JP2017517266A - Ｒｎａ生成を強化する方法及び手段 - Google Patents

Abstract

本発明は、所与の配列のＲＮＡ分子を合成する方法であって、前記ＲＮＡ分子における４種のヌクレオチドＧ、Ａ、Ｃ、及びＵの各割合（１）を求める工程と、配列最適化反応ミックス中でインビトロ転写によって前記ＲＮＡ分子を合成する工程であって、前記配列最適化反応ミックスが、４種のリボヌクレオシド三リン酸ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰを含み、前記配列最適化反応ミックス中の前記４種のリボヌクレオシド三リン酸の各割合（２）が、前記ＲＮＡ分子、バッファ、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼ中の各ヌクレオチドの割合（１）に対応する工程とを含む方法に関する。更に、本発明は、所与の配列のＲＮＡ分子を合成するためのバイオリアクタ（１）であって、配列最適化反応ミックス中でインビトロ転写反応を実施するための反応モジュール（２）と、転写されたＲＮＡ分子を一時的に捕捉するための捕捉モジュール（３）と、前記配列最適化反応ミックスの成分の前記反応モジュール（２）への送り込みを制御するための制御モジュール（４）とを含み、前記反応モジュール（２）が、前記反応ミックスからヌクレオチドを分離するための濾過膜（２１）を含み、前記制御モジュール（４）による前記配列最適化反応ミックスの成分の送り込みの制御が、分離されたヌクレオチドの測定濃度に基づくバイオリアクタ（１）に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、特に、所与の配列のＲＮＡ分子を合成する方法、及び前記方法を実施するための反応器に関する。

治療用リボ核酸（ＲＮＡ）分子とは、新たに登場した薬物の分類を表す。ＲＮＡに基づく治療は、ワクチンとして使用するための抗原をコードしているｍＲＮＡ分子を含む（非特許文献１）。更に、例えば、成長因子又は酵素等の欠損タンパク質を患者に与える補充療法にＲＮＡ分子を使用することも考えられている（非特許文献２及び３）。更に、非コード免疫賦活性ＲＮＡ分子（特許文献１）及び他の非コードＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ及び長鎖非コードＲＮＡ）（非特許文献４）の治療的使用も検討されている。

トランスフェクトされたＲＮＡからのタンパク質発現の成功は、トランスフェクション効率、ＲＮＡの安定性、及び翻訳効率に依存する。５’キャップ構造及び３’ポリ（Ａ）テールは、真核細胞におけるｍＲＮＡの効率的翻訳及びタンパク質合成にとって重要な機構である。新たに合成されたｍＲＮＡは、転写産物の長さが２０ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドに達したとき、キャップ構造によって修飾される。先ず、ＲＮＡ５’−トリホスファターゼ活性及びグアニリルトランスフェラーゼ活性の両方を有する二機能性キャッピング酵素によって、５’末端のヌクレオチドｐｐｐＮが５’ＧｐｐｐＮに変換される。次いで、（グアニン−７）−メチルトランスフェラーゼ活性を有する第２の酵素によってＧｐｐｐＮ部分がメチル化されて、モノメチル化ｍ７ＧｐｐｐＮの０型キャップ構造を形成する。次いで、０型キャップは、２’−Ｏ−メチル化によって核内でｍ７ＧｐｐｐＮの１型構造に変換される（非特許文献５）。

短いＲＮＡ分子は、化学的方法によって合成することができるが、長いＲＮＡは、典型的には、バクテリオファージ由来のプロモータを含む好適なＤＮＡテンプレート、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、バクテリオファージＳＰ６、Ｔ３、又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）、及びリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を含有するインビトロ転写反応によって生成される。主に、２つのプロトコールによって、インビトロで転写されたＲＮＡに５’キャップ構造を導入することができる。

第１のプロトコールでは、キャップ形成は、転写の開始と同時に生じる（同時転写キャップ形成）。このアプローチでは、ジヌクレオチドキャップアナログ（例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍ７Ｇ））を反応混合物に添加する。ＤＮＡテンプレートは、通常、転写される最初のヌクレオチドがグアノシンになるように設計される。キャップアナログは、初期ヌクレオチド（出発ヌクレオチド）としての取り込みについてＧＴＰと直接競合し、任意の他のヌクレオチドと同程度容易に取り込まれる（特許文献２）。キャップアナログを優先的に取り込ませるために、典型的には、ＧＴＰに対してモル過剰のキャップアナログを使用し（例えば、４：１の比）、他のリボヌクレオシド三リン酸ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰに比べてＧＴＰ濃度を低くする。これら条件下では、通常、ＧＴＰがＲＮＡ分子の合成についての律速因子になる。その結果、高比率の他のＮＴＰ（通常、４０％〜７０％）がＲＮＡ合成に用いられず、無駄になる。このアプローチでは、ＲＮＡ収量は、典型的には、約１ｍｇ／ｍＬに制限される（特許文献２）。

第２のプロトコールでは、インビトロ転写後に別の酵素反応においてキャップ形成が行われる（転写後又は酵素的キャップ形成）。ワクチニアウイルスキャッピング酵素（ＶＣＥ）は、ｍ７Ｇキャップ構造を合成するために必要な３つの酵素活性全てを有する（ＲＮＡ５’−トリホスファターゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、及びグアニン−７−メチルトランスフェラーゼ）。基質としてＧＴＰを用いて、ＶＣＥ反応によって正確な配向のＲＮＡキャップが得られる。更に、第２のワクチニア酵素である２’Ｏメチルトランスフェラーゼをキャップ形成反応に添加することによって、１型キャップを作製することができる（非特許文献５）。

ファージポリメラーゼによってインビトロで転写されたＲＮＡは、自己相補的３’伸長によって生じる二本鎖ＲＮＡ分子及び転写開始事象の失敗によって生じる短いＲＮＡ分子を含む複数の夾雑物を含有する場合があることが報告されている。

線状化ＤＮＡテンプレートのランオフ転写中にＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって合成されるＲＮＡ分子は、コードＲＮＡよりも長い場合がある（非特許文献６）。ＤＮＡテンプレートから離れた後、ＲＮＡポリメラーゼは、３’末端が安定な二次構造の一部ではない場合、転写産物をテンプレート部位に、そして、前記転写産物の３’末端を生成物部位に結合させ、それを伸長させる場合がある（自己相補的３’伸長）。この作用は、特にＵＴＰ濃度に対して感受性であると考えられるので、ＵＴＰ濃度のみを低下させることが忠実な転写につながる。しかし、ＵＴＰ濃度の低下は、ＲＮＡ収量にも影響を及ぼす場合がある。特にＲＮＡがポリ（Ａ）テールを含有する場合、ｍＲＮＡ等のＲＮＡにおいて共通であるが、転写反応における過剰の未取り込みＵＴＰによって、ポリＡ配列の反対側でウリジンヌクレオチドのＲＮＡテンプレート依存性取り込みが生じ、その結果、自然免疫反応を活性化させ且つタンパク質合成を減少させ得る二本鎖ＲＮＡ分子が生じる（非特許文献７）。

所望の完全長ＲＮＡ分子に加えて、インビトロ転写反応からより小さなオリゴリボヌクレオチドが生じる場合もあるが、これは、転写開始事象の失敗の結果である（非特許文献８）。これらアボーティブ（未成熟）転写産物は、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡテンプレート、及び新生ＲＮＡ鎖からなる三元複合体から未成熟のまま放出される短いＲＮＡ分子である。典型的には、大部分のアボーティブ転写産物は、２ヌクレオチド長〜８ヌクレオチド長であり、開始中のアボーティブサイクリングに起因して形成される。興味深いことに、ＮＴＰ濃度が約２ｍＭよりも低いとき、アボーティブ転写の増加が観察された（非特許文献９）。アボーティブ転写産物の合成は、貴重なＮＴＰを消費し、完全長産物の収量を低下させるので、アボーティブ転写産物は望ましくない。

ＲＮＡ治療の開発を成功させるために、活性医薬成分としてのＲＮＡ分子の生産は、特に、大規模にＲＮＡを生成し且つ完全長又は完全長キャップＲＮＡ分子が必要な場合、収量、品質、安全性、及びコストの点で効率的でなければならない。インビトロ転写によるＲＮＡ分子の生成を増加させるための幾つかのアプローチが報告されている。高濃度ＮＴＰを使用すると、ＲＮＡ分子の収量が増大すると予測される。或いは、キャップＲＮＡ分子を効率的に合成するために、キャップアナログのＧＴＰに対する比を調整することが提案されている。

インビトロ転写反応の標準的なヌクレオチド濃度は、典型的には、１．５ｍＭ〜１６ｍＭである（非特許文献１０〜１４）。Ｍｇ^＋＋濃度を適宜調整した場合、最高４０ｍＭのＮＴＰ濃度が可能であり、その結果、ＲＮＡ収量が増大したと報告されている（特許文献３）。

幾つかの高収量転写キット、例えば、Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ（商標）Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、又はＡｍｐｌｉＣａｐ−Ｍａｘ（商標）Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｍｅｓｓａｇｅ Ｍａｋｅｒ ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）が市販されている。全てのキットにおいて、標準的な転写反応について３０ｍＭ〜４０ｍＭという高い合計ＮＴＰ作用濃度が提案されている。キャップｍＲＮＡを合成する場合、ＧＴＰ濃度は、１．５ｍＭ〜２ｍＭ ＧＴＰである。

インビトロ転写反応のＲＮＡ収量を最大化するためには、一般的に、高いヌクレオチド濃度が推奨されるが、高濃度ＮＴＰの使用は、不利点も有する。例えば、高い初期ＮＴＰ濃度及び十分に高いＭｇ^＋＋濃度（例えば、Ｍｇ（ＯＡｃ）_２）を用いると、高いＲＮＡ収量を得ることができる。しかし、これら高濃度では、より高い比率のＮＴＰが短いアボーティブ転写産物に取り込まれる場合がある（非特許文献１５）。

キャップアナログの存在下でキャップｍＲＮＡを同時転写的に生成するためには、経済的な理由からＮＴＰの作用濃度を下げる必要があるが、その理由は、キャップアナログをＧＴＰに対して過剰に用いなければならず、これが主なコスト要因となるためである。キャップアナログのＧＴＰに対する比が高いほど、キャップＲＮＡの比率は高くなるが、収量及び経済的な理由から、通常４：１の比が提案される（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃａｐｐｅｄ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｅ２０４０），ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／１／０１／０１／ｃａｐｐｅｄ−ｒｎａ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｅ２０４０）。

例えば、キャップＲＮＡの転写については、Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔの製造業者の説明書には、キャップアナログがＧＴＰに対して４：１過剰である、２ｍＭ ＧＴＰの使用が提案されている。２０μＬの反応あたりの収量は、ＲＮＡ４０μｇ〜５０μｇ（２ｍｇ／ｍＬ〜２．５ｍｇ／ｍＬに相当する）であり、約８０％がキャップＲＮＡ転写産物であることが示されている（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃａｐｐｅｄ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｅ２０４０），ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／１／０１／０１／ｃａｐｐｅｄ−ｒｎａ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｅ２０４０）。

低濃度ＧＴＰから得られる限定された収量を補填するために、ＧＴＰのキャップアナログに対する比が１：１〜１：５０で維持されるように、競合ヌクレオチド（ＧＴＰ、又はＡキャップを用いる場合、ＡＴＰ）との反応を追加することによって、キャップＲＮＡの収量が増大した。このアプローチを用いると、反応あたりの生成されるキャップＲＮＡの量が二倍になり得る（特許文献２）。

インビトロ転写反応は、典型的には、全ての成分を合わせ、次いで、インキュベートして、反応が終結するまでＲＮＡ分子を合成させるバッチ反応として実施される。更に、インビトロ転写反応の効率を増大させるために、フェドバッチ反応が開発された（非特許文献９及び１５）。フェドバッチ系では、全ての成分を合わせるが、次いで、追加量の一部の試薬（例えば、ＮＴＰ及びマグネシウム）を経時的に添加して、一定の反応条件を維持する。フェドバッチストラテジーでは、非常に短い３８塩基対のＤＮＡテンプレートの場合、１単位のＲＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡテンプレートあたりのＲＮＡ収量が１００％改善された。この方法は、５’末端に三リン酸を有する非キャップＲＮＡ分子の合成にしか使用されていなかった。

インビトロ転写によってＲＮＡ分子を合成するためのバイオリアクタ（転写反応器）の使用が報告されている（特許文献４）。バイオリアクタは、供給ラインを介してリアクタコアに反応物質を送達し、限外濾過膜（例えば、１００，０００ダルトンの公称分子量カットオフを有する）を介して流出流に移すことによってＲＮＡ産物を除去するような構造になっている。
要約すると、インビトロ転写反応からのキャップＲＮＡ分子の収量は、２つの要因、即ち、ＲＮＡ分子への取り込みに利用可能なＮＴＰの合計濃度及びキャップアナログ：ＧＴＰ比に主に依存している。同時転写キャップ形成の場合、通常、ＧＴＰ濃度が他のＮＴＰに比べて低い。この事実により、特に高ＧＣ含量のテンプレートにおいて、可能な転写収量が制限される。

国際公開第２００９／０９５２２６号パンフレット 国際公開第２００６／００４６４８号パンフレット 米国特許第５２５６５５５号明細書 国際公開第１９９５／０８６２６号パンフレット

Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１４（６）：４２８−４３９ Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（５）：９４８−９５３ Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（２）：１５４−１５７ Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，２０１１．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１２（１２）：８６１−７４ Ｔｃｈｅｒｅｐａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００８．ＢＭＣ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９：９０ Ｔｒｉａｎａ−Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＪＢＣ；２７０（１１）：６２９８−６３０７ Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．；３９（２１）：ｅ１４２ Ｍｉｌｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５（２１）：８７８３−８７９８ Ｋｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１５，１７４−１８４ Ｍｉｌｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５（２１）：８７８３−８７９８ Ｓａｍｐｓｏｎ ＆ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（４）：１０３３−７ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＆ Ｏｆｅｎｇａｎｄ １９９０．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９（６）：７１３−４ Ｗｅｉｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８（１２）：３５１５−２０ Ｇｕｒｅｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９５（２）：２０７−１３ Ｋｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１３，７４７−７５６

上記を鑑みて、ＲＮＡを生成する、特に、タンパク質に翻訳することができる完全長キャップＲＮＡ分子を生成するための改善された経済的な手段及び方法が継続して必要とされている。

本発明は、特に、所与の配列のＲＮＡ分子を合成する方法であって、
ａ）前記ＲＮＡ分子における４種のヌクレオチドＧ、Ａ、Ｃ、及びＵの各割合（１）を求める工程と、
ｂ）配列最適化反応ミックス中でインビトロ転写によって前記ＲＮＡ分子を合成する工程であって、前記配列最適化反応ミックスが、４種のリボヌクレオチドＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰを含み、前記反応ミックス中の前記４種のリボヌクレオチドの各割合（２）が、前記ＲＮＡ分子、バッファ、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼ中の各ヌクレオチドの割合（１）に対応する工程と
を含む方法に関する。

また、本発明は、所与の配列のＲＮＡ分子を合成するためのバイオリアクタであって、配列最適化反応ミックス中でインビトロＲＮＡ転写反応を実施するための反応モジュールと、転写されたＲＮＡ分子を一時的に捕捉するための捕捉モジュールと、前記配列最適化反応ミックスの成分の前記反応モジュールへの送り込みを制御するための制御モジュールとを有し、前記反応モジュールが、前記配列最適化反応ミックスからヌクレオチドを分離するための濾過膜を含み、前記制御モジュールによる前記配列最適化反応ミックスの成分の送り込みの制御が、分離されたヌクレオチドの測定濃度に基づくバイオリアクタに関する。

以下に示す図面は、単なる例示であり、本発明を更に説明するものとする。これら図面は、本発明を限定すると解釈すべきではない。

配列番号１に対応する、ヒト前立腺幹細胞抗原（ＨｓＰＳＣＡ）をコードしているＲ１８７１のＧ／Ｃ最適化ｍＲＮＡ配列。 配列番号２に対応する、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ（ＰｐＬｕｃ）をコードしているＲ２９８８のＧ／Ｃ最適化ｍＲＮＡ配列。 配列番号３に対応する、ヒトムチン−１シグナルペプチド／上皮成長因子受容体／ムチン−１融合タンパク質（ＥＧＦＲ／ムチン−１）をコードしているＲ１６２６のＧ／Ｃ最適化ｍＲＮＡ配列。 配列番号３に対応する、ヒトムチン−１シグナルペプチド／上皮成長因子受容体／ムチン−１融合タンパク質（ＥＧＦＲ／ムチン−１）をコードしているＲ１６２６のＧ／Ｃ最適化ｍＲＮＡ配列。 配列番号４に対応する、Ｒ２０２５の非コード免疫賦活性ＲＮＡ配列。 ＨｓＰＳＣＡ（Ｒ１８７１）及びＥＧＦＲ／ムチン−１をコードしているｍＲＮＡ（Ｒ１６２６）の経時的ＲＮＡ収量。ｍＲＮＡは、実施例１に示す通りインビトロ転写によって合成した。（Ａ）標準的な転写反応のＲＮＡ収量は、約３０分間後、ＥＧＦＲ／ムチン−１をコードしている５，３３７ヌクレオチド長ＲＮＡ（Ｒ１６２６）については約１．４ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、ＨｓＰＳＣＡをコードしている５８９ヌクレオチド長ＲＮＡ（Ｒ１８７１）については約１．８ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡのプラトーに達する。（Ｂ）配列最適化転写反応のＲＮＡ収量は、標準的な転写反応に比べて著しく高い。６０分間後（Ｒ１６２６）及び１２０分間後（Ｒ１８７１）、両ＲＮＡは、約３．９ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡの同様のプラトーに達する。トリプリケートの平均及び標準偏差を示す。 ＨｓＰＳＣＡ（Ｒ１８７１）、ルシフェラーゼ（ＰｐＬｕｃ、Ｒ２９８８）、及びＥＧＦＲ／ムチン−１（Ｒ１６２６）をコードしているｍＲＮＡにおける、標準的なヌクレオチドミックス及び配列最適化ヌクレオチド（ＣａｐＮＴＰ）ミックスを用いて得られたＲＮＡ収量の比較。実験は、実施例１に記載の通り実施した（反応時間５時間）。 異なる長さの３つの異なるＲＮＡ分子のＲＮＡ収量は、各タイプの転写反応について略同じである。しかし、インビトロ転写に用いられるヌクレオチドミックスに依存して異なる収量が得られる。 標準的な転写（各ＮＴＰのＮＴＰ濃度が等しい）からは、約１．５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡが得られ、２倍の濃度のキャップ−ＮＴＰミックス（２×ＣａｐＮＴＰ）を用いた転写からは、約３．０ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、配列最適化（ｓｅｑ−ｏｐｔ）転写からは、約３．９ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、及びＮＴＰを供給する配列最適化転写からは、約６．７５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡが得られる。トリプリケートの平均及び標準偏差を示す。 ホタルルシフェラーゼ（ＰｐＬｕｃ）ｍＲＮＡの標準的なインビトロ転写及び配列最適化インビトロ転写によって得られるキャップ形成効率の分析。 実施例２に記載の通り、ハンマーヘッド型リボザイムＨＨＮＵＨ２ｄでＲＮＡを切断し、得られたＲＮＡ断片を、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｄＰＡＧＥ）によって分離した。キャップ形成されていない（ｎｏ ｃａｐ）ＲＮＡ及び酵素的にキャップ形成された（Ｅ−ｃａｐ）ＲＮＡが、コントロールとして機能した。 ホタルルシフェラーゼ（ＰｐＬｕｃ）をコードしているｍＲＮＡの合成については、標準的なＮＴＰミックス及び配列最適化ＮＴＰミックスを用いたとき、同等のキャップ形成効率が得られた。 ムチン−１シグナルペプチド／上皮成長因子受容体／ムチン−１融合タンパク質（ＥＧＦＲ／ムチン−１）ｍＲＮＡ（Ｒ１６２６）及び前立腺幹細胞抗原（ＨｓＰＳＣＡ）ｍＲＮＡ（Ｒ１８７１）について、配列最適化ＣａｐＮＴＰミックスにおいてＵＴＰ及びシュードＵＴＰを用いたＲＮＡ収量の比較。実験は、実施例３に記載の通り実施した。これらミックスでは、指定通りＵＴＰの０％、１０％、又は１００％をシュードＵＴＰ（ｐｓＵ）で置き換えた。トリプリケートの平均及び標準偏差を示す。 追加のヌクレオチド（合計ＮＴＰ濃度１３．４５ｍＭ；等量ミックスでは１３．４５ｍＭ ｃａｐ又はＧＴＰ（ＧＴＰに対して４倍過剰）；配列最適化ＮＴＰミックスでは１１．２ｍＭ ｃａｐ又はＧＴＰ（ＧＴＰに対して４倍過剰）の存在下で標準的な（等量）ＮＴＰミックス及び配列最適化（ｓｅｑｏｐｔ）ＮＴＰミックスを用いた、非コード免疫賦活性ＲＮＡ Ｒ２０２５の理論ＲＮＡ収量及び実際ＲＮＡ収量の比較。白色のバー：実際収量。黒色のバー：理論収量。実験は、実施例４に記載の通り実施した。トリプリケートの平均及び標準偏差を示す。 追加のヌクレオチド（合計ＮＴＰ濃度１３．４５ｍＭ；等量ミックスでは１３．４５ｍＭ ｃａｐ又はＧＴＰ（ＧＴＰに対して４倍過剰）；配列最適化ＮＴＰミックスでは１３．７ｍＭ ｃａｐ又はＧＴＰ（ＧＴＰに対して４倍過剰）の存在下で標準的な（等量）ＮＴＰ比及び配列最適化ＮＴＰ比を用いた、ヒト前立腺幹細胞抗原（ＨｓＰＳＣＡ）（Ｒ１８７１）をコードしているｍＲＮＡの理論ＲＮＡ収量及び実際ＲＮＡ収量の比較。白色のバー：実際収量。黒色のバー：理論収量。実験は、実施例４に記載の通り実施した。 それぞれの添加された塩（ＮａＣｌ；Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５）の存在下でＮａ−ＮＴＰ又はＴｒｉｓ−ＮＴＰの配列最適化ＮＴＰミックスを用いた転写効率。実験は、実施例５に記載の通り実施した。 生成されたＲＮＡの量及びヌクレオチドミックスの消費を測定することによる、配列最適化転写反応の進行のモニタリング。実験は、実施例６に記載の通り実施した。 ｃａｐ濃度に依存する、ホタルルシフェラーゼ（ＰｐＬｕｃ）をコードしているｍＲＮＡ（Ｒ２９８８）のＲＮＡ収量。様々な濃度のｃａｐアナログの存在下で、合計ＮＴＰ濃度が４ｍＭ及び１３．４５ｍＭのＰｐＬｕｃ配列最適化ＮＴＰミックスを用いたインビトロ転写によってｍＲＮＡを合成した。実験は、実施例７に記載の通り実施した。（Ａ）実際ＲＮＡ収量［ｍｇ／ｍＬ］。（Ｂ）相対ＲＮＡ収量［％］。 ｃａｐ濃度に依存する、ヒト前立腺幹細胞抗原（ＨｓＰＳＣＡ）をコードしているｍＲＮＡ（Ｒ１８７１）のＲＮＡ収量。様々な濃度のｃａｐアナログの存在下で、合計ＮＴＰ濃度が２ｍＭ、４ｍＭ、及び１３．４５ｍＭのＨｓＰＳＣＡ配列最適化ＮＴＰミックスを用いたインビトロ転写によってｍＲＮＡを合成した。実験は、実施例７に記載の通り実施した。（Ａ）実際ＲＮＡ収量［ｍｇ／ｍＬ］。（Ｂ）相対ＲＮＡ収量［％］。 ＧＴＰ出発ヌクレオチド濃度に依存する、ヒト前立腺幹細胞抗原（ＨｓＰＳＣＡ）をコードしているｍＲＮＡ（Ｒ１８７１）のＲＮＡ収量。２０ｍＭの濃度になるまでＧＴＰ出発ヌクレオチドを添加した合計ＮＴＰ濃度１３．４５ｍＭのＨｓＰＳＣＡ配列最適化ＮＴＰミックスを用いて、インビトロ転写によってｍＲＮＡを合成した。実験は、実施例８に記載の通り実施した。（Ａ）実際ＲＮＡ収量［ｍｇ／ｍＬ］。（Ｂ）相対ＲＮＡ収量［％］。 ＧＴＰ出発ヌクレオチド濃度に依存する、ホタルルシフェラーゼ（ＰｐＬｕｃ）をコードしているｍＲＮＡ（Ｒ２９８８）のＲＮＡ収量。２０ｍＭの濃度になるまでＧＴＰ出発ヌクレオチドを添加した合計ＮＴＰ濃度１３．４５ｍＭのＰｐＬｕｃ配列最適化ＮＴＰミックスを用いて、インビトロ転写によってｍＲＮＡを合成した。実験は、実施例８に記載の通り実施した。（Ａ）実際ＲＮＡ収量［ｍｇ／ｍＬ］。（Ｂ）相対ＲＮＡ収量［％］。 ＧＴＰ出発ヌクレオチド濃度に依存する、ＥＧＦＲ／ムチン−１をコードしているｍＲＮＡ（Ｒ１６２６）のＲＮＡ収量。２０ｍＭの濃度になるまでＧＴＰ出発ヌクレオチドを添加した合計ＮＴＰ濃度１３．４５ｍＭのＥＧＦＲ／ムチン−１配列最適化ＮＴＰミックスを用いて、インビトロ転写によってｍＲＮＡを合成した。実験は、実施例８に記載の通り実施した。（Ａ）実際ＲＮＡ収量［ｍｇ／ｍＬ］。（Ｂ）相対ＲＮＡ収量［％］。 転写反応のテンプレートとして樹脂固定化線状ＤＮＡを用いる、連続又は半バッチプロセス用のモジュールを含むバイオリアクタの概略図。 標準的な等モルＮＴＰミックスと比較した、配列最適化ＮＴＰミックスを用いて合成したＲＮＡによる免疫賦活の低下。細胞上清中のサイトカイン及びケモカイン濃度は、実施例１０に記載の通り測定した。 配列番号６に対応する、Ａ型インフルエンザＨ１Ｎ１亜型（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、２００９）由来のＨＡをコードしているＧＣ最適化ｍＲＮＡ配列（実施例１１）。 ＨＡをコードしているｍＲＮＡの経時的ＲＮＡ収量（実施例１１）。それぞれ、標準的なＮＴＰミックスを用いてバイオリアクタにおけるインビトロ転写によって得られたＲＮＡ（ＴＳ（１））、供給無しでバイオリアクタにおける配列最適化転写によって得られたＲＮＡ（ＴＳ（２））、供給有りでバイオリアクタにおける配列最適化転写によって得られたＲＮＡ（ＴＳ（３））、又は低濃度のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ及び低濃度のテンプレートを用いて、バイオリアクタにおける配列最適化転写によって得られたＲＮＡ（ＴＳ（４））の様々な時点におけるＲＮＡ収量を示す。 フローサイトメトリー分析を用いることによって求めたＨＡタンパク質の表面発現（実施例１１）。それぞれ、標準的なＮＴＰミックスを用いてバイオリアクタにおけるインビトロ転写によって得られたＲＮＡ（ＴＳ（１））、供給無しでバイオリアクタにおける配列最適化転写によって得られたＲＮＡ（ＴＳ（２））、供給有りでバイオリアクタにおける配列最適化転写によって得られたＲＮＡ（ＴＳ（３））、又は低濃度のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ及び低濃度のテンプレートを用いて、バイオリアクタにおける配列最適化転写によって得られたＲＮＡ（ＴＳ（４））をトランスフェクトした細胞について、蛍光強度の幾何平均（ＧＭＦＩ）を求めた。 それぞれ、標準的なＮＴＰミックスを用いてバイオリアクタにおけるインビトロ転写によって合成されたＲＮＡ（ＴＳ（１））、供給無しでバイオリアクタにおける配列最適化転写によって合成されたＲＮＡ（ＴＳ（２））、供給有りでバイオリアクタにおける配列最適化転写によって合成されたＲＮＡ（ＴＳ（３））、又は低濃度のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ及び低濃度のテンプレートを用いて、バイオリアクタにおける配列最適化転写によって合成されたＲＮＡ（ＴＳ（４））による免疫賦活。細胞上清中のサイトカイン及びケモカイン濃度は、実施例１１に記載の通り測定した。

定義
明確さ及び読み易さのために、以下の定義を提供する。これら定義において言及する任意の技術的特徴は、本発明の各実施形態及び全ての実施形態において読み取られ得る。更なる定義及び説明は、以下で更に論じ、説明する通り、これら実施形態の状況において具体的に提供され得る。

５’−キャップ構造：５’キャップは、典型的には、ＲＮＡ分子の５’末端に付加された修飾ヌクレオチド、特にグアニンヌクレオチドである。好ましくは、５’キャップは、５’−５’−三リン酸結合を用いて付加される。５’キャップは、メチル化される場合もあり、例えば、ｍ７ＧｐｐｐＮ（式中、Ｎは、５’キャップを有する核酸の末端５’ヌクレオチド、典型的には、ＲＮＡの５’末端である）である。自然界に存在する５’キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＮである。

５’キャップ構造の更なる例としては、グリセリル、反転型デオキシ非塩基残基（部分）、４’，５’メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−反転型ヌクレオチド部分、３’−３’−反転型非塩基部分、３’−２’−反転型ヌクレオチド部分、３’−２’−反転型非塩基部分、１，４−ブタンジオールホスフェート、３’−ホスホロアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’−ホスフェート、３’ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又は架橋若しくは非架橋メチルホスホネート部分が挙げられる。

特に好ましい５’キャップ構造は、ＣＡＰ１（ｍ７Ｇに隣接するヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＣＡＰ２（ｍ７Ｇの下流２番目のヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＣＡＰ３（ｍ７Ｇの下流３番目のヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＣＡＰ４（ｍ７Ｇの下流４番目のヌクレオチドのリボースのメチル化）であり、５’キャップ構造は、キャップアナログによって形成されてもよい。

キャップアナログ：キャップアナログとは、キャップ機能を有する（即ち、ＲＮＡ分子の５’末端に取り込まれたとき、ＲＮＡ分子の翻訳若しくは局在を促進する、及び／又は分解を防止する）伸長不可能なジヌクレオチドを指す。伸長不可能とは、キャップアナログが５’末端にのみ取り込まれることを意味するが、それは、キャップアナログは５’三リン酸を有していないので、テンプレート依存性ＲＮＡポリメラーゼによって３’方向に伸長することができないためである。

キャップアナログとしては、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ；非メチル化キャップアナログ（例えば、ＧｐｐｐＧ）；ジメチル化キャップアナログ（例えば、ｍ２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップアナログ（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称キャップアナログ（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、又はアンチリバースキャップアナログ（例えば、ＡＲＣＡ；ｍ７，２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ｄＧｐｐｐＧ、及びこれらの四リン酸誘導体）からなる群から選択される化学構造が挙げられるが、これらに限定されない（Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００１．ＲＮＡ ７（１０）：１４８６−９５）。キャップアナログの例を表１に示す。

更なるキャップアナログが、既に報告されている（米国特許第７０７４５９６号明細書、国際公開第２００８／０１６４７３号パンフレット、国際公開第２００８／１５７６８８号パンフレット、国際公開第２００９／１４９２５３号パンフレット、国際公開第２０１１／０１５３４７号パンフレット、及び国際公開第２０１３／０５９４７５号パンフレット）。Ｎ^７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチドキャップアナログの合成が、最近報告された（Ｋｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２１（１５）：４５７０−４）。

特に好ましいキャップアナログは、Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇ、ｍ^７Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇ、ｍ_３ ^{２，２，７}Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇ、ｍ_２ ^{７，３’−Ｏ}Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇ（３’−ＡＲＣＡ）、ｍ_２ ^{７，２’−Ｏ}ＧｐｐｐＧ（２’−ＡＲＣＡ）、ｍ_２ ^{７，２’−Ｏ}ＧｐｐｓｐＧ Ｄ１（β−Ｓ−ＡＲＣＡ Ｄ１）、及びｍ_２ ^{７，２’−Ｏ}ＧｐｐｓｐＧ Ｄ２（β−Ｓ−ＡＲＣＡ Ｄ２）である。

核酸：核酸という用語は、任意のＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を意味し、ポリヌクレオチドと同義である。更に、本明細書に定義する核酸の修飾又は誘導体は、明示的に「核酸」という総称に含まれる。例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）も用語「核酸」に含まれる。

単シストロン性ＲＮＡ：単シストロン性ＲＮＡは、典型的に、オープンリーディングフレームを１つしか含まないＲＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡであってよい。この文脈におけるオープンリーディングフレームは、ペプチド又はタンパク質に翻訳することができる幾つかのヌクレオチドトリプレット（コドン）の配列である。

二／多シストロン性ＲＮＡ：典型的に、２つ（二シストロン性）又はそれ以上（多シストロン性）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有し得るＲＭＡ、好ましくは、ｍＲＮＡ。この文脈におけるオープンリーディングフレームは、ペプチド又はタンパク質に翻訳することができる幾つかのヌクレオチドトリプレット（コドン）の配列である。

免疫賦活性ＲＮＡ：本発明の状況における免疫賦活性ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）は、典型的には、自然免疫反応を誘導することができるＲＮＡであってよい。ｉｓＲＮＡは、通常、オープンリーディングフレームを有しないので、ペプチド抗原を提供するのではなく、例えば、病原関連分子パターン（ＰＡＭＰ）受容体（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）又は他の細胞内ＲＮＡセンサ（例えば、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ−５、又はＰＫＲ）に結合することによって自然免疫反応を誘発する。

ヌクレオチドアナログ：ヌクレオチドアナログは、リン酸骨格修飾、糖修飾、又はヌクレオ塩基の修飾を含む、自然界に存在するヌクレオチドと構造的に類似するヌクレオチド（アナログ）である。

核酸合成：本明細書に定義する本発明に従って用いられる核酸分子は、例えば、固相合成、インビボ増殖（例えば、ウイルスのインビボ増殖）等の合成法に加えて、インビトロ転写反応等のインビトロ法を含む、当技術分野において公知の任意の手段を用いて調製することができる。

本発明によれば、ＲＮＡ分子は、対応するＤＮＡ分子のインビトロ転写によって調製される。このＤＮＡテンプレートは、好ましくは、インビトロ転写に好適なプロモータ、例えば、Ｔ７又はＳＰ６プロモータを含み、この後に、調製されるＲＮＡ分子をコードしている所望のヌクレオチド配列、及びインビトロ転写のための終結シグナルが続く。少なくとも１つの対象ＲＮＡのテンプレートを形成するＤＮＡ分子は、発酵で増殖させ、次いで、細菌内で複製され得るプラスミドの一部として単離することによって調製してよい。本発明に好適であると述べることができるプラスミドは、例えば、プラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＴ７Ｔｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２６４０４；Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９５，１２１：２３４９ ｔｏ ２３６０）、ｐＧＥＭ（登録商標）シリーズ、例えば、ｐＧＥＭ（登録商標）−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６５３００；Ｐｒｏｍｅｇａ製）、及びｐＳＰ６４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６５３２７）である。Ｍｅｚｅｉ ａｎｄ Ｓｔｏｒｔｓ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｉｎ：Ｇｒｉｆｆｉｎ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ（ｅｄ．），ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００１も参照されたい。

ＲＮＡ：ＲＮＡは、リボ核酸の一般的な略称である。ＲＮＡは、核酸分子、即ち、ヌクレオチドからなるポリマーである。これらヌクレオチドは、通常、所謂骨格に沿って互いに結合しているアデノシン一リン酸モノマー、ウリジン一リン酸モノマー、グアノシン一リン酸モノマー、及びシチジン一リン酸モノマーである。骨格は、第１のモノマーの糖、即ち、リボースと、第２の隣接するモノマーのリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成される。モノマーの特定の連続物をＲＮＡ配列と呼ぶ。

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：真核細胞では、転写は、典型的には、核又はミトコンドリア内部で実施される。インビボでは、ＤＮＡの転写によって、通常ｍＲＮＡと略される、所謂メッセンジャーＲＮＡにプロセシングしなければならない、所謂未成熟ＲＮＡが通常生じる。例えば、真核生物における未成熟ＲＮＡのプロセシングは、スプライシング、５’キャップ形成、ポリアデニル化、核又はミトコンドリアからの輸送等の様々な異なる転写後修飾を含む。これらプロセス全体をｍＲＮＡの成熟とも呼ぶ。成熟メッセンジャーＲＮＡは、通常、特定のペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列に翻訳され得るヌクレオチド配列を提供する。典型的には、成熟ｍＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ、及びポリ（Ａ）配列を含む。本発明の状況では、ｍＲＮＡは、人工分子、即ち、自然界には存在しない分子であってもよい。これは、本発明の状況におけるｍＲＮＡが、例えば、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ、及びポリ（Ａ）配列の自然界には存在しない組み合わせを含み得ることを意味する。

自己複製ＲＮＡ（レプリコン）：自己複製ＲＮＡは、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビス（ＳＩＮ）ウイルス、及びベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスから開発されたアルファウイルスに基づく送達ベクターである。アルファウイルスは、アルファウイルスの構造遺伝子を対象異種遺伝子に置き換えることができる一本鎖ＲＮＡウイルスである。イントランスで構造遺伝子を提供することによって、レプリコンＲＮＡをレプリコン粒子（ＲＰ）にパッケージングし、これを遺伝子治療目的又は遺伝子ワクチン接種に用いることができる（例えば、Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃｏｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ，ｐ．１−９を参照）。ホスト細胞に侵入した後、ゲノムウイルスＲＮＡは、先ず、ウイルスＲＮＡの増幅の開始に必要なウイルスの非構造タンパク質（ｎｓＰｓ）を翻訳するためのｍＲＮＡとして機能する。ＲＮＡの複製は、追加のゲノム長ＲＮＡを合成するため及び内部プロモータからプラス鎖サブゲノムＲＮＡを転写するためのテンプレートとして用いられる完全長マイナス鎖中間体の合成を介して生じる。次いで、かかるＲＮＡは、自己複製ＲＮＡであるとみなすことができるが、その理由は、複製（及び異種遺伝子の転写）に関与する非構造タンパク質が、かかるレプリコン中に依然として存在しているためである。かかるアルファウイルスベクターを「レプリコン」と称する。

核酸分子の配列：核酸分子の配列は、典型的には、そのヌクレオチドの具体的且つ個別の順序、即ち、連続物であると理解される。

オープンリーディングフレーム：本発明の状況におけるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、典型的には、ペプチド又はタンパク質に翻訳することができる幾つかのヌクレオチドトリプレットの配列であり得る。オープンリーディングフレームは、好ましくは、開始コドン、即ち、通常アミノ酸メチオニンをコードしている３つの後続ヌクレオチドの組み合わせ（ＡＴＧ又はＡＵＧ）をその５’末端に含み、また、通常３ヌクレオチドの倍数の長さを有する後続領域も含む。ＯＲＦは、好ましくは、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）によって終結する。典型的には、これは、オープンリーディングフレームの唯一の終止コドンである。したがって、本発明の状況におけるオープンリーディングフレームは、好ましくは、３で割り切れる数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、これは、開始コドン（例えば、ＡＴＧ又はＡＵＧ）で始まり、好ましくは、終止コドン（例えば、それぞれ、ＴＡＡ、ＴＧＡ、若しくはＴＡＧ、又はＵＡＡ、ＵＡＧ、ＵＧＡ）で終わる。オープンリーディングフレームは、単離することもでき、又はより長い核酸配列、例えば、ベクター又はｍＲＮＡに組み込むこともできる。また、オープンリーディングフレームは、「タンパク質コード領域」又は「コード領域」と呼ばれることもある。

配列最適化反応ミックス：４種のヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰを含む所与の配列のＲＮＡ分子のインビトロ転写反応において用いるための反応ミックスであって、配列最適化反応ミックス中の４種のヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の各割合（２）が、前記ＲＮＡ分子、バッファ、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼ中の各ヌクレオチドの割合（１）に対応している反応ミックス。あるリボヌクレオチドが前記ＲＮＡ分子中に存在しない場合、配列最適化反応ミックス中にも対応するヌクレオシド三リン酸は存在しない。

配列最適化ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックス：４種のヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰを含む所与の配列のＲＮＡ分子のインビトロ転写反応において用いるためのヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の混合物であって、配列最適化ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックス中の４種のヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の各割合（２）が、前記ＲＮＡ分子中の各ヌクレオチドの割合（１）に対応している混合物。あるリボヌクレオチドが前記ＲＮＡ分子中に存在しない場合、配列最適化ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックス中にも対応するヌクレオシド三リン酸は存在しない。

修飾ヌクレオシド三リン酸：用語「修飾ヌクレオシド三リン酸」とは、本明細書で使用するとき、骨格修飾に加えて、糖修飾又は塩基修飾を含む化学修飾を指す。これら修飾ヌクレオシド三リン酸は、本明細書では、（ヌクレオチド）アナログとも呼ばれる。

この状況では、本明細書に定義する修飾ヌクレオシド三リン酸は、ヌクレオチドアナログ／修飾、例えば、骨格修飾、糖修飾、又は塩基修飾である。本発明に関連する骨格修飾は、ヌクレオチドの骨格のリン酸が化学的に修飾されている修飾である。本発明に関連する糖修飾は、ヌクレオチドの糖の化学修飾である。更に、本発明に関連する塩基修飾は、ヌクレオチドの塩基部分の化学修飾である。この状況では、ヌクレオチドアナログ又は修飾は、好ましくは、転写及び／又は翻訳に適用可能なヌクレオチドアナログから選択される。

糖修飾
本発明の状況で用いることができる修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、糖部分が修飾されていてもよい。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、多数の異なる「オキシ」又は「デオキシ」置換基で修飾又は置換することができる。「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシ又はアリールオキシ（−ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、又は糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＯＲ；２’ヒドロキシルが、例えば、メチレン架橋によって、同じリボース糖の４’炭素に結合している「ロックド」核酸（ＬＮＡ）；及びアミノ基（アミノ基、例えば、ＮＲＲが、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノであってよい−Ｏ−アミノ）、又はアミノアルコキシが挙げられるが、これらに限定されない。

「デオキシ」修飾としては、水素、アミノ（例えば、ＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸）；又はリンカーを介して糖に結合することができるアミノ基（前記リンカーは、原子Ｃ、Ｎ、及びＯのうちの１以上を含む）が挙げられる。

また、糖基は、リボースにおける対応する炭素とは逆の立体化学配置を有する１以上の炭素を含有していてもよい。したがって、修飾ヌクレオチドは、例えば、糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドを含んでいてよい。

骨格修飾
リン酸骨格は、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドが更に修飾されていてもよい。骨格のリン酸基は、酸素原子のうちの１以上を異なる置換基で置換することによって修飾することができる。更に、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、非修飾リン酸部分が本明細書に記載する修飾リン酸で完全に置換されていてもよい。修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロジチオエートは、両方の非結合酸素が硫黄によって置換されている。また、リン酸リンカーは、結合酸素を窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロジチオエート）、及び炭素（架橋メチレン−ホスホネート）で置換することによって修飾することができる。

塩基修飾
本発明で用いることができる修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、ヌクレオ塩基部分が更に修飾されていてもよい。ＲＮＡ中にみられるヌクレオ塩基の例としては、アデニン、グアニン、シトシン、及びウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本明細書に記載するヌクレオシド及びヌクレオチドは、主溝面が化学的に修飾されていてよい。幾つかの実施形態では、主溝化学修飾は、アミノ基、チオール基、アルキル基、又はハロ基を含んでいてよい。

本発明の特に好ましい実施形態では、ヌクレオチドアナログ／修飾は、塩基修飾から選択され、これは、好ましくは、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド−５’−トリホスフェート、２−アミノプリン−リボシド−５’−トリホスフェート；２−アミノアデノシン−５’−トリホスフェート、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン−トリホスフェート、２−チオシチジン−５’−トリホスフェート、２−チオウリジン−５’−トリホスフェート、２’−フルオロチミジン−５’−トリホスフェート、２’−Ｏ−メチルイノシン−５’−トリホスフェート４−チオウリジン−５’−トリホスフェート、５−アミノアリルシチジン−５’−トリホスフェート、５−アミノアリルウリジン−５’−トリホスフェート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスフェート、５−ブロモウリジン−５’−トリホスフェート、５−ブロモ−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスフェート、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスフェート、５−ヨードシチジン−５’−トリホスフェート、５−ヨード−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスフェート、５−ヨードウリジン−５’−トリホスフェート、５−ヨード−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスフェート、５−メチルシチジン−５’−トリホスフェート、５−メチルウリジン−５’−トリホスフェート、５−プロピニル−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスフェート、５−プロピニル−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスフェート、６−アザシチジン−５’−トリホスフェート、６−アザウリジン−５’−トリホスフェート、６−クロロプリンリボシド−５’−トリホスフェート、７−デアザアデノシン−５’−トリホスフェート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスフェート、８−アザアデノシン−５’−トリホスフェート、８−アジドアデノシン−５’−トリホスフェート、ベンズイミダゾール−リボシド−５’−トリホスフェート、Ｎ１−メチルアデノシン−５’−トリホスフェート、Ｎ１−メチルグアノシン−５’−トリホスフェート、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−トリホスフェート、Ｏ６−メチルグアノシン−５’−トリホスフェート、シュードウリジン−５’−トリホスフェート、又はピューロマイシン−５’−トリホスフェート、キサントシン−５’−トリホスフェートから選択される。５−メチルシチジン−５’−トリホスフェート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスフェート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスフェート、及びシュードウリジン−５’−トリホスフェートからなる塩基修飾ヌクレオチドの群から選択される塩基修飾のためのヌクレオチドが特に好ましい。

幾つかの実施形態では、修飾ヌクレオシドとしては、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、ｌ−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−ｌ−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、及び４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジンが挙げられる。

幾つかの実施形態では、修飾ヌクレオシドとしては、５−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、及び４−メトキシ−ｌ−メチル−シュードイソシチジンが挙げられる。

他の実施形態では、修飾ヌクレオシドとしては、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、及び２−メトキシ−アデニンが挙げられる。

他の実施形態では、修飾ヌクレオシドとしては、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、ｌ−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、及びＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシンが挙げられる。

幾つかの実施形態では、ヌクレオチドは、主溝面が修飾されていてもよく、ウラシルのＣ−５におけるハロゲンのメチル基又はハロ基による置換を含んでいてよい。

特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、５’−Ｏ−（ｌ−チオホスフェート）−アデノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−シチジン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−グアノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−ウリジン、又は５’−Ｏ−（ｌ−チオホスフェート）−シュードウリジンである。

更なる特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドとしては、６−アザ−シチジン、２−チオ−シチジン、α−チオ−シチジン、シュード−イソ−シチジン、５−アミノアリル−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、α−チオ−ウリジン、４−チオ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン、デオキシ−チミジン、５−メチル−ウリジン、ピロロ−シチジン、イノシン、α−チオ−グアノシン、６−メチル−グアノシン、５−メチル−シチジン、８−オキソ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、Ｎ１−メチル−アデノシン、２−アミノ−６−クロロ−プリン、Ｎ６−メチル−２−アミノ−プリン、シュード−イソ−シチジン、６−クロロ−プリン、Ｎ６−メチル−アデノシン、α−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデノシンから選択されるヌクレオシド修飾が挙げられる。

更なる修飾ヌクレオチドは、既に報告されている（国際公開第２０１３０５２５２３号パンフレット）。

収量：収量（反応収量とも称する）は、化学反応又は酵素反応で得られる生成物の量である。絶対収量は、グラム又はモル（モル収量）で重量として表すことができる。相対収量、割合収量、又は百分率収量は、合成手順の有効性を測定する機能を有し、得られた生成物の量を理論収量で除することによって算出される（両方の測定単位は、同じでなければならない）。
相対収量＝（実際収量）／（理論収量）

実際収量：実際収量は、化学反応において得られる生成物の量を指す。

理論収量：理論収量は、完全に効率的な化学反応又は酵素反応において生成することができる生成物の最大量である。実際は、殆どの反応は完全に効率的ではないので、反応の実際収量は、通常、理論収量よりも少ない。理論収量は、反応の化学量論を考慮して、律速反応物質のモル量に基づいて算出される。算出については、通常、関与する反応が１つだけであると仮定する。

ＲＮＡ収量：ＲＮＡ収量は、インビトロ転写反応で得られたＲＮＡ生成物の量である。ＲＮＡ収量は、ＲＮＡ濃度（ｇ／ｍＬ又はモル／Ｌ）として表すことができる。ＲＮＡ濃度に反応体積を乗じると、ＲＮＡの絶対量（グラム又はモル）が得られる。

実際ＲＮＡ収量：実際ＲＮＡ収量は、所定の時点におけるインビトロ転写反応のＲＮＡ生成物の実験的に求められた量、例えば、反応完了後の収量である。例えば、ＲＮＡ濃度は、分光光度計を用いて２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによって求めることができる（Ｋｏｌｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５３０：３３１−６）。２６０ｎｍにおける１吸光度単位は、４０ｎｇ／μＬのＲＮＡに相当する（１ Ａ２６０＝４０ｎｇ／μＬ ＲＮＡ）。

理論ＲＮＡ収量：理論ＲＮＡ収量は、インビトロ転写反応において利用可能なＮＴＰに基づく最大可能ＲＮＡ収量である。等濃度の４種のＮＴＰ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ）を用いた標準的な転写反応では、典型的には、ＲＮＡ配列において最も高頻度のヌクレオチドに対応するヌクレオチドが、律速因子となる。対象ＲＮＡ配列用の配列最適化ＮＴＰミックスを用いた配列最適化転写反応では、個々のヌクレオチドのいずれも律速因子にならない。

転写反応についての理論ＲＮＡ収量を算出するために、転写反応の開始時に存在する各ＮＴＰの量（モル）をＲＮＡ分子の配列中に存在するそれぞれのヌクレオチドの数で除して、合成することができる可能ＲＮＡ分子数（モル）を得る。ＲＮＡの分子質量を乗じることにより、質量単位（グラム）の理論ＲＮＡ収量が得られる。等濃度の各ＮＴＰを用いる標準的な転写反応では、典型的には、ＲＮＡ配列において最も高頻度のヌクレオチドに対応するＮＴＰが、律速因子となる。対照的に、配列最適化転写反応では、全ての種類のＮＴＰがＲＮＡ分子の配列中の対応するヌクレオチドと同じ比で存在するので、いずれのＮＴＰも律速因子にならない。

相対ＲＮＡ収量：相対ＲＮＡ収量、割合ＲＮＡ収量、又は百分率ＲＮＡ収量は、インビトロ転写反応の効率を測定する機能を有し、得られたＲＮＡ生成物の量（実際ＲＮＡ収量）を理論ＲＮＡ収量で除することによって算出される（両方の測定単位は、同じでなければならない）：
相対ＲＮＡ収量＝（実際ＲＮＡ収量）／（理論ＲＮＡ収量）。

インビトロ転写反応の効率を表すために、百分率ＲＮＡ収量を算出することもできる：
ＲＮＡ収量（％）＝（実際ＲＮＡ収量）／（理論ＲＮＡ収量）×１００。

第１の態様では、本発明は、所与の配列のＲＮＡ分子を合成する方法であって、
ａ）前記ＲＮＡ分子における４種のヌクレオチドＧ、Ａ、Ｃ、及びＵの各割合（１）を求める工程と、
ｂ）配列最適化反応ミックス中でインビトロ転写によって前記ＲＮＡ分子を合成する工程であって、前記配列最適化反応ミックスが、４種のリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰを含み、前記配列最適化反応ミックス中の前記４種のリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の各割合（２）が、前記ＲＮＡ分子、バッファ、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼ中の各ヌクレオチドの割合（１）に対応する工程と
を含む方法に関する。

本発明の状況では、また、実施例１並びに図５及び６に示す通り、インビトロ転写によって所与の配列のＲＮＡ分子を生成するために４種のリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰを含有する配列最適化反応ミックスを使用することにより、４種全てのＮＴＰを等モル初期濃度で含む非最適化反応ミックスに比べて、より高いＲＮＡ生成物収量が得られるので、取り込まれず無駄になるＮＴＰが少なくてすむ。合成が難しいので、高価な修飾ヌクレオチドを用いるとき、この態様が特に有益である。配列最適化ＮＴＰミックスでは、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰは、前記ＲＮＡ配列中に存在する前記ヌクレオチドＧ、Ａ、Ｃ、及びＵの割合に対応する割合で表される。配列最適化インビトロ転写反応では、４種のＮＴＰは同程度消費され、ＮＴＰを使い果たすまで転写が続くので、無駄になる材料が少なくなると考えられる。

更に、配列最適化ＮＴＰミックスを用いると、例えば、自己相補的３’伸長（Ｔｒｉａｎａ−Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＪＢＣ；２７０（１１）：６２９８−６３０７）に起因してコードＲＮＡよりも長いＲＮＡ分子が合成される可能性が避けられると予測されるが、その理由は、反応の最後に過剰のＵＴＰが残らないためである。特に、ＲＮＡがポリ（Ａ）テールを含有する場合、ｍＲＮＡ等のＲＮＡにおいて共通であるが、転写反応における過剰の未取り込みＵＴＰによって、ポリＡ配列の反対側でウリジンヌクレオチドのＲＮＡテンプレート依存性取り込みが生じ、その結果、自然免疫反応を活性化させ且つタンパク質合成を減少させ得る二本鎖ＲＮＡ分子が生じる（Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．；３９（２１）：ｅ１４２）。

以下に詳細に説明する通り、インビトロ転写を用いてＲＮＡ分子を生成する方法は、当技術分野において公知である。また、例えば、ＲＮＡ分子の安定性を改善するために、ヌクレオチドアナログを使用することも知られている。本発明は、インビトロ転写反応の反応ミックス中のリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の濃度に関する。

したがって、本発明の方法の第１の工程では、前記ＲＮＡ分子中の４種のヌクレオチドＧ、Ａ、Ｃ、及びＵの各割合（１）を求める。これは、例えば、単にヌクレオチド数を数えるか又はコンピュータを利用する方法を用いる等、当技術分野において公知の任意の方法によって実施することができる。

次いで、各ヌクレオチドの割合（１）は、数、百分率、モル分率、又はモル百分率を含む任意の好適な用語で表すことができる。モル分率又はモル百分率（ｘ_ｉ）は、構成成分の量（モルで表される）ｎ_ｉを混合物中の全ての構成成分の合計量ｎ_ｔｏｔで除したものであると定義される。全てのモル分率の合計は、１に等しい。分母を１００として表される同じ概念が、モル百分率（モル％）である。

前記ＲＮＡ分子中の各ヌクレオチドの割合の決定に基づいて、本発明の方法の更なる工程では、前記ＲＮＡ分子は、配列最適化反応ミックス中でインビトロ転写によって合成され、前記配列最適化反応ミックスは、４種のリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰ、又はこれらのアナログを含み、前記配列最適化反応ミックス中の４種のリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の各割合（２）は、前記ＲＮＡ分子中の各ヌクレオチドの割合（１）に対応する。

好ましい実施形態では、本発明の方法の工程ｂ）は、
ｂ１）４種のリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰを含む配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスを調製する工程であって、前記配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックス中の４種のリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の各割合（２）が、前記ＲＮＡ分子中の各ヌクレオチドの割合（１）に対応する工程と、
ｂ２）工程（ｂ１）の前記配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックス、バッファ、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼを含む配列最適化反応ミックス中でインビトロ転写によって前記ＲＮＡ分子を合成する工程と
を含む。

したがって、この好ましい実施形態では、配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスは、割合（１）の決定に基づいて調製され、次いで、反応ミックスに添加される。配列最適化反応ミックスに関して上に示した全ての定義、特に、「割合（１）が割合（２）に対応する」という点に関して行った定義は、配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスにも適用される。

この状況において、当業者であれば、前記ＲＮＡ分子が、それぞれ、全てのヌクレオチドＧ、Ａ、Ｃ、及びＵを含有している訳ではない場合、配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックス及び配列最適化反応ミックスにも同じことが当てはまることを理解する。

本発明によれば、「割合（１）が割合（２）に対応する」とは、配列最適化ＮＴＰミックス又は配列最適化反応ミックス中のリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の割合が、ＲＮＡ分子中のヌクレオチドの割合に合わせて調整されていることを意味する。当業者であれば、割合（２）が割合（１）を正確に反映している必要はないが、配列最適化ＮＴＰミックス又は配列最適化反応ミックス中の各リボヌクレオシド三リン酸の個々の割合（２）は、前記ＲＮＡ分子中の対応するヌクレオチドの割合（１）を反映している必要があることを理解する。

割合（１）と割合（２）との関係をより詳細に評価するために、「割合（１）が割合（２）に対応する」という用語の定義については、以下を考慮してよい：
ａ）合成されるＲＮＡ分子の第１のヌクレオチドに対応する配列最適化ＮＴＰミックス又は配列最適化反応ミックス中のリボヌクレオシド三リン酸の割合に関して、本発明の１つの実施形態によれば、割合（２）が割合（１）の範囲内である、例えば、割合（１）と割合（２）との差が２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、７％以下、５％以下、又は０．１％〜５％の値であることが可能である。
ｂ）前記ＲＮＡ分子の第１のヌクレオチドに対応していない配列最適化ＮＴＰミックス又は配列最適化反応ミックス中に存在する他のリボヌクレオシド三リン酸に関して、割合（２）は、好ましくは、割合（１）の範囲内であり、例えば、割合（１）と割合（２）との差は、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、７％以下、５％以下、又は０．１％〜５％の値である。

本発明の好ましい実施形態では、インビトロ転写を開始する前に、出発ヌクレオチドを配列最適化ＮＴＰミックス又は配列最適化反応ミックスに添加する。出発ヌクレオチドは、前記ＲＮＡ分子の第１のヌクレオチドに対応するヌクレオチドである（＋１位）。出発ヌクレオチドは、特に、ＲＮＡポリメラーゼの初期速度を増大させるために添加してよい。また、前記出発ヌクレオチドは、当技術分野において公知であり、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸を含む。出発ヌクレオチドは、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、又はトリヌクレオチドであってよい。前記ＲＮＡ分子の第１のヌクレオチドがＧである場合、出発ヌクレオチドは、好ましくは、ＧＴＰ又はＧＭＰである。

本発明の好ましい実施形態では、前記出発ヌクレオチドは、ジヌクレオチドである。更により好ましい実施形態では、出発ヌクレオチドは、キャップアナログである。

好ましい実施形態では、キャップアナログは、Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇ、ｍ^７Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇ、ｍ_３ ^{２，２，７}Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇ、ｍ_２ ^{７，３’−Ｏ}Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇ（３’−ＡＲＣＡ）、ｍ_２ ^{７，２’−Ｏ}ＧｐｐｐＧ（２’−ＡＲＣＡ）、ｍ_２ ^{７，２’−Ｏ}ＧｐｐｓｐＧ Ｄ１（β−Ｓ−ＡＲＣＡ Ｄ１）、及びｍ_２ ^{７，２’−Ｏ}ＧｐｐｓｐＧ Ｄ２（β−Ｓ−ＡＲＣＡ Ｄ２）からなる群から選択される。

しかし、別の好ましい実施形態によれば、配列最適化ＮＴＰミックス又は配列最適化反応ミックスにおいて、前記ＲＮＡ分子の第１のヌクレオチドに対応する出発ヌクレオチドは、前記ＲＮＡ分子の第１の位置にみられる前記ＲＮＡ分子中のヌクレオチドの割合に比べて、過剰に添加される。

好ましくは、出発ヌクレオチドは、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１ｍＭ〜約１７．５ｍＭ、約１ｍＭ〜約１５ｍＭ、約１ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１ｍＭ〜約７．５ｍＭ、約１ｍＭ〜約５ｍＭ、又は約１ｍＭ〜約２．５ｍＭの範囲の初期濃度で添加される。更により好ましくは、出発ヌクレオチドは、約５ｍＭ〜約２０ｍＭ又は約７．５ｍＭ〜約１７．５ｍＭの初期濃度で添加される。

上記好ましい例示的な実施形態では、ＲＮＡ分子の第１のヌクレオチドは、Ｇであり、出発ヌクレオチドは、Ｇのキャップアナログであり、対応するリボヌクレオシド三リン酸は、ＧＴＰである。この実施形態では、キャップアナログは、ＧＴＰに比べて反応ミックス中に過剰に存在する。好ましくは、キャップアナログは、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１ｍＭ〜約１７．５ｍＭ、約１ｍＭ〜約１５ｍＭ、約１ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１ｍＭ〜約７．５ｍＭ、約１ｍＭ〜約５ｍＭ、又は約１ｍＭ〜約２．５ｍＭの範囲の初期濃度で添加される。更により好ましくは、キャップアナログは、約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約７．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、又は約１２．５ｍＭ〜約２０ｍＭの初期濃度で添加される。

インビトロ転写の方法は、当技術分野において公知である（Ｇｅａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（２）：１５２−１５９；Ｂｒｕｎｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５３０：１０１−１４）。前記方法で用いられる試薬としては、典型的には、以下が挙げられる：
１）バクテリオファージにコードされているＲＮＡポリメラーゼ等のそれぞれのＲＮＡポリメラーゼに対して高い結合親和性を有するプロモータ配列を含む線状化ＤＮＡテンプレート；
２）４種の塩基（アデニン、シトシン、グアニン、及びウラシル）についてのリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）；
３）上に定義したキャップアナログ（例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍ７Ｇ））；
４）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）；
５）任意の夾雑ＲＮａｓｅを不活化するためのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）阻害剤；
６）転写を阻害し得るピロリン酸を分解するためのピロホスファターゼ；
７）ポリメラーゼの補因子としてＭｇ^２＋を供給するＭｇＣｌ_２；
８）最適濃度の酸化防止剤及びポリアミン（例えば、スペルミジン）を含有していてもよい、好適なｐＨ値を維持するためのバッファ。

好ましい実施形態によれば、所与の配列のＲＮＡ分子を合成するための本発明の方法に用いられる配列最適化反応ミックスは、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）からなる群から選択されるバッファを含む。好ましくは、バッファは、１０ｍＭ〜１００ｍＭ、１０ｍＭ〜７５ｍＭ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ、１０ｍＭ〜４０ｍＭ、１０ｍＭ〜３０ｍＭ、又は１０ｍＭ〜２０ｍＭの濃度で用いられる。バッファのｐＨ値は、例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、又はＨＣｌで調整することができる。好ましくは、バッファは、６〜８．５、６．５〜８．０、７．０〜７．５のｐＨ値を有し、更に好ましくは、７．５である。最も好ましくは、バッファは、８０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．５及び４０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５からなる群から選択される。

本発明の好ましい実施形態によれば、配列最適化反応ミックスに含まれるＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３、Ｔ７、及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される。好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼの濃度は、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１ｎＭ〜約９０ｎＭ、約１ｎＭ〜約８０ｎＭ、約１ｎＭ〜約７０ｎＭ、約１ｎＭ〜約６０ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０ｎＭ、約１ｎＭ〜約４０ｎＭ、約１ｎＭ〜約３０ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０ｎＭ、又は約１ｎＭ〜約１０ｎＭである。更により好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼの濃度は、約１０ｎＭ〜約５０ｎＭ、約２０ｎＭ〜約５０ｎＭ、又は約３０ｎＭ〜約５０ｎＭである。最も好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼ濃度は、約４０ｎＭである。この状況では、５００Ｕ／ｍＬ〜１０，０００Ｕ／ｍＬのＲＮＡポリメラーゼ濃度が好ましい。ＲＮＡポリメラーゼ濃度は、より好ましくは、１，０００Ｕ／ｍＬ〜７，５００Ｕ／ｍＬ、最も好ましくは、２，５００Ｕ／ｍＬ〜５，０００Ｕ／ｍＬである。当業者であれば、ＲＮＡポリメラーゼ濃度の選択が、ＤＮＡテンプレートの濃度に影響を受けることを理解する。

本発明の好ましい実施形態によれば、配列最適化反応ミックスに含まれるＤＮＡテンプレートの濃度は、約１ｎＭ〜約５０ｎＭ、約１ｎＭ〜約４０ｎＭ、約１ｎＭ〜約３０ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０ｎＭ、又は約１ｎＭ〜約１０ｎＭの範囲である。更により好ましくは、ＤＮＡテンプレートの濃度は、約１０ｎＭ〜約３０ｎＭである。最も好ましくは、ＤＮＡテンプレートの濃度は、約２０ｎＭである。この状況では、ＤＮＡテンプレートの濃度は、約１μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬが特に好ましく、約１０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬがより好ましく、約２０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ（例えば、２５μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬ）が最も好ましい。

本発明の好ましい実施形態によれば、配列最適化反応ミックスは、ピロホスファターゼを含む。好ましくは、ピロホスファターゼの濃度は、約１ユニット／ｍＬ〜約２０ユニット／ｍＬ、約１ユニット／ｍＬ〜約１５ユニット／ｍＬ、約１ユニット／ｍＬ〜約１０ユニット／ｍＬ、約１ユニット／ｍＬ〜約５ユニット／ｍＬ、又は約１ユニット／ｍＬ〜約２．５ユニット／ｍＬである。更により好ましくは、ピロホスファターゼの濃度は、約１ユニット／ｍＬ又は約５ユニット／ｍＬである。

本発明の好ましい実施形態によれば、配列最適化反応ミックスは、Ｍｇ^＋＋イオンを含む。好ましくは、Ｍｇ^＋＋イオンは、ＭｇＣｌ_２又はＭｇ（ＯＡｃ）_２の形態で提供される。好ましくは、初期遊離Ｍｇ^＋＋濃度は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１ｍＭ〜約７５ｍＭ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１ｍＭ〜約２５ｍＭ、又は約１ｍＭ〜約１０ｍＭである。更により好ましくは、初期遊離Ｍｇ^＋＋濃度は、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ又は約１５ｍＭ〜約２５ｍＭである。最も好ましくは、初期遊離Ｍｇ^＋＋濃度は、約２４ｍＭである。当業者であれば、Ｍｇ^＋＋濃度の選択が、初期合計ＮＴＰ濃度に影響を受けることを理解する。

本発明の好ましい実施形態によれば、配列最適化反応ミックスは、ＲＮＡポリメラーゼをその活性状態で維持するために還元剤を含む。好ましくは、還元剤は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、及びβ−メルカプトエタノールからなる群から選択される。好ましくは、還元剤の濃度は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１ｍＭ〜約３０ｍＭ、又は約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、又は約１ｍＭ〜約１０ｍＭである。更により好ましくは、還元剤の濃度は、１０ｍＭ〜５０ｍＭ又は２０ｍＭ〜４０ｍＭである。最も好ましくは、配列最適化反応ミックスは、４０ｍＭ ＤＴＴを含む。

本発明の好ましい実施形態によれば、配列最適化反応ミックスは、ポリアミンを含む。好ましくは、ポリアミンは、スペルミン及びスペルミジンからなる群から選択される。好ましくは、ポリアミンの濃度は、約１ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１ｍＭ〜約１５ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１ｍＭ〜約５ｍＭ、又は約１ｍＭ〜約２．５ｍＭである。更により好ましくは、ポリアミンの濃度は、約２ｍＭである。最も好ましくは、配列最適化反応ミックスは、２ｍＭスペルミジンを含む。

本発明の好ましい実施形態によれば、配列最適化反応ミックスは、リボヌクレアーゼ阻害剤を含む。好ましくは、リボヌクレアーゼ阻害剤の濃度は、約１ユニット／ｍＬ〜約５００ユニット／ｍＬ、約１ユニット／ｍＬ〜約４００ユニット／ｍＬ、約１ユニット／ｍＬ〜約３００ユニット／ｍＬ、約１ユニット／ｍＬ〜約２００ユニット／ｍＬ、又は約１ユニット／ｍＬ〜約１００ユニット／ｍＬである。更により好ましくは、リボヌクレアーゼ阻害剤の濃度は、約２００ユニット／ｍＬである。

本発明の好ましい実施形態によれば、配列最適化ＮＴＰミックス又は配列最適化反応ミックス中の初期合計ＮＴＰ濃度は、２０ｍＭ未満、１５ｍＭ未満、１０ｍＭ未満、７．５ｍＭ未満、５．０ｍＭ未満、又は２．５ｍＭ未満である。

本発明によれば、初期合計ヌクレオチド濃度という用語は、配列最適化反応ミックスの様々な成分がインビトロ転写反応を実施するための最終体積にまとめられている場合、配列最適化ＮＴＰミックス又は配列最適化反応ミックス中に最初に存在するＮＴＰの合計濃度、例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、及び／又はＵＴＰの濃度の合計を意味する。自然界では、反応が進行するにつれて、ヌクレオチドがＲＮＡ分子に取り込まれ、その結果、合計ヌクレオチド濃度は、初期値から次第に低下する。

本発明の重要な態様は、配列最適化ＮＴＰミックス又は配列最適化反応ミックスの使用によって、初期合計ヌクレオチド濃度が低い（例えば、２ｍＭ）場合でさえも、ＲＮＡ合成の効率を増大させることである。対照的に、ＲＮＡ収量を増大させるためには、高濃度の合計ヌクレオチド（約１２ｍＭ〜約４０ｍＭ）が必要であることが既に示唆されている（米国特許第６５８６２１８号明細書）。

更に、配列最適化ＮＴＰミックス又は配列最適化反応ミックス中の初期合計ヌクレオチド濃度が低い（例えば、２．５ｍＭ）場合、短いアボーティブＲＮＡ分子の合成が減少すると予測される。対照的に、標準的な等モルＮＴＰミックスのＮＴＰ濃度を約２ｍＭ未満まで下げた場合、アボーティブ転写の増加が観察された（Ｋｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１５，１７４−１８４）。

本発明の別の好ましい実施形態は、配列最適化ＮＴＰミックス又は配列最適化反応ミックスにＮＴＰを添加する形態に関する。リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰ、又はこれらのアナログは、対イオンとして一価又は二価カチオンを備え得る。好ましくは、一価カチオンは、Ｌｉ^＋、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、ＮＨ_４ ^＋、又はトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（Ｔｒｉｓ）からなる群から選択される。好ましくは、二価カチオンは、Ｍｇ^＋＋、Ｂａ^＋＋、及びＭｎ^＋＋からなる群から選択される。

本発明の最も好ましい実施形態によれば、ＮＴＰ対イオンは、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（Ｔｒｉｓ）である。

バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼは、塩阻害に対して感受性であることが知られている。ＲＮＡ収量に対する高濃度ＮａＣｌの負の影響が報告されている（例えば、Ｋｅｒｎ ＆ Ｄａｖｉｓ，１９９７．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１３，７４７−７５６；米国特許第６，５８６，２１８号明細書）。したがって、特にＮＴＰ供給ストラテジーを押し進めた結果Ｎａ−ＮＴＰが高濃度になると、ＲＮＡ収量が減少する場合がある。この制約は、Ｔｒｉｓ−ヌクレオチドを使用することによって回避できるが、その理由は、ＲＮＡポリメラーゼ活性が、高濃度Ｎａに比べて高濃度Ｔｒｉｓにはそれ程影響を受けないためである。実施例５及び図１２に示す通り、ＲＮＡ収量は、Ｔｒｉｓに比べてＮａの添加に対して感受性が高い。

例えば、ＲＮＡの安定性を高めるために、それぞれ、リボヌクレオシド三リン酸ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰの代わりに、修飾リボヌクレオシド三リン酸（アナログ）をインビトロ転写反応において用いてもよいことが当技術分野において公知である。実施例３及び図８に示す通り、配列最適化ＮＴＰミックス又は配列最適化反応ミックスにおけるＵＴＰの一部又は全てをシュードＵＴＰに置き換えてもよい。

その結果、本発明の好ましい実施形態によれば、配列最適化ＮＴＰミックス又は配列最適化反応ミックスにおける少なくとも１つのヌクレオシド三リン酸の一部又は全てが、修飾ヌクレオシド三リン酸に置き換えられる。

本発明の好ましい実施形態では、前記修飾ヌクレオシド三リン酸は、シュードウリジン−５’−トリホスフェート、１−メチルシュードウリジン−５’−トリホスフェート、２−チオウリジン−５’−トリホスフェート、４−チオウリジン−５’−トリホスフェート、及び５−メチルシチジン−５’−トリホスフェートからなる群から選択される。

当業者であれば、配列最適化ＮＴＰミックス又は配列最適化反応ミックスの個々の成分の濃度を正確に確立することは、インビトロ転写の開始前にしかできないことを理解する。したがって、本発明の好ましい実施形態では、上に定義した数及び割合は、転写開始前の配列最適化反応ミックス又は配列最適化ＮＴＰミックス中に存在する初期濃度を反映する。

本発明の別の好ましい実施形態によれば、インビトロ転写の過程で、本明細書に定義する配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスを配列最適化反応ミックスに補充する。

本発明の状況では、追加量の配列最適化ＮＴＰミックスをインビトロ転写反応に供給する（ＮＴＰ供給）ことによって、ＲＮＡ収量を更に増大させ得ることが見出された。実施例１及び図６に示す通り、追加の配列最適化ＮＴＰミックスを添加することによって、ＲＮＡ収量が著しく増大する。

新たな配列最適化ＮＴＰミックスは、キャップアナログの対応するヌクレオチド（例えば、ＧＴＰ）に対する所望の比（例えば、４：１）が維持されるように添加する。好ましくは、配列最適化反応ミックス中の全てのヌクレオチドが消費されたとき、インビトロ転写反応の最後に新たな配列最適化ＮＴＰミックスを添加する。残りのキャップアナログの新たに添加された対応するヌクレオチド（例えば、ＧＴＰ）に対する比（例えば、４：１）は、略維持することができるが、その理由は、ＲＮＡ１分子当たり１つのキャップアナログしか取り込むことができないので、転写反応の最後にキャップアナログが略１００％残存しているためである。このストラテジーによって、同じキャップ形成効率が得られ、収量は増大し（＞４．５倍、ＲＮＡ配列に依存）、且つコストは著しく低下する。更に、ＮＴＰ含量の増大は、転写中のＲＮＡ分子の沈殿を防ぐが、これは、標準的なＮＴＰ濃度でも共通してみられる（標準的な反応及び配列最適化反応のいずれにおいても）。

また、ＮＴＰの配列依存性取り込みによって、インビトロ転写反応の進行をモニタリングすることもできる。実施例６及び図１３に示す通り、インビトロ転写反応の進行は、インビトロ転写反応から未取り込みヌクレオチドを分離し、２６０ｎｍで吸光度を測定することによってモニタリングすることができる。この理由は、４種全てのＮＴＰの合計濃度の低下が、合成されるＲＮＡ量と直接相関しているためである。同じ比のヌクレオシド三リン酸を含む標準的なＮＴＰミックスを用いた場合、このアプローチは容易に可能ではない。例えば、低分子量カットオフ膜で濾過することによって干渉を避けるためにＲＮＡ及びＤＮＡからＮＴＰを分離する場合、２６０ｎｍにおける吸光度の低下は、生成されるＲＮＡ分子に直接転換することができる。

核酸及びヌクレオチドを定量する方法は、当技術分野において公知である。核酸を定量するための分光学的方法としては、従来の吸光度測定（Ｋｏｌｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５３０：３３１−６）、並びに蛍光色素（例えば、エチジウムブロマイド）及び好適な励起波長（例えば、３０２ｎｍ又は５４６ｎｍ）の蛍光光度計を用いるより感度の高い蛍光技術（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，２０１１．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．９３：Ａ．３Ｄ．１−Ａ．３Ｄ．１４）が挙げられる。したがって、本発明の好ましい実施形態では、インビトロ転写による前記ＲＮＡ分子の合成の後に、未取り込みＮＴＰの分離及び定量を行う。

本発明の好ましい実施形態によれば、前記ＲＮＡ分子は、非コードＲＮＡ分子及びコードＲＮＡ分子からなる群から選択される。

非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）分子は、ペプチド又はタンパク質には翻訳されない機能的ＲＮＡ分子である。非コードＲＮＡ分子としては、非常に大量の且つ機能的に重要なＲＮＡ、例えば、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に加えて、ｓｎｏＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、及びｐｉＲＮＡ、並びに長鎖ｎｃＲＮＡ（例としては、Ｘｉｓｔ及びＨＯＴＡＩＲ等が挙げられる）等のＲＮＡが挙げられる（Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，２０１１．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１２（１２）：８６１−７４）。更に、非コードＲＮＡ分子としては、免疫賦活性ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）分子が挙げられる。

好ましくは、免疫賦活性ＲＮＡは、線状一本鎖ＲＮＡであってよい。更により好ましくは、免疫賦活性ＲＮＡは、長鎖線状一本鎖非コードＲＮＡであってよい。この状況では、ｉｓＲＮＡがその５’末端に三リン酸を有することが特に好ましい。

免疫賦活性ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）は、好ましくはヒトファミリーメンバーＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０又はマウスファミリーメンバーＴＬＲ１〜ＴＬＲ１３から選択され、より好ましくはヒトファミリーメンバーＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０から選択され、更により好ましくはＴＬＲ７及びＴＬＲ８から選択されるＴＬＲのリガンド、ＲＮＡの細胞内受容体（例えば、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ−５、又はＰＫＲ）のリガンド（Ｍｅｙｌａｎ ａｎｄ Ｔｓｃｈｏｐｐ，２００６．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２２，５６１−５６９）、又は任意の他の免疫賦活性ＲＮＡ配列を表す及び／又はコードするＲＮＡ配列が挙げられるがこれらに限定されない、免疫賦活性であることが知られている任意のＲＮＡ配列を含んでいてよい。更に、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、自然免疫反応を誘発することができる任意の他のＲＮＡを含んでいてもよい。限定するものではないが、かかる免疫賦活性ＲＮＡは、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、及びウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を含んでいてよい。好ましくは、免疫賦活性ＲＮＡは、非コードＲＮＡである。かかる免疫賦活性ＲＮＡは、１，０００ヌクレオチド長〜５，０００ヌクレオチド長、５００ヌクレオチド長〜５，０００ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長〜５，０００ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長〜１，０００ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長〜５００ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長〜２５０ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長〜１００ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長〜５０ヌクレオチド長、又は５ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長を含んでいてよい。

更なる特に好ましい実施形態によれば、かかる免疫賦活性ＲＮＡ分子は、式（Ｉ）：
（Ｎ_ｕＧ_ｌＸ_ｍＧ_ｎＮ_ｖ）_ａ、（式（Ｉ））
（式中、
Ｇは、グアノシン（グアニン）、ウリジン（ウラシル）、又はグアノシン（グアニン）若しくはウリジン（ウラシル）のアナログ、好ましくは、グアノシン（グアニン）又はそのアナログであり；
Ｘは、グアノシン（グアニン）、ウリジン（ウラシル）、アデノシン（アデニン）、チミジン（チミン）、シチジン（シトシン）、又はこれらヌクレオチド（ヌクレオシド）のアナログ、好ましくは、ウリジン（ウラシル）又はそのアナログであり；
Ｎは、約４核酸長〜約５０核酸長、好ましくは約４核酸長〜約４０核酸長、より好ましくは約４核酸長〜約３０核酸長、又は約４核酸長〜約２０核酸長を有する核酸配列であり、各Ｎは、独立して、グアノシン（グアニン）、ウリジン（ウラシル）、アデノシン（アデニン）、チミジン（チミン）、シチジン（シトシン）、又はこれらヌクレオチド（ヌクレオシド）のアナログから選択され；
ａは、１〜２０、好ましくは１〜１５、最も好ましくは１〜１０の整数であり；
ｌは、１〜４０の整数であり、
ｌ＝１であるとき、Ｇは、グアノシン（グアニン）又はそのアナログであり、
ｌ＞１であるとき、これらヌクレオチド（ヌクレオシド）のうちの少なくとも５０％が、グアノシン（グアニン）又はそのアナログであり；
ｍは、整数であり且つ少なくとも３であり；
ｍ＝３であるとき、Ｘは、ウリジン（ウラシル）又はそのアナログであり、
ｍ＞３であるとき、少なくとも３つの連続するウリジン（ウラシル）又はウリジン（ウラシル）のアナログが存在し；
ｎは、１〜４０の整数であり、
ｎ＝１であるとき、Ｇは、グアノシン（グアニン）又はそのアナログであり、
ｎ＞１であるとき、これらヌクレオチド（ヌクレオシド）のうちの少なくとも５０％が、グアノシン（グアニン）又はそのアナログであり；
ｕ、ｖは、互いに独立して、０〜５０の整数であってよく、
好ましくは、ｕ＝０であるとき、ｖ≧１であるか、又は
ｖ＝０であるとき、ｕ≧１である）
で表されるＲＮＡからなるか又は含み、
前記式（Ｉ）で表される核酸分子は、少なくとも５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１５０ヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも２５０ヌクレオチド長を有する。

最も好ましい実施形態によれば、式（Ｉ）に係るＲＮＡ分子は、例えば、以下の配列から選択してよい：
ＧＧＧＡＧＡＡＡＧＣＵＣＡＡＧＣＵＵＡＵＣＣＡＡＧＵＡＧＧＣＵＧＧＵＣＡＣＣＵＧＵＡＣＡＡＣＧＵＡＧＣＣＧＧＵＡＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＧＡＣＣＧＵＣＵＣＡＡＧＧＵＣＣＡＡＧＵＵＡＧＵＣＵＧＣＣＵＡＵＡＡＡＧＧＵＧＣＧＧＡＵＣＣＡＣＡＧＣＵＧＡＵＧＡＡＡＧＡＣＵＵＧＵＧＣＧＧＵＡＣＧＧＵＵＡＡＵＣＵＣＣＣＣＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＡＧＵＡＡＡＵＧＣＧＵＣＵＡＣＵＧＡＡＵＣＣＡＧＣＧＡＵＧＡＵＧＣＵＧＧＣＣＣＡＧＡＵＣＵＵＣＧＡＣＣＡＣＡＡＧＵＧＣＡＵＡＵＡＧＵＡＧＵＣＡＵＣＧＡＧＧＧＵＣＧＣＣＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＧＧＣＣＣＡＧＵＵＣＵＧＡＧＡＣＵＵＣＧＣＵＡＧＡＧＡＣＵＡＣＡＧＵＵＡＣＡＧＣＵＧＣＡＧＵＡＧＵＡＡＣＣＡＣＵＧＣＧＧＣＵＡＵＵＧＣＡＧＧＡＡＡＵＣＣＣＧＵＵＣＡＧＧＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＣＣＧＣＵＣＡＣＵＡＵＧＡＵＵＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＵＧＧＡＧＵＧＵＣＡＣＵＧＣＵＣＵＣＧＡＧＧＵＣＵＣＡＣＧＡＧＡＧＣＧＣＵＣＧＡＵＡＣＡＧＵＣＣＵＵＧＧＡＡＧＡＡＵＣＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＧＵＧＣＧＡＣＧＡＵＣＡＣＡＧＡＧＡＡＣＵＵＣＵＡＵＵＣＡＵＧＣＡＧＧＵＣＵＧＣＵＣＵＡＧ（Ｒ２０２５；配列番号４）。

コードＲＮＡは、ペプチド又はタンパク質に翻訳することができる機能的ＲＮＡ分子である。好ましくは、コードＲＮＡ分子は、少なくとも１つのペプチド又はタンパク質をコードしている少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む。

この状況では、コードＲＮＡ分子は、１つ（単シストロン性）、２つ（二シストロン性）、又はそれ以上（多シストロン性）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいてよい。コードＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子、ウイルスＲＮＡ分子、又は自己複製ＲＮＡ分子（レプリコン）であってよい。好ましくは、ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡである。

本発明の好ましい実施形態によれば、前記ＲＮＡ分子は、１００ヌクレオチドよりも長い。ＲＮＡが、１００ヌクレオチド長〜１５．０００ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長〜１２．５００ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長〜１０．０００ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長〜７．５００ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長〜５．０００ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長〜２．５００ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長〜１．５００ヌクレオチド長、又は１００ヌクレオチド長〜１．０００ヌクレオチド長であることが、同様に好ましい。

本発明の好ましい実施形態では、所与の配列のＲＮＡ分子の合成は、大規模合成として実施される。
本発明によれば、用語「大規模」とは、前記ＲＮＡ分子の反応収量が、ミリグラムオーダーの量、好ましくは少なくとも１グラムであることを指す。

本発明の好ましい実施形態によれば、インビトロ転写反応は、ＲＮＡの大規模合成用の転写反応器又はＲＮＡ反応器とも呼ばれるバイオリアクタ内で実施される。したがって、バイオリアクタは、本発明の上記方法を実施するようにされていてもよい。

本発明によれば、好ましくは大規模に、所与の配列のＲＮＡ分子を合成するためのかかるバイオリアクタは、配列最適化反応ミックス中でインビトロＲＮＡ転写反応を実施するための反応モジュールと、転写されたＲＮＡ分子を一時的に捕捉するための捕捉モジュールと、前記配列最適化反応ミックスの成分の前記反応モジュールへの送り込みを制御するための制御モジュールとを含む、モジュール式に設計されがインビトロ転写反応器システムである。ここで、反応モジュールは、反応ミックスからヌクレオチドを分離するための濾過膜を含み、制御モジュールによる配列最適化反応ミックスの成分の送り込みの制御は、分離されたヌクレオチドの測定濃度に基づく。

バイオリアクタ又は転写反応器という用語は、本明細書で使用するとき、インビトロ転写反応が指定の条件下で実施されるチャンバ又は試験管又はカラムを指す。バイオリアクタは、特定の温度、通常、４℃〜４０℃を正確に維持するために熱的に調節してよい。バイオリアクタは、流入又は供給ラインと流出口とを備えるようになっていてよい。バイオリアクタは、可変速度で撹拌できる撹拌セルであってよい。

本発明によれば、バイオリアクタは、反応ミックスからヌクレオチドを分離するため、特に、配列最適化反応ミックスからヌクレオチド及び他の低分子量成分を分離するための濾過膜を含む。かかる流動システムにおける濾過膜、例えば、超濾過膜は、低分子量成分（例えば、ヌクレオチド）から高分子量成分（例えば、タンパク質及び／又はポリヌクレオチド）を分離するために導入される。濾過膜は、固定化ＤＮＡテンプレート、ＲＮＡポリメラーゼ、及び合成されたＲＮＡ分子を反応モジュールのリアクタコアに選択的に保持する機能を有するが、ヌクレオチド（ＮＴＰ）等のより小さな分子は、前記濾過膜を通過して、反応モジュールの別のより小さな区画、即ち、濾過区画に入り得る。次いで、例えば、低分子量成分を含む分離された流体中で分光分析によって、ヌクレオチド濃度を測定してよい。或いは、ヌクレオチド濃度は、オンラインＨＰＬＣシステムによって測定してもよい。この反応器システムに配列最適化ＮＴＰミックスを適用することによって、インビトロ転写反応中のヌクレオチド濃度をリアルタイムに測定して、前記インビトロ転写反応の進行をモニタリングすることが可能になる。

好適な濾過膜は、当業者に公知の様々な材料からなっていてよい（ｖａｎ ｄｅ Ｍｅｒｂｅｌ，１９９９．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ ８５６（１−２）：５５−８２）。例えば、膜は、再生若しくは変性セルロース、又は合成材料からなっていてよい。後者としては、ポリスルホン（ＰＳＵ）；ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）；ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）；ポリアリールエーテルスルホン、ポリビニルピロリドン、及びポリアミドの混合物（Ｐｏｌｙａｍｉｘ．ＲＴＭ．）が挙げられる。例えば、ポリスルホンとしては、ポリエーテルスルホン［ポリ（オキシ−１，４−フェニルスルホニル−１，４−フェニル）、ＰＥＳと略される］が挙げられる。幾つかの例示的な実施形態では、ポリエーテルスルホンは、本開示に従って使用するための半透膜として利用することができる。一部の例では、ＰＥＳ膜は、ＰＳＵ膜に比べて親水性が高い（及び／又は水による膜の濡れ性が改善されている）。幾つかの実施形態では、ＰＥＳ膜の濡れ性は、例えば、水溶性ポリマーであるポリビニルピロリドンを含むことによって更に高めることができる。

濾過膜を通過する分子の流れに影響を与える重要なパラメータは、孔径又は孔径分布である。濾過膜は、通常、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）値、即ち、９０％超が保持される最小化合物の分子質量と定義される特定のサイズ限界によって特徴付けられる。各用途について、高分子量化合物は十分に保持されるが、同時に、アナライトの迅速な輸送も確保されるように、適切なＭＷＣＯ値を選択する必要がある。本発明のバイオリアクタの濾過膜は、１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜７５ｋＤａ、１０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、１０ｋＤａ〜２５ｋＤａ、又は１０ｋＤａ〜１５ｋＤａの範囲のＭＷＣＯを有し得る。更により好ましくは、濾過膜は、約１０ｋＤａ〜約５０ｋＤａの範囲のＭＷＣＯを有する。好ましくは、濾過膜は、再生セルロース、変性セルロース、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、及びポリアリールエーテルスルホン（ＰＡＥＳ）の群から選択される。

本発明の好ましい実施形態によれば、バイオリアクタは、ＲＮＡ転写反応の基礎として、固体担体に固定化されたＤＮＡテンプレートを含む。ＤＮＡテンプレートを固定化することによって、テンプレートを繰り返し使用し、且つ残存ＤＮＡのＲＮＡ生成物への夾雑を低減することができるようになる。更に、固定化によって、最終ＲＮＡ生成物からＤＮＡテンプレートを除去するためにＤＮＡｓｅを使用しなくてもよくなる。好ましくは反応モジュールの反応コアにおいて固体担体に固定化されているＤＮＡテンプレートは、化学的に合成されたＤＮＡ分子、単離されたＤＮＡ制限酵素断片、プラスミド、又は例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の増幅プロセスによって増幅されたＤＮＡ分子を表し得る。ＤＮＡテンプレートは、二本鎖デュープレックス、又は一本鎖ＲＮＡコード領域の上流に二本鎖プロモータ領域を含むユニットであってよい。ＤＮＡテンプレートは、ＤＮＡ鎖の５’末端、３’末端、又は内部ヌクレオチドを固体担体に固定化するためのリガンドで修飾されていてよい。

本発明によれば、用語「固体担体」は、その表面上にＤＮＡ分子を固定化することができる全ての未溶解担体に関する。固体担体は、アガロース、変性アガロース、セファロース、ポリスチレン、ラテックス、セルロース、及び強磁性又はフェリ磁性の粒子からなる群から選択してよい。適切な固体担体を選択し、前記固体担体にＤＮＡ分子をカップリングするための方法及びストラテジーは、当技術分野において公知である（例えば、Ａｒｎｄｔ−Ｊｏｖｉｎ ｅｔ ａｌ．１９７５．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４（２）：４１１−８；Ｋｅｒｒｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２４：１２．１０．１−１２．１０．１８；国際公開第１９９５／０８６２６号パンフレット）。固体担体上へのＤＮＡテンプレートの固定化は、共有結合を介していてもよく、非共有結合を介していてもよい。好ましくは、ＤＮＡテンプレートの固定化は、非共有結合を介して行われる。例えば、ＤＮＡテンプレートの固体担体への固定化は、非共有結合性ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介して行ってよい。ＤＮＡテンプレートの非コード鎖を、ストレプトアビジンタンパク質を含む固体担体マトリクスにＤＮＡ鎖を固定化する機能を有する５’末端ビオチン基で修飾してもよい。ＤＮＡテンプレートの相補的ＲＮＡコード鎖は、固定化されていないままであってよい。また、他の種類の非共有結合、例えば、ポリ（Ａ）−ポリ（Ｔ）及びポリ（Ｇ）−ポリ（Ｃ）相互作用を介して固体担体にＤＮＡテンプレートを固定化することも可能である。共有結合、例えば、エステル結合又はその誘導体を介してＤＮＡテンプレートを固定化することも同様に好ましい。一般的に、カップリング前、固体担体は、ＤＮＡ分子とのカップリング反応を可能にするために、ＮＨＳ、カルボジイミド等の活性基を含有していてよい。ＤＮＡ分子は、直接カップリングによって（例えば、アミノ基、スルフヒドリル基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、及びケトン基等の官能基を用いて）固体担体にカップリングしてもよい。固体担体材料への結合は、ＤＮＡテンプレートの前記担体からの空間的分離を最適化するためにスペーサを含んでいてもよい。スペーサは、ＤＮＡテンプレートの５’末端に追加のヌクレオチドを挿入することによって提供することができる。

本発明の好ましい実施形態によれば、バイオリアクタの捕捉モジュールは、転写ＲＮＡ分子を捕捉し、配列最適化転写反応ミックスの他の可溶性成分から前記転写ＲＮＡ分子を分離するために樹脂／固相を含む。好ましくは、捕捉モジュールは、例えば、洗浄プロセス等によって、捕捉された転写ＲＮＡ分子を精製するための手段を含む。更に好ましくは、捕捉モジュールは、好ましくは溶出バッファを用いて、捕捉された転写ＲＮＡ分子を溶出するための手段を含む。

更に好ましい実施形態によれば、バイオリアクタは、転写ＲＮＡ分子を捕捉した後、濾過後の残存配列最適化反応ミックス、即ち、転写ＲＮＡ分子を除く配列最適化転写反応ミックスの他の可溶性成分を捕捉モジュールから反応モジュールに戻すための逆流モジュールを更に含み、好ましくは、濾過後の残存配列最適化反応ミックスを戻すための手段は、ポンプである。ここで、逆流モジュールは、好ましくは、破壊成分（例えば、ホスフェート）を捕捉するために、固定化されている酵素（例えば、ピロホスファターゼ）又は樹脂を含む。

好ましい実施形態では、バイオリアクタは、少なくとも１つのイオン選択性電極を含む。本発明の状況では、用語「イオン選択性電極」とは、溶液に溶解している特定のイオンの活量を電位に変換する変換器（例えば、センサ）に関し、前記電位は、例えば、電圧計又はｐＨ計を用いることによって測定することができる。特に、用語「イオン選択性電極」は、本明細書で使用するとき、選択的透過性を有する膜を含むか又はからなるシステムであって、典型的には、２つの電極が前記膜によって分離されているシステムを含む。イオン選択性電極は、本明細書で使用するとき、典型的には、好ましくは選択的透過性を有する膜と参照電極とを含む感知部を含む。膜は、典型的には、イオン選択性膜であり、これは、異なる種類のイオンに対して異なる透過性を有することを特徴とする。好ましくは、バイオリアクタの少なくとも１つのイオン選択性電極は、ガラス膜、固体膜、液体系膜、及び化合物膜からなる群から選択される膜を含む。

好ましい実施形態では、本明細書に記載するバイオリアクタは、少なくとも１つのイオン選択性電極を含み、前記少なくとも１つのイオン選択性電極は、異なる種類のイオンに対して異なる透過性を有する膜、好ましくは本明細書に記載する膜、より好ましくは電気化学的膜を含むシステムを含むか又はからなり、好ましくは、２つの電極が、前記膜、好ましくは本明細書に記載する膜、より好ましくは電気化学的膜によって分離される。１つの実施形態では、膜は、固体電解質の層、又は電解質の非水相溶性溶媒溶液を含むか又はからなる。膜は、好ましくは、片側又は両側において電解質溶液と接触する。好ましい実施形態では、イオン選択性電極は、内部参照電極を含む。幾つかの実施形態では、かかる内部参照電極を、例えば、金属接触、又は絶縁体及び半導体層によって置き換えてもよい。

イオン選択性電極によって、様々な媒体においてイオン活量又はイオン濃度を高感度、迅速、正確、且つ非破壊的に測定することができるようになる。イオン活量又はイオン濃度の直接測定とは別に、イオン選択性電極は、剤の投与量を制御するための要素として、又は電位差滴定における非常に正確な指示電極として、特に、検量線を用いることによって濃度変化を連続してモニタリングする機能を有し得る。

好ましい実施形態では、バイオリアクタは、前記バイオリアクタの少なくとも１つの区画において１種以上のイオンの濃度を測定するために、好ましくは本明細書に記載する少なくとも１つのイオン選択性電極を含む。例えば、少なくとも１つのイオン選択性電極は、バイオリアクタの反応モジュール、制御モジュール、又は逆流モジュールにおける１種以上のイオンの濃度を測定するために用いることができる。好ましくは、少なくとも１つのイオン選択性電極は、反応モジュール、より好ましくは反応コア又は濾過区画における１種以上のイオンの濃度を測定するために用いられる。更に、少なくとも１つのイオン選択性電極は、好ましくは本明細書に記載するバイオリアクタのセンサユニットに含まれ得る。イオン選択性電極は、バイオリアクタ自体、バイオリアクタ上、又はバイオリアクタの外部（例えば、バイパスによってバイオリアクタに接続されている）に配置してよい。したがって、本発明の状況では、「バイオリアクタは、少なくとも１つのイオン選択性電極を含む」というフレーズは、少なくとも１つのイオン選択性電極がバイオリアクタの一部である状態、又は少なくとも１つのイオン選択性電極がバイオリアクタとは別の物理的実体であるが、バイオリアクタと接続して用いられる状態を指し得る。

幾つかの実施形態によれば、バイオリアクタは、前記バイオリアクタの少なくとも１つの区画内に含まれる液体中の１種以上のイオンの濃度を測定するために、好ましくは本明細書に記載する少なくとも１つのイオン選択性電極を含み、前記イオンは、好ましくは、Ｈ^＋、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｃｌ⁻、及びＰＯ_４ ^３−からなる群から選択される。

幾つかの実施形態によれば、バイオリアクタは、電位差計、好ましくは、多重チャンネル電位差計（例えば、ＣＩＴＳｅｎｓ Ｉｏｎ Ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｅｒ ６−ｃｈａｎｎｅｌ，ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ；Ｃ−ＣＩＴ Ｓｅｎｓｏｒｓ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に接続されている、好ましくは本明細書に記載する少なくとも１つのイオン選択性電極を含む。

好ましい実施形態では、バイオリアクタは、少なくとも１つのイオン選択性電極を含み、前記少なくとも１つのイオン選択性電極は、好ましくは、管電極であり、より好ましくは、Ｍｇ^２＋選択性管電極、Ｎａ^＋選択性管電極、Ｃｌ⁻選択性管電極、ＰＯ_４ ^３−選択性管電極、ｐＨ選択性管電極、及びＣａ^２＋選択性管電極からなる群から選択され、電位差計に接続して用いられることが好ましい。更により好ましくは、バイオリアクタは、少なくとも１つのイオン選択性電極を含み、前記少なくとも１つのイオン選択性電極は、好ましくは、ＣＩＴＳｅｎｓ Ｉｏｎ Ｍｇ^２＋選択性ミニ管電極、ＣＩＴＳｅｎｓ Ｉｏｎ Ｎａ^＋選択性ミニ管電極、ＣＩＴＳｅｎｓ Ｉｏｎ Ｃｌ⁻選択性ミニ管電極、ＣＩＴＳｅｎｓ Ｉｏｎ ＰＯ_４ ^３−選択性ミニ管電極、ＣＩＴＳｅｎｓ Ｉｏｎ ｐＨ選択性ミニ管電極、及びＣＩＴＳｅｎｓ Ｉｏｎ Ｃａ^２＋選択性ミニ管電極（全てＣ−ＣＩＴ Ｓｅｎｓｏｒｓ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ製）からなる群から選択され、好ましくは、電位差計、より好ましくは、多重チャンネル電位差計（例えば、ＣＩＴＳｅｎｓ Ｉｏｎ Ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｅｒ ６−ｃｈａｎｎｅｌ，ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃ−ＣＩＴ Ｓｅｎｓｏｒｓ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））と接続される。

イオン選択性電極は、実用上多数の利点を有する。例えば、イオン選択性電極は、試験溶液に影響を与えないので、非破壊的測定が可能になる。更に、イオン選択性電極は、可動式であり、直接測定及び滴定センサに好適であり、且つコスト効率が高い。バイオリアクタ（例えば、転写反応器）においてイオン選択性電極を使用することの主な利点は、サンプルを回収することなしにその場で且つ非破壊的に測定できることである。

本発明の好ましい実施形態によれば、バイオリアクタ、又はより正確にはバイオリアクタの制御モジュールは、ｐＨ値、伝導性、及び配列最適化反応ミックス中のヌクレオチド濃度等の重要なプロセスパラメータを分析するためのセンサユニットを含む。好ましくは、バイオリアクタのセンサユニットは、インビトロ転写反応中のヌクレオチド濃度をリアルタイムに測定するための、ＵＶ２６０／２８０ｎｍ用のＵＶフローセル等のセンサを含む。好ましくは、センサユニットのセンサは、光分析によって、プロセスパラメータとしてヌクレオチド濃度を測定する。

本発明の好ましい実施形態によれば、バイオリアクタは、制御モジュールを含む。制御モジュールによってデータを収集し、解析することにより、配列最適化ＮＴＰミックスの成分又は配列最適化反応ミックスの成分、例えば、バッファ成分、ＲＮＡポリメラーゼ、又はヌクレオチドを繰り返し供給するために一体型ポンプシステム（アクチュエータ）を制御できるようになる。厳格に制御及び管理を行うことにより、最適な定常状態条件下でインビトロ転写反応を実施して、高い生成物収量を得ることができる。好ましくは、制御モジュールは、配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスの配列最適化反応ミックスへの添加を制御し、好ましくは、前記バイオリアクタは、配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスを配列最適化反応ミックスに添加するためのアクチュエータを含む。更に、アクチュエータは、配列最適化反応ミックスの他の反応成分、例えば、バッファ成分又はＭｇ^＋＋をインビトロ転写反応ミックスに添加することもできる。本発明の更に好ましい実施形態によれば、バイオリアクタは、半バッチモード又は連続モードで動作する。半バッチという用語は、本明細書で使用するとき、一連の転写反応の繰り返しとしてインビトロ転写反応を操作することを指す。例えば、有限時間反応を進行させ、その時点における生成物を除去し、新たな反応物質を添加し、完全な反応を繰り返す。連続流という用語は、本明細書で使用するとき、流入供給ラインを通じて補充反応物質が常に添加され、流出口を通じて生成物が常に除去されるバイオリアクタコアにおいて連続的に実施される反応を指す。連続流反応器は、装置流量を制御することによって試薬の送達及び生成物の除去を制御し、これは、試薬の制約及び阻害生成物のある反応において有利である。

別の態様では、本発明は、本明細書に開示する本発明の方法によって得ることができるＲＮＡ分子に関する。好ましくは、本発明の方法によって得られるＲＮＡは、従来技術の方法によって得られるＲＮＡと比べて、特に、ＮＴＰミックスが転写産物の配列に対して最適化されていないインビトロ転写法、例えば、標準的な等モルＮＴＰミックスを用いる方法によって得られるＲＮＡと比べて、免疫賦活活性が低いことを特徴とする。

更なる態様では、本発明は、ＲＮＡ分子を合成するために所与の配列のＲＮＡ分子について最適化された配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスの使用に関する。本発明の方法に関連して上に記載した配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスに関する全ての定義及び具体的な実施形態は、本発明の前記使用にも適用される。

特に、本発明の好ましい実施形態によれば、配列最適化ＮＴＰミックスは、
ａ）前記ＲＮＡ分子中の４種のヌクレオチドＧ、Ａ、Ｃ、及びＵの各割合（１）を求める工程と、
ｂ）４種のリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰを含む配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスを調製する工程であって、前記配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックス中の前記４種のリボヌクレオシド三リン酸の各割合（２）が、前記ＲＮＡ分子中の各ヌクレオチドの割合（１）に対応する工程と
を含む方法によって最適化されている。

更なる態様では、本発明は、また、４種のリボヌクレオシド三リン酸ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰを含む所与の配列のＲＮＡ分子を合成するための配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスであって、前記配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックス中の前記４種のリボヌクレオシド三リン酸の各割合（２）が、前記ＲＮＡ分子中の各ヌクレオチドの割合（１）に対応するミックスに関する。

更なる態様では、本発明は、また、上に定義した所与の配列のＲＮＡ分子に対して最適化された配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスを含むキットに関する。配列最適化ＮＴＰミックスは、４種全てのＮＴＰ（ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰ）を含む１本のチューブで提供されてもよく、又は各ＮＴＰを別々のチューブに入れてもよい。本発明の方法に関連して上に記載した全ての定義及び具体的な実施形態は、本発明の前記キットにも適用される。

以下に示す実施例は、単なる例示であり、本発明を更に説明するものとする。これら実施例は、本発明を限定すると解釈すべきではない。

実施例１：ｍＲＮＡの調製
１． ＤＮＡ及びｍＲＮＡコンストラクトの調製
本実施例では、ヒト前立腺幹細胞抗原（ＨｓＰＳＣＡ）ｍＲＮＡ（Ｒ１８７１）、ホタルルシフェラーゼ（ＰｐＬｕｃ）ｍＲＮＡ（Ｒ２９８８）、及びムチン−１シグナルペプチド／上皮成長因子受容体／ムチン−１融合タンパク質（ＥＧＦＲ／ムチン−１）（Ｒ１６２６）をコードしているＤＮＡ配列を調製し、その後、インビトロ転写反応に用いた。

第１の調製によれば、Ｔ７プロモータに続いて上記タンパク質をコードしている配列を有するインビトロ転写用のベクターを構築した。安定化のためのＧＣ最適化配列に続いて、アルファ−グロビン−３’−ＵＴＰ（ｍｕａｇ（変異型アルファ−グロビン−３’−ＵＴＰ））由来の安定化配列、６４アデノシン伸長（ポリＡ配列）、３０シトシン伸長（ポリＣ配列）、及びヒストンステムループを導入することによって、野生型コード配列を改変することによって、前記コンストラクトを調製した。

更に、Ｔ７プロモータに続いて、タンパク質をコードしていない免疫賦活性ＲＮＡ（Ｒ２０２５）をコードしている配列を有するインビトロ転写用のベクターを構築した。

ＲＮＡコンストラクト及びそのヌクレオチド組成を、それぞれ、表１及び表２に示す。

２． インビトロ転写
段落１に従って調製したそれぞれのＤＮＡプラスミドを、Ｔ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写した。次いで、ｍＲＮＡをＰｕｒｅＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）（ＣｕｒｅＶａｃ，Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；国際公開第２００８／０７７５９２号パンフレット）を用いて精製した。

標準的な転写反応体積は、２０μＬであった。例えば、キャップ分析の場合、後続のｍＲＮＡのＨＰＬＣ精製については、反応を１ｍＬに設定した。

８０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．５、２４ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ スペルミジン、４０ｍＭ ＤＴＴ、５Ｕ／ｍＬ ピロホスファターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２００Ｕ／ｍＬ Ｒｉｂｏｌｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５，０００Ｕ／ｍＬ Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中３７℃で３時間（又は指定の通り）、線状ＤＮＡプラスミドテンプレート（５０μｇ／ｍＬ）を転写させた。リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を、それぞれ、以下の第３〜７節に従って添加した。転写後、ＤＮａｓｅＩ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅ）（１００Ｕ／ｍＬ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、３７℃で３０分間）によって、ＤＮＡテンプレートを除去した。

ＲＮＡを−２０℃で１６時間、反応体積の３．４５倍の２．８６Ｍ ＬｉＣｌに沈殿させ、次いで、遠心分離した（３０分間、１６．０００ｇ、４℃）。ペレットを５転写反応体積の７５％エタノールで洗浄し（倒立チューブ、５分間、１６．０００ｇ、４℃で遠心分離）、乾燥させ、２．５転写反応体積のＨ_２Ｏに再溶解させた。
ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）分光光度計を用いて２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、ＲＮＡ収量を求めた。２６０ｎｍにおける１吸光度単位は、４０ｎｇ／μＬ ＲＮＡに相当する（１ Ａ２６０＝４０ｎｇ／μＬ ＲＮＡ）。

取り込まれたヌクレオチドの数を求めるために、分子質量で除することによって、生成されたＲＮＡの合計量を生成された分子数に変換した。配列中に存在するそれぞれのヌクレオチドの数を乗じることによって、取り込まれたヌクレオチドが得られる。転写反応の最後における残存ヌクレオチド（％）を求めるために、以下の式に従って、この数を利用可能なヌクレオチド数で除した。

ＲＮＡ収量とは、１反応当たりの生成されるモル数（ｎｍｏｌ）を意味する。ＮＴＰ出発濃度［ＮＴＰ（出発）］は、ｍＭで示し、反応体積は、μＬで示す。
それぞれのヌクレオチドの残存濃度を算出するために、以下の式に従って、反応の開始時に利用可能なＮＴＰに、転写反応の最後における残存ＮＴＰの百分率（上記を参照）を乗じた。

３． キャップアナログの存在下における標準的なインビトロ転写
キャップアナログを用いた５’キャップＲＮＡの生成については、５．８ｍＭ ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、４ｍＭ ＡＴＰ、４ｍＭ ＣＴＰ、４ｍＭ ＵＴＰ、及び１．４５ｍＭ ＧＴＰ（全てＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（表３を参照）を用いて標準的な転写を実施した。キャップアナログ及びＧＴＰは、４：１の比で用いた。

標準的な転写におけるＲＮＡ転写産物の典型的な収量は、約１．５ｍｇ／ｍＬ（反応）である。

４． ２倍の濃度のキャップアナログ及びＮＴＰを用いる、キャップアナログの存在下におけるインビトロ転写（２×ＣａｐＮＴＰ）
キャップアナログ及びＮＴＰ濃度を標準的な転写反応に比べて２倍にして、１１．６ｍＭ ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、８ｍＭ ＡＴＰ、８ｍＭ ＣＴＰ、８ｍＭ ＵＴＰ、及び２．９ｍＭ ＧＴＰ（全てＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（表３を参照）中で反応を実施した。キャップアナログ及びＧＴＰは、４：１の比で用いた。

２倍の濃度のキャップアナログ及びＮＴＰを用いる転写の典型的な収量は、約３ｍｇ／ｍＬ（反応）である。

５． キャップアナログの存在下における配列最適化インビトロ転写
配列最適化インビトロ転写反応については、全てのＮＴＰの合計濃度が標準的な転写反応と同様１３．４５ｍＭになるように、配列のヌクレオチド組成（表２）に従って各個々の配列についてのリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の濃度を算出した。キャップ／ＧＴＰ比が４：１になるように、キャップアナログの濃度をＧＴＰの算出濃度よりも４倍高くした。

配列最適化キャップアナログ及びＮＴＰを用いる転写の典型的なＲＮＡ収量は、約３．９ｍｇ／ｍＬ（反応）である。

６． ＮＴＰを供給するキャップアナログの存在下における配列最適化インビトロ転写
配列最適化インビトロ転写反応については、全てのＮＴＰの合計濃度が標準的な転写反応と同様１３．４５ｍＭになるように、配列のヌクレオチド組成（表２）に従って各個々の配列についてのリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の濃度を算出した。キャップ／ＧＴＰ比が４：１になるように、キャップアナログの濃度をＧＴＰの算出濃度よりも４倍高くした（表７参照）。
ＮＴＰ供給については、２．５時間後、キャップアナログを含まない１３．４５ｍＭ ＮＴＰ（体積２．６９μＬ）を反応ミックスに添加した。この時点で、キャップアナログの＞９９％が転写反応中に依然として存在していたので、４：１ キャップ／ＧＴＰ比を保持することができた。

配列最適化キャップアナログ及びＮＴＰを用い、続いてＮＴＰを供給する転写の典型的なＲＮＡ収量は、約６．７５ｍｇ／ｍＬ（反応）である。

７． 非キャップＲＮＡの標準的なインビトロ転写
非キャップ５’トリリン酸ＲＮＡの生成については、各４ｍＭ ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰ（全てＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の存在下で転写を実施した。非キャップＲＮＡを、キャップ形成分析アッセイのコントロールとして用いた（図７）。

８． ｍＲＮＡの酵素的キャップ形成
製造業者の説明書に従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ（商標）ｍ^７Ｇ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｌｌｓｃｒｉｐｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて酵素的キャップ形成を実施した。簡潔に述べると、１反応あたり非キャップＲＮＡ６０μｇを６８．５μＬの体積で熱変性（１０分間、６５℃）し、次いで、直ちに氷冷（５分間）した。反応成分（１×ＳｃｒｉｐｔＣａｐキャップ形成バッファ、１ｍＭ ＧＴＰ、０．１ｍＭ ＳＡＭ、１，０００Ｕ／ｍＬ ＳｃｒｉｐＧｕａｒｄ ＲＮａｓｅ阻害剤、４００Ｕ／ｍＬ ＳｃｒｉｐｔＣａｐキャップ形成酵素）を最終体積が１００μＬになるように添加した後、反応物を３７℃で１時間インキュベートした。ＲＮＡを−２０℃で１６時間、反応体積の３．４５倍の２．８６Ｍ ＬｉＣｌに沈殿させ、次いで、遠心分離した（３０分間、１６．０００ｇ、４℃）。ペレットを０．５転写反応体積の７５％エタノールで洗浄し（倒立、５分間、１６，０００ｇ、４℃で遠心分離）、乾燥させ、Ｈ_２Ｏに再溶解させた。酵素的にキャップ形成されたＲＮＡをキャップ形成分析アッセイのコントロールとして用いた（図７）。

９． 結果
標準的なインビトロ転写反応及び配列最適化インビトロ転写反応のＲＮＡ収量を、上記の通り（段落２）２時間の所定の時点で求めた。

図５Ａから分かる通り、約３０分間後、標準的な転写反応のＲＮＡ収量は、ＥＧＦＲ／ムチン−１をコードしている５，３３７ヌクレオチド長のＲＮＡ（Ｒ１６２６）については約１．４ｍｇ／ｍＬ、ＨｓＰＳＣＡをコードしている５８９ヌクレオチド長のＲＮＡ（Ｒ１８７１）については約１．８ｍｇ／ｍＬのプラトーに達する。
図５Ｂから分かる通り、配列最適化転写反応のＲＮＡ収量は、標準的な転写反応に比べて著しく高い。それぞれ、６０分間後（Ｒ１６２６）及び１２０分間後（Ｒ１６２６）、両ＲＮＡは、約３．９ｍｇ／ｍＬの類似のプラトーに達する。

図６から分かる通り、異なる長さの３つの異なるＲＮＡ分子のＲＮＡ収量は、５時間後、各種転写反応について略同じである。
標準的な転写（等濃度ＮＴＰ）では、約１．５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、２倍の濃度のキャップ−ＮＴＰミックス（２×ＣａｐＮＴＰ）を用いた転写では、約３．０ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、配列最適化転写では、約３．９ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、そして、ＮＴＰを供給する配列最適化転写では、約６．７５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡが得られる。
したがって、配列最適化転写反応からは、標準的な転写反応に比べて約３倍多いＲＮＡ収量が得られる。この収量は、ＮＴＰとの反応を補充することによって（ＮＴＰ供給）更に約２倍増加し得る。

実施例２：キャップ分析アッセイ
１． アッセイの原理
ハンマーヘッド型リボザイムＨＨＮＵＨ２ｄ（５’−ＧＣＡＵＧＧＣＵＧＡＵＧＡＧＧＣＣＵＣＧＡＣＣＧＡＵＡＧＧＵＣＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＡＧＣＵＵＵＣＵＣＣＣ−３’）（配列番号５）を実施例１のインビトロ転写されたＲＮＡと共にインキュベートし、切断産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｄＰＡＧＥ）によって分離した。

２． リボザイム切断反応
１反応当たりＨＨＮＵＨ２ｄ １０ｐｍｏｌ及び４種それぞれのＲＮＡ生成物１０ｐｍｏｌを、合計体積６μＬの０．６２５ｍＭ ＥＤＴＡ中でアニーリングさせた（９５℃で２分間、０．１℃／秒で２５℃に、２５℃で１０分間）。１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ４μＬ、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５を添加した後（最終濃度：４０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ）、反応物を２５℃で１時間インキュベートした。ＰＡＧＥを介した分析については、１×反応を９５％ホルムアミド３０μＬ、２０ｍＭ ＥＤＴＡで停止させた。

３． ゲル分離、切断産物の定量、及びキャップ形成度の算出
停止させた反応物を熱変性（２分間で８０℃まで加熱、直ちに５分間氷冷）し、１０ｃｍ×８ｃｍ×１．０ｍｍの２０％変性ポリアクリルアミドゲル（８Ｍ尿素（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）、２０％アクリルアミド：ビスアクリルアミド１９：１（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）、１×ＴＢＥ、１％ＡＰＳ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）、０．１％ ＴＥＭＥＤ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）；１８０Ｖ、２時間、Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）Ｔｅｔｒａ Ｃｅｌｌ（ＢｉｏＲａｄ））で分離した。１：１０，０００のＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＴＢＥ中で１０分間ゲルを染色し、３１２ｎｍ−ＵＶトランスイルミネータを備えるＥ−ＢＯＸ ＶＸ２ゲル撮影システム（Ｐｅｑｌａｂ）で撮影した（ＳＴＢＲ Ｇｏｌｄの励起極大：〜３００ｎｍ、発光：〜５３７ｎｍ）。
ｍＲＮＡ調製物におけるキャップ形成比率を求めるために、それぞれ１３ｍｅｒ（非キャップ形成画分由来）又は１４ｍｅｒ（キャップ形成画分由来）の切断産物のバンドを、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ １−Ｄ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を用いて定量した。
それぞれ、キャップＲＮＡ及び非キャップＲＮＡの程度を、以下に従って算出した：

４． 結果
図７から分かる通り、ホタルルシフェラーゼ（ＰｐＬｕｃ）ｍＲＮＡについては、標準的なＮＴＰミックス及び配列最適化ＮＴＰミックスで同等のキャップ形成効率が得られた。

実施例３：配列最適化ヌクレオチドミックスにおけるＵＴＰ及びシュードＵＴＰを用いたＲＮＡ収量の比較
４種のヌクレオチドＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰのうちの１以上をヌクレオチドアナログで置換することによって、インビトロ転写反応を実施することができる。かかる修飾ＮＴＰの例は、シュードウリジン（ｐｓＵ又はΨ）三リン酸及び５−メチルシチジン（５ｍＣ）三リン酸である。ミックス中の修飾ヌクレオチドの割合は、置き換えられる天然ヌクレオチドの０％〜１００％で変動し得る。

配列最適化ヌクレオチドミックスにおいてシュードウリジン（ｐｓＵ）三リン酸等の修飾ヌクレオチドを使用することが可能かどうかを試験するために、ＵＴＰを１０％及び１００％シュードウリジン三リン酸で置き換えた。対照反応では、１００％ＵＴＰを用いた。

キャップアナログの存在下における配列最適化インビトロ転写
配列最適化インビトロ転写反応については、全てのＮＴＰの合計濃度が標準的な転写反応と同様１３．４５ｍＭになるように、配列のヌクレオチド組成（表２）に従って各個々の配列についてのリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の濃度を算出した。キャップ／ＧＴＰ比が４：１になるように、キャップアナログの濃度をＧＴＰの算出濃度よりも４倍高くした。

結果
図８から分かる通り、キャップアナログを含む配列最適化ヌクレオチドミックス（ＣａｐＮＴＰミックス）中でＵＴＰ及びシュードＵＴＰを用いると、配列最適化ヌクレオチドミックス中のシュードＵＴＰの割合とは関係なく同等のＲＮＡ収量が得られる。これは、それぞれ、ムチン−１シグナルペプチド／上皮成長因子受容体／ムチン−１融合タンパク質（ＥＧＦＲ／ムチン−１）（Ｒ１６２６）及び前立腺幹細胞抗原（ＨｓＰＳＣＡ）ｍＲＮＡ（Ｒ１８７１）をコードしている２つの異なるｍＲＮＡについて立証された。

実施例４：標準的なヌクレオチドミックス及び配列最適化ヌクレオチドミックスを用いた理論ＲＮＡ収量及び実際ＲＮＡ収量の比較
実施例１の第２節に記載の通り、転写反応を組み立てた。ＮＴＰは、等しく分布していた（等モル）か又は実施例１の第５節に記載の通り、生成されるＲＮＡの配列に従って分布していた。幾つかの理由から、ＧＴＰに対して４：１の比で追加のヌクレオチド（ＧＴＰ又はキャップアナログ）を添加した。

結果
図９から分かる通り、Ｒ２０２５の実際ＲＮＡ収量は、標準的なＮＴＰミックス（等ＮＴＰミックス）と比べて配列最適化ＮＴＰミックスにおいて増加し得る。

図１０から分かる通り、ヒト前立腺幹細胞抗原をコードしているｍＲＮＡ（ＨｓＰＳＣＡ；Ｒ１８７１）の実際ＲＮＡ収量は、標準的なＮＴＰミックス（等ＮＴＰミックス）と比べて配列最適化ＮＴＰミックスにおいて増加し得る。

実施例５：ＲＮＡ収量に対するＮＴＰ対イオンの影響
ＲＮＡ収量に対するＮＴＰ対イオンの影響を、例としてヒトムチン−１シグナルペプチド／上皮成長因子受容体／ムチン−１融合タンパク質をコードしているｍＲＮＡ（ＥＧＦＲ／ムチン−１、Ｒ１６２６）を用いて調べた。配列最適化ＮＴＰ比及び合計ＮＴＰ濃度１３．４５ｍＭを用いて、実施例１の第２節に記載の通り転写反応を組み立てた。ＮＴＰは、対イオンとしてＮａ^＋又はＴｒｉｓ^＋（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有していた。更に、Ｎａ−ＮＴＰ反応には、様々な濃度のＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＮＴＰ反応には、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌを補充した。２．５時間の反応時間後、ＲＮＡを精製し、実施例１の第２節に記載の通り、その濃度を求めた。

結果
図１１から分かる通り、配列最適化ＮＴＰミックスを用いたヒトムチン−１シグナルペプチド／上皮成長因子受容体／ムチン−１融合タンパク質（ＥＧＦＲ／ムチン−１、Ｒ１６２６）のＲＮＡ収量は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ濃度１５０ｍＭまで略同じであった。対照的に、ＮａＣｌ濃度が７５ｍＭを超えると、ＲＮＡ収量が減少し始めた。

ＲＮＡ収量に対する高濃度ＮａＣｌの負の影響が報告されている（例えば、Ｋｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１３，７４７−７５６；米国特許第６，５８６，２１８号明細書）。したがって、特にＮＴＰ供給ストラテジーを押し進めた結果Ｎａ−ＮＴＰが高濃度になると、ＲＮＡ収量が減少する場合がある。この制約は、Ｔｒｉｓ−ＮＴＰによって回避できるが、その理由は、ポリメラーゼ活性が高濃度Ｔｒｉｓにはそれ程影響を受けないためである。

実施例６：転写反応の進行のモニタリング
配列最適化ＮＴＰ比及び合計ＮＴＰ濃度１３．４５ｍＭを用いて、実施例１の第２節に記載の通りヒト前立腺幹細胞抗原（ＨｓＰＳＣＡ；Ｒ１８７１）の大規模転写反応（３５０μＬ）を組み立てた。キャップアナログは、ＧＴＰに比べて４：１過剰に存在していた。所定の時点（反応開始の１５分間後／３０分間後／６０分間後／９０分間後／１２０分間後）で、サンプル２０μＬを採取し、ＲＮＡを精製し、その２６０ｎｍにおける吸光度を実施例１の第２節に記載の通り求めた。同時点で第２のサンプル４０μＬを採取し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ１０デバイス（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（１６，０００×ｇ、５分間、１７℃）で濾過した。未取り込みのキャップアナログ及びＮＴＰに対応する、２６０ｎｍにおけるフロースルーの吸光度を、製造業者の説明書に従ってＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）分光光度計を用いて求めた（Ｔ００９−Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００％ ８０００；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ，ＵＳＡ）。

結果
図１２から分かる通り、配列最適化リボヌクレオシドミックスを使用すると、所定の時点における合計残存ヌクレオチド濃度を求めることによって、インビトロ転写反応の進行を測定することが可能になる。合計ＮＴＰ濃度の低下は、合成されるＲＮＡ量と直接相関している。

したがって、転写反応の進行は、所与の時点において測定された合計ＮＴＰ濃度及び消費されたＮＴＰのモル数の算出の関数として正確に求めることができる。この情報に基づいて、合成されたＲＮＡの量を算出することができるようになる。

この手順は、例えば、転写反応器において、転写反応の進行を連続的にモニタリングするために特に有用である。標準的なＮＴＰミックスを用いた場合、これは不可能であるが、その理由は、ＮＴＰの消費が、合成されるＲＮＡの量を容易には反映しないからである。

実施例７：キャップ濃度の関数としての配列最適化ヌクレオチドミックスのＲＮＡ収量
実施例１の第２節に記載の通り転写反応を組み立て、図１４及び１５に示す通り、２ｍＭ、４ｍＭ、及び１３．４５ｍＭ ＮＴＰの合計ＮＴＰ濃度で実施した。ＮＴＰは、実施例１の第５節に記載の通り、生成されたＲＮＡの配列に従って分布していた（ＰｐＬｕｃ及びＨｓＰＳＣＡについての配列最適化リボヌクレオチドミックス）。図１４及び１５に示す通り、様々な濃度（０ｍＭ、０．２５ｍＭ、２．０ｍＭ、１０ｍＭ、１６ｍＭ、及び２０ｍＭ）のキャップアナログ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）で反応を実施した。

結果
図１３Ａから分かる通り、キャップアナログ濃度が高いほど、ＰｐＬｕｃ ｍＲＮＡの実際ＲＮＡ収量も増加する。合計ＮＴＰ濃度が４ｍＭの場合に比べて１３．４５ｍＭの方が、実際ＲＮＡ収量が高い。図１３Ｂは、キャップアナログ濃度約１６ｍＭまでＰｐＬｕｃ ｍＲＮＡの相対ＲＮＡ収量が増加することを示す。相対ＲＮＡ収量の増加は、高ＮＴＰ濃度（１３．４５ｍＭ）よりも低ＮＴＰ濃度（４ｍＭ）の方が大きい。

図１４Ａから分かる通り、キャップアナログ濃度が高いほど、ＨｓＰＳＣＡ ｍＲＮＡの実際ＲＮＡ収量も増加する。合計ＮＴＰ濃度が４ｍＭ及び２ｍＭの場合に比べて１３．４５ｍＭの方が、実際ＲＮＡ収量が高い。図１４Ｂは、キャップアナログ濃度約１６ｍＭまでＨｓＰＳＣＡ ｍＲＮＡの相対ＲＮＡ収量が増加することを示す。相対ＲＮＡ収量の最も大きな増加は、試験した中で最低のＮＴＰ濃度（２ｍＭ）においてみられる。

これら結果は、配列最適化リボヌクレオチドミックスの使用は、初期合計ヌクレオチド濃度が低い場合（例えば、２ｍＭ）でさえも、キャップＲＮＡ合成の効率を増大させることを示す。対照的に、ＲＮＡ収量を増大させるためには、高濃度の合計ヌクレオチド（約１２ｍＭ〜約４０ｍＭ）が必要であることが既に示唆されている（米国特許第６５８６２１８号明細書）。

ＰｐＬｕｃ ｍＲＮＡ（１，８７０ヌクレオチド）とＨｓＰＳＣＡ ｍＲＮＡ（５８９ヌクレオチド）との比較は、相対ＲＮＡ収量が、所定の合計ＮＴＰ濃度においてＲＮＡ長さとは無関係であることを示す。

実施例８：ＧＴＰ出発ヌクレオチド濃度の関数としての配列最適化ヌクレオチドミックスのＲＮＡ収量
実施例１の第２節に記載の通り転写反応を組み立て、Ｐ６２５、Ｐ１０４０、及びＰ５３２について配列最適化ヌクレオチドミックスの合計ＮＴＰ濃度１３．４５ｍＭで実施した。
ＮＴＰは、実施例１の第５節に記載の通り、生成されたＲＮＡの配列に従って分布していた（ＰｐＬｕｃ、ＨｓＰＳＣＡ、及びＥＧＦＲ／ムチン−１の配列最適化リボヌクレオチドミックス）。図１６〜１８に示す通り、所定の濃度（０ｍＭ、０．２５ｍＭ、２．０ｍＭ、１０ｍＭ、１６ｍＭ、及び２０ｍＭ）のＧＴＰ出発ヌクレオチドを配列最適化ＮＴＰミックスに添加することによって、反応を実施した。

結果
図１５Ａ及び１５Ｂから分かる通り、ＨｓＰＳＣＡ ｍＲＮＡの実際ＲＮＡ収量及び相対ＲＮＡ収量は、ＧＴＰ出発ヌクレオチド濃度約１０ｍＭまで増加し、それよりも高いＧＴＰ濃度では減少する。

図１６Ａ及び１６Ｂから分かる通り、ＰｐＬｕｃ ｍＲＮＡの実際ＲＮＡ収量及び相対ＲＮＡ収量は、ＧＴＰ出発ヌクレオチド濃度約１０ｍＭまで僅かに増加し、次いで、それよりも高いＧＴＰ濃度では減少する。

図１７Ａ及び１７Ｂから分かる通り、ＥＧＦＲ／ムチン−ｍＲＮＡの実際ＲＮＡ収量及び相対ＲＮＡ収量は、ＧＴＰ出発ヌクレオチド濃度約１０ｍＭまで増加し、それよりも高いＧＴＰ濃度では減少する。

これら結果は、配列最適化リボヌクレオチドミックス及び追加量の出発ヌクレオチドＧＴＰの使用により、ＧＴＰ出発ヌクレオチド濃度約１０ｍＭまでＲＮＡ合成の効率が増大することを立証する。

実施例９：バイオリアクタ
図１８は、本発明に係るバイオリアクタ１の好ましい実施形態の概略図を示す。図１８から、バイオリアクタ１のモジュラー構造が明らかになる。ここでは、バイオリアクタ１は、幾つかのバイオリアクタモジュール２、３、４、５からなる。反応モジュール１は、所与の配列のＲＮＡ分子を合成するための連続プロセス又は半バッチプロセスに用いられる反応容器である。反応モジュール２は、ＲＮＡ転写反応のテンプレートとして用いられる樹脂固定化ＤＮＡを含有する。ここでは、ＤＮＡを固定化することによって、テンプレートを繰り返し使用し、且つ任意の種類の残存ＤＮＡの所望のＲＮＡ生成物への夾雑を低減することができるようになる。更に、ＤＮＡテンプレートの固定化によって、末端ＤＮＡを分解するための酵素ＤＮＡｓｅの使用が不要になる。転写後、生成されたＲＮＡ分子をバッチ毎に又は連続的に捕捉モジュール３に放出することができる。捕捉モジュール３は、ＲＮＡ分子を捕捉し、転写反応の他の可溶性成分からＲＮＡを分離するための樹脂／固相を含む。その後、流出ライン等（不図示）を用いてバイオリアクタ１から受容ユニット等にＲＮＡ分子を分配することができ、前記受容ユニットにおいて、更なるＲＮＡの溶出及び精製を実施することができる。反応モジュール２と捕捉モジュール３との間の移行領域に接続されているそれぞれの洗浄及びバッファタンク３１を用いて、捕捉モジュール３に洗浄流体及び／又は溶出バッファを提供することができる

反応モジュール２における転写プロセスをモニタリング及び制御することができるようにするために、低分子量成分（例えば、ヌクレオチド）から高分子量成分（例えば、タンパク質及びポリヌクレオチド）を分離するための超濾過膜２１が反応モジュール２に提供されている。ＲＮＡ転写反応が実施される反応コア２２は、濾過された反応ミックスが受容される濾過区画２３から膜によって分離される。重要なプロセスパラメータとして用いられる、反応モジュール２の濾過区画２３における濾過された反応ミックス中のヌクレオチド濃度に基づいて、供給タンク２４から反応モジュール２へのヌクレオチド、バッファ成分、及び／又は酵素の供給を、供給ポンプ４３を用いて制御及び調節することができ、これによって、最適な定常状態条件でＲＮＡ転写反応を実施して高い転写性能を得ることが可能になる。測定手段として、反応ミックス中の反応パラメータを測定するためのセンサユニット４１が提供されている。ここで、センサユニット４１は、低分子量成分を含有する濾過された流体中に、ＵＶ２６０／２８０ｎｍ用ＵＶフローセル等の光分析用のセンサを少なくとも含み、前記濾過された流体は、濾過区画２３から抽出され、再循環ポンプ２５によって循環し、濾過区画２３に戻る。循環ラインでは、濾過区画２３内部の濾過された流体をリアルタイムにモニタリングするために、センサユニット４１のセンサが提供されている。バイオリアクタ１に配列最適化リボヌクレオチドミックスを適用することによって、反応モジュール２の反応コア２２におけるＲＮＡ転写反応中に、濾過区画２３におけるヌクレオチド濃度をリアルタイムで測定することができるようになる。センサユニット４１は、コントローラ４２と供給ポンプ４３の形態のアクチュエータとを更に含む制御モジュール４の一部である。コントローラ４２に測定シグナルを提供し、コントローラ４２から命令シグナルを受信するために、センサユニット４１及び供給ポンプ４３がコントローラ４２に接続されている。更に、濾過された流体のｐＨ値又は濾過された流体の伝導性等の他の重要なプロセスパラメータは、センサユニット４１の更なる好適なセンサによって分析することができる。通常コンピュータを利用するシステム等の形態であるコントローラ４２によりデータを収集し、解析することによって、ヌクレオチド、バッファ成分、及び／又は酵素を反応モジュール２に繰り返し供給するためのアクチュエータとしての供給ポンプ４３を制御できるようになると共に、最適な定常状態条件における重要なプロセスパラメータを調整するために、バイオリアクタ１における更なるポンプを制御できるようになる。

浪費を防ぐために、好ましい実施形態のバイオリアクタ１は、捕捉モジュール３に接続されている逆流モジュール５を更に含み、前記逆流モジュール５は、未使用の原材料（例えば、ヌクレオチド及び酵素）を回収し、逆流ポンプ５１を用いてそれを反応モジュール２に再循環させる。逆流モジュール５は、破壊成分（例えば、ホスフェート）を捕捉するための固定化酵素（例えば、ピロホスファターゼ）又は樹脂を含む。

本発明の上記実施形態及び添付図面は、単なる例示を意図するものであり、限定するものと解釈すべきではないが、その理由は、本発明の範囲から逸脱することなしに添付の特許請求の範囲内で、記載した本発明を改変することができるためである。

実施例１０：ＲＮＡ分子の免疫賦活活性
この実施例では、配列最適化ＮＴＰミックス及び標準的な等モルＮＴＰミックスを用いて合成したＲＮＡ分子の免疫賦活性を比較した。免疫賦活は、ｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞の上清中のサイトカイン及びケモカインのレベルを測定することによって求めた。

ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ｐＰｌｕｃ）について、標準的なインビトロ転写反応及び配列最適化インビトロ転写反応を実施例１に記載の通り実施した。
次いで、前記ｍＲＮＡをＬｉＣｌ沈殿によって精製した。

免疫賦活アッセイ
６ウェルプレートの、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び１００ＩＵ／ｍＬ ペニシリン／ストレプトマイシン（全てＬｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）並びに１０％ウシ胎児血清（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加したＧｉｂｃｏ（登録商標）ＲＰＭＩ１６４０培地からなるＨｅＬａ細胞培養培地２ｍＬに、４×１０^５細胞／ウェルの密度でＨｅＬａ細胞を播種した。次の日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号１１６６８−０２７）を用いて、細胞にＲＮＡ２μｇ又はネガティブコントロールとしての注射用水（ＷＦＩ）をトランスフェクトした。簡潔に述べると、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）及びＲＮＡを、それぞれＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で希釈し、１：１．５のＲＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）比で合わせ、室温で２０分間インキュベートした。ネガティブコントロールは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）と混合したＲＮＡの代わりにＷＦＩを含有していた。一方、細胞を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加したＧｉｂｃｏ（登録商標）ＲＰＭＩ１６４０培地（無血清且つペニシリン／ストレプトマイシン不含培地）２ｍＬで１回洗浄し、無血清且つペニシリン／ストレプトマイシン不含培地２ｍＬを前記細胞に添加し、次いで、ＲＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）トランスフェクションミックス０．５ｍＬを添加した。３７℃及び５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、トランスフェクションミックスを含有する培地をＨｅＬａ細胞培養培地２ｍＬに置き換えた。
２４時間後、無細胞上清を回収し、以下のキットを用いて製造業者の説明書（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従ってサイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）によりＩＬ−６、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ５の濃度を測定した：Ｈｕｍａｎ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ Ｋｉｔ（カタログ番号５５８２６４）、Ａｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ（カタログ番号５６０１０４）、Ｈｕｍａｎ ＩＬ−６ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ（カタログ番号５５８２７６）、Ｈｕｍａｎ ＣＸＣＬ１０ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ（カタログ番号５５８２８０）、及びＨｕｍａｎ ＣＣＬ５ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ（カタログ番号５５８３２４）（全てのキットはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）。ＦＣＡＰ Ａｒｒａｙ ｖ３．０ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを解析した。

結果
図１９から分かる通り、分泌されたＩＬ−６、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ５のレベルは、標準的な等モルＮＴＰミックスを用いて合成されたＲＮＡに比べて、配列最適化ＮＴＰミックスを用いて合成された同ＲＮＡの方が低かった。これは、配列最適化ＮＴＰミックスから得られたＲＮＡの免疫賦活活性の方が低いことを示す。

実施例１１：バイオリアクタにおけるインビトロ転写
インビトロ転写に用いられるＤＮＡの調製（Ｐ１１４０）：
以下のエレメントをＤＮＡベクター（ｐＣＶ３２（ＫａｎＲ））に挿入することによってインビトロ転写用のＤＮＡベクター（Ｐ１１４０）を調製した：
５’ＵＴＲ：３２Ｌ４（Ｔｏｐ−ＵＴＲ）
ＯＲＦ：Ｈ１Ｎ１（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ２００９）由来のＨＡ（ＧＣリッチ）
３’ＵＴＲ：Ａｌｂｕｍｉｎ７。

得られたＤＮＡベクターのインビトロ転写から、２，０８３ヌクレオチド長を有するＲＮＡ分子が得られる。それぞれのＲＮＡ配列（配列番号６）を図２０に示す。

ＲＮＡコンストラクトは、以下のヌクレオチド組成を特徴とする：
Ｇ＝５４０（２５，９２％）
Ｃ＝６７６（３２，４５％）
Ａ＝５４１（２５，９７％）
Ｕ＝３２６（１５，６５％）
Ｇ／Ｃ＝５８，３７％。

ＤＮＡベクターの線状化：
以下の条件を用いてプラスミドＰ１１４０を線状化した：
０．５μｇ プラスミドＤＮＡ
１．５μＬ １０×反応バッファ
１μＬ ＥｃｏＲＩ
１５μＬになるまでＷＦＩ（注射用水）を添加。

反応物を３７℃で３時間インキュベートした。次いで、フェノール／クロロホルム抽出及びイソプロパノール沈殿を実施した。

インビトロ転写：
標準的なキャップ／ＮＴＰミックス

ＮＴＰ及びキャップの算出：
標準的な転写反応で用いたのと同じ合計ＮＴＰ濃度１３．４５ｍＭを配列最適化転写にも用いる。キャップアナログについてはＧＴＰの４倍量を用いる。

Ｐ１１０４０用の配列最適化キャップ／ＮＴＰミックスの調製：

５×転写バッファ：
４００ｍＭ ＨＥＰＥＳ
１２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２
１０ｍＭ スペルミジン
２００ｍＭ ＤＴＴ
２５Ｕ／ｍＬ 無機ピロホスファターゼ。

４つの異なる転写反応をバイオリアクタ内で試験した：
バイオリアクタとして、Ｄａｓｇｉｐ製のＤａｓＢｏｘ Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒを用いた。反応物を５０ｒｐｍで撹拌した。指定の時点で、サンプルをそれぞれ２０μＬ取り出した。ＬｉＣｌ沈殿後、２６０ｎｍにおける吸収を求めることによってＲＮＡ濃度を測定した。

インビトロ転写に４つの異なる条件を用いた：

１． 標準的なＮＴＰミックスを用いる転写

転写反応を３７℃で３時間インキュベートした。

次いで、ＤＮＡｓｅＩ（１ｍｇ／ｍＬ）６μＬ及びＣａＣｌ_２溶液（０．１Ｍ）／μｇ（ＤＮＡテンプレート）０．２μＬを転写反応に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。

２． 配列最適化転写（１．５時間、供給無し）

転写反応を３７℃で１．５時間インキュベートした。

次いで、ＤＮＡｓｅＩ（１ｍｇ／ｍＬ）６μＬ及びＣａＣｌ_２溶液（０．１Ｍ）／μｇ（ＤＮＡテンプレート）０．２μＬを転写反応に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。

３． 配列最適化転写（供給有り）

転写反応を３７℃で１．５時間インキュベートした。

１．５時間後、配列最適化キャップ／ＮＴＰミックス１２９３４．６μＬ及び５×転写バッファを添加した。転写反応を３７℃で更に１．５時間インキュベートした。

次いで、ＤＮＡｓｅＩ（１ｍｇ／ｍＬ）６μＬ及びＣａＣｌ２溶液（０．１Ｍ）／μｇ（ＤＮＡテンプレート）０．２μＬを転写反応に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。

４． Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ濃度及びテンプレート濃度を低下させた配列最適化転写

結果：
配列最適化転写ミックスにおける転写によって、標準的な条件下における転写と比べて高濃度の転写ＲＮＡが得られる（図２１、ＴＳ（１））。ヌクレオチド及び転写バッファを更に供給すると、転写ＲＮＡ量が更に増加した（図２１、ＴＳ（３））。

発現及び免疫賦活：
６ウェルプレートの、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び１００ＩＵ／ｍＬ ペニシリン／ストレプトマイシン（全てＬｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）並びに１０％ウシ胎児血清（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加したＧｉｂｃｏ（登録商標）ＲＰＭＩ１６４０培地からなるＨｅＬａ細胞培養培地２ｍＬに、４×１０^５細胞／ウェルの密度でＨｅＬａ細胞を播種した。次の日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号１１６６８−０２７）を用いて、細胞に様々な濃度のＲＮＡ２μｇ又はネガティブコントロールとしての注射用水（ＷＦＩ）をトランスフェクトした。簡潔に述べると、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬及びＲＮＡを、それぞれＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で希釈し、１：１．５のＲＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）比で合わせ、室温で２０分間インキュベートした。ネガティブコントロールは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と混合したＲＮＡの代わりにＷＦＩを含有していた。一方、細胞を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加したＧｉｂｃｏ（登録商標）ＲＰＭＩ１６４０培地（血清及びペニシリン／ストレプトマイシン不含培地）２ｍＬで１回洗浄し、血清及びペニシリン／ストレプトマイシン不含培地２ｍＬを前記細胞に添加し、次いで、ＲＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）トランスフェクションミックス０．５ｍＬを添加した。３７℃及び５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした後、トランスフェクションミックスを含有する培地を除去し、ＨｅＬａ細胞培養培地２ｍＬを添加した。

２４時間後、上清及び細胞を回収した。

タンパク質発現：
フローサイトメトリー分析を用いてＨＡタンパク質の表面発現を決定した。付着しているＨｅＬａ細胞をＰＢＳ１ｍＬで１回洗浄し、トリプシン不含分離バッファ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７，５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて収集した。前記細胞をマウスモノクローナル抗ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）抗体（Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）と共にインキュベートし、次いで、二次抗マウスＦＩＴＣコンジュゲート抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共にインキュベートした。前記細胞をＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏで測定し、ＦｌｏｗＪｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．６を用いて分析した。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０１を用いて統計解析を実施した。

結果：
配列最適化反応ミックス中で転写されたＲＮＡ（図２２、ＴＳ（２）、ＴＳ（３）、ＴＳ（４））からは、標準的な条件下で転写されたＲＮＡよりも、コードＨＡタンパク質が高発現した（図２２、ＴＳ（１））。

免疫賦活：
以下のキットを用いて製造業者の説明書（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従ってサイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）により、無細胞上清中のＩＬ−６、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ５の濃度を測定した：

ＦＣＡＰ Ａｒｒａｙ ｖ３．０ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを解析した。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０１を用いて統計解析を実施した。

結果：
標準的な条件下で転写されたＲＮＡ（図２３、ＴＳ１）は、配列最適化反応ミックス中で転写されたＲＮＡ（図２３、ＴＳ２、ＴＳ３、ＴＳ４）と比べて、Ｈｅｌａ細胞においてより高レベルのサイトカインＩＬ−６、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ５を誘導した。

Claims (52)

1. 所与の配列のＲＮＡ分子を合成する方法であって、
   ａ）前記ＲＮＡ分子における４種のヌクレオチドＧ、Ａ、Ｃ、及びＵの各割合（１）を求める工程と、
   ｂ）配列最適化反応ミックス中でインビトロ転写によって前記ＲＮＡ分子を合成する工程であって、前記配列最適化反応ミックスが、４種のリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰを含み、前記配列最適化反応ミックス中の前記４種のリボヌクレオシド三リン酸の各割合（２）が、前記ＲＮＡ分子、バッファ、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼ中の各ヌクレオチドの割合（１）に対応する工程と
   を含むことを特徴とする方法。
2. 前記工程ｂ）が、
   ｂ１）前記４種のリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰを含む配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスを調製する工程であって、前記配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックス中の前記４種のリボヌクレオシド三リン酸の各割合（２）が、前記ＲＮＡ分子中の各ヌクレオチドの割合（１）に対応する工程と、
   ｂ２）工程（ｂ１）の前記ＮＴＰミックス、バッファ、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼを含む配列最適化反応ミックス中でインビトロ転写によって前記ＲＮＡ分子を合成する工程と
   を含む請求項１に記載の方法。
3. 前記インビトロ転写の開始前に、前記ＲＮＡ分子の第１のヌクレオチドに対応する出発ヌクレオチドを前記配列最適化反応ミックスに添加する請求項１から２のいずれかに記載の方法。
4. 前記出発ヌクレオチドが、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、又はジヌクレオシド三リン酸である請求項３に記載の方法。
5. 前記出発ヌクレオチドが、キャップアナログである請求項３に記載の方法。
6. 前記出発ヌクレオチドが、前記ＲＮＡ分子の第１の位置にみられる前記ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドの割合に比べて過剰に添加される請求項３から５のいずれかに記載の方法。
7. 前記ＲＮＡ分子の前記第１のヌクレオチドに対応しないヌクレオチドについて、前記割合（１）と前記割合（２）との差が最大１０％である請求項１から６のいずれかに記載の方法。
8. 少なくとも１つのリボヌクレオシド三リン酸の一部又は全てが、修飾ヌクレオシド三リン酸によって置換されている請求項１から７のいずれかに記載の方法。
9. 前記修飾ヌクレオシド三リン酸が、シュードウリジン−５’−トリホスフェート、１−メチルシュードウリジン−５’−トリホスフェート、２−チオウリジン−５’−トリホスフェート、４−チオウリジン−５’−トリホスフェート、及び５−メチルシチジン−５’−トリホスフェートからなる群から選択される請求項８に記載の方法。
10. 前記インビトロ転写の過程で、請求項２のｂ１）に記載の前記配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスを前記配列最適化反応ミックスに補充する請求項１から９のいずれかに記載の方法。
11. 前記ＲＮＡ分子が、非コードＲＮＡ分子及びコードＲＮＡ分子からなる群から選択される請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
12. 前記ＲＮＡ分子が、ｍＲＮＡである請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
13. 前記ＲＮＡ分子が、１００ヌクレオチドよりも長い請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
14. 所与の配列のＲＮＡ分子の合成が、大規模合成で実施される請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
15. 前記ＮＴＰの対イオンが、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（Ｔｒｉｓ）である請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
16. インビトロ転写による前記ＲＮＡ分子の合成後に、未取り込みＮＴＰを分離及び定量する請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
17. インビトロ転写による前記ＲＮＡ分子の合成が、バイオリアクタ（１）内で実施される請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
18. 前記バイオリアクタ（１）が、固体担体に固定化されているＤＮＡテンプレートを含む請求項１７に記載の方法。
19. 前記バイオリアクタ（１）が、前記配列最適化反応ミックスからヌクレオチドを分離するための濾過膜（２１）を含む請求項１７から１８のいずれかに記載の方法。
20. 前記濾過膜（２１）が、再生セルロース、変性セルロース、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、及びポリアリールエーテルスルホン（ＰＡＥＳ）の群から選択される請求項１９に記載の方法。
21. 前記濾過膜（２１）が、約１０ｋＤａ〜約５０ｋＤａの範囲の分子量カットオフを有する請求項１９から２０のいずれかに記載の方法。
22. 前記バイオリアクタ（１）が、反応中のヌクレオチド濃度をリアルタイムに測定するためのセンサユニット（４１）を含む請求項１７から２１のいずれかに記載の方法。
23. 前記センサユニット（４１）が、光分析によって前記ヌクレオチド濃度を測定する請求項２２に記載の方法。
24. 前記バイオリアクタが、請求項２のｂ１）に記載の前記配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスの添加を制御する制御モジュール（４）を含む請求項１７から２３のいずれかに記載の方法。
25. 前記バイオリアクタ（１）が、請求項２のｂ１）に記載の前記配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスを添加するアクチュエータ（４３）を含む請求項１７から２４のいずれかに記載の方法。
26. 前記バイオリアクタ（１）が、前記ＲＮＡ分子を捕捉し、転写反応ミックスの他の成分から前記ＲＮＡ分子を分離するための樹脂を含む請求項１７から２５のいずれかに記載の方法。
27. 前記バイオリアクタ（１）が、半バッチモード又は連続モードで動作する請求項１７から２６のいずれかに記載の方法。
28. 前記バイオリアクタ（１）が、少なくとも１つのイオン選択性電極を含む請求項１７から２７のいずれかに記載の方法。
29. 前記少なくとも１つのイオン選択性電極が、前記バイオリアクタ（１）の少なくとも１つの区画に含まれる液体中の１種以上のイオンの濃度を測定するために用いられる請求項２８に記載の方法。
30. 前記イオンが、Ｈ^＋、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｃｌ⁻、及びＰＯ_４ ^３−からなる群から選択される請求項２９に記載の方法。
31. 請求項１から３０のいずれかに記載の方法によって得ることができることを特徴とするＲＮＡ分子。
32. 所与の配列のＲＮＡ分子を合成するために前記ＲＮＡ分子用に最適化されていることを特徴とする配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスの使用。
33. 前記配列最適化ＮＴＰミックスが、
    ａ）前記ＲＮＡ分子中の４種のヌクレオチドＧ、Ａ、Ｃ、及びＵの各割合（１）を求める工程と、
    ｂ）４種のリボヌクレオシド三リン酸ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰを含む配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスを調製する工程であって、前記配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックス中の前記４種のリボヌクレオシド三リン酸の各割合（２）が、前記ＲＮＡ分子中の各ヌクレオチドの割合（１）に対応する工程と
    を含む方法によって最適化されている請求項３２に記載の使用。
34. 少なくとも１つのリボヌクレオシド三リン酸の一部又は全てが、修飾ヌクレオシド三リン酸によって置換されている請求項３２から３３のいずれかに記載の使用。
35. 前記修飾ヌクレオシド三リン酸が、シュードウリジン−５’−トリホスフェート、１−メチルシュードウリジン−５’−トリホスフェート、２−チオウリジン−５’−トリホスフェート、４−チオウリジン−５’−トリホスフェート、及び５−メチルシチジン−５’−トリホスフェートからなる群から選択される請求項３２から３４のいずれかに記載の使用。
36. ４種のヌクレオシド三リン酸ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰを含む、所与の配列のＲＮＡ分子を合成するための配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスであって、前記配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックス中の前記４種のリボヌクレオシド三リン酸の各割合（２）が、前記ＲＮＡ分子中の各ヌクレオチドの割合（１）に対応することを特徴とするミックス。
37. 請求項３２に記載の所与の配列のＲＮＡ分子用に最適化された配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックス又はその成分を含むことを特徴とするキット。
38. 所与の配列のＲＮＡ分子を合成するためのバイオリアクタ（１）であって、
    ｉ）請求項１のｂ）に記載の配列最適化反応ミックス中でインビトロ転写反応を実施するための反応モジュール（２）と、
    ｉｉ）転写された前記ＲＮＡ分子を一時的に捕捉するための捕捉モジュール（３）と、
    ｉｉｉ）前記配列最適化反応ミックスの成分の前記反応モジュール（２）への送り込みを制御するための制御モジュール（４）と
    を含み、
    前記反応モジュール（２）が、前記配列最適化反応ミックスからヌクレオチドを分離するための濾過膜（２１）を含み、
    前記制御モジュール（４）による前記配列最適化反応ミックスの成分の送り込みの制御が、分離されたヌクレオチドの測定濃度に基づくことを特徴とするバイオリアクタ（１）。
39. 前記濾過膜（２１）が、低分子量成分から高分子量成分を分離するための超濾過膜（２１）であり、好ましくは、前記濾過膜（２１）が、１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜７５ｋＤａ、１０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、１０ｋＤＡ〜２５ｋＤＡ、又は１０ｋＤａ〜１５ｋＤａの範囲の分子量カットオフを有し、更に好ましくは、前記濾過膜が、約１０ｋＤａ〜約５０ｋＤａの範囲の分子量カットオフ値を有する請求項３８に記載のバイオリアクタ（１）。
40. 前記濾過膜（２１）が、再生セルロース、変性セルロース、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、及びポリアリールエーテルスルホン（ＰＡＥＳ）の群から選択される請求項３８から３９のいずれかに記載のバイオリアクタ（１）。
41. 前記反応モジュール（２）が、ＲＮＡ転写反応の基礎として固体担体に固定化されているＤＮＡテンプレートを含む請求項３８から４０のいずれかに記載のバイオリアクタ（１）。
42. 前記捕捉モジュール（３）が、転写ＲＮＡ分子を捕捉し、転写反応ミックスの他の可溶性成分から前記転写ＲＮＡ分子を分離するための樹脂を含む請求項３８から４１のいずれかに記載のバイオリアクタ（１）。
43. 前記捕捉モジュール（３）が、捕捉された転写ＲＮＡ分子を精製するための手段（３１）を含む請求項３８から４２のいずれかに記載のバイオリアクタ（１）。
44. 前記捕捉モジュール（３）が、好ましくは溶出バッファを用いて、前記捕捉された転写ＲＮＡ分子を溶出するための手段（３１）を含む請求項３８から４３のいずれかに記載のバイオリアクタ（１）。
45. 前記バイオリアクタ（１）が、前記転写ＲＮＡ分子を捕捉した後、濾過された残存反応ミックスを前記捕捉モジュール（３）から前記反応モジュール（２）に戻すための逆流モジュール（５）を更に含み、好ましくは、前記濾過された残存反応ミックスを戻すための手段（５１）が、ポンプ（５１）である請求項３８から４４のいずれかに記載のバイオリアクタ（１）。
46. 前記逆流モジュール（５）が、破壊成分を捕捉するための固定化酵素又は樹脂を含む請求項４５に記載のバイオリアクタ（１）。
47. 前記制御モジュール（４）が、反応中に分離されたヌクレオチドの濃度をリアルタイムに測定するためのセンサユニット（４１）を含む請求項３８から４６のいずれかに記載のバイオリアクタ（１）。
48. 前記センサユニット（４１）が、前記分離されたヌクレオチドの濃度を光分析によって転写反応パラメータとして測定する請求項４７に記載のバイオリアクタ（１）。
49. 前記センサユニット（４１）が、濾過された反応ミックス中の更なる転写反応パラメータを測定し、好ましくは、前記更なる転写反応パラメータが、ｐＨ値及び／又は塩分である請求項４８に記載のバイオリアクタ（１）。
50. 前記制御モジュール（４）が、請求項３２に記載の前記配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスの前記配列最適化反応ミックスへの添加を制御し、好ましくは、前記バイオリアクタ（１）が、前記配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスを前記配列最適化反応ミックスに添加するためのアクチュエータ（４３）を含む請求項３８から４９のいずれかに記載のバイオリアクタ（１）。
51. 前記バイオリアクタ（１）が、半バッチモード又は連続モードで動作する請求項３８から４９のいずれかに記載のバイオリアクタ（１）。
52. 前記バイオリアクタ（１）が、請求項１から３０のいずれかに記載の方法を実施するようにされる請求項３８から４９のいずれかに記載のバイオリアクタ（１）。