JP2023528586A - Rnaを用いた治療薬の合成方法及び合成モジュール式装置 - Google Patents
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Abstract
液流装置によるRNA合成方法。本方法は、少なくとも1種類のヌクレオシド三リン酸(NTP)、反応緩衝液及びDNA、DNA系化合物又はDNA系混合物を含む複数の反応剤を複数の流入ポートを介して第1の液流モジュールに導入するステップと、反応剤の少なくともいくつかをフローシステムの第1のモジュール中の反応流路内又はウェル内で反応させるステップと、第1のリアクタモジュールでDNAを滞留させるか再循環させて、反応剤の反応生成物を第1の流体ろ過モジュールに流入させるステップと、第1のろ過モジュール中で反応生成物をろ過するステップとを含む。
Description
本発明はRNA合成の方法に関し、特に、連続RNA合成、自動RNA合成又は半自動RNA合成に用いられ、規模を変更することが可能であり、モジュール化された液流システム及び液流方法に関するが、これに限定されない。
フローリアクタ(連続フローリアクタとも称される)は、液の通路を形成するように接続された導管の導管網を通る材料又は反応剤の連続フローを提供するものである。フローシステムの混合用反応ろ過モジュールを組んだ場合にポートとバルブとにより液通路を有効にしたり無効にしたりすることによる導管網の様々な構成を通じて連通を有効にして、連続フロー形式の生成物の製造のためにRNA治療薬又は核酸治療薬に関する合成、精製及び製剤の状態を制御する。目的を持って作成されたソフトウェアコードをコンピュータシステムによって動作させることで、フローシステム中でプロセスパラメータの全集合の制御の指示を行なうことができる。プロセスパラメータは混合状態、温度、pH、薬剤濃度(reagent concentration)、モニタリング、滞留時間、純度プロファイル、産出量などを含む。先行技術のフローリアクタの例は、典型的には、液の流れを管理する単位ブロックを形成するように面と面とを合わせて接続される個々のモジュールの組立体として形成されるものである。フローリアクタの例は国際公開公報第2013/050764号に記載されている。
フロー技術によって医薬品製造の点でより持続可能で柔軟で効果的な製造が提供される。微細技術及び精密工学フローシステムと組み合せたものを、混合、反応合成、抽出、分離、ろ過や精製などの複数の単位操作を一体化する微細工場として構築及び構成することができる。さらに、フロー混合反応システムに特有である小さい体積対表面積比によって、熱及び質量の移動に対してプロセス状態の正確な制御が可能になり、これにより、小さい装置占有面積でプロセスが高速化され、生産性が向上する。これらの単位操作を組み合せる一体化フローシステムを、使用工場のフロア空間を削減し、エネルギー消費量を抑え、リソース利用率を改善する微細工場や小型化製造システムとみなすことができる。したがって、今日予防ワクチンとして物質の製造に一般的に用いられている現行の製造システムと比較してより優れた環境的影響、費用対効果及び柔軟性を備えつつ、持続可能な成長を実現することができる。
ラボオンチップ(LOC)デバイスを用いることが多くなっている分子生物学及びバイオテクノロジにはいくつかのプロトコールが存在する。このようなLOCデバイスでは、小型化して実験室での解析アッセイ法を統合し、微小規模での合成や微小規模でのろ過を微小チップに入れ込むことを行なうのに微細製造を用いる。これらの微小デバイスの材料の消費は少なく、無駄の発生が少なく、コストが抑えられ、応答時間も速くすることができる。マイクロミキサ、微細流路、フィルタを流れる液流を管理することによって所定のプロトコールの様々な工程をLOCデバイスに集約することができ、セルソーティング、混合を可能にすることができ、たとえばDNA又はRNAの合成のための反応が起こることを可能にすることができる。LOCデバイスが反応を起こさない材料で形成され、チップにおけるリアルタイムの反応の目視による検査を可能にするために好ましくは透明であることが重要である。また、デバイスが透明であることで、スペクトル解析とスペクトルによる検討とを可能にすることができる。このような用途の試作品を迅速に作製するのに用いられる好ましい材料はPDMS(ポリジメチルシロキサン(Polydimethylsiloxane))である。
2019年に、世界保健機関はグローバルヘルスに対する10の世界的な脅威を特定した。これらの10の脅威のうちの8つはパンデミックと、特にLMIC(低中所得国(low-and medium-income countries))におけるワクチンの接種のし易さとに対処するものであり、エボラやデング熱などのパンデミックは人口に影響を与える(性質を持つ)ものである。
したがって、大量合成、低コスト及び迅速なバルク合成という要求に応ずることができるワクチンとワクチン前駆体の製造時の使用に適する装置及び方法が緊急に必要である。特に、緊急(すなわち数日以内)のワクチン需要を満たすのに用いることができ、保管と世界中への展開とが容易であり、生産性が高く、実行するのに費用対効果が高い化合物製造プラットフォームが必要である。
したがって、本発明の目的は、特にRNA系ワクチンやその他核酸治療薬を含む化合物並びに生体分子及び非生体分子の規模の変更が可能な合成及び/又はろ過を行なうことができるモジュール式製造プラットフォームを提供することである。本発明の特に目的とするものは、核酸系ワクチン製品の調製に用いられる、構成を変更可能な統合化微細工場フローシステムを提供することである。
本開示では、たとえば病院の設置物において使用時にRNA及び核酸物質を高速に最終段階まで製造する、構成を変更可能でありかつ高度な規模変更が可能である方法を含む前記方式及び実験室プロトコールから影響を受けたモジュール式の統合化デバイスを提供する。
特に、本システムはフローリアクタ部、「連続」ろ過部及び混合部の組合せを含む。これらの部位を目標RNA、核酸治療薬や予防ワクチンに適する任意の順序で統合してもよい。本統合化フローシステムは、連続フロープロセスにおける目標物質の合成又は製造のインサイツ制御及びライン内制御に用いられる紫外可視吸光度又は蛍光分光用の光ファイバプローブ、ディテクタ及び光源を含むいくつかの適宜選択可能な解析プローブを含んでもよい。
具体的な目的は、連続的に動作させることができ、本明細書から理解されるであろうが、膜、ポンプなどの構成要素のアクチュエータ、バルブ、ゲート、供給ポート、流出ポート、シリンジポンプ、センサなどの使用に関与する電子制御ユーティリティ及び/又はソフトウェア制御ユーティリティを用いて自動化することができる、対応する導管/流路を介して接続されて連続液流経路を形成する液流バイオリアクタモジュールと液流ろ過モジュールとを含むモジュールを統合するマイクロ流体力学に基づく装置及び方法を提供することである。
具体的な目的は、連続的でも非連続的でもよく、自動化されても半自動化されてもよいプロセスによる生体分子や非生体分子などの既定の化学成分の反応合成に用いられる液流システムを提供することである。別の具体的な目的は、合成経路に応じて個々のモジュールユニットを接続することができるモジュール式システムを提供することである。このようなユニットはそれぞれのモジュールの間の連通及び接続を可能にするポート、バルブや適切な接続部を含んでもよい。さらに別の具体的な目的は、液の圧力、温度、pH、量や1つ以上の既定の化学成分の比率、液の流量や、液の反応状態などのシステムの特性を測定し、この特性に対する応答性を持つように構成可能である液の反応システムを提供することである。
さらに別の具体的な目的は、自動化液流システム又は半自動化流体フローシステムにおいて液の化学成分を分離することができる液流ろ過装置及び方法を提供することである。適切な電子制御や液供給、再循環及び/又は液圧による液送により連続的に動作させることができるろ過システムを提供することを目的とする。さらに別の具体的な目的は、接続されてネットワークを形成する1つ又は複数のリアクタモジュール及びろ過モジュールを有する液流システムを提供することである。
さらに別の目的は、RNAの合成方法及び装置を提供することである。さらに別の目的は、DNAからRNAを合成する装置及び方法を提供することである。さらに別の目的は、ワクチンの調製に用いることができる合成RNAの一形態を提供することである。
本発明の一目的は、化合物、並びに特にRNAとその後に得られるワクチンとを含む生体分子及び非生体分子の合成及び/又はろ過を行なうことができるモジュール式製造プラットフォームを提供することである。具体的な目的は、下流でのワクチン製造を可能にする生体分子合成に用いられる微細工場として構成可能な装置及びシステムを提供することである。
具体的な目的は、連続的に動作させることができ、電子制御ユーティリティ及び/又はソフトウェア制御ユーティリティを用いて自動化することができる、対応する導管/流路を介して接続されて液流経路を形成する液流バイオリアクタモジュールと液流ろ過モジュールとを含む要素モジュール部品を含む液流統合化システムを形成する装置及び方法を提供することである。
本発明の第1の態様に係れば、少なくとも1種類のヌクレオシド三リン酸(nucleoside triphosphate:NTP)、反応緩衝液及びDNA、DNA系化合物又はDNA系混合物を含む複数の反応剤を複数の流入ポートを介して第1の液流モジュールに導入するステップと、反応剤の少なくともいくつかをフローシステムの第1のモジュール中の反応流路内又はウェル内で反応させるステップと、第1のリアクタモジュールでDNAを滞留させるか再循環させて、反応剤の反応生成物を第1の流体ろ過モジュールに流入させるステップと、第1のろ過モジュール中で反応生成物をろ過するステップとを含むRNA合成方法が提供される。
場合により、少なくとも1種類のヌクレオシド三リン酸(NTP)は少なくとも1種類のヌクレオシド三リン酸(NTP)の溶液である。
場合により、少なくとも1つのヌクレオシド三リン酸(NTP)はアデノシン三リン酸(adenosine triphosphate:ATP)、シチジン三リン酸(cytidine triphosphate:CTP)、グアノシン三リン酸(guanosine triphosphate:GTP)、ウリジン三リン酸(uridine-triphosphate:UTP)のいずれか1つ又はこれらの組合せを含む。
場合により、DNAはプラスミドDNAである。場合により、複数の反応剤は酵素混合物、塩類溶液、RNAポリメラーゼのいずれか1つ又はこれらの組合せをさらに含む。
場合により、本方法は、複数の反応剤の少なくともいくつかを第1のろ過モジュールの流出部から第1のリアクタモジュールの流入部領域に再循環させるステップを含む。場合により、本方法は、ろ過された反応生成物の少なくとも一部を第1のろ過モジュールから第2の液流リアクタモジュールに供給することを、第2のリアクタモジュールにキャッピング酵素を投入することと組み合わせて行なうステップを含む。場合により、本方法は、第2のリアクタモジュールから流出した液を第2の液流ろ過モジュールに供給するステップを含む。場合により、本方法は、未反応NTPを第1のリアクタモジュールの流入部領域に再循環させ、未反応キャッピング酵素を第2のリアクタモジュールの流入部領域に再循環させるステップを含む。
場合により、塩類溶液又は緩衝液はMgCl2を含む。場合により、RNAポリメラーゼはT7ポリメラーゼを含む。
本発明の別の態様に係れば、本出願で主張されている方法によって調製されるRNA又はRNA系化合物が提供される。
本発明のさらに別の態様に係れば、ワクチンの調製の際に本出願で主張されている方法によって調製されるRNA又はRNA系化合物の使用が提供される。
本発明のさらに別の態様に係れば、流入部を有する第1の狭長液流流路と、流出部を有する第2の狭長液流流路と、透過液が第1の流路内の液から膜を介して第2の流路内まで第1及び第2の流路の長さに沿って通過することができるように、第1及び第2の流路のそれぞれの長さに沿って第2の流路から第1の流路を仕切るように配置される浸透膜とを含む液流ろ過装置が提供される。
場合により、第1の流路の長さの大部分が膜を介して第2の流路の長さの大部分に隣接して配置される。
場合により、膜の細孔サイズが範囲100~1000kDa、範囲100~800kDa、範囲200~800kDa又は範囲200~600kDa、範囲300kDa~10MDaにある。
場合により、本装置は第1の流路が形成されている第1のプレートと、形成される場合に第2の流路が形成される第2のプレートとを含み、第1及び第2のプレートのそれぞれの対向する面に膜が挟まれる。場合により、第1及び第2の流路の各々は一連の直線部分及び曲がり部分を含む。場合により、第1及び第2の流路はこれらの長手方向の、それぞれの蛇行プロファイルを含む。場合により、第1及び第2の流路はこれらの長さに沿って開通し、第1及び第2の流路の長手方向の壁又は面を部分的に形成する膜と直接接触する状態で配置される。場合により、膜の細孔サイズがRNA分子の平均分子サイズ未満である。
本発明のさらに別の態様に係れば、反応フロー流路又はウェルと、少なくとも1つの流入部と、少なくとも1つの流出部とを有する第1のリアクタモジュールと、流体ろ過領域と、第1のリアクタモジュールの流出部と連通する状態で設けられる少なくとも1つの流入部と、少なくとも1つの流出部とを有する第1のろ過モジュールとを含む、液の処理に用いられる液流システムであって、第1のろ過モジュールは本出願で主張されている液流ろ過装置を含む、液流システムが提供される。
場合により、本システムは反応フロー流路又はウェルと、少なくとも1つの流入部と、流出部とを有する第2のリアクタモジュールを含み、前記流入部は第1のろ過モジュールと連通する状態で設けられる。
場合により、本システムは液ろ過領域と、少なくとも1つの流入部と、流出部とを有する第2のろ過モジュールを含み、前記流入部は第2のリアクタモジュールの流出部と連通する状態で設けられる。
場合により、本システムは、第1のろ過モジュールの流入部領域と連通する状態で設けられる液注入ポートを含む。場合により、本システムは、第1のリアクタモジュールの流出部の領域と、第1のリアクタモジュールの、少なくとも1つの流入部との間で延びる第1の再循環導管を含む。場合により、本システムは、第1のろ過モジュールの流出部の領域と、第1のリアクタモジュールの流出部との間で延びる第2の再循環導管を含む。場合により、本システムは、第2のろ過モジュールの流出部の領域と、第1の反応モジュールの流入部との間で延びる第3の再循環導管を含む。
本発明のさらに別の態様に係れば、流入部から第1の狭長液流流路に液を流すステップと、第1の流路に沿って延びる膜を通過して第2の狭長液流流路に流入することを液の透過成分に強制的に行なわせるステップと、第1の流路内に液の滞留成分を滞留させるステップとを含む、液流ろ過装置を用いて液をろ過する方法であって、透過液が第1の流路から膜を介して第2の流路内まで第1及び第2の流路のそれぞれの長さに沿って通過することができるように、膜は第2の流路から第1の流路をこれらのそれぞれの長さに沿って仕切るように配置される、方法が提供される。
本発明のさらに別の態様に係れば、フローシステムであって、反応液流流路又はウェルと、少なくとも1つの液流入部と、少なくとも1つの液流出部とを有する少なくとも1つのリアクタモジュールと、流路又はウェルに液流を流す少なくとも1つのフロー送液部と、システム中の液の圧力、温度又はpHのいずれか1つ又はこれらの組合せを測定する第1のセンサと、システム中の液の圧力、温度、pHのいずれか1つ又はこれらの組合せを測定する第2のセンサと、システム中の液の少なくとも2つの化学成分の反応の状態を示すシステム中の液の特性を監視する反応状態監視デバイスと、第1のセンサ、第2のセンサ及び反応状態監視デバイスの少なくとも1つ又はこれらの組合せからデータを受け取って、システム中の液の、少なくとも1つの特性を制御する制御部とを含むフローシステムが提供される。
場合により、システムの特性は、システム中の液の圧力、システム中の液の温度、システム中の液のpH、システム中の液の、1つ以上の化学成分の容積又は比率、システム中の液の流量のいずれか1つ又はこれらの組合せである。場合により、液を流すステップは第1の流路内で液を加圧するステップを含む。場合により、制御部はCPU、PCB、PLC、PC、プロセッサチップ、ハンドヘルド電子デバイスを含む。場合により、さらなるセンサは温度センサ、pHセンサ、圧力センサ、流量センサ、流動量センサ又は分光センサのいずれか1つ又はこれらの組合せを含む。
本発明のさらに別の態様に係れば、液流装置を用いて液を処理する方法であって、少なくとも1種類の液を少なくとも1つの流入部を介してリアクタモジュールに導入するステップと、反応フロー流路又はウェルを通って流れるか、反応フロー流路又はウェル内を流れるように少なくとも1つのフロー送液部を用いて液を流して、流出部で液を流出させるステップと、液流装置中の液の圧力、温度又はpHの少なくとも1つ又はこれらの組合せを測定するステップと、液流装置中の液中の化学成分の反応状態を監視するステップと、液の化学成分の圧力の測定、pHの測定、温度の測定及び/又は反応状態の測定の少なくとも1つ又はこれらの組合せに応じて制御部を用いて液流装置中の液の、少なくとも1つの特性を制御するステップとを含む方法が提供される。
場合により、本システムは、連通状態で接続され合される複数のリアクタモジュール及びろ過モジュールを含む。場合により、フロー送液部は少なくとも1つのポンプであり、場合によりシリンジポンプである。場合により、液解析センサは範囲190nm~1000nmの吸光度解析又は蛍光解析用の紫外可視分光器を含む。
場合により、RNA合成方法は、未反応NTPを第1のリアクタモジュールの流入部領域に再循環させ、未反応キャッピング酵素を第2のリアクタモジュールの流入部領域に再循環させるステップを含む。
本発明のさらに別の態様に係れば、本出願で主張されている方法によって調製されるRNAが提供される。本発明のさらに別の態様に係れば、ワクチンの調製の際にいずれかの先行請求項の方法によって調製されるRNAの使用が提供される。
本発明のさらに別の態様に係れば、反応フロー流路又はウェルと、少なくとも1つの流入部と、少なくとも1つの流出部とを有する第1のリアクタモジュールと、流体ろ過領域と、少なくとも1つの流入部と、少なくとも1つの流出部とを有する第1のろ過モジュールとを含む、液を処理する液流装置であって、前記流入部は第1のリアクタモジュールの流出部と連通する状態で設けられる、液流装置が提供される。
場合により、本装置は、流体ろ過領域と、少なくとも1つの流入部と、流出部とを有する第2のろ過モジュールを含み、前記流入部は第2のリアクタモジュールの流出部と連通する状態で設けられる。
場合により、本装置は、第2のリアクタモジュールの流入部領域と連通する状態で設けられる液注入ポートを含む。場合により、本装置は、第1のリアクタモジュールの流出部の領域と、第1のリアクタモジュールの、少なくとも1つの流入部の領域との間で延びる第1の再循環導管を含む。
場合により、本装置は、第2のろ過モジュールの流出部の領域と、第1の反応モジュールの、少なくとも1つの流入部の領域との間で延びる第3の再循環導管を含む。場合により、本装置は、反応流路又はウェルに流体化学成分を流入させることを可能にする複数の流入ポートを含む。場合により、本装置は、第1のリアクタモジュールの、少なくとも1つの流入部に接続されて、反応流路に液流を流すかウェル内に液流を流す少なくとも1つのポンプを含む。場合により、本装置は、本装置中の液と連通する状態で設けられる少なくとも1つの、バルブ、液流ゲート、液流ポート、発熱体、液貯蔵部又は滞留液だめを含む。場合により、ポンプはシリンジポンプを含む。
場合により、本装置は、プレート状構造上又はその内部に設けられた流路又は陥没した溝として第1のリアクタモジュールと第1のろ過モジュールとが少なくとも部分的に形成されるようなプレート状構造を有する。場合により、本装置は、本装置の異なる液流領域に配置された複数のセンサを含む。
場合により、センサは少なくとも1つの温度センサ、少なくとも1つの流量センサ、少なくとも1つの圧力センサ、少なくとも1つのpHセンサ、少なくとも1つの流動量センサ、少なくとも1つの分光センサ、少なくとも1つの光学センサ、少なくとも1つの光ファイバ又は分光光ファイバのいずれか1つ又はこれらの組合せを含む。
場合により、本装置は、少なくとも1つのポンプ、バルブ、液流ゲート、液流ポート、発熱体、液貯蔵部又は滞留液だめ及びセンサに接続されて、センサによって定量された液の物理的、化学的又は機械的特性の状態に応じて本装置中の液流の特性を制御する制御部を含む。場合により、制御部はCPU、プロセッサ、PCB、PLC、ハンドヘルド電子デバイスを含む。
場合により、制御部は、ソフトウェア、電子コンポネント、データ記憶ユーティリティ、有線又は無線通信モジュール及び/又はポート、視覚的表示出力部、ユーザインタフェイス、少なくとも1つのポンプ、バルブ、液流ゲート、液流ポート、発熱体、液貯蔵部又は滞留液だめ及びセンサのいずれか1つ又はこれらの組合せを作動させる少なくとも1つのアクチュエータのいずれか1つ又はこれらの組合せを含む制御モジュールを含む。
本発明のさらに別の態様に係れば、本出願の特許請求の範囲の複数の装置と、該装置の各々から流出する液を寄せ集める収集部に接続される、該装置の各々の最終液流流出部とを含む、液を処理する液流システムが提供される。
場合により、液流システムは、前記装置の各々又は該装置から選択されたものの、少なくとも1つのポンプ、バルブ、液流ゲート、液流ポート、発熱体、液貯蔵部又は滞留液だめ及びセンサに接続されて、センサによって定量された液の物理的、化学的又は機械的特性の状態に応じて本装置中の液流の特性を制御する制御部を含む。
本発明のさらに別の態様に係れば、少なくとも1種類の液を少なくとも1つの流入部を介して第1のリアクタモジュールに導入して、反応フロー流路又はウェルを通って流れるか、反応フロー流路又はウェル内を流れるように液を流して、第1のリアクタモジュールの流出部で液を流出させるステップと、前記流出部からの液の少なくとも一部を少なくとも1つの流入部を介して、液ろ過領域を有するろ過モジュールに流して、液を第1のろ過モジュールから流出部で流出させるステップとを含む、液流装置を用いて液を処理する方法であって、第1のリアクタモジュールで液の、少なくとも2つの化学成分の間の反応が起こり、第1のろ過モジュールで液のろ過が行なわれる、方法が提供される。
場合により、本方法は少なくとも1つの流体ポンプを用いて前記装置に液流を流すステップを含む。場合により、本方法は、リアクタモジュール及び/又はろ過モジュールの流出部からの液の少なくとも一部を少なくとも1つの再循環導管を介してリアクタモジュールの少なくとも1つの流入部の領域に再循環させるステップを含む。場合により、本方法は、液中で起こる化学成分の間の化学反応の状態を少なくとも1つのセンサを用いて監視するステップを含む。場合により、本方法は、センサによって特定された化学反応の状態に応じて前記装置を通る液流を制御するステップを含む。場合により、本方法は、デバイスの中で液の物理的、化学的及び/又は機械的特性を少なくとも1つのセンサを用いて監視するステップを含む。場合により、本方法は、センサによって特定された液の物理的、化学的及び/又は機械的特性に応じて前記装置中の液流を制御するステップを含む。場合により、液流を制御するステップは、前記装置中の液と連通する状態で設けられた少なくとも1つのアクチュエータ、ポンプ、バルブ、ゲート又はポートを制御するか、その作動を停止させるステップを含む。場合により、液流を制御するステップは、CPU、プロセッサ、PCB、PLC又はハンドヘルド電子デバイスを用いて少なくとも1つのアクチュエータ、ポンプ、バルブ、ゲート又はポートを作動させるか、その作動を停止させるステップを含む。
本発明のさらに別の態様に係れば、流入部を有する第1の狭長液流流路と、流出部を有する第2の狭長液流流路と、透過液が第1の流路内の液から膜を介して第2の流路内まで第1及び第2の流路の長さに沿って通過することができるように、第1及び第2の流路のそれぞれの長さに沿って第2の流路から第1の流路を仕切るように配置される浸透膜とを含む液流ろ過装置が提供される。
場合により、第1の流路は少なくとも1つの流出部を含み、流入部が第1の流路の第1の長手方向の端に設けられるか第1の長手方向の端の方に設けられ、流出部は第1の流路の第2の長手方向の端に設けられるか第2の長手方向の端の方に設けられる。場合により、第2の流路は少なくとも1つの流入部を含んでもよく、前記流入部は第2の流路の第1の長手方向の端に設けられるか第1の長手方向の端の方に設けられ、流出部は第2の流路の第2の長手方向の端に設けられるか第2の長手方向の端の方に設けられる。
本出願のさらに別の態様に係れば、反応フロー流路又はウェルと、少なくとも1つの流入部と、少なくとも1つの流出部とを有する第1のリアクタモジュールと、流体ろ過領域と、第1のリアクタモジュールの流出部と連通する状態で設けられる少なくとも1つの流入部と、少なくとも1つの流出部とを有する第1のろ過モジュールとを含む、液の処理に用いられる液流システムであって、第1のろ過モジュールは本出願で主張されている液流ろ過装置を含む、液流システムが提供される。
本発明のさらに別の態様に係れば、流入部から第1の狭長液流流路に液を流すステップと、第1の流路に沿って延びる膜を通過して第2の狭長液流流路に流入することを液の透過成分に強制的に行なわせるステップと、第1の流路内に液の滞留成分を滞留させるステップとを含む、液流ろ過装置を用いて液をろ過する方法であって、透過液が第1の流路から膜を介して第2の流路内まで第1及び第2の流路のそれぞれの長さに沿って通過することができるように、膜は第2の流路から第1の流路をこれらのそれぞれの長さに沿って仕切るように配置される、方法が提供される。
本発明のさらに別の態様に係れば、液流システムであって、反応液流流路又はウェルと、少なくとも1つの液流入部と、少なくとも1つの液流出部とを有する少なくとも1つのリアクタモジュールと、流路又はウェルに液流を流す少なくとも1つのフロー送液部と、システム中の液の圧力、温度又はpHのいずれか1つ又はこれらの組合せを測定する第1のセンサと、システム中の液の圧力、温度、pHのいずれか1つ又はこれらの組合せを測定する第2のセンサと、システム中の液の少なくとも2つの化学成分の反応の状態を示すシステム中の液の特性を監視する反応状態監視デバイスと、第1のセンサ、第2のセンサ及び反応状態監視デバイスの少なくとも1つ又はこれらの組合せからデータを受け取って、システム中の液の、少なくとも1つの特性を制御する制御部とを含む液流システムが提供される。
本発明のさらに別の態様に係れば、液流装置を用いて液を処理する方法であって、少なくとも1種類の液を少なくとも1つの流入部を介してリアクタモジュールに導入するステップと、反応フロー流路又はウェルを通って流れるか、反応フロー流路又はウェル内を流れるように少なくとも1つのフロー送液部を用いて液を流して、流出部で液を流出させるステップと、液流装置中の液の圧力、温度又はpHの少なくとも1つ又はこれらの組合せを測定するステップと、液流装置中の液中の化学成分の反応状態を監視するステップと、液の化学成分の圧力の測定、pHの測定、温度の測定及び/又は反応状態の測定の少なくとも1つ又はこれらの組合せに応じて制御部を用いて液流装置中の液の、少なくとも1つの特性を制御するステップとを含む方法が提供される。
以下、添付の図面を参照して本発明の特定の実現例を例としてに限って説明する。
RNAの製造に好適な連続反応ろ過装置の概略図である。
図1の装置での使用に好適なリアクタモジュールとろ過モジュールとの斜視図である。
図1の装置での使用に好適なウェルバイオリアクタモジュール、すなわちバッチバイオリアクタモジュールの平面図である。
図1の装置での使用に好適な反応流路形状のバイオリアクタモジュールの平面図である。
図1の装置での使用に好適なろ過モジュールの平面図である。
図5Aのろ過モジュール中の膜の画像である。
図1の装置での使用に好適な化学成分の遠心力分離向けに構成されている領域を有するろ過モジュールの一部の図である。
化学成分の遠心力分離のための領域を有するろ過モジュールの一部の画像である。
本液流装置に用いられる垂直タンジェンシャルフローろ過(vertical tangential flow filtration:VTFF)モジュールである。
図7のろ過モジュールの領域の拡大図である。
螺旋状タンジェンシャルフローろ過モジュールの平面図である。
特定の実現例に係るろ過モジュールの構成要素である。
図10Aのろ過モジュールの別の部分の概略図である。
図10A及び図10Bのろ過モジュールの一部の別の図である。
2層微細流路TFFとして形成されている別のろ過モジュールの平面図である。
特定の実現例に係るろ過機構及びろ過モジュールの概略図である。
流路フロー式バイオリアクタモジュールの概略図である。
液流バイオリアクタ及びろ過システムの設計の計算に用いられたグラフである。
液流デバイスを形成するようにろ過モジュールに接続されるリアクタモジュールの概略図である。
TFFモジュールの斜視図である。
TFFモジュールの流路寸法の顕微鏡解析の画像である。
試作品製作プロセスの概要の概略図である。
特定の実現例に係るリアクタモジュール、一連のセンサ、反応状態監視構成及び制御部を含む液流システムの概略図である。
図18Aの液流システムの一部として好適な反応状態監視構成の構成要素の概略図である。
特定の実現例に係る図18Aの液流システムの一部を形成する一連のセンサ、反応状態監視構成及び制御部の概略図である。
分光光度計構成の一部を含む図18のマイクロ流体フローシステムの一部のアーキテクチャの概略図である。
制御システムに用いられるシリアル通信プログラムの概略図である。
RNA産出量とNaCl、MgCl2、NTPなどを含む様々な反応剤の割合との関係のグラフである。
対象発明の態様に係るデータ解析(マグネシウムイオンに対するRNA産出量)と特定の反応時間の選択とについてのグラフである。
速度プロファイルの解析結果のシミュレーションの概略図である。
速度解析グラフのグラフである。
ろ過モジュール中のタンジェンシャルフローろ過流路の速度の概略図である。
バイオリアクタ流路の圧力降下のグラフである。
多段階降下を行なう圧力降下のグラフである。
液流リアクタ及びろ過装置の製造に用いられるマスクの写真である。
連続マイクロ流体フローリアクタのマスクの写真である。
カプトンテープで封止される連続フローリアクタの画像である。
2つのアクリルプレートを用いて完成された構成の画像である。
使用後の3Dプリントによる型の画像である。
モジュール式フローリアクタを用いて下流の製剤システムと統合され、従来の充填仕上げワクチン製造ラインに取り付けられる本フローシステムの実施形態の概略図の第1の部分である。
モジュール式フローリアクタを用いて下流の製剤システムと統合され、従来の充填仕上げワクチン製造ラインに取り付けられる本フローシステムの実施形態の概略図の第2の部分である。
モジュール式フローリアクタを用いて下流の製剤システムと統合され、従来の充填仕上げワクチン製造ラインに取り付けられる本フローシステムの実施形態の概略図の第3の部分である。
従来のバッチプロトコールと比較して紫外可視分光を用いて評価した図30A~図30Dの実施形態のフローリアクタの産出溶液の波長に対する吸光度のグラフである。
実験用液流化合物合成プラットフォームの写真である。
Pythonの実況プロット(live plot)分光光度計データ(波長に対する強度)である。
マイクロ流体フローリアクタモジュール及び連続ろ過システムとともに用いられ、異なる濃度(A:25mM/L、B:50mM/L、C:75mM/L、D:100Mm/L)を持つサンプルの画像である。
紫外可視スペクトル解析のグラフである。
Pythonの実況プロットpHデータの画像である。
予測プロットのグラフである(左はdNTP 1mMの場合の反応、右はdNTP 4mMの場合の反応)。
第1及び第2の実験の予測プロファイラのグラフを示す(上はdNTP 1mMの場合の反応、下はdNTP 4mMの場合の反応)。
液流バイオリアクタ及びろ過の様々なデータの概要である(左はdNTP 1mMの場合の反応、右はdNTP 4mMの場合の反応 LogWorth=-log10(p-value))。
本システムに用いられる規模を拡大した液流リアクタ及び液流装置の概略図である。
吸光度データとPythonでのリアルタイムプロット(波長に対する吸光度)とのソースコードの図である。
Pythonの実況プロットpHデータのソースコードの図である。
発明の好ましい実施形態の詳細な説明
微孔流路における流体力学の原理
微細加工の進歩によってマイクロメートルの寸法の微細流路を構築することが可能になっている。微細流路は通常これらのマイクロシステムに組み込まれるので、様々なマイクロフローデバイスの優れた設計に用いられる微細流路での液流の特性を決めることが重要である。多孔質媒体、特に、合成RNAワクチン製造に用いられるラボオンチップ設計に用いることができる微孔媒体の液の挙動の理解は技術上の制約のためにきわめて制限される。
微孔流路における流体力学の原理
微細加工の進歩によってマイクロメートルの寸法の微細流路を構築することが可能になっている。微細流路は通常これらのマイクロシステムに組み込まれるので、様々なマイクロフローデバイスの優れた設計に用いられる微細流路での液流の特性を決めることが重要である。多孔質媒体、特に、合成RNAワクチン製造に用いられるラボオンチップ設計に用いることができる微孔媒体の液の挙動の理解は技術上の制約のためにきわめて制限される。
多孔質媒体を用意して、液と液との境界面が形成されないという点に注目した液を含浸させ、1種類の液が細孔空間に行き渡る。dpを粒子寸法とし、Uを速度のオーダーとする。(1)が1以下のレイノルズ数に適用可能であることが分かっている。すなわち、
多孔質媒体の透過率は細孔サイズと細孔構造とに依存する特性である。透過率が気孔率(porosity)eと粒径dpとの関数であることが次元解析によって示され、各々は細孔形状及び細孔サイズをそれぞれ表わす。Carman-Kozeny関係によってこれらの量が以下のように実証的に結び付けられる。ただし、次元を正しくしつつ結び付けられる。
粒径をメートルで表わすと、透過率はm2の次元を持つ。適用時、デバイスそれ自体の長さのオーダーすなわちLと、以下のように定められる比率とを用いたいと考える場合がある。
これはダルシー数と称される。多くの適用例では、デバイスの長さのオーダーが約1メートル以上であるのに対して、粒径は数分の1ミリメートルのオーダーである。式2については、正確には、Da<<1,Re<1という制限内で適用可能なものとして説明することができる。
粒径をメートルで表わすと、透過率はm2の次元を持つ。適用時、デバイスそれ自体の長さのオーダーすなわちLと、以下のように定められる比率とを用いたいと考える場合がある。
これはダルシー数と称される。多くの適用例では、デバイスの長さのオーダーが約1メートル以上であるのに対して、粒径は数分の1ミリメートルのオーダーである。式2については、正確には、Da<<1,Re<1という制限内で適用可能なものとして説明することができる。
Bahrami et al.(M.Bahrami,2006)は任意の断面の微細流路内での圧力降下の予測の汎用モデルを開発した。代表長さの選定は任意に選んだものであり、最終的な解に影響しない。Bahrami et al.のモデルによれば、任意の断面微細流路内での層流の変化し終わった流れの圧力降下を以下から得ることができる。
ここで、Ip*=Ip/Aは微細流路断面の特定の極慣性モーメンタムであり、Г=4(W+H)は微細流路断面の周囲長であり、Lは変化し終わった長さであり、Qは体積流量であり、ε=矩形の微細流路のアスペクト比(幅/高さ)である。
ここで、Ip*=Ip/Aは微細流路断面の特定の極慣性モーメンタムであり、Г=4(W+H)は微細流路断面の周囲長であり、Lは変化し終わった長さであり、Qは体積流量であり、ε=矩形の微細流路のアスペクト比(幅/高さ)である。
マイナー損失ΔPmin(測定された圧力降下に関連する他の圧力降下)は入口損失、出口損失及び曲がり部損失である。これらの損失は通常、巨視的な規模で用いられる従来の関係から得られる。Phillips(参考文献)はマイナー圧力損失を以下から得ることができることを示した。
ここで、A及びAtはそれぞれ流路及び接続管の断面積である。Kbは曲がり部の損失係数であり、そして、Kc及びKeは面積変化に起因する縮小損失係数及び拡大損失係数を表わす。Phillipsは90度の曲がり部に対して約1.2であるKbを推奨した。流路の断面積と接続管の断面積とが等しく、Kc及びKeの可能な値が最大であるとすると、測定された圧力降下に対する相対マイナー損失は測定された圧力降下と比較して無視し得る。
本検討で試行されるサンプルの断面アスペクト比εは0.5である。したがって、完全に矩形の断面は考えないが、2つの平行板の間に挟まれた多孔質媒体としてサンプルをモデル化することができる。
適切なカセットを全サンプル体積、必要なプロセス時間及び所望の最終サンプル体積に応じて選択する。既定の時間内にサンプルを処理するのに必要な膜面積を計算するのに以下の式を用いる。
ここで、
A=膜面積(m2)
V=生成されるろ液の量(リットル)
J=ろ液流量(Filtrate Flux Rate)(リットル/m2/時間、LMH)
T=処理時間(時間)
ここで、
A=膜面積(m2)
V=生成されるろ液の量(リットル)
J=ろ液流量(Filtrate Flux Rate)(リットル/m2/時間、LMH)
T=処理時間(時間)
試作品の検討のための液流シミュレーション
流路の高さと液体の種類とが微細流路の性能に影響する。微細流路のシミュレーションに数値流体力学(computational fluid dynamic:CFD)のFLUENTソフトウェアを用いた。CFDから、変化中領域と変化し終わった領域との速度プロファイルを解析して液流の挙動を検討した。液体の特性は微細流路内の液流に影響する。本発明者らによれば、選定された妥当な液体に応じた最小の動粘度と小さい表面張力とが必要である。
流路の高さと液体の種類とが微細流路の性能に影響する。微細流路のシミュレーションに数値流体力学(computational fluid dynamic:CFD)のFLUENTソフトウェアを用いた。CFDから、変化中領域と変化し終わった領域との速度プロファイルを解析して液流の挙動を検討した。液体の特性は微細流路内の液流に影響する。本発明者らによれば、選定された妥当な液体に応じた最小の動粘度と小さい表面張力とが必要である。
微小規模デバイスには化学工学及び生物化学工学においてポテンシャルがあるので、液流は微小規模デバイスを多数の用途と組み合せる際に重要な役割を演じる。単相液流のメカニズム及び原理は異なる種類の液体と異なる表面粗さとを用いた実験データを用いるレビューであった。したがって、微視的規模では、表面張力や粘度などの液体特性の影響が支配される。(Nawi,M.N.M.,Manaf,A.A.,Arshad,M.R.,&Sidek,O.(2013).Numerical simulation of the microchannel for the microfluidic based flow sensor.Proceedings-2012 IEEE International Conference on Control System,Computing and Engineering,ICCSCE 2012,345-348.)
レイノルズ数は流路を流れる液に及ぼされる慣性力と粘性力との比(すなわち、経路の壁によって与えられる摩擦力に対する液の運動量の比)である。レイノルズ数が小さい流動は、それぞれの液流が互いに平行に流れ、対流拡散及び分子拡散によってしか混合しない層流すなわち層をなす流動である。レイノルズ数が大きい流動は乱流であり、流体の様々なサイズの「塊(parcel)」が、空間的にも時間的にも同時にランダムである動きを示し、これにより、流路にわたって急激な混合が生じる。層流と乱流との間の遷移は内部流れでは通常Re=2000で生じる。(Schulte,T.H.,Bardell,R.L.,&Weigl,B.H.(2002).Microfluidic-technologies-in-clinical-diagnostics_2002_Clinica-Chimica-Acta.321,1-10)
乱流場は層流場よりも複雑であるが、顕著な二次的効果がある。このような状態の解析的分布の経時変化を示す一次元モデル及び二次元モデルが改良されている。共焦点蛍光顕微鏡観察実験と三次元数値解析モデリングによって壁の近傍での反応-拡散プロセスの定量的説明を確認するのを補助することができる。(Schulte,T.H.,Bardell,R.L.,&Weigl,B.H.(2002).Microfluidic-technologies-in-clinical-diagnostics_2002_Clinica-Chimica-Acta.321,1-10)
フローシステムとのセンサ一体化
本検討では、RNA転写プロセスにわたってデータを取得してモニタするためにセンサ一体化プラットフォームを構築した方がよい。Gruber,P.(Gruber,P.,Marques,M.,Szita,N.and Mayr,T.(2017).Integration and application of optical chemical sensors in microbioreactors.Lab on a Chip,17(16),pp.2693-2712.)は液流デバイスにおけるロバストなセンサ一体化に向かう進路を説明するフロー図を提案した。この図は一体化の検討のための案内図になり得た。リアルタイムでの反応の監視のために様々な一体化プラットフォームシステムが設計され開発されてきた(Wang,T.,Kim,S.and An,J.(2017).A novel CMOS image sensor system for quantitative loop-mediated isothermal amplification assays to detect food-borne pathogens.Journal of Microbiological Methods,133,pp.1-7.)。Wangの方法では、一体化及び検出について相補型金属酸化物半導体(CMOS)技術が高い可能性を示した。CMOS画像センサは効果的な反応検出プラットフォームとして動作し、これにより、CMOS画像センサによって増幅プロセスにしたがってリアルタイムの光子変化を監視することができる。CMOS画像センサによって光子を観測してデジタルの単位に変換した。これに加えて、CMOSの効率が正しいことを示すためにUVスペクトルによる検討、光の色の強さの検出及びpH解析が行なわれた(Wang,T.,Devadhasan,J.,Lee,D.and Kim,S.(2016).Real-time DNA Amplification and Detection System Based on a CMOS Image Sensor.Analytical Sciences,32(6),pp.653-658.)。Lopez-Huerta(Lopez-Huerta,F.,Woo-Garcia,R.,Lara-Castro,M.,Estrada-Lopez,J.and Herrera-May,A.(2013).An Integrated ISFET pH Microsensor on a CMOS Standard Process.Journal of Sensor Technology,03(03),pp.57-62.)はCMOSの標準プロセスの際の一体化ISFET pHマイクロセンサを提案した。シリコン領域1.12mm2に完成したシステムを組み込み、pHレベル2~12の濃度範囲で線形性 59mV/pHを示し、これにより、これは生物学的用途や医学的用途の優れた代替物になった。
本検討では、RNA転写プロセスにわたってデータを取得してモニタするためにセンサ一体化プラットフォームを構築した方がよい。Gruber,P.(Gruber,P.,Marques,M.,Szita,N.and Mayr,T.(2017).Integration and application of optical chemical sensors in microbioreactors.Lab on a Chip,17(16),pp.2693-2712.)は液流デバイスにおけるロバストなセンサ一体化に向かう進路を説明するフロー図を提案した。この図は一体化の検討のための案内図になり得た。リアルタイムでの反応の監視のために様々な一体化プラットフォームシステムが設計され開発されてきた(Wang,T.,Kim,S.and An,J.(2017).A novel CMOS image sensor system for quantitative loop-mediated isothermal amplification assays to detect food-borne pathogens.Journal of Microbiological Methods,133,pp.1-7.)。Wangの方法では、一体化及び検出について相補型金属酸化物半導体(CMOS)技術が高い可能性を示した。CMOS画像センサは効果的な反応検出プラットフォームとして動作し、これにより、CMOS画像センサによって増幅プロセスにしたがってリアルタイムの光子変化を監視することができる。CMOS画像センサによって光子を観測してデジタルの単位に変換した。これに加えて、CMOSの効率が正しいことを示すためにUVスペクトルによる検討、光の色の強さの検出及びpH解析が行なわれた(Wang,T.,Devadhasan,J.,Lee,D.and Kim,S.(2016).Real-time DNA Amplification and Detection System Based on a CMOS Image Sensor.Analytical Sciences,32(6),pp.653-658.)。Lopez-Huerta(Lopez-Huerta,F.,Woo-Garcia,R.,Lara-Castro,M.,Estrada-Lopez,J.and Herrera-May,A.(2013).An Integrated ISFET pH Microsensor on a CMOS Standard Process.Journal of Sensor Technology,03(03),pp.57-62.)はCMOSの標準プロセスの際の一体化ISFET pHマイクロセンサを提案した。シリコン領域1.12mm2に完成したシステムを組み込み、pHレベル2~12の濃度範囲で線形性 59mV/pHを示し、これにより、これは生物学的用途や医学的用途の優れた代替物になった。
CMOSは妥当な選択であるが、コストと時間とを考慮すると、実現が困難である。より現実的に考え、各センサの一体化案が見直された。pHセンサについては、統合感知及び作動を用いたマイクロ流体技術に含まれるpHのリアルタイムフィードバック制御の研究(Welch,D.and Christen,J.(2014).Real-time feedback control of pH within microfluidics using integrated sensing and actuation.Lab on a Chip,14(6),p.1191.)があることが分かっている。該システムでは、液流反応室内でpH値をモニタするのに、一体化された擬似参照電極をともなう延長ゲートイオン応答電界効果トランジスタ(ISFET)を利用した。温度センサ(senor)については、蛇行形状の温度センサ(線幅:50mm)とヒーター(線幅:400mm)とを反応室の中央の下に組み込んだ(Sun,H.,Olsen,T.,Zhu,J.,Tao,J.,Ponnaiya,B.,Amundson,S.,Brenner,D.and Lin,Q.(2015).A bead-based microfluidic approach to integrated single-cell gene expression analysis by quantitative RT-PCR.RSC Advances,5(7),pp.4886-4893.)。Choi,K.とMudrik,J.とWheeler,A.(2015).(A guiding light:spectroscopy on digital microfluidic devices using in-plane optical fibre waveguides.Analytical and Bioanalytical Chemistry,407(24),pp.7467-7475.)は面内デジタルマイクロ流体力学分光の新規の方法を提示した。この技術では、専用のマニホールドによって光ファイバとデジタルマイクロ流体力学デバイスとの位置合せを行なうことで、デバイスの面内で光学測定を行なうことが可能になり、これにより、光学検出の着想が与えられた。
本発明の解析の好ましい波長範囲は190nm~1000nmである。得られるピークはほぼ260nmである。
方法
連続フロー合成及び規模拡大
図1には連続RNA製造プロセスの概略図が示されている。図1に示されているように、液流デバイスは第1のバイオリアクタモジュール10、第1のタンジェンシャルフローろ過(tangential flow filtration:TFF)モジュール11、第2のバイオリアクタモジュール12及び第2のタンジェンシャルフローろ過(TFF)モジュール13を含む。モジュール10~13の各々はそれぞれの流路又は導管を介して接続されている。第1のリアクタモジュール10には複数の液供給投入ポート14が、それぞれの反応剤を第1のバイオリアクタ10に導入するために設けられる。各ポート14は対応するシリンジポンプ15を含む。第1のTFFは対応する投入/流入ポート16を含み、第2のバイオリアクタモジュールは対応する流入/投入ポート17を含み、第2のTFFモジュールは対応する投入/流入ポート18を含む。ポート16~18の各々には、液を導入して各リアクタの狭長反応流路24内と各モジュール中の狭長ろ過流路25内とで加圧して液流を流すための対応する付属ポンプやシリンジポートが設けられてもよい。複数の再循環流路19,20,21はモジュール10,11,12,13の様々な液流領域(それぞれの流入/流出端領域にある領域や、それぞれの流入/流出端領域の方の領域)を接続して連通を実現して反応剤/薬剤を還流させる。図1の装置は、生物学的種と非生物学的種とを含む化合物の製造のための完全に自動化した連続液流合成プラットフォームを提供するように、本明細書の別の記載箇所で説明されているようなセンサ、反応状態監視デバイス、制御部や、その他付属電子部品やアクチュエータ部品(図示せず)も含む。第1のバイオリアクタ10の狭長反応流路24の流出端はゲート23を含み、ゲート23は分子サイズ及び/又は分子量に基づいて液からDNAなどの大きい分子量の化学成分をろ過するように構成されている。その後、ろ過された所望の液が流路19を介してリアクタ10の流入部領域に再循環される。このようにして、既定の薬剤及び反応剤を再利用して連続プロセス又は半連続プロセスを実現することができる。
連続フロー合成及び規模拡大
図1には連続RNA製造プロセスの概略図が示されている。図1に示されているように、液流デバイスは第1のバイオリアクタモジュール10、第1のタンジェンシャルフローろ過(tangential flow filtration:TFF)モジュール11、第2のバイオリアクタモジュール12及び第2のタンジェンシャルフローろ過(TFF)モジュール13を含む。モジュール10~13の各々はそれぞれの流路又は導管を介して接続されている。第1のリアクタモジュール10には複数の液供給投入ポート14が、それぞれの反応剤を第1のバイオリアクタ10に導入するために設けられる。各ポート14は対応するシリンジポンプ15を含む。第1のTFFは対応する投入/流入ポート16を含み、第2のバイオリアクタモジュールは対応する流入/投入ポート17を含み、第2のTFFモジュールは対応する投入/流入ポート18を含む。ポート16~18の各々には、液を導入して各リアクタの狭長反応流路24内と各モジュール中の狭長ろ過流路25内とで加圧して液流を流すための対応する付属ポンプやシリンジポートが設けられてもよい。複数の再循環流路19,20,21はモジュール10,11,12,13の様々な液流領域(それぞれの流入/流出端領域にある領域や、それぞれの流入/流出端領域の方の領域)を接続して連通を実現して反応剤/薬剤を還流させる。図1の装置は、生物学的種と非生物学的種とを含む化合物の製造のための完全に自動化した連続液流合成プラットフォームを提供するように、本明細書の別の記載箇所で説明されているようなセンサ、反応状態監視デバイス、制御部や、その他付属電子部品やアクチュエータ部品(図示せず)も含む。第1のバイオリアクタ10の狭長反応流路24の流出端はゲート23を含み、ゲート23は分子サイズ及び/又は分子量に基づいて液からDNAなどの大きい分子量の化学成分をろ過するように構成されている。その後、ろ過された所望の液が流路19を介してリアクタ10の流入部領域に再循環される。このようにして、既定の薬剤及び反応剤を再利用して連続プロセス又は半連続プロセスを実現することができる。
図1及び図2を参照して、図2は図1の流体システムの変形例を示し、図2では、リアクタ10が図1の狭長反応流路24とは対照的に反応ウェル50を含む。図1を参照して説明されているように、反応に用いられる所望の化合物、薬剤、溶媒などの供給のために複数の注入ポート14がウェル50と接続されて連通している。ろ過モジュール11,12は一連の抽出ポート51,22を含んでもよく、これにより、ろ過モジュールから既定の種、薬剤、溶媒を抽出することができ、ポート22で、たとえば、完全にキャッピングされたRNAなどの最終生成物を収集することもできる。
上記から分かるように、流路プロファイルの具体的な詳細、ポート、ゲート、流入部、流出口、ポンプや液流制御アクチュエータの使用を本記載で説明されているような構成を用いて実施することができる。
図39を参照して、図1及び図2を参照して説明されている(かつ、プレート状ユニット10、11、12、13としてその全体が示されている)複数の反応体ろ過システムを、規模を拡大した液流リアクタ及び液流装置としてともに接続して、評価や治験や、最終的には製造に十分な規模で、RNAを用いた治療薬と予防ワクチンとの製造のための完全に統合されたモジュール式液流反応ろ過システムを形成してもよい。特に、各ユニットの産出部(産出部22にある)をまとめて総産出量を得ることができるように、適当な接続導管によって個々のプレート状ユニット10、11、12、13の間を連通させる。図39の集合化システムは、図18A~図20を参照して本明細書で説明されているような単一制御部、複数制御部や対応するセンサや、反応状態監視ユーティリティやユニットを含んでもよい。本発明の複数の流体デバイスが並列動作することで、RNAを用いた治療薬と予防ワクチンの連続製造を行なうことができる。この規模変更方式を用いることで、地域病院の受け持ち区域になり得る標的市場や、製造者の製造地にある従来の充填仕上げラインにユニットが取り付けられる標的市場によって必要とされる規模での産出物の製造に到達することができる。図20はArduino IDE制御ユーティリティとPython IDE制御ユーティリティとの間の制御システムに用いられるシリアル通信プログラムの概略図である。可能な実施形態では、Arduinoボードを用いることができる。好ましい実施形態では、産業用エッジコンピューティングSBC(Single Board Computer)ノードが用いられる。
一例としてRNA合成を用いるが、プロセスの際、DNAのセグメントが酵素のRNAポリメラーゼによってRNAにコピーされる。転写混合物はNTP(ヌクレオシド三リン酸)、DNA、MgCl2(P2O7
-4と反応して沈殿物を生成し、RNAの生産性に影響する)、T7ポリメラーゼ(触媒作用)で構成され、これらは第1のバイオリアクタ流路にシリンジポンプによってそれぞれ注入される。Mg2+イオンの滴定のための比色定量指標としてヒドロキシナフトールブルー(hydroxy naphthol blue:HNB)が用いられる。まず、HNBとMg2+イオンとを化合させてHNB-Mg2+錯体にする。Mg2+イオンの減少の結果、色が紫からスカイブルーに変化する。混合物は第1のリアクタ10に約6時間滞留し、その間中始終、RNA転写反応が進行し、ピロリン酸マグネシウム(magnesium pyrophosphate)沈殿物(Mg2P2O7)をともなってRNAが生成され始める。DNA以外のすべての上記の成分が第1のタンジェンシャルフローろ過(TFF)モジュール11を流れる。モジュール11は分画分子量(molecular weight:MW)の大きい膜を有する。DNAはろ過されて再循環流路19を介して元の流入ポート14(2)に還流され、第1のリアクタで滞留させられ、その他はろ過されて次の段階に向かう。
第1のろ過モジュールの後、T7ポリメラーゼを流入ポート14(4)に再循環させつつ、上記の成分を下流の方に通過させる。その後、ポート17にm7Gメチル基転移酵素(5’キャップ)が注入され、第2のリアクタ12及び流路24に流入し、流入物は2時間滞留して反応する。通過物は第2のTFF部13に流入し、TFF部13は分画MWが中程度の膜を有する。このろ過段階では、反応しなかったNTP及び5’キャップが留めおかれ、(21及び20を介して)再循環されてバイオリアクタ12及び/又は10に流入する。最後に、精製されたRNAは流出部22で押し出される。同時に、Mg2PPi、水、塩類などの他の成分が別の容器すなわちポート51で回収され、場合により廃棄されたり後処理されたりする。その後、産出物(キャッピングされたRNA)をさらなる処理手順(本記載では説明しないが、当業者にはよく知られている)によって処理して所望のワクチンを産出してもよい。
連続合成及び連続精製を実現してRNA物質を得て、システムのスループットの向上を実現することを目的とする。プロセスの連続反応を維持するために消費された分子の分を補うために原材料をパーツ14を介してリアクタに追加することが必要であり、これはアクチュエータシリンジポンプの調整と材料フローのフィードバックループとによって実現することができる。反応状態(マグネシウム濃度、pH、温度、反応時間など)を最適化することによってRNA収量結果の実質的な改善が可能である場合がある。
セット・ベースド・コンカレント・エンジニアリング(Set-Based Concurrent Engineering:SBCE)法
設計を発展させる主要なフレームワークとしてリーン製品開発法(Lean product development methodology)が選択されてきた。リーン製品開発法はセット・ベースド・コンカレント・エンジニアリング(SBCE)である。SBCEは、発展させようとする生成物を異なるサブシステムに分割するプロセスであり、これにより、サブシステム毎に可能な解決手段の集合を並列に発展させることができる。設計が進展するのに応じて、シミュレーション、プロトタイピング、検証やその他得られた知識などのツールを用いて知識に基づいた判断によって各サブシステムの解決手段の集合が絞られる。SBCE法にしたがって、最初の不可欠なステップは、生成物を、個別に発展させることができる異なるサブシステムに分割するステップである。発展させる必要があるシステムの概念上の設計を考えると、発展させることになる、バイオリアクタとろ過プロセスというちょうど2つの機能にグループ化することができる主要な見分けられる4つのプロセスが存在する。同時に、該システムは、ポンプからの圧力を制御し、重要なパラメータを測定するために対策を考える上で重要な生成物の部分にあるセンサを有することができる制御システムと統合される必要がある。システムの概念上の設計を対応づけて、並列に発展させることができる異なるサブシステムを定めることが可能になっていた。表1は異なるサブシステムを示し、サブシステム毎に定められた簡単な説明と、対応するレベルの変革とが記載されている。
設計を発展させる主要なフレームワークとしてリーン製品開発法(Lean product development methodology)が選択されてきた。リーン製品開発法はセット・ベースド・コンカレント・エンジニアリング(SBCE)である。SBCEは、発展させようとする生成物を異なるサブシステムに分割するプロセスであり、これにより、サブシステム毎に可能な解決手段の集合を並列に発展させることができる。設計が進展するのに応じて、シミュレーション、プロトタイピング、検証やその他得られた知識などのツールを用いて知識に基づいた判断によって各サブシステムの解決手段の集合が絞られる。SBCE法にしたがって、最初の不可欠なステップは、生成物を、個別に発展させることができる異なるサブシステムに分割するステップである。発展させる必要があるシステムの概念上の設計を考えると、発展させることになる、バイオリアクタとろ過プロセスというちょうど2つの機能にグループ化することができる主要な見分けられる4つのプロセスが存在する。同時に、該システムは、ポンプからの圧力を制御し、重要なパラメータを測定するために対策を考える上で重要な生成物の部分にあるセンサを有することができる制御システムと統合される必要がある。システムの概念上の設計を対応づけて、並列に発展させることができる異なるサブシステムを定めることが可能になっていた。表1は異なるサブシステムを示し、サブシステム毎に定められた簡単な説明と、対応するレベルの変革とが記載されている。
サブシステム設計仕様決定法
バイオリアクタ
バイオリアクタについて、2つの異なる設計を発展させていた。第1の設計はRNA合成のために化学分野で用いられる従来のバッチ処理の影響を受けて行なわれる。設計は原材料毎に4つの投入部14を含み、投入部14は1mLの主室に接続され、主室では十分な滞留時間を可能にすることによって反応が起こる。その後、容器の出口でマイクロ流体バルブを解放することによって容器から選択的に流出させて、新たな試薬を流入部に導入することができる。従来のバッチシステムと同等の場合、このことはデバイスが連続(灌流)モードで動作することを示唆する。反応が完了した後、生成物が解放されて産出流路に流入する。プロセスの次のステップに進むことができるのか、許可されないのかがセンサによって評価される。図2及び図3はバイオリアクタの設計例を示す。
バイオリアクタ
バイオリアクタについて、2つの異なる設計を発展させていた。第1の設計はRNA合成のために化学分野で用いられる従来のバッチ処理の影響を受けて行なわれる。設計は原材料毎に4つの投入部14を含み、投入部14は1mLの主室に接続され、主室では十分な滞留時間を可能にすることによって反応が起こる。その後、容器の出口でマイクロ流体バルブを解放することによって容器から選択的に流出させて、新たな試薬を流入部に導入することができる。従来のバッチシステムと同等の場合、このことはデバイスが連続(灌流)モードで動作することを示唆する。反応が完了した後、生成物が解放されて産出流路に流入する。プロセスの次のステップに進むことができるのか、許可されないのかがセンサによって評価される。図2及び図3はバイオリアクタの設計例を示す。
この設計例には、デバイスと一体化されるバルブを制御する複雑で適切に調整された制御システムが必要である。滞留時間が経過し終わった後、生成物がシステムの残りの部分に供給される必要がある。
バイオリアクタの第2の設計は、国際公開公報第2019/193346号に記載されているように反応剤の混合と目的の生成物の連続合成とを可能にする蛇行液導管として成形されたマイクロフローリアクタである。本国際公開公報の詳細が参照により本明細書に組み入れられる。本実施形態に係れば、液流の制御によって連続合成が可能である。本設計では、4つの薬剤投入部が存在し、T形ミキサを介して連続的にフローリアクタに供給される。液導管への正味の流入量とT形ミキサを通る個々の成分の液速度とによって反応状態と有効性とが制御される。これらは、コンピュータ制御を用いて分注ポンプの分注量(dispensing rate)を設定することによって制御される。混合物が既定の滞留時間内に蛇行形状のフローバイオリアクタの端に達したときに生成物が形成される。産出部では、微小液保持ウェルとして機能するデバイスの機能部によって液流を一時的に低速化して、ライン内での紫外可視分光(UV-Vis spectroscopy)など、特定の化学溶液の好ましい解析方法を用いてライン内での測定値を得る。分光器からの信号の特定の特徴を抽出することによって、目的を持って構築されたソフトウェアで信号をパースして解析して、参照ベクターと比較することによって所望の生成物が確かに形成されたか否かを判断する。図4は蛇行フローバイオリアクタの概略図である。
ろ過モジュール
ダイレクトフローろ過(direct flow filtration:DFF)とタンジェンシャルフローろ過(tangential flow filtration:TFF)という2種類のろ過が存在する。TFFの液流がフィルタに平行な方向であるのに対して、DFFの特徴はフィルタに対して垂直な主流が存在することにある。DFFでは目詰まりが生じるおそれがきわめて高く、ろ過された量が増大する際には、DFFよりもTFFのろ液流量が大きくなることが実証されている。さらに、TFFの典型的な用途は生体分子の濃縮、ダイアフィルトレーション及び分画並びに細胞の清澄化及び除去であり、これは、本課題に存在する用途と同様の用途である。言い換えると、本課題の用途に対してTFFは最も効果的な選択肢であり、したがって、えり抜かれたろ過形式である。
ダイレクトフローろ過(direct flow filtration:DFF)とタンジェンシャルフローろ過(tangential flow filtration:TFF)という2種類のろ過が存在する。TFFの液流がフィルタに平行な方向であるのに対して、DFFの特徴はフィルタに対して垂直な主流が存在することにある。DFFでは目詰まりが生じるおそれがきわめて高く、ろ過された量が増大する際には、DFFよりもTFFのろ液流量が大きくなることが実証されている。さらに、TFFの典型的な用途は生体分子の濃縮、ダイアフィルトレーション及び分画並びに細胞の清澄化及び除去であり、これは、本課題に存在する用途と同様の用途である。言い換えると、本課題の用途に対してTFFは最も効果的な選択肢であり、したがって、えり抜かれたろ過形式である。
ろ過モジュールについてTFF法を1つのモデルとして選択した。いくつかの設計上の解決手段が研究文献や実施物(commercial practice)において提案されている。製造のし易さなど、その他いくつかの事項が本発明のために検討され、モジュールとしてシステム全体と一体化する能力がこのサブシステムについて考慮された。第1のろ過モジュールの設計の特徴は、同じ高さにある2つの流路を有する蛇行形状の経路にあり、デバイス上で機能部が分離され、機能部のパターンが意図的に形成され、ろ過膜として機能する。X.Chen et al.(2007)(Microfluidic Chip for Blood Cell Separation and Collection Based on Crossflow Filtration.Sensors and Actuator B 130(2008)(p.216-p.221).China.)は他の解決手段と比較して高速で再利用可能であり低コストな生体細胞の分離に用いられるTFFフィルタ設計を従来から用いていた。
本発明では、核酸合成後の溶液中に一般的に存在する生体分子の分離に適したサイズを持つ意図的に選択された膜を用いる。図5A及び図5Bは蛇行微細流路内にあるろ過機能部を含むろ過モジュールを示す。該流路のサイズ及び長さは、ろ液流と滞留液流において正しい生体分子を選択することができるように意図的に設計されている。このようなモジュールの製造は、ガラスやシリコン基板のフォトリソグラフィ(photolithograpy)と深掘り反応性エッチング(deep reactive etching)とを含むマイクロエンジニアリング技術を用いて行なわれる。このような技術はよく知られており、工業的に利用可能であり、製薬上の規制に適合し、デバイスの大量生産に要するコストが低い。
第2のろ過モジュール設計には、いかなるフィルタ膜も必要ではない。第2のろ過モジュール設計は遠心力の主要部を用いて動作し、これにより、液の軌道が所定の速度で曲線軌道である場合にある粒子が他の粒子よりも高速で移動する。このため、2つの異なる流路に分かれる1つの曲がり部微細流路を有することで、異なるサイズの粒子を異なる流出部流路に進ませるとができる(Blatter,C.,Jurischka,R.,Tahhan,I.,Schoth,A.,Kerth,P.,Menz,W.(2005).Microfluidic Blood/Plasma Separation Unit Based on Microchannel Bend Structures.Proceedings of the 3rd Annual International IEEE EMBS.Hawaii.)。このろ過方法が、たとえば、液速度が1[m/s]を超えるといった適切な状態でしか機能しないことに触れておくことが重要である。正常な状態であれば、この分離手法によって最大90%の効率を得ることができ、膜がないので、ろ過プロセスを大幅に単純化することができる。図6A及び図6Bはこの設計解決手段のCAD設計を示す。
第3の設計は上述の第1の設計モジュールときわめて類似している。主な違いは、液の経路が国際公開公報第2019/193346号に記載されているように螺旋状であることである。本国際公開公報の詳細が参照により本明細書に組み入れられる。Z.Geng et al.(2012)(Continuous Blood Separation Utilizing Spiral Filtration Microchannel with Gradually Varied Width and Micro-Pillar Array.Sensors and Actuators B 180(2013)(p.122-p.129).China.)が説明しているように、本設計により、上述されている従来の蛇行形状のろ過モジュールに遠心効果が付加される。この遠心効果によって分離効率が上昇し、閉塞するおそれが低くなる。図9~図10Cは設計例を示す。
ろ過モジュールの第4の設計では2本の液流の間に挟まれた膜を用いる。X.Li et al.(2014)(Continuous-Flow Microfluidic Blood Cell Sorting for Unprocessed Whole Blood Using Surface-Micromachined Microfiltration Membranes.Royal Society of Chemistry.)は血球分離にろ過膜を用いている。しかし、本発明では、ろ過モジュールでは2つの微細流路層を用い、2つの微細流路層によってろ過膜が挟まれてろ液流と滞留液流とが形成され、連続するろ液流が産出部で回収されて、プロセス要件に応じて下流のモジュールに送られる一方で、滞留液流は再循環されてリアクタモジュールに戻る。リアクタから液が流れてきて上層流路を通ってTFFプロセスに至る。圧力差により、液中の分子の一部が膜を通過し、下層流路に至るが、大きすぎて膜を通過することができない分子は上層流路で滞留する。この設計解決手段によって優れた効率が得られ、最も重要なことは、製造のし易さの点で新たな視点が得られることである。図11A及び図11Bはこの解決手段の設計例を示す。
上述のろ過モジュールの4つの実施形態は液流の間の圧力差の制御と用いられた分離方法とに依存している。しかし、第5の実施形態では、デバイスによってデジタルマイクロ流体技術と、マクロ流体技術と、一般的に用いられている分子生物学のプロトコールとを組み合わせて核酸、特にDNAを分離して抽出する。このようなプロトコールは2つある。一方は電荷に基づくものであり、他方は精製のためにDNA又はRNAに磁気ビーズを取り付けるものである。たとえば、本発明では、容器から排出して新しい溶液を補充するときに、図2の本発明のバイオリアクタ設計の場合のように、DNAプラスミドに取り付けられるInvitrogen DNA結合ビーズ(Thermofisher Scientific)などの磁気ビーズを、デジタル的に作製された磁場を用いて反応容器内に滞留させるか、あるいは上述のろ過モジュール設計のろ過膜を強制的に通過させて、滞留液流路を通じて反応モジュールに還流させることができる。
実施形態
すべての設計が核酸を用いた治療薬の製造のためのフローシステムの複数の構成のモジュールであるが、蛇行形状のろ過モジュールはその容易さと低コストで用意されることにより、好ましい代表例である。装置を検証するための試作品の製造のためのプロセス全体を以下でさらに説明する。
すべての設計が核酸を用いた治療薬の製造のためのフローシステムの複数の構成のモジュールであるが、蛇行形状のろ過モジュールはその容易さと低コストで用意されることにより、好ましい代表例である。装置を検証するための試作品の製造のためのプロセス全体を以下でさらに説明する。
図7及び図8は流動式の好ましいろ過モジュールを示し、ろ過モジュールは好ましくは第1の板状層30と第2の板状層31とを含み、第1の板状層30と第2の板状層31とはそれぞれの主面が互いに対抗する状態で設置され、層板構造(lamella structure)を実現するようにこれらの間に膜36が挟まれている。プレート30,31の各々は、中間膜36と直接接触し、中間膜36によって少なくとも部分的に形成されるそれぞれの流路37,38を形成するように、直線部分34と曲がり部分すなわち曲線部分35とを有する蛇行流路を含む。回収液だめ、投入液だめや緩衝液だめ33が第1又は第2の流路37,38のいずれか一方のそれぞれの長手方向の端に設けられたり、長手方向の端の方に設けられたりする。したがって、分子サイズが小さい液の既定の化学成分が膜36を通って緩和して(defusing)第2のプレート31の隣接する液流流路38に入ることができつつ、上プレートの流路37を液が流れることができる。したがって、図7及び図8のTFFモジュールは、上記から分かるように、粒子サイズ(粒径)及び/又は分子量によって区別される透過液と滞留液とを分離するように構成される。
デバイスの検討のための液流シミュレーション方法
表2に示されているように、必要なバイオリアクタ流路の異なる2つの寸法がある。微細流路での仮想データを解析するのに計算流体力学(CFD)ソフトウェアを用いた。微細流路には定常状態の流量が必要である。
表2に示されているように、必要なバイオリアクタ流路の異なる2つの寸法がある。微細流路での仮想データを解析するのに計算流体力学(CFD)ソフトウェアを用いた。微細流路には定常状態の流量が必要である。
FLUENT:FLUENTは、液流問題を扱うのを支援する計算流体力学(CFD)ソフトウェアである。FLUENTは流体の支配方程式を解くために有限体積法を用い、層流又は乱流、粘性又は非粘性、圧縮性又は非圧縮性など、多数の異なる物理モデルを提供する。ジオメトリとグリッド生成とについては、FLUENTとともにバンドルを形成するプリプロセッサであるGAMBITを実行する。
ジオメトリ、メッシュ、セットアップ、求解、結果というステップに従うことによって解を得ることができる。流路は二次元CAD設計図で表わされる。その後、材料特性と境界条件とが設定される。最後に、領域のメッシュを切らなければならない。FLUENTは、収束範囲に達したり、既定の反復回数に達したりするまで対象を収束させる。
a)ジオメトリ
ジオメトリは壁と、流入部及び流出部境界とからなり、図12に示されている。
b)メッシュ
粗密のメッシュ形式を用いることができる。表3に示されているように、メッシュ密度は精細化指数に基づいて変化する。
a)ジオメトリ
ジオメトリは壁と、流入部及び流出部境界とからなり、図12に示されている。
b)メッシュ
粗密のメッシュ形式を用いることができる。表3に示されているように、メッシュ密度は精細化指数に基づいて変化する。
計算流体力学を用いた液流モデリング:
レイノルズ数(Re=0.0269)について層流を選択した。材料として空気と水(液体)を選択する必要がある。材料特性として密度及び粘性を既定することができる。
レイノルズ数(Re=0.0269)について層流を選択した。材料として空気と水(液体)を選択する必要がある。材料特性として密度及び粘性を既定することができる。
c)求解
メッシュを、規定の物理特性及び初期条件とともにFLUENTにエクスポートする。解が収束するか、既定の繰り返し回数に達するかしたとき、FLUENTによってデータをエクスポートする。表5に示されているように、総流動時間は14400秒(4時間)であり、このことから、CFDソフトウェアは60秒毎にデータを記録し、240回繰り返すことを要する。その後、CFDソフトウェアによってX方向及びY方向の速度、エネルギー並びに連続性(continuity)を解析する。結果として、38回繰り返した後、図13に示されているように収束するという結果となった。
メッシュを、規定の物理特性及び初期条件とともにFLUENTにエクスポートする。解が収束するか、既定の繰り返し回数に達するかしたとき、FLUENTによってデータをエクスポートする。表5に示されているように、総流動時間は14400秒(4時間)であり、このことから、CFDソフトウェアは60秒毎にデータを記録し、240回繰り返すことを要する。その後、CFDソフトウェアによってX方向及びY方向の速度、エネルギー並びに連続性(continuity)を解析する。結果として、38回繰り返した後、図13に示されているように収束するという結果となった。
試作品の構築
試作品を製作するために、様々な工程に従った。まず型を作製し、型によりチップをキャスティングした。各設計を検証するために、様々なサブシステムを個別に製作した。設計を確認するために、各サブシステムに対して実験を行なう。型の様々な変形例を検討して用意した。設計の改変が図14に示されている。
試作品を製作するために、様々な工程に従った。まず型を作製し、型によりチップをキャスティングした。各設計を検証するために、様々なサブシステムを個別に製作した。設計を確認するために、各サブシステムに対して実験を行なう。型の様々な変形例を検討して用意した。設計の改変が図14に示されている。
各型に対して実験を行なった後、2つの変形例の間でいくつかの改良を行なった。
・2つの型板を1つにまとめ直すことで、すべての調製チップ製作プロセスを容易にした。
・流路の断面積を0.4mm×0.8mmから0.5mm×1mmに増加させることで、チップの検証時に路の壁が崩壊するのを回避した。
・流路間(0.5mm~1mm)と、型の境界と機能部との間とに余剰スペースを追加して、チップの品質が改善し、型からPDMSマスクを除去する際のなんらかの不具合の発生を回避した。
・最後に、型の境界にいくつかの壁を追加して、キャスティング時のPDMSチップ全体の品質を改善した。
・2つの型板を1つにまとめ直すことで、すべての調製チップ製作プロセスを容易にした。
・流路の断面積を0.4mm×0.8mmから0.5mm×1mmに増加させることで、チップの検証時に路の壁が崩壊するのを回避した。
・流路間(0.5mm~1mm)と、型の境界と機能部との間とに余剰スペースを追加して、チップの品質が改善し、型からPDMSマスクを除去する際のなんらかの不具合の発生を回避した。
・最後に、型の境界にいくつかの壁を追加して、キャスティング時のPDMSチップ全体の品質を改善した。
垂直TFFデバイスについて、上層と下層とを個別に検討して用意して、中間にあるろ過膜とともに封止される2つの異なる層を作製した。図15は2つの層の設計を示す。表6には2つの設計の個々の機能部が説明されている。
ソフトリソグラフィ及びSLA 3Dプリントによる型
所望の反応又はろ過動作を行なうために、微細流体技術チップには精度が高く正確度が高い方法及び技法が必要である。微細流体技術チップに用いられる最も一般の方法はソフトリソグラフィである。この場合、ソフトリソグラフィの本質は型を作製することにあり、この型については、Kamei,K.ichiro,Mashimo,Y.,Koyama,Y.,Fockenberg,C.,Nakashima,M.,Nakajima,M.,...Chen,Y.(2015).3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients.Biomedical Microdevices,によりPDMSがキャスティングされる。型は所望の部分のCAD設計から3Dプリントされる。3Dプリントには様々な技術を用いることができるが、突出物の場合には、ステレオリソグラフィを選択した。
所望の反応又はろ過動作を行なうために、微細流体技術チップには精度が高く正確度が高い方法及び技法が必要である。微細流体技術チップに用いられる最も一般の方法はソフトリソグラフィである。この場合、ソフトリソグラフィの本質は型を作製することにあり、この型については、Kamei,K.ichiro,Mashimo,Y.,Koyama,Y.,Fockenberg,C.,Nakashima,M.,Nakajima,M.,...Chen,Y.(2015).3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients.Biomedical Microdevices,によりPDMSがキャスティングされる。型は所望の部分のCAD設計から3Dプリントされる。3Dプリントには様々な技術を用いることができるが、突出物の場合には、ステレオリソグラフィを選択した。
様々な型を設計して、部品を送ってSLAを用いて3Dプリントした。SLAプリントにより、複雑な形を精度 10μmで約24時間で製作することができる。型に必要な使用量と様々な形状と特徴とについて、最高の解像度をSLAマシンに設定してプリントの解像度と精度とを最適化した。マスクの第1の変形例を顕微鏡によって解析して、CADファイルと3Dプリントされた部品とで寸法を比較した。図16は流路寸法の2つの顕微鏡解析を示す。
最後に、2つの異なる材料で型をプリントした。2つの材料はフォトポリマー樹脂であり、一方が高温樹脂である。これらの2つの材料の主要な違いは荷重たわみ前の最大温度である。一方が250℃まで上昇することが可能である場合に他方は50℃に達することが可能である。
ろ過膜の選択
具体的なろ過膜の選択を2つの工程で実現した。第1のステップの特徴は2つのろ過段階に用いられる2つの異なる膜の分子分画サイズを探索することにあった。実際には、各ろ過段階で異なる分子量を持つ異なる分子に対処する。概念上のプロセスを用いて本明細書に示されているように、薬剤のコストは高いので、薬剤の分子の一部をろ過し、薬剤の対応するバイオリアクタに還流して再利用する必要がある。表8では個々の分子と分子のサイズすなわち分子量が詳細に説明されている。
具体的なろ過膜の選択を2つの工程で実現した。第1のステップの特徴は2つのろ過段階に用いられる2つの異なる膜の分子分画サイズを探索することにあった。実際には、各ろ過段階で異なる分子量を持つ異なる分子に対処する。概念上のプロセスを用いて本明細書に示されているように、薬剤のコストは高いので、薬剤の分子の一部をろ過し、薬剤の対応するバイオリアクタに還流して再利用する必要がある。表8では個々の分子と分子のサイズすなわち分子量が詳細に説明されている。
2つの垂直TFF段階について、第1の垂直TFFはT7ポリメラーゼに対処する工程であるのに対して、第2の垂直TFFはM7g+メチル基転移酵素に対処する工程である。様々な分子サイズを考慮すると、滞留する必要がある分子よりも3倍小さい分子分画サイズを既定のろ過膜が持つ必要があり、この想定例では、このような分子はRNA分子である(General Electric,2014)。これに加えて、再利用分子にフィルタを通過させる程度にフィルタが十分大きい必要がある。このような知見を得て、各膜の分子分画サイズを以下に記載されているように割り当てた。
・垂直TFF1→分画分子量 300kDaの膜
・垂直TFF1→分画分子量 500kDaの膜
・垂直TFF1→分画分子量 300kDaの膜
・垂直TFF1→分画分子量 500kDaの膜
プロセスの第2の工程が膜の適切な提供元を選択することであるとした。したがって、時間的制約により、Synder filtration社の1m×1mのフラットシートメンブレン(flat sheet membrane)を選択した。300kDa、400kDa及び500kDaという異なる細孔サイズの3種類の膜を取り寄せ、これにより、様々な検証や実験を行ない、各膜のろ過効果を解析することができた。
PDMSマスク及びキャスティング
型をプリントして用意すれば、この型によりポリジメチルシロキサン(PDMS)微細流体物をキャスティングすることができる。PDMSチップを作製するのに用いた製品はSylgard(商標)184シリコーンエラストマーである。この生成物は1つのシリコーンエラストマー部分、及びエラストマーの分子架橋形成という役割を担う硬化剤という2つの要素によって提供され、硬化剤はキャスティング特性を維持しつつ、エラストマーを固化させる。ただし、型にわたってPDMSを塗布する前にいくつかの準備が必要である。表9は硬化温度を、それに対応する硬化時間とともに示す。
・シリコーンエラストマーと硬化剤とをビーカーで質量比 10:1(シリコーン/硬化剤)で10分間混合する。
・混合後、混合時の気泡をデシケータによって補助して除去する必要がある。すべての気泡が消失するまで、この作業を繰り返す。
・微小な気泡が残っている場合にはビーカーを安置する。気泡は自然に弾ける。
・混合物が用意されたら、混合物を3Dプリントされた型に塗布してから10~20分間安置する。
型をプリントして用意すれば、この型によりポリジメチルシロキサン(PDMS)微細流体物をキャスティングすることができる。PDMSチップを作製するのに用いた製品はSylgard(商標)184シリコーンエラストマーである。この生成物は1つのシリコーンエラストマー部分、及びエラストマーの分子架橋形成という役割を担う硬化剤という2つの要素によって提供され、硬化剤はキャスティング特性を維持しつつ、エラストマーを固化させる。ただし、型にわたってPDMSを塗布する前にいくつかの準備が必要である。表9は硬化温度を、それに対応する硬化時間とともに示す。
・シリコーンエラストマーと硬化剤とをビーカーで質量比 10:1(シリコーン/硬化剤)で10分間混合する。
・混合後、混合時の気泡をデシケータによって補助して除去する必要がある。すべての気泡が消失するまで、この作業を繰り返す。
・微小な気泡が残っている場合にはビーカーを安置する。気泡は自然に弾ける。
・混合物が用意されたら、混合物を3Dプリントされた型に塗布してから10~20分間安置する。
PDMS硬化の特性及び様子を比較するために様々な温度を試した。ただし、本プロセスに用いた第1の型は高温をサポートすることができないものであった。そのため、周囲温度での硬化が週末を越えても試験が行なわれていた。最後に、様々な機能部がPDMSマスク上にキャスティングされた状態で、これの開放側を封止する必要がある。マスクを封止するのに異なる2つの方法を用いて、試験により異なる結果を得た(図17は連続フローバイオリアクタシステムを作製する試作品製作プロセスの様々な工程の概要である)。
・第1の方法の特徴はPDMSの別の平坦な層でPDMSマスクを封止することにあるものであった。この方法により、マスク全体の余剰厚さを増すことができ、配管と取付け部とをマスクに組み込むのに有用であった。
・第2の方法の特徴はカプトンテープでPDMSマスクの開放側を封止することにあるものであった。この方法により、PDMSマスクの機能部とテープとの間の完全な封止が可能になる。しかし、マスクの厚さが薄いと、配管と取付け部との組み込みがより複雑になる。
・第1の方法の特徴はPDMSの別の平坦な層でPDMSマスクを封止することにあるものであった。この方法により、マスク全体の余剰厚さを増すことができ、配管と取付け部とをマスクに組み込むのに有用であった。
・第2の方法の特徴はカプトンテープでPDMSマスクの開放側を封止することにあるものであった。この方法により、PDMSマスクの機能部とテープとの間の完全な封止が可能になる。しかし、マスクの厚さが薄いと、配管と取付け部との組み込みがより複雑になる。
感知方法
連続フロー微細流体技術システムの機能部と反応とを考え合わせて主な検出システムが設計される。まず、微細流体技術チップの感知システムはチップサイズと検出される必要がある因子の特性とによって制限される。さらに、チップの正確でリアルタイムの検出結果を得るのに適するセンサを選択することが別の重要課題である。微細工場の検出システムは分光光度計、pHセンサ並びに圧力コントローラ及びセンサを含む。分光光度計の背景の理論はL.Zhu,(2005)とNuno Miguel Matos Pires,(2014)とKihwan Choi,(2015)によって説明されている。Yung-Shin Sun,(2016)によって圧力コントローラ及びセンサの背景の理論も検討された。
連続フロー微細流体技術システムの機能部と反応とを考え合わせて主な検出システムが設計される。まず、微細流体技術チップの感知システムはチップサイズと検出される必要がある因子の特性とによって制限される。さらに、チップの正確でリアルタイムの検出結果を得るのに適するセンサを選択することが別の重要課題である。微細工場の検出システムは分光光度計、pHセンサ並びに圧力コントローラ及びセンサを含む。分光光度計の背景の理論はL.Zhu,(2005)とNuno Miguel Matos Pires,(2014)とKihwan Choi,(2015)によって説明されている。Yung-Shin Sun,(2016)によって圧力コントローラ及びセンサの背景の理論も検討された。
材料の選択
a)分光光度計
分光光度計(Ocean Optics社(イギリス)のUSB2000+小型光ファイバ分光光度計(USB2000+Miniature Fiber Optic Spectrometer))は毎秒1000個の完全なスペクトルを記憶することができ、その検出波長範囲は190~1100nmである。これに加えて、公式ソフトウェアを用いるために、検出システムの特性に応じたPythonのオープンソースパッケージを用いたプログラミングが中心となる。この分光光度計は連続反応をモニタするのに好適である。
b)pH計
pH計(Hanna Instruments社(イギリスベッドフォードシャー州)のHI-1093B pH電極)の測定範囲は0~13である。pH計を微細流体技術チップと一体化するためには、pH計の寸法に対して設計仕様による制限を行なう。微細流体技術チップ上の測定セルの直径は5mm2であり、pH計の本体は直径 3mmである。
c)圧力コントローラ及びセンサ
微細流体技術チップのCFD解析から、バイオリアクタ及びTFFセクションの圧力が0.27Barであることが示されている。圧力センサ(ELVEFLOW(フランスパリ)のMPSマイクロ流体高精度圧力センサ(MPS Microfluidic High Precision Pressure Sensor))は70mBarから7Barまでの5つの測定範囲を実現することができる。超微小内部容積を7.5μLまで検出することもでき、容積 0.5mLのマイクロ流体チップに適用することができる。このセンサの流量調整は感度が高く、応答性に優れているものであるので、流量の微小な変化のリアルタイムのモニタリングに好適である。センサの相手となるセンサリーダー(ELVEFLOW(フランスパリ)のSensor Reader)によって高速性を得ることができ、チップへの組み込みが容易であり、これにより、測定が単純かつ実施可能になる。
d)圧力供給源
シリンジポンプ(Tricontinent(米国カリフォルニア州)のC3657 C-Series Syringe Pumps)が反応剤材料をマイクロ流体チップに供給する圧力供給源として用いられる。ポンプのストローク速度は1ストロークにつき1.2秒~100分であり、ポンプ分解能は標準モードについては3,000ステップであり、高分解能モードについては24,000ステップである。システムの反応時間は4~6時間である。また、このようなシリンジポンプによってマイクロ流体システムで定常状態の流量を実現することができる。反応成分を注入する5つの流入部の圧力によって反応剤の割合を制御してRNAワクチンの無駄のない効果的な産出量を実現することができる。
a)分光光度計
分光光度計(Ocean Optics社(イギリス)のUSB2000+小型光ファイバ分光光度計(USB2000+Miniature Fiber Optic Spectrometer))は毎秒1000個の完全なスペクトルを記憶することができ、その検出波長範囲は190~1100nmである。これに加えて、公式ソフトウェアを用いるために、検出システムの特性に応じたPythonのオープンソースパッケージを用いたプログラミングが中心となる。この分光光度計は連続反応をモニタするのに好適である。
b)pH計
pH計(Hanna Instruments社(イギリスベッドフォードシャー州)のHI-1093B pH電極)の測定範囲は0~13である。pH計を微細流体技術チップと一体化するためには、pH計の寸法に対して設計仕様による制限を行なう。微細流体技術チップ上の測定セルの直径は5mm2であり、pH計の本体は直径 3mmである。
c)圧力コントローラ及びセンサ
微細流体技術チップのCFD解析から、バイオリアクタ及びTFFセクションの圧力が0.27Barであることが示されている。圧力センサ(ELVEFLOW(フランスパリ)のMPSマイクロ流体高精度圧力センサ(MPS Microfluidic High Precision Pressure Sensor))は70mBarから7Barまでの5つの測定範囲を実現することができる。超微小内部容積を7.5μLまで検出することもでき、容積 0.5mLのマイクロ流体チップに適用することができる。このセンサの流量調整は感度が高く、応答性に優れているものであるので、流量の微小な変化のリアルタイムのモニタリングに好適である。センサの相手となるセンサリーダー(ELVEFLOW(フランスパリ)のSensor Reader)によって高速性を得ることができ、チップへの組み込みが容易であり、これにより、測定が単純かつ実施可能になる。
d)圧力供給源
シリンジポンプ(Tricontinent(米国カリフォルニア州)のC3657 C-Series Syringe Pumps)が反応剤材料をマイクロ流体チップに供給する圧力供給源として用いられる。ポンプのストローク速度は1ストロークにつき1.2秒~100分であり、ポンプ分解能は標準モードについては3,000ステップであり、高分解能モードについては24,000ステップである。システムの反応時間は4~6時間である。また、このようなシリンジポンプによってマイクロ流体システムで定常状態の流量を実現することができる。反応成分を注入する5つの流入部の圧力によって反応剤の割合を制御してRNAワクチンの無駄のない効果的な産出量を実現することができる。
方法
モニタする必要がある反応の重要なパラメータはRNA及びMg2+の濃度、反応のpH値並びに温度である。同時に、RNA産出量の適切な比率を実現し、反応時間を適切にするために連続フロー流路の混合溶液の流量を調節するように流入部圧力を制御する必要がある。3つの検出箇所が微細流体技術チップに存在し、2箇所がRNA及びMg2+の定量に用いられ、その他がpH値測定に用いられる。また、圧力センサはチップ外に作製される。Mg2+及びRNAの濃度レベル変化を反応の速度を検出するのに用いることができる。吸光度を濃度に変換する方法はRNA及びMg2+の定量を実現する一般的な手法である。260nmでのUV吸光度測定がRNA定量のゴールドスタンダードであり、680nmでの吸光度測定を用いてMg2+定量を得ることができる。RNA及びMg2+の吸光度測定値をBeer-Lambert法則を用いて濃度に変換することができる。本設計では、バイオリアクタを製造するのにPDMSが用いられ、PDMSは十分に透明である。これにより、効果的RNA検出が実現可能になる。
モニタする必要がある反応の重要なパラメータはRNA及びMg2+の濃度、反応のpH値並びに温度である。同時に、RNA産出量の適切な比率を実現し、反応時間を適切にするために連続フロー流路の混合溶液の流量を調節するように流入部圧力を制御する必要がある。3つの検出箇所が微細流体技術チップに存在し、2箇所がRNA及びMg2+の定量に用いられ、その他がpH値測定に用いられる。また、圧力センサはチップ外に作製される。Mg2+及びRNAの濃度レベル変化を反応の速度を検出するのに用いることができる。吸光度を濃度に変換する方法はRNA及びMg2+の定量を実現する一般的な手法である。260nmでのUV吸光度測定がRNA定量のゴールドスタンダードであり、680nmでの吸光度測定を用いてMg2+定量を得ることができる。RNA及びMg2+の吸光度測定値をBeer-Lambert法則を用いて濃度に変換することができる。本設計では、バイオリアクタを製造するのにPDMSが用いられ、PDMSは十分に透明である。これにより、効果的RNA検出が実現可能になる。
反応の際、対応する熱安定性DNAポリメラーゼがpH値の主な原因になる。pH8.3~9.0はシステムにおける最適結果を与えることができるものである。また、反応の際にpH値を上げることで、DNAの鋳型を安定させて転写結果を向上させることを補助することができる。組換え酵素の活性はアッセイのpHによって大きく影響される。デバイスの統合のために、データ収集のコアにArduinoのマイクロコントローラ(Arduino(イギリス)のARDUINO UNO REV3)を用いた。
統合化実験用プラットフォーム
図18A~図18Cには本液流反応システムの概略図が示されている。本システムは、圧力、温度、pH、流量、流動量(flow volume)などを含む液流システム内を流れる液の様々な特性を測定するように構成されている複数のセンサを含む。本システムには、装置中の液の成分の流動経路を制御するために複数のバルブ、注入ポート、ポンプ、特にシリンジポンプ、ゲートなどが組み込まれる。たとえば、必要に応じてバイオリアクタ及び/又はろ過モジュールの長手方向の端にある流出ポートから液の成分を再循環して上流のバイオリアクタ及び/又はろ過モジュールの流入ポートに還流させてもよい。本システムは制御部をさらに含み、制御部は通常、CPU、マイクロプロセッサやその他適当な電子プロセッサデバイスを含む。特定の実施形態に係れば、プロセッサはPCB又はPLCに組み込まれる。制御部にはユーザインタフェイス、感知データ記憶ユーティリティ、ソフトウェア、視覚表示デバイス、通信ポート及び/若しくはモジュール、少なくとも1つのアナログデジタルコンバータ並びに/又はデータソースライブラリが設けられている。このような構成要素をセンサ、注入ポート、ポンプ、バルブなどと組み合わせて制御部によって利用して、液流システム中の液流を連続的かつ自動的に制御することができる。したがって、薬剤の連続投入に用いられる連続リアクタシステムが実現され、所望の反応剤生成物の連続産出が可能になる。本システムは薬剤、溶媒などを再循環させて再使用して、無駄を最小にし、効率を最大にするのに有効である。設備が用意された後、それらのレイアウトが設計され、実験環境が整えられる。当然、PDMSチップは固定具によって動かないようにして留められるべきである。その後、これに応じて他の器具の位置が決められる。
図18A~図18Cには本液流反応システムの概略図が示されている。本システムは、圧力、温度、pH、流量、流動量(flow volume)などを含む液流システム内を流れる液の様々な特性を測定するように構成されている複数のセンサを含む。本システムには、装置中の液の成分の流動経路を制御するために複数のバルブ、注入ポート、ポンプ、特にシリンジポンプ、ゲートなどが組み込まれる。たとえば、必要に応じてバイオリアクタ及び/又はろ過モジュールの長手方向の端にある流出ポートから液の成分を再循環して上流のバイオリアクタ及び/又はろ過モジュールの流入ポートに還流させてもよい。本システムは制御部をさらに含み、制御部は通常、CPU、マイクロプロセッサやその他適当な電子プロセッサデバイスを含む。特定の実施形態に係れば、プロセッサはPCB又はPLCに組み込まれる。制御部にはユーザインタフェイス、感知データ記憶ユーティリティ、ソフトウェア、視覚表示デバイス、通信ポート及び/若しくはモジュール、少なくとも1つのアナログデジタルコンバータ並びに/又はデータソースライブラリが設けられている。このような構成要素をセンサ、注入ポート、ポンプ、バルブなどと組み合わせて制御部によって利用して、液流システム中の液流を連続的かつ自動的に制御することができる。したがって、薬剤の連続投入に用いられる連続リアクタシステムが実現され、所望の反応剤生成物の連続産出が可能になる。本システムは薬剤、溶媒などを再循環させて再使用して、無駄を最小にし、効率を最大にするのに有効である。設備が用意された後、それらのレイアウトが設計され、実験環境が整えられる。当然、PDMSチップは固定具によって動かないようにして留められるべきである。その後、これに応じて他の器具の位置が決められる。
始めに、4つの投入容器に圧力を入力するのに4つのシリンジポンプをそれぞれ用いた。PDMSチップに微少量のサンプルを送るのに一般的に配管と取付け部とが用いられる。第2のバイオリアクタの先頭箇所(第1のTFFの末尾)にある第2の容器に別のポンプが接続され、これにより、m7Gメチル基転移酵素を注入し、チップ中の圧力を調整することができ、フィードバックループを用いる圧力センサを用いることで、液流制御の応答性が大幅に向上する。圧力センサが流路の流入部と流出部とで測定することが考えられている。デバイス内で一定圧力を続けて確保することができる状態で、シリンジポンプを動作させ続けることを目的としている。
濃度検出を実施するためには、第1のバイオリアクタ(蛇行流路)の末尾にある検出室を紫外光/可視光が通過するべきであり、この光は光ファイバによって伝送される。特定の波長の要求に適合する2つの微小光ファイバが互いに垂直に(vertically to each other)設置され、2つの微小光ファイバは、光源に接続された光源ファイバと、小型分光光度計に接続された集光ファイバである。連続バイオ反応の際、pHセンサをバッファに入れてpH値を測定することを想定している一方で、温度センサをボード上に配置して反対側にヒーターを配置し、温度を調節することができる。pHセンサと温度センサとにはBNCコネクタが設けられ、BNCコネクタをArduinoに接続することができる。したがって、それらのセンサからデータを得ることができる。
データ取得及びモニタリング
分光光度計データ
Lambert-Beer法則により、被検体濃度と特定の波長の吸光度との以下の線形関係が説明される。
ここで、I0は光源の初期強度であり、I1はそれがサンプルを通過した後の光の強度であり、εは単位がM-1cm-1である波長に依存するモル吸光係数を表わし、Lは経路長であり、Cは被検体濃度である。
分光光度計データ
Lambert-Beer法則により、被検体濃度と特定の波長の吸光度との以下の線形関係が説明される。
ここで、I0は光源の初期強度であり、I1はそれがサンプルを通過した後の光の強度であり、εは単位がM-1cm-1である波長に依存するモル吸光係数を表わし、Lは経路長であり、Cは被検体濃度である。
したがって、所望の分光光度計データは吸収スペクトルそのものである。Ocean Opticsの分光光度計によってPythonからデータにアクセスする容易な方法を実現した。この方法はPython-Seabreezeパッケージであり、このパッケージには分光光度計と通信するSeabreezeライブラリが入っている。これにより、Ocean OpticsのUSBインタフェイスの完全動作とテスト済みのリファレンス実装とが実現され、このことから、pythonを用いて分光光度計データの読み込みとモニタリングとが可能であるということがいえる。pythonと分光光度計との接続が図19に示されている。
pHセンサをBNCコネクタを通じてArduinoと接続した後、センサデータを得ることができ、リアルタイムデータをシリアルモニタでチェックすることができる。これに用いられるコードが図19に示されている。温度センサデータを得るのに同じ機構が用いられる。薬剤の割合が異なることの影響並びにマグネシウムアイコンの反応時間及び割合に注目して5つの完全実施要因実験(full factorial experiment)を行なった。実験は容積が500μLであるフェドバッチシステムに基づいて行なわれた。背景実験データを以下に示す。データからいくつかの結論を導くことができる。図21はNTP 10mM、NaCl 10mM、MgCl2 75mMと酢酸イオンとの混合物から得られる最大産出値を示しており、最大産出値はRNA産出量約900mMであり、これを最適な組合せと考えることができる。図22にはRNA産出に最適な反応時間が示されている。Mg(OAc)2の割合が約80mmolであるときにRNA産出量は最大レベルに達することができる。4時間の反応の後、RNA産出量は1800mM程度で安定状態に達する。反応条件の最適な組合せはMgCl2、NaCl及びNTPの割合並びに反応時間という4つの主な要因に依存する。さらに別の実験では、RNAの最大産出量を得るために、MgCl2、NaCl及びNTPの割合をモニタしてこれらを所定のレベルに保つ必要がある。インペリアルカレッジとクランフィールド大学との実験の最も顕著な違いは反応システムの設計である。製造の検討のため、フェドバッチ反応システムではなく、バイオリアクタプロセス用に連続フローシステム(continues follow system)を設計している。連続フローシステムを検証するために、Imperial CollegeのShattock Groupによって行なわれた上記の実験に基づいて本実験を計画する。
4つの要因に対して3つのレベルを選定して(表10)、連続フローシステムでのRNA産出量に最適な割合を検証する。選定された要因はフェドバッチシステムでの実験の結果を指す。これに加えて、DNA及びT7ポリメラーゼの値は合理的に考えて再利用の値である。これらの要因を用いて、実験の新たな計画が表11のように示されている。実験の目的は、RNA産出量と4つの要因との関係を探索することと、反応の傾向を特定することである。
結果及び検討
流体力学及びCFD解析
バイオリアクタ及びTFF部分における流体力学的検討に適切な支配方程式を適用して、定常流状態で液の速度が一定であり、適切な圧力勾配がある状態でろ液量を計算する。微細流路内の圧力降下の予測を得るために式(6)を用いた。代表長さの選定は任意に選んだものであり、表12及び表13に示されているように最終的な解に影響しない。
流体力学及びCFD解析
バイオリアクタ及びTFF部分における流体力学的検討に適切な支配方程式を適用して、定常流状態で液の速度が一定であり、適切な圧力勾配がある状態でろ液量を計算する。微細流路内の圧力降下の予測を得るために式(6)を用いた。代表長さの選定は任意に選んだものであり、表12及び表13に示されているように最終的な解に影響しない。
TFF部分の流体力学的検討
透過定数(permeability constant)を得て、適切な境界条件の下で微孔流路にわたって流体パラメータを解くのにCerman-Kozeny関係が用いられる。ここで、表15では投入粒子サイズが変化するので、様々な粒径及び細孔サイズが適用される。
透過定数(permeability constant)を得て、適切な境界条件の下で微孔流路にわたって流体パラメータを解くのにCerman-Kozeny関係が用いられる。ここで、表15では投入粒子サイズが変化するので、様々な粒径及び細孔サイズが適用される。
前記形状の圧力降下を式10から予測することができる。測定単位がミクロンの場合に数学的な誤差が生じるという式の制限がある。微孔流路の長さで割った圧力降下(表16に示す)。
ここで、
μ=粘度(Dynamic Viscosity)
Q:流量
h:流路の高さ/深さ
K:透過率
ここで、
μ=粘度(Dynamic Viscosity)
Q:流量
h:流路の高さ/深さ
K:透過率
計算流体力学解析
バイオリアクタ流路の速度プロファイル
図23A及び図23Bによって示されているように、バイオリアクタ流路全体にX方向の速度が存在する。0.0001ms^-1~0.0002ms^-1に及ぶ同じ速度を示す異なる2つの色がある。これは、黄色が正の方向を示し、緑色が負の方向を示すからである。図23Bには、最初に、最初のポンプによって高い圧力が加えられるために速度が増加し、その後、約の一定の速度 0.00033ms^-1まで低下したことが示されている。この速度は予測結果の約2倍高い速度である。
バイオリアクタ流路の速度プロファイル
図23A及び図23Bによって示されているように、バイオリアクタ流路全体にX方向の速度が存在する。0.0001ms^-1~0.0002ms^-1に及ぶ同じ速度を示す異なる2つの色がある。これは、黄色が正の方向を示し、緑色が負の方向を示すからである。図23Bには、最初に、最初のポンプによって高い圧力が加えられるために速度が増加し、その後、約の一定の速度 0.00033ms^-1まで低下したことが示されている。この速度は予測結果の約2倍高い速度である。
タンジェンシャルフローろ過流路
図24はタンジェンシャルフローろ過流路の速度を示す。微細流路内の個々の速度が流入部の速度に近い0.0001327ms^-1~0.0001858ms^-1であることが色によって示されている。さらに、流出部の速度が所望したように0.000145ms^-1から0.000138ms^-1に僅かに低下することが表18のデータによって示されている。
図24はタンジェンシャルフローろ過流路の速度を示す。微細流路内の個々の速度が流入部の速度に近い0.0001327ms^-1~0.0001858ms^-1であることが色によって示されている。さらに、流出部の速度が所望したように0.000145ms^-1から0.000138ms^-1に僅かに低下することが表18のデータによって示されている。
バイオリアクタの圧力の等圧表示
図25はバイオリアクタ流路の圧力降下を示す。色は個々の圧力値を示す。バイオリアクタ流路に多数の曲がり部が存在する結果として圧力が降下することが図25Bによって示されている。このような様々な結果は設計の改変で考えられていた。
図25はバイオリアクタ流路の圧力降下を示す。色は個々の圧力値を示す。バイオリアクタ流路に多数の曲がり部が存在する結果として圧力が降下することが図25Bによって示されている。このような様々な結果は設計の改変で考えられていた。
実験結果
PDMSマスク検証
バイオリアクタ
型の様々な変形例が本出願の検討を通じて理解されてきたのと同時に、結果の進展も見られたので、これについて説明する。
PDMSマスク検証
バイオリアクタ
型の様々な変形例が本出願の検討を通じて理解されてきたのと同時に、結果の進展も見られたので、これについて説明する。
a)第1型世代
まず、2つのバイオリアクタの第1の変形例を両方とも検証した。カプトンテープと第2のPDMS層という異なる封止体について選択的に実験し、結果を得た。リアクタを両方とも35℃で2日間にわたって硬化させ続けた。2つのリアクタを最初に別の平坦なPDMSの層で封止した。各マスクの流入部の1つに緑色の水をシリンジにより導入した。図26A及び図26Bは各マスクの液の挙動についての最初の結果を示す。2つの図は、バッチバイオリアクタ上で、緑色の水がマスク内に導入されるときに水がリアクタの中間部の同じ高さを示している様子を示す。このことは、図26Aの青い部分で分かるが、リアクタの中間部が硬化した際に崩壊したということによって説明された。さらに、緑色の水のサンプルがマスクのT形合流部を通って、基幹流路の経路を辿ったことが図26Bに示されている。しかし、サンプルはいくつかの領域をよけた。流路の壁のサイズ、すなわち、硬化プロセス中に圧力を支えることができず、崩壊することによってこれを説明することができる。
まず、2つのバイオリアクタの第1の変形例を両方とも検証した。カプトンテープと第2のPDMS層という異なる封止体について選択的に実験し、結果を得た。リアクタを両方とも35℃で2日間にわたって硬化させ続けた。2つのリアクタを最初に別の平坦なPDMSの層で封止した。各マスクの流入部の1つに緑色の水をシリンジにより導入した。図26A及び図26Bは各マスクの液の挙動についての最初の結果を示す。2つの図は、バッチバイオリアクタ上で、緑色の水がマスク内に導入されるときに水がリアクタの中間部の同じ高さを示している様子を示す。このことは、図26Aの青い部分で分かるが、リアクタの中間部が硬化した際に崩壊したということによって説明された。さらに、緑色の水のサンプルがマスクのT形合流部を通って、基幹流路の経路を辿ったことが図26Bに示されている。しかし、サンプルはいくつかの領域をよけた。流路の壁のサイズ、すなわち、硬化プロセス中に圧力を支えることができず、崩壊することによってこれを説明することができる。
次に、カプトンテープで封止された連続フローリアクタを検証した。図27は今回の構成内の液の挙動を示す。液(濃緑色)が問題なく経路を辿った。封止は上述の封止よりも良好に機能した。しかし、流路のサイズに起因して、硬化は今回も適切に行なわれず、マスクのいくつかの部分が型から適切に剥離されなかった。これにより、マスクにいくつかの欠陥領域が形成された。
様々な検証に際してなされたすべての検討から、設計を変更した。これに加えて、支持台(platform)を作製することが決定された。支持台において、PDMSマスクを2つのアクリルプレートの間に配置することができ、これにより、2つのPDMS層の間の圧力が増大し、したがって、マスクの検証時に流路が崩壊することが避けられる。これらの2つのアクリルプレートによってチップに取付け部及び配管を接続することもできる。
図28には、カプトンで封止されたマスクが2つのプレートの間に配置され、配管、取付け部及びいくつかの感知機器と接続されており、最初のPH及び吸光度試験並びに測定が可能になっている様子が示されている。
b)第2型世代
第2型世代をプリントするのに高温耐熱材料を用い、マスクを70℃の硬化温度で4時間かけてキャスティングした。図29に示されているように、使用後の型を用い、型と直接接触した側が型と結合していた。PDMSマスクの微小部分を剥離することができず、マスクから外すことができなかった。特に流路の間については、PDMSの薄い層がマスクに張りついたままだった。硬化は適切に行なわれたが、マスクを型から剥離することに失敗した。可能な限り型をイソプロパノールでクリーニングすることを試した後、別の試作品を硬化温度100℃で35分間かけて得た。しかし、同じ問題が生じた。3Dプリンタ製の高温耐熱材料がこの高温耐熱材料と直接接触したPDMS層と結合したということによってこのような問題を説明することができる。壁も、マスク全体の硬化均一性の不安定化につていの影響を受けるといえる。
第2型世代をプリントするのに高温耐熱材料を用い、マスクを70℃の硬化温度で4時間かけてキャスティングした。図29に示されているように、使用後の型を用い、型と直接接触した側が型と結合していた。PDMSマスクの微小部分を剥離することができず、マスクから外すことができなかった。特に流路の間については、PDMSの薄い層がマスクに張りついたままだった。硬化は適切に行なわれたが、マスクを型から剥離することに失敗した。可能な限り型をイソプロパノールでクリーニングすることを試した後、別の試作品を硬化温度100℃で35分間かけて得た。しかし、同じ問題が生じた。3Dプリンタ製の高温耐熱材料がこの高温耐熱材料と直接接触したPDMS層と結合したということによってこのような問題を説明することができる。壁も、マスク全体の硬化均一性の不安定化につていの影響を受けるといえる。
垂直フローろ過モジュール
垂直TFF型の変形例を高温耐熱材料を用いて1つだけプリントした。バイオリアクタマスクについては、同じプロセスを踏襲し、PDMSサンプルをホイル紙の受け部に流し込み、プロセスの様々な様子及び結果を比較するために2つのマスクとともにオーブンに入れた。図30A及び図30Bはマスクと、オーブンで硬化させたサンプルとの様子を示す。バイオリアクタマスクについては、型と接触したPDMSが型と結合していた。型から剥離するときに、図30Aに示されているようにマスクに亀裂が生じて破損した。一方で、ホイル紙内で硬化させたサンプルは一切デフォルト値を用いずに硬化しており、ホイルから剥離しても何も起こっていない。それに加え、図30Bに示されているようにサンプルについてはホイルの形状の完璧なキャスティングを行なっている。
垂直TFF型の変形例を高温耐熱材料を用いて1つだけプリントした。バイオリアクタマスクについては、同じプロセスを踏襲し、PDMSサンプルをホイル紙の受け部に流し込み、プロセスの様々な様子及び結果を比較するために2つのマスクとともにオーブンに入れた。図30A及び図30Bはマスクと、オーブンで硬化させたサンプルとの様子を示す。バイオリアクタマスクについては、型と接触したPDMSが型と結合していた。型から剥離するときに、図30Aに示されているようにマスクに亀裂が生じて破損した。一方で、ホイル紙内で硬化させたサンプルは一切デフォルト値を用いずに硬化しており、ホイルから剥離しても何も起こっていない。それに加え、図30Bに示されているようにサンプルについてはホイルの形状の完璧なキャスティングを行なっている。
上記の様々な検討から、いくらかの解析を行なうことができ、結果を得ることができる。
・ホイル内のサンプルが問題なく使用されたので、化学とプロトコールに問題があるとはいえない。
・異なるマスクで同じデフォルトが数回起こった。したがって、高温材料はPDMSマスクキャスティングに悪影響を及ぼし、このような実験に用いるべきではない。
・最初に行なったものに用いられた最初の材料を引き続き用いるべきであり、PDMSマスクが適切にキャスティングされるようにし、型から離れる一切の荷重たわみを回避するために、硬化パラメータを周囲温度に設定して48時間で硬化させるべきである。
上述の結果にもかかわらず、図31に示されている新たなプラットフォームを作製した。
・ホイル内のサンプルが問題なく使用されたので、化学とプロトコールに問題があるとはいえない。
・異なるマスクで同じデフォルトが数回起こった。したがって、高温材料はPDMSマスクキャスティングに悪影響を及ぼし、このような実験に用いるべきではない。
・最初に行なったものに用いられた最初の材料を引き続き用いるべきであり、PDMSマスクが適切にキャスティングされるようにし、型から離れる一切の荷重たわみを回避するために、硬化パラメータを周囲温度に設定して48時間で硬化させるべきである。
上述の結果にもかかわらず、図31に示されている新たなプラットフォームを作製した。
統合した実験計画に基づいて、すべての設備を実験室に集め、システムの有効性を確認するために実験用プラットフォームを構築した。実験室で製作された実験用プラットフォームが図31に示されており、PDMSチップが固定具によって動かないようにして留められ、配管と取付け部とによってポンプとチップとを接続した。2つの光ファイバが互いに垂直に設置され、2つの光ファイバは、光源に接続された光源ファイバと、小型分光光度計(Ocean Optics USB2000+)に接続された集光ファイバである。
吸光度測定及びデジタル出力
高正確度吸光度測定
正確に吸光度を測定するために、ベースラインを設ける必要がある。まず、サンプルを用いずにバックグラウンド発光源のスペクトルを記録する。次に、吸収経路にサンプルを加えて実験を繰り返す。次に、初回のスペクトルを2回目のスペクトルから差し引いて本サンプルの純粋な吸収スペクトルを得る。ノイズの効果を打ち消すために、バックグラウンドスペクトルをサンプルのスペクトルと参照スペクトルとの両方から差し引くべきである。したがって、式(9)は以下になるはずである。
高正確度吸光度測定
正確に吸光度を測定するために、ベースラインを設ける必要がある。まず、サンプルを用いずにバックグラウンド発光源のスペクトルを記録する。次に、吸収経路にサンプルを加えて実験を繰り返す。次に、初回のスペクトルを2回目のスペクトルから差し引いて本サンプルの純粋な吸収スペクトルを得る。ノイズの効果を打ち消すために、バックグラウンドスペクトルをサンプルのスペクトルと参照スペクトルとの両方から差し引くべきである。したがって、式(9)は以下になるはずである。
ここで、Isampleはサンプルを通過した後の光強度であり、IBは、光源をオフにしたり遮ったりして、サンプルを用いずに分光光度計によって記録されたバックグラウンド光強度であり、IREFは参照光強度である。
紫外可視データ解析
Python-Seabreeze APIを用いれば、紫外可視分光光度計からリアルタイムデータを取得して、波長に対する強度の図表をプロットすることは容易である。図32に示されているように、波長が約580nmであるときに光強度がピークの値に達する。異なる濃度での吸光度と波長との関係を確認するために、A(25mM/L)、B(50mM/L)、C(75mM/L)、D(100mM/L)の異なる濃度のビタミンB12溶液をそれぞれ用いた。(図33を参照)。紫外可視スペクトル結果が図34に示されており、サンプル濃度の増加にともなって吸光度が増加し、吸光度は波長550nmで最大に達する。
Python-Seabreeze APIを用いれば、紫外可視分光光度計からリアルタイムデータを取得して、波長に対する強度の図表をプロットすることは容易である。図32に示されているように、波長が約580nmであるときに光強度がピークの値に達する。異なる濃度での吸光度と波長との関係を確認するために、A(25mM/L)、B(50mM/L)、C(75mM/L)、D(100mM/L)の異なる濃度のビタミンB12溶液をそれぞれ用いた。(図33を参照)。紫外可視スペクトル結果が図34に示されており、サンプル濃度の増加にともなって吸光度が増加し、吸光度は波長550nmで最大に達する。
pHセンサの較正及びデジタル出力
pHセンサの較正
正確さを確保するために、初めて使用されるPHプローブは較正される必要がある。pHセンサを較正するのに2つの標準緩衝液が用いられ、これらはpH4.0及び7.0の緩衝液である。DFROBOTによって提供される較正ステップ後に較正は完了した。
pHセンサの較正
正確さを確保するために、初めて使用されるPHプローブは較正される必要がある。pHセンサを較正するのに2つの標準緩衝液が用いられ、これらはpH4.0及び7.0の緩衝液である。DFROBOTによって提供される較正ステップ後に較正は完了した。
リアルタイムでのpH値のプロット
次のステップの特徴はpHセンサの有効性を酸性溶液とアルカリ性溶液とを用いて検証することにあるものであった。図35の結果によって、pH変化にしたがってリアルタイムの図表の動的変化が生じることが示され、これにより、その妥当性が示されている。
次のステップの特徴はpHセンサの有効性を酸性溶液とアルカリ性溶液とを用いて検証することにあるものであった。図35の結果によって、pH変化にしたがってリアルタイムの図表の動的変化が生じることが示され、これにより、その妥当性が示されている。
検討
重要な結果の評価
検討作業と得られた結果はラボオンチップ技術を実施してRNA産出値を最大にしつつ連続フロー反応を実現する効果的な試みである。SBCE法を適用することにより、設計フレームワーク全体を構築することができ、本課題の最初から最後までこれに従った。分割された機能的なサブシステムを有するデバイスのモジュール式の設計により、混合部、反応部及びろ過精製部の操作の個々の革新的な解決手段を含むことができる。図30A~図30Cは製剤のための下流のモジュールを含む統合化システムの概略図を示す。特に、図30A~30Cは、モジュール式フローリアクタを用いて下流の製剤システム(モジュール2)(たとえば、国際公開公報第2013/050764号及びM.Jreissat,2016,’’A novel flow system for the concurrent product and process design of emulsion-based formulations’’,Brunel University London)、及び一体型紫外可視プローブと統合され、従来の充填仕上げワクチン製造ラインに取り付けられる本フローシステムの実施形態の図である。
重要な結果の評価
検討作業と得られた結果はラボオンチップ技術を実施してRNA産出値を最大にしつつ連続フロー反応を実現する効果的な試みである。SBCE法を適用することにより、設計フレームワーク全体を構築することができ、本課題の最初から最後までこれに従った。分割された機能的なサブシステムを有するデバイスのモジュール式の設計により、混合部、反応部及びろ過精製部の操作の個々の革新的な解決手段を含むことができる。図30A~図30Cは製剤のための下流のモジュールを含む統合化システムの概略図を示す。特に、図30A~30Cは、モジュール式フローリアクタを用いて下流の製剤システム(モジュール2)(たとえば、国際公開公報第2013/050764号及びM.Jreissat,2016,’’A novel flow system for the concurrent product and process design of emulsion-based formulations’’,Brunel University London)、及び一体型紫外可視プローブと統合され、従来の充填仕上げワクチン製造ラインに取り付けられる本フローシステムの実施形態の図である。
デバイスの合成成績は、図30A~図30Dの実施形態のフローリアクタの産出溶液の波長に対する吸光度のグラフである図30Dに示されている。図40Aは吸光度データとPythonでのリアルタイムプロット(波長に対する吸光度)とのソースコードの図であり、図40BはPythonの実況プロットpHデータのソースコードの図である。
生成物は、従来のバッチプロトコールに対する紫外可視分光を用いて評価されたフローリアクタのis産出溶液の従来のバッチプロトコールグラフに対する紫外可視分光を用いて評価される。グラフ中にRNAの高い濃度レベルを示す高いピークがあることで、バッチプロトコールと比較して本方法の生産性がきわめて高いと考えることができる。図30Dで示されている紫外可視スペクトルでは、従来のバッチプロトコールと本発明の連続フロープロトコールとを用いて得られたRNA物質を比較している。バッチ式プロトコールと比較して高いフロー式プロトコールのピークは溶液に存在する核酸の高い濃度に対応する。点線はRNAの既知の濃度のサンプルに対応しており、バッチ式とフロー式とで得られるものの比較の一助として記入されている。
異なる2つの設計解決手段は、RNA製造を大部分が手動のバッチプロセス(従来のRNA合成)から連続フロー形式に変更することを可能にするリアクタのために開発された。実際に、本発明の連続フローリアクタは革新的で実証済みのリアクタであり、問題なく機能する。本発明は、十分に開発された装置及びプロセスを実施し、迅速な規模の拡大と、自動化されたコンピュータ制御による連続フロー形式でのRNA系物質の生産性の高い製造とに取り組む際の動作及び性能を実証するような先行技術の工程変化を表わす。
ろ過モジュールについては、一般的な製造方法を用いて製造及び規模変更を行なうのに容易でありつつ、連続フロー処理と、フローリアクタと統合する能力との要件を満たすように深く検討して解析した。タンジェンシャルフローろ過はRNA精製プロセスに効果的であることが実証されている一般的な技術である(A.Eon-Duval et al.,2002)が、本発明は、連続フローシステムとして用いるように構成されることを目的として開発されて、意図的に設計されて構築され、製造が容易であり、連続フローシステムに組み込むことができ、規模の変更が可能であり費用対効果の高いデバイスの製造を可能にする新規のろ過デバイスを含む。使用時に治療核酸系物質の自動化された柔軟な製造を可能にすることができる微細工場として本システムを統合することができる。これに加えて、モジュール式の設計により、本ろ過システムを用いることで酵素とプラスミドDNAなどの特定の成分の再循環が可能になり、これにより、製造された物質の総原価が大幅に下がる。
システム全体について、試験及び実験を行なうために新規の統合化プラットフォームを開発した。アクリル加圧プレートを用いてシステムを試作した。また、システムはポンプ用のポートのすべて、センサ並びに流入部及び流出部用の取付け部を含む。これにより、各プロセスの様々な要素及び段階から素早いフィードバックを得ながら連続フロー反応やろ過を検証することができる。さらに、実験を行なうのに使用が容易なフレームワークを可能にするモジュール方式のシステムを試作した。3Dプリントは、柔軟性が高く、コストが低く、リードタイムが短いので型を製造するのに選択したツールであった。モジュールの構成は、ガラス、ステンレス鋼などの金属やポリメチルメタクリレートPMMA(アクリル)基板の微細加工や、感光性ガラスやシリコンを含む基板へのフォトリソグラフィや深掘り反応性イオンエッチングなどの技術を用いて商業的生産に容易に移行することができるものである。さらに、モジュールの大規模製造のために、構造体のPMMA及びポリカーボネート材料に射出成形を用いることができる。
紫外可視スペクトルにより、反応溶液の内容物の信頼性の高いオンライン解析及びインサイツ解析をリアルタイムに提供する本発明の能力が実証されている。これにより、液流を管理し、温度、pHや、フローシステム中の反応剤の分注を調整して全体にわたってプロセスの状態を維持する閉フィードバックループも提供される。
Claims (38)
- 少なくとも1種類のヌクレオシド三リン酸(nucleoside triphosphate:NTP)、反応緩衝液及びDNA、DNA系化合物又はDNA系混合物を含む複数の反応剤を複数の流入ポートを介して第1の液流モジュールに導入するステップと、
前記反応剤の少なくともいくつかをフローシステムの前記第1のモジュール中の反応流路内又はウェル内で反応させるステップと、
前記第1のリアクタモジュールで前記DNAを滞留させるか再循環させて、前記反応剤の反応生成物を第1の流体ろ過モジュールに流入させるステップと、
前記第1のろ過モジュール中で前記反応生成物をろ過するステップと
を含むRNA合成方法。 - 前記少なくとも1種類のヌクレオシド三リン酸(NTP)は少なくとも1種類のヌクレオシド三リン酸(NTP)の溶液である、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのヌクレオシド三リン酸(NTP)はアデノシン三リン酸(adenosine triphosphate:ATP)、シチジン三リン酸(cytidine triphosphate:CTP)、グアノシン三リン酸(guanosine triphosphate:GTP)、ウリジン三リン酸(uridine-triphosphate:UTP)のいずれか1つ又はこれらの組合せを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記DNAはプラスミドDNAである、請求項1~3のいずれか一項記載の方法。
- 前記複数の反応剤は酵素混合物、塩類溶液、RNAポリメラーゼのいずれか1つ又はこれらの組合せをさらに含む、請求項1~4のいずれか一項記載の方法。
- 前記複数の反応剤の少なくともいくつかを前記第1のろ過モジュールの流出部から前記第1のリアクタモジュールの流入部領域に再循環させるステップを含む請求項1~5のいずれか一項記載の方法。
- 前記ろ過された反応生成物の少なくとも一部を前記第1のろ過モジュールから第2の液流リアクタモジュールに供給することを、前記第2のリアクタモジュールにキャッピング酵素を投入することと組み合わせて行なうステップを含む請求項1~6のいずれか一項記載の方法。
- 前記第2のリアクタモジュールから流出した前記液を第2の液流ろ過モジュールに供給するステップを含む請求項7に記載の方法。
- 未反応NTPを前記第1のリアクタモジュールの流入部領域に再循環させ、未反応キャッピング酵素を前記第2のリアクタモジュールの前記流入部領域に再循環させるステップを含む請求項8に記載の方法。
- 前記塩類溶液はMgCl2を含む、請求項5に従属する場合の請求項1~9のいずれか一項記載の方法。
- 前記RNAポリメラーゼはT7ポリメラーゼを含む、請求項5に従属する場合の請求項1~10のいずれか一項記載の方法。
- 請求項1~11のいずれか一項記載の方法によって調製されるRNA又はRNA系化合物。
- ワクチンの前記調製の際に請求項1~11のいずれか一項記載の方法によって調製されるRNA又はRNA系化合物の使用。
- 流入部を有する第1の狭長液流流路と、
流出部を有する第2の狭長液流流路と、
透過液が前記第1の流路内の前記液から前記膜を介して前記第2の流路内まで前記第1及び第2の流路の前記長さに沿って通過することができるように、前記第1及び第2の流路の前記それぞれの長さに沿って前記第2の流路から前記第1の流路を仕切るように配置される浸透膜と
を含む液流ろ過装置。 - 前記第1の流路の前記長さの大部分が前記膜を介して前記第2の流路の前記長さの大部分に隣接して配置される、請求項14に記載の装置。
- 前記膜の細孔サイズが範囲100~1000kDa、範囲100~800kDa、範囲200~800kDa又は範囲200~600kDa、範囲300kDa~10MDaにある、請求項14及び15に記載の装置。
- 前記第1の流路が形成されている第1のプレートと、前記第2の流路が形成されている第2のプレートとを含む装置であって、前記第1及び第2のプレートのそれぞれの対向する面に前記膜が挟まれる、請求項14~16のいずれか一項記載の装置。
- 前記第1及び第2の流路の各々は一連の直線部分及び曲がり部分を含む、請求項14~17のいずれか一項記載の装置。
- 前記第1及び第2の流路はこれらの長手方向の、それぞれの蛇行プロファイルを含む、請求項18に記載の装置。
- 前記第1及び第2の流路はこれらの長さに沿って開通し、前記第1及び第2の流路の長手方向の壁又は面を部分的に形成する前記膜と直接接触する状態で配置される、請求項14~19のいずれか一項記載の装置。
- 前記膜の細孔サイズがRNA分子の平均分子サイズ未満である、請求項14~20のいずれか一項記載の装置。
- 反応フロー流路又はウェルと、少なくとも1つの流入部と、少なくとも1つの流出部とを有する第1のリアクタモジュールと、
流体ろ過領域と、前記第1のリアクタモジュールの前記流出部と連通する状態で設けられる少なくとも1つの流入部と、少なくとも1つの流出部とを有する第1のろ過モジュールと
を含む、液の前記処理に用いられる液流システムであって、
前記第1のろ過モジュールは請求項13~21のいずれか一項記載の液流ろ過装置を含む、
液流システム。 - 反応フロー流路又はウェルと、少なくとも1つの流入部と、流出部とを有する第2のリアクタモジュールを含むシステムであって、前記流入部は前記第1のろ過モジュールと連通する状態で設けられる、請求項22に記載のシステム。
- 液ろ過領域と、少なくとも1つの流入部と、流出部とを有する第2のろ過モジュールをさらに含むシステムであって、前記流入部は前記第2のリアクタモジュールの前記流出部と連通する状態で設けられる、請求項23に記載のシステム。
- 前記第1のろ過モジュールの流入部領域と連通する状態で設けられる液注入ポートを含む請求項22~24のいずれか一項記載のシステム。
- 前記第1のリアクタモジュールの前記流出部の領域と、前記第1のリアクタモジュールの、前記少なくとも1つの流入部との間で延びる第1の再循環導管を含む請求項22~25のいずれか一項記載のシステム。
- 前記第1のろ過モジュールの前記流出部の領域と、前記第1のリアクタモジュールの前記流出部との間で延びる第2の再循環導管を含む請求項22~26のいずれか一項記載のシステム。
- 前記第2のろ過モジュールの前記流出部の領域と、前記第1の反応モジュールの前記流入部との間で延びる第3の再循環導管を含む、請求項24に従属する場合の請求項27に記載のシステム。
- 流入部から第1の狭長液流流路に液を流すステップと、
前記第1の流路に沿って延びる膜を通過して第2の狭長液流流路に流入することを前記液の透過成分に強制的に行なわせるステップと、
前記第1の流路内に前記液の滞留成分を滞留させるステップとを含む、液流ろ過装置を用いて液をろ過する方法であって、
前記透過液が前記第1の流路から前記膜を介して前記第2の流路内まで前記第1及び第2の流路のそれぞれの長さに沿って通過することができるように、前記膜は前記第2の流路から前記第1の流路をこれらの前記それぞれの長さに沿って仕切るように配置される、
方法。 - 前記液を流す前記ステップは前記第1の流路内で前記液を加圧するステップを含む、請求項29に記載の方法。
- フローシステムであって、
反応液流流路又はウェルと、少なくとも1つの液流入部と、少なくとも1つの液流出部とを有する少なくとも1つのリアクタモジュールと、
前記流路又はウェルに液流を流す少なくとも1つのフロー送液部と、
前記システム中の前記液の圧力、温度又はpHのいずれか1つ又はこれらの組合せを測定する第1のセンサと、
前記システム中の前記液の圧力、温度、pHのいずれか1つ又はこれらの組合せを測定する第2のセンサと、
前記システム中の前記液の少なくとも2つの化学成分の反応の状態を示す前記システム中の液の特性を監視する反応状態監視デバイスと、
前記第1のセンサ、前記第2のセンサ及び前記反応状態監視デバイスの前記少なくとも1つ又はこれらの組合せからデータを受け取って、前記システム中の前記液の、少なくとも1つの特性を制御する制御部と
を含むフローシステム。 - 前記システムの前記特性は、
前記システム中の前記液の圧力、
前記システム中の前記液の温度、
前記システム中の前記液のpH、
前記システム中の前記液の、1つ以上の化学成分の容積又は比率、
前記システム中の前記液の流量
のいずれか1つ又はこれらの組合せである、請求項31に記載のシステム。 - 前記制御部はCPU、PCB、PLC、PC、プロセッサチップ、ハンドヘルド電子デバイスを含む、請求項32に記載のシステム。
- 前記さらなるセンサは温度センサ、pHセンサ、圧力センサ、流量センサ、流動量センサ又は分光センサのいずれか1つ又はこれらの組合せを含む、請求項33に記載のシステム。
- 液流装置を用いて液を処理する方法であって、
少なくとも1種類の液を少なくとも1つの流入部を介してリアクタモジュールに導入するステップと、
反応フロー流路又はウェルを通って流れるか、前記反応フロー流路又はウェル内を流れるように少なくとも1つのフロー送液部を用いて前記液を流して、流出部で前記液を流出させるステップと、
前記液流装置中の前記液の圧力、温度又はpHの少なくとも1つ又はこれらの組合せを測定するステップと、
前記液流装置中の前記液中の化学成分の反応状態を監視するステップと、
前記液の前記化学成分の前記圧力の前記測定、前記pHの前記測定、前記温度の前記測定及び/又は前記反応状態の前記測定の少なくとも1つ又はこれらの組合せに応じて制御部を用いて前記液流装置中の前記液の、少なくとも1つの特性を制御するステップと
を含む方法。 - 連通状態で接続され合される複数のリアクタモジュール及びろ過モジュールを含む請求項35に記載のシステム。
- 前記フロー送液部は少なくとも1つのポンプであり、場合によりシリンジポンプである、請求項35に記載のシステム。
- 前記液解析センサは範囲190nm~1000nmの吸光度解析又は蛍光解析用の紫外可視分光器を含む、請求項35に記載のシステム。
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