JP2009142193A - アデノシン３’，５’−ビスホスフェートを用いた無細胞タンパク質合成方法及び無細胞タンパク質合成反応液 - Google Patents
アデノシン３’，５’−ビスホスフェートを用いた無細胞タンパク質合成方法及び無細胞タンパク質合成反応液 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】ｍＲＮＡ分解の抑制を簡便に行うことによって無細胞タンパク質合成を行う方法、及びｍＲＮＡ分解の抑制を簡便に行うことによって無細胞タンパク質合成を行うことができる反応液を提供する。
【解決手段】 生体細胞由来の抽出液、カリウム塩、マグネシウム塩、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、緩衝剤、及びアデノシン３’，５’−ビスホスフェートを少なくとも含む無細胞タンパク質合成反応液、及び当該反応液を用いた、無細胞タンパク質合成方法。
【選択図】図１
【解決手段】 生体細胞由来の抽出液、カリウム塩、マグネシウム塩、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、緩衝剤、及びアデノシン３’，５’−ビスホスフェートを少なくとも含む無細胞タンパク質合成反応液、及び当該反応液を用いた、無細胞タンパク質合成方法。
【選択図】図１
Description
本発明は、無細胞タンパク質合成方法に関する。より詳しくは、本発明は、ｍＲＮＡの分解を抑制して無細胞タンパク質合成を行う方法に関する。具体的には、本発明は、アデノシン３’，５’−ビスホスフェートを用いた無細胞タンパク質合成方法及び無細胞タンパク質合成反応液に関する。
細胞内にはｍＲＮＡ代謝に関わる複数のリボヌクレアーゼが存在していることから、細胞抽出液にはリボヌクレアーゼ活性が存在する。このため、細胞抽出液を用いた無細胞タンパク質合成においては、鋳型となるｍＲＮＡのリボヌクレアーゼによる分解が問題となる。
このため、無細胞タンパク質合成技術においては、ｍＲＮＡの分解の問題を克服する目的で、市販のリボヌクレアーゼ阻害剤（ヒト胎盤やブタ肝臓由来）を用いることによって、無細胞タンパク質合成が行われることが多い。
ここで、細胞内に存在するｍＲＮＡは、一般的に、５’側からＣＡＰ構造、５’非翻訳領域、翻訳領域、３’非翻訳領域、及びポリＡ尾部で構成されている。翻訳が終了したｍＲＮＡは速やかに分解される。この際、３’末端に存在するポリＡ尾部の分解によってｍＲＮＡがある一定の長さになると、脱ＣＡＰ反応が起き、５’エクソヌクレアーゼによって一気に５’側から分解されることが知られている（非特許文献１：Microbiol Rev. 1996 Mar;60(1):233-49）。
そこで、無細胞タンパク質合成技術においては、鋳型となるｍＲＮＡの末端からの分解を抑制する方法が報告されている。例えば、ＣＡＰ構造の付与が有用であることが知られている。さらに、ｍＲＮＡの５’末端と３’末端とをループにすることによりタンパク質の合成量を向上させたという方法も報告されている（非特許文献２：Biotechnol Bioeng. 1999 Jul 20;64(2):194-9）。
カポニグロ・Ｇ（Caponigro G）及びパーカー・Ｒ（Parker R）著、「マイクロバイオロジー・アンド・モレキュラー・バイオロジー・レビューズ（Microbiology and Molecular Biology Reviews）」、第６０巻、第１号、１９９６年３月、ｐ．２３３−２４９
ナカノ・Ｈ（Nakano H）、シンバタ・Ｔ（Shinbata T）、オクムラ・Ｒ（Okumura R）、セキグチ・Ｓ（Sekiguchi S）、フジシロ・Ｍ（Fujishiro M）及びヤマネ・Ｔ（Yamane T）著、「バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Biotechnology and Bioengineering）」、第６４巻、第２号、１９９９年７月２０日、ｐ．９４−９９
上述のＣＡＰ構造を付加する方法は、コストがかかり、その上、前処理も煩雑になるなどの問題がある。また、５’末端と３’末端とをループにする方法（上記非特許文献２参照）は、そのように鋳型ＤＮＡをデザインして調製する必要があり、手間がかかる。従って、いずれも現在の一般的な無細胞タンパク質合成技術においては使われていないか、使われても実用的な技術としては使われていない。このため、結局、リボヌクレアーゼ阻害剤のみ添加して無細胞タンパク質合成が行われることがほとんどである。
しかしながら、無細胞タンパク質技術において用いられてきたリボヌクレアーゼ阻害剤は、具体的にはＲＮａｓｅＡのように、ｍＲＮＡの中ほどから分解させるエンドヌクレアーゼの効果を阻害するものである。一方、このようなリボヌクレアーゼ阻害剤は、５’又は３’末端から分解を行うエキソヌクレアーゼを阻害する効果はない。このため、反応液全体としてみれば、ＲＮＡ分解抑制は効果的に行われていない。
そこで本発明の目的は、ｍＲＮＡ分解の抑制を簡便に行うことによって無細胞タンパク質合成を行う方法、及びｍＲＮＡ分解の抑制を簡便に行うことによって無細胞タンパク質合成を行うことができる反応液を提供することにある。
本発明者らは、鋭意検討の結果、無細胞翻訳系におけるアデノシン３’，５’−ビスホスフェートによるｍＲＮＡ分解抑制効果を見出し、本発明を完成するに至った。
本発明には、以下の発明が含まれる。
（１）
生体細胞由来の抽出液、カリウム塩、マグネシウム塩、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、緩衝剤、及びアデノシン３’，５’−ビスホスフェートを少なくとも含む無細胞タンパク質合成反応液を用いた、無細胞タンパク質合成方法。
（１）
生体細胞由来の抽出液、カリウム塩、マグネシウム塩、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、緩衝剤、及びアデノシン３’，５’−ビスホスフェートを少なくとも含む無細胞タンパク質合成反応液を用いた、無細胞タンパク質合成方法。
アデノシン３’，５’−ビスホスフェート（Adenosine-3’, 5’-bisphosphate）は、アデノシン３’，５’−ジホスフェート（Adenosine-3’, 5’-diphosphate）又は３’−ホスホアデノシン−５’−ホスフェート（3’-Phosphoadenosine 5’-Phosphate）とも呼称する。
アデノシン３’，５’−ビスホスフェートを無細胞タンパク質合成反応液に含ませることによって、ｍＲＮＡの分解を抑制することができる。
アデノシン３’，５’−ビスホスフェートを無細胞タンパク質合成反応液に含ませることによって、ｍＲＮＡの分解を抑制することができる。
前記アデノシン３’，５’−ビスホスフェートが、前記無細胞タンパク質合成反応液中１〜３０ｍＭの濃度で含まれる、前記の無細胞タンパク質合成方法。
アデノシン３’，５’−ビスホスフェートの濃度を上記範囲に設定することによって、ｍＲＮＡ分解抑制効果がより有効に得られる。
アデノシン３’，５’−ビスホスフェートの濃度を上記範囲に設定することによって、ｍＲＮＡ分解抑制効果がより有効に得られる。
（２）
前記無細胞タンパク質合成反応液が、リチウムイオンＬｉ＋をさらに含む、（１）に記載の無細胞タンパク質合成方法。
前記無細胞タンパク質合成反応液が、リチウムイオンＬｉ＋をさらに含む、（１）に記載の無細胞タンパク質合成方法。
リチウムイオンを無細胞タンパク質合成反応液にさらに含ませることによって、ｐＡｐによるｍＲＮＡ分解抑制効果がより有効に、より持続性高く、或いはより安価に得られる。
（３）
無細胞タンパク質合成反応を維持する間に、アデノシン３’，５’−ビスホスフェートを、前記無細胞タンパク質合成反応液に追加添加する、（１）又は（２）に記載の無細胞タンパク質合成方法。
無細胞タンパク質合成反応を維持する間に、アデノシン３’，５’−ビスホスフェートを、前記無細胞タンパク質合成反応液に追加添加する、（１）又は（２）に記載の無細胞タンパク質合成方法。
アデノシン３’，５’−ビスホスフェートを無細胞タンパク質合成反応液に追加添加することによって、ｍＲＮＡ分解抑制効果がより有効に、より持続性高く得られる。
（４）
前記生体細胞が昆虫培養細胞である、（１）〜（３）のいずれかに記載の無細胞タンパ
前記生体細胞が昆虫培養細胞である、（１）〜（３）のいずれかに記載の無細胞タンパ
（５）
生体細胞由来の抽出液、カリウム塩、マグネシウム塩、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、緩衝剤、及びアデノシン３’，５’−ビスホスフェートを少なくとも含む無細胞タンパク質合成反応液。
生体細胞由来の抽出液、カリウム塩、マグネシウム塩、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、緩衝剤、及びアデノシン３’，５’−ビスホスフェートを少なくとも含む無細胞タンパク質合成反応液。
（６）リチウムイオンＬｉ＋をさらに含む、（５）に記載の無細胞タンパク質合成反応液。
本発明によると、ｍＲＮＡ分解の抑制を簡便に行うことによって無細胞タンパク質合成を行う方法、及びｍＲＮＡ分解の抑制を簡便に行うことによって無細胞タンパク質合成を行うことができる反応液を提供することができる。
本発明においては、アデノシン３’，５’−ビスホスフェート（以下、ｐＡｐと記載することがある。）を無細胞タンパク質合成系中に含ませることによってタンパク質の合成を行う。本明細書において「タンパク質」とは、オリゴペプチド、ポリペプチドをも含む意味で用いる。
無細胞タンパク質合成用の反応液を構成する成分については、ｐＡｐを必須成分とし、ＲＮａｓｅインヒビターを必須成分としないことを除いては、基本的には公知の無細胞タンパク質合成用反応液に用いられる成分を特に限定することなく挙げることができる。ｐＡｐ以外の成分としては、通常、水中に、生体細胞由来の抽出液、カリウム塩、マグネシウム塩、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及び緩衝剤を少なくとも含むものが用いられる。
この中でも生体細胞由来の抽出液としては、公知のものを制限なく用いることができるが、特に、昆虫培養細胞由来の抽出液を用いることが好ましい。特に、タンパク質合成能が高く、また無血清培地にて培養が可能であることから、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵細胞由来の細胞であるＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）やＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｌｐｅｒｄａ卵巣細胞由来の細胞であるＳｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を昆虫細胞として用いるのが好ましい。
本発明の無細胞タンパク質合成系に好ましく用いられる昆虫細胞抽出液の調製方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、特開２００４−２１５６５１号公報に記載の方法、すなわち、抽出用液に懸濁した昆虫細胞を急激に凍結させた後に昆虫細胞を破砕し、抽出を行うという方法を用いることができる。この方法は、緩和な状態で細胞破砕を行うことから無細胞タンパク質合成に必須な成分を破壊することなく細胞外に取り出すことができる点、使用器具などからのＲＮａｓｅなどの混入を防ぐことができる点、界面活性剤などの試薬を用いた細胞破砕の場合に懸念される翻訳反応阻害物質の持込がない点などから、好ましく用いられる。
すなわち、昆虫細胞抽出液としては、タンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ含有するとともに、１０ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは５０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、１μＭ〜５０ｍＭ、好ましくは０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスフォニルフルオライド）、及び、５ｍＭ〜２００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）−ＫＯＨ（ｐＨ４〜１０、好ましくは６．５〜８．５）を含有する水溶液として調製され、好ましくはヌクレアーゼ処理を施されたものを用いると良い。さらに、上記に加え、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有させてもよい。
そして、無細胞タンパク質合成用反応液は、このような昆虫細胞抽出液が１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有されるように調製されるのが好ましい。すなわち、上記反応液の全体において、昆虫細胞由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを越えると、目的のタンパク質の合成速度が低下する虞があるためである。
上記抽出液以外の成分として反応液中に用いられる、カリウム塩、マグネシウム塩、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、外来ｍＲＮＡ、緩衝剤については、当業者が適宜決定することができる。例えば、反応液を、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．０５ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜２００μＭのアミノ酸成分、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、２０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を含有する水溶液として実現されるのが好ましい。
また、上記に加えて、さらにジチオトレイトール（ＤＴＴ）（例えば０．２ｍＭ〜５ｍＭ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）（例えば０．１ｍＭ〜１０ｍＭ）を含有するように実現させても良い。
また、上記に加えて、さらにジチオトレイトール（ＤＴＴ）（例えば０．２ｍＭ〜５ｍＭ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）（例えば０．１ｍＭ〜１０ｍＭ）を含有するように実現させても良い。
本発明の無細胞タンパク質合成反応液においては、上記成分にさらにｐＡｐが含まれる。ｐＡｐを反応液中に含ませることによって、ｍＲＮＡの分解を抑制することができる。ｐＡｐによるｍＲＮＡ分解抑制効果は、無細胞タンパク質合成反応液のような多量のｍＲＮＡの存在する特別な環境であるにもかかわらず、このような多量のｍＲＮＡを有効に維持することができる点で非常に優れている。
ｐＡｐの添加量は特に限定されるものではないが、例えば、反応液中に１〜３０ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭの終濃度で含ませることができる。上記濃度より少ないと、ｍＲＮＡ分解抑制の効果が出にくい。
ｐＡｐは、反応中に減少する傾向にある。これは、細胞抽出液に含まれる成分により代謝されることが一因であると考えられる。
そこで、本発明においては、無細胞タンパク質合成反応開始後、反応を持続する間にｐＡｐを追加添加することができる。このことによって、ｍＲＮＡの分解抑制効果をより有効に、より持続性高く得ることが可能である。
そこで、本発明においては、無細胞タンパク質合成反応開始後、反応を持続する間にｐＡｐを追加添加することができる。このことによって、ｍＲＮＡの分解抑制効果をより有効に、より持続性高く得ることが可能である。
追加添加するタイミング、及び追加添加する量としては特に限定されない。追加添加のタイミングとしては、例えば、反応開始から３０〜６０分後とすることができる。特に、終濃度を５ｍＭとなるようにｐＡｐを添加した場合に、反応開始から３０〜６０分後とすることが好ましい。追加添加量としては、追加時に反応液中に残存しうる反応当初から存在していたｐＡｐ以外の、追加添加したｐＡｐの終濃度が、５〜１０ｍＭとなるように設定することができる。追加添加の回数も特に制限されない。例えば、１〜３回の追加添加を行うことができる。
このように、本発明においては、ｐＡｐを添加するだけで、ｍＲＮＡの分解を抑制することができる。このため、ＲＮａｓｅインヒビターの添加や、ｍＲＮＡの末端からの分解を抑制するために行われた方法、たとえばキャップ構造の付与やループ状ｍＲＮＡの調製などの方法が不要である。ＲＮａｓｅインヒビターの添加（例えば反応液中１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ）、及びｍＲＮＡの末端からの分解を抑制するために行われうるいかなる方法を排除するものではない。
また、すでに述べたように、ｐＡｐは、細胞抽出液に含まれる成分により代謝されると考えられる。例えば、酵母細胞に限っていえば、ｐＡｐがＨａｌ２ｐによってＡＭＰに変換されることが知られており、Ｈａｌ２ｐはリチウムイオンによって阻害されることも知られている（例えば、The EMBO Journal (1997) 16, 7184-7195参照）。
本発明においては、無細胞タンパク質合成反応液中に、さらにリチウムイオンＬｉ＋を含ませることができる。リチウムイオンを反応液中に含ませることによって、タンパク質合成量を低下させる一因であるｍＲＮＡの分解を抑制する効果を、より有効に、より持続性高く得ることができる。或いは、リチウムイオンの使用により、ｐＡｐの使用量を減らすことも可能であるため、ｐＡｐによるｍＲＮＡ分解抑制効果をより安価に得ることも可能である。この効果は、細胞抽出液が酵母細胞に由来するものでなくとも得ることが可能である。例えば、細胞抽出液が昆虫細胞に由来するものであってもリチウムイオンによる効果を有効に得ることが可能である。
リチウムイオンの供給源としては、特に限定されないが、生化学的に許容することができるリチウム塩を用いることができる。このようなリチウム塩としては、例えば、塩化リチウム、酢酸リチウムなどが挙げられる。
リチウムイオンの濃度としては、特に限定されないが、例えば反応液中に２５〜４００ｍＭ、好ましくは５０〜１００ｍＭの終濃度で含ませることができる。このような範囲に設定することによって、ｍＲＮＡ分解抑制効果をより有効に得ることができる。
なお無細胞タンパク質合成における反応温度としては、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは１５℃〜３０℃の範囲内である。反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また反応温度が４０℃を越えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。
本発明における無細胞タンパク質合成は、バッチ法によって行うことができる。反応時間としては特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。例えば、６時間程度を目安にすると良い。
本発明の無細胞系タンパク質合成方法にて合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。
本発明の無細胞系のタンパク質合成方法にて合成できるタンパク質に特に制限はない。
本発明の無細胞タンパク質合成方法は、無細胞タンパク質合成系を利用したリボソームディスプレイ法、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｒｕｓ法といった試験管内分子選択法にも適用することができる。リボソームディスプレイ法は、ｍＲＮＡとｍＲＮＡの翻訳により生じるタンパク質とをリボソームを介して複合体形成させる方法である。リボソームディスプレイ法の参考文献としては、Brief Funct Genomic Proteomic. 2002 Jul;1(2):204-12.Ribosome display: cell-free protein display technology.He M, Taussig MJ.が挙げられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｒｕｓ法は、ピューロマイシンをｍＲＮＡの３’末端にpoly(dA)もしくはPEGリンカーを介して結合させた後、翻訳により生じたタンパク質のC末端とピューロマイシンをリボソーム内にて反応させ、タンパク質−ｍＲＮＡ結合分子を形成する。この結合分子のｍＲＮＡ部分を逆転写することにより、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡのニ本鎖核酸へと変換させる方法である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｒｕｓ法の参考文献としては、Miyamoto-Sato, E. et al:Genome res., 15,710(2005)Cell-free cotranslation and selection using in vitro virus for high-throughput analysis of protein-protein interactions and complexesが挙げられる。
以上に述べたように、本発明の方法は、ｐＡｐを添加するだけで、無細胞タンパク質合成反応液中のｍＲＮＡの分解を簡単に抑制することができる。このため、本発明の方法は、従来のｍＲＮＡ分解抑制方法を用いた無細胞タンパク質合成法より簡便であり、従ってより実用的である。
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（工程１．発現用プラスミドの構築）
ヒトリゾチームｃＤＮＡクローン（ｐＥＲＩ８６０２、Kanaya et al., J. Biol. Chem. 1992, 267, 15111-15115）を鋳型とし、下記配列番号１及び配列番号２にそれぞれ示す配列を有するプライマーのセット、及びＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡）を用いてＰＣＲを行った。
5’-ATGAAGGTTTTCGAGAGATGCG-3’（配列番号１）
5’-GGGGTACCAACACCACAACCTTGAACG-3’（配列番号２）
［実施例１］
（工程１．発現用プラスミドの構築）
ヒトリゾチームｃＤＮＡクローン（ｐＥＲＩ８６０２、Kanaya et al., J. Biol. Chem. 1992, 267, 15111-15115）を鋳型とし、下記配列番号１及び配列番号２にそれぞれ示す配列を有するプライマーのセット、及びＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡）を用いてＰＣＲを行った。
5’-ATGAAGGTTTTCGAGAGATGCG-3’（配列番号１）
5’-GGGGTACCAACACCACAACCTTGAACG-3’（配列番号２）
ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片の５’末端を、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡）によりリン酸化し、ＫｐｎＩ（東洋紡）で消化した。これにより得られたＤＮＡを、ｐＴＤ１ ｖｅｃｔｏｒ（島津製作所）のＥｃｏＲＶ／ＫｐｎＩ部位に、Ｔ４リガーゼ（Ｑｕｉｃｋ ＬｉｇａｔｉｏｎTM Ｋｉｔ、ＮＥＢ）を用いて連結した。大腸菌ＤＨ５αを形質転換させて得られたクローンより得られた目的プラスミドをｐＴＤ１−ｓｔｒｅｐ−ｈ−ＬＹＺ（Ezure et. al., Proteomics, in press）と命名した。
（工程２．インビトロ転写反応およびｍＲＮＡの精製）
上記工程１．で作製した発現用プラスミドｐＴＤ１−ｓｔｒｅｐ−ｈ−ＬＹＺを鋳型とし、下記配列番号３及び配列番号４にそれぞれ示す配列を有するプライマーのセット及びＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡）を用いてＰＣＲを行った。
5’-GCAGATTGTACTGAGAGTG-3’（配列番号３）
5’-GCGGATAACAATTTCACAC-3’（配列番号４）
上記工程１．で作製した発現用プラスミドｐＴＤ１−ｓｔｒｅｐ−ｈ−ＬＹＺを鋳型とし、下記配列番号３及び配列番号４にそれぞれ示す配列を有するプライマーのセット及びＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡）を用いてＰＣＲを行った。
5’-GCAGATTGTACTGAGAGTG-3’（配列番号３）
5’-GCGGATAACAATTTCACAC-3’（配列番号４）
増幅断片は、フェノール−クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿により精製した。精製した増幅断片５μｇを鋳型として、Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸTM Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、１００μLスケールで３７℃、３０分の転写反応を行うことにより、ｍＲＮＡを合成した。得られた反応液をＮｉｃｋ ｃｏｌｕｍｎ（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライした後、純水で溶出した。溶出画分に酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行って、ｍＲＮＡを精製した。精製したｍＲＮＡは２６０ｎｍと２８０ｎｍとにおける吸光度を測定することにより定量した。
（工程３．翻訳反応）
Ｔｒａｎｓｄｉｒｅｃｔ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ（島津製作所）を用い、以下の反応液をそれぞれ５０μＬスケールで調製した。Ｔｒａｎｓｄｉｒｅｃｔ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌは、Ｓｆ２１由来の抽出物を含む無細胞タンパク合成反応液であり、Ｓｆ２１由来の抽出物以外の成分としては、カリウム塩、マグネシウム塩、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ｔＲＮＡ、外来ｍＲＮＡ、及び緩衝剤を含む。
なお、ＲＮａｓｅ阻害剤としてはヒト胎盤由来のもの（タカラバイオ）を用い、ｐＡｐとしてはＡｄｅｎｏｓｉｎｅ ３’，５’−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を用い、１００ｍＭの水溶液として用意した。それぞれの反応液を、２５℃の翻訳反応に供した。
Ｔｒａｎｓｄｉｒｅｃｔ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ（島津製作所）を用い、以下の反応液をそれぞれ５０μＬスケールで調製した。Ｔｒａｎｓｄｉｒｅｃｔ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌは、Ｓｆ２１由来の抽出物を含む無細胞タンパク合成反応液であり、Ｓｆ２１由来の抽出物以外の成分としては、カリウム塩、マグネシウム塩、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ｔＲＮＡ、外来ｍＲＮＡ、及び緩衝剤を含む。
なお、ＲＮａｓｅ阻害剤としてはヒト胎盤由来のもの（タカラバイオ）を用い、ｐＡｐとしてはＡｄｅｎｏｓｉｎｅ ３’，５’−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を用い、１００ｍＭの水溶液として用意した。それぞれの反応液を、２５℃の翻訳反応に供した。
反応液１（比較用実験区）：
ｍＲＮＡ 非添加
ＲＮａｓｅ阻害剤 非添加
ｐＡｐ 非添加
反応液２（比較用実験区）：
ｍＲＮＡ 添加（終濃度３２０μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ阻害剤 非添加
ｐＡｐ 非添加
反応液３（比較用実験区）：
ｍＲＮＡ 添加（終濃度３２０μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ阻害剤 添加（終濃度１Ｕ／ｍＬ）
ｐＡｐ 非添加
反応液４（本発明の実験区）：
ｍＲＮＡ 添加（終濃度３２０μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ阻害剤 非添加
ｐＡｐ 添加（終濃度５ｍＭ）
ｍＲＮＡ 非添加
ＲＮａｓｅ阻害剤 非添加
ｐＡｐ 非添加
反応液２（比較用実験区）：
ｍＲＮＡ 添加（終濃度３２０μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ阻害剤 非添加
ｐＡｐ 非添加
反応液３（比較用実験区）：
ｍＲＮＡ 添加（終濃度３２０μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ阻害剤 添加（終濃度１Ｕ／ｍＬ）
ｐＡｐ 非添加
反応液４（本発明の実験区）：
ｍＲＮＡ 添加（終濃度３２０μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ阻害剤 非添加
ｐＡｐ 添加（終濃度５ｍＭ）
（工程４．ＲＮＡ抽出）
それぞれの反応液について、翻訳反応開始０、６０、１２０分後における反応液を回収した。回収した反応液１０μＬを、２０μＬのＴＲＩｚｏｌ ＬＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に回収し、全ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡは１０μＬの純水に溶解した。
それぞれの反応液について、翻訳反応開始０、６０、１２０分後における反応液を回収した。回収した反応液１０μＬを、２０μＬのＴＲＩｚｏｌ ＬＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に回収し、全ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡは１０μＬの純水に溶解した。
（工程５．ＲＮＡの分離検出）
抽出したＲＮＡの溶液に、それぞれ、４μＬのローディングバッファー（和光純薬）を添加し、その全量を電気泳動（ＴＡＥバッファー、１％アガロースゲル）に供した。塩基泳動により分離したＲＮＡはＥｔＢｒ（エチジウムブロマイド）染色により検出した。
得られた電気泳動像を図１に示す。図１において、レーン１は反応液１（ｍＲＮＡ非添加区）、レーン２は反応液２（ｍＲＮＡ添加区）、レーン３は反応液３（ｍＲＮＡ及びＲＮａｓｅ阻害剤を添加した区）、レーン４は反応液４（ｍＲＮＡ及びｐＡｐを添加した区）の、反応時間０、６０、１２０分における反応液中の全ＲＮＡの分離結果を示す。また、レーンＭは１ｋｂラダーDNAサイズマーカー（Bioneer）、レーンＣはｍＲＮＡのみを泳動した結果を示す。
抽出したＲＮＡの溶液に、それぞれ、４μＬのローディングバッファー（和光純薬）を添加し、その全量を電気泳動（ＴＡＥバッファー、１％アガロースゲル）に供した。塩基泳動により分離したＲＮＡはＥｔＢｒ（エチジウムブロマイド）染色により検出した。
得られた電気泳動像を図１に示す。図１において、レーン１は反応液１（ｍＲＮＡ非添加区）、レーン２は反応液２（ｍＲＮＡ添加区）、レーン３は反応液３（ｍＲＮＡ及びＲＮａｓｅ阻害剤を添加した区）、レーン４は反応液４（ｍＲＮＡ及びｐＡｐを添加した区）の、反応時間０、６０、１２０分における反応液中の全ＲＮＡの分離結果を示す。また、レーンＭは１ｋｂラダーDNAサイズマーカー（Bioneer）、レーンＣはｍＲＮＡのみを泳動した結果を示す。
（ｍＲＮＡ分解抑制効果の確認）
得られた電気泳動結果から、各実験区、及び各反応時間におけるｍＲＮＡ残存量を確認した。反応液２（ｍＲＮＡ添加区）と反応液３（ｍＲＮＡ及びＲＮａｓｅ阻害剤を添加した区）のデータ比較から、市販のＲＮａｓｅ阻害剤ではｍＲＮＡの分解抑制効果は認められないことが判明した。一方、反応液４（ｍＲＮＡ及びｐＡｐを添加した区）の、反応時間６０分及び１２０分におけるデータから、ｐＡｐに明らかに分解抑制効果があることが判明した。
得られた電気泳動結果から、各実験区、及び各反応時間におけるｍＲＮＡ残存量を確認した。反応液２（ｍＲＮＡ添加区）と反応液３（ｍＲＮＡ及びＲＮａｓｅ阻害剤を添加した区）のデータ比較から、市販のＲＮａｓｅ阻害剤ではｍＲＮＡの分解抑制効果は認められないことが判明した。一方、反応液４（ｍＲＮＡ及びｐＡｐを添加した区）の、反応時間６０分及び１２０分におけるデータから、ｐＡｐに明らかに分解抑制効果があることが判明した。
［実施例２］
実施例１の工程１〜３と同様の工程により、以下の反応液について翻訳反応を行った。
実施例１の工程１〜３と同様の工程により、以下の反応液について翻訳反応を行った。
反応液４（本発明の実験区）：
ｍＲＮＡ 添加（終濃度３２０μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ阻害剤 非添加
ｐＡｐ 添加（反応前添加：終濃度５ｍＭ、
追加添加：なし）
反応液５（本発明の実験区）：
ｍＲＮＡ 添加（終濃度３２０μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ阻害剤 非添加
ｐＡｐ 添加（反応前添加：終濃度１０ｍＭ
追加添加：なし）
反応液６（本発明の実験区）：
ｍＲＮＡ 添加（終濃度３２０μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ阻害剤 非添加
ｐＡｐ 添加（反応前添加：終濃度５ｍＭ、及び追加添加）
反応液６については、ｐＡｐを反応前に終濃度５ｍＭとなるように添加し、さらに、反応開始６０分後に、工程３で用意した１００ｍＭ ｐＡｐ水溶液を２．５μＬ添加した。これにより、反応当初から存在していたｐＡｐ以外の追加添加したｐＡｐの濃度は、５ｍＭとなった。
ｍＲＮＡ 添加（終濃度３２０μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ阻害剤 非添加
ｐＡｐ 添加（反応前添加：終濃度５ｍＭ、
追加添加：なし）
反応液５（本発明の実験区）：
ｍＲＮＡ 添加（終濃度３２０μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ阻害剤 非添加
ｐＡｐ 添加（反応前添加：終濃度１０ｍＭ
追加添加：なし）
反応液６（本発明の実験区）：
ｍＲＮＡ 添加（終濃度３２０μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ阻害剤 非添加
ｐＡｐ 添加（反応前添加：終濃度５ｍＭ、及び追加添加）
反応液６については、ｐＡｐを反応前に終濃度５ｍＭとなるように添加し、さらに、反応開始６０分後に、工程３で用意した１００ｍＭ ｐＡｐ水溶液を２．５μＬ添加した。これにより、反応当初から存在していたｐＡｐ以外の追加添加したｐＡｐの濃度は、５ｍＭとなった。
それぞれの反応液について、翻訳反応開始０、１２０、１８０、２４０分後における反応液を回収した以外は、実施例１と同様の工程４及び工程５を行った。
得られた電気泳動像を図２に示す。図２において、レーン４は反応液４（ｐＡｐを終濃度５ｍＭになるよう添加し、追加添加しなかった区）、レーン５は反応液５（ｐＡｐを終濃度１０ｍＭになるように添加し、追加添加しなかった区）、レーン６は反応液６（ｐＡｐを終濃度が５ｍＭになるように添加し、６０分後にさらにｐＡｐを追加添加した区）の、反応時間０、１２０、１８０、２４０分における反応液中の全ＲＮＡの分離結果を示す。また、レーンＭは１ｋｂラダーDNAサイズマーカー（Bioneer）を示す。
得られた電気泳動像を図２に示す。図２において、レーン４は反応液４（ｐＡｐを終濃度５ｍＭになるよう添加し、追加添加しなかった区）、レーン５は反応液５（ｐＡｐを終濃度１０ｍＭになるように添加し、追加添加しなかった区）、レーン６は反応液６（ｐＡｐを終濃度が５ｍＭになるように添加し、６０分後にさらにｐＡｐを追加添加した区）の、反応時間０、１２０、１８０、２４０分における反応液中の全ＲＮＡの分離結果を示す。また、レーンＭは１ｋｂラダーDNAサイズマーカー（Bioneer）を示す。
得られた電気泳動結果から、各実験区、及び各反応時間におけるｍＲＮＡ残存量を確認した。反応液４（ｐＡｐ ５ｍＭ添加、追加添加なしの区）の１８０分後のデータから、ｐＡｐのＲＮＡ分解抑制効果は時間とともに失われるが、反応液５（ｐＡｐ １０ｍＭ添加、追加添加なしの区）の２４０分後のデータ、及び、反応液６（ｐＡｐ ５ｍＭ添加、追加添加ありの区）の２４０分後のデータから、添加するｐＡｐの量を増加させること或いは追加添加により、分解抑制効果が持続することが判明した。
実施例１及び実施例２の結果から、反応液に添加するｐＡｐによってｍＲＮＡの分解が抑制可能であること、及び、添加する量によって分解抑制効果の持続時間を伸ばすことが可能であることが判明した。
［実施例３］
実施例１の工程１〜３と同様の工程により、以下の反応液について翻訳反応を行った。
実施例１の工程１〜３と同様の工程により、以下の反応液について翻訳反応を行った。
反応液４（本発明の実験区）：
ｍＲＮＡ 添加（終濃度３２０μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ阻害剤 非添加
ｐＡｐ 添加（終濃度５ｍＭ）
ＬｉＣｌ 非添加
反応液７（比較用実験区）：
ｍＲＮＡ 添加（終濃度３２０μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ阻害剤 非添加
ｐＡｐ 非添加
ＬｉＣｌ 添加（終濃度５０ｍＭ）
反応液８（本発明の実験区）：
ｍＲＮＡ 添加（終濃度３２０μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ阻害剤 非添加
ｐＡｐ 添加（終濃度５ｍＭ）
ＬｉＣｌ 添加（終濃度５０ｍＭ）
反応液７及び８においては、ストック用に４ＭのＬｉＣｌ水溶液を調製し、それを用いて、反応液中の終濃度が５０ｍＭとなるように調整した。
ｍＲＮＡ 添加（終濃度３２０μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ阻害剤 非添加
ｐＡｐ 添加（終濃度５ｍＭ）
ＬｉＣｌ 非添加
反応液７（比較用実験区）：
ｍＲＮＡ 添加（終濃度３２０μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ阻害剤 非添加
ｐＡｐ 非添加
ＬｉＣｌ 添加（終濃度５０ｍＭ）
反応液８（本発明の実験区）：
ｍＲＮＡ 添加（終濃度３２０μｇ／ｍＬ）
ＲＮａｓｅ阻害剤 非添加
ｐＡｐ 添加（終濃度５ｍＭ）
ＬｉＣｌ 添加（終濃度５０ｍＭ）
反応液７及び８においては、ストック用に４ＭのＬｉＣｌ水溶液を調製し、それを用いて、反応液中の終濃度が５０ｍＭとなるように調整した。
それぞれの反応液について、翻訳反応開始０、１８０、２４０分後における反応液を回収した以外は、実施例１と同様の工程４及び工程５を行った。
得られた電気泳動像を図３に示す。図３において、レーン４は反応液４（ｐＡｐを終濃度５ｍＭになるように添加し、ＬｉＣｌを添加しなかった区）、レーン７は反応液７（ＬｉＣｌを終濃度５０ｍＭになるように添加し、ｐＡｐを添加しなかった区）、レーン８は反応液８（ｐＡｐを終濃度５ｍＭになるように添加し、且つＬｉＣｌを終濃度５０ｍＭになるように添加した区）の、反応時間０、１８０、２４０分における反応液中の全ＲＮＡの分離結果を示す。また、レーンＭは１ｋｂラダーDNAサイズマーカー（Bioneer）を示す。
図３に示すとおり、ｐＡｐとＬｉＣｌをそれぞれ単独に添加した区（レーン４及びレーン７）では、１８０分後にほぼすべてのｍＲＮＡが分解されていることが確認されたが、ｐＡｐとＬｉＣｌの両方を添加した区（レーン８）では、２４０分後においてもｍＲＮＡが残存することが確認された。このことから、ｐＡｐに加えてＬｉＣｌを反応液中に添加することにより、分解抑制効果が持続することが判明した。
配列番号１〜４は、プライマーである。
Claims (6)
- 生体細胞由来の抽出液、カリウム塩、マグネシウム塩、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、緩衝剤、及びアデノシン３’，５’−ビスホスフェートを少なくとも含む無細胞タンパク質合成反応液を用いた、無細胞タンパク質合成方法。
- 前記無細胞タンパク質合成反応液が、リチウムイオンをさらに含む、請求項１に記載の無細胞タンパク質合成方法。
- 無細胞タンパク質合成反応を維持する間に、アデノシン３’，５’−ビスホスフェートを、前記無細胞タンパク質合成反応液に追加添加する、請求項１又は２に記載の無細胞タンパク質合成方法。
- 前記生体細胞が昆虫培養細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成方法。
- 生体細胞由来の抽出液、カリウム塩、マグネシウム塩、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、緩衝剤、及びアデノシン３’，５’−ビスホスフェートを少なくとも含む無細胞タンパク質合成反応液。
- リチウムイオンをさらに含む、請求項５に記載の無細胞タンパク質合成反応液。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007321946A JP2009142193A (ja) | 2007-12-13 | 2007-12-13 | アデノシン３’，５’−ビスホスフェートを用いた無細胞タンパク質合成方法及び無細胞タンパク質合成反応液 |
| US12/323,233 US20090155881A1 (en) | 2007-12-13 | 2008-11-25 | Cell-free protein synthesis method and cell-free protein synthesis reaction solution using adenosine 3',5'-bisphosphate |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|
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| CN110551785B (zh) * | 2018-06-01 | 2022-08-30 | 康码（上海）生物科技有限公司 | 一种用于体外蛋白质合成的无细胞冻干制剂、其制法和用途 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1433858A1 (en) * | 2002-12-27 | 2004-06-30 | Rengo Co., Ltd. | Preparation method of insect cell extract solution for cell-free protein synthesis, the insect cell extract solution and cell-free synthesis method of protein using the insect cell extract solution |
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2007
- 2007-12-13 JP JP2007321946A patent/JP2009142193A/ja active Pending
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2008
- 2008-11-25 US US12/323,233 patent/US20090155881A1/en not_active Abandoned
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