CN116203105A - 一种低成本的核酸/蛋白质电洗脱装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于洗脱装置技术领域,提供了一种低成本的核酸/蛋白质电洗脱装置,包括承胶模块、透析膜模块和固定模块,所述承胶模块和透析膜模块均安装于固定模块中,通过固定模块将承胶模块和透析膜模块的组装体固定在水平电泳槽内;所述承胶模块用于装载凝胶电泳分离后切取的胶块,所述承胶模块的一端插入透析膜模块中,所述承胶模块位于透析膜模块中的一端上设置有分隔胶块,用于构建承胶模块和透析膜模块之间的洗脱空间;所述透析膜模块上设置有透析膜,所述透析膜通过卡环固定于透析膜模块上,通过透析膜截取和收集待洗脱目标分子。该装置的操作简单,条件温和,且成本低廉,可以循环使用,经济性高,同时实际洗脱回收率高,适用性广。
Description
技术领域
本发明属于洗脱装置技术领域,尤其涉及一种低成本的核酸/蛋白质电洗脱装置及方法。
背景技术
核酸和蛋白质的凝胶分离在分子生物学及生物技术领域中至关重要,而凝胶分离后的抽提是对制备纯化产物、后续分析和功能化研究等的一项关键技术环节,制备的规模和效率直接影响到研发的进展,也是科研工作者经常涉及和关注的问题。从凝胶中回收目标分子的方法大致分为扩散、溶解胶和电洗脱三种。
目前,核酸和蛋白质凝胶回收试剂盒已经国产化。核酸试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA时,需要使用化学试剂将胶溶解,借助滤膜离心或者磁珠回收。另外,市面上的某些核酸试剂盒可能对单链DNA不具备回收能力。从聚丙烯酰胺PAGE凝胶中回收蛋白质或者DNA时,需要采用剧烈的条件进行胶溶解,会破坏目标物,或者将胶碾碎,利用扩散回收到溶液中,效率通常不高。目前市场上相关的试剂盒,根据产品的质量,价格不均(3~30元/次),实验重复性和抽提效率得不到保证,而且试剂污染环境,对操作人员不友好。
除了溶解胶和扩散方法,还有电洗脱回收方法,原理基本一致,均是在凝胶两端施加一定电压,在电场力的作用下,将带有(负)电荷的核酸/蛋白质洗脱到缓冲液中。目前国内市场上的电洗脱装置主要包括G-Capsule(Geno Technology、Model 422Electro-Eluter(BioRad)、D-tube(Merck)、E-Gel(Thermo Fisher)。
目前电洗脱装置虽然有国产化的个别设计专利,但是相对复杂,应用和市场仍然是空白,在特殊需要的时候,仍然需要通过代理从国外购买,程序复杂冗长,价格较高(约200元/次~约4万元/套),装置经济性低,而且实际使用中,操作繁琐,承胶量或者洗脱规模非常受限。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种低成本的核酸/蛋白质电洗脱装置及方法,旨在解决上述背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的,一种低成本的核酸/蛋白质电洗脱装置,包括承胶模块、透析膜模块和固定模块,所述承胶模块和透析膜模块均安装于固定模块中,通过固定模块将承胶模块和透析膜模块的组装体固定在水平电泳槽内;
所述承胶模块用于装载凝胶电泳分离后切取的胶块,所述承胶模块的一端插入透析膜模块中,所述承胶模块位于透析膜模块中的一端上设置有分隔胶块,用于构建承胶模块和透析膜模块之间的洗脱空间;
所述透析膜模块上设置有透析膜,所述透析膜通过卡环固定于透析膜模块上,通过透析膜截取和收集待洗脱目标分子。
进一步的技术方案,所述承胶模块、透析膜模块和固定模块的材质均为聚丙烯PP材料。
进一步的技术方案,所述承胶模块、透析膜模块和固定模块均采用3D打印成型或注塑的方式进行制造。
本发明实施例的另一目的在于,一种低成本的核酸/蛋白质电洗脱方法,包括以下步骤:
步骤1、组装透析膜模块:将透析膜在二次水中煮沸10分钟后,自然冷却到室温,修剪合适的大小,借助回形圆柱固定并用卡环固定于透析膜模块上(回形圆柱可以选择性使用);
步骤2、制备凝胶分离核酸/蛋白质的同时,将承胶模块的顶端卡入固定模块上端的回型槽内,加入200-500微升胶溶液,制备分隔凝胶,以用于分隔承胶模块和透析膜模块,构建洗脱空间;
步骤3、组装承胶模块和透析膜模块,其相对位置可以调节,以控制洗脱液体积(建议300微升左右),从透析膜模块的回型口加入洗脱液后,进一步调节、缩小两模块之间的洗脱液空间,尽量减少其中未被洗脱液占据的空间;
步骤4、将承胶模块和透析膜模块的组装体通过固定模块固定在水平电泳槽内,加入缓冲液,液面至承胶模块内部设置的回型通道的上端,利用核酸/蛋白质的电负性,施加电压进行电泳,洗脱目标至洗脱液空间;
步骤5、洗脱完成后,将电洗脱装置从电泳槽中取出,将承胶模块和透析膜模块小心拆开,用移液枪将洗脱液小心吹打透析膜后,收集洗脱液。
进一步的技术方案,所述方法还包括:步骤6、回收的DNA进行沉淀浓缩,或将洗脱液透析后进行冻干。
本发明实施例提供的一种低成本的核酸/蛋白质电洗脱装置,其有益效果如下:
(1)操作简单,条件温和,不需要使用任何化学试剂,环境友好;
(2)与水平电泳槽兼容,不需要单独的电源装置,适用性广;
(3)实际洗脱回收率高,对201、486、1485bp双链DNA和486nt单链DNA回收率均高于90%,性能优越,优于SanPrep试剂盒和G-Capsule电洗脱装置,对5、15、25微克的牛血清白蛋白BSA的平均回收效率也高于90%;
(4)成本低廉,可以循环使用,经济性高,便于推广。
附图说明
图1为本发明实施例提供的一种低成本的核酸/蛋白质电洗脱装置的结构示意图;
图2为本发明实施例提供的一种低成本的核酸/蛋白质电洗脱装置中的固定模块的结构示意图;
图3为本发明实施例提供的一种低成本的核酸/蛋白质电洗脱装置中的承胶模块的结构示意图;
图4为本发明实施例提供的一种低成本的核酸/蛋白质电洗脱装置中的透析膜模块的结构示意图;
图5为本发明实施例提供的一种低成本的核酸/蛋白质电洗脱装置中的卡环的结构示意图;
图6为本发明实施例提供的一种低成本的核酸/蛋白质电洗脱装置中的回形圆柱的结构示意图;
图7为双链DNA电洗脱效果凝胶表征图(2%琼脂糖凝胶);
图8为BSA蛋白质洗脱效果凝胶表征图(6%变性PAGE胶);
图9为CDR1as-201、CDR1as-486、CDR1as dsDNA的BSA回收效率图;
图10为5、15、25微克牛血清白蛋白的BSA回收效率图;
图11为2%琼脂糖凝胶电泳速度参考图;
图12为6%变性聚丙烯酰胺PAGE凝胶电泳速度参考图;
图13为本发明实施例提供的一种低成本的核酸/蛋白质电洗脱装置中的循环使用性图。
附图中:承胶模块1;分隔胶块11;透析膜模块2;卡环21;透析膜22;回形圆柱23;固定模块3。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
如图1-6所示,为本发明一个实施例提供的一种低成本的核酸/蛋白质电洗脱装置,包括承胶模块1、透析膜模块2和固定模块3,所述承胶模块1和透析膜模块2均安装于固定模块3中,通过固定模块3将上述承胶模块1和透析膜模块2的组装体固定在水平电泳槽内,方便电洗脱的实施;
所述承胶模块1用于装载凝胶电泳分离后切取的胶块,所述承胶模块1的一端插入透析膜模块2中,所述承胶模块1位于透析膜模块2中的一端上设置有分隔胶块11,用于构建承胶模块1和透析膜模块2之间的洗脱空间;
所述透析膜模块2上设置有透析膜22(可以根据待洗脱分子大小选择),所述透析膜22通过卡环21固定于透析膜模块2上,通过透析膜22截取和收集待洗脱目标分子,洗脱液可通过透析膜模块2端部的回型开囗用移液枪加入,随后可进一步调节承胶模块1和透析膜模块2之间的洗脱空间,让洗脱液尽量覆盖分隔胶块11的截面,优选的,覆盖分隔胶块11截面的2/3左右。
在本发明实施例中,所述承胶模块1、透析膜模块2和固定模块3的材质均为聚丙烯PP材料,采用PP材料注塑成型后,透光度好,可以在日光灯或者紫外灯光下进行可视化观察,初步检验洗脱效果。
作为本发明的一种优选实施例,所述承胶模块1、透析膜模块2和固定模块3的原始模型均采用3D打印成型的方式进行制造,生产时采用注塑的方式进行制造。
本发明一个实施例提供的一种低成本的核酸/蛋白质电洗脱方法,包括以下步骤:
步骤1、组装透析膜模块2:将透析膜22在二次水中煮沸10分钟后,自然冷却到室温,修剪合适的大小,借助回形圆柱23固定并用卡环21固定于透析膜模块2上(回形圆柱23可以选择性使用);
步骤2、制备凝胶分离核酸/蛋白质的同时,将承胶模块1的顶端卡入固定模块3上端的回型槽内,加入200-500微升胶溶液,制备分隔凝胶,以用于分隔承胶模块1和透析膜模块2,构建洗脱空间;
步骤3、组装承胶模块1和透析膜模块2,其相对位置可以调节,以控制洗脱液体积(建议300微升左右),从透析膜模块2的回型口加入洗脱液后,进一步调节、缩小两模块之间的洗脱液空间,尽量减少其中未被洗脱液占据的空间;
步骤4、将承胶模块1和透析膜模块2的组装体通过固定模块3固定在水平电泳槽内,加入缓冲液,液面至承胶模块1内部设置的回型通道的上端,利用核酸/蛋白质的电负性,施加电压进行电泳,洗脱目标至洗脱液空间(承胶模块1和透析膜22之间的空间,洗脱时间和施加电压值参考见附图7-12);
步骤5、洗脱完成后,将电洗脱装置从电泳槽中取出,将承胶模块1和透析膜模块2小心拆开,用移液枪将洗脱液小心吹打透析膜22后,收集洗脱液。
在本发明实施例中,还包括,步骤6、回收的DNA可以进行沉淀浓缩,建议将洗脱液透析后进行冻干。
如图7-13所示,作为本发明的一种优选实施例,基于CDR1as-201(其序列如SEQ IDNO.1所示)、CDR1as-486(其序列如SEQ ID NO.2所示)和CDR1as(其序列如SEQ ID NO.3所示)双链DNA的回收效率,将本装置与自制电洗脱原始模型装置、SanPrep试剂盒、商品化的G-Capsule电洗脱装置进行对比,具体步骤如下:
步骤一、双链底物dsDNA的积累:通过PCR反应快速积累起以双链形式存在的DNA,PCR反应体系(25μL)为:Taq PCR预混液7.5μL(上海生物生工),ddH2O 10μL,上、下游引物各0.5μL(100μM),HEK263基因组模板9μL(10ng/μL)。
PCR扩增程序为预变性95℃(5min),随后开始进入35次循环:94℃(30s)、64℃(30s)、72℃(2min),最后72℃延伸2min,样品放入4℃保存或者立即凝胶分离和纯化。PCR产物使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化,使用奥盛Nano-500微量分光光度计对DNA进行定量。
PCR引物:
正向引物均为:GGTTTCCGATGGCACCTGTGT;
反向引物:
CDR1as:CTGGATATTGCAGACACTGGAAGAC;
CDR1as-486:TTTGCTGGAAGACTTGATTTACTGG;
CDR1as-201:CCTGGATTTCTTTCTGGAAGACAC。
步骤2、对201、486和1485bp双链DNA的电洗脱采用1.5%的琼脂糖凝胶和TBE缓冲液,洗脱电压6V/cm,洗脱25min,通过对照实验(将洗脱前等量的物质稀释至洗脱后洗脱液体积)和荧光定量dsDNA浓度方法,最终计算的回收率平均在90%以上,并进行了琼脂糖凝胶电泳表征;
步骤三、对5、15和25微克的血清牛蛋白BSA进行电洗脱,采用6%变性PAGE胶和Tris-Glycine缓冲液,洗脱电压10V/cm,洗脱25min,通过对照实验和Bradford法测定蛋白质浓度,最终计算的洗脱回收率平均在90%以上,并进行了变性PAGE胶电泳表征;
步骤四、通过对照实验和荧光定量ssDNA浓度,对486个碱基长度的单链DNA进行洗脱和沉淀后,制备效率最终计算为90%左右。
另外,本发明对循环使用性的考察是采用原始的简单模型和约50个碱基长度的单链DNA进行的,可以循环使用至少30次(附图13)。
表1、电洗脱效率对比
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种低成本的核酸/蛋白质电洗脱装置,其特征在于,包括承胶模块、透析膜模块和固定模块,所述承胶模块和透析膜模块均安装于固定模块中,通过固定模块将承胶模块和透析膜模块的组装体固定在水平电泳槽内;
所述承胶模块用于装载凝胶电泳分离后切取的胶块,所述承胶模块的一端插入透析膜模块中,所述承胶模块位于透析膜模块中的一端上设置有分隔胶块,用于构建承胶模块和透析膜模块之间的洗脱空间;
所述透析膜模块上设置有透析膜,所述透析膜通过卡环固定于透析膜模块上。
2.根据权利要求1所述的低成本的核酸/蛋白质电洗脱装置,其特征在于,所述承胶模块、透析膜模块和固定模块的材质均为聚丙烯PP材料。
3.根据权利要求2所述的低成本的核酸/蛋白质电洗脱装置,其特征在于,所述承胶模块、透析膜模块和固定模块均采用3D打印成型或注塑的方式进行制造。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的低成本的核酸/蛋白质电洗脱装置的电洗脱方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1、组装透析膜模块:将透析膜在二次水中煮沸10分钟后,自然冷却到室温,进行尺寸修剪后,借助回形圆柱固定并用卡环固定于透析膜模块上;
步骤2、制备凝胶分离核酸/蛋白质的同时,将承胶模块的顶端卡入固定模块上端的回型槽内,加入200-500微升胶溶液,制备分隔凝胶,以用于分隔承胶模块和透析膜模块,构建洗脱空间;
步骤3、组装承胶模块和透析膜模块,通过调节两者的相对位置的方式控制洗脱液体积,从透析膜模块的回型口加入洗脱液后,进一步调节并缩小两模块之间的洗脱液空间,减少其中未被洗脱液占据的空间;
步骤4、将承胶模块和透析膜模块的组装体通过固定模块固定在水平电泳槽内,加入缓冲液,液面至承胶模块内部设置的回型通道的上端,利用核酸/蛋白质的电负性,施加电压进行电泳,洗脱目标至洗脱液空间;
步骤5、洗脱完成后,将电洗脱装置从电泳槽中取出,将承胶模块和透析膜模块拆开,用移液枪将洗脱液吹打透析膜后,收集洗脱液。
5.根据权利要求4所述的低成本的核酸/蛋白质电洗脱装置的电洗脱方法,其特征在于,所述方法还包括:步骤6、回收的DNA进行沉淀浓缩,或将洗脱液透析后进行冻干。
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CN (1) | CN116203105A (zh) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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EP0380357A2 (en) * | 1989-01-27 | 1990-08-01 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Electrophoresis apparatus and method |
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CN1180710A (zh) * | 1996-10-24 | 1998-05-06 | 兰荣良 | 脱氧核糖核酸笔式琼脂糖凝胶电洗脱器及应用 |
CN2908495Y (zh) * | 2005-11-08 | 2007-06-06 | 周松华 | 一种简易的蛋白回收装置 |
CN102816202A (zh) * | 2012-08-14 | 2012-12-12 | 上海交通大学 | 一种整体柱电洗脱装置及其方法 |
-
2023
- 2023-04-19 CN CN202310416340.1A patent/CN116203105A/zh active Pending
Patent Citations (5)
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