CN102816202A - 一种整体柱电洗脱装置及其方法 - Google Patents

Abstract

一种整体柱电洗脱装置及其方法，包括带电极的电泳槽、含有目标蛋白质或核酸区带的凝胶板、插槽、透析管以及框架；凝胶板放置在插槽中，透析管套设在该插槽外，且该透析管的两端向上折叠，插槽放置在所述的框架内，且该插槽的长轴与框架外侧的电极互相平行。本发明通过对实验用简单材料的组装完成了样品回收这一难题，具有样品回收率高，洗脱时间短的特点，且可同时进多种样品的洗脱，操作简单，可作为理想的洗脱和预富集方法。

Description

一种整体柱电洗脱装置及其方法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，具体涉及的是一种从凝胶中回收蛋白质或核酸的整体柱电洗脱装置及其方法。

背景技术

样品的纯化回收是生化实验室的一项常规操作，也是蛋白质或核酸分析过程中的关键步骤。在蛋白质或核酸分析过程中常常需要将特定的蛋白质或核酸从凝胶中分离和提取出来，用于后续操作(如SDS-PAGE、LC-MS和MS分析鉴定等)。因此, 凝胶电泳后蛋白质或核酸区带的回收直接影响到整个蛋白质或核酸分离分析过程的进程、结果好坏，甚至成败等。

目前，电泳中蛋白质或核酸区带回收主要有四种洗脱方法。第一种是常规的扩散方法，即蛋白质或核酸区带或斑点从凝胶上切下并切碎放入透析袋中，之后加入洗脱液进行洗脱（Seelert, H., Krause, F., 2008, Electrophoresis, 29, 2617-2636. )。这种方法简单无需特殊装置，但洗脱时间较长，且回收率低。第二种是基于高速离心的物理提取方法（Kurien, B. T., Sco?eld, R. H., 2002, Anal. Biochem., 302, 1-9. )。该方法操作简单, 但会导致凝胶污染相应的蛋白质或核酸，回收损失严重。第三种是通过有机试剂溶解凝胶回收样品（Horsten, H.H., 2003, Anal. Biochem., 316, 139-141.）。这种方法操作步骤繁琐, 对操作人员的技术和熟练程度有一定要求，且涉及有毒化学试剂，并存在样品损失，不适于微量蛋白质或核酸样品的纯化回收。

第四种是蛋白质或核酸区带的电洗脱方法，也是现在被研究者逐渐接受的方法（Mondal, S., Mondal, A.K., Mandal, S., 2007, Grana, 46, 91–97. )。但常规电洗脱是将所含蛋白质或核酸区带的凝胶碾碎，然后电洗脱；因此存在所需时间长、浓缩作用有限、操作繁琐、回收率低等问题。

发明内容

本发明的目的就是针对以上存在的洗脱时间长，低回收率和操作繁琐等问题，提供一种蛋白质或核酸整体柱电洗脱装置及其方法，实现最短时间得到最大回收率的同时，也可对不同样品进行洗脱。

为了实现上述发明目的，本发明的技术解决方案如下：

      一种蛋白质或核酸整体柱电洗脱装置，包括带电极的电泳槽，该电泳槽中充满电洗脱缓冲液，其特点在于：还包括含有目标蛋白质或核酸区带的凝胶板、插槽、透析管以及框架；

      所述的凝胶板放置在插槽中，透析管套设在该插槽外，且该透析管的两端向上折叠，此插槽放置在所述的框架内，且该插槽的长轴与框架外侧的电极互相平行。

 所述的插槽包括上下两层板和位于该上下两层板之间的多个圆柱。

 所述的圆柱为5个，圆柱的直径为2 mm，高度为2-5 mm。

 所述圆柱的高度与含有目标蛋白质或核酸区带的凝胶板的厚度相适配。

所述的透析管的长度比所述的插槽的长度长。

所述框架的长轴前后设有多个孔道、长轴的左右两侧分别设有洗脱窗口，保证洗脱液的自由通过以及电泳洗脱时电流通过。

电泳槽为商品化的常规琼脂糖凝胶电泳仪等，也可根据实验要求选择合适大小的电泳槽。

凝胶板可以是琼脂糖凝胶，也可以是聚丙烯酰胺凝胶。

本发明的具体操作步骤是：经凝胶电泳分离的含有目标蛋白质或核酸区带的凝胶板放于插槽中。随后此插槽套上合适的透析管（长度约为150 mm，宽度约为25 mm），透析管的长度比插槽稍长，在透析管中加入约2 ml洗脱液，插槽两端的透析管向上折叠，放于电洗脱框架中。一个框架可用来进行五个插槽的洗脱，将此组装好的框架放于电泳槽中。注意插槽的方向平行于电极。只有这种安排才可使蛋白质或核酸电泳迁移距离最短，从而能够进行快速、高效的电洗脱。

 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）在最短时间得到最大回收率的同时，也可同时进行不同样品的洗脱，而且洗脱时间大大缩短。

（2）整个过程无需凝胶的切碎、融胶、抽提、溶解，离心等操作，简化了蛋白质或核酸纯化回收的操作步骤，避免了操作中有毒化学试剂的使用，同时也避免了蛋白质或核酸样品提取、切碎等步骤中的样品损失。

（3）制作简单，成本低廉，可以同时进行高通量以及多种蛋白质或核酸的洗脱。

附图说明  

图1是本发明插槽的主视图。

图2是本发明插槽的侧视图。

图3是本发明插槽的剖视图。

图4是本发明的操作示意图。

图5是本发明整体柱电洗脱（A）与常规电洗脱（B）的原理图。

图中:1. 含有目标蛋白质或核酸区带的凝胶板，2. 凝胶，3. 插槽，4. 透析管，5. 框架，6. 洗脱窗口，7. 孔道，8. 电泳槽，9. 正极，10. 负极，11. 含有目标蛋白质或核酸区带的碎凝胶颗粒。

具体实施方式

以下结合附图并列举实例对本发明的相关内容进行详细阐述。下述的实验内容都是在以本发明的相关内容为基础进行试验的，但是本发明的保护范围不限于下述的实例。

在下列的实验中未注明具体的实验方案和过程，一般条件下需按照常规条件，或者是按照相关的仪器指标或厂商建议的进行操作。

一种蛋白质或核酸电洗脱装置，包括带电极的电泳槽8，该电泳槽中充满电洗脱缓冲液，还包括含有目标蛋白质或核酸区带的凝胶板1、插槽3、透析管4以及框架5；所述的凝胶板1放置在插槽3中，透析管4套设在该插槽3外，且该透析管4的两端向上折叠，插槽3放置在所述的框架5内，且该插槽3的长轴与框架5外侧的电极互相平行。

所述的透析管4的长度比所述的插槽的长度长。所述框架的长轴前后设有多个孔道7、长轴的左右两侧分别设有洗脱窗口6。

图1是本发明插槽的主视图，图2是本发明插槽的侧视图，图3是本发明插槽的剖视图，如图所示，本实施例的插槽3包括上下两层板和位于该上下两层板之间的5个圆柱。圆柱的直径为2 mm，高度为2-5 mm，构成大小为 89×8×（2-5） mm的区室，圆柱的高度与含有目标蛋白质或核酸区带的凝胶板的厚度相适配。透析管规格可根据制作插槽的大小选择不同的尺寸，本实施例中透析管的长度约为150 mm，宽度约为25 mm。透析管的长度比插槽稍长，在透析管中加入约2 ml洗脱液，插槽两端的透析管向上折叠，放于电洗脱框架中。一个框架可用来进行五个插槽的洗脱，将此组装好的框架放于电泳槽中。注意插槽的方向平行于电极。只有这种安排才可使蛋白质或核酸电泳迁移距离最短，从而能够进行快速、高效的电洗脱。

实施例1：从琼脂糖凝胶电泳（AGE）中电洗脱目标蛋白质

步骤一：进行蛋白质（如牛血清白蛋白）AGE

用9 mM巴比妥缓冲液（pH 8.6）制琼脂糖凝胶（0.8 %琼脂糖, w/v）。样品用标准的牛血清白蛋白5 mg溶解在5 ml的9 mM巴比妥缓冲液（pH 8.6）中，通过搅拌使其完全溶解。然后加入160微升样品溶液上样进行琼脂糖电泳，电泳电压为100 V，实验温度为25^oC，电泳时间是35 min。电泳结束后取出凝胶，凝胶两边切割下来进行快速考染，完成后放回原胶板处进行未染色蛋白质区带的定位。

步骤二：切割含有目标蛋白质（如白蛋白）区带的凝胶板并放入插槽中

根据步骤一定位的目标蛋白质（如白蛋白）的部位进行切割，切下的凝胶板完整移入插槽中，可多层放置，凝胶板的宽度及厚度与插槽吻合，紧贴在另一侧小圆柱上。

步骤三：插槽套上透析管并加入洗脱液

将准备好的透析管轻轻套在装有含样品凝胶板的插槽上，插槽两端均多出少许，随后一端按住，倾斜，在另一端加入2 ml 9 mM 巴比妥缓冲液（pH 8.6），排尽气泡。

步骤四：套有透析管的1-5个插槽放入框架中

将处理好的插槽放入框架中，透析管两端出口向上，贴在框架上。制作的框架可同时进行含有1-5个插槽的洗脱。

步骤五：组装好的框架放入电泳槽中进行电洗脱

随后将其安装好的框架放入有洗脱液的电泳槽中进行电泳，洗脱液是9 mM 巴比妥缓冲液（pH 8.6），电泳电压设置为100 V，温度为25 ^oC，电泳时间为15-20 min。

步骤六：洗脱样品收集

电泳洗脱结束后，取下插槽，倒出洗脱液，离心，取上清，测体积。可采用考马斯亮蓝G-250染色法测回收蛋白质浓度，可计算出回收率。

本实施例得到蛋白质回收率可达到83%，而相同条件下采用传统方法仅为50%，显示出巨大的优势。

实施例2：从聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中电洗脱目标蛋白质

步骤一：进行蛋白质（如血清蛋白）PAGE

PAGE电泳条件：聚丙烯酰胺分离胶（T：10%，C：2.7%）, 聚丙烯酰胺浓缩胶（T：4%, C：2.7%），1500 mM Tris-Hcl分离胶缓冲液（pH 8.9），500 mM Tris-Hcl浓缩胶缓冲液（pH 6.8），25 mM Tris-Gly电极缓冲液（pH 8.3），血清样品溶解于 50 mM Tris-Hcl浓缩胶缓冲液（pH 6.8，含1% 溴酚蓝）中，10倍稀释，每孔道10 微升样品上样，60 V电泳直到溴酚蓝进入分离胶，然后160 V电泳直至溴酚蓝达到凝胶的下端，电泳时间是90 min。电泳结束后取出凝胶，凝胶两边切割下来进行快速考染，完成后放回原胶板处进行未染色蛋白质区带的定位。

步骤二：切割含有目标蛋白质区带的凝胶板并放入插槽中

根据步骤一定位的目标蛋白质的部位进行切割，切下的凝胶板完整移入插槽中，凝胶板的宽度及厚度与插槽吻合，紧贴在另一侧小圆柱上。

步骤三：插槽套上透析管并加入洗脱液

透析管实验前处理好，长度约为150 mm，轻轻套在装有含样品胶条的插槽上，插槽两端均多出少许，随后一端按住倾斜，在另一端加入2 ml 25 mM Tris-Gly缓冲液（pH 8.3），如有气泡，排出。

步骤四：套有透析管的多个插槽放入框架中

将处理好的插槽放入框架中，透析管两端出口向上，贴在框架上。制作的框架可同时进行含有1-5个插槽的洗脱，满足大量的同类或不同类样品洗脱的需要。

步骤五：组装好的框架放入电泳槽中进行电洗脱

随后将其安装好的框架放入有洗脱液的电泳槽中进行电泳，洗脱液是25 mM Tris-Gly缓冲液（pH 8.3），电泳电压设置为100V，温度为25 ^oC，电泳时间为15-30 min。

步骤六：洗脱样品收集

电泳洗脱结束后，取下插槽，倒出洗脱液，离心，取上清，测体积。可采用考马斯亮蓝G-250染色法测回收蛋白质浓度，并计算回收率。本实施例得到蛋白质回收率可达到82%，而在相同条件下采用传统方法仅为67%。

实施例3：从琼脂糖凝胶电泳（AGE）中电洗脱目标核酸

步骤一：进行核酸AGE

按照常规条件进行DNA琼脂糖电泳，胶浓度为0.5%，胶中含EtBr 0.5_μg/ml,电极缓冲液为TAE（40 mM， pH 8.0），电压为4V/cm。电泳完毕后，凝胶移至紫外灯下（360 nm），用高压灭菌过的无菌手术刀片迅速横切出目的条带，之后关闭紫外灯在可见光下进行后续操作。

步骤二：将切割好的含有核酸区带的凝胶板并放入插槽中

根据步骤一划出的目标核酸条带，移出并将完整的凝胶板放入插槽中，凝胶板的宽度及厚度与插槽吻合，紧贴在另一侧小圆柱上。

步骤三：插槽套上透析管并加入洗脱液

将准备好的透析管轻轻套在装有含样品凝胶板的插槽上，两端均多出少许，随后一端按住，倾斜，在另一端加入2 ml 洗脱液TAE，排尽气泡。

步骤四：套有透析管的1-5个插槽放入框架中

将处理好的插槽放入框架中，透析管两端出口向上，紧贴于框架上。每个框架可同时进行含有1-5个插槽的洗脱。

步骤五：组装好的框架放入电泳槽中进行电洗脱

随后将其安装好的框架放入有电极液的电泳槽中进行电泳，电泳电压设置为8V/cm，温度为25 ^oC，电泳时间为15-20 min。

步骤六：洗脱样品收集

电泳洗脱结束后，取下插槽，倒出洗脱液，低温离心，取上清，测体积。可采用紫外分光光度法测回收核酸浓度，可计算出回收率。

Claims (7)

1.一种整体柱电洗脱装置，包括带电极的电泳槽（8），该电泳槽中充满电洗脱缓冲液，其特征在于：还包括含有目标蛋白质或核酸区带的凝胶板（1）、插槽（3）、透析管（4）以及框架（5）；

     所述的凝胶板（1）放置在插槽（3）中，透析管（4）套设在该插槽（3）外，且该透析管（4）的两端向上折叠，插槽（3）放置在所述的框架（5）内，且该插槽（3）的长轴与框架（5）外侧的电极互相平行。

2. 根据权利要求1所述的整体柱电洗脱装置，其特征在于：所述的插槽（3）包括上下两层板和位于该上下两层板之间的多个圆柱。

3. 根据权利要求2所述的整体柱电洗脱装置，其特征在于：所述的圆柱为5个，圆柱的直径为2 mm，高度为2-5 mm。

4. 根据权利要求3所述的整体柱电洗脱装置，其特征在于：所述圆柱的高度与含有目标蛋白质或核酸区带的凝胶板的厚度相适配。

5. 根据权利要求1所述的整体柱电洗脱装置，其特征在于：所述的透析管（4）的长度比所述的插槽的长度长。

6.根据权利要求1所述的整体柱电洗脱装置，其特征在于：所述框架的长轴前后设有多个孔道（7），框架的长轴的左右两侧分别设有洗脱窗口（6）。

7.利用权利要求1-6任一所述的整体柱电洗脱装置的电洗脱方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

步骤一、将含有目标蛋白质或核酸区带的凝胶板放入插槽中；

步骤二、将透析管套在插槽上，并将透析管一端向上弯折；透析管向下斜；

步骤三、从透析管的另一端加入洗脱液后，使其向上弯折；

步骤四、将多个套有透析管的插槽放入框架中，使插槽的长轴与框架外侧的电极平行；

步骤五、将框架放入电泳槽中进行电洗脱；

步骤六、电洗脱结束后，取出插槽，回收蛋白质或核酸。

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