DE2353973A1 - Steroid-bindendes globulin und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Steroid-bindendes globulin und verfahren zu dessen herstellung

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Description

BEHHrNGWEHKEAKTIENGESELLSCIIAFT, Marburg (Lahn)
Aktenzeichen: Hoe 73/017 Ma 183
Datum: ?5. Oktober 1973 Dr. Li/Fo
Steroid-bindendes Globulin und Verfahren zu dessen - " .
Herstellung - - -- . - . · - .
Gegenstand der Erfindung ist ein Steroid-bindendes Globulin, welches ein Derivat des Steroid-bindenden ß-Globulins ist sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung aus dem Steroidbindenden !!-Globulin durch Behandlung mit dem Enzym Neuraminidase. :
Es ist bekannt, dass unter den als ß-Globuline bezeichneten Plasmaproteinen ein EiweisskÖrper, vorkömmt, der eine be—-sondere Affinität zu Steroidhormonen besitzt und deshalb als Steroid-bindendes ß-Globulin bzw. Testosteron-bindendes Globulin bezeichnet'wird. Es wurde bereits vorgeschlagen, (P 2221261.9 Hoe 72/b 007 = Ma 151) dieses auch als ß^AP-Glykoprotein bezeichnete Protein aus Plazenten oder aus dem Blut von Schwangeren zu isolieren. Es ist Jedoch bisher nicht gelungen, dieses ß-Globulin in reiner Form darzustellen. Das hat insbesondere den Nachteil, dass bei der Gewinnung von Antiserum, das gegen dieses Protein gerichtet ist, die Verunreinigungen, auch wenn sie in noch so geringer Konzentration vorkommen, in den immunisierten Tieren ebenfalls zur Antikorperbildung führen und dadurch unspezifische Reaktionen der Antiseren bedingen. .- "
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Es wurde nun ein Derivat des Steroid-bindenden ß-Globulins gefunden, das durch die Behandlung dieser Substanz mit dem Enzym N_euraminidase entsteht und das in sehr reiner Form hergestellt werden kann. Dieses Derivat im folgenden "Steroid-bindendes Globulin" genannt, entspricht in seinen biologischen Eigenschaften weitgehend dem ursprünglichen Steroid-bindenden ß-Globulin, insbesondere ist von damit immunisierten Tieren ein Antiserum hoher Spezifität zu gewinnen.
Gegenstand der Erfindung ist demgemäss ein Derivat 'des Steroidbindenden ß-Globulins, ein Glykoprotein mit einer besonderen Affinität zu Steroidhormonen. Die Summe aller Kohlenhydrate dieses Steroid-bindenden Globulins beträgt 10,4 + 2,6% (nach der Bestimmungsmethode von H.E. Schultze et al. (1958), Biochem. Z. 329, S. 490), davon 5,8 + 1,2% Hexosen, 4,0 + 0,8%
/ N-acetyl ~ ~
Hexosamin (berechnet als/Hexosamin), 0.5 + 0,5% Neuramin-
, N-acetyl ■ -
säure (berechnet als/Neuraminsäure) und 0,1 + 0,1% Fucose, womit die Kohlenhydrat-Analyse mit Ausnahme des Neuraminsäure-Gehalts. derjenigen entspricht, wie sie für das Steroid-bindende ß-Globulin erstellt werden kann. Das neue Globulin wird durch ein gegen das Steroid-bindende ß-Globulin gerichtetes Antiserum präzipitiert. Die elektrophoretische Beweglichkeit entspricht der eines Gainmaglobulins. Das in Phosphatpuffer bei pH 6,8 gelöste erfindungsgemässe Protein zeigt in der Utrazentrifuge eine Sediroentationskonstante von 4,1+1,OS. In 1%iger Natriumdodezylsulfatlösung sedimentiert das Protein mit 1,1 + 0,3 S. In einem Dodezylsulfat-haltigen Polyacrylamidgel wandert das erfindungsgemässe Protein im elektrischen- Spannungsfeld mit oder etwa schneller als Albumin, woraus sich ein Molekulargewicht von 65.000 + 5.000 ableiten lässt. Nach Inkubation des Proteins vor der Auftrennung in einer 1%igen Natriumdodezylsulfatlösung wird eine Wanderungsstrecke der Proteinzone gemessen, die mit humanem Plazenten-
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laktogen vergleichbar ist, wodurch ein Molekulargewicht von <20.000 kalkulierbar ist. Demnach ist ein Molekülaraufbau aus A Untereinheiten, die Molekulargewicht von jeweils etwa 16.000 besitzen, anzunehmen. *ein
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren, zur Herstellung, des Steroid-bindenden Globulins, dadurch gekennzeichnet, dass Steroid-bindendes ß-Globulin-zuerst aus Körperflüssigkeiten oder Gewebeextrakten, die dieses Protein in messbaren Konzentrationen enthalten, beispielsweise aus menschlichen Seren, vorzugsweise aus dem Blut von Schwangeren, Retroplazentarserum oder Plazentenextrakten isoliert, danach mit Neuraminidase behandelt und in einem abschliessenden Reinigungsschritt, vorzugsweise durch Chromatographie, an einem Anionenaustauscher oder durch eine entsprechende Maßnahme, z.B. durch eine Elektrophorese in reiner Form dargestellt wird.
Die Isolierung des Steroid-bindenden ß-Globulins erfolgt durch eine ausgewählte Kombination von Methoden, die einerseits zur Anreicherung des Steroid-bindenden ß-Globulins, andererseits zur Abtrennung dieses Proteins von den übrigen Plasmaproteinen führt. Ohne dass daraus eine Einschränkung herzuleiten wäre, sollen im folgenden Möglichkeiten beispielhaft aufgezeigt werden, die ein zur Herstellung des Derivats des Steroidbindenden ß-Globulins geeignetes Ausgangsmaterial liefern.
Dazu werden zerkleinerte Plazenten mit Wasser oder einer verdünnten Salzlösung, vorteilhaft mit einer etwa 0,5%igen.Kochsalzlösung, extrahiert. Aus dem Extrakt wird durch Zusatz einer wässrigen Lösung eines wasserlöslichen Derivats einer Akridinbase, vorteilhaft mit Diaminoäthcxyakridinlaktat, das bis zu einer Konzentration von 0,25 bis 0,55, vorteilhaft
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von 0,4% der Lösung zugegeben wird, bei schwach saurem bis neutralem pH-Wert im Bereich von pH 5 bis pH 7, vorteilhaft bei pH 6, eine Vorfällung abgetrennt, die das gewünschte Protein nicht oder nur in Spuren enthält.
Anschliessend wird im alkalischen pH-Bereich von pH 7 bis pH 9, vorteilhaft bei pH 8,5, aus dem Überstand der ersten Fällung das Steroid-bindende ß-Globulin durch Zusatz einer wässrigen Lösung eines wasserlöslichen Derivats einer Akridinbase, vorteilhaft wiederum mit Diaminoathoxyakrxdinlaktat, das bis zu einer Konzentration von 0,55 bis 1,1%, vorteilhaft von 0,8% der Lösung zugesetzt wird, präzipitiert. Der Niederschlag wird nach dessen Suspension in Wasser und anschliessender Erniedrigung des pH-Wertes mit Hilfe von schwachen Säuren in Lösung gebracht und durch Zugabe von geeigneten Adsorptionsmitteln, z.B. Aktivkohle, vom Fällungsmittel befreit und durch Zentrifugation abgetrennt. Besonders einfach erfolgt die Abtrennung des Fällungsmittels vom Protein durch Aufschwemmung der Fällung in einer chloridhaltigen wässrigen Lösung, vorteilhaft in einer etwa 5%igen Kochsalzlösung, wobei das Fällungsmittel präzipiert und danach durch Filtration oder Zentrifugation entfernt wird, während die Proteine in Lösung gehen. Zur weiteren Anreicherung des Steroid-bindenden ß-Globulins wird eine Fällung mit geeigneten Salzen, vorteilhaft mit Ammoniumsulfat, in der Weise durchgeführt, dass die Konzentration des Salzes das Steroid-bindende Globulin aus der Lösung verdrängt. Hierzu ist bekannt, dass Globuline von Ammoniümsulfat bei dessen Sättigungskonzentration von etwa 50% präzipitiert werden.' Nach Wiederauflösen des durch Zentrifugation oder Filtration gewonnenen Präzipitats wird zu der Lösung ein niedriger Alkohol, vorteilhaft Äthanol, bis zu einer Konzentration zugesetzt, bei der das Steroid-
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bindende ß-Globulin noch nicht niedergeschlagen, eine Reihe von Verunreinigungen jedoch als Fällung abgeschieden werden kann. Ks hat sich als zweckmässig erwiesen, etwa 25% Äthanol zuzufügen, wobei die Zugabe des Äthanols zur Vermeidung von Denaturierungserscheinungen unterhalb Raumtemperatur,^ vorzugswt.'i se Ii β i. einer Temperatur um 0 + 4°C erfolgt. Durch FraktionierungsmeLhoden, die Proteine mit Molekulargewichten zwischen 50.000 und 150.000 in definierten Bereichen anzureichern im Stande sind, kann das Steroid-bindende ß-Globulin weitergereinigt werden. Besonders geeignet sind hierfür Maßnahmen der Gelfiltration, beispielsweise Saulenchromatographie-Schritte unter Verwendung von mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran, beispielsweise Sephadex® G-1150 der Firma Pharmacia, Uppsala. Die Gelfiltration kann gewünschtenfalls auch im Anschluss an eine Dialyse gegen eine verdünnte Pufferlösung, z.B. gegen 0,01 molare Trishydroxymethylaminoraethan-Salzsäure-Pufferlösung von pH 7,5 bis 8,5, vorzugsweise pH 8,0, durchgeführt werden. Zur Elutionkann beispielsweise 0,1 molarer Trishydroxymethylaminomethan-Salzsäurepuffer vom pH-Wert 8 dienen, der pro Liter 1 M Natriumchlorid enthält. Bei diesem Elutionsverfahren wird das Steroid-bindende ß-Globulin in dem Bereich der Molekulargewichte von etwa 10.0.000., häufig unmittelbar nach dem 7-S-Gammaglobulin des Plasmas, eluiert.
Unter Ausnutzung der elektrischen Eigenschaften des Steroidbindenden ß-Globulins lassen sich zu dessen Reinigung jedoch auch Elektrophorese-Maßnahmen und Schritte: der Ionenaustausch-Chromatographie einsetzen. Das Steroid-bindende ß-Globulin wird von basischen Anionenaustauschern, beispielsweise von Diamindäthyl-Austauschern auf der Basis von vernetztem Dextran, im Handel als Diaminoäthyl-Sephadex'8' der Firma Pharmacia, Uppsala, erhältlich, im pH-Bereich von etwa4,5 bis
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9 adsorbiert und ist davon durch Elution mit Pufferlösungen steigender Tononstärke zu gewinnen. Vorteilhaft werden 2 D'raktionierungen an basischen Ionenaustauschern ausgeführt, einmal durch Adsorption und fraktionierte Elution des Steroidbindenden ß-Globulins bei schwach saurem pH-Wert, beispielsweise pH 5,0, und ein zweites Mal in neutralem bis schwach alkalischem pH-Bereich, beispielsweise pH 7,0.
Besonders geeignet als Reinigungsoperation ist die präparative Zorienelektrophorese, die in Kombination mit Molekularsiebver— fahren gute Erfolge zeigen.
Auch das zonenlektrophoretxsche Verfahren mit Hilfe von Trägersubstanzen wird vorteilhaft in zwei verschiedenen pH-Bereichen durchgeführt, einmal im alkalischen pH-Bereich, beispielsweise pH 8,6, wobei die Zone des ß-Bereichs der Plasmaproteine gewonnen wird und das andere Mal im schwach sauren pH-Bereich, beispielsweise pH 5, wobei die entsprechende, das Steroidbindende ß-Globulin enthaltende Zone herausgeschnitten wird. Die Reihenfolge dieser Maßnahme ist dabei nicht zwingend.
Wird die Elution des Proteins aus dem Trägermaterial der Elektrophorese mit einem flüchtigen Puffer, beispielsweise Ammoniumhydrogencarbonat, vorgenommen, lässt sich eine Gefriertrocknung des Verfahrensprodukts direkt anschliessen.
Bei Verwendung von Plasma als Ausgangsmaterial für die Gewinnung von Steroid-bindendem ß-Globulin kann genau so verfahren werden wie beim Plazentenextrakt. Es erscheint lediglich die Vorfällung mit Akridinsalzen im schwach sauren pH-Bereich nicht erforderlich.
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Zur Gewinnung des erfindungsgemässen Derivats de#Steroidbindenden f3-Globulins. wird die nach den oben beschriebenen oder vergleichbaren Reinigungsoperationen erhaltene Substanz in einem Puffer gelöst, dessen pH-Wert den angenähert optimalen Bedingungen der Neuraminidase für die Abspaltung der Neuraminsäure aus dem Substrat durch Neuraminidase entspricht.
Die Inkubation des Steroid-bindenden ß-Globulins mit Neuraminidase v/ird so lange durchgeführt, bis der Neuraminsäure-Gehalt dieses Proteins auf 0,5 + 0,5%, also weniger als Λ%,~ abgesunken ist.
Für die Behandlung von Steroid-bindendem ß-Globulin sind Glykoprotein N-acetylneuraminylhydrolasen, klassifiziert unter EC. 3-2-1·18, sogenannte Neuraminidasen vorzugsweise mikrobiellen Ursprungs geeignet, insbesondere bakterielle Neuraminidasen wie die entsprechenden Enzyme aus Vibrio cholerae, Pneümokokken oder Clostridium perfringens. Bei Verwendung einer Neuraminidase aus Vibrio eholerae wird die Inkubation im pH-Bereich 5 bis-7» vorzusweise bei pH 5,5, in einem in der Enzymologie gebräuchlichen Puffer, vorteilhaft in einer Pufferlösung aus Trishydroxymethylaminomethan oder Natriumacetat, durchgeführt. Dabei werden auf 100 mg Protein 50-500 Einheiten Neuraminidase zugesetzt, und die Inkubation wird im Temperaturbereich O-37°C, vorzugsweise 40C oder bei Zimmertemperatur von 200C, durchgeführt, wobei 20 Stunden "bei 4°C etwa die gleiche Verringerung des Neuraminsäuregehalt© des Proteins, nämlich auf etwa 0,5%, zeigen wie 5 Stunden bei 20°C. /
Wie jedem Enzymologen bekannt, sind Reaktionen dieser Art unter den verschiedensten Bedingungen durchzuführen, so dass auch mit einer anderen, niedrigeren als angegebenen Kon —
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zentration an Neurajninidase bei entsprechend längerer Inkubationsdauer, insbesondere bei etwas erhöhten Temperaturen und Zusatz von Aktivatoren des Enzyms, der gleiche Effekt, nämlich die Entfernung der Neuraminsäure aus dem Steroidbindenden ß-Globulin, erreicht werden kann, mit anderen Worten, das erfindungsgemässe Derivat dieses Proteins hergestellt v/erden kann. Einige Neuraminidasen werden durch Erdalkaliionen aktiviert. Besonders geeignet für die Aktivierung der Neuraminidase aus Vibrio cholerae sind bekanntlich Calciumionen, die in Form von wasserlöslichen Salzen wie Calciumchlorid in einer Konzentration von '0,1 bis 1 mg/ml der Inkubationslösung zugesetzt werden können. Die Menge der einzusetzenden Neuraminidase ist durch folgende Definition der Einheiten gegeben:
Eine Neuraininidase-Einheit ist die Menge des Enzyms, die benötigt wird, um 1 Mikrogramm N-acetylneuraminsäure aus humanem c^j-Glykoprotein in 0,05 molaren Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 5,5 mit dem Zusatz von 9 mg/ml Kochsalz und 1 mg/ml Calciumchlorid in 15 Min. bei 37°C freizusetzen (E. Mohr und G. Schramm, Z.Naturf. 15b, S. 568, 1960).
Das durch die Neuraminsäure-Abspaltung gegenüber dem Ausgangsmaterial stärker basisch gewordene Proteinderivat wird weniger an basische Anionenaustauscher gebunden und ist deshalb durch eine Chromatographie an beispielsweise Diaminoäthyl-Ionenaustauscher von restlichen Verunreinigungen und auch von eventuell noch vorhandenem unverändertem Ausgangsmaterial zu befreien.
Die Ladungseigenschaft des neu gewonnenen Derivats erlaubt die Abtrennung der Verunreinigungen auch auf elektrophoretischem Wege. Die das Derivat des Steroid-bindenden ß-Globulins ent-
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haltenden Eluate können konzentriert, dialysiertundohne Denaturierungserscheinigungen lyophllisiert werden.
Das Steroid-bIndene Globulin liefert in der elektrophoretischen Analyse eine einheitliche Linie, in der Ultrazentrifugen-Analyse eine einheitliche Bände. Es reagiert mit Antiserum gegen das flteroid-bindende ß. -Globulin wie das ursprüngliche Protein. Es bindet wie das ursprüngliche Protein Steroide, insbesondere Testosteron und Östradiol.
Das erfindungsgemäss hergestellte Pröteinderivat hat eine diagnostische Bedeutung dadurch, dass einerseits das reine Antigen, andererseits das durch Immunisierung mit'dem reinen Antigen gewonnene spezifische Antiserum in Bestimmungsmethoden für Steroid-bindendes ß-Globulin eingesetzt werden kann. Diese Methoden erlauben, Störungen des Steroid-Haushalts bzw. Änderungen im Gehalt des Steroid-bindenden ß-Globulin in Plasma oder Geweben z.B. im Verlauf von Krankheiten festzustellen und zu verfolgen.
Die Erfindung wird im nachfolgenden Beispiel näher erläutert.
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Beispiel
Isolierung des Steroid-bindenden ß-Globulins aus Plazenten:
10 kg menschliche Plazenten werden in tiefgefrorenem Zustand zerkleinert und mit 10 Liter einer 0,5%igen Natriumchloridlösung extrahiert (1 Stunde bei 5°C). Alle im nachfolgenden beschriebenen Operationen werden, soweit nichts anderes vermerkt ist, bei A-0C durchgeführt. Den verwendeten Pufferlösungen ist zur Sterilhaltung 0,05% w/v Natriumazid zugesetzt,
10 Liter der Extraktionslösung werden mit 20%iger Essigsäure auf pH 6,0 eingestellt und zunächst mit 1500 ml einer 3%igen 6,9-Diamino-2-Äthoxyakridinlaktat-Lösung ("Akridinsalz-Lösung") versetzt. Die inaktive Vorfällung wird durch Zentrifugation abgetrennt und verworfen. Der' Überstand wird mit 2 normaler Natriumhydroxidlösung auf pH 8,5 eingestellt und mit 3 Liter Akridinsalzlösung gefällt. Die Fällung, die das Steroid-bindende Globulin enthält, wird zentrifugiert. Der flüssige Überstand wird verworfen, der Niederschlag wird in 6 1 einer 5%igen Natriumchloridlösung suspendiert. Nach Abzentrifugation der aufgetretenen Fällung wird dem Überstand festes Ammoniumsulfat bis zu einer 50%igen Sättigung zugefügt. Dabei bildet sich ein Niederschlag, der abzentrifugiert wird.
Die als Zentrifugat erhaltene feuchte, ammonsulfathaltige Paste (250 g) wird in 1000 ml Wasser gelöst, gegen deionisiertes Wasser dialysiert und zur Abscheidung eines Teils der Begleitproteine bei pH 7,0, einer Leitfähigkeit von 10 mS (Einstellung mit einer 5%igen Kochsalzlösung) und einer Temperatur von O0C mit Äthanol bis zu einer Konzentration von 25% versetzt. Den dabei entstehende Niederschlag zentrifugiert man ab und verwirft ihn; der Überstand, der die Hauptmenge des Steroid-bindenden ß-Globulins enthält,
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wird gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Die Weiterreinigung erfolgt durch Gelfiltration an Sephadex® G-150 (Säule 20 χ 100 cm) unter Verwendung eines 0,01 m Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffers pH 7,0. .
Der Nachweis des Steroid-bindenden ß-Globulins in den Eluaten wird immunologisch, mit einem spezifischen Antiserum im Geldiffusionstest durchgeführt. Die positiven Fraktionen 1400 ml werden gepoolt und zur weiteren chromatographisehen Reinigung an einer Diaminoäthyl-Sephadex®-Säule (5x20cm) adsorbiert. .
Die Elution der Proteine von der Diaminoäthyl-Sephadex^-Säule erfolgt mit 0,01 m Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffer unter Verwendung eines Kochsalzgradienten von 0-2%. Der Nachweis des Steroid-bindenden ß-Globulins im Eluat wird wieder immunologisch geführt; die das Steroid-bindende ß-Globulin enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, 900 ml, und mit 35% w/v Ammoniumsulfat gefällt. Die sich dabei ausbildende Fällung wird durch Zentrifugation gewonnen und der Niederschlag in Wasser aufgelöst, zuerst gegen Wasser und anschliessend gegen 0,1 m Natriumdiäthylbarbituratpuffer von pH 8*6 dialysiert. Die weitere Auftrennung der Proteine des Dialysats; : im elektrischen Feld erfolgt mit der von Heide et al. (1964) beschriebenen Apparatur und Methode; als inertes Trägermaterial dient Polyvinylchlorid (Geon® X 427), Hersteller Goodrich Chem. Comp., Cleveland/Ohio, USA, als Puffer wird eine 0,1 m Natriumdiäthylbarbituratlösung (pH 8,6) verwendet.Das Steroid-bindende ß-Globulin wandert in der ß^-Zone; es wird daraus mit dem mehrfachen Volumen des Trägers mit 0,9%iger Kochsalzlösung eluiert und nach Entfernung der SaIzC durch Dialyse gegen Wasser mit Ammonsulfat (35% w/v) gefällt.
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Die Fällung wird in 500 ml Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffe.r pH f3,0 aufgelöst und gegen einen 0,01 m Trishydroxymethylaminomuthan-IICl-Puffer pH 5,0 dialysiert. Anschliessend lässt man die Lösung über eine Diaminoäthyl-Sephadex®-Säule (5 x 25 cm) laufen, die mit dem gleichen Puffer (pH 5,0) equilibriert worden war. Ein Teil der Proteine bleibt zusammen mit dem Steroid-bindenden ß-Globulin an der Säule adsorbiert und kann dann unter Anwendung eines linearen Kochsalzgradienten von 0-2% eluiert werden. Die Eluate, die das Steroidbindende ß-Globulin enthalten, werden vereinigt, neutralisiert und durch Zusatz von 40% w/v Ammoniumsulfat präzipitiert. Für die anschliessende präparative Zonenelektrophorese bei pH 5,0 ist das Trägermaterial wieder Geon X 427; als Puffer wird eine 0,15 m Natriumazetatlösung von pH 5,0 verwendet. Das Steroid-bindende ß-Globulin wandert bei diesem pH anodisch; es wird mit physiologischer Kochsalzlösung aus der entsprechenden Zone eluiert und nach Neutralisiation der Lösung durch Zusatz von 40% (w/v) Ammoniumsulfat ausgefällt.
Steroid-bindendes ß-Globulin kann auf die gleiche Weise aus Serum, insbesondere Retroplazentarserum gewonnen werden. Dazu wird als Ausgangsmaterial für die Fraktionierung entsprechend dem vorstehenden Beispiel statt 10 Liter Gewebeextrakt 5 Liter Serum eingesetzt, das mit. 5 Liter destilliertem Wasser verdünnt wird.
Neuraminidasebehandlung des Steroid-bindenden ß-Globulins:
Zur Abspaltung der Neuraminsäure werden 150 mg Steroid-bindendes ß-Globulin in 30 ml 0,01 m Trishydroxymethylaminomethan-Puffer von pH 5,5, der 0,2 mg CaCIp pro ml enthält, gelöst und mit 500 Einheiten Neuraminidase aus Vibrio cholerae 20 Stunden bei 4°C inkubiert. Anschliessend reinigt man
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das modifizierte Protein durch Chromatogaphie an Diaminoäthyl-Sephadex^ (2,5 χ 20 cm) unter Verwendung eines 0,01 in Trishydroxymethylamlnomethan-HCl-Puffers vom pH 5,5. Das Derivat des Steroid-bindenden ß-Globulins wandert dabei ungehindert durch die Säule hindurch, während die im Ausgangs-, material noch vorhanden gewesenen Verunreinigungen adsorbiert bleiben. Das proteinhaltige Eluat wird Inreiner^ Kollodiumhülse (Sartorius-Membranf111er-Geseilschaft) eingeengt, gründlich gegen Wasser dialysiert und dann lyophllisiert.
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Claims (8)

  1. - 14 - . Ma 183
    Patentansprüche
    Steroid-bindendes Globulin gekennzeichnet durch
    (a) eine besondere Affinität zu Steroidhormonen,
    (b) einen Gehalt an Kohlenhydraten von 10,4 + 2,6%,
    davon 5,8 + 1,2% Hexosen, 4,0 + 0,8% Hexosamin, berechnet als N-acetyl-Hexosamin ,. 0,5 + 0,5% Neuraminsäure,berechnet als N-acetyl-Neuraminsäure, und 0,1 + 0,1% Fucose,
    (c) die Präzipitierbarkeit mit gegen Steroid-bindendes ß-Globulin gerichteten Antiseren,
    (d) eine elektrophoretische Beweglichkeit entsprechend dem Gammaglobulin,
    (e) eine Sedimentationskonstante von 4,1 + 1,0 S gemessen in Phosphatpuffer bei pH 6,8,
    (f) eine Sedimentationskonstante von 1,1 + 0,3 S gemessen in 1%iger Natriumdodezylsulfatlösung und
    (g) ein Molekulargewicht von 65.000 + 5.000.
  2. 2. Verfahren zur Herstellung des Steroid-bindenden Globulins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Steroidbindendes ß-Globulin mit folgenden Eigenschaften:
    (a) eine besondere Affinität zu Steroidhormonenj
    (b) einen Gehalt an Kohlenhydraten von 12,5 + 3%, davon 5,7 + 1,2% Hexosen, 3,9 + 0,8% Hexosamin, berechnet als N-acetyl-Hexosamin, 2,9 + 0,9% Neuraminsäure, berechnet als N-acetyl-Neuraminsäure, und 0,1 + 0,1% Fucose, rf
    (c) die Präzipitierbarkeit mit spezifischen Antiseren,
    (d) eine elektrophoretische Beweglichkeit entsprechend den ß^-Globulinen,
    (e) eine Sedimentationskonstante von 4,1 + 1,0 S gemessen in Phosphatpuffer bei pH 6,8,
    (f) eine Sedimentationskonstante von 1,1 + 0,3 S gemessen in 1%iger Natriumdodezylsulfatlösung und
    (g) ein Molekulargewicht von 65-000 + 5.000.
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    mit Neuraminidase behandelt und in einem Reinigungsschritt • vorzugsweise durch Ionenaustausch-Chromatographie oder. Elektrophorese in reiner Form darstellt.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Steroid-bindendes ß-Globulin mit Neuraminidase bis zum Absinken des Neuraminsauregehalts des Proteins auf 0,5 + 0,5% "behandelt wird. _ ". -
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Steroid-bindendes ß-Globulln mit einer mikrobiellen Neuraminidase'im pH-Bereich des ReaktionsOptimums des Enzyms vorteilhaft von pH 5 bis 7 behandelt wird.
  5. 5- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Steroid-bindendes ß-Globulin mit Neuraminidase aus Vibrio cholerae bei pH 5,5 im Verhältnis von 50-5,00 Einheiten Neuraminidase pro 100 mg Protein bei 0.20 G, . " ν vorzugsweise A0C, während 5-20 Stunden behandelt wird, wobei der langen Inkubationsdauer niedrige Temperaturen und der kurzen Inkubationsdauer entsprechend höhere Temperaturen zuzuordnen sind.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das als Ausgangsmaterial dienende Steroid-bindende ß-Globulin aus Körperflüssigkeiten oder Gewebeextrakten, die dieses Protein in meßbaren Konzentrationen enthalten, wie menschliche Seren, vorzugsweise aus dem Blut von Schwangeren, Retroplazentenserum oder Plazentenextrakten isoliert wird.
    Ma 183 - 16 -
  7. 7. Verfahren nach Ansprüchen 2-6, dadurch gekennzeichnet, dass das als Ausgangsstoff dienende Steroid-bindende Globulin.erhalLon wird, indem man
    (a) aus Körperflüssigkeiten oder Gewebeextrakten nicht gewünschte Proteine im pH-Bereich von pH 5 bis pH. 7 mit einem wasserlöslichen Akridinderivat, das bis zu einer Konzentration von 0,25 bis 0,55% der Lösung zugegeben wird, ausfällt,
    (b) aus dem Überstand dieser Fällung das Steroid-bindende ß-Globul.in durch ein wasserlösliches Akridinderivat, das bis zu einer Konzentration von 0,55 bis 1,1% der Lösung zugegeben wird, im alkalischen pH-Bereich von pH 7 bis pH 9 ausfällt,
    (c) den Niederschlag aus (b) in Wasser auflöst und aus dieser Lösung das Globulin mit geeigneten Salzen erneut präzipitiert,
    (d) das Präzipitat aus (c) in Wasser löst und aus' der Lösung mit einem niedrigen Alkohol weitere Verunreinigungen abscheidet und verwirft,
    (e) durch Fraktionierungsmethoden, die Proteine mit Molekulargewichten zwischen 50.000 und 150.000 in definierten Bereichen anzureichern im Stande sind, den Bereich der Molekulargewichte, unterhalb 100.000 anreichert,
    (f) das in diesem Bereich anfallende Steroid-bindende ß-Globulin durch Chromatographie an basischen Ionenaustauschern im schwach sauren und im neutralen bis schwach alkalischen Bereich adsorbiert und eluiert und in zonenelektrophoretischen Verfahren im alkalischen pH-Bereich als Zone des ß-Bereichs der Plasmaproteine und im schwach sauren pH-Bereich die entsprechende, das Steroid-bindende Globulin enthaltende Zone gewinnt.
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  8. 8. Verwendung des Steroid-bindenden Globulins nach Anspruch 1 als diagnostisches Reagenz.
    9· Verwendung dos Steroid-bindenden Globulins nach Anspruch 1 zur· Gewinnung von AnLi seren. ;
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1064396A (en) * 1975-02-18 1979-10-16 Myer L. Coval Fractional precipitation of gamma globulin with polyethylene glycol
US4165370A (en) * 1976-05-21 1979-08-21 Coval M L Injectable gamma globulin
DE2640387C3 (de) * 1976-09-08 1981-01-22 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Gewebespezifisches Protein und Verfahren zu dessen Herstellung
DE2718326A1 (de) * 1977-04-25 1978-10-26 Behringwerke Ag Neues protein und verfahren zu dessen herstellung
US4230684A (en) * 1978-03-16 1980-10-28 Cornell Research Foundation, Inc. Method for determining steroids in human body liquids
DE3013724A1 (de) * 1980-04-10 1981-10-15 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Neues protein pp (pfeil abwaerts)9(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner anreicherung und gewinnung sowieseine verwendung
KR0123107B1 (ko) * 1992-02-27 1997-11-12 아끼야마 요시히사 연소배기가스중의 2산화탄소의 제거방법

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