JP2017517266A5

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Publication number: JP2017517266A5
Application number: JP2016572447A
Authority: JP
Filing date: 2015-06-10
Publication date: 2018-05-31
Anticipated expiration: 2035-06-10

Claims

所与の配列のＲＮＡ分子を合成する方法であって、
ａ）前記ＲＮＡ分子における４種のヌクレオチドＧ、Ａ、Ｃ、及びＵの各割合（１）を求める工程と、
ｂ）配列最適化反応ミックス中でインビトロ転写によって前記ＲＮＡ分子を合成する工程であって、前記配列最適化反応ミックスが、４種のリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ
）ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰを含み、前記配列最適化反応ミックス中の前記４種のリボヌクレオシド三リン酸の各割合（２）が、前記ＲＮＡ分子、バッファ、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼ中の各ヌクレオチドの割合（１）に対応する工程と
を含むことを特徴とする方法。
前記工程ｂ）が、
ｂ１）前記４種のリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰを含む配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスを調製する工程であって、前記配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックス中の前記４種のリボヌクレオシド三リン酸の各割合（２）が、前記ＲＮＡ分子中の各ヌクレオチドの割合（
１）に対応する工程と、
ｂ２）工程（ｂ１）の前記ＮＴＰミックス、バッファ、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼを含む配列最適化反応ミックス中でインビトロ転写によって前記ＲＮＡ分子を合成する工程と
を含む請求項１に記載の方法。
前記インビトロ転写の開始前に、前記ＲＮＡ分子の第１のヌクレオチドに対応する出発ヌクレオチドを前記配列最適化反応ミックスに添加する請求項１から２のいずれかに記載の方法。
前記出発ヌクレオチドが、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、又はジヌクレオシド三リン酸、若しくはキャップアナログである請求項３に記載の方法。
前記出発ヌクレオチドが、前記ＲＮＡ分子の第１の位置にみられる前記ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドの割合に比べて過剰に添加される請求項３から４のいずれかに記載の方法。
前記ＲＮＡ分子の前記第１のヌクレオチドに対応しないヌクレオチドについて、前記割合（１）と前記割合（２）との差が最大１０％である請求項１から５のいずれかに記載の方法。
少なくとも１つのリボヌクレオシド三リン酸の一部又は全てが、修飾ヌクレオシド三リン酸によって置換されており、前記修飾ヌクレオシド三リン酸が、好ましくは、シュードウリジン−５’−トリホスフェート、１−メチルシュードウリジン−５’−トリホスフェート、２−チオウリジン−５’−トリホスフェート、４−チオウリジン−５’−トリホスフェート、及び５−メチルシチジン−５’−トリホスフェートからなる群から選択される請求項１から６のいずれかに記載の方法。
前記インビトロ転写の過程で、請求項２のｂ１）に記載の前記配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスを前記配列最適化反応ミックスに補充する請求項１から７のいずれかに記載の方法。
前記ＲＮＡ分子が、非コードＲＮＡ分子及びコードＲＮＡ分子からなる群から選択され、好ましくはｍＲＮＡである請求項１から８のいずれかに記載の方法。
前記ＲＮＡ分子が、１００ヌクレオチドよりも長い、及び／又は所与の配列のＲＮＡ分子の合成が、大規模合成で実施される、及び／又は前記ＮＴＰの対イオンが、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（Ｔｒｉｓ）である請求項１から９のいずれかに記載の方法。
インビトロ転写による前記ＲＮＡ分子の合成後に、未取り込みＮＴＰを分離及び定量する請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
インビトロ転写による前記ＲＮＡ分子の合成が、バイオリアクタ（１）内で実施され、前記バイオリアクタ（１）が、好ましくは、固体担体に固定化されているＤＮＡテンプレートを含む請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
前記バイオリアクタ（１）が、前記配列最適化反応ミックスからヌクレオチドを分離するための濾過膜（２１）を含み、前記濾過膜（２１）が、好ましくは、再生セルロース、変性セルロース、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、及びポリアリールエーテルスルホン（ＰＡＥＳ）の群から選択される請求項１２に記載の方法。
前記濾過膜（２１）が、約１０ｋＤａ〜約５０ｋＤａの範囲の分子量カットオフを有する請求項１３に記載の方法。
前記バイオリアクタ（１）が、反応中のヌクレオチド濃度をリアルタイムに測定するためのセンサユニット（４１）を含み、前記センサユニット（４１）が、好ましくは、光分析によって前記ヌクレオチド濃度を測定する請求項１２から１４のいずれかに記載の方法。
前記バイオリアクタが、請求項２のｂ１）に記載の前記配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスの添加を制御する制御モジュール（４）を含む、及び／又は前記バイオリアクタ（１）が、請求項２のｂ１）に記載の前記配列最適化リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスを添加するアクチュエータ（４３）を含む、及び／又は前記バイオリアクタ（１）が、前記ＲＮＡ分子を捕捉し、転写反応ミックスの他の成分から前記ＲＮＡ分子を分離するための樹脂を含む、及び／又は前記バイオリアクタ（１）が、半バッチモード又は連続モードで動作する請求項１２から１５のいずれかに記載の方法。
前記バイオリアクタ（１）が、少なくとも１つのイオン選択性電極を含み、前記少なくとも１つのイオン選択性電極が、好ましくは、前記バイオリアクタ（１）の少なくとも１つの区画に含まれる液体中の１種以上のイオンの濃度を測定するために用いられ、前記イオンが、好ましくは、Ｈ ^＋、Ｎａ ^＋、Ｋ ^＋、Ｍｇ ^２＋、Ｃａ ^２＋、Ｃｌ ⁻ 、及びＰＯ _４ ^３− からなる群から選択される請求項１２から１６のいずれかに記載の方法。