CN110240646B - 肌红蛋白的纯化方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肌红蛋白的纯化方法及应用，包括将含有肌红蛋白的待纯化样品依次经粗级分离、疏水层析纯化和镍柱纯化，达到对肌红蛋白的高效稳定纯化，使纯化得到的肌红蛋白的纯度达99％；纯化后所获得重组人肌红蛋白的活性、稳定性、特异性等性能均满足需求。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，尤其是涉及一种肌红蛋白的纯化方法及应用。
背景技术
肌红蛋白(MYO)是一种含血色素的蛋白质，存在于动物的瘦肉组织中，心肌及横纹肌中含量较高，起储氧和携氧作用。在心肌梗死、肌肉损伤、药物中毒的情况下，肌细胞损坏而释放出肌红蛋白，由于肌红蛋白分子量较小(17KDa)且不与血浆蛋白质中珠蛋白结合，所以肌红蛋白一旦进入血液就容易从尿中排除，引起肌红蛋白尿。所以测定尿中或血中MYO含量是心肌梗死的一种早期诊断指标，测定肌红蛋白并区别血红蛋白及血液中其他蛋白质的方法有很多，但是灵敏度最高、特异性最强的方法就是用MYO特异性抗体测定机体MYO抗原的免疫学方法，因为肌红蛋白检测水平较高(ng/ml)，因此需要提纯MYO抗原免疫实验动物获得高纯度特异性的抗体。抗原提纯可从动物组织中天然提取，但是动物组织中杂蛋白含量较多，对提取条件要求较高，样本来源又受限制，且不利于控制样品批间差异，难度较大，不利于规模生产。目前，虽然通过多种途径可以很好地解决目的蛋白的高效表达，但后续肌红蛋白的高纯度及稳定纯化依然是个难题，尤其是需求满足免疫原对蛋白纯度的要求。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种肌红蛋白的纯化方法，以缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供上述肌红蛋白的纯化方法的应用。
本发明提供了一种肌红蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括将含有肌红蛋白的待纯化样品依次经粗级分离、疏水层析纯化和镍柱纯化，得到肌红蛋白。
进一步地，所述待纯化样品中的肌红蛋白为重组肌红蛋白；
优选地，所述重组肌红蛋白带有His标签。
进一步地，所述粗级分离的方法包括沉淀法；
优选地，所述沉淀法包括硫酸铵沉淀法、聚乙二醇沉淀法、丙酮沉淀法、苦味酸沉淀法、磷钨酸盐沉淀法或三氯乙酸沉淀法，优选为硫酸铵沉淀法；
优选地，所述硫酸铵沉淀法中硫酸铵溶液的浓度为35wt％-50wt％。
进一步地，所述疏水层析纯化中的疏水配基包括苯基、丁基或辛基，优选为苯基。
进一步地，所述疏水层析纯化依次包括步骤：平衡、洗杂和洗脱；
优选地，疏水层析洗脱步骤的电导为150-169ms/cm，优选为155-165ms/cm；
优选地，疏水层析洗杂步骤的电导为170-185ms/cm，优选为175-180ms/cm；
优选地，疏水层析平衡步骤的电导为190-250ms/cm，优选为200-240ms/cm。
进一步地，疏水层析洗脱步骤、疏水层析洗杂步骤或疏水层析平衡步骤中所用试剂的至少一种包括缓冲体系和盐；
优选地，所述缓冲体系包括PB、Tris-HCl、HEPES、醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液；
优选地，所述盐选自硫酸铵、氯化钠、醋酸钠、磷酸二氢钾或柠檬酸钠。
进一步地，所述镍柱纯化依次包括步骤：平衡、洗杂和洗脱；
优选地，镍柱纯化洗脱步骤中所用试剂包括终浓度为50-100mM的咪唑，优选为55-80mM；
优选地，镍柱纯化洗杂步骤中所用试剂包括终浓度为5-15mM的咪唑，优选为8-12mM。
进一步地，镍柱纯化洗脱步骤、镍柱纯化洗杂步骤或镍柱纯化平衡步骤中所用试剂的至少一种包括缓冲体系；
优选地，所述缓冲体系包括PB、Tris-HCl、HEPES、醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液；
进一步地，在所述镍柱纯化后进行脱盐；
优选地，所述脱盐包括G25脱盐或透析脱盐。
另外，本发明还提供了上述的肌红蛋白的纯化方法在如下(a)-(c)中的应用：
(a)制备肌红蛋白免疫原；
(b)制备肌红蛋白校准品；
(c)偶联亲和柱纯化抗体。
本发明提供的肌红蛋白的纯化方法，包括将含有肌红蛋白的待纯化样品依次经粗级分离、疏水层析纯化和镍柱纯化，根据肌红蛋白本身性质对纯化技术合理组合并确定各纯化技术手段的先后顺序；达到对肌红蛋白的高效纯化，使纯化得到的肌红蛋白的纯度达99％。而且，该纯化方法的重复性和得率等指标也均能够稳定在较高水平，纯化后所获得重组人肌红蛋白的活性、稳定性、特异性等性能均满足肌红蛋白功能研究需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实验例2提供的纯化技术组合纯化后的MYO蛋白经SDS-PAGE检测的结果图；
图2为本发明实验例2提供的纯化的MYO蛋白经SDS-PAGE检测的结果图；
图3为本发明实验例2提供的纯化的MYO蛋白经硝酸银染色纯度鉴定的结果图；
图4为本发明实验例2提供的疏水层析纯化MYO蛋白经SDS-PAGE鉴定洗杂及洗脱效果结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应用层析法进行蛋白纯化时，层析的组合和次序选择很重要，合理的层析次序能提高分离效率，同时有利于各个步骤间的过渡。当几种方法连用时，最好前一种方法处理的样品能适应后一种纯化方法。
基于此，本发明提供了一种肌红蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括将含有肌红蛋白的待纯化样品依次经粗级分离、疏水层析纯化和镍柱纯化，得到肌红蛋白。
该纯化方法根据肌红蛋白本身性质对纯化技术合理组合并确定各纯化技术手段的先后顺序；达到对肌红蛋白的高效纯化，使纯化得到的肌红蛋白的纯度达99％。而且，该纯化方法的重复性和得率等指标也均能够稳定在较高水平，纯化后所获得重组人肌红蛋白的活性、稳定性、特异性等性能均满足肌红蛋白功能研究需求。
在一些优选的实施方式中，所述待纯化样品中的肌红蛋白为重组肌红蛋白；重组肌红蛋白为应用了重组DNA或重组RNA技术，获得连接有可以翻译成目的蛋白的基因片段的重组载体，通过体内表达或体外表达得到的肌红蛋白。
优选地，所述重组肌红蛋白带有His标签。镍柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有His(组蛋白)标签的碱性蛋白结合，在蛋白上样后，带有His标签的蛋白特异性结合到镍柱中，而其他的杂蛋白通过除杂流出，能够有效保证纯化率。
在一些优选的实施方式中，所述粗级分离的方法包括沉淀法。沉淀法能够降低蛋白质在溶液中的溶解度，使蛋白质凝聚从而从溶液中析出，选择沉淀法进行粗级分离，能够实现将蛋白质与其他的杂质的快速分离。
优选地，所述沉淀法包括硫酸铵沉淀法、聚乙二醇沉淀法、丙酮沉淀法、苦味酸沉淀法、磷钨酸盐沉淀法或三氯乙酸沉淀法，优选为硫酸铵沉淀法。应该理解的是，上述沉淀法均为本领域公知的沉淀方法，对上述沉淀法不做具体的限定，原则上所用的沉淀剂不与各组分发生化学反应，过量的沉淀剂不干扰测定，能够沉淀完全即可。
优选地，所用的硫酸铵溶液的终浓度为35wt％-50wt％。
在一个具体的实施方式中，向含有肌红蛋白的待纯化样品中，缓慢加入饱和硫酸铵至终浓度为35wt％-50wt％，边加边混匀，室温静置30min，13500rpm，离心6min，保留上清、弃沉淀，完成粗级分离。其中，硫酸铵溶液的终浓度例如可以为，但不限于35wt％、40wt％、45wt％或50wt％。
在一些优选的实施方式中，所述疏水层析纯化中的疏水配基包括苯基、丁基或辛基，优选为苯基。苯基更倾向于结合含苯环的分子，待纯化的肌红蛋白含苯基氨基酸占总氨基酸的7.18％时，采用苯基作为疏水配基能够更好的提高纯化率。
在一些优选的实施方式中，所述疏水层析纯化依次包括步骤：平衡、洗杂和洗脱；
在一些优选的实施方式中，疏水层析洗脱步骤的电导为150-169ms/cm，例如可以为，但不限于150ms/cm、152ms/cm、155ms/cm、158ms/cm、160ms/cm、162ms/cm、165ms/cm或169ms/cm，优选为155-165ms/cm；
在一些优选的实施方式中，疏水层析洗杂步骤的电导为170-185ms/cm，例如可以为，但不限于170ms/cm、175ms/cm、180ms/cm或185ms/cm，优选为175-180ms/cm；
在一些优选的实施方式中，疏水层析平衡步骤的电导为190-250ms/cm，例如可以为，但不限于190ms/cm、195ms/cm、200ms/cm、210ms/cm、220ms/cm、230ms/cm、240ms/cm或250ms/cm，优选为200-240ms/cm。
在一定范围内，盐浓度越高，样品与疏水基团结合越强，因此电导对于蛋白洗杂及洗脱具有指导意义，例如，洗杂过程汇总电导越高洗杂效果越差，但电导太低会将目的蛋白一起洗脱下来。本发明通过创造性的调整疏水层析洗脱步骤、疏水层析洗杂步骤和疏水层析平衡步骤中的电导在合适的水平，能够大大提高纯化的成功率，达到对肌红蛋白的高效稳定纯化。
在一些优选的实施方式中，疏水层析洗脱步骤、疏水层析洗杂步骤或疏水层析平衡步骤中所用试剂的至少一种包括缓冲体系和盐。
其中“至少一种”指的是，可以是疏水层析洗脱步骤中所用试剂包括缓冲体系和盐、疏水层析洗杂步骤中所用试剂包括缓冲体系和盐、疏水层析平衡步骤中所用试剂包括缓冲体系和盐，或者疏水层析洗脱和疏水层析洗杂步骤中所用试剂均包括缓冲体系和盐、疏水层析洗杂和疏水层析平衡步骤中所用试剂均包括缓冲体系和盐、或者疏水层析洗脱和疏水层析平衡步骤中所用试剂均包括缓冲体系和盐，或者疏水层析洗脱、疏水层析洗杂和疏水层析平衡步骤中所用试剂均包括缓冲体系和盐。
缓冲体系指的是由弱酸及其盐、弱碱及其盐组成的混合溶液，能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的pH值相对稳定。优选地，所述缓冲体系包括PB、Tris-HCl、HEPES、醋酸缓冲液、磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液。
盐是指一类金属离子或铵根离子与酸根离子或非金属离子结合的化合物。优选地，所述盐包括硫酸铵、氯化钠、醋酸钠、磷酸二氢钾或柠檬酸钠。
在一些优选的实施方式中，疏水层析洗脱步骤、疏水层析洗杂步骤和疏水层析平衡步骤中所用试剂均包括缓冲体系和盐，且疏水层析洗脱步骤、疏水层析洗杂步骤和疏水层析平衡步骤中所用的缓冲体系和盐均相同。
在一些优选的实施方式中，所述镍柱纯化依次包括步骤：平衡、洗杂和洗脱；
在一些优选的实施方式中，镍柱纯化洗脱步骤中所用试剂包括终浓度为50-100mM的咪唑，咪唑的终浓度例如可以为，但不限于50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM，通过限定镍柱纯化洗脱步骤中的咪唑浓度，能够使咪唑与杂蛋白的竞争性更强，使杂蛋白不能挂柱，起到更好的除杂效果。
镍柱纯化步骤中咪唑的终浓度优选为55-80mM；当咪唑的浓度为55-80mM时，咪唑与杂蛋白的竞争性更强，除杂效果更好。
优选地，镍柱纯化洗杂步骤中所用试剂包括终浓度为5-15mM的咪唑，咪唑的终浓度例如可以为，但不限于5mM、8mM、10mM、12mM或15mM，通过限定镍柱纯化洗杂缓冲液中的咪唑浓度，能够使咪唑与杂蛋白的竞争性更强，使杂蛋白不能挂柱，起到更好的除杂效果。
镍柱纯化洗杂步骤中咪唑的终浓度优选为8-12mM；当咪唑的浓度为8-12mM时，咪唑与杂蛋白的竞争性更强，除杂效果更好。
在一些优选的实施方式中，镍柱纯化洗脱步骤、镍柱纯化洗杂步骤或镍柱纯化平衡步骤中所用试剂的至少一种包括缓冲体系。
其中“至少一种”指的是，可以是镍柱纯化洗脱步骤中所用试剂包括缓冲体系、镍柱纯化洗杂步骤中所用试剂包括缓冲体系、镍柱纯化平衡步骤中所用试剂包括缓冲体系，或者镍柱纯化洗脱和镍柱纯化洗杂步骤中所用试剂均包括缓冲体系、镍柱纯化洗杂和镍柱纯化平衡均包括缓冲体系、镍柱纯化洗脱和镍柱纯化平衡均包括缓冲体系，或者镍柱纯化洗脱缓冲液、镍柱纯化洗杂缓冲液和镍柱纯化平衡缓冲液均包括缓冲体系。
缓冲体系指的是由弱酸及其盐、弱碱及其盐组成的混合溶液，能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的pH值相对稳定。优选地，所述缓冲体系包括PB、Tris-HCl、HEPES、醋酸缓冲液、磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液。
在一些优选的实施方式中，镍柱纯化洗脱步骤、镍柱纯化洗杂步骤和镍柱纯化平衡步骤中所用试剂均包括缓冲体系，且镍柱纯化洗脱步骤、镍柱纯化洗杂步骤和镍柱纯化平衡步骤中所用的缓冲体系均相同。
优选的，镍柱纯化洗脱步骤、镍柱纯化洗杂步骤和镍柱纯化平衡步骤中所用的缓冲体系与疏水层析洗脱、疏水层析洗杂和疏水层析平衡步骤中所用的缓冲体系相同。
在一些优选的实施方式中，在所述镍柱纯化后进行脱盐；脱盐能够将蛋白质同其它盐类小分子分离开，起到更好的除杂纯化效果。
优选地，所述脱盐包括G25脱盐或透析脱盐。
其中，G25脱盐柱置换缓冲效果好，耗时较短，能够更好的保持肌红蛋白的稳定性，并且，G25脱盐柱还可以除去蛋白样品中一些脱落的NI离子等，保证肌红蛋白的纯度，此外，G25脱盐柱可以快速置换到蛋白合适的缓冲液中，防止蛋白氧化，获得肌红蛋白的稳定性更高。
另外，本发明还提供了上述的肌红蛋白的纯化方法在如下(a)-(c)任一种或多种中的应用：
(a)制备肌红蛋白免疫原；
(b)制备肌红蛋白校准品；
(c)偶联亲和柱纯化抗体。
作为免疫原及用于偶联亲和柱纯化抗体的用途中，对肌红蛋白的纯度要求是越高越好，至少在95％以上。例如，与纯度为95％的抗原相比，用纯度更高(如97％、98％、99％)的抗原偶联亲和柱纯化得到的抗体纯度更高，免疫电泳无杂带，并且所获得的抗体特异性更高；再如，与纯度为95％的抗原相比，用纯度更高(如97％、98％、99％)的抗原作为免疫原时，获得特异性抗体的水平更高。因此，将本发明提供的肌红蛋白纯化方法应用于制备肌红蛋白免疫原、制备肌红蛋白校准品或偶联亲和柱纯化抗体，能够使获得特异性抗体的水平更高，或得到的抗体纯度和特异性更高。
其中，(a)-(c)任一种或多种指的是本发明提供的肌红蛋白纯化方法例如可以应用于制备肌红蛋白免疫原、或应用于制备肌红蛋白校准品、或应用于偶联亲和柱纯化抗体，或者应用于制备肌红蛋白免疫原和偶联亲和柱纯化抗体，或者应用于制备肌红蛋白免疫原、制备肌红蛋白校准品和偶联亲和柱纯化抗体。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明实施例中用到的主要试剂信息如下：
| 试剂名称 | 公司 | 规格 |
| 硫酸铵 | 广州化学试剂厂 | 500g/瓶 |
| 磷酸氢二钠 | 广州化学试剂厂 | 500g/瓶 |
| 磷酸二氢钠 | 广州化学试剂厂 | 500g/瓶 |
| 咪唑 | Sigma | 500g/瓶 |
| 氯化钠 | 广州化学试剂厂 | 500g/瓶 |
实施例1
本实施例提供了一种肌红蛋白的纯化方法，包括如下步骤：
(a)蛋白质粗级分离：使用硫酸铵沉淀：即向表达带有His标签的重组肌红蛋白的菌体裂解上清中缓慢加入饱和硫酸铵至终浓度为35％，室温静置30min后离心收集上清。
(b)疏水层析纯化：步骤(a)得到的上清过疏水介质苯基，平衡柱子(电导为195±5ms/cm，试剂为硫酸铵和PB)，随后上样，洗杂(电导为180±5ms/cm，试剂为硫酸铵和PB)，随后洗脱(电导为153±3ms/cm，试剂为硫酸铵和PB)，收集洗脱样。
(c)镍柱纯化：将步骤(b)洗脱样过镍柱纯化，用PB平衡介质后上样，随后洗杂(试剂为含15mM咪唑的PB)，洗脱(试剂为含50mM咪唑的PB)，收集洗脱样。
(d)G25脱盐纯化：使用G25脱盐柱对步骤(c)得到的洗脱样处理，获得纯化的肌红蛋白。
实施例2
本实施例提供了一种肌红蛋白的纯化方法，包括如下步骤：
(a)蛋白质粗级分离：使用硫酸铵沉淀：即向表达带有His标签的重组肌红蛋白的菌体裂解上清中缓慢加入饱和硫酸铵至终浓度为50％，室温静置30min后离心收集上清。
(b)疏水层析纯化：步骤(a)得到的上清过疏水介质苯基，平衡柱子(电导为245±5ms/cm，试剂为硫酸铵和PB)，随后上样，洗杂(电导为175±5ms/cm，试剂为硫酸铵和PB)，随后洗脱(电导为167±2ms/cm，试剂为硫酸铵和PB)，收集洗脱样。
(c)镍柱纯化：将步骤(b)洗脱样过镍柱纯化，用PB平衡介质后上样，随后洗杂(试剂为含5mM咪唑的PB)，洗脱(试剂为含100mM咪唑的PB)，收集洗脱样。
(d)G25脱盐纯化：使用G25脱盐柱将步骤(c)得到的洗脱样处理，获得纯化的肌红蛋白。
实施例3
本实施例提供了一种肌红蛋白的纯化方法，包括如下步骤：
(a)蛋白质粗级分离：使用硫酸铵沉淀：即向表达带有His标签的重组肌红蛋白的菌体裂解上清中缓慢加入饱和硫酸铵至终浓度为40％，室温静置30min后离心收集上清。
(b)疏水层析纯化：步骤(a)得到的上清过疏水介质苯基，平衡柱子(电导为205±5ms/cm，试剂为硫酸铵和PB)，随后上样，洗杂(电导为175±5ms/cm，试剂为硫酸铵和PB)，随后洗脱(电导为158±3ms/cm，试剂为硫酸铵和PB)，收集洗脱样。
(c)镍柱纯化：将步骤(b)洗脱样过镍柱纯化，用PB平衡介质后上样，随后洗杂(试剂为含8mM咪唑的PB)，洗脱(试剂为含80mM咪唑的PB)，收集洗脱样。
(d)G25脱盐纯化：使用G25脱盐柱对步骤(c)得到的洗脱样处理，获得纯化的肌红蛋白。
实施例4
本实施例提供了一种肌红蛋白的纯化方法，包括如下步骤：
(a)蛋白质粗级分离：使用硫酸铵沉淀：即向表达带有His标签的重组肌红蛋白的菌体裂解上清中缓慢加入饱和硫酸铵至终浓度为45％，室温静置30min后离心收集上清。
(b)疏水层析纯化：步骤(a)得到的上清过疏水介质苯基，平衡柱子(电导为235±5ms/cm，试剂为硫酸铵和PB)，随后上样，洗杂(电导为175±5ms/cm，试剂为硫酸铵和PB)，随后洗脱(电导为162±3ms/cm，试剂为硫酸铵和PB)，收集洗脱样。
(c)镍柱纯化：将步骤(b)洗脱样过镍柱纯化，用PB平衡介质后上样，随后洗杂(试剂为含12mM咪唑的PB)，洗脱(试剂为含55mM咪唑的PB)，收集洗脱样。
(d)G25脱盐纯化：使用G25脱盐柱对步骤(c)得到的洗脱样处理，获得纯化的肌红蛋白。
实施例5
本实施例提供了一种肌红蛋白的纯化方法，包括如下步骤：
(a)蛋白质粗级分离：使用硫酸铵沉淀：即向表达带有His标签的重组肌红蛋白的菌体裂解上清中缓慢加入饱和硫酸铵至终浓度为45％，室温静置30min后离心收集上清。
(b)疏水层析纯化：步骤(a)得到的上清过疏水介质苯基，平衡柱子(电导为220±5ms/cm，试剂为硫酸铵和PB)，随后上样，洗杂(电导为178±5ms/cm，试剂为硫酸铵和PB)，随后洗脱(电导为160±3ms/cm，试剂为硫酸铵和PB)，收集洗脱样。
(c)镍柱纯化：将步骤(b)洗脱样过镍柱纯化，用PB平衡介质后上样，随后洗杂(试剂为含10mM咪唑的PB)，洗脱(试剂为含68mM咪唑的PB)，收集洗脱样。
(d)G25脱盐纯化：使用G25脱盐柱对步骤(c)得到的洗脱样处理，获得纯化的肌红蛋白。
实施例6
本实施例提供了一种肌红蛋白的纯化方法，与实施例3的不同之处在于，在步骤(a)中使用聚乙二醇沉淀法进行蛋白质的粗级分离。
实施例7
本实施例提供了一种肌红蛋白的纯化方法，与实施例5的不同之处在于，在步骤(a)中使用丙酮沉淀法进行蛋白质的粗级分离。
实施例8
本实施例提供了一种肌红蛋白的纯化方法，与实施例5的不同之处在于，在步骤(b)和步骤(c)中PB替换为Tris-HCl。
实施例9
本实施例提供了一种肌红蛋白的纯化方法，与实施例3的不同之处在于，在步骤(b)和步骤(c)中PB替换为HEPES。
实施例10
本实施例提供了一种肌红蛋白的纯化方法，与实施例5的不同之处在于，在步骤(d)中使用透析脱盐纯化：将步骤(c)得到的洗脱样进行透析，透析液(含PB和氯化钠)，透析体积比为1:1000。
实施例11
本实施例提供了一种肌红蛋白的纯化方法，与实施例5的不同之处在于，在步骤(b)中疏水层析洗脱步骤的电导为140ms/cm。
实施例12
本实施例提供了一种肌红蛋白的纯化方法，与实施例1的不同之处在于，在步骤(b)中疏水层析洗杂步骤的电导为160ms/cm。
对比例1
本对比例提供了一种肌红蛋白的纯化方法，与实施例5不同的是，将含有肌红蛋白的待纯化样品依次经镍柱纯化、粗级分离、疏水层析纯化和G25脱盐纯化，得到肌红蛋白。
对比例2
本对比例提供了一种肌红蛋白的纯化方法，与实施例5不同的是，将含有肌红蛋白的待纯化样品依次经镍柱纯化和G25脱盐纯化，再经SP(阳离子交换层析)柱进行精纯，得到肌红蛋白。
对比例3
本对比例提供了一种肌红蛋白的纯化方法，与实施例5不同的是，将含有肌红蛋白的待纯化样品依次经粗级分离和疏水层析纯化，得到肌红蛋白。
实验例1
分别对应用上述实施例1-12及对比例1-3提供的肌红蛋白的纯化方法纯化得到的肌红蛋白进行纯度及稳定性的检测，结果如下表1所示：
| 组别 | 蛋白纯度(％) |
| 实施例1 | 98 |
| 实施例2 | 98 |
| 实施例3 | 99 |
| 实施例4 | 99 |
| 实施例5 | 99 |
| 实施例6 | 99 |
| 实施例7 | 98 |
| 实施例8 | 98 |
| 实施例9 | 99 |
| 实施例10 | 99 |
| 实施例11 | 96 |
| 实施例12 | 97 |
| 对比例1 | 95 |
| 对比例2 | 90 |
| 对比例3 | 90 |
从上述表1的结果中可以看出，采用各实施例提供的纯化方法纯化得到的肌红蛋白的纯度及稳定性均高于对比例，由此说明，本发明提供的肌红蛋白的纯化方法能够达到对肌红蛋白的高效纯化，使纯化得到的肌红蛋白的纯度能高达99％。
实验例2
性能指标展示
一、纯度：
1.1采用本发明实施例5提供的纯化技术组合纯化后的MYO蛋白，经SDS-PAGE检测，胶浓度15％，结果如图1所示，其中，泳道1-10均为采用本发明方案纯化得到的不同批次MYO蛋白MYO。从图1中可以看出，SDS-PAGE检测结果只有一条目的条带，说明通过本发明实施例5提供的纯化技术能够对肌红蛋白达到高效纯化的目的，得到的蛋白纯度高，纯度达99％，且批次稳定。
1.2纯化的MYO蛋白经SDS-PAGE检测，胶浓度15％。结果如图2所示，其中，上样顺序：泳道1：对比例2中纯化的MYO蛋白；泳道2：本发明实施例4提供的纯化技术纯化的MYO蛋白；泳道3：对比例1中纯化的MYO蛋白；泳道4：本发明实施例3提供的纯化技术纯化的MYO蛋白；泳道5-6：空白；泳道7-8：对比例3中纯化的MYO蛋白。从图2中可以看出，泳道2和4肌红蛋白纯度明显高于泳道1、3、7、8肌红蛋白纯度，说明本发明提供的纯化工艺组合达到的技术效果明显优于其他纯化工艺。
1.3纯化的MYO蛋白经硝酸银染色纯度鉴定，胶浓度15％。结果如图3所示，其中，上样顺序：泳道1-3：其他无关蛋白；泳道4：对比例2中纯化的MYO蛋白；泳道5：本发明实施例5提供的纯化技术纯化的MYO蛋白；泳道6：其他无关蛋白；泳道7：空白；泳道8：对比例1中纯化的MYO蛋白；泳道9：对比例3中纯化的MYO蛋白。从图3中可以看出，泳道5肌红蛋白纯度明显高于泳道4、8和9肌红蛋白纯度，说明不同纯化工艺组合对蛋白纯度有不同的影响。本发明提供的纯化工艺组合纯化的MYO蛋白纯度达99％。
1.4疏水层析纯化MYO蛋白经SDS-PAGE鉴定洗杂及洗脱效果，胶浓度15％。结果如图4所示，其中，上样顺序：泳道1：硫酸铵处理后MYO粗蛋白；泳道2-8：电导170-185ms/cm下洗杂后样品；泳道9：电导160±5ms/cm下洗脱紫外吸收峰值的前半部分，含较多杂蛋白；泳道10-15：电导160±5ms/cm下洗脱目的蛋白，纯度较高，合并泳道10-15洗脱样品进入下一个纯化流程。从图4中可以看出，电导170-185ms/cm下洗杂有很好的洗杂效果；此时样品中大部分为杂蛋白，电导160±5ms/cm下洗脱刚出峰时含有较多杂蛋白，此时和填料介质结合力较强的杂蛋白被洗脱下来，见泳道9，然后目的蛋白才开始被洗脱下来，所以舍弃刚出峰时的洗脱样本；合并洗脱较纯样品作为疏水纯化样品。
二、活性及稳定性评价
实验目的：酶联免疫方法评价测定本发明实施例5纯化得到的myo蛋白的活性
包被抗原：将本发明纯化后的抗原从10μg/ml开始3倍梯度往下稀释，同时设置空白对照，即包被抗原浓度为0.00000；
抗体：MYO抗体(DAKO)：1:40000稀释上样；
酶：羊抗兔-HRP 1:4000上样；
结果如下表2所示：
从表2的酶联免疫结果中可以看出，活性能达到0.0137μg/ml，说明应用本发明提供的纯化工艺组合纯化得到的肌红蛋白活性好。
三、特异性
实验目的：MYO抗原交叉性检测
取纯化的MYO抗原(实施例5)按包被10μg/ml，5μg/ml开始往后3倍梯度稀释包被；抗体样本包括：dako-MB兔抗；CTNI羊抗；HbA1C-100-4B；ALB羊抗；FC-IgG；酶标抗体：羊抗兔IgG-HRP；兔抗羊IgG-HRP(1:2000)；羊抗鼠IgG-HRP。
结果如下表3所示：
从表3的酶联免疫结果中可以看出，本发明中纯化的MYO抗原只与MYO抗体有反应性；与上述其他抗体样本无反应性。说明应用本发明提供的纯化工艺组合纯化得到的MYO蛋白与其它抗体间无交叉反应。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (23)
1.一种肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括将含有肌红蛋白的待纯化样品依次经粗级分离、疏水层析纯化和镍柱纯化，得到肌红蛋白；
所述疏水层析纯化依次包括步骤：平衡、洗杂和洗脱，疏水层析洗脱步骤的电导为150-169 ms/cm；疏水层析洗杂步骤的电导为170-185 ms/cm；疏水层析平衡步骤的电导为190-250 ms/cm；
所述纯化方法还包括在所述镍柱纯化后进行脱盐；
所述待纯化样品中的肌红蛋白带有His标签。
2.根据权利要求1所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，所述待纯化样品中的肌红蛋白为重组肌红蛋白。
3.根据权利要求1所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，所述粗级分离的方法为沉淀法。
4.根据权利要求3所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，所述沉淀法为硫酸铵沉淀法、聚乙二醇沉淀法、丙酮沉淀法、苦味酸沉淀法、磷钨酸盐沉淀法或三氯乙酸沉淀法。
5.根据权利要求3所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，所述沉淀法为硫酸铵沉淀法。
6.根据权利要求5所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，所述硫酸铵沉淀法中硫酸铵溶液的终浓度为35wt%-50wt%。
7.根据权利要求1所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，所述疏水层析纯化中的疏水配基包括苯基、丁基或辛基。
8.根据权利要求1所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，所述疏水层析纯化中的疏水配基为苯基。
9.根据权利要求1所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，疏水层析洗脱步骤的电导为155-165 ms/cm。
10.根据权利要求1所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，疏水层析洗杂步骤的电导为175-180 ms/cm。
11.根据权利要求1所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，疏水层析平衡步骤的电导为200-240 ms/cm。
12.根据权利要求1所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，疏水层析洗脱步骤、疏水层析洗杂步骤或疏水层析平衡步骤中所用试剂包括缓冲体系和盐。
13.根据权利要求12所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，所述缓冲体系为PB、Tris-HCl、HEPES、醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液。
14.根据权利要求12所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，所述盐为硫酸铵、氯化钠、醋酸钠、磷酸二氢钾或柠檬酸钠。
15.根据权利要求1所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，所述镍柱纯化依次包括步骤：平衡、洗杂和洗脱。
16.根据权利要求15所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，镍柱纯化洗脱步骤中所用的试剂包括终浓度为50-100 mM的咪唑。
17.根据权利要求15所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，镍柱纯化洗脱步骤中所用的试剂包括终浓度为55-80 mM的咪唑。
18.根据权利要求15所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，镍柱纯化洗杂步骤中所用的试剂包括终浓度为5-15 mM的咪唑。
19.根据权利要求15所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，镍柱纯化洗杂步骤中所用的试剂包括终浓度为8-12 mM的咪唑。
20.根据权利要求15所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，镍柱纯化洗脱步骤、镍柱纯化洗杂步骤或镍柱纯化平衡步骤中所用试剂包括缓冲体系。
21.根据权利要求20所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，所述缓冲体系为PB、Tris-HCl、HEPES、醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液。
22.根据权利要求1所述的肌红蛋白的纯化方法，其特征在于，所述脱盐为G25脱盐或透析脱盐。
23.权利要求1-22任一项所述的肌红蛋白的纯化方法在如下（a）-（c）任一种或多种中的应用：
（a）制备肌红蛋白免疫原；
（b）制备肌红蛋白校准品；
（c）偶联亲和柱纯化抗体。
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