JP2023513836A - メッセンジャーｒｎａのインビトロ転写プロセスの改善 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ｍＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型として最適化されたＤＮＡ配列を調製するための方法を提供する。これらのＤＮＡ配列は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の早期終結を回避するために最適化される。本発明はまた、非鋳型的な「ランオフ」転写を低減又は防止するために、３’末端に１つ以上の終結シグナルを含む最適化されたＤＮＡ配列を調製するための方法を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年２月１８日に出願された米国仮出願第６２／９７８，１８０号に対する優先権を主張するものであり、その仮出願の開示は参照によって本明細書に組み込まれる。
配列表
本明細書は、配列表（「ＭＲＴ－２１２１ＵＳＰ１＿ＳＬ」という名称のテキスト（．ｔｘｔ）ファイルとして２０２０年２月１８日に電子的に提出されたもの）を参照する。当該テキストファイルは、日付に作成されたものであり、サイズは２４，６７５バイトである。当該配列表の全内容が、参照によって本明細書に組み込まれる。
ｍＲＮＡ療法は、様々な疾患を治療するためにますます重要になっている。Ｔ７及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは両方とも、ｍＲＮＡのインビトロ合成中に不全型（ａｂｏｒｔｉｖｅ）転写物を生成することが報告されている（Ｎａｍ ｅｔ ａｌ．１９８８，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６３：３４，ｐｐ １８１２３－１８１２７、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１０，１－９）。インビトロで合成されたｍＲＮＡに基づく治療用組成物におけるこのような不全型転写物の存在は、その安全性及び有効性に影響を与える可能性がある。
特にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって産生されるｍＲＮＡ転写物には、例えば、鋳型化された配列よりも長く伸長された転写物を生成する「ランオフ」転写が原因で、所望の転写物よりもより長いＲＮＡ及びより短いＲＮＡが混入していることが知られている。転写物のこれらの非鋳型的に伸長された部分は、ＲＮＡ分子自体又は別のＲＮＡ分子にアニーリングして、分子内ＲＮＡ二本鎖又は分子間ＲＮＡ二本鎖を形成し得る（Ｇｈｏｌａｍａｌｉｐｏｕｒ ｅｔ ａｌ．２０１８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６：１８ ｐｐ ９２５３－９２６３）。ＲＮＡ二本鎖は免疫原性が高い可能性がある（Ｍｕ ｅｔ ａｌ．２０１８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６：５２３９－５２４９）。ＲＮＡ二本鎖不純物は、標準的な実験室プロトコルを使用して、インビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡから効率的に除去されない。最も効果的な精製方法は、イオン対逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）であると考えられる。しかしながら、この方法は拡張可能ではなく、毒性試薬の使用を必要とし、多くの研究室にとって法外に高価なものである（Ｂａｉｅｒｓｄoｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，１５：２６－３５）。エタノール含有緩衝液中のセルロースへの二本鎖ＲＮＡの選択的結合は、最近、ＩＶＴ ｍＲＮＡからＲＮＡ二本鎖不純物を除去するためのスケーラブルな方法として特定されているが、この方法は、ＲＮＡ収率の顕著な低下をもたらした（Ｂａｉｅｒｓｄoｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１９，同書）。
ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの代替として使用されている。しかしながら、インビトロ転写においてＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが使用される場合、不完全なｍＲＮＡ転写物は依然として問題である。ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、ｒｒｎＢｔ１ターミネーターの２つのシグナル（上流及び下流のシグナル）で転写を停止し、シグナル領域の変化が終結効率に影響を及ぼすことが以前に報告されている（Ｋｗｏｎ ＆ Ｋａｎｇ １９９９， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７４：４１ ｐｐ ２９１４９－２９１５５）。発明者らは、ｒｒｎＢｔ１様終結シグナルが、ｍＲＮＡのインビトロ転写に使用される鋳型ＤＮＡ配列に頻繁に存在することを発見した。更に、彼らは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼでも「ランオフ」転写が起こる可能性があることを発見した。
ＷＯ２０１７／００９３７６は、環状ＤＮＡからＲＮＡを産生する方法であって、環状ＤＮＡ鋳型配列が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、続いて自己切断リボザイムをコードする配列、続いてＲＮＡポリメラーゼ終結配列要素を含む、方法を提供する。本出願に含まれるデータは、自己切断リボザイム及び２つ又は４つの終結配列を含む線状化ＤＮＡプラスミドからのインビトロ転写について、最大約９５％の終結効率を達成できることを示す。この大きさの終結効率は、治療用ｍＲＮＡの生産に使用される商業規模のプロセスには十分ではない。
ＷＯ２０１２／１７０４４３は、ファージプロモーターが、複数のターミネータードメインに作動可能に結合された対象ＲＮＡポリヌクレオチドをコードする配列に作動可能に連結された、環状ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを産生する方法を提供する。複数のターミネータードメインは、クラスＩ及びクラスＩＩの終結シグナルから選択される少なくとも３つの終結シグナルを含む。クラスＩ終結シグナル（Ｔ７ ｐｈｉターミネーターとしても知られる、ＰｈｉバクテリオファージＴ７ターミネーターによって例示される）は、安定なステムループ構造を形成し得、その後に一連の６つＵ残基が続くＲＮＡ配列をコードする。クラスＩＩ終結シグナル（ヒト副甲状腺前ホルモン（ＰＴＨ）遺伝子によって例示される）は、中断された一連の６つのＵ残基をコードするが、明らかなステムループ構造を欠く。ｒｒｎＢｔ１終結シグナルは、クラスＩＩ終結シグナルである。ＷＯ２０１７／００９３７６と同様に、ＷＯ２０１２／１７０４４３の実施例で試験されたＤＮＡ鋳型は、対象のＲＮＡポリヌクレオチドをコードする配列と、２つのＴ７ ｐｈｉターミネーター（クラスＩ）、２つのＰＴＧターミネーター（クラスＩＩ）、及びｐＢＲ３２２ターミネーター（クラスＩ）からなる複数のターミネータードメインとの間の自己切断リボザイムをコードする配列を含む。
Ｄｕｅｔ ａｌ．（２００９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｇｅｎ．，１０４（６）：１１８９－１１９６）は、Ｔ７ ｐｈｉターミネーターの大きなサイズ（１００ｂｐ）と非効率が問題であると考え、代わりに、各々８塩基対で区切られた１～３個の水胞性口内炎ウイルス（ｖｓｖ）クラスＩＩ終結シグナル（ＴＡＴＣＴＧＴＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣ）をタンデムで含めることによって、環状ＤＮＡ鋳型からの転写中の終結効率を改善することを試みた。その結果、単一のｖｓｖ終結シグナルを使用した場合、終結効率は５３～６２％に過ぎないことが判明した。２～３個のｖｓｖターミネーターを使用した場合、終了効率は６５～７５％に増加した。
したがって、早期終結（ｐｒｅｍａｔｕｒｅｌｙ ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）転写物及び二本鎖ｍＲＮＡを含まない完全長ｍＲＮＡ転写物を産生する、改善されたインビトロ転写法に対するニーズが存在する。
本発明は、ｍＲＮＡのインビトロ転写の鋳型として最適化されたＤＮＡ配列を調製するための方法を提供することによって、この必要性に対処する。これらのＤＮＡ配列は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の早期終結を回避するために最適化されている。加えて、本発明はまた、その３’末端で１つ以上の終結シグナルを含む最適化されたＤＮＡ配列を調製するための方法も提供する。終結シグナルは、「ランオフ」転写を低減又は防止するため、これらの最適化されたＤＮＡ配列の使用は、二本鎖ｍＲＮＡ転写物の形成を最小限に抑える。
一態様では、本発明は、インビトロ転写のための鋳型としてタンパク質をコードする最適化ＤＮＡ配列を調製するための方法に関し、当該方法は、（ａ）タンパク質コード配列を含むＤＮＡ配列を提供することと、（ｂ）ＤＮＡ配列中の終結シグナルの存在を決定することであって、終結シグナルは、以下の核酸配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’（配列番号１）を有し、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される、決定することと、（ｃ）１つ以上の終結シグナルが存在する場合、当該終結シグナルの２位、３位、４位、５位及び７位のうちのいずれか１つにおいて、１つ以上の核酸を他の３つの核酸のうちのいずれか１つで置換して最適化されたＤＮＡ配列を生成することによって、ＤＮＡ配列を修飾することであって、必要に応じて、１つ以上の置換核酸が、タンパク質コード配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を保存するために選択される、修飾することと、を含む。
いくつかの実施形態では、ステップｂ及びｃは、コンピュータによって実施される。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、５’ＵＴＲをコードする第１の核酸配列、及び／又は３’ＵＴＲをコードする第２の核酸配列を更に含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列中の終結シグナルの３’の直近の５つのヌクレオチドは、３つ以上のＴヌクレオチドを含まない。
いくつかの実施形態では、方法は、同じタンパク質配列をコードする野生型ＤＮＡ配列と比較して、（ａ）ｍＲＮＡプロセシング及び安定性に関連する要素、並びに／又は（ｂ）翻訳若しくはタンパク質折り畳みに関連する要素を、最適化するためにＤＮＡ配列を修飾するステップを更に含み、修飾は、最適化されたＤＮＡ配列が生成される前に行われる。ｍＲＮＡ処理又は安定性に関連する要素には、隠れた（ｃｒｙｐｔｉｃ）スプライス部位、ｍＲＮＡ二次構造、ｍＲＮＡの安定した自由エネルギー、反復配列、及びＲＮＡ不安定性モチーフが含まれ得る。翻訳又はタンパク質折り畳みに関連する要素は、コドン使用頻度バイアス、コドン適応性、内部Ｃｈｉ部位、リボソーム結合部位、未成熟ポリＡ（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｐｏｌｙＡ）部位、シャイン－ダルガーノ配列、コドンコンテキスト、コドン－アンチコドン相互作用、及び翻訳休止部位（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｐａｕｓｅ ｓｉｔｅ）を含み得る。
いくつかの実施形態では、方法は、最適化されたＤＮＡ配列を合成するステップを更に含む。方法は、合成された最適化されたＤＮＡ配列を、インビトロ転写を使用するための核酸ベクターに挿入することを更に含んでもよい。核酸ベクターは、最適化されたＤＮＡ配列に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含み得、任意選択的に、ＲＮＡポリメラーゼは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ又はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、核酸ベクターは、プラスミドである。プラスミドは、インビトロ転写前に線状化されてもよい。
いくつかの実施形態では、本方法は、合成された最適化されたＤＮＡ配列をインビトロ転写で使用してｍＲＮＡを合成することを更に含む。ｍＲＮＡは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによって合成されてもよい。ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、天然由来のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ又は組換えＳＰ６ポリメラーゼであってもよい。組換えＳＰ６ポリメラーゼは、タグ（例えば、ｈｉｓ－タグ）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって合成される。
いくつかの実施形態では、この方法は、合成されたｍＲＮＡをキャッピング及び／又はテーリングする別個のステップを更に含む。いくつかの実施形態では、キャッピング及びテーリングは、インビトロ転写中に起こる。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、各ＮＴＰが１～１０ｍＭの範囲の濃度のＮＴＰ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のＤＮＡ鋳型、及び０．０１～０．１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含む反応混合物で合成される。例えば、反応混合物は、５ｍＭの濃度のＮＴＰ、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のＤＮＡ鋳型、及び０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含んでもよい。ＮＴＰは、天然由来のＮＴＰであってもよく、又は修飾ＮＴＰを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、３７～５６℃の範囲の温度で合成されてもよい。
いくつかの実施形態では、コンピュータプログラムは、プログラムがコンピュータによって実行されるとき、コンピュータに、（ａ）タンパク質コード配列を含むＤＮＡ配列を受信させ、及び（ｂ）本発明のインビトロ転写のための鋳型としてタンパク質をコードする最適化されたＤＮＡ配列を調製するための上記の方法のステップ（ｂ）及び（ｃ）を実施させる命令を含む。本発明はまた、本発明のコンピュータプログラムを記憶させたコンピュータ可読データキャリアを提供する。本発明は更に、本発明のコンピュータプログラムを搬送するデータキャリア信号を提供する。本発明は更に、本発明のインビトロ転写のための鋳型としてタンパク質をコードする最適化されたＤＮＡ配列を調製するための方法を実施するための手段を含む、データ処理システムを提供する。
別の態様では、本発明は、インビトロ転写のための鋳型としてタンパク質をコードする最適化されたＤＮＡ配列を調製するための方法に関し、当該方法は、（ａ）タンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供することと、（ｂ）ＤＮＡ配列の３’末端に１つ以上の終結シグナルを付加して、最適化されたＤＮＡ配列を提供することと、を含み、１つ以上の終結シグナルは、以下の核酸配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’（配列番号１）を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される。
いくつかの実施形態では、終結シグナルは、核酸配列５’－Ｘ１ＡＴＣＴＧＴＴ－３’（配列番号２）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｘ１が、Ｔである。いくつかの実施形態では、Ｘ１が、Ｃである。
いくつかの実施形態では、終結シグナルは、５’ＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号３）、５’ＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号４）、５’ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号５）、５’ＣＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号６）、５’ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＴ－３’（配列番号７）、５’ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＴ－３’（配列番号８）、又は５’ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＴ－３’（配列番号９）から選択される。
いくつかの実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上の終結シグナルが、ＤＮＡ配列の３’末端に付加される。
いくつかの実施形態では、タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、５’ＵＴＲをコードする第１の核酸配列、及び／又は３’ＵＴＲをコードする第２の核酸配列を更に含み得る。ＤＮＡ配列は、ポリＡテールをコードする第３の核酸配列を更に含んでもよく、又は含んでいなくてもよい。
いくつかの実施形態では、タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、リボザイムをコードするＤＮＡ配列を更に含まない。
いくつかの実施形態では、タンパク質をコードするＤＮＡ配列中の終結シグナルの３’の直近の５つのヌクレオチドが、３つ以上のＴヌクレオチドを含まない。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、２つ以上の終結シグナルを含み、該終結シグナルは、１０塩基対以下、例えば５～１０塩基対で区切られる。
いくつかの実施形態では、最適化されたＤＮＡ配列は、以下の配列：（ａ）５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－（ＺＮ）－Ｘ４ＡＴＣＴＸ５ＴＸ６－３’（配列番号１０）又は（ｂ）５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－（ＺＮ）－Ｘ４ＡＴＣＴＸ５ＴＸ６－（ＺＭ）－Ｘ７ＡＴＣＴＸ８ＴＸ９－３’（配列番号１１）を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８及びＸ９が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択され、ＺＮは、Ｎ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、及びＺＭは、Ｍ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、それらの各々が独立してＡ、Ｃ、ＴのＧから選択され、及び式中、Ｎ及び／又はＭは独立して１０以下である。いくつかの実施形態では、Ｎは、５、６、７、８、９又は１０であり、かつ／又はＭは、５、６、７、８、９、１０である。いくつかの実施形態では、ＺはＴである。
いくつかの実施形態では、方法は、同じタンパク質配列をコードする野生型ＤＮＡ配列と比較して、（ａ）ｍＲＮＡプロセシング及び安定性に関連する要素、並びに／又は（ｂ）翻訳若しくはタンパク質折り畳みに関連する要素を、最適化するためにＤＮＡ配列を修飾するステップを更に含み、修飾は、最適化されたＤＮＡ配列が生成される前に行われる。ｍＲＮＡ処理又は安定性に関連する要素には、隠れたスプライス部位、ｍＲＮＡ二次構造、ｍＲＮＡの安定した自由エネルギー、反復配列、及びＲＮＡ不安定性モチーフが含まれ得る。翻訳又はタンパク質折り畳みに関連する要素は、コドン使用頻度バイアス、コドン適応性、内部Ｃｈｉ部位、リボソーム結合部位、未成熟ポリＡ部位、シャイン－ダルガーノ配列、コドンコンテキスト、コドン－アンチコドン相互作用、及び翻訳休止部位を含み得る。
いくつかの実施形態では、本方法は、最適化されたＤＮＡ配列を、インビトロ転写で使用するための核酸ベクターに挿入することを更に含んでもよい。
別の態様では、本発明は、インビトロ転写で使用するためのＤＮＡ配列に関し、５’から３’の順序で、（ａ）５’ＵＴＲと、（ｂ）タンパク質コード配列と、（ｃ）３’ＵＴＲと、（ｄ）任意選択的にポリＡテールをコードする核酸配列と、（ｅ）終結シグナルと、を含み、終結シグナルは、以下の核酸配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’（配列番号１）を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される。いくつかの実施形態では。
いくつかの実施形態では、Ｘ１が、Ｔである。いくつかの実施形態では、Ｘ１が、Ｃである。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列の終結シグナルは、５’ＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号３）、５’ＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号４）、５’ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号５）、５’ＣＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号６）、５’ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＴ－３’（配列番号７）、５’ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＴ－３’（配列番号８）、又は５’ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＴ－３’（配列番号９）から選択される。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、２つ以上の終結シグナル、例えば、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、終結シグナルは、１０塩基対以下、例えば５～１０塩基対で区切られる。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、以下の配列：（ａ）５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－（ＺＮ）－Ｘ４ＡＴＣＴＸ５ＴＸ６－３’（配列番号１０）又は（ｂ）５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－（ＺＮ）－Ｘ４ＡＴＣＴＸ５ＴＸ６－（ＺＭ）－Ｘ７ＡＴＣＴＸ８ＴＸ９－３’（配列番号１１）を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８及びＸ９が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択され、ＺＮは、Ｎ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、及びＺＭは、Ｍ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、それらの各々が独立してＡ、Ｃ、ＴのＧから選択され、及び式中、Ｎ及び／又はＭは独立して１０以下である。いくつかの実施形態では、Ｎは、５、６、７、８、９又は１０であり、かつ／又はＭは、５、６、７、８、９又は１０である。いくつかの実施形態では、ＺはＴである。
いくつかの実施形態では、終結シグナルは、ＤＮＡ配列の５’ＵＴＲ、タンパク質コード配列、及び３’ＵＴＲに存在しない。
いくつかの実施形態では、タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、リボザイムをコードするＤＮＡ配列を更に含まない。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、同じタンパク質配列をコードする野生型ＤＮＡ配列と比較して、（ａ）ｍＲＮＡプロセシング及び安定性に関連する要素、並びに／又は（ｂ）翻訳若しくはタンパク質折り畳みに関連する要素を、最適化するために修飾される。
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のＤＮＡ配列を含む核酸ベクターを更に提供する。核酸ベクターは、最適化されたＤＮＡ配列に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含み得、任意選択的に、ＲＮＡポリメラーゼは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ又はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、核酸ベクターは、プラスミドである。
いくつかの実施形態では、本発明はまた、本発明のＤＮＡ配列又は核酸ベクターを含むインビトロ転写で使用するためのキットを提供する。キットは、ＮＴＰ及びＲＮＡを更に含み得る。
別の態様では、本発明は、ｍＲＮＡの産生のための方法に関し、当該方法は、本発明の核酸ベクターを、ＮＴＰ及びＲＮＡポリメラーゼを含む反応混合物に添加することを含み、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ配列をｍＲＮＡ転写物に転写する。核酸ベクターはプラスミドであってもよく、インビトロ転写前に線状化されていてもよいし、そうでない場合もある。ＲＮＡポリメラーゼは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼであってもよい。ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、天然由来のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ又は組換えＳＰ６ポリメラーゼであってもよい。組換えＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、タグ（例えば、ｈｉｓ－タグ）を含んでもよい。あるいは、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼであってもよい。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの産生のための方法は、合成されたｍＲＮＡをキャッピング及び／又はテーリングする別個のステップを更に含む。いくつかの実施形態では、キャッピング及びテーリングは、インビトロ転写中に起こる。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、各ＮＴＰが１～１０ｍＭの範囲の濃度のＮＴＰ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のＤＮＡ鋳型、及び０．０１～０．１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含む反応混合物で合成される。例えば、反応混合物は、５ｍＭの濃度のＮＴＰ、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のＤＮＡ鋳型、及び０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含んでもよい。ＮＴＰは、天然由来のＮＴＰであってもよく、又は修飾ＮＴＰを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、３７～５６℃の範囲の温度、例えば、５０～５２℃で合成されてもよい。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの産生のための方法は、終結シグナルで終結するｍＲＮＡ転写物の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％を結果として生じ得る。終結部位は、（ｉ）サイズが１００ヌクレオチド未満の３’末端断片を生成するためのｍＲＮＡの消化、及び（ｉｉ）液体クロマトグラフィーによる３’末端断片の分析によって決定され得る。終結部位は、ＲＮＡシーケンシングによって決定されてもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼであり、ｍＲＮＡ転写物は、ＲＮＡ二本鎖を実質的に含まない。ｍＲＮＡ転写物は、対照と比較して検出不可能なレベルのＲＮＡ二本鎖を含有してもよい。ＲＮＡ二本鎖は、ｄｓＲＮＡに特異的に結合する抗体を用いて検出されてもよい。
本明細書に記載される任意の態様又は実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様又は実施形態と組み合わせることができる。本開示は、その詳細な説明と併せて記載されてきたが、前述の記載は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を例示することを意図しており、限定するものではない。その他の態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
本明細書に参照される特許及び科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立する。本明細書に引用される全ての米国特許及び公開又は未公開の米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書に引用される全ての米国特許及び公開又は未公開の米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書に引用されるその他全ての公表された参考文献、文書、原稿及び科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の他の特徴及び利点は、実施例を含む、図面及び以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
上記及び更なる特徴は、添付図面と併せて読む場合、以下の詳細な説明からより明確に理解されるであろう。図面は、単に例示を目的とするものであり、制限するためのものではない。
セクションＩは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼで合成されたｍＲＮＡ－１のキャピラリー電気泳動プロファイルを示すエレクトロフェログラムである。 ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼで合成された、ｍＲＮＡ－１及びＴＡＴＣＴＧＴＴ終結シグナル配列における点変異を有するｍＲＮＡ－１のバリアントのキャピラリー電気泳動による全ＲＮＡの定量的分析から生成されたデジタルゲル画像である。 ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ又はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのいずれかで調製されたｍＲＮＡサンプルで検出されたｄｓＲＮＡの量を示すドットブロットの画像である。検出のために西洋わさびペルオキシドでコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧ抗体を使用して、マウスモノクローナル抗体Ｊ２を用いてｄｓＲＮＡの存在を決定した。ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼで調製された試料中に潜在的に存在する任意のｄｓＲＮＡは、検出下限（ＬＬＯＤ）未満であった。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼで調製した試料中のｄｓＲＮＡの量は、２５ｎｇを超えていた。 ＳＰ６ ｍＲＮＡ転写物の３’末端の解析結果を提供する。ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼにより転写されたｍＲＮＡをＲＮａｓｅＨを使用して消化し、３’末端消化産物を、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）により分析し（図４Ａ）、質量分析によって決定されたそのサイズに基づいて断片を同定した（図４Ｂ）。 ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（上部パネル）及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（下部パネル）のｍＲＮＡ転写物の非鋳型的な伸長を比較する。鋳型による転写後のｍＲＮＡ転写物の３’末端に添加された余分なヌクレオチドの数を、ＬＣ／ＭＳ（図５Ａ）及びＲＮＡシーケンシング（図５Ｂ）によって決定した。 線状化プラスミドからＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼにより合成されたｍＲＮＡ－１２のキャピラリー電気泳動プロファイル（セクションＩ）を示すエレクトロフェログラムを提供する。プラスミドは、未修飾（図６Ａ）であるか、又はｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の３’末端に１つ（図６Ｂ）若しくは２つ（図６Ｃ）のｒｒｎＢ終結ｔ１シグナルを付加することによって修飾された。 スーパーコイル化（非線状化）プラスミドからＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼで合成されたｍＲＮＡ－１２のキャピラリー電気泳動プロファイル（セクションＩ）を示すエレクトロフェログラムを提供する。プラスミドは、未修飾（図７Ａ）であるか、又はｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の３’末端に１つ（図７Ｂ）若しくは２つ（図７Ｃ）のｒｒｎＢ終結ｔ１シグナルを付加することによって修飾された。 ３７℃（図８Ａ）又は５０℃（図８Ｂ）でのスーパーコイル化（非線状化）プラスミドからＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼで合成されたｍＲＮＡ－１２のキャピラリー電気泳動プロファイル（セクションＩ）を示すエレクトロフェログラムを提供する。プラスミドは、ｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の３’末端に２つのｒｒｎＢ終結ｔ１シグナルを加えることによって修飾された。 ３７℃（図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、９Ｇ）又は５０℃（図９Ｂ、９Ｄ、９Ｆ、９Ｈ）でのスーパーコイル化（非線状化）プラスミドからＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼで合成されたｍＲＮＡ－１２について生成されたキャピラリー電気泳動プロファイルを示すエレクトロフェログラムを提供する。プラスミドは、未修飾（図９Ａ、９Ｂ）であるか、又はｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の３’末端の１つ（図９Ｃ、９Ｄ）、２つ（図９Ｅ、９Ｆ）、又は３つ（図９Ｇ、９Ｈ）のｒｒｎＢ終結ｔ１シグナルの付加によって修飾された。 線状化されていない未修飾プラスミド（終結配列を含まない）から転写されたｍＲＮＡ－１２から発現したタンパク質のレベルと、ｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の３’末端に３つのｒｒｎＢ終結ｔ１シグナルを付加することによって修飾されたスーパーコイル化プラスミドから転写されたｍＲＮＡ－１２から発現したタンパク質のレベルとを比較する。
定義
本発明がより容易に理解されるように、ある特定の用語を最初に以下に定義する。以下の用語及び他の用語の追加の定義は、本明細書全体に記載される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。
特に明記されていない限り、又は文脈から明白でない限り、本明細書で使用される場合、用語「又は」は包括的であると理解され、「又は」及び「及び」の両方を包含する。
用語「例えば」、及び「すなわち」は、本明細書で使用される場合、限定を意図することなく単に例として使用されるものであり、本明細書に明示的に列挙された項目のみを参照するものとして解釈されるべきではない。
用語「以上」、「少なくとも」、「より大きい」など、例えば、「少なくとも１つ」は、記載された値よりも、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９若しくは１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００又はそれ以上が含まれるが、これらに限定されないことが理解される。また、その間の任意のより大きな数又は分数も含まれる。
逆に、用語「以下」は、指定された値よりも小さい各値が含まれる。例えば、「１００ヌクレオチド以下」には、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、及び０ヌクレオチドが含まれる。また、その間の任意のより小さい数又は分数も含まれる。
用語「複数」は、「少なくとも２つ」、「２つ以上」、「少なくとも第２の」等々、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９若しくは１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００又はそれ以上が含まれるが、これらに限定されないことが理解される。また、その間の任意のより大きな数又は分数も含まれる。
本明細書の全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載される要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群の包含を暗示するが、他の要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群の除外を暗示するものではないと理解される。
特に明記されていない限り、又は文脈から明らかな場合を除き、本明細書で使用される場合、用語「約」は、当技術分野での通常の許容範囲内、例えば、平均の２標準偏差の範囲内であると理解される。「約」は、記載値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、又は０．００１％以内であると理解され得る。文脈から明確でない限り、本明細書に提供される全ての数値は、当業者によって理解され得る通常の変動を反映している。
本明細書で使用される場合、用語「不全型転写物」又は「前不全（ｐｒｅ－ａｂｏｒｔｅｄ）転写物」などは、配列非依存性の様式で鋳型ＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼの早期放出に起因する、ＤＮＡ鋳型によってコードされる完全長ｍＲＮＡ分子よりも短い任意の転写物である。いくつかの実施形態では、不全型転写物は、標的ＤＮＡ分子から転写される完全長ｍＲＮＡ分子の長さの９０％未満、例えば、完全長ｍＲＮＡ分子の長さの８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％未満であってもよい。
本明細書で使用される場合、用語「バッチ」は、一度に合成される、例えば、同じ製造サイクル中の単一の製造順序に従って産生される、ｍＲＮＡの量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）又は量（ａｍｏｕｎｔ）を指す。バッチは、１セットの条件下での連続合成のために、酵素の単回アリコート及び／又はＤＮＡ鋳型の単回アリコートを介して発生する、１回の反応で合成されたｍＲＮＡの量を指す場合がある。いくつかの実施形態では、バッチは、反応が進行するにつれて、全ての試薬及び／又は成分が補充されるかつ／又は補給されるわけではない反応から産生されたｍＲＮＡを含む。用語「バッチ」は、所望の量を達成するために組み合わされる異なる時点で合成されたｍＲＮＡを意味するものではない。
本明細書で使用される場合、用語「コドン最適化（ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）」及び「コドン最適化（ｃｏｄｏｎ－ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）」は、そのアミノ酸配列を変化させないペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードする天然型又は野生型核酸のコドン組成物の修飾を指し、それによって該核酸のタンパク質発現を改善する。天然型又は野生型の核酸に対するこうした修飾は、可能な限り高いＧ／Ｃ含量を達成し、コドン使用を調整して希少又は速度制限コドンを回避し、不安定化核酸配列若しくはモチーフを除去し、かつ／又は休止部位若しくは終結配列を除去するために行われてもよい。
本明細書で使用される際に、「送達」という用語は、局所送達及び全身送達の両方を包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされたタンパク質が発現され、標的組織内で保持される状況（「局所分布」又は「局所送達」とも称される）、及びｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされたタンパク質が発現され、患者の循環系（例えば、血清）中に分泌され、全身に分布され、他の組織によって取り込まれる状況（「全身分布」又は「全身送達」とも称される）を包含する。
本明細書で使用される場合、用語「薬物」、「薬剤」、「治療」、「活性薬剤」、「治療化合物」、「組成物」、「化合物」は、互換的に使用され、身体機能の疾患、病気、状態、又は障害を治療又は予防するために使用できる任意の化学物質、医薬、薬物、生物、植物などを指す。薬物は、公知及び潜在的に治療化合物の両方を含み得る。薬物は、当業者に公知のスクリーニングを使用してスクリーニングすることによって治療的であると判断され得る。「公知の治療化合物」、「薬物」、又は「薬剤」は、（例えば、動物実験又はヒトへの投与に関する過去の経験を通して）そのような治療において有効であることが示されている治療化合物を指す。「治療レジメン」は、本明細書に開示される「薬物」、「薬剤」、「治療」、「活性薬剤」、「治療化合物」、「組成物」、「化合物」を含む治療、及び／又は対象による行動修正を含む治療、及び／又は外科手術手段を含む治療に関する。
本明細書で使用される場合、「封入」という用語、又は文法的等価物は、ナノ粒子内にｍＲＮＡ分子を閉じ込めるプロセスを指す。所望のｍＲＮＡをナノ粒子内に組み込むプロセスは、しばしば「担持させる（ｌｏａｄｉｎｇ）」と称される。例示的な方法は、Ｌａｓｉｃ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５－２５８，１９９２に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。ナノ粒子組み込まれた核酸は、ナノ粒子の内部空間、二分子膜内（リポソームナノ粒子の場合）に完全に若しくは部分的に位置するか、又はナノ粒子膜の外表面と会合し得る。
本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、以下の事象：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の生成（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／又は３’末端形成による）、（３）ポリペプチド又はタンパク質へのＲＮＡの翻訳、及び／又は（４）ポリペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾、のうちの１つ以上を指す。この用途において、用語「発現」及び「生成」並びに文法的等価物は互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、特定のアッセイ、例えば、ゲル電気泳動、並びにキャピラリー電気泳動による分離を伴うＵＶ及びＵＶ吸収分光法を用いた検出を使用する場合、「完全長ｍＲＮＡ」が特性評価される。完全長ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子の長さは、標的ＤＮＡから転写される完全長ｍＲＮＡ分子の長さの少なくとも５０％、例えば、標的ＤＮＡから転写される完全長ｍＲＮＡ分子の長さの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．０１％、９９．０５％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％である。
本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加させる」、若しくは「低減させる」、又は文法的同義語は、ベースライン測定、例えば、本明細書に記載の治療の開始前の同じ個体における測定、又は本明細書に記載の治療の不在下での対照対象（又は複数の対照対象）における測定と比較した値を示す。「対照対象」とは、治療されている対象と同じ疾患形態に罹患しており、治療されている対象とほぼ同じ年齢の対象である。
本明細書で使用される場合、用語「不純物」は、限定された量の液体、気体、又は固体内の物質を指し、これは標的物質又は化合物の化学組成とは異なる。不純物は、混入物とも呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内というよりむしろ、人工環境下で、例えば、試験管又は反応容器内、細胞培養下などで生じる事象を指す。
本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、ヒト及び非ヒト動物などの多細胞生物内で生じる事象を指す。細胞ベースの系の文脈では、この用語は、（例えば、インビトロ系とは対照的に）生きている細胞内で生じる事象を指すために使用され得る。
本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、（１）（自然界及び／又は実験的環境にかかわらず）最初に産生されたときに会合していた成分のうちの少なくともいくつかから分離しており、かつ／又は（２）人工的に産生、調製、及び／若しくは製造された物質及び／又は実体を指す。
本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドを指す。本明細書で使用されるｍＲＮＡは、修飾及び未修飾の両方のＲＮＡを包含する。ｍＲＮＡは、１つ以上のコード領域及び非コード領域を含み得る。ｍＲＮＡは、天然の供給源から精製されてもよく、組換え発現系を使用して作製されてもよく、及び任意で精製されてもよく、インビトロで転写されてもよく、又は化学的に合成されてもよい。必要に応じて、例えば、化学的に合成された分子の場合、ｍＲＮＡは、化学修飾された塩基又は糖、骨格修飾などを有する類似体などのヌクレオシド類似体を含み得る。ｍＲＮＡ配列は、別段指示されない限り、５’から３’の方向に提示される。
ｍＲＮＡは、典型的には、ＤＮＡからリボソームに情報を運ぶＲＮＡの種類と考えられている。ｍＲＮＡの存在期間は、通常非常に短く、プロセシング及び翻訳、その後の分解が含まれる。典型的には、真核生物において、ｍＲＮＡプロセシングは、Ｎ末端（５’）上に「キャップ」を、Ｃ末端（３’）上に「テール」を付加することを含む。典型的なキャップは、７－メチルグアノシンキャップであり、これは、最初に転写されたヌクレオチドへの５’－５’－三リン酸結合を介して連結されたグアノシンである。キャップの存在は、大半の真核細胞にみられるヌクレアーゼへの耐性を提供する上で重要である。テールは、典型的にはポリＡ部分がｍＲＮＡ分子の３’末端に付加されるポリアデニル化事象である。この「テール」の存在は、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護する役割を果たす。メッセンジャーＲＮＡは通常、リボソームによってタンパク質を構成する一連のアミノ酸に翻訳される。
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、その最も広範な意味で、ポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、又は組み込まれ得る任意の化合物及び／又は物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、又は組み込まれ得る化合物及び／又は物質である。いくつかの実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／又はヌクレオシド）を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡ、並びに一本鎖及び／若しくは二本鎖のＤＮＡ並びに／又はｃＤＮＡを包含する。更に、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、及び／又は同様の用語は、核酸類似体、すなわち、ホスホジエステル骨格以外を有する類似体を含む。核酸は、別途指示されない限り、５’から３’の方向に提示される。
本明細書で使用される場合、用語「早期終結」は、ＤＮＡ鋳型の完全長が転写される前の転写の終結を指す。早期終結は、ＤＮＡ鋳型内に終結シグナルが存在によって引き起こされ、完全長ｍＲＮＡよりも短いｍＲＮＡ転写物（「早期終結転写物」又は「トランケートしたｍＲＮＡ転写物」）をもたらす。終結シグナルの例としては、本明細書に記載されるＥ．ｃｏｌｉｒｒｎＢターミネーターｔ１シグナル（コンセンサス配列：ＡＴＣＴＧＴＴ）及びそのバリアントが挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「ランオフ転写」は、ｍＲＮＡ転写物の末端で非鋳型的な核酸の付加を指す。本明細書に記載されるように、ＲＮＡポリメラーゼは、転写終結シグナルに遭遇した後、非鋳型媒介様式でｍＲＮＡ転写物を伸長し続ける。付加された配列は、本明細書では、「ランオフ」又は「ランオフ配列」と呼称される。いくつかの実施形態では、ランオフ配列は、鋳型化されたｍＲＮＡ転写物の一部で自己アニーリング又はアニーリングして、二本鎖又は二本鎖ＲＮＡを形成することができる。
本明細書で使用される場合、用語「ショートマー（ｓｈｏｒｔｍｅｒ）」は、インビトロ転写反応中に不完全なｍＲＮＡ転写の産物である、短いアボーティブＲＮＡ転写物とも呼ばれる、早期に中止された（ｐｒｅｍａｔｕｒｅｌｙ ａｂｏｒｔｅｄ）短いｍＲＮＡオリゴヌクレオチドを特に指すために使用される。ショートマー、早期に中止されたｍＲＮＡ、前不全型（ｐｒｅ－ａｂｏｒｔｉｖｅ）ｍＲＮＡ、又は短い不全型ｍＲＮＡ転写物は、本明細書において互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的とする特徴又は特性の全又はほぼ全範囲又は程度を呈する質的状態を指す。生物学分野の当業者であれば、生物学的及び化学的現象が、完了すること、及び／又は完了に至ること、又は絶対的結果を達成若しくは回避することが、仮にあったとしてもめったにないことを理解するであろう。したがって、用語「実質的に」は、多くの生物学的及び化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するために本明細書で使用される。
本明細書で使用される場合、用語「鋳型ＤＮＡ」（又は「ＤＮＡ鋳型」）は、典型的には、インビトロ転写によって合成されるｍＲＮＡ転写物をコードする核酸配列を含むＤＮＡ分子に関する。鋳型ＤＮＡは、鋳型ＤＮＡによってコードされるｍＲＮＡ転写物を産生するためのインビトロ転写の鋳型として使用される。鋳型ＤＮＡは、インビトロ転写に必要な全ての要素、特に、例えば、所望のｍＲＮＡ転写をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結された、例えば、Ｔ３、Ｔ７及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合のためのプロモーター要素を含む。更に、鋳型ＤＮＡは、ｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の５’及び／又は３’のプライマー結合部位を含み、例えば、ＰＣＲ又はＤＮＡシーケンシングによって、ｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の同一性を決定することができる。本発明の文脈における「鋳型ＤＮＡ」は、線状又は環状ＤＮＡ分子であってもよい。本明細書で使用される場合、用語「鋳型ＤＮＡ」は、所望されるｍＲＮＡ転写物をコードする核酸配列を含むプラスミドＤＮＡなどのＤＮＡベクターを指す場合がある。
本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、他に定義されない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解され、本出願が属する技術分野で一般的に使用されるものと同じ意味を有し、そのような技術は参照によりその全体が組み込まれる。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が優先される。
ＤＮＡ鋳型配列におけるコンセンサスモチーフＴＡＴＣＴＧＴＴを含む終結シグナルの意図しない存在は、ＳＰ６及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写の早期終結をもたらし、所望される完全長ｍＲＮＡ転写物の収率が大幅に低下する、ｍＲＮＡ転写物の不均一な集団につながる可能性がある。本発明者らは、コンセンサス終結シグナルＴＡＴＣＴＧＴＴの１位、６位、又は８位での単一の点変異が、インビトロ転写の早期終結を防止するのに十分であることを確認した。発明者らはまた、以前に同定されたコンセンサスモチーフＴＡＴＣＴＧＴＴのそのようなバリアントが、インビトロ転写で使用するためのコドン最適化されたＤＮＡ鋳型配列に頻繁に存在することも発見した。更に、以前の研究では、コンセンサスモチーフＴＡＴＣＴＧＴＴの３’の直近にあるＴリッチ配列が転写の終結に必要であることが示唆されていたが（Ｋｗｏｎ ＆ Ｋａｎｇ １９９９，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４：４１，ｐｐ ２９１４９－２９１５５）、本発明者らは、これが終結シグナルの必須要素ではないことを実証した。本発明者の発見は、終結シグナルをスクリーニングし、それらをそのようなＤＮＡ鋳型配列から効果的に除去することを可能にする。
したがって、一態様では、本発明は、インビトロ転写のための鋳型としてタンパク質をコードする最適化ＤＮＡ配列を調製するための方法を対象とし、当該方法は、（ａ）タンパク質コード配列を含むＤＮＡ配列を提供すること、（ｂ）ＤＮＡ配列中の終結シグナルの存在を決定することを含み、終結シグナルは、以下の核酸配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’を有し、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される、決定することと、（ｃ）１つ以上の終結シグナルが存在する場合、当該終結シグナルの２位、３位、４位、５位及び７位のうちのいずれか１つにおいて、１つ以上の核酸を他の３つの核酸のうちのいずれか１つで置換して最適化されたＤＮＡ配列を生成することによって、ＤＮＡ配列を修飾することであって、必要に応じて、１つ以上の置換核酸が、タンパク質コード配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を保存するために選択される、修飾することと、を含む。
ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較して、不全型転写物（いわゆる「ショートマー」）が著しく低減したｍＲＮＡを合成するので、ｍＲＮＡの大規模なインビトロ合成に比類なく好適である（ＷＯ２０１８／１５７１５３を参照）。更に、本発明者らは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼとは異なり、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによって合成されるｍＲＮＡ転写物が、分子内又は分子間二本鎖を形成せず、したがって、本質的に二本鎖ｍＲＮＡを含まないことを本明細書に示す。
発明者らは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ又はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのいずれかを使用したときに、インビトロ合成中にｍＲＮＡ転写物の非鋳型的な伸長（ランオフ転写）が起こることを発見した。ｍＲＮＡ転写物の末端に「ランオフ」配列が存在することは、様々な理由から問題となる可能性がある。例えば、得られたｍＲＮＡ調製物の不均一性を増加させ、それゆえ、例えば、バッチ間変動のために、品質管理をより困難にする。「ランオフ」はまた、ｍＲＮＡプロセシング及び安定性に関連する望ましくない要素をｍＲＮＡ転写物に導入することもある。更に、少なくともＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写プロセスに関して、転写の「ランオフ」は、ＲＮＡ二本鎖の形成をもたらす。インビトロ合成によるｍＲＮＡの産生のための既存の方法を改善するために、本発明は、１つ以上の終結シグナルをＤＮＡ鋳型の３’末端に付加してｍＲＮＡ転写物の非鋳型的な伸長を防止する方法及びＤＮＡ配列を提供する。発明者らは驚くべきことに、１つ以上の終結シグナルの付加が、ＲＮＡポリメラーゼによるそれに応じて修飾されたＤＮＡ鋳型の転写を終結させるのに非常に効果的であるため、インビトロ転写の前に、ＤＮＡ鋳型を含むプラスミドを線状化する必要がなくなることを発見した。通常の制限酵素とのインキュベーションを含む線状化ステップの除去は、特に医薬品を製造するために大規模に行われた場合に、ｍＲＮＡの産生において大幅なコスト削減をもたらすことができる。ＷＯ２０１７／００９３７６及びＷＯ２０１２／１７０４４３では、インビトロ合成によるＲＮＡの産生のための鋳型として環状プラスミドが使用された。しかしながら、このＤＮＡ鋳型配列は、自己切断リボザイムをコードする配列と、複数の終結シグナルをコードする配列の両方を含んでいた。本発明者らは、終結配列のみの付加による、環状ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写により、ｍＲＮＡ合成中に９０％を超える終結効率を達成できることを初めて実証した。
したがって、更なる態様では、本発明は、インビトロ転写のための鋳型としてタンパク質をコードする最適化ＤＮＡ配列を調製するための方法を提供し、当該方法は、（ａ）タンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供することと、（ｂ）ＤＮＡ配列の３’末端に１つ以上の終結シグナルを付加して、最適化されたＤＮＡ配列を提供することと、を含み、１つ以上の終結シグナルは、以下の核酸配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される。本発明は、インビトロ転写で使用するためのＤＮＡ配列もまた提供し、５’から３’の順序で、（ａ）５’ＵＴＲと、（ｂ）タンパク質コード配列と、（ｃ）３’ＵＴＲと、（ｄ）任意選択的にポリＡテールをコードする核酸配列と、（ｅ）終結シグナルと、を含み、終結シグナルは、以下の核酸配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される。更に、本発明は、典型的にはＲＮＡポリメラーゼプロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含む核酸ベクター、及びＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ配列をｍＲＮＡ転写物に転写する、ｍＲＮＡの産生のための方法におけるこれらの核酸ベクターの使用を提供する。
本発明の様々な態様は、以下のセクションで詳細に記載される。セクションの使用は、本発明を限定することを意味しない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。
ＤＮＡ鋳型
様々な核酸鋳型が本発明で使用され得る。典型的には、完全に二本鎖であるか、又は二本鎖ＳＰ６プロモーター配列を有する大部分が一本鎖であるかのいずれかのＤＮＡ鋳型を使用することができる。
いくつかの実施形態では、合成された最適化されたＤＮＡ配列は、インビトロ転写の使用のために核酸ベクターに挿入される。いくつかの実施形態では、核酸ベクターは、プラスミドである。「プラスミド」又は「プラスミド核酸ベクター」という用語は、環状核酸分子、好ましくは人工核酸分子を指す。本発明との関連において、プラスミドＤＮＡは、ＲＮＡをコードする配列及び／又は少なくとも１つのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸配列など、所望の核酸配列を組み込み、又は保有するのに好適である。かかるプラスミドＤＮＡ構築物／ベクターは、発現ベクター、クローニングベクター、トランスファーベクターなどであってもよい。プラスミドＤＮＡは、典型的には、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム及び５’－及び／又は３’ＵＴＲに対応する配列など、所望のｍＲＮＡ転写物又はその一部に対応する（コードする）配列を含む。いくつかの実施形態では、所望のｍＲＮＡ転写物に対応する配列は、ポリＡテールがｍＲＮＡ転写物に含まれるように、３’ＵＴＲの後にポリＡテールをコードしてもよい。より典型的には、本発明との関連において、所望のｍＲＮＡ転写物に対応する配列は、５’／３’ＵＴＲ及びオープンリーディングフレームから構成される。本発明の後続の実施形態では、インビトロ転写中にＤＮＡプラスミドから合成されたｍＲＮＡ転写物は、ポリＡテールを含有せず、ポリＡテールを付加するためにｍＲＮＡ転写物の合成後のプロセシングが必要とされる。
発現ベクターは、ＲＮＡ、例えば、ＲＮＡインビトロ転写と呼ばれるプロセスにおけるｍＲＮＡなどの発現産物の産生に使用され得る。例えば、発現ベクターは、プロモーター配列、例えばＴ３、Ｔ７又はＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列などのＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列など、ベクターの配列ストレッチのＲＮＡインビトロ転写に必要な配列を含んでもよい。
クローニングベクターは、典型的には、核酸配列をベクターに組み込む（挿入）ために使用され得るクローニング部位を含有するベクターである。クローニングベクターは、例えば、プラスミドベクター又はバクテリオファージベクターであってもよい。トランスファーベクターは、核酸分子を細胞又は生物体に導入するのに好適なベクターであり、例えばウイルスベクターである。本発明との使用に好適なプラスミドＤＮＡベクターは、典型的には、多重クローニング部位、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、任意選択には抗生物質耐性因子などの選択マーカー、及び複製起点などのベクターの増殖に好適な配列を含む。特に、Ｔ３、Ｔ７及びＳＰ６などのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含むプラスミドＤＮＡベクター、又は発現ベクターが好適である。本発明を実施するための適切なプラスミドとしては、例えば、ｐＵＣ１９及びｐＢＲ３２２が挙げられる。
線状化プラスミドＤＮＡ（１つ以上の制限酵素を介して線状化）、線状化ゲノムＤＮＡ断片（制限酵素及び／又は物理的手段を介して）、ＰＣＲ産物、及び／又は合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写されるＤＮＡ配列の上流に（及び正しい向きで）二本鎖ＳＰ６プロモーターを含有する場合はＳＰ６／Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いた、又は、転写されるＤＮＡ配列の上流に（及び正しい向きで）二本鎖Ｔ７プロモーターを含有する場合はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いた、インビトロ転写の鋳型として使用することができる。
いくつかの実施形態では、線状化ＤＮＡ鋳型は、平滑末端を有する。
本発明の特定の実施形態では、プラスミドＤＮＡは、インビトロ転写のための線状化を必要としない。具体的には、本発明は、インビトロ転写のためのＳＰ６／Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して、プラスミドＤＮＡ（典型的にはスーパーコイル化される）などの環状核酸ベクターからｍＲＮＡ転写物を作製することを初めて可能にする。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型には、５’及び／又は３’非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性又は翻訳に影響を及ぼす１つ以上の要素、例えば、鉄応答要素を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、約５０～５００ヌクレオチド長であり得る。
いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞におけるｍＲＮＡの位置安定性に影響するタンパク質の結合部位、又はｍｉＲＮＡの１つ以上の結合部位のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、５０～５００ヌクレオチド長以上であり得る。
例示的な３’及び／又は５’ＵＴＲ配列は、センスｍＲＮＡ分子の安定性を増加させるために、安定しているｍＲＮＡ分子（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、又はクエン酸回路酵素）から誘導することができる。例えば、５’ＵＴＲ配列は、ヌクレアーゼ耐性を改善する及び／又はポリヌクレオチドの半減期を改善するために、ＣＭＶ前初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分配列又はその断片を含み得る。ポリヌクレオチドを更に安定させるために、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列又はその断片の、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’末端又は非翻訳領域への包含も企図される。概して、これらの修飾は、ポリヌクレオチドの安定性及び／又は薬物動態特性（例えば、半減期）を、それらの修飾されていない対応物と比較して改善し、例えば、そのようなポリヌクレオチドのインビボヌクレアーゼ消化に対する耐性を改善するために行われる修飾を含む。
配列最適化
本発明の一態様は、ＤＮＡ鋳型内の終結配列を除去して、最適化されたＤＮＡ配列を調製することに関する。本方法は、特に、ＤＮＡ配列中の終結シグナルの存在を決定するステップと、１つ以上の終結シグナルが存在する場合、当該終結シグナルの２位、３位、４位、５位、及び７位のうちのいずれか１つにおいて、１つ以上の核酸を他の３つの核酸のうちのいずれか１つで置換して最適化されたＤＮＡ配列を生成することによって、ＤＮＡ配列を修飾するステップを含み、必要に応じて、１つ以上の置換核酸が、タンパク質コード配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を保存するために選択される。終結シグナルは、ＤＮＡ配列の任意の場所（例えば、タンパク質コード配列をコードする領域内、５’非翻訳領域をコードする領域内、及び／又は３’非翻訳領域をコードする領域内）で検出され得る。上記のステップは、コンピュータによって行われてもよい。ＤＮＡ配列内の特定の核酸配列（例えば、本発明の終結シグナル）の存在を検出し、タンパク質コード配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を保存する核酸置換を同定するのに適したコンピュータプログラムは、当技術分野で周知である。
転写されるＤＮＡ配列は、より効率的な転写及び／又は翻訳を促進するために更に最適化されてもよい。例えばＤＮＡ配列は、シス調節エレメント（例えば、ＴＡＴＡボックス、終結シグナル、及びタンパク質結合部位）、人工組換え部位、Ｃｈｉ部位、ＣｐＧジヌクレオチド含量、ネガティブＣｐＧアイランド、ＧＣ含量、ポリメラーゼのずれ部位、及び／若しくは転写に関連する他の要素に関して最適化することができ、ＤＮＡ配列は、隠れたスプライス部位、ｍＲＮＡ二次構造、ｍＲＮＡの安定した自由エネルギー、反復配列、ＲＮＡ不安定性モチーフ、及び／若しくはｍＲＮＡの処理と安定性に関連する他の要素に関して最適化することができ、ＤＮＡ配列は、コドン使用頻度バイアス、コドン適応性、内部Ｃｈｉ部位、リボソーム結合部位（例えば、ＩＲＥＳ）、未成熟ポリＡ部位、シャイン－ダルガーノ（ＳＤ）配列、及び／若しくは翻訳に関連するその他の要素に関して最適化することができ、並びに／又はＤＮＡ配列は、コドンコンテキスト、コドン－アンチコドン相互作用、翻訳休止部位、及び／若しくはタンパク質折り畳みに関連する他の要素に関して最適化することができる。当技術分野で既知の最適化方法、例えば、ＵＳ２０１１／００８１７０８に記載されている、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによるＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ及びＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）が、本発明で使用されてもよく、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、コドン最適化アルゴリズムを使用して、ＤＮＡ配列を修飾し、より効率的な転写及び／又は翻訳を促進する。いくつかの実施形態では、コドン最適化アルゴリズムは、ＤＮＡ配列中の終結シグナルの存在を決定する。いくつかの実施形態では、コドン最適化アルゴリズムは、１つ以上の核酸を置換することによってＤＮＡ配列を修飾し、必要に応じて、タンパク質コード配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を保存するため１つ以上の置換核酸を選択してもよい。
特定の実施形態では、コドン最適化アルゴリズムは、ＤＮＡ配列中の終結シグナルの存在を決定し、終結シグナルは、以下の核酸配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’を有し、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択され、１つ以上の終結シグナルが存在する場合、当該終結シグナルの２位、３位、４位、５位及び７位のうちのいずれか１つにおいて、１つ以上の核酸を他の３つの核酸のうちのいずれか１つで置換して最適化されたＤＮＡ配列を生成することによって、ＤＮＡ配列を修飾し、必要に応じて、１つ以上の置換核酸が、タンパク質コード配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を保存するために選択される。
コドン最適化アルゴリズムは、コドン適応指標（ＣＡＩ）を最大化することによって配列を生成する。ＣＡＩは、参照遺伝子のセットからの配列の偏差を測定するためのコドン使用バイアスの数値スコアである。いくつかの実施形態では、参照セットの遺伝子は哺乳類遺伝子である。特定の実施形態では、参照セットの遺伝子はヒト遺伝子である。ＣＡＩは、典型的には、目的のタンパク質コドン配列中の全てのコドンの使用頻度に基づいて計算される。第１のステップでは、コドン最適化アルゴリズムは、入力タンパク質コドン配列を繰り返し修正し、最適なＣＡＩを有する第１の出力配列を達成する。第２のステップでは、第１の出力配列は、転写又は翻訳レベルで遺伝子発現にマイナスの影響を与えることが知られている配列要素の存在について分析される。これには、本明細書に記載される終結シグナルが含まれる。こうした配列要素が同定された場合、コドン最適化アルゴリズムは、それらを除去するために第１の出力配列を修正し、それによって第２の出力配列を生成する。同じステップ又は後続するステップでは、第１の出力配列又は第２の出力配列も、以下のパラメータのうちの１つ以上について分析される：ＧＣ含量、コードされたｍＲＮＡ転写物の安定した自由エネルギー、及びアウトオブフレームの開始コドンの存在。必要に応じて、第１又は第２の出力配列は、これらのパラメータのうちの１つ以上を最適化するように修正される。例えば、任意のアウトオブフレーム開始コドンは、適切なコドン置換によって除去されてもよい。ＧＣ含量が低い出力配列は、通常、ＧＣ含量が高い出力配列よりも、自由エネルギーの負の値が高い。自由エネルギーの最も負の値は、最も構造化され、それに応じて最も安定したｍＲＮＡ転写物をもたらすと考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、アルゴリズムは、更なるコドン置換によって第１又は第２の出力配列のＧＣ含量を増加させる。
終結シグナルの標的挿入
本発明の別の態様は、インビトロ転写の鋳型として最適化されたＤＮＡ配列を調製するために、目的のタンパク質（例えば、治療用タンパク質）をコードするＤＮＡ配列の３’末端に、１つ以上の終結シグナルを含有させることに関する。ｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の３’末端での１つ以上の終結シグナル（例えば、２つ又は３つの終結シグナル）の標的挿入により、インビトロ転写前の鋳型をコードするプラスミドの線状化の必要性を不要にすることができる。したがって、一態様では、本発明は、インビトロ転写で使用するためのＤＮＡ配列であって、５’から３’の順序で、
・５’ＵＴＲと、
・タンパク質コード配列と、
・３’ＵＴＲと、
・任意選択的に、ポリＡテールをコードする核酸配列と、
－終結シグナルと、を含む、ＤＮＡ配列に関する。
本発明によれば、終結シグナルは、以下の核酸配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される。一実施形態では、終結シグナルは、核酸配列５’－Ｘ１ＡＴＣＴＧＴＴ－３’を含む。Ｘ１は、Ｔ又はＣであってもよい。好適な終結は、５’－－ＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’、５’－－ＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’、５’－－ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’、５’－－ＣＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’、５’－－ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＴ－３’、５’－－ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＴ－３’、又は５’－－ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＴ－３’から選択され得る。
典型的には、ＤＮＡ配列は、２つ以上の終結シグナル、例えば、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上を含む。発明者らは、効果的な終結が発生するためには、終結シグナルは１０塩基対以下で区切られ得、例えば５～１０塩基対で区切られ得ることを示した。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、長さ３０ヌクレオチドのヌクレオチド配列内に２つの終結シグナル（例えば、５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される）を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本発明で使用するためのＤＮＡ配列は、その３’末端に以下の配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－（ＺＮ）－Ｘ４ＡＴＣＴＸ５ＴＸ６－３’を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６は独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択され、ＺＮが、Ｎ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、その各々は独立してＡ、Ｃ、ＴのＧから選択され、Ｎは１０以下である。例えば、Ｎは、５、６、７、８、９、又は１０とすることができる。ＺはＴであってもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、以下の配列を含む：ＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号１２）．他の実施形態では、ＤＮＡ配列は、長さ５０ヌクレオチドのヌクレオチド配列内に３つの終結シグナル（例えば、５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される）を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本発明で使用するためのＤＮＡ配列は、その３’末端に以下の配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－（ＺＮ）－Ｘ４ＡＴＣＴＸ５ＴＸ６－（ＺＭ）－Ｘ７ＡＴＣＴＸ８ＴＸ９－３’を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８及びＸ９が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択され、ＺＮが、Ｎ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、ＺＭが、Ｍ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、それらの各々は独立してＡ、Ｃ、ＴのＧから選択され、Ｎ及び／又はＭは、１０以下である。例えば、Ｎは、５、６、７、８、９、又は１０とすることができる。Ｍは、５、６、７、８、９、又は１０とすることができる。Ｚは、Ｔであってもよい。特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、その３’末端に以下の配列を含む：
Figure 2023513836000002
本明細書で示されるように、ＤＮＡ配列の３’末端に連続して２つの終結シグナルを有することは、インビトロ転写の効果的な終結をもたらすことができる。本出願の例は、ｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の３’末端に終結シグナルの３コピー以上が存在する場合、１００％に近づく正しく終結されたｍＲＮＡ転写物の収率に到達できることを更に実証する。特に、ＤＮＡ配列の３’末端に３つ以上の終結シグナルを連続で付加することは、１００％終結をもたらすことができる。この観察は、インビトロ転写を３７℃で実行したときに行われた。
更に、本発明者らは、ＤＮＡ配列の末端でのインビトロ転写の効果的な終結には、１０ヌクレオチド（例えば、Ｔ）以下の間隔での配列（例えば、
Figure 2023513836000003
 ）における２つ又は３つ（又はそれ以上）の終結シグナルの最小限の終結配列で、十分であることを示した。したがって、本発明で使用するＤＮＡ配列は、いかなる更なる終結シグナル及び／又は配列も含まない。本発明の最小限の終結配列を有するＤＮＡ配列は、３’末端のリボザイム配列又は代替的な終結シグナルを必要とせずに、正しく終結されたｍＲＮＡ転写物を産生することができる。したがって、いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、その３’末端にリボザイムをコードする更なる配列を含まない。加えて、又は代替的に、ＤＮＡ配列は、クラスＩ終結シグナルを含まない。実際に、本明細書に開示される最小限の終結配列に加えて、インビトロ転写終結をもたらすために、他の終結シグナルは必要とされない。
本発明によれば、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ配列の３’末端に到達する前にインビトロ転写の早期終結を回避するために、５’ＵＴＲ、タンパク質コード配列、及びＤＮＡ配列の３’ＵＴＲには終結シグナルは存在しない。
本明細書において、前述の段落に記載されるＤＮＡ配列を調製するための方法も提供される。方法は、（ａ）タンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供することと、（ｂ）ＤＮＡ配列の３’末端に１つ以上の終結シグナルを付加してＤＮＡ配列を提供することとを含み、１つ以上の終結シグナルは、以下の核酸配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’（配列番号１）を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列の３’末端で付加される終結シグナルは、以下の配列を含む：ＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号１４）。
本出願の実施例は、２つ以上の終結シグナルの付加が、線状ＤＮＡ鋳型及びスーパーコイルＤＮＡ鋳型の両方について、インビトロ転写中のｍＲＮＡ転写物の望ましくない伸長の低下をもたらすことを実証する。したがって、いくつかの実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上の終結シグナルが、ＤＮＡ配列の３’末端に付加される。いくつかの実施形態では、３’末端に付加される終結配列は、長さ３０ヌクレオチドのヌクレオチド配列内に２つの終結シグナル（例えば、５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される）を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、３’末端に付加される終結配列は、以下の配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－（ＺＮ）－Ｘ４ＡＴＣＴＸ５ＴＸ６－３’を含むか、又はそれからなり、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択され、ＺＮは、Ｎ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、その各々は独立してＡ、Ｃ、ＴのＧから選択され、Ｎは１０以下である。いくつかの実施形態では、終結配列は、以下の配列を含むか、又はそれらからなる：ＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号１２）。
いくつかの実施形態では、３’末端に付加される終結配列は、長さ５０ヌクレオチドのヌクレオチド配列内に３つの終結シグナル（例えば、５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される）を含むか、又はからなる。いくつかの実施形態では、３つの終結シグナルが、ＤＮＡ配列の３’末端に付加される。いくつかの実施形態では、３’末端に付加される終結配列は、以下の配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－（ＺＮ）－Ｘ４ＡＴＣＴＸ５ＴＸ６－（ＺＭ）－Ｘ７ＡＴＣＴＸ８ＴＸ９－３’を含むか、又はそれらからなり、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８及びＸ９が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ、又はＧから選択され、ＺＮが、Ｎ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、ＺＭが、Ｍ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、それらの各々は独立してＡ、Ｃ、ＴのＧから選択され、Ｎ及び／又はＭは、１０以下である。いくつかの実施形態では、終結配列は、以下の配列を含むか、又はそれらからなる：
Figure 2023513836000004
ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ
ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、ＳＰ６プロモーター配列に対して高い配列特異性を有するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。典型的には、このポリメラーゼは、そのプロモーターの下流にある一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡのいずれかで、ＲＮＡの５’→３’インビトロ合成を触媒し、天然リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチドを重合転写物に組み込む。
バクテリオファージＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの配列は、最初に以下のアミノ酸配列を有するものとして記載されていた（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｙ００１０５．１）：
ＭＱＤＬＨＡＩＱＬＱＬＥＥＥＭＦＮＧＧＩＲＲＦＥＡＤＱＱＲＱＩＡＡＧＳＥＳＤＴＡＷＮＲＲＬＬＳＥＬＩＡＰＭＡＥＧＩＱＡＹＫＥＥＹＥＧＫＫＧＲＡＰＲＡＬＡＦＬＱＣＶＥＮＥＶＡＡＹＩＴＭＫＶＶＭＤＭＬＮＴＤＡＴＬＱＡＩＡＭＳＶＡＥＲＩＥＤＱＶＲＦＳＫＬＥＧＨＡＡＫＹＦＥＫＶＫＫＳＬＫＡＳＲＴＫＳＹＲＨＡＨＮＶＡＶＶＡＥＫＳＶＡＥＫＤＡＤＦＤＲＷＥＡＷＰＫＥＴＱＬＱＩＧＴＴＬＬＥＩＬＥＧＳＶＦＹＮＧＥＰＶＦＭＲＡＭＲＴＹＧＧＫＴＩＹＹＬＱＴＳＥＳＶＧＱＷＩＳＡＦＫＥＨＶＡＱＬＳＰＡＹＡＰＣＶＩＰＰＲＰＷＲＴＰＦＮＧＧＦＨＴＥＫＶＡＳＲＩＲＬＶＫＧＮＲＥＨＶＲＫＬＴＱＫＱＭＰＫＶＹＫＡＩＮＡＬＱＮＴＱＷＱＩＮＫＤＶＬＡＶＩＥＥＶＩＲＬＤＬＧＹＧＶＰＳＦＫＰＬＩＤＫＥＮＫＰＡＮＰＶＰＶＥＦＱＨＬＲＧＲＥＬＫＥＭＬＳＰＥＱＷＱＱＦＩＮＷＫＧＥＣＡＲＬＹＴＡＥＴＫＲＧＳＫＳＡＡＶＶＲＭＶＧＱＡＲＫＹＳＡＦＥＳＩＹＦＶＹＡＭＤＳＲＳＲＶＹＶＱＳＳＴＬＳＰＱＳＮＤＬＧＫＡＬＬＲＦＴＥＧＲＰＶＮＧＶＥＡＬＫＷＦＣＩＮＧＡＮＬＷＧＷＤＫＫＴＦＤＶＲＶＳＮＶＬＤＥＥＦＱＤＭＣＲＤＩＡＡＤＰＬＴＦＴＱＷＡＫＡＤＡＰＹＥＦＬＡＷＣＦＥＹＡＱＹＬＤＬＶＤＥＧＲＡＤＥＦＲＴＨＬＰＶＨＱＤＧＳＣＳＧＩＱＨＹＳＡＭＬＲＤＥＶＧＡＫＡＶＮＬＫＰＳＤＡＰＱＤＩＹＧＡＶＡＱＶＶＩＫＫＮＡＬＹＭＤＡＤＤＡＴＴＦＴＳＧＳＶＴＬＳＧＴＥＬＲＡＭＡＳＡＷＤＳＩＧＩＴＲＳＬＴＫＫＰＶＭＴＬＰＹＧＳＴＲＬＴＣＲＥＳＶＩＤＹＩＶＤＬＥＥＫＥＡＱＫＡＶＡＥＧＲＴＡＮＫＶＨＰＦＥＤＤＲＱＤＹＬＴＰＧＡＡＹＮＹＭＴＡＬＩＷＰＳＩＳＥＶＶＫＡＰＩＶＡＭＫＭＩＲＱＬＡＲＦＡＡＫＲＮＥＧＬＭＹＴＬＰＴＧＦＩＬＥＱＫＩＭＡＴＥＭＬＲＶＲＴＣＬＭＧＤＩＫＭＳＬＱＶＥＴＤＩＶＤＥＡＡＭＭＧＡＡＡＰＮＦＶＨＧＨＤＡＳＨＬＩＬＴＶＣＥＬＶＤＫＧＶＴＳＩＡＶＩＨＤＳＦＧＴＨＡＤＮＴＬＴＬＲＶＡＬＫＧＱＭＶＡＭＹＩＤＧＮＡＬＱＫＬＬＥＥＨＥＶＲＷＭＶＤＴＧＩＥＶＰＥＱＧＥＦＤＬＮＥＩＭＤＳＥＹＶＦＡ（配列番号１５）。
本発明に適したＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼと実質的に同じポリメラーゼ活性を有する任意の酵素であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に適したＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号 １５から修飾され得る。例えば、好適なＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は付加を含有してもよい。いくつかの実施形態では、好適なＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１５と約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７５％、７０％、６５％、又は６０％同一又は相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、好適なＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、（Ｎ末端、Ｃ末端、又は内部からの）トランケートタンパク質であり得るが、ポリメラーゼ活性は保持される。いくつかの実施形態では、好適なＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは融合タンパク質である。
いくつかの実施形態では、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、以下のヌクレオチド配列を有する遺伝子によってコードされる：ＡＴＧＣＡＡＧＡＴＴＴＡＣＡＣＧＣＴＡＴＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＴＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＴＧＴＴＴＡＡＴＧＧＴＧＧＣＡＴＴＣＧＴＣＧＣＴＴＣＧＡＡＧＣＡＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＧＣＣＡＧＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＧＴＡＧＣＧＡＧＡＧＣＧＡＣＡＣＡＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＧＣＣＧＣＣＴＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＣＴＴＡＴＴＧＣＡＣＣＴＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＧＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＴＡＴＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧＡＡＡＧＧＴＣＧＴＧＣＡＣＣＴＣＧＣＧＣＡＴＴＧＧＣＴＴＴＣＴＴＡＣＡＡＴＧＴＧＴＡＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＡＧＣＡＴＡＣＡＴＣＡＣＴＡＴＧＡＡＡＧＴＴＧＴＴＡＴＧＧＡＴＡＴＧＣＴＧＡＡＴＡＣＧＧＡＴＧＣＴＡＣＣＣＴＴＣＡＧＧＣＴＡＴＴＧＣＡＡＴＧＡＧＴＧＴＡＧＣＡＧＡＡＣＧＣＡＴＴＧＡＡＧＡＣＣＡＡＧＴＧＣＧＣＴＴＴＴＣＴＡＡＧＣＴＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＧＣＣＧＣＴＡＡＡＴＡＣＴＴＴＧＡＧＡＡＧＧＴＴＡＡＧＡＡＧＴＣＡＣＴＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＣＧＴＡＣＴＡＡＧＴＣＡＴＡＴＣＧＴＣＡＣＧＣＴＣＡＴＡＡＣＧＴＡＧＣＴＧＴＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＡＴＣＡＧＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＧＧＡＣＧＣＧＧＡＣＴＴＴＧＡＣＣＧＴＴＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＡＡＴＴＧＣＡＧＡＴＴＧＧＴＡＣＴＡＣＣＴＴＧＣＴＴＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＡＡＧＧＴＡＧＣＧＴＴＴＴＣＴＡＴＡＡＴＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＡＴＧＣＧＴＧＣＴＡＴＧＣＧＣＡＣＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＴＡＣＴＴＡＣＡＡＡＣＴＴＣＴＧＡＡＡＧＴＧＴＡＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＴＡＧＣＧＣＡＴＴＣＡＡＡＧＡＧＣＡＣＧＴＡＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＧＣＣＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＣＴＴＧＣＧＴＡＡＴＣＣＣＴＣＣＴＣＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＣＣＡＴＴＴＡＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＣＣＡＴＡＣＴＧＡＧＡＡＧＧＴＡＧＣＴＡＧＣＣＧＴＡＴＣＣＧＴＣＴＴＧＴＡＡＡＡＧＧＴＡＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＴＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＧＡＣＴＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＴＧＣＣＡＡＡＧＧＴＴＴＡＴＡＡＧＧＣＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＡＣＡＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＡＴＧＴＡＴＴＡＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＡＡＴＣＣＧＣＴＴＡＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＴＧＧＴＧＴＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＣＴＧＡＴＴＧＡＣＡＡＧＧＡＧＡＡＣＡＡＧＣＣＡＧＣＴＡＡＣＣＣＧＧＴＡＣＣＴＧＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧＴＣＧＴＧＡＡＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＴＧＣＴＡＴＣＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＣＡＡＣＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＣＴＧＧＡＡＡＧＧＣＧＡＡＴＧＣＧＣＧＣＧＣＣＴＡＴＡＴＡＣＣＧＣＡＧＡＡＡＣＴＡＡＧＣＧＣＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＣＣＧＣＣＧＣＣＧＴＴＧＴＴＣＧＣＡＴＧＧＴＡＧＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＴＡＡＡＴＡＴＡＧＣＧＣＣＴＴＴＧＡＡＴＣＣＡＴＴＴＡＣＴＴＣＧＴＧＴＡＣＧＣＡＡＴＧＧＡＴＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＴＧＴＣＴＡＴＧＴＧＣＡＡＴＣＴＡＧＣＡＣＧＣＴＣＴＣＴＣＣＧＣＡＧＴＣＴＡＡＣＧＡＣＴＴＡＧＧＴＡＡＧＧＣＡＴＴＡＣＴＣＣＧＣＴＴＴＡＣＣＧＡＧＧＧＡＣＧＣＣＣＴＧＴＧＡＡＴＧＧＣＧＴＡＧＡＡＧＣＧＣＴＴＡＡＡＴＧＧＴＴＣＴＧＣＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＣＴＡＡＣＣＴＴＴＧＧＧＧＡＴＧＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＣＴＴＴＴＧＡＴＧＴＧＣＧＣＧＴＧＴＣＴＡＡＣＧＴＡＴＴＡＧＡＴＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＴＡＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＣＡＧＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＡＴＴＣＡＣＣＣＡＡＴＧＧＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＴＧＣＡＣＣＴＴＡＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＣＴＴＧＧＴＧＣＴＴＴＧＡＧＴＡＴＧＣＴＣＡＡＴＡＣＣＴＴＧＡＴＴＴＧＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧＣＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＧＧＡＣＧＧＧＴＣＴＴＧＴＴＣＡＧＧＣＡＴＴＣＡＧＣＡＣＴＡＴＡＧＴＧＣＴＡＴＧＣＴＴＣＧＣＧＡＣＧＡＡＧＴＡＧＧＧＧＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＴＡＡＣＣＴＧＡＡＡＣＣＣＴＣＣＧＡＴＧＣＡＣＣＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＡＴＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＣＡＡＧＴＧＧＴＴＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＴＧＣＧＣＴＡＴＡＴＡＴＧＧＡＴＧＣＧＧＡＣＧＡＴＧＣＡＡＣＣＡＣＧＴＴＴＡＣＴＴＣＴＧＧＴＡＧＣＧＴＣＡＣＧＣＴＧＴＣＣＧＧＴＡＣＡＧＡＡＣＴＧＣＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＧＡＴＡＧＴＡＴＴＧＧＴＡＴＴＡＣＣＣＧＴＡＧＣＴＴＡＡＣＣＡＡＡＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＴＧＣＣＡＴＡＴＧＧＴＴＣＴＡＣＴＣＧＣＴＴＡＡＣＴＴＧＣＣＧＴＧＡＡＴＣＴＧＴＧＡＴＴＧＡＴＴＡＣＡＴＣＧＴＡＧＡＣＴＴＡＧＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＧＣＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＧＴＡＧＣＡＧＡＡＧＧＧＣＧＧＡＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＧＧＴＡＣＡＴＣＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＴＴＧＡＣＴＣＣＧＧＧＣＧＣＡＧＣＴＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＴＧＡＣＧＧＣＡＣＴＡＡＴＣＴＧＧＣＣＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＡＧＴＴＡＡＧＧＣＡＣＣＧＡＴＡＧＴＡＧＣＴＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＡＣＧＣＣＡＧＣＴＴＧＣＡＣＧＣＴＴＴＧＣＡＧＣＧＡＡＡＣＧＴＡＡＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＡＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＴＴＡＧＡＡＣＡＧＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＡＡＣＣＧＡＧＡＴＧＣＴＡＣＧＣＧＴＧＣＧＴＡＣＣＴＧＴＣＴＧＡＴＧＧＧＴＧＡＴＡＴＣＡＡＧＡＴＧＴＣＣＣＴＴＣＡＧＧＴＴＧＡＡＡＣＧＧＡＴＡＴＣＧＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＣＧＣＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＡＡＴＴＴＣＧＴＡＣＡＣＧＧＴＣＡＴＧＡＣＧＣＡＡＧＴＣＡＣＣＴＴＡＴＣＣＴＴＡＣＣＧＴＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＧＴＡＧＡＣＡＡＧＧＧＣＧＴＡＡＣＴＡＧＴＡＴＣＧＣＴＧＴＡＡＴＣＣＡＣＧＡＣＴＣＴＴＴＴＧＧＴＡＣＴＣＡＴＧＣＡＧＡＣＡＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＴＣＴＴＡＧＡＧＴＧＧＣＡＣＴＴＡＡＡＧＧＧＣＡＧＡＴＧＧＴＴＧＣＡＡＴＧＴＡＴＡＴＴＧＡＴＧＧＴＡＡＴＧＣＧＣＴＴＣＡＧＡＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＧＣＧＣＴＧＧＡＴＧＧＴＴＧＡＴＡＣＡＧＧＴＡＴＣＧＡＡＧＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＧＡＧＴＴＣＧＡＣＣＴＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣＡＴＧＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＡＣＧＴＡＴＴＴＧＣＣＴＡＡ（配列番号１６）。
本発明においてＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼをコードする好適な遺伝子は、配列番号１６と約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、又は８０％同一又は相同であり得る。
本発明に適したＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、例えば、Ａｍｂｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、Ｐｒｏｍｅｇａ、及びＲｏｃｈｅからの市販製品であってもよい。ＳＰ６は、本明細書に記載される配列番号１５のアミノ酸配列、又は配列番号１５のバリアントに従って、市販の供給源若しくは非市販の供給源から注文及び／又はカスタム設計されてもよい。ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、標準忠実度のポリメラーゼであってもよく、又は、ＲＮＡポリメラーゼ活性を促進するために修飾された（例えば、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の変異、又はＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ自体の翻訳後修飾）高忠実度／高効率／高能力のものであってもよい。こうした修飾ＳＰ６の例としては、ＡｍｂｉｏｎのＳＰ６ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ－Ｐｌｕｓ（商標）、ＮＥＢのＨｉＳｃｒｉｂｅ ＳＰ６、及びＰｒｏｍｅｇａのＲｉｂｏＭＡＸ（商標）及びＲｉｂｏｐｒｏｂｅ（登録商標）システムが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、熱安定性である。特定の実施形態では、本発明で使用するためのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、３７℃～５６℃の範囲の温度で酵素を活性化させる野生型ＳＰ６ポリメラーゼと比較して１つ以上の変異を含有する。いくつかの実施形態では、本発明で使用するためのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、５０℃～５２℃の最適温度で機能する。他の実施形態では、本発明で使用するためのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、５０℃で少なくとも６０分の半減期を有する。例えば、本発明で使用するのに特に好適なＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、５０℃で６０分～１２０分（例えば、７０分～１００分、又は８０分～９０分）の半減期を有する。
いくつかの実施形態では、好適なＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは融合タンパク質である。例えば、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、酵素の単離、精製、又は溶解性を促進するための１つ以上のタグを含み得る。適切なタグは、Ｎ末端、Ｃ末端、及び／又は内部に配置され得る。好適なタグの非限定的な例としては、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ８－ｋＤａ抗原（Ｆｈ８）、ＦＬＡＧタグペプチド、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジンタグ（例えば、ヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６））、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｎ－利用物質（ＮｕｓＡ）、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）融合タグ、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＴＲＥＰ）、タンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）、及びチオレドキシン（ＴｒｘＡ）が挙げられる。本発明では他のタグを使用することができる。これら及び他の融合タグは、例えば、Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５（２０１４）：６３及びＰＣＴ／ＵＳ１６／５７０４４に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓタグは、ＳＰ６のＮ末端に位置する。
ＳＰ６プロモーター
ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得る任意のプロモーターが、本発明で使用され得る。典型的には、ＳＰ６プロモーターは、５’ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ－３’（配列番号１７）を含む。ＳＰ６プロモーターのバリアントは、そのプロモーターに対するＳＰ６の認識及び／又は結合を最適化するように発見及び／又は作製されている。非限定的なバリアントには、以下が含まれるが、これらに限定されない。５’－ＡＴＴＴＡＧＧＧＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＡＧ－３’、５’－ＡＴＴＴＡＧＧＧＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＴＴＡＧＧＧＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＧＧ－３’、５’－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡ－３’、５’－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＡ－３’、５’－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＡＧ－３’、５’－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＧＧ－３’、５’－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＮＧ－３’、及び５’－ＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ－３’（配列番号１８～配列番号２７）。
更に、本発明に適したＳＰ６プロモーターは、配列番号１８～配列番号２７のうちのいずれか１つと約９５％、９０％、８５％、８０％ｍ、７５％、又は７０％同一又は相同であり得る。更に、本発明に好適なＳＰ６プロモーターは、本明細書に記載されるプロモーター配列のいずれかに対して、５’及び／又は３’に１つ以上の追加のヌクレオチドを含み得る。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７プロモーター配列に対して高い配列特異性を有するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。典型的には、このポリメラーゼは、そのプロモーターの下流にある一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡのいずれかで、ＲＮＡの５’→３’インビトロ合成を触媒し、天然リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチドを重合転写物に組み込む。
いくつかの実施形態では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、熱安定性である。特定の実施形態では、本発明で使用するためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、３７℃～５６℃の範囲の温度で酵素を活性化させる野生型Ｔ７ポリメラーゼと比較して１つ以上の変異を含有する。適切なＲＮＡポリメラーゼの例は、ＮＥＢからのＨｉ－Ｔ７（登録商標）ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、本発明で使用するためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、５０℃～５２℃の最適温度で機能する。他の実施形態では、本発明で使用するためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、５０℃で少なくとも６０分の半減期を有する。例えば、本発明で使用するのに特に好適なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、５０℃で６０分～１２０分（例えば、７０分～１００分、又は８０分～９０分）の半減期を有する。
Ｔ７ プロモーター
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得る任意のプロモーターが、本発明で使用され得る。典型的には、Ｔ７プロモーターは、５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ－３’（配列番号２８）を含む。
ｍＲＮＡ合成
本発明によるｍＲＮＡは、様々な既知の方法のうちのいずれかに従って合成され得る。様々な方法が、公開された米国特許出願第２０１８／０２５８４２３号に記載され、本発明の実施に使用され得、それら全てが参照により本明細書に組み込まれる。例えば、本発明によるｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成され得る。簡潔に述べると、ＩＶＴは多くの場合、プロモーターを含む線状状又は環状のＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴ及びマグネシウムイオンを含み得る緩衝系、並びに適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、又はＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅＩ、ピロホスファターゼ、並びに／又はＲＮＡｓｅ阻害剤を用いて行われる。正確な条件は、具体的な用途によって変動するであろう。
いくつかの実施形態では、好適な鋳型配列は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、好適な鋳型配列は、ヒト細胞における効率的な発現ために最適化されたコドンである。コドン最適化は、典型的にはペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードする天然型又は野生型の核酸配列を修飾して、可能な限り最高のＧ／Ｃ含量を達成し、コドンの使用を調整して、希少若しくは律速コドンを回避し、不安定化核酸配列若しくはモチーフを除去し、かつ／又はｍＲＮＡコードされたペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、休止部位又は終結配列を除去することを含む。いくつかの実施形態では、好適なタンパク質コード配列は、天然由来又は野生型の配列である。いくつかの実施形態では、好適なタンパク質コード配列は、そのアミノ酸配列に１つ以上の変異を含有するタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードする。
本明細書に開示される方法は、ｍＲＮＡの大規模産生に使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明による方法は、単一バッチで少なくとも１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、５ｇ、１０ｇ、２５ｇ、５０ｇ、７５ｇ、１００ｇ、２５０ｇ、５００ｇ、７５０ｇ、１ｋｇ、５ｋｇ、１０ｋｇ、５０ｋｇ、１００ｋｇ、１０００ｋｇ、又はそれ以上のｍＲＮＡを合成する。いくつかの実施形態では、本発明による方法は、単一バッチで少なくとも１ｋｇ、１０ｋｇ又は１００ｋｇを合成する。本明細書で使用される場合、用語「バッチ」は、一度に合成される、例えば、単一の製造設定に従って産生される、ｍＲＮＡの数量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）又は量（ａｍｏｕｎｔ）を指す。バッチは、１セットの条件下での連続合成のために、酵素の単回アリコート及び／又はＤＮＡ鋳型の単回アリコートを介して発生する、１回の反応で合成されたｍＲＮＡの量を指す場合がある。単一バッチで合成されたｍＲＮＡは、所望の量を達成するために組み合わされる異なる時点で合成されたｍＲＮＡを含まない。一般に、反応混合物は、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ鋳型、及びＲＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（リボヌクレオチドを含む場合もあれば、又はリボヌクレオチドの添加を必要とする場合がある）を含む。ＤＮＡ鋳型は線状状であってもよいが、本発明との関連ではより典型的には環状である。
本発明によれば、典型的には、産生されるｍＲＮＡの１グラム（ｇ）当たり１～１００ｍｇのＲＮＡポリメラーゼが使用される。いくつかの実施形態では、産生されるｍＲＮＡの１グラム当たり約１～９０ｍｇ、１～８０ｍｇ、１～６０ｍｇ、１～５０ｍｇ、１～４０ｍｇ、１０～１００ｍｇ、１０～８０ｍｇ、１０～６０ｍｇ、１０～５０ｍｇのＲＮＡポリメラーゼが使用される。いくつかの実施形態では、約１グラムのｍＲＮＡを産生するために約５～２０ｍｇのＲＮＡポリメラーゼが使用される。いくつかの実施形態では、約１００グラムのｍＲＮＡを産生するために約０．５～２グラムのＲＮＡポリメラーゼが使用される。いくつかの実施形態では、約１キログラムのｍＲＮＡのために約５～２０グラムのＲＮＡポリメラーゼが使用される。いくつかの実施形態では、少なくとも１グラムのｍＲＮＡを産生するために少なくとも５ｍｇのＲＮＡポリメラーゼが使用される。いくつかの実施形態では、少なくとも１００グラムのｍＲＮＡを産生するために少なくとも５００ｍｇのＲＮＡポリメラーゼが使用される。いくつかの実施形態では、少なくとも１キログラムのｍＲＮＡを産生するために少なくとも５グラムのＲＮＡポリメラーゼが使用される。いくつかの実施形態では、産生されたｍＲＮＡの１グラム当たり約１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、又は１００ｍｇのプラスミドＤＮＡが使用される。いくつかの実施形態では、約１グラムのｍＲＮＡを産生するために約１０～３０ｍｇのプラスミドＤＮＡが使用される。いくつかの実施形態では、約１００グラムのｍＲＮＡを産生するために約１～３グラムのプラスミドＤＮＡが使用される。いくつかの実施形態では、約１キログラムのｍＲＮＡのために約１０～３０グラムのプラスミドＤＮＡが使用される。いくつかの実施形態では、少なくとも１グラムのｍＲＮＡを産生するために少なくとも１０ｍｇのプラスミドＤＮＡが使用される。いくつかの実施形態では、少なくとも１００グラムのｍＲＮＡを産生するために少なくとも１グラムのプラスミドＤＮＡが使用される。いくつかの実施形態では、少なくとも１キログラムのｍＲＮＡを産生するために少なくとも１０グラムのプラスミドＤＮＡが使用される。
いくつかの実施形態では、反応混合物中のＲＮＡポリメラーゼの濃度は、約１～１００ｎＭ、１～９０ｎＭ、１～８０ｎＭ、１～７０ｎＭ、１～６０ｎＭ、１～５０ｎＭ、１～４０ｎＭ、１～３０ｎＭ、１～２０ｎＭ、又は約１～１０ｎＭであり得る。特定の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼの濃度は、約１０～５０ｎＭ、２０～５０ｎＭ、又は３０～５０ｎＭである。１００～１００００ユニット／ｍｌのＲＮＡポリメラーゼの濃度を使用することができ、例として、１００～９０００ユニット／ｍｌ、１００～８０００ユニット／ｍｌ、１００～７０００ユニット／ｍｌ、１００～６０００ユニット／ｍｌ、１００～５０００ユニット／ｍｌ、１００～１０００ユニット／ｍｌ、２００～２０００ユニット／ｍｌ、５００～１０００ユニット／ｍｌ、５００～２０００ユニット／ｍｌ、５００～３０００ユニット／ｍｌ、５００～４０００ユニット／ｍｌ、５００～５０００ユニット／ｍｌ、５００～６０００ユニット／ｍｌ、１０００～７５００ユニット／ｍｌ、及び２５００～５０００ユニット／ｍｌの濃度を使用することができる。
反応混合物中の各リボヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、及びＣＴＰ）の濃度は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭであり、例えば、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約２ｍＭ～約１０ｍＭ、約３ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約８ｍＭ、約１ｍＭ～約６ｍＭ、約３ｍＭ～約１０ｍＭ、約３ｍＭ～約８ｍＭ、約３ｍＭ～約６ｍＭ、約４ｍＭ～約５ｍＭである。いくつかの実施形態では、各リボヌクレオチドは、反応混合物中、約５ｍＭである。いくつかの実施形態では、反応に使用されるｒＮＴＰ（例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰの組み合わせ）の総濃度は、１ｍＭ～４０ｍＭの範囲である。いくつかの実施形態では、反応に使用されるｒＮＴＰ（例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰの組み合わせ）の総濃度は、１ｍＭ～３０ｍＭ、又は１ｍＭ～２８ｍＭ、又は１ｍＭ～２５ｍＭ、又は１ｍＭ～２０ｍＭの範囲である。いくつかの実施形態では、総ｒＮＴＰｓ濃度は、３０ｍＭ未満である。いくつかの実施形態では、総ｒＮＴＰｓ濃度は、２５ｍＭ未満である。いくつかの実施形態では、総ｒＮＴＰｓ濃度は、２０ｍＭ未満である。いくつかの実施形態では、総ｒＮＴＰｓ濃度は、１５ｍＭ未満である。いくつかの実施形態では、総ｒＮＴＰｓ濃度は、１０ｍＭ未満である。
特定の実施形態では、反応混合物中の各ｒＮＴＰの濃度が、所与のｍＲＮＡ転写物をコードする核酸配列中の各核酸の頻度に基づいて最適化される。具体的には、そのような配列最適化反応混合物は、ｍＲＮＡ転写物中のこれらの４つの核酸（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）の比率に対応する、４つのｒＮＴＰ（例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ）のそれぞれの比率を含む。
いくつかの実施形態では、開始ヌクレオチドは、インビトロ転写の開始前に反応混合物に加えられる。開始ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ転写物の最初のヌクレオチド（＋１位）に対応するヌクレオチドである。開始ヌクレオチドは、特に、ＲＮＡポリメラーゼの開始速度を増加させるために追加されてもよい。開始ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸であってもよい。開始ヌクレオチドは、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、又はトリヌクレオチドであり得る。ｍＲＮＡ転写物の最初のヌクレオチドがＧである実施形態では、開始ヌクレオチドは典型的には、ＧＴＰ又はＧＭＰである。特定の実施形態では、開始ヌクレオチドはキャップ類似体である。キャップ類似体は、Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇ、ｍ７Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇ、ｍ３ ２，２，７Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇ、ｍ２ ７，３’－ＯＧ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇ（３’－ＡＲＣＡ）、ｍ２ ７，２’－ＯＧｐｐｐＧ（２’－ＡＲＣＡ）、ｍ２ ７，２’－ＯＧｐｐｓｐＧ Ｄ１（β－Ｓ－ＡＲＣＡ Ｄ１）及びｍ２ ７，２’－ＯＧｐｐｓｐＧ Ｄ２（β－Ｓ－ＡＲＣＡ Ｄ２）から選択することができる。
特定の実施形態では、ＲＮＡ転写物の最初のヌクレオチドは、Ｇであり、開始ヌクレオチドは、Ｇのキャップ類似体であり、対応するｒＮＴＰは、ＧＴＰである。このような実施形態では、キャップ類似体は、ＧＴＰと比較して、反応混合物中に過剰に存在する。いくつかの実施形態では、キャップ類似体は、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、約１ｍＭ～約１７．５ｍＭ、約１ｍＭ～約１５ｍＭ、約１ｍＭ～約１２．５ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約７．５ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、又は約１ｍＭ～約２．５ｍＭの範囲の初期濃度で添加される。
より典型的には、本発明との関連において、キャップ類似体などのキャップ構造は、ｍＲＮＡ転写物が合成された後にのみ、例えば、合成後プロセシングステップにおいて、インビトロ転写中に得られたｍＲＮＡ転写物に付加される。典型的には、このような実施形態では、ｍＲＮＡ転写物は、キャップ構造が付加される前に（例えば、タンジェンシャルフロー濾過によって）最初に精製される。
ＲＮＡポリメラーゼ反応緩衝液は、典型的には、塩／緩衝剤、例えば、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及び塩化マグネシウムを含む。
反応混合物のｐＨは、約６～８．５、６．５～８．０、７．０～７．５の間であってもよく、いくつかの実施形態では、ｐＨは７．５である。
ＤＮＡ鋳型（例えば、上述のように、及び所望の量のＲＮＡを提供するのに十分な量／濃度で）、ＲＮＡポリメラーゼ反応緩衝液、及びＲＮＡポリメラーゼを組み合わせて、反応混合物を形成する。反応混合物を、約３７℃～約５６℃で、３０分～６時間、例えば、約６０～約９０分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、約３７℃～約４２℃で行われる。他の実施形態では、インキュベーションは、約４３℃～約５６℃、例えば、約５０℃～約５２℃で行われる。本明細書で実証されるように、インビトロ転写反応において得られた正確に終結したｍＲＮＡ転写物の収率は、目的のｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の末端に本明細書に記載される１つ以上の終結シグナルを含めることによって、かつ約５０℃～約５２℃の温度でＤＮＡ配列を含む鋳型との反応を実行することによって、大幅に増加させることができる。
いくつかの実施形態では、好適なＲＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（約７．５の最終反応混合物ｐＨ）中の、約５ｍＭのＮＴＰ、約０．０５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡポリメラーゼ、及び約０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ鋳型を、約３７℃～約４２℃で６０～９０分間インキュベートする。他の実施形態では、好適なＲＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（約７．５の最終反応混合物ｐＨ）中の、約５ｍＭのＮＴＰ、約０．０５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡポリメラーゼ、及び約０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ鋳型を、５０℃～約５２℃で６０～９０分間インキュベートする。
いくつかの実施形態では、反応混合物は、ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ、２９ｍＭのＮＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ、及び反応緩衝液（１０ｘの場合、８００ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０ｍＭのスペルミジン、２５０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．７）とともに二本鎖ＤＮＡ鋳型、並びにＲＮａｓｅを含まない水で所望の反応体積にする十分な量（ＱＳ）を含有し、次いで、この反応混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。次に、このポリメラーゼ反応をＤＮａｓｅ Ｉ及びＤＮａｓｅ Ｉ緩衝液（１０ｘの場合、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２及び２５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．６）を添加することによりクエンチして、精製のための調製で二本鎖ＤＮＡ鋳型の消化を促進した。この実施形態は、１００グラムのｍＲＮＡを産生するのに十分であることが示されている。
いくつかの実施形態では、反応混合物は、１～１０ｍＭの範囲の濃度のＮＴＰ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のＤＮＡ鋳型、及び０．０１～０．１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のＲＮＡポリメラーゼを含み、例えば、反応混合物は、５ｍＭの濃度のＮＴＰ、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のＤＮＡ鋳型、及び０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度のＲＮＡポリメラーゼを含む。
ヌクレオチド
様々な天然由来の又は修飾されたヌクレオシドを使用して、本発明によるｍＲＮＡを産生してもよい。いくつかの実施形態では、本発明によるｍＲＮＡ転写物は、天然ヌクレオシド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）で合成される。他の実施形態では、本発明によるｍＲＮＡ転写物は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）並びに次のうちのいずれか：ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、プソイドウリジン（例えば、Ｎ－１－メチル－プソイドウリジン）、２－チオウリジン及び２－チオシチジン）、化学修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）、介在塩基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ ｂａｓｅ）、修飾された糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）、及び／若しくは修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエート及び５’－Ｎ－ホスホルアミダイト結合）を用いて、合成される。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上の非標準的なヌクレオチド残基を含む。非標準的なヌクレオチド残基は、例えば、５－メチル－シチジン（「５ｍＣ」）、プソイドウリジン（「ψＵ」）、及び／又は２－チオ－ウリジン（「２ｓＵ」）を含み得る。このような残基及びそのｍＲＮＡへの組み込みについての考察については、例えば、米国特許第８，２７８，０３６号又はＷＯ２０１１／０１２３１６を参照されたい。ｍＲＮＡは、Ｕ残基の２５％が２－チオ－ウリジンであり、Ｃ残基の２５％が５－メチルシチジンであるＲＮＡと定義される、ＲＮＡであってもよい。ＲＮＡの使用に関する教示は、米国特許出願公開第２０１２／０１９５９３６号及び国際公開第２０１１／０１２３１６号に開示されており、それら両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。非標準的なヌクレオチド残基の存在は、ｍＲＮＡを、同じ配列を有するが標準的な残基のみを含有する対照ｍＲＮＡよりも、より安定かつ／又はより少ない免疫原性にすることができる。更なる実施形態では、ｍＲＮＡは、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５－ブロモウラシル、５－プロピニルウラシル、６－アミノプリン、２－アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、及び２－クロロ－６－アミノプリンシトシン、並びにこれらの修飾及び他の核酸塩基修飾の組み合わせから選択される１つ以上の非標準的なヌクレオチド残基を含み得る。いくつかの実施形態は、フラノース環又は核酸塩基への追加の修飾を更に含み得る。追加的な修飾は、例えば、糖修飾又は置換（例えば、２’－Ｏ－アルキル修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）のうちの１つ以上）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、追加のポリヌクレオチド及び／又はペプチドポリヌクレオチド（ＰＮＡ）と複合体化又はハイブリダイズされてもよい。糖修飾が２’－Ｏ－アルキル修飾であるいくつかの実施形態では、このような修飾には、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾、及び２’－デオキシ修飾を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、これらの修飾のいずれかは、ヌクレオチドの０～１００％で、例えば、構成ヌクレオチドの０％、１％、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、又は１００％超を個別に又は組み合わせて存在し得る。
合成ｍＲＮＡ
本発明は、高品質のインビトロ合成ｍＲＮＡを提供する。例えば、本発明は、合成されたｍＲＮＡの均一性／均質性を提供する。特に、本発明の組成物は、実質的に完全長である複数のｍＲＮＡ分子を含む。例えば、ｍＲＮＡ分子の少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％は、完全長ｍＲＮＡ分子である。そのような組成物は、完全長ｍＲＮＡ分子に対して「エンリッチである」と言われる。いくつかの実施形態では、本発明に従って合成されるｍＲＮＡは、実質的に完全長である。本発明の組成物は、先行技術のプロセス、すなわち、本発明による最適化されたＤＮＡ配列の使用を含むプロセスによって産生される組成物よりも、より大きいパーセンテージの完全長ｍＲＮＡ分子を有する。
本発明のいくつかの実施形態では、組成物又はバッチは、完全長ｍＲＮＡ分子ではないｍＲＮＡ分子（すなわち、不全型若しくは不全の（ａｂｏｒｔｅｄ）転写物、又は早期終結転写物）を特異的に除去するステップなしに調製される。
いくつかの実施形態では、本発明により合成されるｍＲＮＡ分子は、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１０，０００、又はそれ以上のヌクレオチド長であり、本発明にはその間の任意の長さを有するｍＲＮＡも含まれる。
合成後プロセシング
典型的には、５’キャップ及び／又は３’テールは、合成後に付加されてもよい。キャップの存在は、大半の真核細胞にみられるヌクレアーゼへの耐性を提供する上で重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護する役割を果たす。
５’キャップは、典型的には、以下のように付加される。最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが、５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの１つを除去し、２つの末端リン酸を残す。次いで、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）が、グアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加され、５’５’５三リン酸結合をもたらす。次いで、グアニンの７－窒素が、メチルトランスフェラーゼによってメチル化される。キャップ構造の例には、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）、ｍ７（３’ＯＭｅＧ）（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）、ｍ７（３’ＯＭｅＧ）（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、キャップ構造は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）である。追加のキャップ構造は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第ＵＳ２０１６／００３２３５６号及び２０１７年２月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／４６４，３２７号に記載されている。
テール構造は典型的に、ポリ（Ａ）テール及び／又はポリ（Ｃ）テールを含む。ｍＲＮＡの３’末端上のポリＡテール又はポリＣテールは、典型的には、少なくとも５０個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、少なくとも１５０個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２５０個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３５０個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４５０個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５５０個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６５０個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７５０個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８５０個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９５０個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、又は少なくとも１ｋｂのアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチドをそれぞれ含む。いくつかの実施形態では、ポリＡテール又はポリＣテールはそれぞれ、約１０～８００個のアデノシンヌクレオチド又はシトシンヌクレオチド（例えば、約１０～２００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、約１０～３００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、約１０～４００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、約１０～５００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、約１０～５５０個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、約１０～６００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、約５０～６００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、約１００～６００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、約１５０～６００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、約２００～６００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、約２５０～６００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、約３００～６００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、約３５０～６００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、約４００～６００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、約４５０～６００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、約５００～６００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、約１０～１５０個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、約１０～１００個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、約２０～７０個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド、又は約２０～６０個のアデノシンヌクレオチド若しくはシトシンヌクレオチド）であり得る。いくつかの実施形態では、テール構造は、本明細書に記載の様々な長さを有するポリ（Ａ）テール及びポリ（Ｃ）テールの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアデノシンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のシトシンヌクレオチドを含む。
本明細書に記載されるように、５’キャップ及び／又は３’テールの添加は、キャッピング及び／又はテーリングなしでは、それらの早期に中止したｍＲＮＡ転写物のサイズが検出するには小さすぎる場合があるため、インビトロ合成中に生成された不全型転写物の検出を容易にする。したがって、いくつかの実施形態では、５’キャップ及び／又は３’テールは、ｍＲＮＡが純度（例えば、ｍＲＮＡ中に存在する不全型転写物のレベル）について試験される前に、合成ｍＲＮＡに加えられる。いくつかの実施形態では、５’キャップ及び／又は３’テールは、本明細書に記載されるようにｍＲＮＡが精製される前に合成ｍＲＮＡに付加される。いくつかの実施形態では、５’キャップ及び／又は３’テールは、本明細書に記載されるようにｍＲＮＡが精製された後に合成ｍＲＮＡに付加される。
ｍＲＮＡの精製
本発明に従って合成されたｍＲＮＡは、更なる精製を行うことなく使用され得る。特に、本発明に従って合成されたｍＲＮＡは、ショートマー（ｓｈｏｒｔｍｅｒ）を除去するステップなしに使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って合成されたｍＲＮＡは、更に精製されてもよい。本発明に従って合成されたｍＲＮＡを精製するために様々な方法を使用することができる。例えば、ｍＲＮＡの精製は、遠心分離、濾過、及び／又はクロマトグラフィー法を使用して実行することができる。いくつかの実施形態では、合成されたｍＲＮＡは、エタノール沈殿若しくは濾過若しくはクロマトグラフィー、又はゲル精製若しくは任意の他の好適な手段により精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ＨＰＬＣにより精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、当業者に周知の標準的なフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール溶液で抽出される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、タンジェンシャルフロー濾過を使用して精製される。好適な精製方法には、ＵＳ２０１６／００４０１５４、ＵＳ２０１５／０３７６２２０、２０１８年２月２７日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＭＥＳＳＥＮＧＥＲ ＲＮＡ」と題されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／１９９７８、及び２０１８年２月２７日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＭＥＳＳＥＮＧＥＲ ＲＮＡ」と題されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／１９９５４、２０１８年１１月８日に出願された米国仮出願第６２／７５７，６１２号、及び２０１９年８月２６日に出願された米国仮出願第６２／８９１，７８１号に記載されている方法が含まれ、それら全てが参照により本明細書に組み込まれ、本発明を実施するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、キャッピング及び／又はテーリングの前に精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、キャッピングの前に精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、テーリングの前に精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、キャッピング及びテーリングの後に精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、キャッピング及びテーリングの前及び後の両方で精製される。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、遠心分離により、キャッピングとテーリングの前若しくは後のいずれか、又はキャッピングとテーリングの前及び後の両方で精製される。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、濾過により、キャッピングとテーリングの前若しくは後のいずれか、又はキャッピングとテーリングの前及び後の両方で精製される。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により、キャッピングとテーリングの前若しくは後のいずれか、又はキャッピングとテーリングの前及び後の両方で精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、透析、透析濾過、及び／又は限外濾過を含む更なる精製に供され得る。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、クロマトグラフィーにより、キャッピングとテーリングの前若しくは後のいずれか、又はキャッピングとテーリングの前及び後の両方で精製される。
ｍＲＮＡの沈殿
インビトロ合成反応混合物などの不純な調製物中のｍＲＮＡは、２０１８年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６２／７５７，６１２号、又は２０１９年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／８９１，７８１号に記載される緩衝液及び好適な条件を使用して、沈殿させてもよく、本発明を実施するために、当該技術分野で既知の様々な精製方法に続いて使用されてもよい。本明細書で使用される場合、用語「沈殿」（又は任意の文法的に同等のもの）は、溶液中の不溶性物質（例えば、固体）の形成を指す。ｍＲＮＡに関連して使用される場合、用語「沈殿」は、液体中のｍＲＮＡの不溶性又は固体形態の形成を指す。
典型的には、ｍＲＮＡ沈殿は変性状態を伴う。本明細書で使用される場合、「変性状態」という用語は、ｍＲＮＡの天然立体構造の破壊を引き起こす可能性のある任意の化学的又は物理的状態を指す。分子の天然立体構造は通常、最も水溶性であるため、分子の二次構造及び三次構造を破壊すると、溶解性に変化が生じ、溶液からのｍＲＮＡの沈殿が生じる可能性がある。
例えば、不純な調製物からｍＲＮＡを沈殿させる適切な方法は、ｍＲＮＡが沈殿するように、不純な調製物を変性試薬で処理することを伴う。本発明に適した変性試薬の例としては、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化グアニジニウム、グアニジウムチオシアネート、グアニジウムイソチオシアネート、酢酸アンモニウム、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好適な試薬は、固体形態又は溶液で提供され得る。
いくつかの実施形態では、グアニジニウム塩は、ｍＲＮＡを沈殿させるための変性緩衝液中で使用される。非限定的な例として、グアニジニウム塩には、塩化グアニジニウム、グアニジウムチオシアネート、又はグアニジウムイソチオシアネートが含まれ得る。グアニジニウムチオシアネート（ＧＣＳＮ）はまた、チオシアン酸グアニジンとも呼ばれ、ｍＲＮＡを沈殿させるために使用され得る。グアニジニウム塩、例えばグアニジニウムチオシアネートは、変性反応に通常使用されるよりも高い濃度で使用することができ、結果として、実質的にタンパク質混入物を含まないｍＲＮＡをもたらす。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿に適した溶液は、４Ｍ超の濃度のチオシアン酸グアニジンを含有する。
典型的な実施形態では、キャッピング及びテール化ｍＲＮＡ転写物を含む、ｍＲＮＡ転写物及び／又はキャッピング及び／又はテール化反応から生じる混合物を含有するインビトロ転写反応混合物は、ｍＲＮＡが溶液から沈殿するように、グアニジウム塩などの変性剤（例えば、グアニジウムチオシアネート）の添加、続いて沈殿剤（例えば、１００％のエタノール）の添加を含む精製プロセスに供される。得られたｍＲＮＡ懸濁液を、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）カラムに加える。
変性試薬に加えて、ｍＲＮＡ沈殿に適した溶液は、追加の塩、界面活性剤及び／又は緩衝剤を含み得る。例えば、好適な溶液は、ラウリルサルコシルナトリウム及び／又はクエン酸ナトリウムを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿に適した緩衝液は、約５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿に適した緩衝液は、約１０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿に適した緩衝液は、約２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿に適した緩衝液は、約２５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿に適した緩衝液は、約３０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿に適した緩衝液は、約５０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿に適した緩衝液は、Ｎ－ラウリルサルコシン（サルコシル）などの界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿に適した緩衝液は、約０．０１％のＮ－ラウリルサルコシンを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿に適した緩衝液は、約０．０５％のＮ－ラウリルサルコシンを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿に適した緩衝液は、約０．１％のＮ－ラウリルサルコシンを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿に適した緩衝液は、約０．５％のＮ－ラウリルサルコシンを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿に適した緩衝液は、１％のＮ－ラウリルサルコシンを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿に適した緩衝液は、約１．５％のＮ－ラウリルサルコシンを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿に適した緩衝液は、約２％、約２．５％又は約５％のＮ－ラウリルサルコシンを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿に適した溶液は、還元剤を含む。いくつかの実施形態では、還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ベータ－メルカプトエタノール（ｂ－ＭＥ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリス（３－ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰＰ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、及びジチオブチルアミン（ＤＴＢＡ）から選択される。いくつかの実施形態では、還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。
いくつかの実施形態では、ＤＴＴは、１ｍＭ超及び最大約２００ｍＭの最終濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ＤＴＴは、２．５ｍＭ～１００ｍＭの最終濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ＤＴＴは、５ｍＭ～５０ｍＭの最終濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ＤＴＴは、約２０ｍＭの最終濃度で存在する。
タンパク質変性は、還元剤の存在下又は非存在下では、変性試薬の低濃度でさえも起こり得る。不純物を含有するｍＲＮＡを沈殿させるための変性溶液における高濃度のＧＳＣＮと高濃度のＤＴＴとの組み合わせにより、純粋かつ実質的にタンパク質混入物を含まないｍＲＮＡが得られる。緩衝液中に沈殿したｍＲＮＡは、フィルターを介して処理することができる。いくつかの実施形態では、約５ＭのＧＳＣＮ及び約１０ｍＭのＤＴＴを含む緩衝液を使用した、単回沈殿に続く濾過後の溶離液は、検出可能なタンパク質不純物を有しない、高品質及び高純度のものである。更に、この方法は、フィルターを通した流体の流れの妨げを生じさせずに、約１グラム、又は約１０グラム、又は約１００グラム、又は５００グラム、又は約１０００グラム以上のｍＲＮＡを含む規模で、広範なｍＲＮＡの処理量で再現性がある。
いくつかの実施形態では、沈殿ステップのための緩衝液は、アルコールを更に含む。いくつかの実施形態では、沈殿は、ｍＲＮＡ、変性緩衝液（ＧＳＣＮ及び還元剤、例えば、ＤＴＴを含む）、及びアルコール（例えば、１００％エタノール）が、１：（５）：（３）の体積比で存在する条件下で実施される。いくつかの実施形態では、沈殿は、ｍＲＮＡ、変性緩衝液及びアルコール（例えば、１００％エタノール）が、１：（３．５）：（２．１）の体積比で存在する条件下で実施される。いくつかの実施形態では、沈殿は、ｍＲＮＡ、変性緩衝液及びアルコール（例えば、１００％エタノール）が、１：（４）：（２）の体積比で存在する条件下で実施される。いくつかの実施形態では、沈殿は、ｍＲＮＡ、変性緩衝液及びアルコール（例えば、１００％エタノール）が、１：（２．８）：（１．９）の体積比で存在する条件下で実施される。いくつかの実施形態では、沈殿は、ｍＲＮＡ、変性緩衝液及びアルコール（例えば、１００％エタノール）が、１：（２．３）：（１．７）の体積比で存在する条件下で実施される。いくつかの実施形態では、沈殿は、ｍＲＮＡ、変性緩衝液及びアルコール（例えば、１００％エタノール）が、１：（２．１）：（１．５）の体積比で存在する条件下で実施される。
いくつかの実施形態では、相当量のｍＲＮＡの沈殿を許容する所望の温度で一定期間、本明細書に記載の１つ以上の変性試薬を用いて、不純物調製物をインキュベートすることが望ましい。例えば、不純な調製物と変性剤との混合物は、室温で、又は周囲温度で一定期間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、好適なインキュベーション時間は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は６０分、又はそれ以上の時間である。いくつかの実施形態では、好適なインキュベーション時間は、約６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、又は５分以下の時間である。いくつかの実施形態では、混合物は、室温で約５分間インキュベートされる。典型的には、「室温」又は「周囲温度」は、約２０～２５℃の範囲の温度、例えば、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃又は２５℃を指す。いくつかの実施形態では、不純な調製物及び変性剤の混合物は、室温以上（例えば、約３０～３７℃、又は特に、約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃若しくは３７℃）又は室温以下（例えば、約１５～２０℃、又は特に、約１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃若しくは２０℃）でインキュベートされ得る。インキュベーション期間は、インキュベーション温度に基づいて調整され得る。典型的には、高いインキュベーション温度は、より短いインキュベーション時間を必要とする。
あるいは又は追加的に、溶媒を使用してｍＲＮＡ沈殿を促進し得る。好適な例示的な溶媒としては、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、エタノール、メタノール、デナトニウム、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、溶媒（例えば、１００％エタノール）を、変性試薬とともに、又は変性試薬の添加及び本明細書に記載されるインキュベーションの後に、不純な調製物に添加して、ｍＲＮＡ沈殿を更に強化及び／又は促進することができる。典型的には、好適な溶媒（例えば、１００％エタノール）の添加後、混合物は、室温で別の時間インキュベートされ得る。典型的には、インキュベーション時間の好適な時間は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は６０分、又はそれ以上である。いくつかの実施形態では、好適なインキュベーション時間は、約６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、又は５分以下の時間である。典型的には、混合物を、室温で約５分間インキュベートする。室温を上回る、又は下回る温度は、インキュベーション時間の適切な調整とともに使用され得る。あるいは、沈殿のため４℃又は－２０℃でインキュベーションを行うこともできる。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを精製する方法は、アルコールを含まない。したがって、いくつかの実施形態では、懸濁液中のｍＲＮＡの沈殿は、アルコール（例えば、１００％エタノール）の代わりに１つ以上の両親媒性ポリマーを含む。多くの両親媒性ポリマーは、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマーは、プルロニック、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマーは、以下のうちの１つ以上から選択される：ＰＥＧトリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１，０００、ＰＥＧ１，５００、ＰＥＧ２，０００、ＰＥＧ３，０００、ＰＥＧ３，３５０、ＰＥＧ４，０００、ＰＥＧ６，０００、ＰＥＧ８，０００、ＰＥＧ１０，０００、ＰＥＧ２０，０００、ＰＥＧ３５，０００、及びＰＥＧ４０，０００、又はそれらの組み合わせ。
いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマーは、２種類以上の分子量のＰＥＧポリマーの混合物を含む。例えば、いくつかの実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個の分子量のＰＥＧポリマーが、両親媒性ポリマーを構成する。したがって、いくつかの実施形態では、ＰＥＧ溶液は、１つ以上のＰＥＧポリマーの混合物を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧポリマーの混合物は、別個の分子量を有するポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを懸濁液中に沈殿させるには、ＰＥＧポリマーを含む。様々な種類のＰＥＧポリマーが当該技術分野で認識され、その一部は別個の幾何学的形態を有する。例えば、好適なＰＥＧポリマーは、線状、分岐状、Ｙ字形状、又はマルチアーム形状を有するＰＥＧポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、別個の幾何学的形態うちの１つ以上のＰＥＧを含む懸濁液中にある。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ＰＥＧ－６０００を使用してｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ＰＥＧ－４００を使用してｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。
他の実施形態では、ｍＲＮＡを精製するアルコールを含まない方法は、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）でｍＲＮＡを沈殿させることを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、トリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＭＴＥＧ）を使用してｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ｔｅｒｔ－ブチル－ＴＥＧ－Ｏ－プロピオネートを使用して、ｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ＴＥＧ－ジメタクリレートを使用してｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ＴＥＧ－ジメチルエーテルを使用してｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ＴＥＧ－ジビニルエーテルを使用してｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ＴＥＧ－モノブチルエーテルを使用してｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ＴＥＧ－メチルエーテルメタクリレートを使用してｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ＴＥＧ－モノデシルエーテルを使用してｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ＴＥＧ－ジベンゾエートを使用して、ｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。これらのＰＥＧ又はＴＥＧベースの試薬のうちの任意の１つを、ＧＳＣＮと組み合わせて使用して、ｍＲＮＡを沈殿させることができる。本発明に従って産生されたｍＲＮＡを精製するエタノールを含まない例示的方法は、ＧＳＣＮとＭＴＥＧとの組み合わせを使用してｍＲＮＡを沈殿させる。
いくつかの実施形態では、懸濁液中でｍＲＮＡを沈殿させるには、ＰＥＧポリマーを含み、ＰＥＧポリマーは、ＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＯＰＡ－ＰＥＧコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ポロキサマー－ＰＥＧコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＯＴＡＰを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、コレステロールを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、前述のＰＥＧ又はＴＥＧ試薬のいずれかを含む懸濁液中で沈殿する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ又はＴＥＧは、約１０重量／体積％～約１００重量／体積％の濃度で懸濁液中にある。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＥＧ又はＴＥＧは、懸濁液中に、約５重量／体積％、１０重量／体積％、１５重量／体積％、２０重量／体積％、２５重量／体積％、３０重量／体積％、３５重量／体積％、４０重量／体積％、４５重量／体積％、５０重量／体積％、５５重量／体積％、６０重量／体積％、６５重量／体積％、７０重量／体積％、７５重量／体積％、８０重量／体積％、８５重量／体積％、９０重量／体積％、９５重量／体積％、１００重量／体積％の濃度、及びそれらの間の任意の値で存在する。
いくつかの実施形態では、懸濁液中でｍＲＮＡを沈殿させることは、約０．１～約５．０の総ｍＲＮＡ懸濁液体積に対するＰＥＧ又はＴＥＧの体積：体積比を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＥＧ又はＴＥＧは、ｍＲＮＡ懸濁液中に、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、５．０の体積：体積比で存在する。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿の反応体積には、（ｉ）ＧＳＣＮ及び（ｉｉ）ＰＥＧ又はＴＥＧを含む。
ｍＲＮＡの特性評価
ｍＲＮＡの全長転写物、不全型転写物及び／又は早期終結した転写物は、当技術分野で利用可能な任意の方法を使用して検出及び定量化されてもよい。いくつかの実施形態では、合成されたｍＲＮＡ分子は、ブロッティング、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー、蛍光、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、銀染色、分光法、紫外線（ＵＶ）、又はＵＰＬＣ、又はそれらの組み合わせを使用して検出される。本発明には、当該技術分野で公知の他の検出方法が含まれる。いくつかの実施形態では、合成されたｍＲＮＡ分子は、キャピラリー電気泳動による分離を伴うＵＶ吸収分光法を使用して検出される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ゲル電気泳動の前にグリオキサール染料によって最初に変性される（「グリオキサールゲル電気泳動」）。いくつかの実施形態では、合成ｍＲＮＡは、キャッピング又はテーリング前に特性評価される。いくつかの実施形態では、合成ｍＲＮＡは、キャッピング及びテーリング後に特性評価される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって生成されるｍＲＮＡは、完全長ｍＲＮＡ以外、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満の不純物を含む。不純物は、ＩＶＴ混入物質、例えば、タンパク質、酵素、遊離ヌクレオチド、及び／又はショートマーを含む。
いくつかの実施形態では、本発明に従って産生されるｍＲＮＡは、ショートマー又は不全型転写物を実質的に含まない。特に、本発明に従って産生されるｍＲＮＡは、キャピラリー電気泳動又はグリオキサールゲル電気泳動によって、検出不可能なレベルのショートマー又は不全型転写物を含有する。本明細書で使用される場合、用語「ショートマー」又は「不全型転写物」は、完全長よりも小さい任意の転写物を指す。いくつかの実施形態では、「ショートマー」又は「不全型転写物」は、長さが１００ヌクレオチド未満、長さが９０ヌクレオチド未満、長さが８０ヌクレオチド未満、長さが７０ヌクレオチド未満、長さが６０ヌクレオチド未満、長さが５０ヌクレオチド未満、長さが４０ヌクレオチド未満、長さが３０ヌクレオチド未満、長さが２０ヌクレオチド未満、又は長さが１０ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態では、５’－キャップ、及び／又は３’－ポリＡテールを付加した後に、ショートマーを検出又は定量化する。
伸長ｍＲＮＡ転写物
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって生成されたｍＲＮＡ転写物の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％が、終結シグナルで終結する。本明細書で使用される場合、「終結シグナルで終結する」とは、終結シグナルの３’末端の１０ヌクレオチド、９ヌクレオチド、８ヌクレオチド、７ヌクレオチド、６ヌクレオチド、５ヌクレオチド、４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチド、１ヌクレオチド、又は０ヌクレオチド内での転写の終結を指す。
ランオフ転写を検出するために、ｍＲＮＡ転写物を消化して短い３’末端断片を産生でき、これを液体クロマトグラフィー質量分析法（消化ＬＣ／ＭＳ）を用いて分析することができる。好適な３’末端断片は、１００ヌクレオチド未満、例えば、９０ヌクレオチド未満、８０ヌクレオチド未満、７０ヌクレオチド未満、６０ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、４０ヌクレオチドのサイズを有する。所望の長さの３’末端断片は、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが形成されるように、鋳型化されたｍＲＮＡ転写物の３’末端に特異的にハイブリダイズするプローブオリゴヌクレオチドを提供することによって生成することができる。プローブオリゴヌクレオチドは、鋳型化されたｍＲＮＡ転写物の３’末端の約５～約２０ヌクレオチド内に結合してもよい。次いで、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅＨで消化して、所望の長さの３’末端断片を得ることができる。３’末端断片は、ＲＮＡシーケンシングを使用して分析し、ランオフ配列の存在及び長さを決定することができる。ＲＮＡシーケンシングに好適な方法は、ナノポアシーケンシングである。
好適なプローブオリゴヌクレオチドは、修飾ＲＮＡ－ＤＮＡギャップオリゴヌクレオチド（一般にギャップマーとも呼ばれる）である。典型的なギャップマー設計は、５’－ウィングに続いて、天然核酸であってもよく又はリン基（ＰＳ結合）中に硫黄イオンを含有してよい８～１２個のデオキシ核酸モノマーのギャップ、続いて３’－ウィングから構成される。このようなＲＮＡ－ＤＮＡ－ＲＮＡ様構成には、通常、例えば２’－Ｏ－メチルリボースを含有することによって修飾されたＲＮＡヌクレオチドを含有する。本明細書に開示されるＲＮＡ－ＤＮＡギャップオリゴヌクレオチドは、わずか３～５個のデオキシ核酸モノマー（典型的には４個のデオキシ核酸モノマー）のより短いギャップを有するため、この標準設計から外れる。これにより、鋳型化されたｍＲＮＡ転写物の３’末端へのＲＮＡｓｅ Ｈ消化の正確な標的化が可能となる。ｍＲＮＡ転写物への正確なアニーリングを確実にするために、ＲＮＡ－ＤＮＡギャップオリゴヌクレオチドは、１０～２０ヌクレオチド長、例えば、約１５～１８ヌクレオチドである。修飾ＲＮＡヌクレオチドを含む５’及び３’のウィング配列は、同じ長さを有しない。いくつかの実施形態では、５’ウィング（例えば、４～６ヌクレオチドの長さを有する）は、３’ウィング（例えば、７～１０ヌクレオチドの長さを有する）よりも短い。他の実施形態では、５’ウィング（例えば、７～１０ヌクレオチドの長さを有する）は、３’ウィング（例えば、４～６ヌクレオチドの長さを有する）よりも長い。
タンパク質発現
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼで合成されたｍＲＮＡ転写物には、通常、所望の転写物よりもより長いＲＮＡ及びより短いＲＮＡが混入している（ＷＯ２０１８／１５７１５３を参照されたい）。伸長された配列は、終結シグナル後の鋳型にコードされたｍＲＮＡ転写物の末端でのヌクレオチドの非鋳型的付加によって生成されると考えられる。追加のヌクレオチドは、一般に「ランオフ」と呼ばれる。ランオフの３’末端が、それ自体又は第２のｍＲＮＡ分子に結合して、それぞれ伸長可能な分子内二重鎖又は分子間二重鎖を形成するのに十分な相補性を有する場合、更なる伸長が起こり得る（Ｇｈｏｌａｍａｌｉｐｏｕｒ ｅｔ ａｌ．２０１８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６：１８，ｐｐ ９２５３－９２６３）。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が細胞に入ると、ウイルス侵入者として感知される。これは、オリゴアデニル酸シンテターゼ（ＯＡＳ）、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、及びＲＮＡ活性化タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）などのｄｓＲＮＡ依存性酵素の活性化につながり、タンパク質合成の阻害をもたらす（Ｂａｉｅｒｓｄoｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，１５：２６－３５）。
本発明の実施例は、本発明によるｍＲＮＡの合成が、線状ＤＮＡ鋳型及びスーパーコイルＤＮＡ鋳型の両方からのｍＲＮＡ転写物の望ましくない伸長を防止することを実証する。その３’末端の望ましくない伸長なしに、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して合成されたｍＲＮＡを含む、本発明に従って合成されたｍＲＮＡは、ｄｓＲＮＡを本質的に含まない（ｄｓＲＮＡに特異的なモノクローナル抗体を用いて（例えば、ドットブロットアッセイを使用することによって）決定することができる）。したがって、対象に投与されたときにｄｓＲＮＡ依存性酵素を活性化しない。したがって、本発明により合成されたｍＲＮＡは、より効率的なタンパク質翻訳をもたらす。
いくつかの実施形態では、本発明に従って合成されたｍＲＮＡは、細胞内にトランスフェクトされると、先行技術プロセス、特にＴ７又はＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いるプロセスを使用して合成された同量のｍＲＮＡと比較して、例えば、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれ以上まで増加したタンパク質発現をもたらす。
いくつかの実施形態では、本発明に従って合成されたｍＲＮＡは、細胞内にトランスフェクトされると、先行技術プロセス、特にＴ７又はＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いるプロセスを使用して合成された同量のｍＲＮＡと比較して、例えば、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれ以上まで増加したｍＲＮＡによってコードされたタンパク質活性をもたらす。
本発明を使用して任意のｍＲＮＡを合成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上の天然由来ペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上の修飾又は非天然ペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞内タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、サイトゾルタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、アクチン細胞骨格に関連するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、原形質膜に関連するタンパク質をコードする。一部の特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、膜貫通タンパク質をコードする。一部の特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、イオンチャネルタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、核周囲タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、核タンパク質をコードする。いくつかの特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、転写因子をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、シャペロンタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞内酵素をコードする（例えば、ｍＲＮＡは、尿素サイクル又はリソソーム蓄積代謝異常に関連する酵素をコードする）。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞代謝、ＤＮＡ修復、転写及び／又は翻訳に関与するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞外タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞外基質と関連するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、分泌タンパク質をコードする。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法で使用されるｍＲＮＡは、１つ以上の標的細胞によって、周囲の細胞外液中に排泄又は分泌される機能性タンパク質又は酵素を発現させるために使用され得る（例えば、ホルモン及び／又は神経伝達物質をコードするｍＲＮＡ）。
本発明は、対象、例えば、ヒト対象、又はヒト対象の細胞、又は治療されてヒト対象に送達される細胞への送達又はその治療に使用するための目的とするペプチド又はポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡ分子が豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、対象の肺又は肺細胞への送達又はその治療に使用するためのペプチド又はポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー３タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ダイニン軸糸中間鎖１タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための産生を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ダイニン軸糸重鎖５（ＤＮＡＨ５）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルファ－１－アンチトリプシンタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、１つ以上のサーファクタントタンパク質、例えば、サーファクタントＡタンパク質、サーファクタントＢタンパク質、サーファクタントＣタンパク質、及びサーファクタントＤタンパク質のうちの１つ以上をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の肝臓又は肝臓細胞への送達又はその治療に使用するためのペプチド又はポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。このようなペプチド及びポリペプチドは、尿素サイクル障害に関連するもの、リソソーム貯蔵障害に関連するもの、グリコーゲン貯蔵障害に関連するもの、アミノ酸代謝障害に関連するもの、脂質代謝若しくは線維性障害に関連するもの、メチルマロン酸血症に関連するもの、又は任意の他の代謝性障害に関連するものを含めることができ、それらに対し豊富な完全長ｍＲＮＡで肝臓又は肝臓細胞への送達又は治療することで治療的利益が得られる。
ある特定の実施形態では、本発明は、尿素サイクル障害に関連するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルギノコハク酸シンテターゼ１タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、カルバモイルリン酸シンテターゼＩタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルギノコハク酸リアーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルギナーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、リソソーム貯蔵障害に関連するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルファ－ガラクトシダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グルコセレブロシダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、イズロン酸－２－スルファターゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、イズロニダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ｎ－アセチル－アルファ－Ｄ－グルコサミニダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヘパランＮ－スルファターゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ガラクトサミン－６スルファターゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ベータ－ガラクトシダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、リソソームリパーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アリールスルファターゼＢ（Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、グリコーゲン貯蔵障害に関連するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、酸アルファ－グルコシダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、肝臓グリコーゲンホスホリラーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、筋ホスホグリセリン酸ムターゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グリコーゲン脱分岐酵素をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、アミノ酸代謝に関連するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、オキサラーゼ（ｏｘａｌａｓｅ）アラニン－グリオキシルアミノトランスフェラーゼ酵素をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、脂質代謝又は線維性障害に関連するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰａｓｅリン脂質輸送８Ｂ１（ＡＴＰ８Ｂ１）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、１つ以上のＮＦ－カッパＢ阻害剤、例えば、Ｉ－カッパＢアルファ、インターフェロン関連発生制御因子１（ＩＦＲＤ１）、及びサーチュイン１（ＳＩＲＴ１）のうちの１つ以上をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＰＰＡＲ－ガンマタンパク質又は活性バリアントをコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、メチルマロン酸血症に関連するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、メチルマロニルＣｏＡムターゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、肝臓への送達又はその治療が治療的利益を提供することができる完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ７Ｂタンパク質、別名、ウィルソン病タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ酵素をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、及び第Ｘ因子等の１つ又は複数の凝固酵素をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の心臓血管構造又は心臓血管細胞への送達又はその治療に使用するためのペプチド又はポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、血管内皮成長因子Ａタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、レラキシンタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、骨形成タンパク質－９タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、骨形成タンパク質－２受容体タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の筋肉又は筋肉細胞への送達又はその治療に使用するためのペプチド又はポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ジストロフィンタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フラタキシンタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、対象の心筋又は心筋細胞への送達又はその治療に使用するためのペプチド又はポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、筋肉組織又は筋肉細胞におけるカリウムチャネル及びナトリウムチャネルの一方又は両方を調節するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、筋肉組織又は筋肉細胞におけるＫｖ７．１チャネルを調節するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、筋肉組織又は筋肉細胞におけるＮａｖ１．５チャネルを調節するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の神経系又は神経系細胞への送達又はその治療に使用するためのペプチド又はポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、生存運動ニューロン１タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、生存運動ニューロン２タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フラタキシンタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＤメンバー１（ＡＢＣＤ１）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＬＮ３タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の血液若しくは骨髄又は血液若しくは骨髄細胞への送達又はその治療に使用するためのペプチド又はポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ベータ－グロビンタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ブルトンチロシンキナーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、１つ又は複数の凝固酵素、例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、及び第Ｘ因子をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の腎臓又は腎臓細胞への送達又はその治療に使用するためのペプチド又はポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＩＶ型コラーゲンアルファ５鎖（ＣＯＬ４Ａ５）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の眼又は眼細胞への送達又はその治療に使用するためのペプチド又はポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、レチノスキシンタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａ（ＲＰＥ６５）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、２９０ｋＤａ中心体タンパク質（ＣＥＰ２９０）をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象又は対象の細胞用のワクチンの送達又はそれでの治療に使用するためのペプチド又はポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、ウイルスなどの感染病原体由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インフルエンザウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、狂犬病ウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、サイトメガロウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ロタウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、又はＣ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトパピローマウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、単純ヘルペスウイルス１型又は単純ヘルペスウイルス２型などの単純ヘルペスウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス１型又はヒト免疫不全ウイルス２型などのヒト免疫不全ウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトメタニューモウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトパラインフルエンザウイルス１型、ヒトパラインフルエンザウイルス２型、又はヒトパラインフルエンザウイルス３型などのヒトパラインフルエンザウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、マラリアウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ジカウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、チクングニヤウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象のがんに関連する抗原又は対象のがん細胞から特定された抗原をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、対象自身のがん細胞から決定された抗原をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための、すなわち、個別化がんワクチンを提供するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、変異ＫＲＡＳ遺伝子から発現した抗原をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、抗体をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、二重特異性抗体であり得る。ある特定の実施形態では、抗体は、融合タンパク質の一部であり得る。ある特定の実施形態では、本発明は、ＯＸ４０に対する抗体をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦに対する抗体をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、組織壊死因子アルファに対する抗体をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に対する抗体をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ１９に対する抗体をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、免疫調節因子をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インターロイキン１２をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インターロイキン２３をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インターロイキン３６ガンマをコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、１つ以上のインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質の構成的に活性なバリアントをコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、エンドヌクレアーゼをコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ｃａｓ ９タンパク質などのＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、メガヌクレアーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡが豊富な治療用組成物を産生するための方法を提供する。
脂質ナノ粒子
本発明に従って合成されたｍＲＮＡは、任意の方法を使用してインビボタンパク質産生のために製剤化され、送達されてもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ナノ粒子などの輸送ビヒクル内に封入される。とりわけ、このような封入の目的の１つは、多くの場合、核酸を分解する酵素若しくは化学物質、及び／又は核酸の急速な排出を引き起こす系又は受容体を含み得る環境から核酸を保護することである。したがって、いくつかの実施形態では、好適な送達ビヒクルは、その中に含まれるｍＲＮＡの安定性を強化することができ、及び／又は標的細胞若しくは標的組織へのｍＲＮＡの送達を容易にする。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、例えば、リポソームを含む、脂質系ナノ粒子であってもよく、又はポリマー系ナノ粒子であってもよい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約４０～１００ｎｍ未満の直径を有してもよい。ナノ粒子は、少なくとも１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、１ｇ、又はそれ以上のｍＲＮＡを含み得る。
いくつかの実施形態では、輸送ビヒクルは、リポソーム小胞、又は標的細胞及び組織への核酸の輸送を促進するための他の手段である。適切な輸送ビヒクルには、限定されるものではないが、リポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、ナノ粒子、カルシウムリン－ケイ酸塩ナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、ナノ結晶性粒子、半導体ナノ粒子、ポリ（Ｄ－アルギニン）、ナノデンドリマー、デンプンベースの送達システム、ミセル、エマルション、ニオソーム、プラスミド、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチド及び他のベクタータグを含む。また、好適な輸送ビヒクルとして、バイオナノカプセル及び他のウイルスキャプシドタンパク質アセンブリの使用も企図される。（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；１９（９）：８８７－９５）。
リポソームは、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、１つ以上のステロール系脂質、又は１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含み得る。リポソームは、脂質の３つ以上の別個の成分、ステロール系カチオン性脂質である脂質の１つの別個の成分を含み得る。いくつかの実施形態では、ステロール系カチオン性脂質は、イミダゾールコレステロールエステル又は「ＩＣＥ」脂質である（ＷＯ ２０１１／０６８８１０を参照されたい、当該文献は参照によりその全体が組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ステロール系カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子（例えば、リポソーム）中の総脂質の７０％以下（例えば、６５％以下及び６０％以下）を構成する。
好適な脂質の例としては、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、及びガングリオシド）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質の非限定的例には、Ｃ１２－２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＯＦ－０２、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ及びＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ、及びＨＧＴ４００３、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
非カチオン性脂質の非限定的な例としては、セラミド、セファリン、セレブロシド、ジアシルグリセロール、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルグリセロールナトリウム塩（ＤＰＰＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、及び１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、スフィンゴミエリン、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、長さがＣ６－Ｃ２０のアルキル鎖を有する脂質に共有結合された長さ最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含み得る。ＰＥＧ修飾脂質の非限定的な例としては、ＤＭＧ－ＰＥＧ、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、Ｃ８－ＰＥＧ、ＤＯＧ ＰＥＧ、セラミドＰＥＧ、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
また、単独で、又は他の移送ビヒクルと組み合わせて、移送ビヒクルとしてのポリマーの使用も企図される。好適なポリマーとして、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、及びポリエチレンイミンが挙げられ得る。ポリマー系ナノ粒子は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、例えば分岐ＰＥＩを含んでもよい。
典型的には、本発明によるリポソームの脂質部分は、３つ又は４つの脂質成分のいずれかからなる。本発明による４成分リポソームは一般に以下の脂質成分を有する：カチオン性脂質（典型的には、ｃＫＫ－Ｅ１２又は環状アミノ酸系脂質などのイオン化可能カチオン性脂質）、非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ又はＤＥＰＥ）、コレステロール系脂質（例えば、コレステロール）、及びＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）を。本発明による３成分リポソームは一般に、以下の脂質成分を有する：ステロール系脂質（例えば、ＩＣＥ又は他のイミダゾール系コレステロール誘導体）、非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ又はＤＥＰＥ）、及びＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）。
本発明に関連する追加の教示は、以下のうちの１つ以上に記載される：ＷＯ２０１１／０６８８１０、ＷＯ２０１２／０７５０４０、ＵＳ１５／２９４，２４９、ＵＳ６２／４２１，０２１及びＵＳ１５／８０９，６８０、並びに２０１７年２月２７日に本出願人により出願された、「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＩＴＡＴＩＯＮ ＯＦ ＭＥＳＳＥＮＧＥＲ ＲＮＡ」、「ＮＯＶＥＬ ＣＯＤＯＮ－ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＣＦＴＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ」、及び「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＭＥＳＳＥＮＧＥＲ ＲＮＡ」と題された関連出願、これらの各々はその全体が参照により組み込まれる。
本発明の組成物で使用するためのリポソーム移送ビヒクルは、当該技術分野において現在公知である様々な技術により調製することができる。例えば、多重層ベシクル（ＭＬＶ）は、適切な溶媒に脂質を溶解することにより、選択された脂質を好適な容器又は器の内壁に堆積させ、次いで、溶媒を蒸発させて器の内側に薄膜を残すか、又は噴霧乾燥させることなどによる、従来技術に従って調製され得る。続いて、水相を渦動運動させながら器に添加し、その結果として、ＭＬＶを形成することができる。次に、単層ベシクル（ＵＬＶ）を、多重層ベシクルのホモジナイゼーション、超音波処理、又は押出により形成することができる。加えて、単層ベシクルを、界面活性剤除去技術により形成することができる。
様々な方法が公開された米国特許出願２０１１／０２４４０２６、公開された米国特許出願２０１６／００３８４３２、公開された米国特許出願２０１８／０１５３８２２、公開された米国特許出願２０１８／０１２５９８９、及び２０１９年７月２３日に出願された米国仮特許出願６２／８７７，５９７に記載されており、そうした方法を使用して本発明を実施することができ、これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、プロセスＡとは、ＵＳ２０１６／００３８４３２に記載されるように、最初に脂質を脂質ナノ粒子に予め形成することなく、ｍＲＮＡを脂質の混合物と混合することによってｍＲＮＡを封入する従来的な方法を指す。本明細書で使用される場合、プロセスＢは、米国特許出願２０１８／０１５３８２２に記載されるように、予め形成された脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと混合することによってメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入するプロセスを指す。
所望のｍＲＮＡをリポソーム内に組み込むプロセスは、「担持させる（ｌｏａｄｉｎｇ）」と称されることが多い。例示的な方法は、Ｌａｓｉｃ，ｅｔ ａｌ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５－２５８，１９９２に記載されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。リポソーム組み込まれたｍＲＮＡは、リポソームの内部空間、つまりリポソームの二分子膜内に完全に若しくは部分的に位置するか、又はリポソーム膜の外表面と会合し得る。ｍＲＮＡのリポソーム内への組み込みは本明細書において「封入」とも称され、そこで、核酸がリポソームの内部空間内に完全に包含される。ｍＲＮＡを、例えばリポソームなどの移送ビヒクル内に組み込む目的はしばしば、核酸を分解する酵素若しくは化学物質、及び／又は核酸の急速排出をもたらす系若しくは受容体を含み得る環境から核酸を保護することである。したがって、いくつかの実施形態では、好適な送達ビヒクルは、その中に含まれるｍＲＮＡの安定性を強化することができ、及び／又は標的細胞若しくは標的組織へのｍＲＮＡの送達を容易にする。
医薬組成物
本明細書に記載される様々なプロセスを組み合わせて、本明細書に記載されるプロセスによって鋳型化されたように忠実に転写される最適化されたＤＮＡ配列を提供することによって、ｄｓＲＮＡを本質的に含まない、並びにショートマー配列及びロングマー（ｌｏｎｇｍｅｒ）配列の混入のない優れた品質のｍＲＮＡ転写物が提供される。本明細書に記載される精製プロセス（特に、本明細書に記載されるｍＲＮＡを精製するための沈殿ベースのエタノールを含まない方法）を使用した、そのようなｍＲＮＡ転写物の効率的な回収は、同じ優れた特性を有する非常に純粋なｍＲＮＡ転写物をもたらす。予め形成された脂質ナノ粒子を精製されたｍＲＮＡと混合することによって（例えば、上述のプロセスＢを使用することによって）、これらのｍＲＮＡ転写物を封入することは、非常に高い封入効率（例えば、９０％超）をもたらすことができる。これらの様々な処理ステップを組み合わせる最終的な結果は、ｍＲＮＡを標的細胞に送達して、ｍＲＮＡがコードするペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の最大発現を達成するのに極めて効率的である医薬品である。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、以下のステップを含む医薬組成物を調製するための方法を提供する：
ａ）タンパク質コード配列を含むＤＮＡ配列を提供するステップと、
ｂ）以下によりＤＮＡ配列を最適化するステップであって、
ｉ）ＤＮＡ配列中の終結シグナルの存在を決定することであって、終結シグナルが、以下の核酸配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’を有し、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ若しくはＧから選択される、決定することと、１つ以上の終結シグナルが存在する場合、当該終結シグナルの２位、３位、４位、５位及び７位のうちのいずれか１つにおいて、１つ以上の核酸を他の３つの核酸のうちのいずれか１つで置換して最適化されたＤＮＡ配列を生成することによって、ＤＮＡ配列を修飾することであって、必要に応じて、１つ以上の置換核酸が、タンパク質コード配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を保存するために選択される、修飾することと、並びに／又は
ｉｉ）タンパク質コード配列の３’末端に１つ以上の終結シグナルを付加することであって、１つ以上の終結シグナルが、以下の核酸配列：Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は独立してＡ、Ｃ、Ｔ若しくはＧから選択される、付加することと、により、最適化するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）の最適化されたＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によってｍＲＮＡを合成するステップと、
ｄ）ステップ（ｃ）で調製物からｍＲＮＡを沈殿させるステップと、
ｅ）ステップ（ｄ）の沈殿したｍＲＮＡを含む不純な調製物を、タンジェンシャルフロー濾過によって精製するステップと、
ｆ）ステップ（ｅ）の精製されたｍＲＮＡを、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、１つ以上のステロール系脂質、又は１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含むリポソームに封入するステップ。
いくつかの実施形態では、方法は、ステップ（ｅ）の後に実行される別個のキャッピング反応及びテーリング反応を含む。これらの実施形態では、ステップ（ｄ）及び（ｅ）は、キャッピング反応及びテーリング反応の後に繰り返される。いくつかの実施形態では、不純物調製物を精製することには、エタノールを含まない方法を含む。いくつかの実施形態では、封入は、精製されたｍＲＮＡを予め形成された脂質ナノ粒子と混合することが含まれる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｆ）に続いて製剤化ステップが行われる。製剤化ステップには、緩衝液交換が含まれ得る。いくつかの実施形態では、製剤化ステップには、ｍＲＮＡを封入するリポソームの凍結乾燥が含まれる。
本明細書に記載の方法及び材料と同様又は同等の方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書に引用される参考文献は、請求される発明の先行技術であるとは認められない。更に、材料、方法、及び実施例は例示のみであり、限定することを意図していない。
実施例１：Ｔ７及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用したｍＲＮＡ合成の例示的な実験設計
本実施例は、Ｔ７及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼに基づくｍＲＮＡ合成、トランスフェクション、及びそれらの特性評価のための例示的な条件を示す。
メッセンジャーＲＮＡ材料
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに作動可能に連結された対象タンパク質コード配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを、制限酵素で線状化し、精製した。ｍＲＮＡ転写物を、精製され線状化されたプラスミドからのインビトロ転写により合成した。Ｔ７転写反応は、１×Ｔ７転写緩衝液（８０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、２ｍＭスペルミジン、及び２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、最終ｐＨ７．７を有する）、１０ｍＭ ＤＴＴ、７．２５ｍＭの各ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰ、ＲＮＡｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ、並びにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼから構成された。ＳＰ６反応は、５ｍＭの各ＮＴＰ、約０．０５ｍｇ／ｍＬのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼＤＮＡ、及び約０．１ｍｇ／ｍＬの鋳型ＤＮＡを含み、転写緩衝液の他の成分は変化させた。反応を、３７℃で６０～９０分間（別段の記載がない限り）行った。ＤＮＡｓｅＩを添加して反応を停止させ、更に１５分間、３７℃でインキュベートした。インビトロ転写されたｍＲＮＡを、製造業者の推奨に従って、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡ ｍａｘｉカラムを使用して精製した。
前述のインビトロ転写ステップからの精製ｍＲＮＡ転写物を、ＧＴＰ（１．２５ｍＭ）、Ｓ－アデノシルメチオニン、ＲＮＡｓｅ阻害剤、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、及びグアニリルトランスフェラーゼの一部分で処理し、反応緩衝液（１０ｘ、５００ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）と混合した。合わせた溶液を、３７℃で３０～９０分間、一定時間インキュベートした。完了後、ＡＴＰ（２．０ｍＭ）、ポリＡポリメラーゼ、及びテーリング反応緩衝液（１０×、５００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２．５ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ２）のアリコートを添加し、全反応混合物を、３７℃で２０～４５分間更にインキュベートした。完了したら、最終反応混合物をクエンチし、適宜精製した。
アガロースゲル電気泳動：
１％のアガロースゲルを、５０ｍｌのＴＡＥ緩衝液中、０．５ｇのアガロースを使用して調製した。１～２μｇのＲＮＡを、２ｘのグリオキサルゲルローディング色素又は２ｘのホルムアミドゲルローディング色素で処理し、アガロースゲルに装填し、１３０Ｖで３０分間又は６０分間泳動した。
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）
標準感度ＲＮＡ分析キット（１５ｎｔ）をＡｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌから購入し、１２本のキャピラリーアレイを備えたフラグメントアナライザー機器（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）でのキャピラリー電気泳動の実行で使用した。ゲルプライミング時に、３００ｎｇの全ＲＮＡを希釈マーカーと、１：１１（ＲＮＡ：マーカー）の比率で混合し、９６ウェルプレートにウェル当たり２４μＬを装填した。分子量インジケータラダーは、２μＬの標準感度ＲＮＡラダーを２２μＬの希釈マーカーと混合することによって調製した。試料注入は５．０ｋＶ、４秒で、試料分離は８．０ｋＶ、４０．０分で行った。各試料の蛍光ベースのエレクトロフェログラムを、ＰｒｏＳｉｚｅ ２ソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を介して処理し、試料中に存在する断片の集計されたサイズ（ｂｐ）及び存在量（ｎｇ／μｌ）を生成した。
消化液クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）
プローブオリゴヌクレオチドをｍＲＮＡ転写物にアニーリングし、続いてＲＮａｓｅ Ｈ及びシュリンプアルカリホスファターゼにより消化した。消化反応は、１ｘ ＲＮａｓｅ Ｈ緩衝液（ＮＥＢ）、ＲＮａｓｅ Ｈ（ＮＥＢ）、シュリンプアルカリホスファターゼ（ＮＥＢ）、アニールされたｍＲＮＡ、及びプローブオリゴヌクレオチドから構成されていた。消化反応を、３７℃で４０分間行った。
ｍＲＮＡ断片の解析を、ＵＨＰＬＣ－ＱＴＯＦシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて実施した。移動相Ａは、１００ｍＭのヘキサフルオロイソプロパノール及び８．６ｍＭのトリエチルアミン、ｐＨ８．３から構成され、移動相Ｂは１００％のＭｅＯＨであった。Ａｇｉｌｅｎｔ ＩｎｆｉｎｉｔｙＬａｂ Ｃ１８ ２．１ｘ１００ｍｍカラムを、５０℃で０．５ｍＬ／分の流量で全ての分析に使用した。移動相Ｂの５％～２３％の勾配を１２分間にわたって適用し、続いて、５０％の移動相Ｂで２分間の洗浄ステップを行い、ＲＮＡ断片を溶出した。全ての質量スペクトルを、４００～３２００ｍ／ｚのスキャン範囲にわたって負イオンモードで、以下のＭＳ設定を用いて取得した：乾燥ガス流量、１３Ｌ／分；ガス温度、３５０℃；ネブライザー圧力、１０ｐｓｉ；キャピラリー電圧、３７５０Ｖ。試料データを、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して取得した。
ＲＮＡシーケンシング
１０～１５塩基の３’バーコード配列、続いて２５～４０ＡのポリＡストレッチを含み、３’末端と５’末端の両方にリン酸基を有し、それぞれｍＲＮＡ転写物へのライゲーションを可能にし、自己ライゲーションを防止する、オリゴを設計した。まず、ｍＲＮＡ転写物の５’末端へのオリゴのライゲーションを防止するために、ｍＲＮＡ転写物をｒＳＡＰで処理して、その５’リン酸基を除去した。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを使用して、オリゴをｍＲＮＡ転写物にライゲーションし、ＨＯ－ｍＲＮＡ転写物－バーコード－ポリＡ－ＰＯ４構築物を得た。第２のｒＳＡＰ処理ステップは、Ｎａｎｏｐｏｒｅシーケンシング（ＭｉｎＩＯＮ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ）の準備において、上記構築物から３’リン酸を除去した。
Ｎａｎｏｐｏｒｅシーケンシングについては、ＨＯ－ｍＲＮＡ転写物－バーコード－ポリＡ－ＯＨ構築物を、シーケンシングアダプターにアニーリング及びライゲーションし、製造業者のプロトコルに従ってつながれた後、Ｎａｎｏｐｏｒｅ細胞チップに装填した。装填されると、試料は、３’～５’方向にナノ細孔を通して引かれた。シーケンシングの完了後、バーコードの一部を含有する読み取りを解析し、その領域に続く塩基を収集して分析した。
実施例２：ｒｒｎＢターミネーターｔ１シグナルの存在は、ｍＲＮＡ転写物の早期終結を引き起こす
本実施例は、対象のタンパク質コード配列のコドン最適化ＤＮＡ配列における終結シグナルの意図しない存在が、どのようにインビトロ転写の早期終結をもたらし、その結果、完全長タンパク質コード配列をその一部のみが含む、ｍＲＮＡ転写物の不均一な集団を生じさせるかを示している。
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに作動可能に連結された対象のコドン最適化タンパク質コード配列（ｍＲＮＡ－１）をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを、実施例１に記載されるようなＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用するｍＲＮＡ転写物のインビトロ転写に使用した。ｍＲＮＡ転写物のサイズを、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）により評価した（図１）。完全長ｍＲＮＡ－１転写物の長さは約１９００ヌクレオチドであった。ｍＲＮＡ－１転写物のおおよそ４５％は、約９００ヌクレオチドの長さのトランケートされた転写物であった（図１）。
Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｒｎＢターミネーターｔ１シグナルコンセンサス配列ＴＡＴＣＴＧＴＴの存在は、ＳＰ６及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの両方の一次停止又は終結を引き起こすと報告されている（Ｋｗｏｎ ＆ Ｋａｎｇ １９９９，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４：４１，ｐｐ ２９１４９－２９１５５、Ｓｏｈｎ ＆ Ｋａｎｇ，２００５，ＰＮＡＳ，１０２：１，ｐｐ．７５－８０）。ｍＲＮＡ－１タンパク質コード配列の分析により、それにはヌクレオチド７９６で始まるコンセンサスｒｒｎＢターミネーターｔ１シグナルが含まれていることが分かった。
野生型ｒｒｎＢターミネーターｔ１シグナルでは、コンセンサス配列ＴＡＴＣＴＧＴＴの直後にＧＴＴＴＧＴＣＧＴＧ配列が続く。バリアントｒｒｎＢ１ターミネーターｔ１シグナル配列の終結効率を評価する際に、Ｋｗｏｎ ＆ Ｋａｎｇ（同書）は、試験されたバリアントターミネーターｔ１シグナルのうちの１つを除く全てにおいて、ＴＡＴＧＴＣＴＴコンセンサス配列の３’の直近の５ヌクレオチドに少なくとも３つのＴ塩基を含めた。この領域が削除された場合、０％の終結効率が観察され、この下流のＴリッチ配列が、ｒｒｎＢターミネーターｔ１シグナルでの終結に必要であることを示唆する。しかしながら、ｍＲＮＡ－１中のコンセンサスｒｒｎＢターミネーターｔ１シグナルに続いて、下流Ｔリッチ配列（代わりに、
Figure 2023513836000005
 配列番号２９内に見出される）が続かず、これが終結配列の必須要素ではないことを実証している。
本実施例は、ｍＲＮＡ構築物中のｒｒｎＢターミネーターｔ１シグナルコンセンサス配列の存在が、Ｔリッチ配列の非存在下であっても、ｍＲＮＡ転写物の早期終結を引き起こし、所望の完全長ｍＲＮＡ転写物の収率の大幅な低下をもたらし得ることを示す。
実施例３：ｒｒｎＢ終結ｔ１シグナルのバリアントもまた、ｍＲＮＡ転写物の早期終結をもたらす
本実施例は、コンセンサス配列に対して１位、６位、又は８位の点変異を有するｒｒｎＢターミネーターｔ１シグナルの存在も、インビトロ転写中の早期終結をもたらすことを示す。
実施例２からのｍＲＮＡ－１タンパク質コード配列のバリアントを作製し、そこでＴＡＴＣＴＧＴＴコンセンサス終結シグナル配列を単一位置で変異させて、ｒｒｎＢ終結ｔ１シグナル内のどのヌクレオチドが転写終結に必須であるかを決定した（以下の表１を参照）。
バリアントを、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写に使用した。ｍＲＮＡ転写物のサイズを、実施例１に記載されるようにキャピラリー電気泳動により決定した。約１９００ヌクレオチドで観察されるバンドは、完全長ｍＲＮＡ－１構築物を表す。約９００ヌクレオチドのバンドが観察され、ｍＲＮＡ転写物は、バリアント終結シグナルでの早期終結のためにトランケートされた。この実験の結果は、ＣＥによるｍＲＮＡ転写物の定量から生成されたデジタルゲル画像に示され（図２）、表１に要約されている。
Figure 2023513836000006
ｍＲＮＡ－１バリアントは、１位、６位、又は８位のヌクレオチドの同一性がコンセンサス配列と比較して変化していた場合でも、依然としてトランケートされたｍＲＮＡ転写物をもたらした。しかしながら、２、３、４、５、又は７位のヌクレオチドが変異していた場合、トランケーションは観察されなかった。したがって、タンパク質コード配列を有するＤＮＡ配列内の終結シグナルをスクリーニングする場合、コンセンサス配列と、１位、６位、及び８位の点変異を有する配列バリアントの両方が、インビトロ転写の早期終結を避けるために考慮されるべきである。
ＴＡＴＣＴＧＴＴコンセンサス終結シグナル配列の第４位のＣがＧで置換された場合、終結は発生しないことが以前に知られていた（Ｓｏｈｎ ＆ Ｋａｎｇ，２００５，ＰＮＡＳ，１０２：１，ｐｐ．７５－８０）。２、３、４、５、又は７位の残基のいずれかが、その位置に天然に存在しないヌクレオチドで置換された場合、トランケーションが観察されなかったという所見は、ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質コード配列を変更することなく、終結シグナルを除去するためのより大きな柔軟性を提供する。
実施例４：ｒｒｎＢターミネーターｔ１シグナルは、ｍＲＮＡ転写物の早期終結を引き起こす
本実施例は、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写によって産生されるｍＲＮＡ転写物における早期終結部位が、ｒｒｎＢターミネーターｔ１シグナルのインシリコスクリーニングによって予測され得ることを示す。
実施例３で決定されたように、１位、６位、又は８位でこの配列とは異なる、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｒｎＢターミネーターｔ１シグナルコンセンサス配列ＴＡＴＣＴＧＴＴ又はバリアント配列の存在について、コドン最適化タンパク質コード配列を有する様々なＤＮＡ配列をインシリコでスクリーニングした。この解析は、ポリメラーゼがこれらの終結シグナルで早期終結したときに産生されるであろうトランケートされたｍＲＮＡ転写物のサイズを予測するために実施された（以下の表２を参照）。
正確性についてインシリコ予測を試験するために、コドン最適化タンパク質コード配列をＳＰ６／Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロで転写し、ｍＲＮＡ転写物の実際のサイズを、実施例１に記載されるように、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって決定した。トランケートされたｍＲＮＡ転写物の実際のサイズは、インシリコ解析によって予測されるサイズと比較した（表２を参照）。
Figure 2023513836000007
ｍＲＮＡ転写物のトランケーションは、同定された全てのターミネーターシグナルで観察された。ｒｒｎＢターミネーターｔ１シグナルの同定に基づくトランケートされたｍＲＮＡ転写物の予測サイズは、トランケートされたｍＲＮＡ転写物の実験的に決定されたサイズと良好に相関した。
実施例５：ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによって産生されるｍＲＮＡ転写物は、二重鎖ＲＮＡを含有しない
本実施例は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって合成されるｍＲＮＡ転写物とは異なり、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのｍＲＮＡ転写物が、ＲＮＡ二本鎖を含有することを示す。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼで合成されたｍＲＮＡ転写物には、通常、所望の転写物よりもより長いＲＮＡ及びより短いＲＮＡが混入している（ＷＯ２０１８／１５７１５３を参照されたい）。非常に短い転写物は、一般的に「ショートマー」と呼ばれ、典型的には、インビトロ転写ｍＲＮＡの広範な精製によって除去される必要がある。
伸長された配列は、終結シグナル後の鋳型にコードされたｍＲＮＡ転写物の末端でのヌクレオチドの非鋳型的付加によって生成されると考えられる。追加のヌクレオチドは、一般に「ランオフ」と呼ばれる。ランオフの３’末端が、それ自体又は第２のｍＲＮＡ分子に結合して、それぞれ伸長可能な分子内二重鎖又は分子間二重鎖を形成するのに十分な相補性を有する場合、更なる伸長が起こり得る（Ｇｈｏｌａｍａｌｉｐｏｕｒ ｅｔ ａｌ．２０１８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６：１８，ｐｐ ９２５３－９２６３）。
ｍＲＮＡ転写物は、実施例１に記載されるように、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ又はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのいずれかを使用した、４つの異なる鋳型プラスミドからのインビトロ転写によって生成された。各鋳型プラスミドは、同じタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物をコードした。ＲＮＡ二本鎖の存在は、Ｂａｉｅｒｓｄoｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，１５：２６－３５に記載されているように、抗ｄｓＲＮＡモノクローナル抗体Ｊ２を使用して実行されるドットブロット分析によって検出された。
ドット当たり２００ｎｇの全ｍＲＮＡに相当する、インビトロ転写されたｍＲＮＡの各サンプル２μｌを、正に荷電したナイロン膜上にスポットした。ｄｓＲＮＡの対照サンプルを、ドット当たり２ｎｇ及び２５ｎｇでスポットした。ｄｓＲＮＡの検出については、膜を抗ｄｓＲＮＡマウスモノクローナル抗体Ｊ２とインキュベートした。検出には、西洋わさびペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。得られたドットブロットを図３に示す。この図から分かるように、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼで合成されたｍＲＮＡ転写物では二本鎖ＲＮＡは検出されなかったが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼで調製されたサンプルでは多量の二本鎖ＲＮＡが検出された。
ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼによって合成されたｍＲＮＡ転写物は、分子内二重鎖又は分子間二重鎖を形成しない。
実施例６：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによって産生されるｍＲＮＡ転写物は、非鋳型的な伸長によって伸長される
本実施例は、Ｔ７及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの両方によって合成されるｍＲＮＡ転写物が、「ランオフ」転写によって伸長されることを実証する。
インビトロ転写のためのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの使用は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼで一般的に観察されるｍＲＮＡ転写物におけるショートマーの形成を回避する（ＷＯ２０１８／１５７１５３を参照されたい）。ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼによって合成されるｍＲＮＡ転写物は、通常は、より均質なサイズであるようである。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと同様にＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが、終結シグナル（ランオフ転写）に遭遇した後、非鋳型媒介様式でｍＲＮＡ転写物を伸長し続けるかどうかを決定するために、鋳型化された配列によってコードされるｍＲＮＡ転写物の３’末端に結合するプローブオリゴヌクレオチドのセットを設計した。プローブオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成されたＲＮＡ－ＤＮＡギャップオリゴヌクレオチドであった。それらの配列及び糖修飾を表３に示す。２’－Ｏ－メチルリボース修飾ＲＮＡヌクレオチドは、対応する塩基の前に「ｍ」で示され、ＤＮＡヌクレオチドは斜体で示される。
Figure 2023513836000008
ＲＮａｓｅＨを添加してＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを消化し、鋳型化配列の３’のｍＲＮＡ転写物の断片のみを残した。ｍＲＮＡ転写物の３’末端消化産物のサイズを、実施例１に記載されるように、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）によって決定した。試験された６つのオリゴヌクレオチドのうち、プローブオリゴヌクレオチド＃１は、予想される最長の３’消化産物（ＣＡＵＣＡＡＧＣＵ）を生じさせ、更なる実験のために選択された。
結果を図４Ａに示す。ＳＰ６ ｍＲＮＡ転写物が鋳型化された配列の末端で終了した（すなわち、ランオフ伸長がなかった場合）場合、プローブオリゴヌクレオチド＃１を用いて、９ヌクレオチド３’消化産物（ＣＡＵＣＡＡＧＣＵ）が得られた。この消化産物の同一性は、実施例１に記載されるように、質量分析によって確認された。質量分析分析の結果を図４Ｂに示す。ｍＲＮＡ産物のランオフ伸長が発生したところで、より長い３’消化産物が得られた。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて実験を繰り返した。ＳＰ６及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより転写されたｍＲＮＡの３’消化産物のＬＣ／ＭＳ分析の結果を、図５Ａで比較する。ランオフ伸長によって３’に付加された塩基の数は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼｍＲＮＡ転写物をシーケンシングすることによっても決定された（図５Ｂ）。ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによって合成されたｍＲＮＡ転写物は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって合成されたｍＲＮＡ転写物と比較して短いランオフ配列を有したが、追加のランオフ配列のない場合のｍＲＮＡ転写物のパーセンテージも低かった。
これらのデータは、インビトロで合成されたｍＲＮＡ転写物の非鋳型的な伸長が、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの両方を使用した場合に起こることを実証している。
実施例７：３’末端に終結シグナルを含めることで、線状化プラスミドから合成されたｍＲＮＡ転写物の望ましくない伸長を防ぐ
本実施例は、ｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の３’末端に１つ以上の終結シグナルを付加することが、線状化プラスミドから転写されたｍＲＮＡの望ましくない伸長を減少させることを示す。
ｍＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡ－１２）をコードするＤＮＡ配列は、標準的な分子生物学手順を使用してプラスミド内に挿入することによりＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼに作動可能に連結された。得られたプラスミドを、事前の線状化の有無に関わらず、インビトロ転写に使用した。転写開始部位から８８０ｂｐ下流で配列特異的制限酵素でプラスミドを切断することによって、線状化を実行した。図６Ａに示すように、線状化プラスミドは、実施例１に記載されるようなキャピラリー電気泳動によって決定されるように、単一の８７９ｎｔ長のｍＲＮＡ転写物を生じた。
終結配列の挿入が、ＤＮＡ配列の末端で転写の効果的な終結をもたらすかどうかを決定するために、２つの修飾プラスミドを調製した。プラスミド１には、ｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の３’末端に単一のｒｒｎＢ終結ｔ１シグナル
Figure 2023513836000009
 が含まれていた。プラスミド２には、ＤＮＡ配列の３’末端に同じ終結シグナルの２コピーを含有していた
Figure 2023513836000010
非修飾プラスミド及び修飾プラスミド１及び２は、線状化され、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写の鋳型として使用され、ｍＲＮＡ転写物のサイズを、実施例１に記載されるように、キャピラリー電気泳動によって決定した。
図６Ｂに示すように、プラスミド１は、長さ７９６ｎｔのより短いｍＲＮＡ転写物を産生し、新たに付加された終結配列で終結が起こったことを示す。しかしながら、終結シグナルは、第１のピークに近い第２のピークによって証明されるように、ポリメラーゼの停止に完全には有効ではなく、ＲＮＡポリメラーゼが終結シグナルで直接終結せず、代わりに転写を終結する前に短い距離の間転写を続ける事例が比較的多いことを示唆している。この第２のピークは、プラスミド２から生成されるｍＲＮＡ転写物に対して目に見えず（図６Ｃを参照）、わずか１０塩基対で区切られたタンデムでの２つの終結シグナルの含有が、ｍＲＮＡ転写物の望ましくない伸長を防ぐのに効率的であったことを実証した。
実施例８：３’末端に終結シグナルを含めると、スーパーコイルドプラスミドＤＮＡから合成されたｍＲＮＡ転写物の望ましくない伸長が防止される
本実施例は、ｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の３’末端に１つ以上の終結シグナルを付加することで、インビトロ転写の前に環状核酸ベクターを線状化する必要がなくなることを示している。
ｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の３’末端に終結シグナルが含まれる場合に、線状化が必要かどうかを決定するために、インビトロ転写の前にプラスミドの線状化をすることなく、実施例７の実験を繰り返した。スーパーコイル化プラスミドＤＮＡを、未修飾プラスミドのインビトロ転写に使用した場合、得られたｍＲＮＡ転写物のキャピラリー電気泳動中に、複数の新しいピークが見られた（図７Ａ）。最大のピーク（全ｍＲＮＡ転写物の約５５％を表す）は、約３１２６ｎｔ～約３２３０ｎｔの長さのｍＲＮＡ転写物に対応した。プラスミドのヌクレオチド配列のより綿密な検査により、ｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡシーケンシングの下流の終結シグナル（ＣＡＴＣＴＡＴＴ）が同定された。ヌクレオチド配列解析に基づいて、ｍＲＮＡ転写物の予測されるサイズは、３３０６ｎｔであると予想されるため、約３１２６ｎｔ～約３２３０ｎｔで観察されたピークサイズと良好に相関した。この観察は、ＲＮＡポリメラーゼが、プラスミド骨格内に既に存在する終結シグナルに遭遇するまで、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡを転写し続けたことを示しており、その時点で転写は終結し、所望されるｍＲＮＡ転写をコードするＤＮＡ配列の末端に終結シグナルを含有させることにより、インビトロ転写の前にプラスミド線状化の必要がなくなることが偶然にも確認された。更に大きな転写物に対応する複数のより小さなピークの存在は、反応混合物中のＲＮＡポリメラーゼの少なくとも一部が、反応が終結する前にプラスミド鋳型を複数回転写することを示唆する。対照的に、プラスミド１を鋳型として使用した場合、終結シグナルＴＡＴＣＴＧＴＴの存在により、転写のより効果的な終結をもたらし、ｍＲＮＡ転写物の約７０％が約７９２ｎｔのサイズを有する（図７Ｂ）。二つのＴＡＴＣＴＧＴＴ終結シグナルをタンデムでわずか１０塩基対で区切られたプラスミド２を用いると、正しく終結されたｍＲＮＡ転写物のパーセンテージは更に約９５％まで改善された（図７Ｃ）。
本実施例は、ｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の３’末端に１つ以上の終結シグナルが存在することにより、ｍＲＮＡ合成が主にＤＮＡ配列の末端で終結されるので、鋳型を含むプラスミドの線状化の必要性がなくなることを示す。ｍＲＮＡ転写物の長さを考えると、ランオフ転写は、終結シグナルの存在によっても防止されると考えられる。特に、わずか１０塩基対で区切られた２つのコンセンサス終結シグナルを含めることで、非常に効率的な転写終結に至り、ランオフ転写が防止され、プラスミド線状化の必要性をなくすことができる。
実施例９：３７℃を超える温度でのインビトロ転写は、終結を改善する
本実施例は、インビトロ転写反応が３７℃を超える温度で実行される場合、１つ以上の終結シグナルで終結する可能性が高くなることを示す。
正しく終結したｍＲＮＡ転写物のパーセンテージが更に改善され得るかを決定するために、実施例８に記述された実験をプラスミド２で反復したが、異なる温度で行った。ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用し、温度は別として、実施例１に記載されるものと同一の反応条件で、スーパーコイル化プラスミド２をインビトロ転写反応の鋳型として使用した。得られたｍＲＮＡ転写物のサイズは、実施例１にも記載されるように、キャピラリー電気泳動によって決定された。
ブロックヒーターに置かれたエッペンドルフ管中でインビトロ転写反応を実行することによって反応温度を制御した。図８Ａに示すように、以前に使用した３７℃の温度では、スーパーコイル化プラスミド２から得られたｍＲＮＡ転写物の９２％～９５％が正しく終結した。インビトロ転写反応が実行された温度が４３℃、５０℃、又は５５℃に上昇するにつれて、正しく終結されたプラスミドのパーセンテージは更に増加した。正しく終結されたｍＲＮＡ転写物の収率は、５０℃でピークに達した。図８Ｂに示すように、その温度で、プラスミド２から得られたｍＲＮＡ転写物の９９．７％が正しく終結した。５０℃では最小限の分解しか観察されなかった。
１つ以上の終結シグナルを有するスーパーコイル化プラスミドを使用し、３７℃を超える温度でインビトロ転写反応を実行することにより、プラスミド線状化を必要とせずに正しく終結されたｍＲＮＡ転写物の収率を最大化する反応条件が得られた。
実施例１０：３’末端に３つ以上の終結シグナルを含有させることで、３７℃で正しく終結されたｍＲＮＡ転写物が得られる
本実施例は、ｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の３’末端に３コピー以上の終結シグナルが存在する場合、インビトロ転写が３７℃で実行されるときに、１００％に近い正しく終結されたｍＲＮＡ転写物の収率に到達できることを示す。これにより、反応を実施する前に環状核酸ベクターを線状化する必要なく、従来の条件下でインビトロ転写反応を実施することができる。
鋳型ＤＮＡプラスミドへの３つ以上の終結シグナルの挿入の効果を調査するために、ｍＲＮＡ－１２をコードする更に修飾されたプラスミドを調製した。プラスミド１及び２を、実施例７に記載されるように調製した。プラスミド３は、ｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の３’末端に３つのｒｒｎＢ終結ｔ１シグナルのコピーを含有し、以下の終結配列を作成した：
Figure 2023513836000011
 プラスミド１及び２の終結配列は、ｍＲＮＡ－１２のタンパク質コード領域の直後に挿入されたが、プラスミド３の終結配列は、３’ＵＴＲ領域の後に挿入された。したがって、プラスミド３がインビトロ転写のＤＮＡ鋳型として使用される場合、正しく終結された転写物は、プラスミド１又は２が使用される場合に生成されるもの（約７８０ヌクレオチド長）よりも長い（約８８０ヌクレオチド長）。
実施例９の実験（ＤＮＡプラスミドの線状化なし、３７℃及び５０℃で実行されるインビトロ転写）を、未修飾プラスミド、及び修飾プラスミド１、２及び３に対して繰り返した。反応温度は、サーモサイクラーに置かれたエッペンドルフ管中でインビトロ転写反応を実行することによって制御された。
実施例８のように、３７℃での未修飾プラスミドのインビトロ転写について観察された最大のピークは、長さ約３１１９ｎｔのｍＲＮＡ転写物に対応した（図９Ａ）。これは、ＲＮＡポリメラーゼが、プラスミド骨格中に既に存在する終結シグナルに遭遇するまで、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡを転写し続け、その時点で転写は終結したことを、再度示すものである。インビトロ転写を５０℃で行ったとき、分解が観察され、３７℃転写反応の同等のピークと比較して約３０９９ｎｔの長さのｍＲＮＡ転写物に対応する、より小さなピークにつながった（図９Ｂ）。
プラスミド１を鋳型として使用した場合、終結シグナルの存在が、それぞれ３７℃及び５０℃で実行された転写反応について完全長ｍＲＮＡ－１２転写物に対応するサイズを有する約６２％及び約７４％のｍＲＮＡ転写物で、転写のより効果的な終結をもたらした（図（９Ｃ及び９Ｄ）。二つの終結シグナルをタンデムで含むプラスミド２では、正しく終結されたｍＲＮＡ－１２転写物のパーセンテージが更に増加し、それぞれ３７℃及び５０℃で実行された転写反応に対して約９０％及び約９３％に達した（図９Ｅ及び９Ｆ）。正しく終結された転写物の割合は、３つの終了シグナルをタンデムで含むプラスミド３について更に増加し、３７℃で実施された転写反応では１００％に近づく収率、及び５０℃では＞９９．０％の収率に達した（図９Ｇ及び９Ｈ）。未修飾プラスミドについては、ＤＮＡ鋳型としてプラスミド１、２又は３を使用して５０℃で実行された転写反応について、ｍＲＮＡ転写物の著しい分解が観察された。この実験で５０℃で行われた反応で著しい分解が観察されたが、実施例９に記載された実験では観察されなかったという事実は、実施例９の反応温度が一貫して５０℃に維持されていない可能性があることを示唆している。（例えば、エッペンドルフ管の一部が、加熱ブロック自体よりもはるかに低い温度を有する周囲空気に曝露されるため）。これは、３７℃を超える温度での分解を最小限に抑えるために、反応条件を最適化する必要がある場合があることを示唆している。
本実施例は、ｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の３’末端で終結シグナルの数を増やすことにより、ｍＲＮＡ合成が主にＤＮＡ配列の末端で終結するため、鋳型を含むプラスミドの線状化の必要性がなくなることを更に確認する。また、１つ又は２つの終結シグナルが直列に含まれていた場合、正しく終結されたｍＲＮＡ転写物の収率は、転写反応をより高い温度で行うことによって改善され得るが、ｍＲＮＡ分解を最小限に抑えるよう注意する必要があることも示す。３つ以上の終結シグナルを直列に含めることにより、正しく終結されたｍＲＮＡ転写物の収率が１００％に近くに到達することができ、転写反応が３７℃で実行されるときに、このようなＤＮＡプラスミド鋳型に対し終結効率を最大化できることが示される。
実施例１１：３’終結シグナルを有するスーパーコイル化プラスミドＤＮＡから転写されたｍＲＮＡは、インビトロで効果的に発現する
本実施例は、３’終結シグナルを有するスーパーコイル化プラスミドＤＮＡから転写されたｍＲＮＡと、線状化プラスミドから転写されたｍＲＮＡについて、同等のレベルのタンパク質発現を達成できることを示す。したがって、本実施例は、３’終結シグナルを含めることで、インビトロ転写前に環状核酸ベクターを線状化させる必要性がなくなるという更なる証拠を提供する。
タンパク質発現レベルは、実施例１０に記載される、スーパーコイル化プラスミド３（ｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の３’末端に３コピーのｒｒｎＢ終結ｔ１シグナルを含有する）からのインビトロ転写によって調製されたｍＲＮＡ－１２転写物について、及び線状化されていないプラスミド（終結シグナルを含有しない）からのインビトロ転写によって調製された同等のｍＲＮＡ－１２転写物について、決定された。
タンパク質発現レベルを、無細胞翻訳系（ＣＦＴＳ）を使用して評価した。ＣＦＴＳは、細胞培養の維持又はトランスフェクション剤の使用を必要とせずに、ハイスループット様式でｍＲＮＡ構築物の発現をスクリーニングするための有用なツールである。ＣＦＴＳのコア成分は、ＨｅＬａ細胞から生成された細胞質抽出物であり、タンパク質を発現するために必要な機構を含む（Ｍｉｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．２００５，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，４６，３４８－３５７）。補助的反応成分、主にＭｇ２＋及びＫ＋レベルの調整を介して、目的のタンパク質に対してタンパク質発現が最適化される。本実施例で使用されるＣＦＴＳ反応条件及び成分は、ｍＲＮＡ－１２転写物によってコードされるタンパク質の発現のために最適化されている。
２つの別個のＣＦＴＳ反応混合物を、各ｍＲＮＡ－１２転写物に対して調製した。ＣＦＴＳ反応混合物は、６５μＬの反応体積中に、３２５ｆｍｏｌのｍＲＮＡ－１２転写物、４０％（ｖ／ｖ）のＨｅＬａ細胞質抽出物（２０ｍｇ／ｍｌ総タンパク質量）、２７ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭのＫＯＡｃ、１．２ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２、１６ｍＭのＫＣｌ、ＲＮＡｓｅ阻害剤（１Ｕ／μＬ）、１ｍＭのＤＴＴ、１．２ｍＭのＡＴＰ、１２５μｇのＧＴＰ、３０μＭのアミノ酸混合物、３００μＭのスペルミジン、１８ｍＭのクレアチンホスファターゼ、６０μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、及び９０μｇ／ｍＬの子牛肝ｔＲＮＡを含む。
反応混合物を、２５℃で２時間インキュベートした。この後、タンパク質発現レベルがＥＬＩＳＡにより決定されるまで、反応混合物を、－８０℃で保存した。この分析の結果を図１０に示す。図１０は、スーパーコイル化プラスミド３から転写されたｍＲＮＡ－１２について、線状化されていないプラスミドから転写されたｍＲＮＡ－１２よりも、同等又は更にわずかに高いレベルのタンパク質発現を達成できることを示す。
これらのデータは、終結配列の付加が、それに応じて修飾されたＤＮＡ鋳型のＲＮＡポリメラーゼによる転写を終結させるのに有効であり、その結果インビトロ転写の前にＤＮＡ鋳型を含むプラスミドを線状化する必要がもはやないという本発明者らの発見を裏付けるものである。したがって、３’終結シグナルを有するスーパーコイル化ＤＮＡ鋳型から産生されたｍＲＮＡは、ｍＲＮＡを作製するための既存のプロセスにおいて、線状化プラスミドから提供されるｍＲＮＡを置き換えることができる。
プラスミド線状化ステップは、典型的には制限酵素とのインキュベーションを伴う。したがって、このステップを除去することにより、特に医薬品としてｍＲＮＡを製造するために大規模に行われる場合に、ｍＲＮＡの生産における大幅なコスト削減をもたらすことができる。
均等物
当業者は、日常的な実験作業を越えない手法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、又は確認できるものとなる。本発明の範囲は、上記の記載を限定することを意図しないが、むしろ以下の特許請求の範囲に記述されるとおりである。
配列表
本明細書は、配列表（「ＭＲＴ－２１２１ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔ」という名称のテキスト（．ｔｘｔ）ファイルとして２０２２年１０月１３日に電子的に提出されたもの）を参照する。当該テキストファイルは、日付に作成されたものであり、サイズは２２，７４４バイトである。当該配列表の全内容が、参照によって本明細書に組み込まれる。
Ｄｕｅｔ ａｌ．（２００９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｇｅｎ．，１０４（６）：１１８９－１１９６）は、Ｔ７ ｐｈｉターミネーターの大きなサイズ（１００ｂｐ）と非効率が問題であると考え、代わりに、各々８塩基対で区切られた１～３個の水胞性口内炎ウイルス（ｖｓｖ）クラスＩＩ終結シグナル（ＴＡＴＣＴＧＴＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣ（配列番号３６））をタンデムで含めることによって、環状ＤＮＡ鋳型からの転写中の終結効率を改善することを試みた。その結果、単一のｖｓｖ終結シグナルを使用した場合、終結効率は５３～６２％に過ぎないことが判明した。２～３個のｖｓｖターミネーターを使用した場合、終了効率は６５～７５％に増加した。
したがって、一態様では、本発明は、インビトロ転写のための鋳型としてタンパク質をコードする最適化ＤＮＡ配列を調製するための方法を対象とし、当該方法は、（ａ）タンパク質コード配列を含むＤＮＡ配列を提供すること、（ｂ）ＤＮＡ配列中の終結シグナルの存在を決定することを含み、終結シグナルは、以下の核酸配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’（配列番号１）を有し、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される、決定することと、（ｃ）１つ以上の終結シグナルが存在する場合、当該終結シグナルの２位、３位、４位、５位及び７位のうちのいずれか１つにおいて、１つ以上の核酸を他の３つの核酸のうちのいずれか１つで置換して最適化されたＤＮＡ配列を生成することによって、ＤＮＡ配列を修飾することであって、必要に応じて、１つ以上の置換核酸が、タンパク質コード配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を保存するために選択される、修飾することと、を含む。
したがって、更なる態様では、本発明は、インビトロ転写のための鋳型としてタンパク質をコードする最適化ＤＮＡ配列を調製するための方法を提供し、当該方法は、（ａ）タンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供することと、（ｂ）ＤＮＡ配列の３’末端に１つ以上の終結シグナルを付加して、最適化されたＤＮＡ配列を提供することと、を含み、１つ以上の終結シグナルは、以下の核酸配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’（配列番号１）を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される。本発明は、インビトロ転写で使用するためのＤＮＡ配列もまた提供し、５’から３’の順序で、（ａ）５’ＵＴＲと、（ｂ）タンパク質コード配列と、（ｃ）３’ＵＴＲと、（ｄ）任意選択的にポリＡテールをコードする核酸配列と、（ｅ）終結シグナルと、を含み、終結シグナルは、以下の核酸配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’（配列番号１）を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される。更に、本発明は、典型的にはＲＮＡポリメラーゼプロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含む核酸ベクター、及びＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ配列をｍＲＮＡ転写物に転写する、ｍＲＮＡの産生のための方法におけるこれらの核酸ベクターの使用を提供する。
特定の実施形態では、コドン最適化アルゴリズムは、ＤＮＡ配列中の終結シグナルの存在を決定し、終結シグナルは、以下の核酸配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’（配列番号１）を有し、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択され、１つ以上の終結シグナルが存在する場合、当該終結シグナルの２位、３位、４位、５位及び７位のうちのいずれか１つにおいて、１つ以上の核酸を他の３つの核酸のうちのいずれか１つで置換して最適化されたＤＮＡ配列を生成することによって、ＤＮＡ配列を修飾し、必要に応じて、１つ以上の置換核酸が、タンパク質コード配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を保存するために選択される。
本発明によれば、終結シグナルは、以下の核酸配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’（配列番号１）を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される。一実施形態では、終結シグナルは、核酸配列５’－Ｘ１ＡＴＣＴＧＴＴ－３’（配列番号２）を含む。Ｘ１は、Ｔ又はＣであってもよい。好適な終結は、５’－－ＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号３）、５’－－ＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号４）、５’－－ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号５）、５’－－ＣＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号６）、５’－－ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＴ－３’（配列番号７）、５’－－ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＴ－３’（配列番号８）、又は５’－－ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＴ－３’（配列番号９）から選択され得る。
典型的には、ＤＮＡ配列は、２つ以上の終結シグナル、例えば、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上を含む。発明者らは、効果的な終結が発生するためには、終結シグナルは１０塩基対以下で区切られ得、例えば５～１０塩基対で区切られ得ることを示した。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、長さ３０ヌクレオチドのヌクレオチド配列内に２つの終結シグナル（例えば、５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’（配列番号１）、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される）を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本発明で使用するためのＤＮＡ配列は、その３’末端に以下の配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－（ＺＮ）－Ｘ４ＡＴＣＴＸ５ＴＸ６－３’（配列番号１０）を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６は独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択され、ＺＮが、Ｎ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、その各々は独立してＡ、Ｃ、ＴのＧから選択され、Ｎは１０以下である。例えば、Ｎは、５、６、７、８、９、又は１０とすることができる。ＺはＴであってもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、以下の配列を含む：ＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号１２）．他の実施形態では、ＤＮＡ配列は、長さ５０ヌクレオチドのヌクレオチド配列内に３つの終結シグナル（例えば、５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’（配列番号１）、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される）を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本発明で使用するためのＤＮＡ配列は、その３’末端に以下の配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－（ＺＮ）－Ｘ４ＡＴＣＴＸ５ＴＸ６－（ＺＭ）－Ｘ７ＡＴＣＴＸ８ＴＸ９－３’（配列番号１１）を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８及びＸ９が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択され、ＺＮが、Ｎ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、ＺＭが、Ｍ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、それらの各々は独立してＡ、Ｃ、ＴのＧから選択され、Ｎ及び／又はＭは、１０以下である。例えば、Ｎは、５、６、７、８、９、又は１０とすることができる。Ｍは、５、６、７、８、９、又は１０とすることができる。Ｚは、Ｔであってもよい。特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、その３’末端に以下の配列を含む：
Figure 2023513836000037
本出願の実施例は、２つ以上の終結シグナルの付加が、線状ＤＮＡ鋳型及びスーパーコイルＤＮＡ鋳型の両方について、インビトロ転写中のｍＲＮＡ転写物の望ましくない伸長の低下をもたらすことを実証する。したがって、いくつかの実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上の終結シグナルが、ＤＮＡ配列の３’末端に付加される。いくつかの実施形態では、３’末端に付加される終結配列は、長さ３０ヌクレオチドのヌクレオチド配列内に２つの終結シグナル（例えば、５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’（配列番号１）、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される）を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、３’末端に付加される終結配列は、以下の配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－（ＺＮ）－Ｘ４ＡＴＣＴＸ５ＴＸ６－３’（配列番号１０）を含むか、又はそれからなり、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択され、ＺＮは、Ｎ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、その各々は独立してＡ、Ｃ、ＴのＧから選択され、Ｎは１０以下である。いくつかの実施形態では、終結配列は、以下の配列を含むか、又はそれらからなる：ＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号１２）。
いくつかの実施形態では、３’末端に付加される終結配列は、長さ５０ヌクレオチドのヌクレオチド配列内に３つの終結シグナル（例えば、５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’（配列番号１）、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される）を含むか、又はからなる。いくつかの実施形態では、３つの終結シグナルが、ＤＮＡ配列の３’末端に付加される。いくつかの実施形態では、３’末端に付加される終結配列は、以下の配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－（ＺＮ）－Ｘ４ＡＴＣＴＸ５ＴＸ６－（ＺＭ）－Ｘ７ＡＴＣＴＸ８ＴＸ９－３’（配列番号１１）を含むか、又はそれらからなり、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８及びＸ９が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ、又はＧから選択され、ＺＮが、Ｎ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、ＺＭが、Ｍ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、それらの各々は独立してＡ、Ｃ、ＴのＧから選択され、Ｎ及び／又はＭは、１０以下である。いくつかの実施形態では、終結配列は、以下の配列を含むか、又はそれらからなる：
Figure 2023513836000038
いくつかの実施形態では、好適なＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは融合タンパク質である。例えば、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、酵素の単離、精製、又は溶解性を促進するための１つ以上のタグを含み得る。適切なタグは、Ｎ末端、Ｃ末端、及び／又は内部に配置され得る。好適なタグの非限定的な例としては、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ８－ｋＤａ抗原（Ｆｈ８）、ＦＬＡＧタグペプチド、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジンタグ（例えば、ヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６）（配列番号３８））、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｎ－利用物質（ＮｕｓＡ）、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）融合タグ、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＴＲＥＰ）、タンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）、及びチオレドキシン（ＴｒｘＡ）が挙げられる。本発明では他のタグを使用することができる。これら及び他の融合タグは、例えば、Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５（２０１４）：６３及びＰＣＴ／ＵＳ１６／５７０４４に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓタグは、ＳＰ６のＮ末端に位置する。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、以下のステップを含む医薬組成物を調製するための方法を提供する：
ａ）タンパク質コード配列を含むＤＮＡ配列を提供するステップと、
ｂ）以下によりＤＮＡ配列を最適化するステップであって、
ｉ）ＤＮＡ配列中の終結シグナルの存在を決定することであって、終結シグナルが、以下の核酸配列：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’（配列番号１）を有し、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ若しくはＧから選択される、決定することと、１つ以上の終結シグナルが存在する場合、当該終結シグナルの２位、３位、４位、５位及び７位のうちのいずれか１つにおいて、１つ以上の核酸を他の３つの核酸のうちのいずれか１つで置換して最適化されたＤＮＡ配列を生成することによって、ＤＮＡ配列を修飾することであって、必要に応じて、１つ以上の置換核酸が、タンパク質コード配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を保存するために選択される、修飾することと、並びに／又は
ｉｉ）タンパク質コード配列の３’末端に１つ以上の終結シグナルを付加することであって、１つ以上の終結シグナルが、以下の核酸配列：Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’（配列番号１）を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は独立してＡ、Ｃ、Ｔ若しくはＧから選択される、付加することと、により、最適化するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）の最適化されたＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によってｍＲＮＡを合成するステップと、
ｄ）ステップ（ｃ）で調製物からｍＲＮＡを沈殿させるステップと、
ｅ）ステップ（ｄ）の沈殿したｍＲＮＡを含む不純な調製物を、タンジェンシャルフロー濾過によって精製するステップと、
ｆ）ステップ（ｅ）の精製されたｍＲＮＡを、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、１つ以上のステロール系脂質、又は１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含むリポソームに封入するステップ。
野生型ｒｒｎＢターミネーターｔ１シグナルでは、コンセンサス配列ＴＡＴＣＴＧＴＴの直後にＧＴＴＴＧＴＣＧＴＧ配列（配列番号３７）が続く。バリアントｒｒｎＢ１ターミネーターｔ１シグナル配列の終結効率を評価する際に、Ｋｗｏｎ ＆ Ｋａｎｇ（同書）は、試験されたバリアントターミネーターｔ１シグナルのうちの１つを除く全てにおいて、ＴＡＴＧＴＣＴＴコンセンサス配列の３’の直近の５ヌクレオチドに少なくとも３つのＴ塩基を含めた。この領域が削除された場合、０％の終結効率が観察され、この下流のＴリッチ配列が、ｒｒｎＢターミネーターｔ１シグナルでの終結に必要であることを示唆する。しかしながら、ｍＲＮＡ－１中のコンセンサスｒｒｎＢターミネーターｔ１シグナルに続いて、下流Ｔリッチ配列（代わりに、
Figure 2023513836000039
 配列番号２９内に見出される）が続かず、これが終結配列の必須要素ではないことを実証している。
終結配列の挿入が、ＤＮＡ配列の末端で転写の効果的な終結をもたらすかどうかを決定するために、２つの修飾プラスミドを調製した。プラスミド１には、ｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の３’末端に単一のｒｒｎＢ終結ｔ１シグナル
Figure 2023513836000040
 （配列番号１４））が含まれていた。プラスミド２には、ＤＮＡ配列の３’末端に同じ終結シグナルの２コピーを含有していた
Figure 2023513836000041
 （配列番号１２））。
鋳型ＤＮＡプラスミドへの３つ以上の終結シグナルの挿入の効果を調査するために、ｍＲＮＡ－１２をコードする更に修飾されたプラスミドを調製した。プラスミド１及び２を、実施例７に記載されるように調製した。プラスミド３は、ｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の３’末端に３つのｒｒｎＢ終結ｔ１シグナルのコピーを含有し、以下の終結配列を作成した：
Figure 2023513836000042
 （配列番号１３）。
プラスミド１及び２の終結配列は、ｍＲＮＡ－１２のタンパク質コード領域の直後に挿入されたが、プラスミド３の終結配列は、３’ＵＴＲ領域の後に挿入された。したがって、プラスミド３がインビトロ転写のＤＮＡ鋳型として使用される場合、正しく終結された転写物は、プラスミド１又は２が使用される場合に生成されるもの（約７８０ヌクレオチド長）よりも長い（約８８０ヌクレオチド長）。

Claims (97)

  1. インビトロ転写のための鋳型としてタンパク質をコードする最適化されたＤＮＡ配列を調製するための方法であって、前記方法が、
    ａ．タンパク質コード配列を含むＤＮＡ配列を提供することと、
    ｂ．前記ＤＮＡ配列中の終結シグナルの存在を決定することであって、前記終結シグナルが、以下の核酸配列：
    ５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’を有し、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される、決定することと、
    ｃ．１つ以上の終結シグナルが存在する場合、前記終結シグナルの２位、３位、４位、５位、及び７位のうちのいずれか１つにおいて、１つ以上の核酸を他の３つの核酸のうちのいずれか１つで置換して前記最適化されたＤＮＡ配列を生成することによって、前記ＤＮＡ配列を修飾することであって、必要に応じて、前記１つ以上の置換核酸が、前記タンパク質コード配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を保存するために選択される、修飾することと、を含む、方法。
  2. ステップｂ及びｃが、コンピュータによって実施される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＤＮＡ配列が、５’ＵＴＲをコードする第１の核酸配列及び／又は３’ＵＴＲをコードする第２の核酸配列を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ＤＮＡ配列中の前記終結シグナルの３’の直近の５つのヌクレオチドが、３つ以上のＴヌクレオチドを含まない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記方法が、同じタンパク質配列をコードする野生型ＤＮＡ配列と比較して、
    ａ．ｍＲＮＡプロセシング及び安定性に関連する要素、並びに／又は
    ｂ．翻訳若しくはタンパク質折り畳みに関連する要素を最適化するために、前記ＤＮＡ配列を修飾するステップを更に含み、
    前記修飾が、前記最適化されたＤＮＡ配列が生成される前に行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ｍＲＮＡプロセシング又は安定性に関連する要素が、隠れた（ｃｒｙｐｔｉｃ）スプライス部位、ｍＲＮＡ二次構造、ｍＲＮＡの安定した自由エネルギー、反復配列、及びＲＮＡ不安定性モチーフを含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記翻訳又はタンパク質折り畳みに関連する要素が、コドン使用頻度バイアス、コドン適応性、内部ｃｈｉ部位、リボソーム結合部位、未成熟ポリＡ部位、シャイン－ダルガーノ配列、コドンコンテキスト、コドン－アンチコドン相互作用、及び翻訳休止部位を含む、請求項５に記載の方法。
  8. 前記方法が、前記最適化されたＤＮＡ配列を合成するステップを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記方法が、合成された最適化された前記ＤＮＡ配列を、インビトロ転写を使用するための核酸ベクターに挿入することを更に含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記核酸ベクターが、前記最適化されたＤＮＡ配列に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含み、任意選択的に、前記ＲＮＡポリメラーゼが、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ又はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項９に記載の方法。
  11. 前記核酸ベクターが、プラスミドである、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 前記プラスミドが、インビトロ転写前に線状化される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記方法が、前記合成された最適化されたＤＮＡ配列をインビトロ転写で使用してｍＲＮＡを合成することを更に含む、請求項８～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記ｍＲＮＡが、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによって合成される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが、天然由来のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが、組換えＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが、タグを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記タグが、ｈｉｓ－タグである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ｍＲＮＡが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって合成される、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記方法が、合成された前記ｍＲＮＡをキャッピング及び／又はテーリングする別個のステップを更に含む、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. キャッピング及びテーリングが、インビトロ転写中に起こる、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記ｍＲＮＡが、各ＮＴＰが１～１０ｍＭの範囲の濃度のＮＴＰ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のＤＮＡ鋳型、及び０．０１～０．１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度の前記ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含む反応混合物で合成される、請求項１３～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記反応混合物が、各ＮＴＰが５ｍＭの濃度のＮＴＰ、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のＤＮＡ鋳型、及び０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度の前記ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ｍＲＮＡが、３７～５６℃の範囲の温度で合成される、請求項１３～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記ＮＴＰが、天然由来のＮＴＰである、請求項１３～２３のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記ＮＴＰが、修飾ＮＴＰを含む、請求項１３～２４のいずれか一項に記載の方法。
  27. コンピュータプログラムであって、前記プログラムがコンピュータによって実行されるとき、前記コンピュータに、
    ａ．タンパク質コード配列を含むＤＮＡ配列を受信させ、
    ｂ．請求項１～７のいずれか一項に記載のステップｂ及びｃを実施させる命令を含む、コンピュータプログラム。
  28. 請求項２７に記載のコンピュータプログラムを記憶させたコンピュータ可読データキャリア。
  29. 請求項２７に記載のコンピュータプログラムを搬送するデータキャリア信号。
  30. 請求項１～７のいずれか一項に記載の方法を実施するための手段を含む、データ処理システム。
  31. インビトロ転写のための鋳型としてタンパク質をコードする最適化されたＤＮＡ配列を調製するための方法であって、前記方法が、
    ａ．タンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供することと、
    ｂ．前記ＤＮＡ配列の３’末端に１つ以上の終結シグナルを付加して、前記最適化されたＤＮＡ配列を提供することと、を含み、
    前記１つ以上の終結シグナルが、以下の核酸配列：
    ５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される、方法。
  32. 前記終結シグナルが、核酸配列５’－Ｘ１ＡＴＣＴＧＴＴ－３’を含む、請求項３１に記載の方法。
  33. Ｘ１が、Ｔである、請求項３１又は３２に記載の方法。
  34. Ｘ１が、Ｃである、請求項３１又は３２に記載の方法。
  35. 前記終結シグナルが、５’－－ＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’、５’－－ＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’、５’－－ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’、５’－－ＣＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’、５’－－ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＴ－３’、５’－－ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＴ－３’、又は５’－－ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＴ－３’から選択される、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. ２つ以上、３つ以上、４つ以上の終結シグナルが、前記ＤＮＡ配列の３’末端に付加される、請求項３１～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列が、５’ＵＴＲをコードする第１の核酸配列及び／又は３’ＵＴＲをコードする第２の核酸配列を更に含む、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列が、ポリＡテールをコードする第３の核酸配列を更に含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列が、ポリＡテールをコードする配列を含まない、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列が、リボザイムをコードするＤＮＡ配列を更に含まない、請求項３０～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列中の前記終結シグナルの３’の直近の５つのヌクレオチドが、３つ以上のＴヌクレオチドを含まない、請求項３０～３４及び３６～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記ＤＮＡ配列が、２つ以上の終結シグナルを含み、前記終結シグナルが、１０塩基対以下で区切られ、例えば５～１０塩基対で区切られる、請求項３０～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記最適化されたＤＮＡ配列が、以下の配列：（ａ）５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－（ＺＮ）－Ｘ４ＡＴＣＴＸ５ＴＸ６－３’又は（ｂ）５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－（ＺＮ）－Ｘ４ＡＴＣＴＸ５ＴＸ６－（ＺＭ）－Ｘ７ＡＴＣＴＸ８ＴＸ９－３’を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８及びＸ９が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択され、ＺＮが、Ｎ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、ＺＭが、Ｍ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、それらの各々が独立して、Ａ、Ｃ、ＴのＧから選択され、式中、Ｎ及び／又はＭが、独立して１０以下である、請求項３０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. Ｎが、５、６、７、８、９若しくは１０であり、かつ／又はＭが、５、６、７、８、９若しくは１０である、請求項４３に記載の方法。
  45. Ｚが、Ｔである、請求項４３又は４４に記載の方法。
  46. 前記ＤＮＡ配列が、前記タンパク質をコードする別の配列と比較して、
    ａ．ｍＲＮＡプロセシング及び安定性に関連する要素、並びに／又は
    ｂ．翻訳若しくはタンパク質折り畳みに関連する要素に関して最適化される、請求項３０～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記ｍＲＮＡプロセシング又は安定性に関連する要素が、隠れたスプライス部位、ｍＲＮＡ二次構造、ｍＲＮＡの安定した自由エネルギー、反復配列、及びＲＮＡ不安定性モチーフを含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記翻訳又はタンパク質折り畳みに関連する要素が、コドン使用頻度バイアス、コドン適応性、内部ｃｈｉ部位、リボソーム結合部位、未成熟ポリＡ部位、シャイン－ダルガーノ配列、コドンコンテキスト、コドン－アンチコドン相互作用、及び翻訳休止部位を含む、請求項４６に記載の方法。
  49. ステップａで提供される前記ＤＮＡ配列が、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法によって最適化されている、請求項３０～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記方法が、前記最適化されたＤＮＡ配列を、インビトロ転写を使用するための核酸ベクターに挿入することを更に含む、請求項３０～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. インビトロ転写で使用するためのＤＮＡ配列であって、５’から３’の順序で、
    ａ．５’ＵＴＲと、
    ｂ．タンパク質コード配列と、
    ｃ．３’ＵＴＲと、
    ｄ．任意選択的に、ポリＡテールをコードする核酸配列と、
    ｅ．終結シグナルと、を含み、
    前記終結シグナルが、以下の核酸配列：
    ５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択される、ＤＮＡ配列。
  52. 前記終結シグナルが、核酸配列５’－Ｘ１ＡＴＣＴＧＴＴ－３’を含む、請求項５１に記載のＤＮＡ配列。
  53. Ｘ１が、Ｔである、請求項５１又は５２に記載のＤＮＡ配列。
  54. Ｘ１が、Ｃである、請求項５１又は５２に記載のＤＮＡ配列。
  55. 前記終結シグナルが、５’－－ＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’、５’－－ＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’、５’－－ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’、５’－－ＣＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’、５’－－ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＴ－３’、５’－－ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＴ－３’、又は５’－－ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＴ－３’から選択される、請求項５１～５４のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列。
  56. ２つ以上の終結シグナル、例えば、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上を含む、請求項５１～５５のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列。
  57. 前記終結シグナルが、１０塩基対以下で区切られ、例えば５～１０塩基対で区切られる、請求項５６に記載のＤＮＡ配列。
  58. 前記ＤＮＡ配列が、以下の配列：（ａ）５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－（ＺＮ）－Ｘ４ＡＴＣＴＸ５ＴＸ６－３’又は（ｂ）５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－（ＺＮ）－Ｘ４ＡＴＣＴＸ５ＴＸ６－（ＺＭ）－Ｘ７ＡＴＣＴＸ８ＴＸ９－３’を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８及びＸ９が独立して、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから選択され、ＺＮが、Ｎ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、ＺＭが、Ｍ個のヌクレオチドのスペーサー配列を表し、それらの各々が独立して、Ａ、Ｃ、ＴのＧから選択され、式中、Ｎ及び／又はＭが、独立して１０以下である、請求項５１～５７のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列。
  59. Ｎが、５、６、７、８、９若しくは１０であり、かつ／又はＭが、５、６、７、８、９若しくは１０である、請求項５８に記載のＤＮＡ配列。
  60. Ｚが、Ｔである、請求項５８又は５９に記載のＤＮＡ配列。
  61. 前記終結シグナルが、前記５’ＵＴＲ、前記タンパク質コード配列、及び前記３’ＵＴＲに存在しない、請求項５１～６０のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列。
  62. 前記ＤＮＡ配列が、リボザイムをコードするＤＮＡ配列を含まない、請求項５１～６１のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列。
  63. 前記ＤＮＡ配列が、同じタンパク質配列をコードする野生型ＤＮＡ配列と比較して、
    ａ．ｍＲＮＡプロセシング及び安定性に関連する要素、並びに／又は
    ｂ．翻訳若しくはタンパク質折り畳みに関連する要素を最適化するために、修飾される、請求項５１～６２のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列。
  64. 請求項５１～６３のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列を含む核酸ベクター。
  65. 前記ベクターが、前記最適化されたＤＮＡ配列に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む、請求項６４に記載の核酸ベクター。
  66. 前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター又はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである、請求項６５に記載の核酸ベクター。
  67. 前記核酸ベクターが、プラスミドである、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
  68. 請求項５１～６３のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列、又は請求項６４～６７のいずれか一項に記載の核酸ベクターを含む、インビトロ転写で使用するためのキット。
  69. ＲＮＡポリメラーゼ及びＮＴＰを更に含む、請求項６８に記載のキット。
  70. ｍＲＮＡの産生のための方法であって、前記方法が、請求項６４～６７のいずれか一項に記載の核酸ベクターを、ＮＴＰ及びＲＮＡポリメラーゼを含む反応混合物に添加することを含み、前記ＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ配列をｍＲＮＡ転写物に転写する、方法。
  71. 前記核酸ベクターが、プラスミドである、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記プラスミドが、インビトロ転写前に線状化される、請求項７２に記載の方法。
  73. 前記プラスミドが、インビトロ転写前に線状化されない、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記ＲＮＡポリメラーゼが、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項７０～７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが、天然由来のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが、組換えＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項７４に記載の方法。
  77. 前記組換えＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが、タグを含む、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記タグが、ｈｉｓ－タグである、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項７０～７３のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記方法が、合成された前記ｍＲＮＡをキャッピング及び／又はテーリングする別個のステップを更に含む、請求項７０～７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. キャッピング及びテーリングが、インビトロ転写中に起こる、請求項７０～７９のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記ｍＲＮＡが、各ＮＴＰが１～１０ｍＭの範囲の濃度のＮＴＰ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のＤＮＡ鋳型、及び０．０１～０．１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度の前記ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含む反応混合物で合成される、請求項７０～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記反応混合物が、各ＮＴＰが５ｍＭの濃度のＮＴＰ、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のＤＮＡ鋳型、及び０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度の前記ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記ｍＲＮＡが、３７～５６℃の範囲の温度、例えば、５０～５２℃で合成される、請求項７０～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記ＮＴＰが、天然由来のＮＴＰである、請求項７０～８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記ＮＴＰが、修飾ＮＴＰを含む、請求項７０～８４のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記ｍＲＮＡ転写物の少なくとも７５％が、前記終結シグナルで終結される、請求項７０～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記ｍＲＮＡ転写物の少なくとも８０％が、前記終結シグナルで終結される、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記ｍＲＮＡ転写物の少なくとも８５％が、前記終結シグナルで終結される、請求項８７に記載の方法。
  90. 前記ｍＲＮＡ転写物の少なくとも９０％が、前記終結シグナルで終結される、請求項８７に記載の方法。
  91. 前記ｍＲＮＡ転写物の少なくとも９５％が、前記終結シグナルで終結される、請求項８７に記載の方法。
  92. 前記ｍＲＮＡ転写物の少なくとも９９％が、前記終結シグナルで終結される、請求項８７に記載の方法。
  93. 終結部位が、（ｉ）サイズが１００ヌクレオチド未満の３’末端断片を生成するための前記ｍＲＮＡの消化、及び（ｉｉ）液体クロマトグラフィーによる前記３’末端断片の分析によって決定される、請求項８７～９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. 終結部位が、ＲＮＡシーケンシングによって決定される、請求項８７～９２のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼであり、前記ｍＲＮＡ転写物が、ＲＮＡ二本鎖を実質的に含まない、請求項７０～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記ｍＲＮＡ転写物が、対照と比較して検出不可能なレベルのＲＮＡ二本鎖を含有する、請求項９５に記載の方法。
  97. ＲＮＡ二本鎖が、ｄｓＲＮＡに特異的に結合する抗体を用いて検出される、請求項９６に記載の方法。
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