TW202402306A - 在IVT期間減少dsRNA形成及/或增加加帽效率之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明屬於核酸製造之領域，尤其係關於試管內RNA轉錄。更具體言之，本發明係關於用於在試管內轉錄反應期間減少雙股RNA（dsRNA）之形成的方法，更尤其藉由於低於7.5的pH下及使用特定量的鎂來進行試管內轉錄反應。本發明進一步關於可藉由根據本發明的方法獲得的經試管內轉錄RNA組成物。

Description

在IVT期間減少dsRNA形成及/或增加加帽效率之方法
本發明屬於核酸製造之領域，尤其係關於試管內RNA轉錄。更具體言之，本發明係關於用於在試管內轉錄反應期間減少雙股RNA（dsRNA）之形成及／或增加加帽效率的方法，更尤其藉由於低於7.5的pH下及使用特定量的鎂來進行試管內轉錄反應。本發明進一步關於可藉由根據本發明的方法獲得的經試管內轉錄RNA組成物。
基於RNA的治療法之出現需要強固且經濟的方法以製造RNA同時使源於異常活性的副產物很少。使用噬菌體T7 RNA聚合酶的試管內轉錄係如此受歡迎的方法之一，該等方法較佳使用含有啟動子的經純化線性DNA模板、核糖核苷酸三磷酸（NTP）、核糖核酸酶抑制劑、焦磷酸酶、鎂離子、適合的噬菌體RNA聚合酶、及pH緩衝劑。轉錄反應中使用的確切條件取決於特定應用所需的RNA之量。用於RNA試管內轉錄的方法於發明所屬技術領域中係已知的（參見例如WO200204439）。
傳統IVT反應之一個重要缺點係於合成程序期間某些副產物之存在或產生，包括雙股RNA（dsRNA），其等觸發細胞免疫反應。因此，當合成供尋求最小化細胞免疫反應的活體內應用之用的mRNA時，自mRNA製劑排除此等dsRNA污染物或減少dsRNA形成係較佳的。數種依靠於完成IVT反應後移除副產物的方法已被敘述過，其中諸如基於層析術的純化方法的分析性純化係最主要的方法。雖然有效率，此方法於mRNA合成流程中導致額外的步驟、涉及特殊儀器配置、往往與反應之擴大規模不相容、可能降低RNA產量、且阻礙方法之成本效益。與合成後純化相反，於IVT反應期間預防dsRNA形成係更有成本效益的方法。
本發明之發明人已出人意料地發現特殊量的鎂及IVT反應之pH之降低（低於通常使用者）之組合導致試管內合成期間dsRNA形成之形成之減少或預防。尤其，本發明敘述用於在試管內轉錄反應期間減少dsRNA形成的方法，其包含於低於7.5但不低於5.0的pH下及於至少超過24 mM的Mg濃度下進行該試管內轉錄反應。
於此等條件下進行IVT反應之主要優點係於合成程序期間dsRNA形成顯著減少同時維持高RNA產量。例如，當IVT反應係於pH 8.0及24 mM的Mg下進行時，相較於使用超過24 mM Mg及於較低的pH（諸如例如pH 7.0）下進行IVT反應，dsRNA量明顯較高。此外，於低於7.5的pH下，dsRNA量穩定於±0.6 µg/mgRNA量的低水平。
此外，本發明之方法之第二有利功效係其提供經轉錄RNA之更有效率的加帽程序。例如，若IVT反應係在帽類似物存在下於低於7.5的pH（諸如約pH 7.0）下進行，大約97%的所轉錄RNA分子在其等之5’端上帶有帽結構，相較之下當IVT反應係於pH 8.0下進行時係80%。減少未加帽RNA之量可藉由增加IVT反應中的加帽劑之濃度完成（大約95%加帽效率）但藉由調整IVT反應之pH效率更高（大約99%加帽效率）（且較不昂貴）。因此，本發明提供一種針對兩個特別技術問題的解決方案，該等技術問題係於RNA之合成程序期間以有成本效益的方式減少dsRNA形成及增加加帽效率。
RNA試管內轉錄中使用的一般緩衝系統包括4-(2-羥基-乙基)-1-哌乙磺酸（HEPES）及參(羥甲基)胺基-甲烷（Tris）。對於RNA之試管內轉錄的最優pH一般被認為是在7.7與8.3之間（Chamberlin & Ring, 1972）。於Kartje等人2021之另一研究中，研究了7.3至8.3的pH範圍，並得到以下結論：在此範圍內的變化對產量影響極小但產量似乎於7.9的pH下最高（Kartje等人, 2021）。一些一般使用的試管內轉錄緩衝劑包含80 mM HEPES/KOH，pH 7.5及40 mM Tris/HCl，pH 7.5加上低濃度的Mg（低於24 mM）。總而言之，傳統IVT反應係於7.5至大約8.3的pH下及在低濃度的Mg存在下進行以回收足夠的RNA產量但非為了減少dsRNA形成或增加加帽效率的目標而使用。本發明提供一種用於在RNA之合成程序期間以有成本效益的方式減少或預防dsRNA形成及／或同時增加加帽效率的解決方案，其係藉由於低於7.5的pH下組合至少超過24 mM的Mg濃度來進行該IVT反應。
於第一方面，本發明提供一種用於在試管內轉錄反應期間減少雙股RNA（dsRNA）形成的方法，其包含於低於7.5但不低於5.0的pH下及在至少24 mM的鎂存在下進行該試管內轉錄反應。
於一進一步實施方式中，該試管內轉錄反應係於低於7.0但不低於5.0，更佳低於6.7，最佳約6.5的pH下進行。
於另一實施方式中，該試管內轉錄反應係於約及在5.0與約7.5之間，更佳約及在5.0與7.0之間，甚至更佳約及在5.0與6.7之間的pH下進行。
於一特別實施方式中，該試管內轉錄反應係於約及在5.0與6.5之間的pH下進行。
於一特別實施方式中，鎂之濃度係約及在24 mM至約100 mM之間，較佳約及在30 mM與約80 mM之間，更佳約及在35 mM與約70 mM之間，最佳約55 mM。
於另一特別實施方式中，鎂之濃度係至少約40 mM，較佳至少約45 mM，更佳至少約50 mM。
於又另一特別實施方式中，鎂係呈選自包含氯化鎂（MgCl 2）、醋酸鎂（MgOAc 2）之群的形式。
於一進一步實施方式中，該試管內轉錄反應係於至少37°C，較佳至少約40°C，更佳至少約41°C下，甚至更佳於45°C的溫度下進行。
於一特別實施方式中，該試管內轉錄反應於濃度約及在0.5至約20 mM之間，較佳約及在1與15 mM之間，更佳約及在2與10 mM之間，最佳約5 mM的5’帽類似物存在下進行。
於另一特別實施方式中，該試管內轉錄反應係在濃度約及在2與20 mM之間，較佳約及在3與15 mM之間，更佳約及在4與10 mM之間，最佳約5 mM的天然存在的或經修飾核苷三磷酸（NTP）存在下進行。
於一特別實施方式中，該試管內轉錄反應之帽類似物對比NTP的比例係約1:4，更佳至少約1:3，甚至更佳至少約1:2。
於本發明之方法之另一實施方式中，該試管內轉錄反應係在至少一種選自包含以下者的列表的pH緩衝劑存在下進行：參(羥甲基)胺基甲烷（Tris）、TAPS（[參(羥甲基)甲基胺基]丙磺酸）、Bicine（2-(雙(2-羥乙基)胺基)醋酸）、Tricine（N-[參(羥甲基)甲基]甘胺酸）、TAPSO（3-[N-參(羥甲基)甲基胺基]-2-羥基丙磺酸）、HEPES（4-(2-羥乙基)-1-哌乙磺酸）、TES（2-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]乙磺酸）、MOPS（3-(N-啉基)丙磺酸）、MOPSO（3-(N-啉基)-2-羥基丙磺酸）、MOBS（4-(N-啉基)丁磺酸）、PIPES（哌-N,N′-雙(2-乙磺酸)）、Cacodylate（二甲基砷酸）、MES（2-(N-啉基)乙磺酸）、BTM（雙-三甲烷）、BTP（雙-三丙烷）、ADA（N-(胺甲醯基甲基)亞胺基二醋酸）、ACES（N-(2-乙醯胺基)-2-胺基乙磺酸）、BES（N,N-雙(2-羥乙基)-2-胺基乙磺酸）、HEPPSO（β-羥基-4-(2-羥乙基)-1-哌丙磺酸一水合物）、POPSO（哌-N,N′-雙(2-羥基丙磺酸)）、TEA（N,N-二乙基乙胺）、EPPS（N-(2-羥乙基)哌-N-(3-丙磺酸)）、DIPSO（3-(N,N-雙[2-羥乙基]胺基)-2-羥基丙磺酸）、NaHCO 3/CO 2緩衝劑、或其等之任何組合。
於一本發明之方法之特別實施方式中，該試管內轉錄反應係在HEPES存在下進行。
於另一特別實施方式中，於試管內轉錄反應中的緩衝劑之濃度係約及在1 mM至約200 mM之間，較佳約及在5 mM與約150 mM之間，更佳約及在10 mM與約100 mM之間，最佳約50 mM。
於本發明之又另一實施方式中，該試管內轉錄反應係在焦磷酸酶存在下進行；尤其，其中該焦磷酸酶之濃度係約及在0.01 U/ml至約40 U/ml之間，較佳約及在0.1 U/ml與約20 U/ml之間，更佳約及在1 U/ml與約10 U/ml之間，最佳約5 U/ml。
現將進一步敘述本發明。於以下段落，更詳細地定義本發明之不同方面。可組合所定義的各方面與任一或多個其他方面，除非明確指示相反者。尤其，可組合任何指出為較佳或有利的特徵與任一或多個指出為較佳或有利的其他特徵。
用於本說明書及所附申請專利範圍中，單數形式「一（「a」和「an」）」及「該」包括複數所指事物，除非前後文另有明確規定。舉例而言，「一種化合物」意味一種化合物或超過一種化合物。
用於本文中，術語「包含（「comprising」、「comprises」、及「comprised of」）與「包括（「including」及「includes」）」或「含有（「containing」及「contains」）」同義且係包容性的或開放式的且不排除另外的未列舉成員、元件、或方法步驟。此術語亦涵蓋「由...組成」及「基本上由...組成」。
用於本文中，當指可測量的值（諸如參數、量、持續時間、等等）時，術語「約」或「大約」意欲涵蓋所明確指出的值之+/-10%或更小，較佳+/-5%或更小，更佳+/- 1 %或更小，且又更佳+/-0.1 %或更小的變異或距離所明確指出的值+/-10%或更小，較佳+/-5%或更小，更佳+/- 1 %或更小，且又更佳+/-0.1 %或更小的變異，其程度為如此變異於所揭露的發明中適合執行。應了解修飾語「約」或「大約」所指的值本身亦被明確地（且較佳地）揭露。術語「至多」係指最大量，而「至少」一般指最小值。「至多」意味任何小於或等於所呈現數字的數字皆係可接受的或係真實的。而「至少」或「少於」意味任何包括且分別大於或小於所陳述數字的數字皆係可能的。例如，當提及至少24 mM的濃度時，其意味24mM或超過24.0 mM。
本發明係關於一種用於在IVT反應期間減少dsRNA之形成的方法。本發明進一步關於一種可藉由根據本發明的方法獲得的經純化經試管內轉錄RNA組成物。本發明之發明人已出人意料地發現藉由於低於通常使用者的pH水平下進行IVT反應，dsRNA副產物形成可以有成本效益的方式減少。尤其，本發明敘述一種用於減少dsRNA形成的方法，其藉由於低於7.5的pH（相較於7.5至大約8.3的傳統pH水平）下進行IVT反應。此製造IVT RNA的方法之主要優點係dsRNA之60-90%的減少同時所製造RNA之產量及完整性不受損。此外，所述方法與用於包括以下者的不同類型的mRNA的製造程序相容：未加帽RNA、CAP-0及CAP-1（例如Cleancap）RNA、核苷經修飾RNA（例如N1-甲基假尿苷）、RNA、或有或無多腺苷酸尾的RNA。本發明之方法之另一優點係於轉錄RNA之程序之期間加帽效率可增加。
於第一方面，本發明提供一種用於在試管內轉錄反應期間減少雙股RNA（dsRNA）形成的方法，其包含於低於7.5的pH下進行該試管內轉錄反應。於一特別實施方式中，本發明提供一種用於在試管內轉錄反應期間減少雙股RNA（dsRNA）形成的方法，其包含於低於7.5但不低於5.0的pH下及在至少24 mM的鎂存在下進行該試管內轉錄反應。
對於在45°C下於pH 6.5下在55 mM MgCl 2存在下進行的IVT反應，獲得了極低量的dsRNA。
於本發明之前後文中，術語「減少（「reducing」或著「to reduce」）」意味「減少（「lessen」）」、「減少（「decrease」）」、「最小化」、或「減少（「diminish」）」dsRNA之形成。據此，當一樣本於試管內轉錄後於正常情況下會含有一特別量的dsRNA時，術語「減少」意味當使該樣本經歷本發明之方法時該dsRNA之量較少。尤其，當與正常情況相比時，dsRNA之量較佳減少達至少10%，諸如至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%。
於本發明之前後文中，術語「形成」意味於該試管內轉錄反應中dsRNA之「出現」、「發展」、「起源」、或「產生」。具體言之，於試管內轉錄後獲得的分子典型包含dsRNA，而吾人已鑑認出於低於7.5的pH下進行IVT反應導致如此dsRNA之形成減少。
於本發明之前後文中，術語「增加（「increasing」或著「to increase」）」意味「提高」、「增強」、「促升」、或「加強」加帽效率。據此，當一樣本於試管內轉錄後於正常情況下會含有一量的經轉錄經加帽RNA時，術語「增加」意味當使該樣本經歷本發明之方法時該經加帽RNA之量較高。尤其，當與正常情況相比時，經加帽RNA之量較佳增加達至少10%、諸如至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%。
於本發明之前後文中，術語「RNA」係關於一種分子，其包含核糖核苷酸殘基且較佳完全或實質上由核糖核苷酸殘基構成。「核糖核苷酸」係關於一種核苷酸，其於β-D-核呋喃糖基之2’位置具有羥基。尤其，此術語係指雙股RNA，但亦可指單股RNA、經分離RNA，諸如經部分純化RNA、基本上純的RNA、合成RNA、重組生產的RNA、以及與天然存在的RNA差異在於一或多個核苷酸核苷或鹼基（諸如經修飾嘌呤或經修飾嘧啶）之添加、缺失、取代、及／或改變的經修飾RNA。如此改變可包括將非核苷酸物質添加（諸如）至RNA之末端或內部，例如於該RNA之一或多個核苷酸。RNA分子中的核苷酸亦可包含非標準核苷酸，諸如非天然存在的核苷酸或化學合成的核苷酸或去氧核苷酸。此等經改變RNA可稱為類似物或天然存在的RNA之類似物。
根據本發明，術語「RNA」包括且較佳係關於「mRNA」，其意味「傳訊RNA」且係關於「轉錄本」，其可使用DNA作為模板來生產且編碼胜肽或蛋白質。mRNA典型包含5’非轉譯區（5’-UTR）、蛋白質或胜肽編碼區、及3’非轉譯區（3’-UTR）。在細胞中及試管內，mRNA之半生期有限。為清楚起見，mRNA涵蓋任何編碼性RNA分子，其等可由真核宿主轉譯成蛋白質。
術語「經修飾mRNA分子」意味含有一或多個經修飾核苷的mRNA分子（稱為「經修飾核酸」），其具有有用特性，諸如mRNA被導入至其中的細胞之先天性免疫反應之實質誘發之缺乏。此等經修飾核酸增強蛋白質製造之效率、核酸之細胞內滯留、及所接觸細胞之生存力、以及具有減少的致免疫性。例示性的適合的經修飾核苷可例如係N1-甲基假尿苷。
較佳，mRNA係使用諸如DNA模板的核酸模板藉由試管內轉錄生產。於本發明之一個實施方式中，RNA係藉由試管內轉錄獲得。試管內轉錄方法學對於發明所屬技術領域中具有通常知識者而言係已知的且可包含含有啟動子的經純化線性DNA模板、核糖核苷酸三磷酸（NTP）、視需要包含二硫蘇糖醇（DTT）及／或鎂離子的緩衝系統、及／或亞精胺及適合的RNA聚合酶，諸如T7 RNA聚合酶。轉錄反應中使用的確切條件取決於特殊應用所需的RNA之量。存在各種各樣可商購的試管內轉錄套組。
於本發明之前後文中，術語「雙股RNA」或「dsRNA」意味任何具有足夠的內部同源性以形成明顯二級結構（諸如髮夾）的RNA分子，該明顯二級結構係源自內部互補序列彼此間或不同股間透過互補序列內的核苷酸鹼基之Watson-Crick鹼基配對的雜交。明顯二級結構一般包括大於大約九個鹼基的同源性延伸，但確切長度某種程度上取決於前後文及如此二級結構是否賦予該分子任何生物功能。尤其，於試管內轉錄後獲得的分子典型包含具有兩個分開的互補股且大小變化可為例如20個核苷酸至200個核苷酸或甚至超過500個核苷酸的dsRNA。
於本發明之前後文中，dsRNA以IVT反應中鑑認到的副產物的形式形成，其可源自T7 RNA依賴性RNA聚合酶活性。尤其，IVT反應中三種主要類型的副產物可能導致dsRNA分子之形成。第一種由以順式（藉由在相同RNA分子上摺疊回去）或反式（與第二RNA分子貼合）方式與跑離（run-off）轉錄本之主體中的互補序列貼合以形成延伸的雙股的跑離產物之3’延伸形成。第二種dsRNA分子由反義RNA分子與跑離轉錄本之雜交形成。已報導過反義RNA分子以獨立於啟動子及獨立於跑離轉錄本的方式形成。或者，亦已報導過全長反義RNA之獨立於啟動子的轉錄於T7 RNAPol驅動性IVT反應中為新穎的dsRNA產生之機制。第三種dsRNA源自不完全（abortive）轉錄本之順式（即在相同分子內）或反式（二個不同分子間）的隨機配對。根據本發明，dsRNA涵蓋任何類型的所述IVT反應中的RNA副產物。
用於偵測dsRNA的方法基本上依賴免疫學方法，諸如免疫螢光法、ELISA、免疫轉漬，以及獨立於抗體的方法，諸如核酸螢光原位雜交（FISH）或基於纖維素的dsRNA分離亦已經用於dsRNA偵測。如於本文中使用及如於實施例中敘述，免疫學方法（諸如抗dsRNA J2抗體免疫轉漬）使用抗體作為專一性辨認dsRNA採取的A螺旋結構的結構探針。可商購的J2抗dsRNA IgG2a（以及較低程度上IgG2a K1及IgM K2 mAb或9D5 mAb）已成為dsRNA偵測中的黃金標準。此外，可使用完整質譜測定術以定量不同的3’端延伸dsRNA物種之豐度及長度。
於一特別實施方式中，當與正常情況相比時，於IVT反應後RNA之完整性未受損或較佳增加達至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或甚至更高。RNA之完整性可藉由任何適合的方式測量，諸如藉由毛細管電泳峰輪廓，其可在生物分析儀上獲得。具體言之，於本文中進行的實驗中未觀察到顯著降解（ 圖 3）且對於7.5或更高的傳統pH而言，相較於低於7.5的pH，峰輪廓幾乎相同。
於一特別實施方式中，該試管內反應可在pH緩衝劑、帽類似物、核糖核苷三磷酸（NTP）、核酸模板、及RNA聚合酶存在下進行。該試管內反應可進一步在一或多種鎂鹽、一或多種核糖核酸酶抑制劑、焦磷酸酶、一或多種抗氧化劑、及一或多種胺及／或多胺存在下進行。
發明所屬技術領域中具有通常知識者已知用於RNA之IVT反應的最優pH一般被認為係7.7與8.3（Chamberlin & Ring, 1972）。一些尖端技術轉錄緩衝劑具有7.5的pH且其等包含一量的緩衝劑，諸如HEPES或Tris及24 mM的鎂濃度。高產量轉錄緩衝劑之另一實例可包含30 mM HEPES、40 mM醋酸鎂、25 mM麩胺酸鉀、0.25 mM EDTA、0.05% Tween20，pH 7.8、10單位/ml焦磷酸酶之最終濃度。據此，轉錄緩衝劑包含至少一種緩衝劑以維持反應混合物之pH。
發明人所得的一極令人意外的觀察結果係當IVT反應於低於通常使用者的pH水平下進行時，尤其是當組合高於通常使用者的鎂濃度進行時，dsRNA形成減少。更具體言之，當IVT反應於pH 8.0及24 mM鎂下進行時，相較於在24 mM鎂的濃度下及於pH 7.5或更低，諸如例如pH 7.0、6.5、6.0、5.5、或5.0下進行的IVT反應，dsRNA量明顯較高。此外，於低於7.5的pH下，dsRNA量穩定於±0.6 µg/mg RNA量的低水平。
於本發明之前後文中，術語pH或著pH條件意味於整個IVT反應期間使用的恆定pH。此例如係藉由向反應添加pH緩衝劑來達成。發現到於正常IVT反應期間，pH傾向於整個反應期間變化。因為此可能對包括產量及dsRNA形成的種種參數有影響，本發明之目標為於整個反應期間保持pH恆定，以使得可保持此等參數之較佳控制。
於一進一步實施方式中，該試管內轉錄反應係於低於7.0但不低於5.0，更佳低於6.7，最佳約6.5的pH下進行。
於一特別實施方式中，該試管內轉錄反應係於低於7.5，諸如例如低於7.4、低於7.3、低於7.2、低於7.1、低於7.0、低於6.9、低於6.8、低於6.7、低於6.6、低於6.5、低於6.4、低於6.3、低於6.2、低於6.1、或低於6.0的pH下進行。
於另一實施方式中，該試管內轉錄反應係於約及在5.0與約7.5之間，更佳約及在5.0與7.0之間，甚至更佳約及在5.0與6.7之間的pH下進行。
於一特別實施方式中，該試管內轉錄反應係於約及在5.0與6.5之間的pH下進行。
於又另一實施方式中，該試管內轉錄反應係於約及在5.5與約7.5之間，更佳約及在5.5與7.0之間，甚至更佳約及在5.5與6.7之間的pH下進行。
於又另一實施方式中，該試管內轉錄反應係於約及在6.0與約7.5之間，更佳約及在6.0與7.0之間，甚至更佳約及在6.0與6.7之間的pH下進行。
於一特別實施方式中，該試管內轉錄反應係於約5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9的pH值下進行。於一特別實施方式中，該試管內轉錄反應係於較佳約6.0、約6.5、或約6.7的pH值下進行。
本發明之目標為於IVT反應期間減少dsRNA形成而此係藉由於低於7.5的pH下，更尤其於約及在5.0與7.4之間的pH下，甚至更尤其於約及在5.0與6.5之間的pH下進行IVT反應來達成。
於一些實施方式中，反應混合物之pH係藉由至少一種緩衝劑來維持。於本發明之前後文中，應將術語「緩衝劑（「buffering agent」或「buffer agent」）理解成一種弱酸或鹼，其用於在添加另一種酸或鹼後將一溶液之酸度（pH）維持在靠近一所選值。因此，緩衝劑之功能係當酸或鹼被加至溶液時預防pH之快速改變。據此，藉由使用至少一種緩衝劑，IVT反應之pH大致恆定，意味pH顯示諸如所具體指明的pH值之+/-10%或更小，較佳+/-5%或更小，更佳+/-1%或更小，且又更佳+/-0.1%或更小或距離所具體指明的pH值之+/-10%或更小，較佳+/-5%或更小，更佳+/-1%或更小，且又更佳+/-0.1%或更小的微小改變。
於一特別實施方式中，反應混合物之pH係於IVT反應開始時藉由至少一種緩衝劑來維持。
於另一實施方式中，一旦IVT反應已開始，則可進一步維持反應混合物之pH。尤其，pH可於IVT反應之任何部分期間諸如例如於約10、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、…分鐘的培養後進一步調整。
於另一實施方式中，反應混合物之pH係藉由超過一種緩衝劑（諸如例如二種、三種、四種、五種、等等緩衝劑之組合）來維持。
於本發明之方法之另一實施方式中，該試管內轉錄反應係在至少一種選自包含以下者的列表的pH緩衝劑存在下進行：參(羥甲基)胺基甲烷（Tris）、TAPS（[參(羥甲基)甲基胺基]丙磺酸）、Bicine（2-(雙(2-羥乙基)胺基)醋酸）、Tricine（N-[參(羥甲基)甲基]甘胺酸）、TAPSO（3-[N-參(羥甲基)甲基胺基]-2-羥基丙磺酸）、HEPES（4-(2-羥乙基)-1-哌 乙磺酸）、TES（2-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]乙磺酸）、MOPS（3-(N-啉基)丙磺酸）、MOPSO（3-(N-啉基)-2-羥基丙磺酸）、MOBS（4-(N-啉基)丁磺酸）、PIPES（哌 -N,N’-雙(2-乙磺酸)）、Cacodylate（二甲基砷酸）、MES（2-(N-啉基)乙磺酸）、BTM（雙-三甲烷）、BTP（雙-三丙烷）、ADA（N-(胺甲醯基甲基)亞胺基二醋酸）、ACES（N-(2-乙醯胺基)-2-胺基乙磺酸）、BES（N,N-雙(2-羥乙基)-2-胺基乙磺酸）、HEPPSO（β-羥基-4-(2-羥乙基)-1-哌丙磺酸一水合物）、POPSO（哌-N,N’-雙(2-羥基丙磺酸)）、TEA（N,N-二乙基乙胺）、EPPS（N-(2-羥乙基)哌-N-(3-丙磺酸)）、DIPSO（3-(N,N-雙[2-羥乙基]胺基)-2-羥基丙磺酸）、NaHCO 3/CO 2緩衝劑、或其等之任何組合。
用於本文中，可使用能夠將pH調整至IVT係於其下進行的所欲水平的任何類型的pH緩衝劑。於RNA IVT反應中使用以維持適合的pH值的常見pH緩衝劑包括HEPES及Tris。緩衝劑物質可進一步包含用於調整pH的酸或鹼，諸如於參(Tris-HCl)的例子中的HCl及於HEPES（HEPES-KOH）的例子中的KOH。
於一本發明之方法之特別實施方式中，該試管內轉錄反應係在HEPES存在下進行。
於本發明之方法之另一特別實施方式中，該試管內轉錄反應係在TRIS存在下進行。
於另一特別實施方式中，該試管內轉錄反應中的緩衝劑之濃度係約及在1 mM至約200 mM之間，較佳約及在5 mM與約150 mM之間，更佳約及在10 mM與約100 mM之間，最佳約50 mM。
於一特別實施方式中，該試管內轉錄反應中的緩衝劑之濃度係約31 mM、32 mM、33 mM、34 mM、35 mM、36 mM、37 mM、38 mM、39 mM、40 mM、41 mM、42 mM、43 mM、44 mM、45 mM、46 mM、47 mM、48 mM、49 mM、50 mM。
於一特別實施方式中，該試管內轉錄反應中的緩衝劑之濃度係約及在1 mM至約75 mM之間，較佳約及在5 mM與約50 mM之間，更佳約及在10 mM與約30 mM之間，最佳約20 mM。
於一特別實施方式中，該試管內轉錄反應中的緩衝劑之濃度係約5 mM、6 mM、7 mM、8 mM、9 mM、10 mM、11 mM、12 mM、13 mM、14 mM、15 mM、16 mM、17 mM、18 mM、19 mM、20 mM、21 mM、22 mM、23 mM、24 mM、25 mM、26 mM、27 mM、28 mM、29 mM、30 mM。
為獲得具有適當完整性及產量的全長轉錄本，用於普通IVT反應的培養時間係自短至10分鐘變化但對於最佳結果而言係自30分鐘至二小時變化。以下者係通常已知的：較長的培養時間會增加所合成RNA之總產量。如於 圖 1顯示的，RNA累積於大約150分鐘的培養時間時開始穩定。於RNA在反應體積中累積的時段之期間（培養之0至±150分鐘），觀察到pH逐漸降低。一旦RNA之累積停止，pH訊號同樣變穩定。
於一些實施方式中，該試管內轉錄反應之培養時間係至少30分鐘，諸如例如至少60分鐘、至少90分鐘、至少120分鐘、至少150分鐘、至少180分鐘、至少210分鐘。於另一實施方式中，該IVT反應之培養時間係約及在60分鐘與90分鐘之間。
於一特別實施方式中，該試管內轉錄反應之培養時間係約及在30分鐘與約240分鐘之間，較佳約及在80分鐘與約180分鐘之間，更佳約及在70分鐘與120分鐘之間，最佳90分鐘。發明所屬技術領域中具有通常知識者會理解到反應時間會取決於所使用的酶之量。尤其，使用較高濃度的酶會減短培養時間而較低濃度的酶會延長培養時間。因此，本文中使用的培養時間可係大約90分鐘或（於使用約一半的酶濃度的例子中）大約180分鐘。
使用高於37°C的培養溫度對於減少dsRNA之形成而言係有利的。於一進一步實施方式中，該試管內轉錄反應係於至少37°C，較佳至少約38°C、39°C、40°C，更佳至少約41°C、42°C、43°C、44°C下，甚至更佳於45°C的溫度下進行。於另一實施方式中，該IVT反應之溫度係約及在37°C與50°C之間，較佳約及在40°C與47°C之間，更佳約及在42°C與46°C之間，甚至更佳約及在43°C與45°C之間。
緩衝劑可進一步與最優濃度的抗氧化劑（例如二硫蘇糖醇（DTT））、鎂及／或鉀鹽、及／或多胺，諸如亞精胺組合。對於最優的酶活性，反應緩衝劑可包含新鮮的DTT。經氧化緩衝劑可能導致低產量及／或低mRNA品質，其中截短的轉錄本之製造增加。
為進一步增強dsRNA形成之減少，可組合低pH與經優化濃度的鎂。藉由調整該IVT反應之酸度並組合最優濃度的鎂，可達成dsRNA形成之更好的減少。
於一特別實施方式中，該試管內轉錄反應係在至少24 mM鎂存在下進行。
用於本文中且除非另外具體指出，應將術語「鎂」或「Mg」理解成對於所有已知活生物之所有細胞之基本核酸化學而言係基本的化學元素。許多酶對於其等之催化作用而言需要鎂離子，包括使用或合成ATP的酶及使用其他核苷酸以合成DNA及／或RNA者。根據本發明，Mg 2+離子係由所述鎂形式之任何者提供且對於催化由例如RNA聚合酶，諸如T3、T7、SP6、焦磷酸酶、及DNA水解酶I驅動的反應而言係必須的。據此，此組分必須於整個反應期間提供且對於該等酶具有特殊功能且因此影響IVT產量。
於另一特別實施方式中，鎂之濃度係至少約40 mM，較佳至少約45 mM，更佳至少約50 mM。
於另一特別實施方式中，鎂之濃度係約及在24 mM至約100 mM之間，較佳約及在30 mM與約80 mM之間，更佳約及在35 mM與約70 mM之間，最佳約55 mM。
於一些實施方式中，該鎂之濃度可係至少約24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 mM。於一特別實施方式中，存在的鎂之濃度較佳係約35 mM、約45mM、或約55 mM。
尤其，鎂對比NTP的比率係一通過T7聚合酶之催化活性影響高效率IVT的重要參數。例如，10 mM的各NTP加上75 mM的鎂陰離子的組合產生最優的IVT RNA產量，而5 mM的各NTP僅一半好且20 mM的各NTP係過多的。於一特別實施方式中，鎂係呈選自包含氯化鎂、醋酸鎂、硫酸鎂、氫氧化鎂、氧化鎂、葡萄糖酸鎂、蘋果酸鎂、乳清酸鎂、甘胺酸鎂、抗壞血酸鎂、檸檬酸鎂、硼酸鎂、柳酸鎂、溴化鎂、硬脂酸鎂、碳酸鎂、或其等之任何組合之群的形式。
於又另一特別實施方式中，鎂係呈選自包含氯化鎂（MgCl 2）、醋酸鎂（MgOAc 2）之群的形式。
尤其，於該IVT反應期間鎂係呈氯化鎂的形式。
於一進一步實施方式中，該IVT反應係在焦磷酸酶存在下進行。
於本發明之方法之另一特別實施方式中，焦磷酸酶之濃度係約及在0.01 U/ml至約40 U/ml之間，較佳約及在0.1 U/ml與約20 U/ml之間，更佳約及在1 U/ml與約10 U/ml之間，最佳約5 U/ml。
於一些實施方式中，該焦磷酸酶之濃度可係至少約0.01, U/ml。於一特別實施方式中，存在的焦磷酸酶之濃度較佳係約5 U/ml。
用於本文中，應將術語「焦磷酸酶」（亦以二磷酸酶為人所知）理解成一種在二磷酸酯鍵上起作用的酸酐水解酶。此術語較佳係關於催化無機焦磷酸根之水解以形成正磷酸根的無機焦磷酸酶。當核苷三磷酸被併入至生長中的鏈中／聚合成生長中的鏈時，無機焦磷酸根被釋放。焦磷酸根係RNA聚合之抑制子，且因此移除導致IVT中RNA產量增加。Mg離子對於晶形焦磷酸酶之催化活性而言係必須的。
於一進一步方面，焦磷酸酶亦可選自包含以下者的列表：菸草酸焦磷酸酶，其催化磷酸酯之水解、種種有機焦磷酸酶，其等在具有焦磷酸基團（但排除在最後的鍵上起作用的三磷酸酶）的有機分子上起作用、噻胺焦磷酸酶。
於一本發明之方法之進一步實施方式中，該IVT反應係在鉀，更佳氯化鉀（KCl）存在下進行。
於一特別實施方式中，鉀之濃度係約及在10 mM至約100 mM之間，較佳約及在15 mM與約80 m之間，更佳約及在20 mM與約60 mM之間，最佳約25 mM。
於一特別實施方式中，該試管內轉錄反應中的RNA可係經加帽及未加帽RNA、經修飾及未修飾RNA、或有或無多腺苷酸尾的RNA、或其等之任何組合。準備好由核糖體高效率轉譯的成熟mRNA含有二個主要修飾：5’帽結構及多腺苷酸尾。此外，於低於7.5的pH下進行該IVT反應不會偏離朝向短或長RNA分子，即其對於小型及長模板作用一樣好。
根據本發明，RNA分子（諸如傳訊RNA（或mRNA））包含以下類型：無多腺苷酸尾的未加帽未修飾RNA、有多腺苷酸尾的未加帽未修飾RNA、無多腺苷酸尾的未加帽經修飾RNA、有多腺苷酸尾的未加帽經修飾RNA、無多腺苷酸尾的經加帽未修飾RNA、有多腺苷酸尾的經加帽未修飾RNA、無多腺苷酸尾的經加帽經修飾RNA、有多腺苷酸尾的經加加帽經修飾RNA。
於本發明之前後文中，應將術語「經加帽RNA」理解成一種RNA分子，其5’端連接至鳥苷或經修飾鳥苷，較佳7-甲基鳥苷（N7-甲基鳥苷或m7G），連接到5’至5’三磷酸鍵聯或類似物。RNA結構之「加帽」於各種各樣的細胞程序中扮演關鍵角色，該等細胞程序包括轉譯起始、剪接、細胞內運輸、及周轉。經加帽mRNA之試管內合成係藉由在轉錄本之5’端處共轉錄地併入帽類似物的噬菌體RNA聚合酶（T7、SP6、或T3）介導性試管內轉錄來進行。或者，亦可使用轉錄後酶催化加帽以向IVT製造的RNA分子添加5’ CAP。
用於本文中，「帽類似物」係生物學上等效於7-甲基鳥苷（m7G）的帽，且包含傳統類似物，諸如G(5’)ppp(5’)G、m7G(5’)ppp(5’)G、或m2,2,7G(5’)ppp(5’)G，且亦包含抗逆帽類似物（ARCA）3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G、未甲基化帽類似物G(5′)ppp(5′)G、用於A+1位置的經甲基化帽類似物m7G(5′)ppp(5′)A；用於A+1位置的未甲基化帽類似物G(5′)ppp(5′)A。抗逆帽類似物（ARCA）係一種經修飾帽類似物，其中3’ OH基團（靠近m7G）被-OCH3置換（即經甲基化）以預防透過於此位置的磷酸二酯鍵形成的RNA延長。此修飾強制正確方向的ARCA併入並隨後導致可轉譯mRNA群。
於一些較佳實施方式中，本發明之方法中使用的mRNA具有一種具有所謂的CAP-1結構的5’帽結構（諸如CleanCap®），意味相對於帽核苷酸而言的次末端基核苷酸中的核糖之2’羥基被甲基化，諸如如下闡明的：
於本發明之前後文中，應將術語「未加帽RNA」理解成任何不包含如於定義「經加帽RNA」中定義的帽的RNA分子。因此，於一特別實施方式中，「未加帽mRNA」可指一種mRNA，其5’端未（透過5’至5’三磷酸鍵聯）連接至7-甲基鳥苷或先前定義的類似物。
於本發明之前後文中，應將術語「經修飾RNA」理解成一種RNA分子，其含有至少一個經修飾核苷酸、核苷、或鹼基，諸如經修飾嘌呤或經修飾嘧啶。經修飾核苷或鹼基可為任何非A、U、C或G（對於核苷而言分別為腺苷、尿苷、胞苷、或鳥苷；及當僅指糖部分時腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、或鳥糞嘌呤）的核苷或鹼基。
於本發明之前後文中，術語應將「未修飾RNA」理解成任何不包含如於定義「經修飾RNA」中定義的修飾的RNA分子。
用於本文中，應將術語「多腺苷酸尾」理解成一種部分，其包含多個腺苷單磷酸且於發明所屬技術領域中係廣為人知的。多腺苷酸尾一般於稱為多腺苷酸化的步驟期間產生，該步驟係轉譯後修飾之一且一般於成熟傳訊RNA之製造期間發生；如此多腺苷酸尾有助於該等mRNA之穩定性及半生期，且長度可變化。尤其，多腺苷酸尾可等於或長過10個腺苷核苷酸，其包括等於或長過20個腺苷核苷酸，其包括等於或長過100個腺苷核苷酸，及例如約120個腺苷核苷酸。
於本發明之前後文中，應將術語「無多腺苷酸尾的」理解成任何不包含如於定義「多腺苷酸尾」中敘述的多腺苷酸尾的RNA分子。
於本發明之意義上，術語「經修飾及未修飾」被視為與「經加帽及未加帽」不同，因為後者特別關於位於RNA分子之5’端的鹼基，且亦與「有多腺苷酸尾的及無多腺苷酸尾的」不同。
未加帽RNA（其於5’端不帶有正確的帽結構）引起強力的先天性免疫反應。為了於基因療法中應用，將未加帽RNA之比率減少至盡可能最小的程度係極其重要的。由於目前尚不存在經敘述為瞄準下游程序中的未加帽RNA之移除的程序，此未加帽RNA之減少應於IVT反應本身發生。未加帽RNA之量之減少可藉由增加IVT反應中的加帽劑之濃度來完成（如於 圖 8B中顯示的）。由於加帽劑之成本可占RNA製造中的總貨物成本之至多達一半，調整IVT反應之酸度係達成此功效的遠更有成本效益的方式。此外，可藉由增加加帽劑之濃度達到的加帽效率之上限似乎係±95%（ 圖 8B）。
本發明之另一優點係當於在5.0與低於7.5之間的pH下進行IVT反應時，經加帽RNA之於試管內轉錄期間藉由共轉錄加帽的合成被加強。因此，藉由調整該IVT反應之酸度，可達到較高的加帽效率。據此，該IVT反應之酸度之調整相較於增加加帽劑之濃度係更有成本效益的且甚至產生更高的加帽效率。
於本發明之前後文中，應將術語「共轉錄加帽」理解成於試管內轉錄反應期間帽類似物之基於酶的至RNA分子的併入。或者，術語「轉錄後加帽」係指帽類似物之於轉錄反應後至RNA分子的併入。加帽係預mRNA加工中的第一步且對於mRNA穩定性及轉譯而言係需要的。於共轉錄加帽中，帽類似物與四種標準核苷酸三磷酸（NTP）以經優化的帽類似物對比NTP的比率被導入至轉錄反應中。此允許所合成RNA分子之一大部分中具有帽結構的轉錄本之起始。
為進一步增強加帽效率，可組合低pH與經優化的帽類似物對比NTP的比率及或提高的鎂之量。明顯地，為增強加帽，可改變帽類似物對比NTP的比例本身以給出對於特別應用而言必須的最優的加帽效率。藉由調整該IVT反應之酸度組合最優的帽類似物對比NTP的濃度，可達到較高的加帽效率。
因此，除了dsRNA形成之減少外，本發明亦提供一種用於在試管內轉錄反應期間增加RNA之共轉錄加帽效率的方法。當IVT反應係於低於7.5，較佳低於7.0的pH及至少24 mM的鎂濃度，諸如例如55 mM MgCl 2下進行時，觀察到特別好的加帽效率。
於一特別實施方式中，該試管內轉錄反應係於濃度約及在0.5至約20 mM之間，較佳約及在1與15 mM之間，更佳約及在2與10 mM之間，最佳約5 mM的5’帽類似物存在下進行。
於又另一特別實施方式中，該試管內轉錄反應係於濃度0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 mM的5’帽類似物存在下進行。
於另一特別實施方式中，該試管內轉錄反應係在濃度約及在2與20 mM之間，較佳約及在3與15 mM之間，更佳約及在4與10 mM之間，最佳約5 mM的天然存在的或經修飾NTP存在下進行。
於又另一特別實施方式中，該試管內轉錄反應係於濃度2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 mM的NTP存在下進行。
帽類似物對比NTP的比率係影響mRNA之加帽效率以及反應產量的重要參數。若反應設置包括相較於帽類似物為高莫耳過量的各NTP而對於起始（與模板於+1及+2位置雜交）而言允許NTP勝過帽類似物，則不完全的加帽可能發生。更具體言之，於共轉錄加帽程序中，帽類似物與四種標準核苷酸三磷酸係以經優化的帽類似物對比NTP的比率導入至轉錄反應中。如於實施例部分中顯示的，具有1:1的帽類似物對比NTP的比率的反應可優於具有1:4的帽類似物對比NTP的比率的反應之加帽效率。更具體言之，具有1:4的帽類似物對比NTP的比率的反應產生83%的加帽效率，而等量的加帽類似物對比NTP（1:1）產生95%的加帽效率。取決於欲達到的加帽效率，IVT反應中使用的帽類似物對比NTP的比率可據以改變。例如，若極高比率的轉錄本必須被加帽，則可使用低至1:1帽類似物對比NTP的比率。
於一特別實施方式中，該試管內轉錄反應之帽類似物對比NTP的比例係至少約1:4，更佳至少約1:3，甚至更佳至少約1:2。
於一特別實施方式中，帽類似物對比NTP的比例可係約1:10、1:9；1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1；10:1、9:1、8:1、7:1、6:1；5:1、4:1、3:1、2:1。最優的帽類似物對比NTP的比率可基於所使用的帽類似物獨立選擇。例如，對於CleanCap®類似物而言帽類似物對比NTP的比例較佳係約1:1，而對於ARCA帽類似物而言帽類似物對比NTP的比例較佳係約4:1。
對於各NPT（即ATP、CTP、UTP、及GTP），最優的帽類似物對比NTP的比率可基於所欲的加帽效率及產量獨立選擇。典型地，對於ATP、CTP、及UTP，加帽效率及／或產量於使用相較於帽類似物為過量的NTP時係最佳的；其中對於GTP而言，加帽效率及／或產量於使用相較於NTP為過量的帽類似物時係最佳的。
反應中的GTP之濃度係限制性的，因為增加帽類似物對比GTP的比率會提高經加帽RNA轉錄本之比率；然而，其亦顯著減低反應之產量。為了保留帽類似物及提高轉錄反應之產量，建議的帽類似物對比GTP的比率係4:1。此方法產生具有最大產量及轉錄本的混合物，該等轉錄本中~80%經加帽，且剩下者具有5’-三磷酸端。取決於欲達到的加帽效率及所使用的帽類似物，IVT反應中使用的帽類似物對比GTP的比率可據以改變。例如，若極高比例的轉錄本必須被加帽，則可使用低至1:1帽類似物對比GTP的比率。典型地，於ARCA帽類似物的例子中使用過量的GTP（諸如4:1），而於CleanCap®類似物的例子中使用等莫耳量的GTP（諸如1:1）。
於一本發明之特別實施方中式，帽類似物對比GTP的比率可係10:1、9:1、8:1、7:1、6:1；5:1、4:1、3:1、2:1、1:1，較佳4:1。
於一本發明之特別實施方式中，ARCA帽類似物對比GTP的比率較佳係4:1。
於另一特別實施方式中，CleanCap類似物對比GTP的比率較佳係1:1。
據此，在5.0至7.3之間的根據本發明的任何pH值可與以上陳述的帽類似物對比NTP的比率組合以達成最優的加帽效率。 實施例
本發明現將通過以下實施例闡明。發明所屬技術領域中具有通常知識者會了解到可輕易作種種改變及修飾而不偏離本發明之技術精神或基本特徵。因此，應了解以下敘述的實施例於所有方面皆係闡明性的且不以任何方式限制本發明之範圍。 實施例 1– 試管內轉錄期間的 RNA 量與 pH
由於NTP之至RNA股中的併入將焦磷酸根及質子兩者釋放至介質中，較佳使用IVT反應中的緩衝劑之存在以使酸度保持穩定。於目標為IVT程序之優化的實驗中，研究了目前的IVT程序之緩衝特性是否足夠。IVT反應係於標準條件下進行並每15分鐘取樣。接著使用實驗室pH計測定所獲得的樣本之pH。
當IVT反應之RNA量及pH係對培養時間作圖時，令人意外地發現到IVT反應之酸度於培養時段期間顯著增加（ 圖 1）。此等IVT反應係使用對應於持續活化的TLR4構築體（caTLR4）的經線性化pDNA進行。於RNA在反應體積中累積的時段之期間（培養之0至±150分鐘），觀察到pH逐漸降低。一旦RNA之累積停止，pH訊號同樣變穩定。此等觀察結果顯示被製造的RNA之一大部分於所欲的pH下未被轉錄。 實施例 2– 酸度之對雙股 RNA 形成的功效
因為經轉錄RNA之一大部分於酸度之目標水平下未被轉錄，必須證實所觀察到的pH之移動並未負面地影響RNA之關鍵品質屬性。為了證實此，進行數個IVT反應，其中於6.5至8.5的範圍調整轉錄緩衝劑之pH（實驗1； 圖 2A）。IVT反應之pH對雙股RNA（dsRNA）形成有明顯功效。當IVT係於大於7.5（例如8.0）的pH下進行時，dsRNA之量相較於在較低的pH（諸如例如pH 7.5或甚至更低的pH）下進行的IVT反應明顯較高（ 圖 2A）。
為了追蹤及確認此等先前獲得的數據，使用對應於人類CD40配體的第二構築體重複實驗（實驗2； 圖 2B）。亦將IVT反應之pH範圍擴大至pH 5至8.5。與於實驗1中類似，經試管內轉錄RNA中的dsRNA量在於大於7.5的pH下進行的IVT反應中較高。此外，當IVT係於低於7.5的pH下進行時，dsRNA量似乎穩定於±0.6 µg/mg RNA的低水平。最後，經試管內轉錄RNA之完整性被維持。不同條件之電泳圖間未看到差異，而所有RNA構築體皆顯示單一RNA峰且無可視的降解跡象（ 圖 3）。
應注意此等IVT反應係使用增加水平的MgCl 2（即55 mM Mg）進行。酸度及氯化鎂之濃度之功效獨立地起作用（參見實施例3）。 實施例 3– 酸度之對 dsRNA 的獨立功效
為了證實所觀察到的酸度之對dsRNA量的功效是否依賴於或獨立於先前觀察到的增加的MgCl 2之對dsRNA的功效，使用標準的 24mM 的 MgCl 2 濃度重複實驗（ 圖 4）。IVT反應之pH範圍在pH 4.5至8.5。與於實施例1及2中類似，經試管內轉錄RNA中的dsRNA量在於大於7.5的pH下進行的IVT反應中較高。如先前觀察到的，當酸度係於pH 7.5或更低時，dsRNA穩定化。基於此等觀察結果，可得到以下結論：所觀察到的酸度之對dsRNA量的功效係獨立於IVT反應中的鎂濃度。 實施例 4–pH 及鎂濃度之組合
為了進一步優化IVT反應，進行第二輪實驗，其中研究pH組合鎂濃度之對RNA構築體TLR4之RNA產量、完整性、dsRNA量、殘餘pDNA量、及加帽效率的功效。進行一實驗，其中使用HEPES作為緩衝劑以將不同的IVT反應之pH調整到在8.5及3之間（ 圖 5），並使用 55 mM MgCl 2 的濃度。製備不同的TLR4之200 μl IVT反應，其中HEPES pH被調整至8.2、8、7.8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、及3（n=1）。HEPES之pH係使用HCl（18.5%）或KOH（1M）調整，且使用WFI以獲得116 mM的目標濃度。反應係於37°C下培養90分鐘。接著針對產量、CGE、dsRNA狹槽墨漬、殘餘pDNA、及加帽效率分析反應。 圖 5展示於55 mM MgCl 2及不同pH下進行的反應之RNA濃度。 圖 5A清楚地顯示於低於5的pH下無RNA被製造。當於低於7.5的pH下進行IVT反應時獲得最高的RNA產量，更尤其於pH 6.5下獲得最高的產量。於此pH範圍內，RNA之完整性未受影響（數據未顯示）。
IVT混合物之dsRNA量係使用dsRNA狹槽墨漬來分析。樣本係以5 μg RNA/ml WFI的濃度裝載。 圖 5B顯示不同IVT反應（n=1）之相對dsRNA量（μg dsRNA/mg RNA）且顯示高於pH 7.5，dsRNA量顯著增加。於較低的pH下，dsRNA量相對低。
吾人重複此等發現並針對三個Trimix構築體（TLR4、huCD40L、及huCD70）比較於6.5及7.8兩者下的IVT反應。HEPES（1 M）之pH係藉由添加0.55體積的KOH（1 M）調整至7.8，及藉由添加0.075體積的KOH（1 M）調整至6.5。此分別將HEPES之濃度改變至大約650及930 mM。因此，IVT反應混合物中的HEPES之最終濃度於pH 7.8下係75 mM且於pH 6.5下係108 mM。每個條件總共三個100 μl IVT反應係於45°C（DOE-最佳）或37°C（IVT24）下培養90分鐘。使用24 mM MgCl 2於pH 7.8下（IVT(24)）、55 mM MgCl 2於pH 7.8下（DOE最佳pH 7.8）、及55 mM MgCl 2於pH 6.5下（DOE最佳pH 6.5）進行的IVT反應。 圖 6A展示相較於使用24 mM MgCl 2及pH 7.8的IVT反應，在55 MgCl 2存在下及於pH 7.8及pH 6.5下進行的反應於90分鐘內產生更多RNA。另一方面，dsRNA量於使用24 mM MgCl 2及pH 7.8的IVT反應（IVT(24)）明顯較高。對於所有三種構築體，當反應係於55 mM MgCl 2及pH 6.5下進行時，dsRNA量最低（ 圖 6B）。吾人未觀察到pH之對RNA產量的功效。 實施例 5– 氯化鎂及醋酸鎂間的差異
典型係將氯化鎂加至IVT反應混合物作為對於T7 RNA聚合酶活性而言必須的鎂離子之來源。醋酸鎂係另一種可能的用於IVT反應的鎂離子之來源。為了比較此兩種鎂之來源，數個IVT反應係使用氯化鎂或醋酸鎂作為IVT基質之部分來進行並比較其等之RNA產量、完整性、dsRNA量、及殘餘pDNA量。進行總共六個100 μl IVT反應，其中起始緩衝劑係pH 7.8。於此六個反應中，三者係使用55 mM氯化鎂進行，且三者係使用55 mM醋酸鎂進行。反應係於45°C下培養90分鐘。任一鎂來源之使用對RNA之完整性無影響（數據未顯示）。 圖 7顯示氯化鎂或醋酸鎂之使用對RNA產量及dsRNA量的影響。基於此等數據，相較於氯化鎂，當醋酸鎂存在於IVT反應混合物中時，RNA產量似乎較高且較一致。另一方面，在醋酸鎂存在下dsRNA量顯著較高。 實施例 6– 酸度之對加帽效率的功效
一於此等實驗之過程中得到的極令人意外的觀察結果係IVT反應之酸度對通過共轉錄加帽獲得的加帽效能的功效。當IVT係於pH = 8.0（極接近由Kartje等人及Chamberlin & Ring鑑認的最優pH）下進行時，80%的經轉錄RNA分子在其等之5’端上帶有帽結構。藉由於55 mM MgCl 2反應中將IVT反應之pH減低至pH 6.5，此分數增加至99%（ 圖 8）。此清楚顯示加帽效率於較低的pH下較高且於高於7.5的pH下強力地減低。
於另外的實驗中，在使用以下者進行的IVT反應之間作於不同的NTP/CleanCap之比率下的加帽效率之直接比較：24 mM MgCl 2於pH 7.8下（IVT(24)）；55 mM MgCl 2於pH 7.8下（DOE最佳pH 7.8）；及55 mM MgCl 2於pH 6.5下（DOE最佳pH 6.5）（ 圖 9）。與 圖 8之結果一致，低於7.5的IVT反應之pH改善加帽效率。於pH 6.5及1/1的NTP/CleanCap比率下的於DOE-最佳IVT後的huCD40L之加帽效率係最高的（98.33%）。有意思地，於IVT24後的huCD40L之加帽效（96.80%）與於使用1/0.4的NTP/CleanCap比率的DOE-最佳IVT之後者（96.82%）係相同的，表明於pH 6.5下，可減少DOE-最佳IVT反應混合物中的CleanCap之起始濃度達60%，而仍獲得與IVT24於pH 7.8下者的類似的加帽效率。 實施例 7– 培養時間及溫度之功效
進一步研究培養溫度及時間之於IVT反應期間對dsRNA形成的影響。IVT反應係於二種溫度（37°C與45°C）下及於不同的培養時間（30、60、90、120分鐘）下進行。當進行IVT反應時，最大RNA產量於在37°C下一小時的反應後已獲得。類似產量係於45°C下於60分鐘後獲得（數據未顯示）。因此，假設於兩種溫度下，最大RNA產量應相等且係於大約60分鐘後獲得。
進一步，使用不同的IVT反應條件：IVT(24)= 24 mM MgCl 2於pH 7.8下（標準）；IVT(55)= 55 mM MgCl 2於pH 7.8下；IVT3.0 = 55 mM MgCl 2於pH 6.5下，且反應係針對二種構築體測試，該等構築體係於二個不同的溫度（37°C與45°C）下培養。對於所有反應，當IVT係於45°C下培養時，相較於37°C，所得的dsRNA量皆較低（ 圖 10）。尤其，對於IVT(24)，溫度之對dsRNA量的功效極明顯。一般而言，對於所有構築體，於IVT3.0（pH 6.5，55 mM MgCl）的pH下及於45°C下進行的IVT反應皆產生最低的濃度。 參考文獻
Chamberlin M.J. , Ring J. 大腸桿菌RNA聚合酶與DNA的結合之研究。V.透過酶-DNA複合物的T7 RNA鏈起始(Studies of the binding of E. coli RNA polymerase to DNA. V. T7 RNA chain initiation by enzyme-DNA complexes). J. Mol. Biol. 1972; 70: 221-237.
Kartje ZJ, Janis HI, Mukhopadhyay S, Gagnon KT. 使用青花菜RNA適配體作為簡化的即時螢光報導子重訪試管內T7 RNA聚合酶轉錄(Revisiting T7 RNA polymerase transcription in vitro with the Broccoli RNA aptamer as a simplified real-time fluorescent reporter). J Biol Chem. 2021; 296:100175.
無
現具體參照圖式，欲強調者係所顯示的具體態樣僅係舉例及為了說明性討論本發明之不同實施方式的目的。其等係為了提供被認為最有用且最容易敘述本發明之原理及概念方面者而呈現。於此方面，未嘗試以超過基本了解本發明所需者的細節來顯示本發明之結構細節。以下敘述加上圖式使得對於發明所屬技術領域中具有通常知識者而言本發明之數種形式可如何實際實施變得很明顯。
[ 圖 1] ：於試管內轉錄期間的 RNA 量及 pH 。IVT反應之RNA量（µg/ml；左y軸）及pH（右y軸）係對培養時間（min；x軸）作圖。IVT反應係於標準條件下進行且每15分鐘取樣。所獲得的樣本之pH係使用實驗室pH計測定。
[ 圖 2] ： IVT 反應之酸度對雙股 RNA （ dsRNA ）之形成的影響。dsRNA（µg/mg；y軸）係對pH（x軸）作圖。進行兩個獨立的實驗（A圖及B圖），其中將各IVT反應之轉錄緩衝劑之pH調整至pH 6.5至8.5（A圖）；或pH 5.0至8.5（B圖）。
[ 圖 3] ： IVT 反應之酸度對經試管內轉錄 RNA 之完整性的影響。IVT係於範圍5.0至8.5的pH下進行且RNA之完整性係使用Agilent生物分析儀評估。不同條件之電泳圖間未看到差異，而所有RNA構築體皆顯示單一RNA峰且無可視的降解跡象。
[ 圖 4] ：於不同酸度下使用含有 24 mM MgCl 2 的 IVT 反應的經試管內轉錄 RNA 之 dsRNA 量。dsRNA（µg/mg；y軸）係對pH（x軸）作圖，其中將轉錄緩衝劑之pH調整至pH 4.5至8.5（A圖）。對於pH 5.0至8.5，經試管內轉錄RNA之完整性係使用Agilent生物分析儀評估（B圖）。
[ 圖 5] ：於不同酸度下使用含有 55 mM MgCl 2 的 IVT 反應的經試管內轉錄 RNA 之 dsRNA 量（ A 圖）及 RNA 產量（ B 圖）。當IVT反應係於低於5的pH下進行時，RNA產量不足，而此係因為無RNA被製造出。當於低於7的pH下進行IVT反應時，獲得最高的RNA產量，其中最高的產量係於pH 6.5下獲得。高於pH 7.5，dsRNA量顯著增加，而於在5.0與低於7.5之間的pH，dsRNA量相對較低。
[ 圖 6] ： IVT 反應之鎂及酸度之組合之對 RNA 產量（ A 圖）及 dsRNA 之形成（ B 圖）的影響。IVT(24) = 24 mM MgCl 2於pH 7.8下（標準）；DOE最佳pH 7.8於55 mM MgCl 2下；DOE最佳pH 6.5於55 mM MgCl 2下。實驗係針對三種構築體以三重複進行（n= 3）。
[ 圖 7] ：當 IVT 係在 55 mM MgCl 2 或 55 mM 醋酸鎂（ MgAc ）存在下及於 pH 7.8 下進行時的 RNA 產量（ A 圖）及 dsRNA 量（ B 圖）之比較。相較於氯化鎂，使用醋酸鎂RNA產量似乎較高且較一致。另一方面，dsRNA量在醋酸鎂存在下明顯較高。
[ 圖 8] ：酸度及加帽劑之濃度之對使用含有 55 mM MgCl 2 的 IVT 反應的經試管內轉錄 RNA 之加帽效率的影響。加帽效率（%；y軸）係對pH（x軸）作圖。進行數種IVT反應，其中將轉錄緩衝劑之pH調整至5.0、5.5、6、6.5、7.0、7.5、7.8、或8。（A圖）。於B圖，加帽劑之濃度係以加帽分子（莫耳）/NTP（莫耳）表示。減少未加帽RNA之量可藉由增加IVT反應中的加帽劑之濃度來達成。超過90%的加帽效率可藉由將加帽劑之濃度增加至至少0.5來達成。實驗係於pH 7.8下進行。
[ 圖 9] ：於使用不同條件及改變 NTP 對比 Cleancap 之比率進行的 IVT 反應後的 huCD40L 之加帽效率。IVT(24) = 24 mM MgCl 2於pH 7.8下（標準）；DOE最佳pH 7.8於55 mM MgCl 2下.；DOE最佳pH 6.5於55 mM MgCl 2下。實驗係針對一個構築體以二重複進行（n= 2）。
[ 圖 10] ：對於二種 RNA 構築體（ TLR4 、 huCD40L ，（ n=2 ））之製造的 IVT 組成物及培養溫度之對 dsRNA 量的影響。IVT(24) = 24 mM MgCl 2於pH 7.8下（標準）；IVT(55) = 55 mM MgCl 2於pH 7.8下；IVT3.0 = 55 mM MgCl 2於pH 6.5下。對於所有反應，當IVT係於45°C下培養時，相較於37°C，所得的dsRNA量皆較低。尤其是對於IVT(24)而言，溫度之對dsRNA量的影響極明顯。一般而言，於IVT3.0的pH（pH 6.5、55 mM MgCl）下及於45°C下進行的IVT反應對於所有構築體而言皆產生最低的dsRNA濃度。

Claims (13)

  1. 一種用於在試管內轉錄反應（IVT反應）期間減少雙股RNA（dsRNA）形成之方法，其包含於約及在5.0與7.5之間的pH下及在至少24 mM的鎂存在下進行該試管內轉錄反應。
  2. 如請求項1之方法，其中該試管內轉錄反應係於約及在5.0與7.0之間下進行。
  3. 如請求項1之方法，其中該試管內轉錄反應係於約及在5.0與6.5之間的pH下進行。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中鎂之濃度係約及在30 mM與80 mM之間，更佳約及在35 mM與70 mM之間，最佳約55 mM。
  5. 如請求項1至3中任一項之方法，其中鎂之濃度係至少約40 mM，較佳至少約45 mM，更佳至少約50 mM。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該鎂係呈選自包含氯化鎂（MgCl 2）、醋酸鎂（MgOAc 2）之群的形式。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該試管內轉錄反應係於至少37°C，較佳至少約40°C，更佳至少約41°C下，甚至更佳於約45°C的溫度下進行。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其包含在帽類似物存在下進行該IVT反應，其中該IVT中使用的帽類似物對比NTP的比例係至少約1:4，更佳至少約1:3，甚至更佳至少約1:2。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該試管內轉錄反應係在至少一種選自包含以下者的列表的pH緩衝劑存在下進行：參(羥甲基)胺基甲烷（Tris）、TAPS（[參(羥甲基)甲基胺基]丙磺酸）、Bicine（2-(雙(2-羥乙基)胺基)醋酸）、Tricine（N-[參(羥甲基)甲基]甘胺酸）、TAPSO（3-[N-參(羥甲基)甲基胺基]-2-羥基丙磺酸）、HEPES、（4-(2-羥乙基)-1-哌乙磺酸）、TES、（2-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]乙磺酸）、MOPS（3-(N-啉基)丙磺酸）、MOPSO（3-(N-啉基)-2-羥基丙磺酸）、MOBS（4-(N-啉基)丁磺酸）、、PIPES、（哌-N,N′-雙(2-乙磺酸)）、Cacodylate、（二甲基砷酸）、MES、（2-(N-啉基)乙磺酸）、BTM（雙-三甲烷）、BTP（雙-三丙烷）、ADA（N-(胺甲醯基甲基)亞胺基二醋酸）、ACES（N-(2-乙醯胺基)-2-胺基乙磺酸）、BES（N,N-雙(2-羥乙基)-2-胺基乙磺酸）、HEPPSO（β-羥基-4-(2-羥乙基)-1-哌丙磺酸一水合物）、POPSO（哌-N,N′-雙(2-羥基丙磺酸)）、TEA（N,N-二乙基乙胺）、EPPS（N-(2-羥乙基)哌-N-(3-丙磺酸)）、DIPSO（3-(N,N-雙[2-羥乙基]胺基)-2-羥基丙磺酸）、NaHCO 3/CO 2緩衝劑、或其等之任何組合。
  10. 如請求項1至9中任一項之方法，其中該試管內轉錄反應係在HEPES存在下進行。
  11. 如請求項9或10之方法，其中該緩衝劑之濃度係約及在1 mM至約200 mM之間，較佳約及在5 mM與約150 mM之間，更佳約及在10 mM與約100 mM之間，最佳約50 mM。
  12. 如請求項1至11中任一項之方法，其中該試管內轉錄反應係在焦磷酸酶存在下進行。
  13. 如請求項12之方法，其中該焦磷酸酶之濃度係約及在0.01 U/ml至約40 U/ml之間，較佳約及在0.1 U/ml與約20 U/ml之間，更佳約及在1 U/ml與約10 U/ml之間，最佳約5 U/ml。
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