JPS58404B2 - ステロイド結合性グロブリンの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ステロイド結合性β−グロブリンの誘導体で
あるステロイド結合性グロブリン、および酵素ノイラミ
ニダーゼで処理することによりステロイド結合性β−グ
ロブリンからそれを製造する方法に関する。

β−グロブリンき呼ばれる血漿蛋白質の中にステロイド
ホルモンに対する格別の親和性を有しまたそれ故にステ
ロイド結合性β−グロブリンまたはテストステロン結合
性グロブリンと呼ばれる蛋白体の存在することは知られ
ている。

β１ＡＰ−糖蛋白質とも呼ばれるこの蛋白質を胎盤から
または妊婦の血液から単離することは既に提案されてい
る（ドイツ特許出願第２２２１６１．９号明細書参照）
。

しかしながら、このβ−グロブリンを純粋な形で製造す
ることにはこれまで成功していない。

このことは特に、この蛋白に対する抗血清を得る際に不
純物（たとえ極めて低濃度で存在していても）のために
免疫された動物に同じく抗体が形成されそのため非特異
的な抗血清の反応が生ずるという欠点を伴なう。

本発明によれば、ステロイド結合性β−グロブリンを酵
素ノイラミニダーゼを用いて処理することにより生成し
、しかも極めて純粋な形で製造することのできるステロ
イド結合性β−グロブリンの誘導体が見出された。

この誘導体を以下「ステロイド結合性グロブリン」と呼
ぶが、その生物学的性質上は広い範囲にわたってもとの
ステロイド結合性β−グロブリンに相当し、特にそれに
よって免疫された動物からは高特異性の抗血清が得られ
る。

従って本発明の対象はステロイド結合性グロブリンの誘
導体、ステロイドホルモンに対する特別な親和性を有す
る糖蛋白質である。

このステロイド結合性グロブリンの全炭水化物の総計は
１０．４±２．６ ％ （Ｈ，Ｅ、シュルツエ氏等の「
ＢＩＯＣｈｅｍ。

Ｚ、」第３２９巻第４９０頁（１９５８年）記載の測定
方法による）であり、そのうち５．８±１．２％はヘキ
ソース、４．０±ｏ、 ｓ ％はへキソサミン（Ｎ−ア
セチルへキソサミンとして計算）、０．５±０．５係は
ノイラミン酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸として計算）
および０．１±０．１１１はフコースでありしたがって
ノイラミン酸含量を除いた炭水化物分析値はステロイド
結合性β−グロブリンについて得られるような分析値に
相当する。

この新規グロブリンはステロイド結合性β−グロブリン
に対しで調製された抗血清により沈殿する。

電気泳動の動きはγ−グロブリンのそれに相当する。

ｐＨ６，８のホスフェート緩衝液に溶解された本発明の
蛋白質は超遠心分離においで４．１±１．Ｏ８の沈降定
数を示す。

１％ナトリウムドデシルサルフェート溶液中では、この
蛋白質は１．１±０．３８で沈降する。

ドデシルサルフェート含有ポリアクリルアミドゲル中で
は本発明による蛋白質は電圧の場においてアルブミンと
同様にまたはそれよりもやや迅速に移動するが、このこ
とから分子量は６５．０００±５，０００であることが
推論される。

１％ナトリウムドデシルサルフェート溶液中で分離を行
なう前に蛋白質をインキュベーションした後、蛋白質帯
域の移動距離を測定すると、これは人の胎盤ラクトジエ
ンに匹敵し、したがって分子量は＜２０，０００である
と計算され得る。

その後は各々約１６．０００の分子量を有する４個のサ
ブユニットから成る分子構成が認められる。

本発明の対象は更にステロイド結合性β−グロブリンを
まずこの蛋白質を測定し得る濃度で含有する体液または
組織抽出液１例えば人の血清好ましくは妊婦血液、胎盤
後血清または胎盤抽出液から単離し、次いでノイラミニ
ダーゼで処理しそして最後の精製段階において好ましく
はクロマトグラフィー陰イオン交換樹脂でのクロマトグ
ラフィーまたは相当する手段例えば電気泳動により、純
粋な形に仕上げることを特徴とするステロイド結合性グ
ロブリンの製造方法である。

ステロイド結合性β−グロブリンの単離は一方ではステ
ロイド結合性β−グープリンを富化し。

ざらに一方ではこの蛋白質を他の血漿蛋白質から分離す
る選択された方法の組合せによって行なわれる。

次に本発明のステロイド結合性β−グロブリン誘導体の
製造に適した出発物質を与える可能性を例示的に示すが
本発明はこれによって制限をうけるものではない。

細分した胎盤を水または希塩溶液、有利には約０．５係
食塩溶液を用いて抽出する。

この抽出液からアクリジン塩基の水溶性誘導体の水溶液
を添加することにより、有利にはジアミノエトキシアク
リジンラクテート（これは０．２５〜０．５５好ましく
は０．４％の濃度に達するまで溶液に添加される）を用
いてｐＨ５〜ｐＨ７の範囲の弱酸性ないし中性ｐＨ値で
好ましくはｐＨ６において初沈膜を分離するが、これは
目的とする蛋白質を含有しないかまたは痕跡量で含有す
るにすぎない。

次いでｐＨ７〜ｐＨ９のアルカリｐＨ域、有利にはｐ
Ｈ８，５において前記の最初の沈殿の上澄み液からステ
ロイド結合性β−グロブリンをアクリジン塩基の水溶性
誘導体の水溶液を加えることにより、有利にはまたジア
ミノエトキシアクリジンラクテート（これは０．５５〜
１．１１％、有利には０．８％の濃度まで溶液に添加さ
れる）を加えることにより沈殿せしめる。

この沈殿はそれを水に懸濁させた後ｐＨ値を弱酸を用い
て低下させることによって溶解させ、そして適当な吸着
剤例えば活性炭を添加することにより沈殿剤を除去しそ
して遠心分離を行なうことにより分離される。

この蛋白質からの沈殿剤の分離は沈殿をクロライド含有
水溶液、有利には約５％食塩溶液に浮遊させることによ
り特に簡単に行なわれ、その際沈殿剤は沈殿し次いで濾
過または遠心分離により除去され。

一方、蛋白質は溶液中にとどまる。

ステロイド結合性β−グロブリンを更に富化するには適
当な塩。

有利には硫酸アンモニウムを用いて塩濃度がステロイド
結合性グロブリンを溶液から排除するような方法で沈殿
を実施する。

これに対してはグロブリンは硫酸アンモニウムによって
その約５０％の飽和濃度で沈殿することが知られている
。

遠心分離または濾過により得られた沈殿を再溶解した後
。

その溶液に低級アルコール、好ましくはエタノールをス
テロイド結合性β−グロブリンは未だ沈殿りないが一連
の不純物は沈殿として分離され得るような濃度となるま
で添加する。

約２５％エタノールを添加するのが好都合であることが
判明しているが、その際、当該エタノールの添加は変性
現象を避けるために室温以下、好ましくは約０±４℃で
行なわれる。

５０，０００〜１５０，０００の分子量を有する蛋白質
を定められた範囲に富化するのに都合のよい分別法によ
りステロイド結合性β−グロブリンは更に精製され得る
。

これに対しては特にゲル濾過１例えば、エピクロルヒド
リンで交叉結合したデキストラン例えばセファデックス
（登録商標名）Ｇ−１５０（ファルマシア社製品）など
を用いたカラムクロマトグラフィー法などが特に適して
いる。

このゲル濾過は所望により希緩衝液例えばｐ Ｈ７、５
〜８．５好ましくはｐＨ８，０の０．０１Ｍトリスヒド
ロキシメチルアミンメタン−塩酸緩衝液などに対する透
析に続いて行なうこともできる。

溶出には例えば１リツトルあたりＩＭの塩化ナトリウム
を含有するｐＨ８の０．１ Ｍ トリスヒドロキシメチ
ルアミノメタン−塩酸緩衝液などを用いるこきができる
。

この溶出法によれば。約１００，０００の分子量範囲の
ステロイド結合性β−グロブリンがしばしば血漿の７−
８−γ−グロブリンの直後に溶出される。

ステロイド結合性β−グロブリンの電気的特性を利用し
て電気泳動法およびイオン交換クロマトグラフィー法も
この精製に用いることができる。

ステロイド結合性β−グロブリンは塩基性陰イオン交換
樹脂例えば交叉結合デキストラン系のジアミノエチル−
イオン交換樹脂〔市販品としではファルマシア社製のジ
アミノエチル−セファデックス（登録商標名）として入
手し得る〕などにより約４．５〜９のｐＨ範囲で吸着さ
れ、またイオン強度が徐々に増加する緩衝溶液を用いて
溶出するこ吉により前記樹脂から得ることができる。

有利には塩基性イオン交換樹脂による分別を２回行なう
。

すなわち第１回目は弱酸性ｐＨ値１例えば、Ｈ５，０に
おいでステロイド結合性β−グロブリンの吸着および分
別溶出を行ない第２回目は中性〜弱アルカリ性ｐＨ域１
例えばｐ Ｈ７、０で行なう。

特に精製操作として適するのはプレパラテイブゾーン電
気泳動であり、これは分子ふるい法と組み合わせると良
好な結果を示す。

担体を用いたゾーン電気泳動法もまた有利には２種の異
なったｐＨ域で行なわれる。

すなわち第１回目はアルカリ性ｐＨ域１例えば、Ｈ８，
６で行なわれ、その際血漿蛋白質のβ−域のゾーンが得
られる。

第２回目は弱酸性ｐＨ域１例えばｐＨ５で行なわれ、そ
の際相当するステロイド結合性β−グロブリン含有ゾー
ンが分離される。

この方法の上記の順序は強制的なものではない。

揮発性緩衝液１例えば炭酸水素アンモニウムなどを用い
て電気泳動の担体から蛋白質が溶出される場合には１次
いで目的物を直接凍結乾燥することができる。

ステロイド結合性β−グロブリンを得るために血漿を出
発物質として用いる場合、胎盤抽出液の場合ろ全く同様
にして行なうことができる。

ただ弱酸性ｐＨ域でアクリジン塩を用いて予め沈殿させ
ることは必要でないと考えられる。

本発明によるステロイド結合性β−グロブリンの誘導体
を得るには上記のまたはそれと比較し得る精製操作によ
り得られた物質を、そのｐＨ値がノイラミン酸を基質か
らノイラミニダーゼにより脱離するためのノイラミニダ
ーゼの近似至適条件に相当する緩衝液に溶解させる。

ステロイド結合性β−グロブリンのノイラミニダーゼに
よるインキュベーションはこの蛋白質のノイラミン酸含
有率が０．５±０．５％、すなわち１％以下に低下する
まで行なう。

ステロイド結合性β−グロブリンの処理には［ＥＣ，３
，２，１，１８Ｊとしで分類される糖蛋白質Ｎ−アセチ
ルノイラミニル加水分解酵素。

いわゆるノイラミニダーゼ、好ましくは微生物起源のノ
イラミニダーゼが適しており、特に細菌性ノイラミニダ
ーゼ例えばコレラ菌、肺炎双球菌またはウエルチ菌から
の相当する酵素が適する。

コレラ菌からのノイラミニダーゼを用いる場合にはイン
キュベーションを５〜７のｐＨ域好ましくはｐ Ｈ５，
５において酵素学上慣用される緩衝液中。

有利にはトリスヒドロキシメチルアミノメタンまたは酢
酸ナトリウムを用いた緩衝液中で行なう。

その際蛋白質１００ｍｇに対して５０〜５００単位のノ
イラミニダーゼを添加しまたインキュベーションは０〜
３７℃の温度域好ましくは４℃または２０°Ｃの室温で
行なわれ、その際４℃で２０時間のインキュベーション
は２０℃で５時間インキュベーションを行なう場合とほ
ぼ同じ蛋白質のノイラミン酸含有率減少すなわち約０．
５％までの減少を示す。

酵素学上周知のようにこの種の反応は極めて多様の条件
下で行なうことができ、したがって前述のノイラミニダ
ーゼ濃度よりも低いその他の濃度でもそれ相応にインキ
ュベーション時間を延長し特に温度を若干高くして酵素
賦活化剤を添加すれば同じ効果すなわちステロイド結合
性β−グロブリンからのノイラミン酸除去を達成するこ
とができる。

換言すれば本発明による前記蛋白質の誘導体を製造する
ことができる。

若干のノイラミニダーゼはアルカリ土類金属イオンによ
り活性化される。

コレラ菌からのノイラミニダーゼの活性化に特に適する
のは周知のようにカルシウムイオンであり、これは塩化
カルシウムのような水溶性塩の形で０．１〜１ｍｇ〜の
濃度においてインキュベーション溶液に添加することが
できる。

添加されるべきノイラミニダーゼの量は次に掲げる単位
の定義によって与えられる。

１ノイラミニダ一ゼ単位とは、９ｍｇ／ｍｌの食塩およ
び１ ｍ ｇ／ｍｌの塩化カルシウムを添加した、Ｈ値
５．５の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中で人のα１
−糖蛋白質から３７℃、１５分で１μｇのＮ−アセチル
ノイラミン酸を遊離させるのに必要な酵素の量である（
Ｅ、モールおよびＧ、シュラム両氏１−Ｚ、 Ｎａｔ
ｕｒｆ、 Ｊ第１５ｂ巻第５６８頁（１９６０年参照）
〕。

ノイラミン酸の除去により出発物質よりも塩基性の強く
なった蛋白質誘導体は塩基性陰イオン交換樹脂への結合
がより小さく、従って１例えばジアミノエチル−イオン
交換樹脂でのクロマトグラフィーにより残留不純物以外
に、場合によりなおも存在する未変化出発物質を除去す
ることができる。

本発明による新規誘導体の電荷特性番こより、不純物の
分離を電気泳動法によっても行なうことが可能となる。

ステロイド結合性β−グロブリンの誘導体を含有する溶
出液は、濃縮し、透析し、そして変性現象を伴なうこと
なく凍結乾燥され得るステロイド結合性グロブリンは電
気泳動分析では１本の線を与え、超遠心分離では一つの
バンドを与える。

それはもとの蛋白質と同様に、ステロイド結合性β１−
グロブリンに対する抗血清と反応する。

それはもとの蛋白質と同様にステロイド特にテストステ
ロンおよびエストラジオールと結合する。

本発明により製造される蛋白質誘導体は、一方では純粋
な抗原を、他方ではその純粋な抗原を用いて免疫して得
られる特定の抗血清をステロイド結合性β−グロブリン
の測定法に用いることができるという診断上の意義を有
する。

この方法によれば、ステロイド代謝の障害または血漿中
または組織中のステロイド結合性β−グロブリン含有量
の変化を１例えば疾病の進行中に確認し且つ追跡するこ
とが可能である。

次に本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。

実施例 胎盤からのステロイド結合性β−グロブリンの単離 １０ｋｇの人胎盤を深冷状態で細分し１０１の０．５％
塩化ナトリウム溶液を用いて抽出する（５℃で１時間）
。

次に記載する操作はすべて、特に他に記載のない限り４
°Ｃで行なわれる。

使用緩衝液にけ滅菌維持のために０．０５％ｗ／ｖナト
リウムアジドを添加する。

前記抽出液１Ｍを２０％酢酸を用いてｐＨ６，０に調整
し、そしてまず１５００ｍｌの３％６，９−シアミツ−
２−エトキシアクリジンラクテート溶液（「アクリジン
塩溶液」）と混合する。

その不活性前沈殿を遠心分離により分離し捨てる。

上澄み液を２Ｎ−水酸化ナトリウム溶液でｐ Ｈ８，５
に調整し３１のアクリジン塩溶液を用いて沈殿させる。

ステロイド結合性グロブリンを含有する沈殿を遠心分離
する。

液状上澄み液を捨て沈殿を６１の５％塩化ナトリウム溶
液中に懸濁させる。

生ずる沈殿を遠心分離により除去後、その上澄み液に固
体硫酸アンモニウムを５０％飽和まで添加する。

その際沈殿が生ずるが、これを遠心分離する。

遠心分離物として得られた湿った硫酸アンモン含有ペー
スト（２５０ｇ）を水１０００ｍｇに溶解し、脱イオン
水に対して透析し、付随蛋白質の一部を分離するために
、ｐＨ７，０，１０ｍ５の伝導度（５％食塩溶液で調節
）および０℃の温度でエタノールを２５％の濃度となる
まで混合する。

その除虫ずる沈殿を遠心分離により除去して排棄し。

主要量のステロイド結合性β−グロブリンを含有する上
澄み液を水に対して透析しそして凍結乾燥する。

ｐ Ｈ７、０の０．０１Ｍトリスヒドロキシメチルアミ
ンメタン−ＨＣｌ緩衝液を使用するセファデックスＧ−
１５０（２０Ｘ１００ｃｍカラム）によるゲル濾過によ
り更に精製を行なう。

溶出液中のステロイド結合性β−グープリンの証明は免
疫学的に、特定の抗血清を用いてゲル拡散試験により行
なわれる。

陽性フラクション１４００ｍ１をプールし、更にクロマ
トグラフィー精製するれめにジアミノエチル−セファデ
ックスのカラム（５Ｘ ２０ｃｍ）に吸着させる。

ジアミノエチル−セファデックスのカラムからの蛋白質
の溶出は０〜２％の食塩勾配を利用して０．０１Ｍトリ
スヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ緩衝液を用い
て行なわれる。

溶出液中のステロイド結合性β−グロブリンの証明は同
様に免疫学的に行なわれる。

ステロイド結合性β−グロブリン含有フラクションを合
しく９００ｍ１）３５％ｗ／ｖ硫酸アンモニウムを用い
て沈殿させる。

その除虫ずる沈殿を遠心分離により集め、その沈殿を水
に溶解し、まず水に対し、次いでｐ Ｈ８，６の０．１
Ｍナトリウムジエチルパルピッレート緩衝液に対し透
析する。

透析物の蛋白質を更に電場で分離するためにハイデ氏（
１９６４年）の記載した装置および方法を実施する。

不活性担体としてはポリ塩化ビニル（「Ｇｅｏｎ（登録
商標名）」×４２７、グツドリッチ社製品）を使用し、
緩衝液としては０．１Ｍナトリウムジエチルパルピッレ
ート溶液（ｐＨ８，６）を用いる。

ステロイド結合性β−グロブリンはβ１−ゾーンを移動
しそこから数倍の容量の担体と共に０．９％食塩溶液に
より溶出され、塩を水に対して透析することによって除
去した後、硫酸アンモン（３５％ｗ／ｖ ）を用イて沈
殿させる。

その沈殿をｐ Ｈ５，０のトリスヒドロキシメチルアミ
ノメタン−ＨＣＡ緩衝液５００ｍ１に溶解しそしてｐ
Ｈ５，０の０．０１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメ
タン−ＨＣｌ緩衝液に対して透析する。

次いで、その溶液を、前記と同じ緩衝液（ｐＨ５，０）
で平衡化されたジアミノエチル−セファデックスカラム
（５×２５ｃｍ）に通す。

蛋白質の一部はステロイド結合性β−グロブリンと共に
カラムに吸着されてとどまり、また次いで０〜２％の直
線的食塩勾配を用いて溶出され得がステロイド結合性β
−グロブリンを含有する溶出液を合し、中和り、４０％
ｗ／ｖ硫酸アンモニウムを添加することにより沈殿させ
る。

次の、ｐＨ５，０におけるプレパラテイブ・ゾーン電気
泳動のためにＧｅｏｎ Ｘ ４２７のような担体を使
用し。

緩衝液としではｐ Ｈ５，０の０．１５Ｍ酢酸ナトリウ
ム溶液を用いる。

ステロイド結合性β−グロブリンはこのｐＨで陽極的に
移動し、またそれは生理学的食塩溶液により相当するゾ
ーンから溶出され。

該溶液の中和後４０％（ｗ／ｖ ）硫酸アンモニウムの
添加により沈殿する。

ステロイド結合性β−グロブリンは上記と同じ方法によ
り血清、特に胎盤後血清から得ることができる。

これには１分別のための出発物質として前述の実施例に
対応して１０１の組織抽出液に代えて５１の血清を用い
、これを５１の蒸留水で希釈する。

ステロイド結合性β−グロブリンのノイラミニダーゼ処
理 ノイラミン酸を除去するためには、１５０ｍｇのステロ
イド結合性β−グロブリンを、１ｍｇあたりＣａＣ１１
２０°２ｍｇを含有するｐＨ５，５の０．０１Ｍトリス
ヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液３０ｍ１に溶解し
そしてコレラ菌からのノイラミニダーゼ５００単位を用
いて４℃で２０時間インキュベートする。

次いでその変性させた蛋白質をｐＨ５，５の０．０１Ｍ
トリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ緩衝液を
用いてジアミノエチル−セファデックス（２，５× ２
０ｃｍ）でのクロマトグラフィーにより精製する。

その際ステロイド結合性β−グロブリンの誘導体は妨害
されることなくカラムを通過し、一方出発物質中にまだ
存在する不純物は吸着されてとどまる。

前記の蛋白質含有溶出液をコロジオンカートリッジ（ザ
ルトリウス・メンブランフィルタ−社製品）内で濃縮し
、水に対し充分に透析し次いで凍結乾燥する。

以下に本発明の要旨ならびに実施の態様の代表例を示す
。

１、 （ａ） ステロイドホルモンに対する顕著な親
和性、 （ｂ） １０．４±２．６％の炭水化物含有率〔但し
、そのうちヘキソース５．８±１．２％、ヘキソサミン
（Ｎ−アセチル−へキンサミンとして計算）４．０±０
．８％、ノイラミン酸（Ｎ−アセチル−ノイラミン酸と
して計算）０．５±０．５％、およびフコース０，１±
０．１％〕。

（ｃ） ステロイド結合性β−グロブリンに対する抗
血清による沈殿性。

（ｄ） ｒ−グロブリンに相当する電気泳動における
易動度。

（ｅ） ｐ Ｈ６、８のホスフェート緩衝液中で測定
された沈降定数４．１±１．Ｏ８゜ （ｆ）１％ナトリウムドデシルサルフェート溶液中で測
定された沈降定数１．１±０．３８゜および （ｇ） 分子量６５，０００±５，０００を特徴とす
るステロイド結合性グロブリン。

２、次に掲げる性質、すなわち （ａ） ステロイドホルモンに対する顕著な親和性。

（ｂ） １２．５±３％の炭水化物含有率〔但し、そ
のうちヘキソース５．７±１．２％、ヘキソサミン（Ｎ
−アセチル−へキン。

サミンとして計算）３．９±ｏ、ｓ％、ノイラミン酸（
Ｎ−アセチル−ノイラミン酸として計算）２．９±０．
９％。

およびフコース０．１±０．１％〕。

（ｃ） 特異抗血清による沈殿性。

（ｄ） β１−グロブリンに相当する電気泳動におけ
る易動度。

（ｅ） ｐ Ｈ６、８のホスフェート緩衝液中で測定
された沈降定数４．１±ｉ、ｏｓ。

（ｆ）１％ナトリウムドデシルサルフェート溶液中で測
定された沈降定数１．１±０．３８゜および （ｇ） 分子量６５，０００±５，０００を有するス
テロイド結合性β−グロブリンをノイラミニダーゼで処
理しそして精製段階において好ましくはイオン交換クロ
マトグラフィーまたは電気泳動により、純粋な形になす
ことを特徴とする前記第１項によるステロイド結合性グ
ロブリンの製造方法。

３、ステロイド結合性β−グロブリンをノイラミニダー
ゼで当該蛋白質のノイラミン酸含有率が０．５±０．５
％まで低下するまで処理することを特徴とする前記第２
項の方法。

４、ステロイド結合性β−グロブリンを微生物性ノイラ
ミニダーゼで当該酵素の反応に最適なｐＨ域、有利には
ｐＨ５〜７のｐＨ域で処理することを特徴とする前記第
２項の方法。

５、ステロイド結合性β−グープリンを、コレラ菌から
のノイラミニダーゼを用いてｐ Ｈ５，５において、蛋
白質１００ｍｇあたりノイラミニダーゼ５０〜５００単
位の割合で、０〜２０℃好ましくは４℃において５〜２
０時間処理し、その際、長いインキュベーション時間に
対してはより低い温度を、また短いインキュベーション
時間に対しては相応して高い温度を用いることを特徴と
する前記第２項の方法。

６、出発物質として用いられるステロイド結合性β−グ
ロブリンを、この蛋白質を測定し得る濃度で含有する体
液または組織抽出液９例えば人の血清、好ましくは妊婦
血清、胎盤後血清または胎盤抽出液などから単離するこ
とを特徴とする前記第２項の方法。

７、 （ａ） 体液または組織抽出液から、望まし
くない蛋白質をｐＨ５〜７のｐＨ域で、水溶性アクリジ
ン誘導体を溶液の０．２５〜０．５５％の濃度となるま
で添加して沈殿させ。

（ｂ） この沈殿の上澄み液からステロイド結合性β
−グロブリンを、水溶性アクリジン誘導体を溶液の０．
５５〜１．１％の濃度となるまで添加することによりｐ
Ｈ７〜ｐＨ９のアルカリ性ｐｎ域で沈殿させ。

（ｃ） （ｂ）からの沈殿を水に溶解しそしてこの溶
液からグロブリンを適当な塩を用いて新たに沈殿させ。

（ｄ） （ｃ）からの沈殿を水に溶解しそしてその溶
液から更に不純物を低級アルコールを用いて分離除去し
。

（ｅ） ５０，０００〜１５０，０００の分子量を有
する蛋白質を定められた範囲に富化するのに適した分別
方法により分子量範囲を１００，０００以下で富化し。

（ｆ） この範囲内に生ずるステロイド結合性β−グ
ロブリンを塩基性イオン交換樹脂でのクロマトグラフィ
ーにより弱酸性およぶ中性〜弱アルカリ性域で吸着およ
び溶出し、そしてゾーン電気泳動法においてアルカリ性
ｐＨ域で血漿蛋白質のβ−域ゾーンとしておよび弱酸性
ｐＨ域で相当する。

ステロイド結合性グロブリン含有ゾーンを得る ことにより出発物質として用いられるステロイド結合性
β−グロブリンを得ることを特徴とする前記第２〜６項
の方法。

８、前記第１項によるステロイド結合性グロブリンの診
断用試薬としての使用。

９、前記第１項によるステロイド結合性グロブリンの抗
血清取得のための使用。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次の性質 （ａ） ステロイドホルモンに対する顕著な親和性。 （ｂ）１２．５±３％の炭水化物含有率〔但し、そのう
   ちヘキソース５．７±１．２％、ヘキソサミン（Ｎ−ア
   セチル−へキソサミンとして計算）３．９±０．８％、
   ノイラミン酸（Ｎ−アセチル−ノイラミン酸として計算
   ）２．９±０．９％、およびフコース０．１±０．１％
   〕、 （ｃ） 特異抗血清による沈殿性。 （ｄ） β１−グロブリンに相当する電気泳動におけ
   る易動度、 （ｅ） ｐ Ｈ６、８のホスフェート緩衝液中で測定
   された沈降定数４．１±１．０８ （４）１％ナトリウムドデシルサルフェート溶液中で測
   定された沈降定数１．１±０．３８および（ｇ） 分
   子量６５，０００±５，０００を有するステロイド結合
   性β−グロブリンをノイラミニダーゼで処理し１次いで
   精製することを特徴とする。 （ａ） ステロイドホルモンに対する顕著な親和性。 （ｂ）１０．４±２．６％の炭水化物含有率（但し、そ
   のうちヘキソース５．８±１．２％、ヘキソサミン（Ｎ
   −アセチル−へキソサミンとして計算）４．０±０．８
   ％、ノイラミン酸（Ｎ−アセチル−ノイラミン酸として
   計算）０．５±０．５％およびフコース０．１±０．１
   ％）。 （ｃ） ステロイド結合性β−グロブリンに対する抗
   血清による沈殿性、 （ｄ） ｒ−グロブリンに相当する電気泳動における
   易動度。 （ｅ） ｐＨ６，８のホスフェート緩衝液中で測定さ
   れた沈降定数４６１±ｉ、ｏｓ。 （ｆ）１％ナトリウムドデシルサルフェート溶液中で測
   定された沈降定数１．１±０．３８およびｉｇ） 分
   子量６５，０００±５，０００の特性を有するステロイ
   ド結合性グロブリンの製法。