CN116836974A - 一种体外合成加帽mRNA的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种体外合成加帽mRNA的方法。具体地，涉及一种酶法加帽反应缓冲液及其应用。本发明的反应缓冲体系中，对于未经纯化的上游产物可以有效进行加帽，得到高加帽率的加帽mRNA。本发明的加帽缓冲体系极大地提高生产效率，降低生产成本，可用于实验室和工业化的mRNA原液的生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种mRNA酶法合成的加帽缓冲体系。
背景技术
mRNA疫苗行业迅速发展。目前mRNA生产企业的生产工艺线主要利用酶法加帽进行mRNA生产，即使用RNA加帽酶将合成的RNA(例如，体外转录（IVT）的RNA)转变为加帽的RNA。
酶法加帽的加帽率高，但酶法合成过程中加帽酶受离子浓度的影响比较大，因此对反应底物的纯度要求较高。通常需要在RNA体外转录后去除蛋白和盐分后，在常规加帽缓冲体系中进行加帽反应。生产工艺中，酶法加帽的上游产物纯化环节是一大痛点，其步骤繁琐，通常会造成部分模板的损耗，增加工艺流程和成本。
体外转录的产物不经纯化直接进行加帽反应的难点在于：上游反应中的杂质会带来影响；此外加帽反应所使用的酶需要在缓冲反应体系内保持较高的生物学活性。因此，对反应体系的成分比例要求较高。
综上所述，本领域需要开发一种缓冲体系来提高mRNA酶对杂质的容忍度，进而降低上游反应中的杂质对酶法加帽反应的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种mRNA酶法合成的加帽缓冲体系。
在本发明的第一方面，提供了一种用于体外合成加帽mRNA的加帽缓冲液，所述加帽缓冲液包含选自下组的组分：
20-80 mM 螯合剂，
0.2-1.0 M Tris-HCl，
20-100 mM KCl，
5-50 mM MgCl2，和
5-50 mM DTT，所述浓度为加帽缓冲液中的浓度。
在另一优选例中， 包含选自下组的组分：
25-60 mM 螯合剂；
0.3-0.8 M Tris-HCl，
40-60 mM KCl，
10-20 mM MgCl2，和
10-20 mM DTT。
在另一优选例中，所述加帽缓冲液的pH为7.2-8.7；较佳地为8.0±0.5。
在另一优选例中， 所述螯合剂选自下组：EDTA（乙二胺四乙酸）、NTA(氨基三乙酸)、DTPA（二亚乙基三胺五乙酸）、CDTA(1.2-环己二胺四乙酸)、EDDHA（乙二胺二邻苯基乙酸）和HEEDTA（氨乙基乙醇胺三乙酸）以及酒石酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠。
在本发明的第二方面，提供了一种用于体外合成加帽mRNA的加帽缓冲体系，包含本发明第一方面所述的加帽缓冲液。
在另一优选例中， 所述加帽缓冲体系还包括如下浓度的组分：
牛痘病毒加帽酶，终浓度为1.0-2.0 U/ul；较佳地1.2-1.6 U/ul；
Cap2’-O甲基转移酶，终浓度为10.0-20.0 U/ul；较佳地12.0-16.0 U/ul。
在另一优选例中， 所述加帽缓冲体系还包括如下浓度的组分：
0.5-3.0 mM SAM；较佳地 1.5-2.0 mM SAM；
0.5-3.0 mM GTP；较佳地1.0-2.0 mM GTP。
在另一优选例中， 所述加帽缓冲体系还包括如下浓度的组分：
0.5 mg/ml-10 mg/ml mRNA；较佳地1 mg/ml-5 mg/ml mRNA。
在另一优选例中，所述加帽缓冲体系还包括如下浓度的组分：
RNA酶抑制剂，终浓度为1.0-2.0 U/ul。
在另一优选例中，所述加帽缓冲体系中，螯合剂的终浓度为2.0-8.0 mM；较佳地2.5-6.0 mM。
在另一优选例中，所述加帽缓冲体系包含选自下组的组分：
（1）加帽缓冲液，包括Tris-HCl、K离子、Mg离子、DTT、和螯合剂；
（2）牛痘病毒加帽酶，终浓度为1.2-1.6 U/ul；
（3）mRNA Cap2’-O甲基转移酶，终浓度为12.0-16.0 U/ul；
（4）SAM，终浓度为1.5-2.0 mM；和
（5）GTP，终浓度为1.0-2.0 mM；
其中，加帽缓冲体系中，
螯合剂的终浓度为2.5-6.0 mM；
Tris-HCl的终浓度为0.03-0.08 M；
KCl的终浓度为4.0-6.0 mM；
MgCl2的终浓度为1.0-2.0 mM，和
DTT的终浓度为1.0-2.0 mM。
在另一优选例中，所述螯合剂选自下组：EDTA（乙二胺四乙酸）、NTA(氨基三乙酸)、DTPA（二亚乙基三胺五乙酸）、CDTA(1.2-环己二胺四乙酸)、EDDHA（乙二胺二邻苯基乙酸）和HEEDTA（氨乙基乙醇胺三乙酸）以及酒石酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠。
在本发明的第三方面，提供了一种体外合成加帽mRNA的方法，包括步骤：
(S1) 提供一体外转录的mRNA产物；所述mRNA产物是体外转录获得的mRNA反应混合液；和
(S2) 将上述的体外转录的mRNA产物与加帽缓冲液按照1：1~3：1的体积比混合，形成加帽缓冲体系，进行mRNA体外加帽反应，从而获得加帽产物；
所述(S1)和(S2)之间不包括纯化步骤；
所述加帽产物的产率≥90%；
其中，所述加帽缓冲体系包含以下浓度的组分：
2.5-6.0 mM 螯合剂；
0.03-0.08 M Tris-HCl；
4.0-6.0 mM KCl；
1.0-2.0 mM MgCl2，
1.0-2.0 mM DTT，
1.0-2.0 U/ul 牛痘病毒加帽酶；
10.0-20.0 U/ul Cap 2’-O甲基转移酶；
0.5-3.0 mM SAM；
0.5-3.0 mM GTP。
在另一优选例中，将所述(S1)中的体外转录的mRNA反应混合液直接用于步骤(S2)。
在另一优选例中， 所述混合的温度为36-45℃，反应时间为0.5-5小时（较佳地1-4小时）。
在另一优选例中， 所述目标mRNA的长度为500bp-3000bp；较佳地为700 bp-2500bp。
在另一优选例中，所述(S1)不经过纯化，直接进行步骤(S2)。
在另一优选例中，所述(S1)中，体外转录的mRNA的终浓度为6 mg/ml-10 mg/ml。
在另一优选例中，所述(S2)中，所述加帽产物的产率≥90%；较佳地≥95%；更佳地≥98%。
在另一优选例中， 将上述的体外转录的mRNA产物与加帽缓冲液按照1.2：1~2.5：1的体积比混合。
在另一优选例中，所述加帽缓冲体系包括如下浓度的组分：
1.2-1.6 U/ul 牛痘病毒加帽酶；
12.0-16.0 U/ul Cap2’-O甲基转移酶。
在另一优选例中，所述加帽缓冲体系包括如下浓度的组分：
1.5-2.0 mM SAM；
1.0-2.0 mM GTP。
在另一优选例中，所述加帽缓冲体系包括如下浓度的组分：0.5 mg/ml-10 mg/mlmRNA。
在另一优选例中，所述浓度为加帽缓冲体系中，mRNA体外加帽反应前的各组分浓度。
在本发明的第四方面，提供了一种体外合成加帽mRNA的试剂盒，包括如本发明第一方面所述的加帽缓冲液或如本发明第二方面所述的加帽缓冲体系。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括说明书，其中记载了体外合成加帽mRNA的方法。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了利用本发明和现有技术的缓冲体系，IVT后不经过纯化直接进行加帽反应的加帽效果的对比。
图2显示了不同品牌的加帽缓冲体系的一步法加帽效果。
图3显示了不同模板在本发明缓冲体系中的通用性。
图4-图7显示了不同模板在本发明缓冲体系中的加帽效率检测的质谱结果。
图8显示了EDTA可替代物在缓冲体系中的效果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外发现，本发明的加帽缓冲体系对于蛋白和盐离子具有高容忍性。对于转录产物，可以不经纯化，直接在本发明含有螯合剂（例如EDTA）的加帽缓冲体系进行加帽反应，能获得高加帽效率(≥95%)的加帽mRNA。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明中，用T7高产率RNA合成试剂盒通过从线性质粒DNA模板进行体外转录来合成未经修饰的线性mRNA。体外转录后，将反应用DNA酶I处理15分钟，消化线性质粒。将反应产物加热至65℃持续5分钟，然后立即置于冰上快速冷却5分钟，直接加入加帽反应液中，混匀后在37℃孵育1小时。
用磁珠或纯化柱的方法去除过程中的盐分和蛋白，得到高纯度的带有帽子结构的mRNA。利用RNA酶H将mRNA的5’端UTR序列切割，链霉亲和素磁珠富集5’端加帽序列，使用Agilent Q-TOF 6545 液相质谱联用分析仪进行加帽效率检测和计算。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
本发明的加帽缓冲体系
目前，酶法加帽的mRNA生产工艺为质粒DNA转录后会进行纯化去除蛋白和盐离子，再进行酶法加帽。为了减少工艺的繁琐性，希望能够省略转录后纯化步骤，尝试用不同品牌的加帽体系在转录后直接进行酶法加帽，但加帽率结果差强人意。
本发明中，发明人在某次实验过程中，误将EDTA添加到反应缓冲液中，用该缓冲液对未纯化处理的转录产物进行加帽，意外发现在含有EDTA的反应体系中，加帽效率竟达到了95%以上。为了排除偶然因素，重复验证两次，两次的加帽率均与第一次一致。进一步优化实验条件，发现EDTA在反应体系中优选的终浓度范围为2.5-6 mM。
如本文所用，本发明的目标DNA(或模板DNA)选自质粒DNA、分离的目的DNA片段或化学合成的DNA片段。
如本文所用，“体外转录(IVT)”主要是以线性DNA为模板制备mRNA，其中双链DNA(dsDNA)模板被DNA引导的RNA聚合酶(通常是噬菌体聚合酶)复制以产生包含从模板复制的RNA分子的产物。
如本文所用，“目标RNA”是指感兴趣的多核糖核苷酸。多核糖核苷酸可以是或者包含治疗性RNA或其前体(例如，加帽的治疗性RNA的未加帽前体)。目标RNA可由细胞转录或体外转录产生。目标RNA可存在于混合物，例如，体外转录反应混合物、细胞、或细胞裂解物中。目标RNA可以是未加帽的。
一种本领域中常规的IVT反应体系如下：
Mg2+ 30-40 mM
Tris HCl(PH=8) 40 mM
亚精胺(Spermidine) 1-20 mM
DTT 1-10 mM
底物 1 μg
NTPs (ATP CTP UTP GTP) 6-10 mM
RNA聚合酶 0.5-1 μL
条件 37℃，3-4 h。
其中，在IVT中引入的Mg2+浓度高于后续加帽反应所需求浓度(例如现有技术的常规两步法加帽体系中，Mg2+终浓度为1 mM)，不利于常规加帽反应的进行。
因此，常规两步法加帽反应需要在转录后，通过纯化除去反应中的金属离子(例如镁离子、钠离子、钾离子)和其他副产物。
本发明中，利用本发明特定的加帽缓冲液，IVT产物不经过纯化可以直接在本发明的加帽缓冲体系进行加帽反应，相比较需要纯化的常规加帽反应，不仅减少工艺的繁琐性，降低了损耗，还能获得高加帽效率(≥95%)的加帽mRNA。
如本文所用，“本发明的加帽缓冲体系”、“用于体外合成加帽mRNA的加帽缓冲体系”可以互换使用。
在另一优选例中，所述加帽缓冲体系包含选自下组的组分：
（1）加帽缓冲液，包括Tris-HCl、KCl、MgCl2、DTT、和螯合剂；
（2）牛痘病毒加帽酶，终浓度为1.2-1.6 U/ul；
（3）mRNA Cap2’-O甲基转移酶，终浓度为12.0-16.0 U/ul；
（4）SAM，终浓度为1.5-2.0 mM；和
（5）GTP，终浓度为1.0-2.0 mM。
其中，加帽缓冲体系中，
螯合剂的终浓度为2.5-6.0 mM；
Tris-HCl的终浓度为0.03-0.08 M；
KCl的终浓度为4.0-6.0 mM；
MgCl2的终浓度为1.0-2.0 mM，和
DTT的终浓度为1.0-2.0 mM。
在另一优选例中，所述螯合剂选自下组：EDTA（乙二胺四乙酸）、NTA(氨基三乙酸)、DTPA（二亚乙基三胺五乙酸）、CDTA(1.2-环己二胺四乙酸)、EDDHA（乙二胺二邻苯基乙酸）和HEEDTA（氨乙基乙醇胺三乙酸）以及酒石酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠。
本发明的主要优点包括
（1）本发明的酶法加帽反应缓冲液对于蛋白和盐离子具有高容忍性。本发明的反应缓冲体系中，对未经纯化的目标DNA体外转录反应产物可以有效的加帽，加帽效率达到了95%以上。
（2）本发明的加帽缓冲体系适用于长度不同的模板RNA。
（3）本发明的mRNA酶法合成的加帽缓冲体系，可用于体外转录后mRNA产物的直接加帽反应，省略了纯化去杂的过程，避免了纯化带来的RNase降解风险，减少了工艺过程，更加适合工业化的大规模生产。本发明的加帽缓冲体系可应用于实验室和工业化的mRNA原液的生产，进而提高生产效率，降低生产成本。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：本发明的加帽缓冲液适用于不同的反应体系
酶活和帽子供体是影响加帽反应的直接因素。其中，较高的酶活可以提高反应速率，而过饱和的甲基供体S-腺苷-甲硫氨酸可以保证加帽反应的甲基化程度。
按表1中的体系配制反应液。设置酶量和甲基供体的增量作为对照。将转录产物不经纯化，直接投入配制好的加帽缓冲体系中，37℃孵育1小时，进行加帽反应。
用LiCl沉淀液(7.5M LiCl，50mM EDTA pH 8.0)纯化得到加帽的mRNA。用RNaseH(E124, Novoprotein)进行探针酶切，链霉亲和素磁珠富集5'端加帽序，利用LC-MS检测加帽效率。其中，
Cap1的加帽效率(%)= Cap1的峰面积/总峰面积；
Cap0+ Cap1的加帽效率(%)= (Cap0+ Cap1)的峰面积/总峰面积。
体外转录(IVT)中，mRNA的终浓度依赖于转录反应的产率，一般为6 mg/ml-10 mg/ml（本实施例为6 mg/ml）。
现有技术中，10x加帽缓冲液的组分包括：0.5 M Tris-HCl，50 mM KCl，10 mMMgCl2，10 mM DTT；pH 8.0；
本发明中，10x加帽缓冲液的组分包括：0.5 M Tris-HCl，50 mM KCl，10 mMMgCl2，10 mM DTT，40mM EDTA；pH 8.0。
表1
比较不经纯化的转录产物（未去除蛋白、盐分的转录RNA），在常规缓冲体系和本发明缓冲体系中的加帽反应结果（图1）。
常规缓冲体系中，加帽反应产生大量的副产物二磷酸核酸，产物加帽率低于90%（Cap1%：87.46%）；提高酶量、提高甲基供体的浓度，依然未得到改善。
本发明缓冲体系在两种反应条件下，均表现出优异的加帽效率（Cap1%：96.8%）。
实施例2：不同的加帽缓冲体系下的加帽效果
加帽反应的缓冲体系是影响加帽效率的重要因素。本实施例中，利用不同品牌的缓冲体系进行加帽反应。对体外转录后获得的RNA产物，不经纯化，直接在加帽体系中进行一步法加帽反应。实验方法同实施例1。
结果如图2所示。利用不同品牌的缓冲体系，加帽产物中存在大量的副产物二磷酸核酸（≤10%），加帽效率均低于90%。
实施例3：本发明缓冲体系对不同模板的通用性
不同模板的序列设计决定其转录RNA的二级结构的差异性，从而影响加帽反应的难易程度。为了验证本发明缓冲体系针对不同模板的通用性，使用不同长度的模板进行实验。
使用本发明的缓冲体系，分别设计700bp、1200bp、1800bp、2200bp的模板，利用实施例1中的方法，转录后不经纯化，直接进行加帽反应。
结果如图3、图4-图7所示。在本发明的缓冲体系中，不同模板的加帽效率均可达到95%以上。
实施例4：缓冲体系中EDTA的可替代物
本发明的缓冲体系中，添加EDTA（乙二胺四乙酸）提高了未经纯化RNA的加帽效率。此外，还寻找了一些EDTA的可替代物，其中包括NTA(氨基三乙酸)、DTPA（二亚乙基三胺五乙酸）、CDTA(1.2-环己二胺四乙酸)、EDDHA（乙二胺二邻苯基乙酸）和HEEDTA（氨乙基乙醇胺三乙酸）以及酒石酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠。
将反应体系中的EDTA分别替换为上述物质，按照与之相同的浓度，加入加帽缓冲体系中。
结果如图8所示。本发明的缓冲体系中，使用NTA、DTPA、CDTA、EDDHA和HEEDT以及酒石酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠，加帽效率都达到了90%以上。因此，上述物质均可以替代EDTA作为本发明的缓冲体系的添加剂。
实施例5：ETDA等物质在反应体系的添加方式
在最初的方案中，发明人意外地将EDTA加入加帽的反应缓冲液中，得到了本发明的加帽缓冲液。
此外，将EDTA加入到酶的保存体系中，或在配制反应液时作为独立的组分加入，将EDTA的终浓范围均控制在2.5-6 mM 内，进行实验。
结果显示，EDTA以不同的方式加入加帽反应中，均可以提高不经纯化的转录RNA（未去除蛋白、盐分的转录RNA）的加帽效率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种体外合成加帽mRNA的方法，其特征在于，包括步骤：
(S1) 提供一体外转录的mRNA产物；所述mRNA产物是体外转录获得的mRNA反应混合液；和
(S2) 将上述的体外转录的mRNA产物与加帽缓冲液按照1：1~3：1的体积比混合，形成加帽缓冲体系，进行mRNA体外加帽反应，从而获得加帽产物；
所述(S1)和(S2)之间不包括纯化步骤；
所述加帽产物的产率≥90%；
其中，所述加帽缓冲体系包含以下浓度的组分：
2.5-6.0 mM 螯合剂；
0.03-0.08 M Tris-HCl；
4.0-6.0 mM KCl；
1.0-2.0 mM MgCl2，
1.0-2.0 mM DTT，
1.0-2.0 U/ul 牛痘病毒加帽酶；
10.0-20.0 U/ul Cap 2’-O甲基转移酶；
0.5-3.0 mM SAM；
0.5-3.0 mM GTP。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述(S1)中的体外转录的mRNA反应混合液直接用于步骤(S2)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加帽产物的产率≥95%。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加帽缓冲液包含选自下组浓度的组分：
20-80 mM 螯合剂，
0.2-1.0 M Tris-HCl，
20-100 mM KCl，
5-50 mM MgCl2，和
5-50 mM DTT；所述浓度为加帽缓冲液中的浓度。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述螯合剂选自下组：EDTA、NTA、DTPA、CDTA、EDDHA和HEEDTA以及酒石酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加帽缓冲体系包括如下浓度的组分：
1.2-1.6 U/ul 牛痘病毒加帽酶；
12.0-16.0 U/ul Cap2’-O甲基转移酶。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加帽缓冲体系包括如下浓度的组分：
1.5-2.0 mM SAM；
1.0-2.0 mM GTP。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加帽缓冲体系包括如下浓度的组分：0.5mg/ml-10 mg/ml mRNA。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标mRNA的长度为500bp-3000bp。
10.如权利要求1、6、7、8中任一所述的方法，其特征在于，所述浓度为加帽缓冲体系中，mRNA体外加帽反应前的各组分浓度。
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