CN115948382A - 一种mRNA的加帽方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种mRNA加帽的方法。所述方法包括：将mRNA连接在固定相后进行加帽反应，得到加帽的mRNA。本发明创造性地建立了一种基于固定化mRNA的加帽反应‑分离耦合策略，提供一种高效，简便，低成本的加帽方法，加帽操作既可以间歇操作，也可以在柱子上连续操作，为mRNA新型生产工艺的开发及应用提供了研究基础。
Description
技术领域
本发明属于核酸技术领域，涉及一种mRNA的加帽方法。
背景技术
天然mRNA具有单链结构，由5’端甲基鸟苷酸帽(5’-cap)、3’端多聚腺苷酸尾(3’-polyA)以及中间的蛋白翻译区和非翻译区组成。其中，5’-cap可以消除mRNA序列中的游离磷酸基团，防止核糖核酸酶和核酸外切酶对mRNA的消化，从而显著提高mRNA的稳定性，同时，5’-cap能够促进核糖体识别mRNA，并通过与真核翻译起始因子4E(eIF4E)结合来提高翻译效率。根据5’-cap中甲基化的程度，mRNA中存在三种类型的帽，即cap-0(m7GpppN)、cap-1(m7GpppNm)和cap-2(m7GpppNmNm)。免疫细胞中的模式识别受体(PRRs)可以识别未加帽的mRNA或具有cap-0帽的mRNA并抑制其翻译。然而，具有cap-1和cap-2帽结构的mRNA在被识别后仍然被翻译。当前治疗用的mRNA均由体外转录获得，即在RNA聚合酶的作用下，以DNA为模板转录生成mRNA。为了提高转录后mRNA的结构稳定性和翻译效率，需进一步对其进行加帽。
目前mRNA的加帽方法包括酶法加帽、共转录法加帽、化学法加帽。其中最常用的是酶法加帽，即首先通过具有三种酶活性的牛痘病毒加帽酶产生cap-0帽，其具体的反应机制为：mRNA在RNA三磷酸酶的作用下脱去一个5’端的磷酸基团，之后鸟苷转移酶将三磷酸鸟苷(GTP)分子中的单磷酸鸟苷(GMP)结构添加至脱去一个磷酸基团的mRNA上，最后通过鸟苷甲基转移酶的催化在鸟嘌呤结构的N7端添加一个甲基，从而生成具有cap-0帽结构的mRNA。此外，在2-O’甲基转移酶的作用下，具有cap-0帽结构的mRNA能够在2-O’端添加一个甲基生成具有cap-1帽结构的mRNA。但酶法加帽法反应组分较多，需要经过“吸附-洗脱-加帽-再吸附-再洗脱”的五步操作才能够获得纯化的加帽mRNA，分离步骤多，成本高，mRNA产量低，损失大，易降解。
WO2016193226A1公开了一种利用固定化加帽酶对RNA加帽的方法，所述方法中，牛痘病毒加帽酶和2’-O-甲基转移酶的固定相均为环氧甲基丙烯酸磁珠，该固定相经过环氧基活化后能够与酶分子的半胱氨酸形成巯基，从而进行两种加帽酶的固定，其固定条件为：100mM磷酸钾、500mM氯化钠、1mM乙二胺四乙酸(pH7.5)，在20℃固定60min后，其上清液中的蛋白酶浓度经测定基本为0，说明该方法固定化加帽酶的效率较高。经过高效液相色谱柱进行分析，加帽酶在通过该方法固定化后具有较高的活性和稳定性。但该方法仍需要先利用介质把mRNA吸附-洗脱进行分离，然后与固定化的加帽酶结合进行加帽反应，后续仍需要把mRNA从除加帽酶之外的其他组分中分离出来，存在造成mRNA损失等问题。
CN112626177A公开了一种快速定量检测RNA加帽效率的方法，所述方法步骤包括S1.体外转录合成未加帽的RNA并除去模板DNA；S2.对RNA进行加帽处理；S3.对经S1、S2步骤得到的RNA进行单磷酸化处理：先利用碱性磷酸酶去磷酸化，RNA纯化后再利用多聚核苷酸激酶在RNA的5’端加上单磷酸；S4.用单磷酸酶除去进行单磷酸化处理后的RNA，并设置不用单磷酸酶处理的对照组；S5.跑胶检测，定量测定用单磷酸酶处理的RNA的条带亮度(记为n)以及对照组的RNA的条带亮度(记为N)，计算RNA的加帽效率为：(n/N)×100％。该方法可快速定量地检测出RNA的加帽效率，操作简单快速，结果有效准确，对样品需求量少，对RNA类型、长度等无特殊要求，适用范围广。但此方法存在加帽前后分离步骤多，纯化容易造成mRNA的质量损失，工艺时间长，并容易导致mRNA的降解等问题。
综上所述，目前mRNA加帽方法存在步骤多，成本高，mRNA产量低，损失大，易降解等问题。如何提供一种更为简单，快速，低成本的mRNA加帽方法，已成为目前核酸技术领域亟待解决的问题之一。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种mRNA的加帽方法，解决了目前mRNA加帽方法存在步骤多，成本高，mRNA产量低，损失大，易降解等问题，实现了便捷，高效且低成本地对mRNA进行加帽。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种mRNA加帽的方法，所述方法包括：将mRNA连接在固定相后进行加帽反应，得到加帽的mRNA。
本发明创造性地建立了一种基于固定化mRNA的加帽反应-分离耦合策略，提供一种高效，简便，低成本的加帽方法，加帽操作既可以间歇操作，也可以在柱子上连续操作，为mRNA新型生产工艺的开发及应用提供了研究基础。
优选地，所述mRNA由体外转录获得。
优选地，所述体外转录的反应体系包括RNA聚合酶和DNA模板。
优选地，所述RNA聚合酶包括T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或T3 RNA聚合酶中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述DNA模板为具有编码蛋白质功能的DNA序列，包括线性化质粒、PCR产物、合成的DNA片段中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述mRNA通过非共价作用与固定相连接。
优选地，所述非共价作用包括疏水作用、静电作用、亲和作用中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述固定相包括表面修饰有能和mRNA结合的配基的固体材料。
优选地，所述能和mRNA结合的配基包括疏水配基、阳离子配基、亲和配基中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述加帽反应包括将mRNA与mRNA加帽酶接触，在mRNA的5’端添加帽子结构。
优选地，所述mRNA加帽酶包括mRNA加帽酶1和mRNA加帽酶2。
优选地，所述mRNA加帽酶1包括由D1和D12两个亚基组成的异质二聚体，更优选来源于牛痘病毒的加帽酶。
优选地，所述mRNA加帽酶2包括2-O’甲基转移酶。
优选地，所述加帽的mRNA的5’端帽子结构包括cap-0(m7GpppN)、cap-1(m7GpppNm)或cap-2(m7GpppNmNm)中任意一种。
优选地，所述的mRNA加帽的方法包括以下步骤：
(1)将mRNA连接到固定相上；
(2)对连接在固定相上的mRNA进行加帽反应；
(3)洗去未反应的组分；
(4)将加帽后的mRNA从固定相上解离。
其加帽过程示意图如图1所示。
优选地，所述mRNA连接到固定相上的方法包括：将mRNA与结合缓冲液混合，加热后至于冰浴上冷却，后将mRNA加入预先用结合缓冲液平衡后的固定相中，进行结合。
优选地，所述结合缓冲液包括Tris-盐酸、氯化钠、乙二胺四乙酸、硫酸铵中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述Tris-盐酸的浓度为0-50mM。
上述0-50中的具体点值可以选择0、3、5、7、10、20、30、40、45、48、49、50等。
优选地，所述氯化钠的浓度为0-1M。
上述0-1中的具体点值可以选择0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1等。
优选地，所述乙二胺四乙酸的浓度为0-1mM。
上述0-1中的具体点值可以选择0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1等。
优选地，所述硫酸铵的浓度为0-1M。
上述0-1中的具体点值可以选择0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1等。
优选地，所述加热的温度为35-65℃。
上述35-65中的具体点值可以选择35、36、40、45、50、55、60、62、63、64、65等。
优选地，所述加热的时间为5-10min。
上述5-10中的具体点值可以选择5、6、7、8、9、10等。
优选地，所述mRNA与固定相的结合比为0.2-8μg/μL，更优选为1-4μg/μL。
上述0.2-8中的具体点值可以选择0.2、2、3、4、5、6、7、8等。
上述1-4中的具体点值可以选择1、2、3、4等。
优选地，所述结合温度为25-65℃。
上述25-65中的具体点值可以选择25、36、40、45、50、55、60、62、63、64、65等。
优选地，所述结合的时间为5-120min。
上述5-120中的具体点值可以选择5、30、40、45、50、55、60、80、90、110、120等。
优选地，步骤(2)中所述的加帽反应包括：将含有三磷酸鸟苷和S-腺苷甲硫氨酸的加帽缓冲液添加至吸附有mRNA的固定相中，后加入mRNA加帽酶1和mRNA加帽酶2进行加帽反应。
优选地，所述三磷酸鸟苷的浓度为0.1-1mM。
上述0.1-1中的具体点值可以选择0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1等。
优选地，所述S-腺苷甲硫氨酸的浓度为0.1-1mM。
上述0.1-1中的具体点值可以选择0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1等。
优选地，所述加帽缓冲液还包括Tris-盐酸、氯化钾、氯化镁、二硫苏糖醇中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述Tris-盐酸的浓度为0-50mM。
上述0-50中的具体点值可以选择0、10、15、20、25、30、35、40、45、50等。
优选地，所述氯化钾的浓度为0-10mM。
上述0-10中的具体点值可以选择0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等。
优选地，所述氯化镁的浓度为0-1mM。
上述0-1中的具体点值可以选择0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1等。
优选地，所述二硫苏糖醇的浓度为0-1mM；
上述0-1中的具体点值可以选择0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1等。
优选地，所述加帽反应的温度为25-65℃。
上述25-65中的具体点值可以选择25、36、40、45、50、55、60、62、63、64、65等。
优选地，所述加帽反应的时间为5-60min。
上述5-60中的具体点值可以选择5、30、40、45、50、55、60等。
优选地，步骤(4)中所述解离的方法包括将洗脱缓冲液加入至连接有加帽后的mRNA的固定相中，进行洗脱，收加帽后的mRNA。
优选地，所述洗脱缓冲液包括Tris-盐酸、氯化钠、乙二胺四乙酸中的任意一种或几种的组合。
优选地，所述Tris-盐酸的浓度为0-50mM。
上述0-50中的具体点值可以选择0、10、15、20、25、30、35、40、45、50等。
优选地，所述氯化钠的浓度为0-1M。
上述0-1中的具体点值可以选择0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1等。
优选地，所述乙二胺四乙酸的浓度为0-1mM。
上述0-1中的具体点值可以选择0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1等。
优选地，所述洗脱的温度为25-65℃。
上述25-65中的具体点值可以选择25、36、40、45、50、55、60、62、63、64、65等。
优选地，所述洗脱的时间为5-60min。
上述5-60中的具体点值可以选择5、30、40、45、50、55、60等。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)减少了加帽反应前mRNA变性预处理的步骤，操作更加简便；
(2)加帽反应之后仅通过简单的清洗/淋洗操作就能实现mRNA和其他反应组分的分离，减少了反应后额外的纯化步骤，简化了mRNA的生产工艺；
(3)反应后通过一步洗脱即可获得纯化的加帽mRNA，提高了mRNA的稳定性和产量收率。
附图说明
图1为固定化mRNA加帽过程示意图；
图2为实施例1和对比例1加帽前后琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
一种固定化mRNA加帽方法。
(1)取50μg体外转录的表达绿色荧光蛋白的mRNA在65℃加热变性后立即进行冰浴降温。将用平衡缓冲液(10mM Tris-HCl+1M NaCl+1mM EDTA,pH 7.4)平衡之后的Oligo dT介质50μL加入mRNA中，于25℃结合10min；
(2)将1mM的GTP、1mM的SAM的缓冲液添加至吸附有mRNA的固定相中，混匀后加入加帽酶1(牛痘病毒加帽酶)和加帽酶2(2-O’甲基转移酶)，进行加帽反应30min，加帽温度为45℃，离心收集吸附有加帽mRNA的固定相；
(3)清洗去除未反应的组分；
(4)用洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl+1mM EDTA,pH 7.4)将吸附在固定相上的加帽后的mRNA进行洗脱，于25℃洗脱30min，离心收集解离的mRNA。
实施例2
一种固定化mRNA加帽方法。
(1)取150μg体外转录的表达绿色荧光蛋白的mRNA在35℃加热变性后立即进行冰浴降温。将用平衡缓冲液(10mM Tris-HCl+1mM EDTA,pH 7.4)平衡之后的DEAE介质50μL加入mRNA中，于40℃结合60min；
(2)将0.5mM的GTP、0.5mM的SAM的缓冲液添加至吸附有mRNA的固定相中，混匀后加入加帽酶1(牛痘病毒加帽酶)和加帽酶2(2-O’甲基转移酶)，进行加帽反应60min，加帽温度为65℃，离心收集吸附有加帽mRNA的固定相；
(3)清洗去除未反应的组分；
(4)用洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl+1M NaCl+1mM EDTA,pH 7.4)将吸附在固定相上的加帽后的mRNA进行洗脱，于40℃洗脱10min，离心收集解离的mRNA。
实施例3
一种固定化mRNA加帽方法。
(1)取400μg体外转录的表达绿色荧光蛋白的mRNA在45℃加热变性后立即进行冰浴降温。将用平衡缓冲液(20mM Tris-HCl+1M硫酸铵+1mM EDTA,pH 7.4)平衡之后的Butyl-FF介质100μL加入mRNA中，于65℃结合120min；
(2)将0.1mM的GTP、0.1mM的SAM的缓冲液添加至吸附有mRNA的固定相中，混匀后加入加帽酶1(牛痘病毒加帽酶)和加帽酶2(2-O’甲基转移酶)，进行加帽反应10min，加帽温度为25℃，离心收集吸附有加帽mRNA的固定相；
(3)清洗去除未反应的组分；
(4)用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl+1mM EDTA,pH 7.4)将吸附在固定相上的加帽后的mRNA进行洗脱，于65℃洗脱30min，离心收集解离的mRNA。
实施例4
一种固定化mRNA加帽方法。
(1)取100μg体外转录的表达绿色荧光蛋白的mRNA(体积为200μL)在65℃加热变性后立即进行冰浴降温；
(2)将100μL的Oligo dT介质装入层析柱管中，并用平衡缓冲液(10mM Tris-HCl+1M NaCl+1mM EDTA,pH 7.4)进行平衡；
(3)将(1)中的mRNA进样层析柱中，保留时间为10min，柱温和进样温度为25℃；
(4)进样完成后，用600μL结合缓冲液将未结合的组分进行淋洗；
(5)将300μL含有1mM GTP、1mM SAM、加帽酶1(牛痘病毒加帽酶)和加帽酶2(2-O’甲基转移酶)的缓冲液进样至层析柱，在柱上反应30min，温度为45℃；
(6)加帽反应完成后用700μL平衡缓冲液淋洗层析柱，去除未反应的组分；
(7)25℃条件下，用400μL洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl+1mM EDTA,pH7.4)将吸附在固定相上的加帽后的mRNA进行洗脱，收集洗脱下的mRNA。
对比例1
游离mRNA的酶法加帽。
(1)取50μg体外转录的表达绿色荧光蛋白的mRNA在65℃加热变性后立即进行冰浴降温，将平衡(平衡缓冲液为：10mM Tris-HCl+1M NaCl+1mM EDTA,pH 7.4)之后的Oligo dT介质50μL加入mRNA中，于25℃结合10min，收集吸附mRNA的固定相并去除未结合的mRNA，用洗脱缓冲液将吸附mRNA进行洗脱并收集洗脱组分；
(2)将洗脱后的mRNA通过超滤膜换液至平衡缓冲液；
(3)将换液后的mRNA、1mM的GTP、1mM的SAM、加帽酶1(牛痘病毒加帽酶)和加帽酶2(2-O’甲基转移酶)的溶液共混，进行加帽反应30min，加帽温度为45℃；
(3)将含有加帽mRNA的混合物再次结合50μL dT亲和树脂，于25℃结合10min，去除未结合的组分；
(4)用洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl+1mM EDTA,pH 7.4)将吸附加帽mRNA进行洗脱，于25℃洗脱30min，收集洗脱组分。
测试例1
本测试例检测加帽效率。
用Ribozyme对mRNA进行酶切，用聚丙烯酰胺变性电泳对酶切后的5’端mRNA片段进行分析，测试结果如图2所示，采用DNAPac RP色谱柱(2.1×100mm，Thermo Fisher，USA)对酶切后的5’端mRNA片段进行分析，对液相图谱中加帽和未加帽的组分的峰面积进行积分，加帽率通过如下方式计算：
利用该方法检测实施例1-4和对比例1的加帽效果，根据峰面积分析加帽效率如表1所示。
表1
| 加帽方法 | 加帽效率(％) |
| 对比例1 | 99.88 |
| 实施例1 | 99.70 |
| 实施例2 | 99.16 |
| 实施例3 | 99.25 |
| 实施例4 | 99.31 |
由表1的测试数据可知，固定化mRNA加帽与游离mRNA加帽相比，无论间歇操作还是在柱子上连续操作，均具有超过99％的加帽效率，说明本发明固定化mRNA加帽的方法能够高效率对mRNA进行加帽，既可以间歇操作，也可以在柱子上连续操作，为mRNA新型生产工艺的开发及应用提供了研究基础。
测试例2
本测试例为在相同加帽条件下，实施例1-4和对比例1的mRNA收率、纯度和所用步骤、时间对比。
具体方法如下：
(1)使用NanoDrop对洗脱液中的mRNA浓度进行测定，mRNA收率的计算方法的计算公式如下所示：
测试结果如表2所示。
表2
| 加帽方法 | mRNA收率(％) |
| 实施例1 | 84.59 |
| 实施例2 | 81.44 |
| 实施例3 | 82.06 |
| 实施例4 | 80.22 |
| 对比例1 | 45.62 |
由表2的测试数据可知，固定化mRNA加帽与游离mRNA加帽相比，最终获得的mRNA收率更高，说明本发明固定化mRNA加帽的方法提高了mRNA的产量收率。
(2)通过液相色谱检测mRNA的纯度：采用TSK 6000色谱柱(7.8×300mm，TOSOH，Japan)对洗脱后的mRNA进行检测，对液相图谱中加帽和未加帽的组分的峰面积进行积分，其纯度计算方法为：
mRNA纯度结果统计如表3所示。
表3
| 加帽方法 | mRNA纯度(％) |
| 实施例1 | 99.27 |
| 实施例2 | 98.33 |
| 实施例3 | 97.56 |
| 实施例4 | 99.16 |
| 对比例1 | 93.87 |
由表3的测试数据可知，固定化mRNA加帽与游离mRNA加帽相比，最终获得的mRNA纯度更高，说明本发明固定化mRNA加帽的方法提高了mRNA的纯度。
(3)根据实施例1和对比例1各步骤消耗的时间进行加和计算，获得总加帽时间消耗，结果如表4所示。
表4
由表4的测试数据可知，在相同mRNA质量的条件下，固定化mRNA加帽与游离mRNA加帽相比，固定化mRNA加帽具有较高的mRNA收率，且步骤和时间花费均为游离mRNA的一半，说明本发明固定化mRNA加帽的方法提高了mRNA的产量收率，减少了反应步骤，简化了mRNA的生产工艺。
综上所述，本发明创造性地建立了一种高效，简便，低成本的加帽方法，加帽操作既可以间歇操作，也可以在柱子上连续操作，为mRNA新型生产工艺的开发及应用提供了研究基础。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种mRNA加帽的方法，其特征在于，所述方法包括：将mRNA连接在固定相后进行加帽反应，得到加帽的mRNA。
2.根据权利要求1所述的mRNA加帽的方法，其特征在于，所述mRNA由体外转录获得；
优选地，所述体外转录的反应体系包括RNA聚合酶和DNA模板；
优选地，所述RNA聚合酶包括T7RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶或T3RNA聚合酶中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述DNA模板为具有编码蛋白质功能的DNA序列，包括线性化质粒、PCR产物、合成的DNA片段中任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1或2所述的mRNA加帽的方法，其特征在于，所述mRNA通过非共价作用与固定相连接；
优选地，所述非共价作用包括疏水作用、静电作用、亲和作用中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述固定相包括表面修饰有能和mRNA结合的配基的固体材料；
优选地，所述能和mRNA结合的配基包括疏水配基、阳离子配基、亲和配基中任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的mRNA加帽的方法，其特征在于，所述加帽反应包括将mRNA与mRNA加帽酶接触，在mRNA的5’端添加帽子结构。
5.根据权利要求4所述的mRNA加帽的方法，其特征在于，所述mRNA加帽酶包括mRNA加帽酶1和mRNA加帽酶2；
优选地，所述mRNA加帽酶1包括由D1和D12两个亚基组成的异质二聚体，更优选来源于牛痘病毒的加帽酶；
优选地，所述mRNA加帽酶2包括2-O’甲基转移酶。
6.根据权利要求1-5任一项所述的mRNA加帽的方法，其特征在于，所述加帽的mRNA的5’端帽子结构包括cap-0(m7GpppN)、cap-1(m7GpppNm)或cap-2(m7GpppNmNm)中任意一种。
7.根据权利要求1-6任一项所述的mRNA加帽的方法，其特征在于，所述的mRNA加帽的方法包括以下步骤：
(1)将mRNA连接到固定相上；
(2)对连接在固定相上的mRNA进行加帽反应；
(3)洗去未反应的组分；
(4)将加帽后的mRNA从固定相上解离。
8.根据权利要求7所述的mRNA加帽的方法，其特征在于，所述mRNA连接到固定相上的方法包括：将mRNA与结合缓冲液混合，加热后至于冰浴上冷却，后将mRNA加入预先用结合缓冲液平衡后的固定相中，进行结合；
优选地，所述结合缓冲液包括Tris-盐酸、氯化钠、乙二胺四乙酸、硫酸铵中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述Tris-盐酸的浓度为0-50mM；
优选地，所述氯化钠的浓度为0-1M；
优选地，所述乙二胺四乙酸的浓度为0-1mM；
优选地，所述硫酸铵的浓度为0-1M；
优选地，所述加热的温度为35-65℃；
优选地，所述加热的时间为5-10min；
优选地，所述mRNA与固定相的结合比为0.2-8μg/μL，更优选为1-4μg/μL；
优选地，所述结合温度为25-65℃；
优选地，所述结合的时间为5-120min。
9.根据权利要求7或8所述的mRNA加帽的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的加帽反应包括：将含有三磷酸鸟苷和S-腺苷甲硫氨酸的加帽缓冲液添加至吸附有mRNA的固定相中，后加入mRNA加帽酶1和mRNA加帽酶2进行加帽反应；
优选地，所述三磷酸鸟苷的浓度为0.1-1mM；
优选地，所述S-腺苷甲硫氨酸的浓度为0.1-1mM；
优选地，所述加帽缓冲液还包括Tris-盐酸、氯化钾、氯化镁、二硫苏糖醇中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述Tris-盐酸的浓度为0-50mM；
优选地，所述氯化钾的浓度为0-10mM；
优选地，所述氯化镁的浓度为0-1mM；
优选地，所述二硫苏糖醇的浓度为0-1mM；
优选地，所述加帽反应的温度为25-65℃；
优选地，所述加帽反应的时间为5-60min。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的mRNA加帽的方法，其特征在于，步骤(4)中所述解离的方法包括将洗脱缓冲液加入至连接有加帽后的mRNA的固定相中，进行洗脱，收加帽后的mRNA；
优选地，所述洗脱缓冲液包括Tris-盐酸、氯化钠、乙二胺四乙酸中的任意一种或几种的组合；
优选地，所述Tris-盐酸的浓度为0-50mM；
优选地，所述氯化钠的浓度为0-1M；
优选地，所述乙二胺四乙酸的浓度为0-1mM；
优选地，所述洗脱的温度为25-65℃；
优选地，所述洗脱的时间为5-60min。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202211659059.2A CN115948382A (zh) | 2022-12-22 | 2022-12-22 | 一种mRNA的加帽方法 |
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| CN202211659059.2A CN115948382A (zh) | 2022-12-22 | 2022-12-22 | 一种mRNA的加帽方法 |
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| CN114907430A (zh) * | 2022-06-21 | 2022-08-16 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种mRNA的分离纯化方法 |
| CN114907430B (zh) * | 2022-06-21 | 2023-12-01 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种mRNA的分离纯化方法 |
| CN116836974A (zh) * | 2023-09-01 | 2023-10-03 | 苏州近岸蛋白质科技股份有限公司 | 一种体外合成加帽mRNA的方法 |
| CN116836974B (zh) * | 2023-09-01 | 2024-02-20 | 苏州近岸蛋白质科技股份有限公司 | 一种体外合成加帽mRNA的方法 |
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