’－Ｏ－メチルリボース、５’－アミノリボース、５’－チオリボース、５－ニトロ－１－インドリル－２’－デオキシリボース、５’－ビオチン－リボース、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン連結、２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノ連結リボース、および２’－Ｏ，４’－Ｃ－チオ連結リボース。
  197. 少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドが２’修飾を含む、請求項１６３～１９６のいずれか１項に記載の方法。
  198. ２’修飾が以下からなる群から選択される、請求項１９７に記載の方法：ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、および２’－Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）。
  199. 少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドが修飾されたリン酸を含む、請求項１６３～１９８のいずれか１項に記載の方法。
  200. 修飾されたリン酸が以下からなる群から選択される、請求項１９９に記載の方法：ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホロジチオエート、チオリン酸、５’－Ｏ－メチルホスホネート、３’－Ｏ－メチルホスホネート、５’－ヒドロキシホスホネート、ヒドロキシホスファネート、ホスホロセレノアート、セレノホスフェート、ホスホロアミダート、カルボホスホネート、メチルホスホネート、フェニルホスホネート、エチルホスホネート、Ｈ－ホスホネート、グアニジニウム環、トリアゾール環、ボラノホスフェート（ＢＰ）、メチルホスホネート、およびグアニジノプロピルホスホロアミダート。
  201. テーリング核酸が少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６つのホスホロチオエートを含む、請求項１６３～２００のいずれか１項に記載の方法。
  202. テーリング核酸が少なくとも６つのホスホロチオエートを含む、請求項２０１に記載の方法。
  203. テーリング核酸が少なくとも３つのグアニンヌクレオチドおよび少なくとも３つのホスホロチオエートを含む、請求項１６３～２０１のいずれか１項に記載の方法。
  204. テーリング核酸が２’修飾を含む少なくとも６ヌクレオチドを含む、請求項１６３～２０３のいずれか１項に記載の方法。
  205. テーリング核酸が少なくとも３つのデオキシリボース糖を含む、請求項１６３～２０４のいずれか１項に記載の方法。
  206. テーリング核酸が少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２３個のデオキシリボース糖を含む、請求項２０５に記載の方法。
  207. テーリング核酸が少なくとも２３個のデオキシリボース糖を含む、請求項２０６に記載の方法。
  208. テーリング核酸の３’末端ヌクレオチドがジデオキシアデノシン、ジデオキシシチジン、ジデオキシグアノシン、ジデオキシチミジン、ジデオキシウリジン、または反転デオキシチミジンを含む、請求項１６３～１６８または１７８～２０７のいずれか１項に記載の方法。
  209. テーリング核酸が第１の修飾されたヌクレオチドおよび第２の修飾されたヌクレオチドを含み、ここで、第１および第２の修飾されたヌクレオチドは異なる構造を含む、請求項１６３～２０８のいずれか１項に記載の方法。
  210. 修飾された非コードＲＮＡのポリＡ領域の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％がアデノシンヌクレオチドである、請求項１６３～２０９のいずれか１項に記載の方法。
  211. 修飾された非コードＲＮＡのポリＡ領域が少なくとも２５～５００ヌクレオチドを含む、請求項１６３～２１０のいずれか１項に記載の方法。
  212. 修飾された非コードＲＮＡのポリＡ領域が少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、または少なくとも２００ヌクレオチドを含む、請求項２１１に記載の方法。
  213. ＲＮＡリガーゼがＴ４ＲＮＡリガーゼである、請求項１６３～２１２のいずれか１項に記載の方法。
  214. 請求項１０６～１６２のいずれか１項に記載の方法によって産生される修飾されたｍＲＮＡ。
  215. ｍＲＮＡが抗原または治療薬蛋白質をコードする、請求項１～５９または２１４のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  216. 抗原がウイルス抗原、細菌抗原、原生動物抗原、または真菌抗原である、請求項２１５に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  217. 治療薬蛋白質が酵素、転写因子、細胞表面受容体、成長因子、または凝固因子である、請求項２１５に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  218. オープンリーディングフレームが細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項１～５９または２１５～２１７のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  219. 修飾されたｍＲＮＡが哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項２１８に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  220. 修飾されたｍＲＮＡがヒト細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項２１９に記載の修飾されたｍＲＮＡ。
  221. 請求項１６３～２１３のいずれか１項に記載の方法によって産生される、修飾された非コードＲＮＡ。
  222. 修飾された非コードＲＮＡがガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）、または長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である、請求項６０～１０５または２２１のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ。
  223. 請求項１～５９もしくは２１４～２２０のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡまたは請求項６０～１０５、２２１、もしくは２２２のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡを含む、脂質ナノ粒子。
  224. 請求項１～５９もしくは２１４～２２０のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡまたは請求項６０～１０５、２２１、もしくは２２２のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡを含む、細胞。
  225. 細胞が哺乳動物細胞である、請求項２２４に記載の細胞。
  226. 細胞がヒト細胞である、請求項２２５に記載の細胞。
  227. 請求項１～５９もしくは２１４～２２０のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ、請求項６０～１０５、２２１、もしくは２２２のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ、請求項２２３に記載の脂質ナノ粒子、または請求項２２４～２２６のいずれか１項に記載の細胞を含む、組成物。
  228. 請求項２２７に記載の組成物と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
  229. 請求項１～５９もしくは２１４～２２０のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ、請求項６０～１０５、２２１、もしくは２２２のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ、または請求項２２３に記載の脂質ナノ粒子を細胞に導入することを含む、方法。
  230. 請求項１～５９もしくは２１４～２２０のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ、請求項６０～１０５、２２１、もしくは２２２のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ、請求項２２３に記載の脂質ナノ粒子、請求項２２４～２２６のいずれか１項に記載の細胞、または請求項２２７もしくは２２８に記載の組成物を対象に導入することを含む、方法。
  231. 請求項１～５９もしくは２１４～２２０のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ、請求項２２３に記載の脂質ナノ粒子、請求項２２４～２２６のいずれか１項に記載の細胞、または請求項２２７もしくは２２８に記載の組成物を対象に導入することを含み、ここで、修飾されたｍＲＮＡのオープンリーディングフレームは抗原をコードする、対象にワクチン接種する方法。
  232. 請求項１～５９もしくは２１４～２２０のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ、請求項２２３に記載の脂質ナノ粒子、請求項２２４～２２６のいずれか１項に記載の細胞、または請求項２２７もしくは２２８に記載の組成物を対象に導入することを含み、ここで、修飾されたｍＲＮＡのオープンリーディングフレームは酵素をコードする、対象において酵素を補充する方法。
  233. 請求項６０～１０５、２２１、もしくは２２２のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ、請求項２２３に記載の脂質ナノ粒子、または請求項２２７もしくは２２８に記載の組成物を対象に導入することを含む、対象のゲノムを改変する方法。
  234. 対象が哺乳動物である、請求項２３０～２３３のいずれか１項に記載の方法。
  235. 対象がヒトである、請求項２３４に記載の方法。
  236. 医薬としての使用のための、請求項１～５９もしくは２１４～２２０のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡ、請求項６０～１０５、２２１、もしくは２２２のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡ、請求項２２３に記載の脂質ナノ粒子、請求項２２４～２２６のいずれか１項に記載の細胞、または請求項２２７もしくは２２８に記載の組成物。
  237. 請求項１０６～２１３のいずれか１項に記載のＲＮＡおよびテーリング核酸を含むキット。
  238. さらにＲＮＡリガーゼを含む、請求項２３７に記載のキット。
  239. 請求項２２８に記載の医薬組成物と送達デバイスとを含むキット。
  240. 以下を含む、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを精製するための方法：
    請求項１～５９のいずれか１項に記載の修飾されたｍＲＮＡまたは請求項６０～１０５のいずれか１項に記載の修飾された非コードＲＮＡを含む混合物を、精製媒体と接触させ、ここで、修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡは精製媒体と相互作用して、修飾されたＲＮＡ－精製媒体コンジュゲートを形成すること；
    修飾されたＲＮＡ－精製媒体コンジュゲートを混合物から分離すること；および
    修飾されたｍＲＮＡまたは修飾された非コードＲＮＡを、修飾されたＲＮＡ－精製媒体コンジュゲートから、溶媒によって溶出すること。
  241. 精製媒体が常磁性ビーズを含む、請求項２４０に記載の方法。
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