CN112292395A - 用于疫苗接种的新型rsv rna分子和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及人工核酸，特别是适用于治疗和/或预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染或与这种感染有关的病症的人工RNA。本发明还涉及一种治疗或预防病症或疾病的方法，人工RNA、组合物和疫苗的第一医药用途和第二医药用途。此外，本发明涉及试剂盒，特别是试剂盒套装，其包含人工RNA、组合物和疫苗。

Description

用于疫苗接种的新型RSV RNA分子和组合物
引言
本发明涉及适用于治疗或预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染或与这种感染有关的病症的人工RNA。具体地，本发明的人工RNA包含至少一个异源性非翻译区(UTR)，优选3′-UTR和/或5′-UTR，和编码区，其编码至少一种衍生自RSV的抗原肽或蛋白，特别是至少一种衍生自RSV融合(F)蛋白的抗原肽或蛋白。人工RNA优选地以与所述UTR元件可操作连接的编码区的表达效率提高为特征。本发明还涉及包含所述人工RNA以及聚合物载体、聚阳离子蛋白或肽或脂质纳米颗粒(LNP)的组合物和疫苗。此外，本发明涉及试剂盒，特别是包含人工RNA或组合物或疫苗的部件的试剂盒。本发明还涉及治疗或预防病症或疾病的方法，以及人工RNA、组合物或疫苗的第一医药用途和第二医药用途。
呼吸道合胞病毒(RSV)是副黏病毒科肺炎病毒属中的有包膜的非分段负链RNA病毒。它是儿童一岁以下发生毛细支气管炎和肺炎的最常见病因。RSV还会引起反复感染，包括严重的下呼吸道疾病，这种感染可能在任何年龄发生，特别是在老年人或心脏、肺或免疫系统受损的人中发生。当前，被动免疫被用于预防由RSV感染引起的严重疾病，特别是在早产、支气管肺发育不良或先天性心脏病的婴儿中。
RSV细支气管炎的推荐治疗方法主要包括呼吸支持和水合作用。不建议使用特异性抗病毒治疗。中和性单克隆抗体帕利珠单抗用于预防严重感染处于最高风险的婴儿，但价格昂贵且无法通用。当前，没有获得许可/批准的RSV疫苗，开发安全有效的RSV疫苗是全球公共卫生的重点。
在1960年代的疫苗试验中，使用福尔马林灭活的全病毒粒子RSV制剂(FIRSV)或等效的副黏病毒制剂(FIPIV)对婴儿和幼儿进行了免疫。接受FI-PIV免疫然后在下一个RSV季节自然感染RSV的对象中有百分之五住院；接受FI-RSV免疫然后再感染RSV的人中有80％住院，并且有2名儿童死亡。由于疫苗接种引起的RSV感染的这种增强是开发针对RSV感染的疫苗的特殊问题。
因此，呼吸道合胞病毒(RSV)感染是发达国家中尚未满足的最大婴儿疫苗需求，也是世界范围内尚未满足的重要婴儿疫苗需求。超过40年的努力尚未产生用于人的被许可的RSV疫苗。
尽管有上述人源化单克隆抗体帕利珠单抗，但已经开发出了可引起强烈的免疫应答的减毒活疫苗病毒，但不建议在特定的目标人群(婴儿、儿童、老年人和免疫功能低下的患者)中使用。同样，表达带有B细胞表位的RSV F蛋白的DNA载体被用于诱导中和抗体的产生。在这个背景下，WO2008/077527和WO96/040945公开了用作疫苗的包含编码RSV F蛋白的DNA序列的载体。然而，将DNA用作疫苗可能是危险的，这是因为对基因组进行了不需要插入，这可能导致功能性基因的中断和癌症或抗DNA抗体的形成。
WO2015/024668公开了编码RSV抗原肽和蛋白的RNA序列，以及适合于皮内施用的包含鱼精蛋白复合RNA的抗原组合物，所述抗原肽和蛋白选自融合蛋白F、糖蛋白G、短疏水蛋白SH、基质蛋白M、核蛋白N、大聚合酶L、M2-1蛋白、M2-2蛋白、磷蛋白P、非结构蛋白NS1或非结构蛋白NS2。
WO2017/070622公开了一种疫苗，其包含编码RSV抗原肽和蛋白的RNA，所述抗原肽和蛋白选自糖蛋白F和糖蛋白G，其中RNA被配制在脂质纳米颗粒中。
除了上面引用的一些方法外，对于预防或治疗RSV感染的有效疫苗的医疗需求仍未得到满足。
因此，本发明的目的是提供用于编码RSV的抗原肽或蛋白的新型人工RNA以及包含所述RNA的组合物/疫苗，其用作预防或治疗RSV感染的疫苗，特别是在婴儿、新生儿、孕妇、老年人和免疫功能低下的患者中。
此外，基于RNA的组合物或疫苗应具有以下有利特征：
-改善注射部位(例如肌肉)的RNA构建体的翻译
-针对以非常低的剂量和给药方案的编码的抗原肽或蛋白非常有效地诱导RSV抗原特异性免疫应答
-适用于母体免疫
-适用于婴儿和/或新生儿的疫苗接种
-适用于肌内施用
-诱导RSV特异性功能性体液免疫应答
-诱导RSV特异性B细胞记忆
-针对RSV的免疫保护起效更快
-长期诱导的针对RSV的免疫应答
-诱导针对RSV的广谱性细胞T细胞应答
-诱导(局部和短暂)促炎环境
-接种疫苗后不诱导全身细胞因子或趋化因子应答
-耐受性好，无副作用，无毒，
-接种疫苗不会增强RSV感染
-疫苗的有利稳定性特征
-RSV疫苗生产的速度、适应性、简便性和可扩展性
上面概述的目标通过所要求保护的主题解决。
定义
为了清楚和可读性起见，提供了以下定义。可以在本发明的每个实施方案上阅读针对这些定义所提到的任何技术特征。在这些实施方案的上下文中，可以特别地提供附加的定义和解释。
数字中的百分比应理解为相对于各个项目总数的百分比。在其他情况下，除非上下文另有指示，否则百分比应理解为重量百分比(重量％)。
适应性免疫应答：如本文所使用的术语“适应性免疫应答”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在表示免疫系统(适应性免疫系统)的抗原特异性应答。抗原特异性允许产生针对特定病原体或病原体感染的细胞的应答。通常通过“记忆细胞”(B细胞)在体内维持发出这些定制的应答的能力。在本发明的上下文中，抗原由编码至少一种抗原肽或蛋白的人工RNA编码序列提供。
抗原：如本文所使用的术语“抗原”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在表示可以被免疫系统，优选地被适应性免疫系统识别的物质，并且能够例如通过形成抗体和/或抗原特异性T细胞作为适应性免疫应答的一部分触发抗原特异性免疫应答。通常，抗原可以是或可以包含可由MHC呈递给T细胞的肽或蛋白。在本发明的上下文中，衍生自例如包含至少一个表位的RSV F蛋白的肽或蛋白的片段、变体和衍生物也应理解为抗原。在本发明的上下文中，抗原可以是本文提供的人工RNA的翻译产物。
抗原肽或蛋白：术语“抗原肽或蛋白”将被本领域普通技术人员所认识和理解，例如旨在表示衍生自(抗原)蛋白/多蛋白的肽、蛋白(或多蛋白)，其可以刺激人体的适应性免疫系统以提供适应性免疫应答。因此，“抗原肽或蛋白”包含衍生其的蛋白(例如，在本发明的上下文中，RSV肽或蛋白，优选RSV F蛋白或其变体)的至少一个表位(如本文所定义)或抗原(如本文所定义)。
人工核酸：如本文所使用的术语“人工核酸”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在表示非天然存在的人工核酸。人工核酸可以是DNA分子、RNA分子或包含DNA和RNA部分的杂交分子。通常，可以通过基因工程方法设计和/或产生人工核酸以对应于所需的人工核苷酸序列(异源性序列)。在本发明的上下文中，人工序列通常是天然不存在的序列，即它与野生型序列相差至少一个核苷酸。如本文所使用的术语“野生型”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在表示天然存在的序列。此外，术语“人工核酸”不限于意指“单个分子”，而是通常应理解为包括基本上相同的分子的集合。
人工RNA：如本文所使用的术语“人工RNA”旨在表示非天然存在的RNA。换句话说，人工RNA可以被理解为非天然核酸分子。这样的RNA分子由于其单独的序列(其不是天然存在的，例如G/C含量修饰的编码序列，UTR)和/或由于其他修饰，例如不是天然存在的核苷酸的结构修饰而可以是非天然的。通常，可以通过基因工程方法设计和/或产生人工RNA以对应于所需的人工核苷酸序列(异源性序列)。在本发明的上下文中，人工RNA序列通常是天然不存在的序列，即它与野生型序列相差至少一个核苷酸。术语“人工RNA”不限于指“单个分子”，而是通常应理解为包括基本上相同的分子的集合。因此，它可以涉及等分试样或样品中包含的多个基本上相同的RNA分子。在本发明的上下文中，本发明的RNA是如本文定义的人工RNA。
阳离子：除非从特定上下文中可以清楚地看出不同的含义，否则术语“阳离子”指相应的结构具有永久性或非永久性的正电荷，但其响应于例如pH的某些条件。因此，术语“阳离子”涵盖“永久性阳离子”和“可阳离子化”。
可阳离子化：如本文所使用的术语“可阳离子化”是指化合物、基团或原子在其环境的较低pH下带正电而在较高pH下不带电。同样在无法确定pH值的非含水环境中，可阳离子化的化合物、基团或原子在高氢离子浓度下带正电，而在低氢离子浓度或低氢离子活性下不带电。这取决于可阳离子化或可多阳离子化的化合物的个别性质，特别是各个可阳离子化基团或原子的pKa，在该pH或氢离子浓度下它是带电的或不带电的。在稀释的含水环境中，可以使用本领域技术人员众所周知的所谓的Henderson-Hasselbalch方程来估计带正电荷的可阳离子化的化合物、基团或原子的分数。例如，在一些实施方案中，如果化合物或部分可阳离子化，则优选其在约1至9，优选4至9、5至8或甚至6至8的pH值，更优选低于9的pH值、低于8的pH值或低于7的pH值，最优选生理pH值，例如约7.3至7.4，即在生理条件下，特别是在体内细胞的生理盐条件下带正电荷。在其他实施方案中，优选可阳离子化的化合物或部分在生理pH值，例如约7.0至7.4下主要是中性的，但是在较低pH值下变成带正电的。在一些实施方案中，对于可阳离子化的化合物或部分，pKa的优选范围是约5至约7。
编码序列/编码区：如本文所使用的术语“编码序列”或“编码区”以及相应的缩写“cds”将被本领域普通技术人员所认识和理解，例如旨在表示可以被翻译成肽或蛋白的几个核苷酸三联体的序列。在本发明的上下文中，编码序列优选是RNA序列，其由可以被三除的数目的核苷酸组成，以起始密码子开始并且优选以终止密码子终止。
组合物：在本发明的上下文中，“组合物”是指其中可以结合指定成分(例如与LNP结合的本发明的人工RNA)的任何类型的组合物，其任选地与任何其他成分一起，通常与至少一种药学上可接受的载体或赋形剂结合。因此，组合物可以是干燥的组合物，例如粉末或颗粒，或者是固体单元，例如冻干形式或片剂。或者，组合物可以是液体形式，每种成分可以以溶解或分散(例如悬浮或乳化)的形式独立地结合。
化合物：如本文所使用的“化合物”是指化学物质，其是由具有基本相同的化学结构和性质的分子组成的材料。对于小分子化合物，分子的原子组成和结构构型通常相同。对于大分子或聚合化合物，化合物的分子高度相似，但并非所有分子都必须相同。例如，被指定由50个单体单元组成的聚合物链段也可能包含具有48个或53个单体单元的单个分子。
衍生自：贯穿整个说明书，在核酸的上下文中使用的术语“衍生自”，即对于“衍生自”(另一个)核酸的核酸是指衍生自(另一个)核酸的核酸与衍生其的核酸具有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％、81％、82％、83％、84％，更优选至少85％、86％、87％、88％、89％，甚至更优选至少90％、91％、92％、93％、94％，甚至更优选至少95％、96％、97％，特别优选至少98％、99％的序列同一性。技术人员知道，通常针对相同类型的核酸即DNA序列或RNA序列计算序列同一性。因此，应当理解，如果DNA“衍生自”RNA，或者RNA“衍生自”DNA，则第一步将RNA序列转换为相应的DNA序列(特别是通过在整个序列中用胸苷(T)替换尿嘧啶(U))或者反之亦然，DNA序列被转换为相应的RNA序列(特别是通过在整个序列中用尿嘧啶(U)替换胸苷(T))。此后，确定DNA序列的序列同一性或RNA序列的序列同一性。优选地，“衍生自”核酸的核酸也指与衍生其的核酸相比，例如为了进一步提高RNA稳定性和/或延长和/或增加蛋白产量而被修饰的核酸。不言而喻，例如与其衍生的核酸相比，不损害RNA的稳定性的修饰是优选的。在氨基酸序列(例如抗原肽或蛋白)的上下文中，术语“衍生自”是指衍生自(另一个)氨基酸序列(例如RSV F蛋白)的氨基酸序列与衍生其的氨基酸序列具有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％、81％、82％、83％、84％，更优选至少85％、86％、87％、88％、89％，甚至更优选至少90％、91％、92％、93％、94％，甚至更优选至少95％、96％、97％，特别优选至少98％、99％的序列同一性。
因此，应当理解，如果抗原肽或蛋白“衍生自”RSV融合(F)蛋白，则“衍生自”所述RSV F蛋白的抗原肽或蛋白可以指RSV F蛋白的变体或片段，例如F0(全长前体)、F-del、F0_DSCav1、F_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut3(在此指定)。此外，“衍生自”所述RSV F蛋白的抗原肽或蛋白(例如F0、F-del、F0_DSCav1、F_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut3)的氨基酸序列可以不同，其共有如上定义的一定百分比的同一性。表1中提供了可以“衍生”抗原肽或蛋白的RSV F蛋白的合适的其他实例。
表位：如本文所使用的术语“表位”(本领域中也称为“抗原决定簇”)将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在表示T细胞表位和B细胞表位。抗原肽或蛋白的T细胞表位或部分可以包含优选长度为约6个至约20个或甚至多于20个氨基酸的片段，例如由MHC I类分子加工和呈递的片段，其优选长度为约8个至约10个氨基酸，例如8个、9个或10个氨基酸(或甚至11个或12个氨基酸)，或者由MHC II类分子加工和呈递的片段，其优选长度为约13个至约20个或甚至多于20个氨基酸的片段，其中这些片段可选自氨基酸序列的任何部分。这些片段通常以由肽片段和MHC分子组成的复合物的形式被T细胞识别，即片段通常不以其天然形式被识别。B细胞表位通常是位于(天然)蛋白或肽抗原的外表面上的片段，其优选具有5个至15个氨基酸，更优选具有5个至12个氨基酸，甚至更优选具有6个至9个氨基酸，其可以被抗体识别，即以其天然形式被抗体识别。此类蛋白或肽的表位还可以选自本文中提及的此类蛋白或肽的任何变体。在上下文中，抗原决定簇可以是构象表位或不连续表位，其由本文定义的蛋白或肽的片段组成，其在本文定义的蛋白或肽的氨基酸序列中是不连续的，但在三维结构或由单个多肽链组成的连续或线性表位中聚集在一起。在本发明的上下文中，表位可以是本文提供的人工RNA的翻译产物。
片段：贯穿整个本说明书，在核酸序列或氨基酸序列的上下文中使用的术语“片段”通常可以是例如核酸序列或氨基酸序列的全长序列的较短部分。因此，片段通常由与全长序列内的相应一段相同的序列组成。在本发明的上下文中，序列的优选片段由实体的连续一段组成，例如对应于该片段所衍生的分子中实体的连续一段的核苷酸或氨基酸，其占衍生该片段的全部(即全长)分子(例如RSV F蛋白)的至少5％、10％、20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％，最优选至少80％。贯穿整个说明书，在蛋白或肽的上下文中使用的术语“片段”通常可以包含本文定义的蛋白或肽的序列，就其氨基酸序列(或编码它的核酸分子)而言，与原始(天然)蛋白的氨基酸序列(或编码它的核酸分子)相比，N-末端和/或C-末端被截断。因此，这种截断可以在氨基酸水平上或相应地在核酸水平上发生。因此，相对于本文所定义的此类片段的序列同一性可以优选地指本文所定义的整个蛋白或肽，或者是指此类蛋白或肽的完整(编码)核酸分子。在抗原的情况下，这种片段可以具有约6个至约20个或甚至多于20个氨基酸的长度，例如由MHC I类分子加工和呈递的片段，其优选长度为约8个至约10个氨基酸，例如8个、9个或10个氨基酸(或甚至6个、7个、11个或12个氨基酸)，或者由MHC II类分子加工和呈递的片段，其优选长度为约13个或多于13个氨基酸，例如13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或甚至多于20个氨基酸的片段，其中这些片段可选自氨基酸序列的任何部分。这些片段通常以由肽片段和MHC分子组成的复合物的形式被T细胞识别，即片段通常不以其天然形式被识别。蛋白或肽的片段(例如在抗原的情况下)可包含那些蛋白或肽的至少一个表位。此外，蛋白的结构域，例如胞外结构域、胞内结构域或跨膜结构域以及蛋白的缩短或截断形式也可以理解为包含蛋白片段。
异源性：贯穿整个说明书中，在核酸序列或氨基酸序列的上下文中使用的术语“异源性”或“异源性序列”是指本领域普通技术人员将认识和理解的序列(例如DNA、RNA、氨基酸)，并且其旨在表示衍生自另一个基因、另一个等位基因、另一个物种的序列。如果两个序列不是衍生自相同基因或相同的等位基因，则通常应理解为“异源性”的。即，尽管异源性序列可以衍生自同一生物，但是它们天然地(自然地)不存在于相同的核酸分子中，例如相同的RNA或相同的蛋白中。
体液免疫应答：术语“体液免疫”或“体液免疫应答”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在表示B细胞介导的抗体产生以及任选地伴随抗体产生的辅助过程。体液免疫应答通常可以以例如Th2激活和细胞因子产生、生发中心形成和同种型转换、亲和力成熟和记忆细胞生成为特征。体液免疫通常还可以指抗体的效应子功能，包括病原体和毒素的中和作用、经典补体的活化以及调理素促进吞噬作用和病原体消除的作用。
(序列)同一性：贯穿整个说明书中，在核酸序列或氨基酸序列的上下文中使用的术语“同一性”将被本领域普通技术人员所认识和理解，例如旨在表示两个序列相同的百分比。为了确定两个序列相同的百分比，例如本文定义的核酸序列或氨基酸序列，优选地，由本文定义的人工核酸序列编码的氨基酸序列或氨基酸序列本身，序列可以比对以便随后彼此比较。因此，例如可以将第一序列的位置与第二序列的相应位置进行比较。如果第一个序列中的位置被第二个序列中的位置的相同成分(残基)占据，则两个序列在该位置相同。如果不是这种情况，则序列在该位置不同。如果与第一序列相比在第二序列中发生插入，则可以将缺口插入第一序列中以允许进一步比对。如果与第一序列相比在第二序列中发生缺失，则可以在第二序列中插入缺口以允许进一步比对。从而两个序列相同的百分比是相同位置数除以包括那些位置仅在一个序列中占据的位置总数的函数。可以使用数学算法确定两个序列相同的百分比。可以使用的数学算法的优选而非限制性实例是集成在BLAST程序中的算法。可以通过该程序识别在一定程度上与本发明的序列相同的序列。
免疫原、免疫原性：术语“免疫原”或“免疫原性”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在表示能够刺激/诱导免疫应答的化合物。优选地，免疫原是肽、多肽或蛋白。在本发明的意义上，免疫原是所提供的人工核酸、优选RNA的翻译产物，其包含编码至少一种衍生自本文所定义的RSV的抗原肽、蛋白的至少一个编码序列。通常，免疫原引发适应性免疫应答。
免疫应答：术语“免疫应答”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在表示适应性免疫系统对特定抗原的特异性反应(所谓的特异性或适应性免疫应答)或先天性免疫系统的非特异性反应(所谓的非特异性或先天性免疫应答)或其组合。
免疫系统：术语“免疫系统”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在表示可以保护生物体免受感染的生物体系统。如果病原体成功通过生物体的物理屏障并进入该生物体，则先天免疫系统会提供立即但非特异性的应答。如果病原体逃避了这种先天应答，脊椎动物将拥有第二层保护，即适应性免疫系统。在这里，免疫系统在感染期间适应其应答，以提高对病原体的识别能力。然后，在消除病原体后，以免疫记忆的形式保留了这种改善的应答，并且每次遇到该病原体时，适应性免疫系统都会发起更快、更强的攻击。因此，免疫系统包括先天性和适应性免疫系统。这两个部分通常都包含所谓的体液成分和细胞成分。
先天免疫系统：术语“先天免疫系统”(也称为非特异性或非特异免疫系统)将被本领域普通技术人员所认识和理解，例如旨在表示通常包括以非特异性方式保护宿主免受其他生物感染的细胞和机制的系统。这意味着先天系统的细胞可以以通用方式识别病原体并对病原体作出应答，但与适应性免疫系统不同，它不会赋予宿主持久或保护性的免疫力。先天免疫系统例如可以通过Toll样受体(TLR)的配体或其他辅助物质例如脂多糖、TNF-α、CD40配体或细胞因子、单核因子、淋巴因子、白介素或趋化因子、IL-1至IL-33、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-β、TNF-α、生长因子和hGH、人Toll样受体的配体(例如TLR1至TLR10)、鼠Toll样受体的配体(例如TLR1至TLR13)、NOD样受体的配体、RIG-I样受体的配体、免疫刺激性核酸、免疫刺激性RNA(isRNA)、CpG-DNA、抗菌剂或抗病毒剂激活。
类脂质化合物：类脂质化合物，也简称为类脂质，是类脂质的化合物，即具有类脂质物理性质的两亲化合物。在本发明的上下文中，术语脂质被认为涵盖类脂质化合物。
单价疫苗、单价组合物：术语“单价疫苗”、“单价组合物”、“一价疫苗”或“一价组合物”将被本领域普通技术人员所认识和理解，例如旨在表示仅包含来自病毒的一种抗原的组合物或疫苗。因此，所述疫苗或组合物仅包含编码用于单个生物的单个抗原的一种RNA。术语“单价疫苗”包括针对单价的免疫。在本发明的上下文中，单价RSV疫苗或组合物将包含人工RNA，其编码一种衍生自一种特定RSV(例如RSV F)的单一抗原肽或蛋白。
核酸：术语“核酸”或“核酸分子”将被本领域普通技术人员认识和理解，例如旨在表示包括核酸组分，优选由核酸组分组成的分子。术语核酸分子优选是指DNA或RNA分子。优选与术语多核苷酸同义使用。优选地，核酸或核酸分子是包含核苷酸单体或由核苷酸单体组成的聚合物，所述核苷酸单体通过糖/磷酸酯骨架的磷酸二酯键彼此共价连接。术语“核酸分子”还涵盖经修饰的核酸分子，例如本文所定义的碱基修饰的、糖修饰的或骨架修饰的DNA或RNA分子。
核酸序列/RNA序列/氨基酸序列：术语“核酸序列”、“RNA序列”或“氨基酸序列”将被本领域普通技术人员所认识和理解，例如旨在分别表示它的核苷酸或氨基酸的序列的特定和个别顺序。
永久性阳离子：如本文所使用的术语“永久性阳离子”将被本领域普通技术人员所认识和理解，例如表示相应的化合物、基团或原子在其环境的任何pH值或氢离子活性下带正电。通常，正电荷是由于季氮原子的存在而产生的。当化合物带有多个这样的正电荷时，可以称之为永久性聚阳离子，这是永久性阳离子的子类别。
药学有效量：术语“药学有效量”或“有效量”将被本领域普通技术人员所认识和理解，例如旨在表示足以引起药物作用，例如在本发明的上下文中的免疫应答(例如针对本文定义的抗原肽、蛋白、多蛋白)的化合物(例如，本发明的人工RNA)的量。
多价疫苗、多价组合物：术语“多价疫苗”或“多价组合物”将被本领域普通技术人员所认识和理解，例如旨在表示包含来自一种以上病毒株的抗原、或包含同一病毒的不同抗原、或其任何组合的组合物或疫苗。这些术语描述了所述疫苗或组合物具有一种以上的价。在本发明的上下文中，多价RSV疫苗将包括包含编码衍生自几种不同RSV病毒株的抗原肽或蛋白的人工RNA、或包含编码来自相同RSV病毒株的不同抗原的人工RNA、或其组合的疫苗。在优选的实施方案中，多价RSV疫苗或组合物包含一种以上，优选为2种、3种、4种或甚至多于4种不同的人工RNA，每种编码至少一种不同的RSV抗原肽或蛋白(例如RSV F和RSV M或RSV F和RSV N)。PCT申请PCT/EP2016/082487或公开的专利申请WO2017/1090134A1中公开了制备多价mRNA疫苗的方法。
“稳定的核酸分子”或“稳定的RNA”：术语“稳定的核酸分子”或“稳定的RNA”是指核酸分子，优选经修饰的RNA分子，使其通过环境因素或酶消化，例如通过外切核酸酶或内切核酸酶降解，比未修饰的核酸分子对崩解或降解更稳定。优选地，在本发明的上下文中，稳定的核酸分子，例如稳定的RNA在细胞如原核细胞或真核细胞中、优选在哺乳动物细胞如人细胞中是稳定的。稳定作用还可以例如在包含稳定的核酸分子的药物组合物的制造过程中在细胞外部，例如在缓冲溶液等中发挥作用。
T细胞应答：本文所使用的术语“细胞免疫”或“细胞免疫应答”或“细胞T细胞应答”将被本领域普通技术人员所认识和理解，例如旨在表示巨噬细胞、天然杀伤细胞(NK)、抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的活化以及响应于抗原的各种细胞因子的释放。从更一般的意义上讲，细胞免疫不是基于抗体，而是基于免疫系统细胞的激活。通常，细胞免疫应答的特征可以在于例如通过激活能够在细胞例如特定免疫细胞如树突状细胞或其他细胞中诱导凋亡的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，从而在其表面上展示外源抗原表位。在本发明的上下文中，抗原由编码至少一种衍生自RSV的抗原肽或蛋白的人工RNA提供，其适当地诱导T细胞应答。本发明的人工RNA、组合物、疫苗有利地引发针对RSV F抗原的细胞T细胞应答。
(序列的)变体：贯穿整个说明书中，在核酸序列的上下文中使用的术语“变体”将被本领域普通技术人员所认识和理解，例如旨在表示形成核酸序列基础的核酸序列变体。例如，与衍生变体的核酸序列相比，变体核酸序列可表现出一个或多于一个核苷酸的缺失、插入、添加和/或置换。优选地，核酸序列的变体与衍生该变体的核酸序列至少40％、优选至少50％、更优选至少60％、更优选70％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％相同。优选地，变体是功能性变体。核酸序列的“变体”在该核酸序列的10个、20个、30个、50个、75个或100个核苷酸的片段上可以具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的核苷酸同一性。
贯穿整个说明书，在蛋白或肽的上下文中使用的术语“变体”将被本领域普通技术人员所认识和理解，例如旨在表示一种蛋白或肽变体，其氨基酸序列在一个或多于一个突变中不同于原始序列，例如一个或多于一个置换、插入和/或缺失的氨基酸。优选地，与全长天然蛋白相比，这些片段和/或变体具有相同的生物学功能或比活性，例如它的特异性抗原性质。本发明的上下文中定义的蛋白或肽的“变体”相对于其天然的，即非突变的生理序列可以包含保守的氨基酸置换。那些氨基酸序列以及它们的编码核苷酸序列特别地属于本文所定义的术语变体。衍生自同一类别的氨基酸彼此交换的置换称为保守置换。特别地，这些是具有脂肪族侧链、带正电或负电的侧链、芳香基团侧链的氨基酸或侧链可以进入氢桥的例如侧链具有羟基官能团的氨基酸。这意味着例如具有极性侧链的氨基酸被具有相似极性侧链的另一个氨基酸置换，或者例如以疏水性侧链为特征的氨基酸被具有相似疏水性侧链的另一个氨基酸置换(例如，丝氨酸(苏氨酸)被苏氨酸(丝氨酸)置换，或亮氨酸(异亮氨酸)被异亮氨酸(亮氨酸)置换)。插入和置换是可能的，特别是在不引起三维结构改变或不影响结合区域的那些序列位置。例如，可以使用CD光谱(圆二色性光谱)容易地确定通过插入或缺失对三维结构的改变。蛋白或肽的“变体”在该蛋白或肽的10个、20个、30个、50个、75个或100个氨基酸的片段上可以具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的氨基酸同一性。优选地，蛋白的变体包含蛋白的功能性变体，这意味着该变体发挥与衍生其的蛋白相同的作用或功能。
3′-非翻译区、3′-UTR元件、3′-UTR：术语“3′-非翻译区”或“3′-UTR元件”将被本领域普通技术人员所认识和理解，例如旨在表示核酸分子的位于编码序列的3′(即“下游”)并且通常不翻译成蛋白的部分。通常，3′-UTR是mRNA的一部分，位于mRNA的编码序列(cds)和多聚腺苷酸序列之间。在本发明的上下文中，术语3′-UTR还可以包含未在用于转录人工RNA的DNA模板中编码的元件，但是它在转录后的成熟过程中添加，例如多聚腺苷酸序列。
5′-非翻译区、5′-UTR元件、5′-UTR：术语“5′-非翻译区(5′-UTR)”将被本领域普通技术人员所认识和理解，例如旨在表示核酸分子位于编码序列的5′(即“上游”)的不翻译成蛋白的部分。通常将5′-UTR理解为信使RNA(mRNA)的特定部分，它位于mRNA编码序列的5′端。通常，5′-UTR从转录起始位点开始，在编码序列的起始密码子之前一个核苷酸终止。优选地，5′-UTR的长度超过20个、30个、40个或50个核苷酸。5′-UTR可包含用于控制基因表达的元件，也称为调节元件。这样的调节元件可以是例如核糖体结合位点。5′-UTR可以进行转录后修饰，例如通过添加5′-帽(5′-cap)。
5′-末端寡嘧啶束(TOP)，TOP-UTR：术语“5′-末端寡嘧啶束(TOP)”必须理解为位于核酸分子5′-末端区域，例如某些mRNA分子的5′-末端区域或功能实体，例如某些基因的转录区域的5′-末端区域的一段嘧啶核苷酸。序列以通常对应于转录起始位点的胞苷开始，然后是通常约3个至30个嘧啶核苷酸的一段。例如，TOP可包含3个至30个或多于30个核苷酸。嘧啶段以及这样的5′-TOP在位于TOP下游的第一个嘌呤核苷酸5′的一个核苷酸终止。包含5′-末端寡嘧啶束的信使RNA通常被称为TOP mRNA。因此，将提供这种信使RNA的基因称为TOP基因。术语“TOP基序”或“5′-TOP基序”必须理解为对应于如上定义的5′-TOP的核酸序列。因此，在本发明的上下文中，TOP基序优选是一段长度为3个至30个核苷酸的嘧啶核苷酸。优选地，TOP基序由至少3个嘧啶核苷酸、优选至少4个嘧啶核苷酸、优选至少5个嘧啶核苷酸、更优选至少6个核苷酸、更优选至少7个核苷酸、最优选至少8个嘧啶核苷酸组成，其中嘧啶核苷酸的片段优选在其5′-端以胞嘧啶核苷酸开始。在TOP基因和TOP mRNA中，TOP基序优选在其5′-端以转录起始位点开始，并在所述基因或mRNA中的第一个嘌呤残基的5′-端的一个核苷酸终止。在本发明的意义上，TOP基序优选位于代表5′-UTR的序列的5′-端或编码5′-UTR的序列的5′-端。因此，优选地，在本发明的意义上，如果3个或多于3个嘧啶核苷酸的一段位于相应序列的5′-端，则该段称为“TOP基序”，相应序列例如人工核酸、人工核酸的5′-UTR元件或衍生自本文所述TOP基因5′-UTR的核酸序列。换言之，3个或多于3个嘧啶核苷酸的一段，其不在5′-UTR或5′-UTR元件的5′末端，而是在5′-UTR或5′-UTR元件内的任何位置，则优选地不称为“TOP基序”。在一些实施方案中，衍生自TOP基因5′-UTR的5′-UTR元件的核酸序列在其3′末端的核苷酸终止，该核苷酸位于衍生它的基因或RNA的起始密码子(例如A(U/T)G)上游1位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位或10位。因此，5′-UTR元件不包含蛋白编码序列的任何部分。因此，优选地，至少一个核酸序列，特别是RNA序列的唯一蛋白编码部分由编码序列提供。
发明内容
本发明基于发明人的出人意料的发现，即由本发明的人工RNA编码的呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白衍生的至少一种肽或蛋白可以在哺乳动物细胞中有效表达。更出人意料的是，发明人表明，本发明的人工RNA可以在例如棉鼠中诱导特异性的功能性和保护性免疫应答(参见例如实施例2、3)。通过对RSV F抗原设计进行不同的优化，可以进一步提高免疫应答。此外，通过选择合适的异源性5′非翻译区(UTR)和合适的异源性3′非翻译区(UTR)可以增加由人工核酸RNA编码的RSV F抗原的表达(参见例如实施例4)。有利地，所述包含有利的3′-UTR/5′-UTR组合的本发明的人工RNA诱导了针对编码的RSV F的非常有效的抗原特异性的免疫应答。此外，包含在脂质纳米颗粒(LNP)中的本发明的人工RNA以非常低的剂量和给药方案非常有效地诱导了针对RSV F的抗原特异性的免疫应答(参见例如实施例3)。此外，例如实施例8和实施例12提供了包含编码另外的抗原的其他人工RNA的组合物/疫苗，其中所述编码另外的抗原的人工RNA适当地引起或增强T细胞应答并导致偏向Th1的免疫应答，这被认为是潜在的RSV疫苗的重要前提(在动物模型中，偏向Th2的应答与增强的呼吸道疾病(ERD)相关)。此外，组合物适合于诱导T细胞应答。因此，本发明的人工RNA以及包含所述人工RNA的组合物/疫苗适用于在哺乳动物对象中引发针对RSV F的免疫应答。因此，人工RNA和包含所述人工RNA的组合物/疫苗适合用作疫苗，例如用作人疫苗，例如用作孕妇或婴儿的疫苗。
在第一方面，本发明提供了一种人工核酸，优选包含至少一个5′非翻译区(UTR)和/或至少一个3′非翻译区(UTR)以及与所述3′-UTR和/或5′-UTR可操作地连接的至少一个编码序列的人工RNA，所述至少一个编码序列编码至少一种衍生自RSV F蛋白或其片段或变体的抗原肽或蛋白。
在优选的实施方案中，人工RNA包含至少一种衍生自选自ALB7基因、α-珠蛋白基因、PSMB3、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9的基因的3′-UTR，或衍生自这些基因中任一种的同源物、片段或变体的核酸序列。
在优选的实施方案中，人工RNA包含至少一种衍生自选自RPL32基因、HSD17B4、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B和UBQLN2的基因的5′-UTR，或衍生自这些基因中任一种的同源物、片段或变体的核酸序列。
适当地，本发明的人工RNA包含至少一个编码序列，其编码至少一种衍生自可操作地连接至选自a-1(HSD17B4/PSMB3)、a-2(Ndufa4/PSMB3)、a-3(SLC7A3/PSMB3)、a-4(NOSIP/PSMB3)、a-5(MP68/PSMB3)、b-1(UBQLN2/RPS9)、b-2(ASAH1/RPS9)、b-3(HSD17B4/RPS9)、b-4(HSD17B4/CASP1)、b-5(NOSIP/COX6B1)、c-1(NDUFA4/RPS9)、c-2(NOSIP/NDUFA1)、c-3(NDUFA4/COX6B1)、c-4(NDUFA4/NDUFA1)、c-5(ATP5A1/PSMB3)、d-1(Rpl31/PSMB3)、d-2(ATP5A1/CASP1)、d-3(SLC7A3/GNAS)、d-4(HSD17B4/NDUFA1)、d-5(Slc7a3/Ndufa1)、e-1(TUBB4B/RPS9)、e-2(RPL31/RPS9)、e-3(MP68/RPS9)、e-4(NOSIP/RPS9)、e-5(ATP5A1/RPS9)、e-6(ATP5A1/COX6B1)、f-1(ATP5A1/GNAS)、f-2(ATP5A1/NDUFA1)、f-3(HSD17B4/COX6B1)、f-4(HSD17B4/GNAS)、f-5(MP68/COX6B1)、g-1(MP68/NDUFA1)、g-2(NDUFA4/CASP1)、g-3(NDUFA4/GNAS)、g-4(NOSIP/CASP1)、g-5(RPL31/CASP1)、h-1(RPL31/COX6B1)、h-2(RPL31/GNAS)、h-3(RPL31/NDUFA1)、h-4(Slc7a3/CASP1)、h-5(SLC7A3/COX6B1)、i-1(SLC7A3/RPS9)、i-2(RPL32/ALB7)或i-3(α-珠蛋白基因)的3′-UTR和5′-UTR的RSV F蛋白的抗原肽或蛋白，其中a-1(HSD17B4/PSMB3)、a-4(NDUFA4/PSMB3)、c-1(NDUFA4/RPS9)、e-4(NOSIP/RPS9)、g-2(NDUFA4/CASP1)、i-2(RPL32/ALB7)或i-3(α-珠蛋白)是特别优选的。
衍生自RSV F蛋白的至少一种抗原肽或蛋白可以是全长F蛋白(称为“F0”，aa 1-574)或具有缺失的C末端的F蛋白(称为“F-del”，aa 1-553)或其片段或变体。
至少一种抗原肽或蛋白可以另外包含使在构象前状态/融合前构象的抗原稳定的突变，优选DSCav1突变(S155C、S290C、S190F和V207L)或其片段或变体，或功能变体(称为“DSCav1”，例如“F0_DSCav1”或“F-del_DSCav1”)。
至少一种抗原肽或蛋白可以是融合蛋白，其包含成熟F的两个亚基F1和F2为单链，并通过接头(GS)连接以增强蛋白(F(1-103)-GS-F(145-574)；F(1-103)-GS-F(145-553))的稳定性。
包含成熟F的两个亚基为单链的蛋白(称为“F2-接头-F1”)，例如(F(1-103)-GS-F(145-574)；F(1-103)-GS-F(145-553))可另外包含DSCav1突变(本文称为“mut0”)。
在单链中包含成熟F的两个亚基的蛋白(称为“F2-接头-F1”)除DSCav1突变外，还可以包含至少一个促进启动子间二硫键的其他突变，其中突变可以选自(S46G、A149C、S215P、Y458C、K465Q；本文称为“mut1”)、(S46G、E92D、A149C、S215P、Y458C、K465Q；本文称为“mut2”)或(S46G、N67I、E92D、A149C、S215P、Y458C、K465Q；本文称为“mut3”)、(A149C、Y458C；本文称为“mut4”)、(N183GC、N428C；本文称为“mut5”)、(Q98C、Q361C、S46G、E92D、L95M、S215P、I217P、I221M、R429K、K465Q；本文称为“mut6”)、(Q98C、Q361C、L95M、I221M、R429K；本文称为“mut7”)或(N183GC、N428C、S46G、N67I、E92D、S215P、K465Q；本文称为“mut8”)或其片段或变体、或功能变体。
由本发明的人工RNA编码的至少一种衍生自RSV F蛋白的抗原肽或蛋白可以选自F0、F-del、F0_DSCav1、F_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F_DSCav1_mut3、F_DSCav1_mut4、F_DSCav1_mut5、F_DSCav1_mut6、F_DSCav1_mut7、F_DSCav1_mut8、F_DSCav1_mut0、F-del_DSCav1、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut4、F-del_DSCav1_mut5、F-del_DSCav1_mut6、F-del_DSCav1_mut7、F-del_DSCav1_mut8、F-del_DSCav1_mut0是优选的。
至少一个编码序列可以编码与SEQ ID NO：68、483、898、1267、1636、2005、2374、2743、3112、3481、3850、4219、4588、4957、5326、5695、6064、6433、6802、7171、7540、7909、8279-9683、11726、12095、12464、12833、13940、14309、14678、15047、15416、15785、13202、13571、16154、16523、16892、17261、17630、17999、18368、18737、19106、19475中的任一个或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列中的至少一个。
优选地，人工RNA可以包含与SEQ ID NO：69至77、484至492、899至906、1268至1275、1637至1644、2006至2013、2375至2382、2744至2751、3113至3120、3482至3489、3851至3858、4220至4227、4589至4596、4958至4965、5327至5334、5696至5703、6065至6072、6434至6441、6803至6810、7172至7179、7541至7548、7910至7917、21363至21384、11727至11734、12096至12103、12465至12472、12834至12841、13941至13948、14310至14317、14679至14686、15048至15055、15417至15424、15786至15793、13203至13210、13572至13579、16155至16162、16524至16531、16893至16900、17262至17269、17631至17638、18000至18007、18369至18376、18738至18745、19107至19114、19476至19483、21389至21410中的任何一个或这些序列中任何一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的编码序列。
人工RNA可以包含选自C最大化的编码序列、CAI最大化的编码序列、人密码子使用适应性编码序列、G/C含量修饰的编码序列和G/C优化的编码序列或其任意组合的密码子经修饰的编码序列。
人工RNA可以是mRNA、病毒RNA、自复制RNA、环状RNA或复制子RNA。在优选的实施方案中，人工RNA是mRNA。
人工RNA，优选mRNA，还可以包括选自帽结构、多聚腺苷酸序列、多聚胞苷酸序列、组蛋白-茎环结构和/或3′-末端序列元件中的至少一种。
本发明的人工RNA优选包含或组成为与选自SEQ ID NO：78至482、11735至12094、21415至21417、21561至21563、21489、21490、21635、21636或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F0)，SEQ ID NO：493至897、12104至12463、21418至21420、21564至21566、21491、21492、21637、21638或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F-del)，SEQ ID NO：907至1266、12473至12832、21421至21423、21567至21569、21493至21495、21639至21641或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F0_DSCav1)，SEQ ID NO：1276-1635、8278、12842至13201、21424至21426、21570至21572、21496至21498、21642至21644或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F-del_DSCav1)，SEQ ID NO：1645至2004、13949至14308、21433至21435、21579至21581、21505至21507、21651至21653或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F_DSCav1_mut1)，SEQ ID NO：2014至2373、14318至14677、21436至21438、21582至21584、21508至21510、21654至21656或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F-del_DSCav1_mut1)，SEQ ID NO：2383至2742、14687至15046、21439至21441、21585至21587、21511至21513、21657至21659或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F_DSCav1_mut2)，SEQ ID NO：2752至3111、15056至15415、21442至21444、21588至21590、21514至21516、21660至21662或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F-del_DSCav1_mut2)，SEQ IDNO：3121至3480、15425至15784、21445至21447、21591至21593、21517至21519、21663至21665或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F_DSCav1_mut3)，SEQ ID NO：3490至3849、15794至16153、21448至21450、21594至21596、21520至21522、21666至21668或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F-del_DSCav1_mut3)，SEQ ID NO：3859至4218、13211至13570、21427至21429、21573至21575、21499至21501、21645至21647或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F_DSCav1_mut0)，SEQ ID NO：4228至4587、13580至13939、21430至21432、21576至21578、21502至21504、21648至21650或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F-del_DSCav1_mut0)，SEQ ID NO：4597至4956、16163至16522、21451至21453、21597至21599、21523至21525、21669至21671或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F_DSCav1_mut4)，SEQ ID NO：4966至5325、16532至16891、21454至21456、21600至21602、21526至21528、21672至21674或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F-del_DSCav1_mut4)，SEQ ID NO：5335至5694、16901至17260、21457至21459、21603至21605、21529至21531、21675至21677或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F_DSCav1_mut5)，SEQ IDNO：5704至6063、17270至17629、21460至21462、21606至21608、21532至21534、21678至21680或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F-del_DSCav1_mut5)，SEQ ID NO：6073至6432、17639至17998、21463至21465、21609至21611、21535至21537、21681至21683或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F_DSCav1_mut6)，SEQ ID NO：6442至6801、18008至18367、21466至21468、21612至21614、21538至21540、21684至21686或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F-del_DSCav1_mut6)，SEQ ID NO：6811至7170、18377至18736、21469至21471、21615至21617、21541至21543、21687至21689或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F_DSCav1_mut7)，SEQ ID NO：7180至7539、18746至19105、21472至21474、21618至21620、21544至21546、21690至21692或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F-del_DSCav1_mut7)，SEQ ID NO：7549至7908、19115至19474、21475至21477、21621至21623、21547至21549、21693至21695或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F_DSCav1_mut8)或SEQ ID NO：7918至8277、19484至19843、21478至21480、21624至21626、21550至21552、21696至21698或这些序列中任何一个的片段或变体(编码F-del_DSCav1_mut8)的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列。
在第二方面，本发明提供了包含第一方面的人工RNA的组合物。
在优选的实施方案中，包含第一方面的人工RNA的组合物包含至少一种其他人工RNA，其包含至少一个编码序列，所述编码序列编码至少一种选自基质蛋白M、核蛋白N、M2-1蛋白和/或磷蛋白P或其组合的衍生自RSV的抗原肽或蛋白。
基质蛋白M、核蛋白N、M2-1蛋白、M2-2蛋白和/或磷蛋白P是合适的T细胞抗原，并且当施用于对象时可促进组合物或疫苗的有效T细胞应答。
其他人工RNA可以包含与SEQ ID NO：9685至9692、10135至10142、10638至10645、11184至11191、21385至21388、19845至19852、20214至20221、20583至20590、20952至20959、21411至21414中的任何一个或这些序列中任何一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的编码序列。
适当地，所述其他人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：9693至10052、10143至10502、10646至11005、11192至11551、19853至20212、20222至20581、20591至20950、20960至21319、21481至21488、21627至21634、21553至21560、21699至21706的核酸序列或这些序列中任何一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列。
适当地，组合物可以包含与一种或多于一种脂质复合、封装在其中或与之缔合从而形成脂质纳米颗粒的本发明的人工RNA。
组合物可以优选包含与一种或多于一种脂质复合从而形成脂质纳米颗粒(LNP)的本发明的人工RNA，其中所述LNP基本上由以下物质组成：
(i)至少一种本文所定义的阳离子脂质，优选式(III)的脂质，更优选脂质III-3；
(ii)本文所定义的中性脂质，优选1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；
(iii)本文所定义的类固醇或类固醇类似物，优选胆固醇；和
(iv)本文所定义的PEG-脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，优选式(IVa)的聚乙二醇化脂质；
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20％至60％的阳离子脂质：5％至25％的中性脂质：25％至55％的固醇；0.5％至15％的PEG-脂质。
本发明还涉及包含所述人工RNA或所述组合物的RSV疫苗。
本发明还涉及人工RNA、组合物和疫苗在治疗或预防RSV感染中的用途。
特别地，本发明涉及人工RNA、组合物和疫苗在治疗或预防RSV感染或与这种感染有关的病症中的用途。
本发明还涉及治疗或预防对象的病症或疾病的方法，人工RNA、组合物和疫苗的第一医药用途和第二医药用途。此外，本发明涉及试剂盒，特别是涉及试剂盒套装，其包含人工RNA、组合物和疫苗。
具体实施方式
本申请与电子格式的序列表一起提交，其是本申请的描述的一部分(WIPO标准ST.25)。与本申请一起提交的电子格式的序列表中包含的信息通过引用整体并入本文。在本文中提及“SEQ ID NO”时是指序列表中具有相应标识符的相应核酸序列或氨基酸(aa)序列。对于许多序列，序列表还提供例如有关某些结构特征、序列优化、GenBank标识符的其他详细信息，或有关其编码能力的其他详细信息。特别是，此类信息在WIPO标准ST.25序列表中的数字标识符<223>下提供。因此，在所述数字标识符<223>下提供的信息在此明确地整体包括，并且必须被理解为发明的描述的组成部分。
人工核酸：
在第一方面，本发明涉及一种人工核酸，其包含
a)至少一个异源性5′非翻译区(5′-UTR)和/或至少一个异源性3′非翻译区(3′-UTR)；和
b)与所述3’-UTR和/或5’-UTR可操作地连接的至少一个编码序列，其编码至少一种衍生自呼吸道合胞病毒(RSV)或其片段或变体的抗原肽或蛋白。
在第一方面的一个优选实施方案中，本发明涉及人工RNA，优选适合于疫苗接种的RNA，其包含
a)至少一个异源性5′非翻译区(5′-UTR)和/或至少一个异源性3′非翻译区(3′-UTR)；和
b)与所述3′-UTR和/或5′-UTR可操作地连接的至少一个编码序列，其编码至少一种衍生自RSV融合(F)蛋白或其片段或变体的抗原肽或蛋白。
通常，本发明的RNA可以由蛋白编码区以及5′和/或3′非翻译区(UTR)组成。3′-UTR的序列和大小可变；它跨越终止密码子和多聚腺苷酸尾之间。重要的是，3′-UTR序列具有确定RNA转换、稳定性和定位的几个调控基序，因此支配着转录后调控的许多方面。在RNA的医学应用(例如免疫疗法应用、疫苗接种)中，RNA翻译成蛋白的调控对于治疗安全性和功效至关重要。本发明人出人意料地发现3’-UTR和/或5’-UTR的某些组合协同作用，以协同增强编码RSV抗原肽或蛋白的可操作连接的核酸序列的表达。具有本发明的UTR组合的人工RNA分子有利地使得能够快速和瞬时表达大量衍生自RSV F的RSV抗原肽或蛋白。因此，本文提供的人工RNA特别有用并且适用于体内的各种应用，包括针对RSV的疫苗。
适当地，人工RNA可以包含至少一种异源性5′-UTR和/或至少一种异源性3′-UTR。在上下文中，本发明的UTR包含或组成为衍生自任何天然存在的基因或其片段、同源物或变体的5′-UTR或3′-UTR的核酸序列。优选地，本发明的5′-UTR或3′-UTR与编码至少一种衍生自RSV F的抗原肽或蛋白的至少一种编码序列是异源的。合适的异源性5′-UTR或异源性3′-UTR衍生自天然存在的基因(不是衍生自RSV)。在其他实施方案中，在本发明的上下文中可以使用合成设计的5′-UTR或3′-UTR。
在优选的实施方案中，至少一种人工RNA包含至少一种异源性3′-UTR。
优选地，至少一个异源性3′-UTR包含或组成为衍生自脊索动物基因，优选脊椎动物基因，更优选哺乳动物基因，最优选人基因的3′-UTR的核酸序列或衍生自脊索动物基因，优选脊椎动物基因，更优选哺乳动物基因，最优选人基因的3′-UTR的变体。
优选地，本发明的人工RNA包含3′-UTR，其可以衍生自与具有延长的半衰期的RNA有关(提供稳定的RNA)的基因，例如下面定义和描述的3′-UTR。
优选地，至少一个异源3′-UTR包含衍生自基因的3′-UTR的核酸序列，该核酸序列优选编码稳定的mRNA或所述基因的同源物、片段或变体。
在第一方面的优选实施方案中，本发明的人工RNA包含至少一种异源3′-UTR，其中至少一个异源3′-UTR包含衍生自选自PSMB3、ALB7、α-珠蛋白(称为“muag”)、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9的基因或衍生自这些基因中任一个的同源物、片段或变体的3′-UTR的核酸序列。
ALB7衍生的3’-UTR：在优选的实施方案中，3′-UTR包含或组成为衍生自脊椎动物白蛋白基因的3′-UTR或其变体，优选衍生自哺乳动物白蛋白基因的3′-UTR或其变体，更优选衍生自人白蛋白基因的3′-UTR或其变体，甚至更优选衍生自根据GenBank登录号NM_000477.5的人白蛋白基因的3′-UTR或其同源物、片段或变体的核酸序列。因此，本发明的人工RNA可以包含衍生自ALB7基因的3′-UTR，其中所述衍生自ALB7基因的3′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：35或36或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
α珠蛋白基因衍生的3′-UTR：在优选的实施方案中，3′-UTR包含或组成为衍生自脊椎动物α-珠蛋白基因(称为“muag”)或其变体的3′-UTR，优选衍生自哺乳动物α-珠蛋白的3′-UTR或其变体，更优选衍生自人α-珠蛋白基因的3′-UTR或其变体，甚至更优选衍生自人α-珠蛋白基因的3′-UTR的核酸序列。因此，本发明的RNA可以包含衍生自α-珠蛋白基因的3′-UTR，其中所述衍生自α-珠蛋白基因的3′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：37或38或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
PSMB3衍生的3’-UTR：本发明的人工RNA可以包含3′-UTR，其衍生自编码蛋白酶体亚基β3型(PSMB3)蛋白的基因或其同源物、变体、片段或衍生物的3′-UTR。此类3′-UTR优选包含或组成为衍生自蛋白酶体亚基β3型(PSMB3)基因，优选衍生自脊椎动物，更优选哺乳动物，最优选人蛋白酶体亚基β3型(PSMB3)基因或其同源物、变体、片段或衍生物的3′-UTR的核酸序列。所述基因可优选编码对应于人蛋白酶体亚基β-3型(PSMB3)蛋白(UniProt参考号P49720，条目号#183，2017年8月30日)的蛋白酶体β亚基3型(PSMB3)蛋白。因此，本发明的人工RNA可以包含衍生自PSMB3基因的3′-UTR，其中所述衍生自PSMB3基因的3′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：23或24或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
CASP1衍生的3’-UTR：本发明的人工RNA可以包含3′-UTR，其衍生自编码半胱天冬酶-1(CASP1)蛋白的基因或其同源物、变体、片段或衍生物的3′-UTR。此类3′-UTR优选包含或组成为衍生自半胱天冬酶-1(CASP1)基因，优选衍生自脊椎动物，更优选哺乳动物，最优选人半胱天冬酶-1(CASP1)基因或其同源物、变体、片段或衍生物的3′-UTR的核酸序列。因此，本发明的RNA可以包含衍生自CASP1基因的3′-UTR，其中所述衍生自CASP1基因的3′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：25或26或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
COX6B1衍生的3’-UTR：本发明的人工RNA可以包含3′-UTR，其衍生自编码细胞色素c氧化酶亚基6B1(COX6B1)蛋白的COX6B1基因或其同源物、变体、片段或衍生物的3′-UTR。此类3′-UTR优选包含或组成为衍生自细胞色素c氧化酶亚基6B1(COX6B1)基因，优选衍生自脊椎动物，更优选哺乳动物，最优选人细胞色素c氧化酶亚基6B1(COX6B1)基因或其同源物、变体、片段或衍生物的3′-UTR的核酸序列。所述基因可优选编码对应于人细胞色素c氧化酶亚基6B1(COX6B1)蛋白(UniProt参考号P14854，条目号#166，2017年8月30日)的细胞色素c氧化酶亚基6B1(COX6B1)蛋白。因此，本发明的人工RNA可以包含衍生自COX6B1基因的3′-UTR，其中所述衍生自COX6B1基因的3′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：27或28或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
GNAS衍生的3’-UTR：本发明的人工RNA可以包含3′-UTR，其衍生自编码鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G亚基α亚型短(GNAS)蛋白的GNAS基因或其同源物、变体、片段或衍生物的3′-UTR。此类3′-UTR优选包含或组成为衍生自鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G亚基α亚型短(GNAS)基因，优选衍生自脊椎动物，更优选哺乳动物鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G亚基α亚型短(GNAS)基因或其同源物、变体、片段或衍生物的3′-UTR的核酸序列。所述基因可以优选编码对应于人鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G亚基α亚型短(GNAS)蛋白(UniProt参考号P63092，条目号#153，2017年8月30日)的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G亚基α亚型短(GNAS)蛋白。因此，本发明的人工RNA可以包含衍生自GNAS基因的3′-UTR，其中所述衍生自GNAS基因的3′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：29或30或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
NDUFA1衍生的3’-UTR：本发明的人工RNA可以包含3′-UTR，其衍生自编码NADH脱氢酶[泛醌]1α亚复合物亚基1(NDUFA1)蛋白的基因或其同源物、变体、片段或衍生物的3′-UTR。此类3′-UTR优选包含或组成为衍生自NADH脱氢酶[泛醌]1α亚复合物亚基1(NDUFA1)基因，优选衍生自脊椎动物，更优选哺乳动物NADH脱氢酶[泛醌]1α亚复合物亚基1(NDUFA1)基因或其同源物、变体、片段或衍生物的3′-UTR的核酸序列。所述基因可以优选地编码对应于人NADH脱氢酶[泛醌]1α亚复合物亚基1(NDUFA1)蛋白(UniProt参考号O15239，条目号#152，2017年8月30日)的NADH脱氢酶[泛醌]1α亚复合物亚基1蛋白。因此，本发明的人工RNA可以包含衍生自NDUFA1基因的3′-UTR，其中所述衍生自NDUFA1基因的3′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：31或32或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
RPS9衍生的3’-UTR：本发明的人工RNA可以包含3′-UTR，其衍生自编码40S核糖体蛋白S9(RPS9)蛋白的基因或其同源物、变体、片段或衍生物的3′-UTR。此类3′-UTR优选包含或组成为衍生自40S核糖体蛋白S9(RPS9)基因，优选衍生自脊椎动物，更优选哺乳动物，最优选人40S核糖体蛋白S9(RPS9)基因或其同源物、变体、片段或衍生物的3′-UTR的核酸序列。所述基因可优选编码对应于人40S核糖体蛋白S9(RPS9)蛋白(UniProt参考号P46781，条目号#179，2017年8月30目)的40S核糖体蛋白S9(RPS9)蛋白。因此，本发明的人工RNA可以包含衍生自RPS9基因的3′-UTR，其中所述衍生自RPS9基因的3′-UTR包含或组成为与SEQ IDNO：33或34或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
其他3′-UTR：在实施方案中，如本文定义的人工RNA包含如WO2016/107877中所述的3’-UTR。在这种情况下，涉及3′-UTR序列的WO2016/107877的公开内容通过引用并入本文。特别合适的3′-UTR是专利申请WO2016/107877的SEQ ID NO：1至24和SEQ ID NO：49至318，或这些序列的片段或变体。因此，本发明的人工RNA的3′-UTR可以包含或组成为专利申请WO2016/107877的SEQ ID NO：1至24和SEQ ID NO：49至318的核酸序列的相应RNA序列。在其他实施方案中，如本文定义的人工RNA包含如WO2017/036580中所述的3’-UTR。在这种情况下，涉及3′-UTR序列的WO2017/036580的公开内容通过引用并入本文。特别合适的3′-UTR是专利申请WO2017/036580的SEQ ID NO：152至204，或这些序列的片段或变体。因此，本发明的人工RNA的3′-UTR可以包含或组成为专利申请WO2017/036580的SEQ ID NO：152至204的核酸序列的相应RNA序列。
根据优选的实施方案，人工RNA包含至少一个异源5’-UTR。
在优选的实施方案中，至少一种本文定义的人工核酸，特别是本文定义的RNA可包含至少一种异源性5′-UTR。
优选地，至少一种5′-UTR包含或组成为衍生自脊索动物基因，优选脊椎动物基因，更优选哺乳动物基因，最优选人基因的5′-UTR的核酸序列或衍生自脊索动物基因，优选脊椎动物基因，更优选哺乳动物基因，最优选人基因的5′-UTR的变体。
优选地，本发明的人工RNA包含5′-UTR，其可以衍生自与具有延长的半衰期的RNA有关(提供稳定的RNA)的基因，例如下面定义和描述的5′-UTR。
优选地，至少一种异源5′-UTR包含衍生自基因的5′-UTR的核酸序列，该核酸序列优选编码稳定的mRNA或衍生自所述基因的同源物、片段或变体。
在第一方面的优选实施方案中，本发明的人工RNA包含至少一种异源性5′-UTR，其中至少一种异源性5′-UTR包含衍生自选自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、UBB4B和UBQLN2的基因或衍生自这些基因中任一个的同源物、片段或变体的5′-UTR的核酸序列。
RPL32衍生的5′-UTR：本发明的人工RNA可包含衍生自编码60S核糖体蛋白L32的基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR，其中所述5′-UTR优选缺少5′TOP基序。此类5′-UTR优选包含或组成为衍生自60S核糖体蛋白L32(RPL32)基因，优选衍生自脊椎动物，更优选哺乳动物，最优选人60S核糖体蛋白L32(RPL32)基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR的核酸序列，其中5’-UTR优选不包含所述基因的5’TOP。所述基因可优选编码对应于人60S核糖体蛋白L32(RPL32)蛋白(UniProt参考号P62899，条目号#138，2017年8月30日)的60S核糖体蛋白L32(RPL32)蛋白。因此，本发明的人工RNA可以包含衍生自RPL32基因的5′-UTR，其中所述衍生自RPL32基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：21或22或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
HSD17B4衍生的5’-UTR：本发明的人工RNA可包含衍生自编码17-β-羟基类固醇脱氢酶4的基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR，优选缺少5′TOP基序。此类5′-UTR优选包含或组成为衍生自17-β-羟基类固醇脱氢酶4(也称为过氧化物酶体多功能酶2型)基因，优选衍生自脊椎动物，更优选哺乳动物，最优选人17-β-羟基类固醇脱氢酶4(HSD17B4)基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR的核酸序列，其中优选5’-UTR不包含所述基因的5’TOP。所述基因可以优选编码对应于人17-β-羟基类固醇脱氢酶4(UniProt参考号Q9BPX1，条目号#139，2017年8月30日)或其同源物、变体、片段或衍生物的17-β-羟基类固醇脱氢酶4蛋白。因此，本发明的人工RNA可以包含衍生自HSD17B4基因的5′-UTR，其中所述衍生自HSD17B4基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：1或2或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
ASAH1衍生的5′-UTR：本发明的人工RNA可以包含5′-UTR，其衍生自编码酸性神经酰胺酶(ASAH1)的基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR。此类5′-UTR优选包含或组成为衍生自酸性神经酰胺酶(ASAH1)基因，优选衍生自脊椎动物，更优选哺乳动物，最优选人酸性神经酰胺酶(ASAH1)基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR的核酸序列。所述基因可以优选编码对应于人酸性神经酰胺酶(ASAH1)(UniProt参考号Q13510，条目号#177，2017年6月7日)或其同源物、变体、片段或衍生物的酸性神经酰胺酶(ASAH1)蛋白。因此，本发明的人工RNA可以包含衍生自ASAH1基因的5′-UTR，其中所述衍生自ASAH1基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：3或4或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
ATP5A1衍生的5’-UTR：本发明的人工RNA可包含衍生自编码线粒体ATP合酶亚基α(ATP5A1)的基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR，其中所述5′-UTR优选缺少5′TOP基序。此类5′-UTR优选包含或组成为衍生自线粒体ATP合酶亚基α(ATP5A1)基因，优选衍生自脊椎动物，更优选哺乳动物，最优选人线粒体ATP合酶亚基α(ATP5A1)基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR的核酸序列，其中5’-UTR优选不包含所述基因的5’TOP。所述基因可以优选编码对应于人线粒体ATP合酶亚基α(ATP5A1)(UniProt参考号P25705，条目号#208，2017年8月30日)或其同源物、变体、片段或衍生物的线粒体ATP合酶亚基α蛋白。因此，本发明的人工RNA可以包含衍生自ATP5A1基因的5′-UTR，其中所述衍生自ATP5A1基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：5或6或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
MP68衍生的5’-UTR：本发明的人工RNA可以包含5′-UTR，其衍生自编码MP68的基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR。此类5′-UTR优选包含或组成为衍生自6.8kDa线粒体蛋白脂(MP68)基因，优选衍生自脊椎动物，更优选哺乳动物6.8kDa线粒体蛋白脂(MP68)基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR的核酸序列。所述基因可优选编码对应于人6.8kDa线粒体蛋白脂(MP68)蛋白(UniProt参考号P56378，条目号#127，2017年2月15日)的6.8kDa线粒体蛋白脂(MP68)蛋白。因此，本发明的人工RNA可以包含衍生自MP68基因的5′-UTR，其中所述衍生自MP68基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：7或8或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
NDUFA4衍生的5’-UTR：本发明的人工RNA可以包含5′-UTR，其衍生自编码细胞色素C氧化酶亚基(NDUFA4)的基因或其同源物、片段或变体的5′-UTR。此类5′-UTR优选包含或组成为衍生自细胞色素C氧化酶亚基(NDUFA4)基因，优选衍生自脊椎动物，更优选哺乳动物细胞色素C氧化酶亚基(NDUFA4)基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR的核酸序列。所述基因可优选编码对应于人细胞色素c氧化酶亚基(NDUFA4)蛋白(UniProt参考号O00483，条目号#149，2017年8月30日)的细胞色素c氧化酶亚基(NDUFA4)蛋白。因此，本发明的人工RNA可以包含衍生自NDUFA4基因的5′-UTR，其中所述衍生自NDUFA4基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：9或10或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
NOSIP衍生的5’-UTR：本发明的人工RNA可以包含5′-UTR，其衍生自编码一氧化氮合酶相互作用(NOSIP)蛋白的基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR。此类5′-UTR优选包含或组成为衍生自一氧化氮合酶相互作用蛋白(NOSIP)基因，优选衍生自脊椎动物，更优选哺乳动物，最优选人一氧化氮合酶相互作用蛋白(NOSIP)基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR的核酸序列。所述基因可优选编码对应于人一氧化氮合酶相互作用蛋白(NOSIP)的蛋白(UniProt参考号Q9Y314，条目号#130，2017年6月7日)的一氧化氮合酶相互作用蛋白(NOSIP)。因此，本发明的人工RNA可以包含衍生自NOSIP基因的5′-UTR，其中所述衍生自NOSIP基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：11或12或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
RPL31衍生的5’-UTR：本发明的人工RNA可包含5′-UTR，其衍生自编码60S核糖体蛋白L31的基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR，其中所述5′-UTR优选缺少5′TOP基序。此类5′-UTR优选包含或组成为衍生自60S核糖体蛋白L31(RPL31)基因，优选衍生自脊椎动物，更优选哺乳动物60S核糖体蛋白L31(RPL31)基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR的核酸序列，其中5’-UTR优选不包含所述基因的5’TOP。所述基因可优选编码对应于人60S核糖体蛋白L31(RPL31)蛋白(UniProt参考号P62899，条目号#138，2017年8月30日)的60S核糖体蛋白L31(RPL31)蛋白。因此，本发明的人工RNA可以包含衍生自RPL31基因的5′-UTR，其中所述衍生自RPL31基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：13或14或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
SLC7A3衍生的5’-UTR：本发明的人工RNA可以包含5′-UTR，其衍生自编码阳离子氨基酸转运蛋白3(溶质载体家族7成员3，SLC7A3)蛋白的基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR。此类5′-UTR优选包含或组成为衍生自阳离子氨基酸转运蛋白3(SLC7A3)基因，优选衍生自脊椎动物，更优选哺乳动物阳离子氨基酸转运蛋白3(SLC7A3)基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR的核酸序列。所述基因可优选编码对应于人阳离子氨基酸转运蛋白3(SLC7A3)蛋白(UniProt参考号Q8WY07，条目号#139，2017年8月30日)的阳离子氨基酸转运蛋白3(SLC7A3)蛋白。因此，本发明的人工RNA可以包含衍生自SLC7A3基因的5′-UTR，其中所述衍生自SLC7A3基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：15或16或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
TUBB4B衍生的5’-UTR：本发明的人工RNA可以包含5′-UTR，其衍生自编码微管蛋白β-4B链(TUBB4B)蛋白的基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR。此类5′-UTR优选包含或组成为衍生自微管蛋白β-4B链(TUBB4B)基因，优选衍生自脊椎动物，更优选哺乳动物，最优选人微管蛋白β-4B链(TUBB4B)基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR的核酸序列。所述基因可优选编码对应于人微管蛋白β-4B链(TUBB4B)蛋白(UniProt参考号Q8WY07，条目号#142，2017年8月30日)的微管蛋白β-4B链(TUBB4B)蛋白。因此，本发明的人工RNA可以包含衍生自TUBB4B基因的5′-UTR，其中所述衍生自TUBB4B基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：17或18或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
UBQLN2衍生的5’-UTR：本发明的人工RNA可以包含5′-UTR，其衍生自编码泛醌蛋白2(UBQLN2)蛋白的基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR。此类5′-UTR优选包含或组成为衍生自泛醌蛋白2(UBQLN2)基因，优选衍生自脊椎动物，更优选哺乳动物泛醌蛋白2(UBQLN2)基因或其同源物、变体、片段或衍生物的5′-UTR的核酸序列。所述基因可优选编码对应于UniProt参考号Q8WY07，条目号#151，2017年8月30日的泛醌蛋白2(UBQLN2)蛋白。因此，本发明的人工RNA可以包含衍生自UBQLN2基因的5′-UTR，其中所述衍生自UBQLN2基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：19或20或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
其他5′-UTR：在实施方案中，如本文定义的人工RNA包含如WO2013/143700中所述的5’-UTR。在这种情况下，涉及5′-UTR序列的WO2013/143700的公开内容通过引用并入本文。特别优选的5′-UTR是衍生自专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO：1至1363、SEQ IDNO：1395、SEQ ID NO：1421和SEQ ID NO：1422的核酸序列或这些序列的片段或变体。在这种情况下，优选的是，根据本发明的人工RNA的5’-UTR包含或组成为根据专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO：1至1363、SEQ ID NO：1395、SEQ ID NO：1421和SEQ ID NO：1422的核酸序列的相应RNA序列。在其他实施方案中，本发明的人工RNA包含如WO2016/107877中所述的5’-UTR。在这种情况下，涉及5′-UTR序列的WO2016/107877的公开内容通过引用并入本文。特别优选的5′-UTR是根据专利申请WO2016/107877的SEQ ID NO：25至30和SEQ ID NO：319至382的核酸序列或这些序列的片段或变体。在这种情况下，特别优选地，人工RNA的5′-UTR包含或组成为根据专利申请WO2016/107877的SEQ ID NO：25至30和SEQ ID NO：319至382的核酸序列的对应的RNA序列。在其他实施方案中，本发明的人工RNA包含如WO2017/036580中所述的5’-UTR。在这种情况下，涉及5′-UTR序列的WO2017/036580的公开内容通过引用并入本文。特别优选地，5′-UTR是根据专利申请WO2017/036580的SEQ ID NO：1至151的核酸序列或这些序列的片段或变体。在这种情况下，特别优选地，人工RNA的5′-UTR包含或组成为根据专利申请WO2017/036580的SEQ ID NO：1至151的核酸序列的对应的RNA序列。
发明人发现，至少一种异源5′-UTR和/或至少一种异源3′-UTR的某些组合有利地增加可操作地连接至所述3′-UTR和/或5′-UTR的至少一种编码序列的翻译，所述编码序列编码靶组织(例如，肌肉、真皮)中的至少一种衍生自RSV F蛋白的抗原肽或蛋白。
因此，优选地，本文定义的至少一种异源性5′-UTR和本文定义的至少一种异源性3′-UTR协同作用以增加来自本发明的人工RNA的抗原肽或蛋白的产生(即翻译)。在下文中指定了5′-UTR和3′-UTR的这些有利组合。下述介绍的每一个缩写，即“a-1”、“a-2”、“a-3”、“a-4”、“a-5”、“b-1”、“b-2”、“b-3”、“b-4”、“b-5”、“c-1”、“c-2”、“c-3”、“c-4”、“c-5”、“d-1”、“d-2”、“d-3”、“d-4”、“d-5”、“e-1”、“e-2”、“e-3”、“e-4”、“e-5”、“e-6”、“f-1”、“f-2”、“f-3”、“f-4”、“f-5”、“g-1”、“g-2”、“g-3”、“g-4”、“g-5”、“h-1”、“h-2”、“h-3”、“h-4”、“h-5”、“i-1”、“i-2”、“i-3”，在本发明的整个说明书中使用，并且代表本发明的5′-UTR和/或3′-UTR的一种有利的组合。
因此，在第一方面的优选实施方案中，本发明的人工RNA包括
a-1.至少一个衍生自HSD17B4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自PSMB3基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
a-2.至少一个衍生自NDUFA4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自PSMB3基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
a-3.至少一个衍生自SLC7A3基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自PSMB3基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
a-4.至少一个衍生自NOSIP基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自PSMB3基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
a-5.至少一个衍生自MP68基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自PSMB3基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
b-1.至少一个衍生自UBQLN2基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
b-2.至少一个衍生自ASAH1基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
b-3.至少一个衍生自HSD17B4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
b-4.至少一个衍生自HSD17B4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自CASP1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
b-5.至少一个衍生自NOSIP基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自COX6B 1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
c-1.至少一个衍生自NDUFA4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
c-2.至少一个衍生自NOSIP基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自NDUFA1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
c-3.至少一个衍生自NDUFA4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自COX6B1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
c-4.至少一个衍生自NDUFA4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自NDUFA1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
c-5.至少一个衍生自ATP5A1基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自PSMB3基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
d-1.至少一个衍生自RPL31基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自PSMB3基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
d-2.至少一个衍生自ATP5A1基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自CASP1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
d-3.至少一个衍生自SLC7A3基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自GNAS基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
d-4.至少一个衍生自HSD17B4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自NDUFA1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
d-5.至少一个衍生自SLC7A3基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自NDUFA1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
e-1.至少一个衍生自TUBB4B基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
e-2.至少一个衍生自RPL31基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
e-3.至少一个衍生自MP68基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
e-4.至少一个衍生自NOSIP基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
e-5.至少一个衍生自ATP5A1基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
e-6.至少一个衍生自ATP5A1基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自COX6B1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
f-1.至少一个衍生自ATP5A1基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自GNAS基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
f-2.至少一个衍生自ATP5A1基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自NDUFA1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
f-3.至少一个衍生自HSD17B4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自COX6B1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
f-4.至少一个衍生自HSD17B4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自GNAS基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
f-5.至少一个衍生自MP68基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自COX6B1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
g-1.至少一个衍生自MP68基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自NDUFA1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
g-2.至少一个衍生自NDUFA4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自CASP1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
g-3.至少一个衍生自NDUFA4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自GNAS基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
g-4.至少一个衍生自NOSIP基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自CASP1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
g-5.至少一个衍生自RPL31基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自CASP1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
h-1.至少一个衍生自RPL31基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自COX6B1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
h-2.至少一个衍生自RPL31基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自GNAS基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
h-3.至少一个衍生自RPL31基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自NDUFA1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
h-4.至少一个衍生自SLC7A3基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自CASP1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
h-5.至少一个衍生自SLC7A3基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自COX6B1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
i-1.至少一个衍生自SLC7A3基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR。
i-2.至少一个衍生自RPL32基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自ALB7基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR。
i-3.至少一个衍生自α-珠蛋白基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR。
适当地，本发明的人工RNA包含至少一个编码序列，其编码至少一种衍生自可操作地连接至选自a-1(HSD17B4/PSMB3)、a-2(Ndufa4/PSMB3)、a-3(SLC7A3/PSMB3)、a-4(NOSIP/PSMB3)、a-5(MP68/PSMB3)、b-1(UBQLN2/RPS9)、b-2(ASAH1/RPS9)、b-3(HSD17B4/RPS9)、b-4(HSD17B4/CASP1)、b-5(NOSIP/COX6B1)、c-1(NDUFA4/RPS9)、c-2(NOSIP/NDUFA1)、c-3(NDUFA4/COX6B1)、c-4(NDUFA4/NDUFA1)、c-5(ATP5A1/PSMB3)、d-1(Rpl31/PSMB3)、d-2(ATP5A1/CASP1)、d-3(SLC7A3/GNAS)、d-4(HSD17B4/NDUFA1)、d-5(Slc7a3/Ndufa1)、e-1(TUBB4B/RPS9)、e-2(RPL31/RPS9)、e-3(MP68/RPS9)、e-4(NOSIP/RPS9)、e-5(ATP5A1/RPS9)、e-6(ATP5A1/COX6B1)、f-1(ATP5A1/GNAS)、f-2(ATP5A1/NDUFA1)、f-3(HSD17B4/COX6B1)、f-4(HSD17B4/GNAS)、f-5(MP68/COX6B1)、g-1(MP68/NDUFA1)、g-2(NDUFA4/CASP1)、g-3(NDUFA4/GNAS)、g-4(NOSIP/CASP1)、g-5(RPL31/CASP1)、h-1(RPL31/COX6B1)、h-2(RPL31/GNAS)、h-3(RPL31/NDUFA1)、h-4(Slc7a3/CASP1)、h-5(SLC7A3/COX6B1)、i-1(SLC7A3/RPS9)、i-2(RPL32/ALB7)或i-3(α-珠蛋白基因)的3′-UTR和5′-UTR的RSV F蛋白的抗原肽或蛋白。
在第一方面的特别优选的实施方案中、本发明的人工RNA包含根据a-1(HSD17B4/PSMB3)、a-4(NDUFA4/PSMB3)、c-1(NDUFA4/RPS9)、e-4(NOSIP/RPS9)、g-2(NDUFA4/CASP1)、i-2(RPL32/ALB7)或i-3(α-珠蛋白(muag))的UTR元件。
在第一方面的一个特别优选的实施方案中，本发明的人工RNA包含根据a-1(HSD17B4/PSMB3)的UTR元件。
本发明涉及一种人工RNA，优选地是适于疫苗接种的RNA，其包含至少一个如上定义的异源性5′-UTR和/或至少一个如上定义的异源性3′-UTR和至少一个可操作地连接至所述3′-UTR和/或5′-UTR的编码序列，其中所述编码序列编码至少一种衍生自呼吸道合胞病毒(“RSV”)的抗原肽或蛋白或其片段或变体。
如本文所用，术语“呼吸道合胞病毒”或相应的缩写“RSV”不限于包含任何来源的任何呼吸道合胞病毒的特定病毒株、变体、血清型或分离株等。
根据不同的实施方案，人工RNA，优选人工RNA的编码序列包含或组成为衍生自病毒的核酸序列，具有在以下列表1中提供的NCBI分类学ID(“NCBI-ID”)。
列表1：RSV病毒株：
人骨肺炎病毒，HRSV(NCBI-ID 11250)；人呼吸道合胞病毒A，HRSV-A，呼吸道合胞病毒A族(NCBI-ID 208893)；人呼吸道合胞病毒A长病毒株，人呼吸道合胞病毒(A亚族/长病毒株)(NCBI-ID 11260)；人呼吸道合胞病毒A2，人呼吸道合胞病毒(A2病毒株)，HRSVA(NCBI-ID 11259)；人呼吸道合胞病毒(RSB1734病毒株)，(NCBI-ID 11253)；人呼吸道合胞病毒(RSB5857病毒株)(NCBI-ID 11254)；人呼吸道合胞病毒(RSB6190病毒株)，(NCBI-ID11255)；人呼吸道合胞病毒(RSB6256病毒株)，(NCBI-ID 11256)；人呼吸道合胞病毒(RSB642病毒株)，(NCBI-ID 11252)；人呼吸道合胞病毒(RSB6614病毒株)，(NCBI-ID11257)；人呼吸道合胞病毒B，HRSV-B，呼吸道合胞病毒B族，(NCBI-ID 208895)；人呼吸道合胞病毒9320(NCBI-ID 253182)；人呼吸道合胞病毒B1(NCBI-ID 79692)；人呼吸道合胞病毒(亚族B/18537病毒株)，(NCBI-ID11251)；人呼吸道合胞病毒(B族/8/60病毒株)，(NCBI-ID11258)；人呼吸道合胞病毒S2，(NCBI-ID 410078)；人呼吸道合胞病毒株RSS-2，(NCBI-ID11261)；未分类的人类呼吸道合胞病毒，(NCBI-ID 410233)；人呼吸道合胞病毒(RSP112/Sweden/02-03病毒株)，(NCBI-ID 410237)；人呼吸道合胞病毒(RSP120/Sweden/02-03病毒株)，(NCBI-ID 410238)；人呼吸道合胞病毒(RSP121/Sweden/02-03病毒株)，(NCBI-ID410239)；人呼吸道合胞病毒(RSP122/Sweden/02-03病毒株)，(NCBI-ID 410247)；人呼吸道合胞病毒(RSP13/Sweden/02-03病毒株)，(NCBI-ID 410241)；人呼吸道合胞病毒(RSP140/Sweden/02-03病毒株)，(NCBI-ID 410248)；人呼吸道合胞病毒(RSP16/Sweden/02-03病毒株)，(NCBI-ID 410242)；人呼吸道合胞病毒(RSP171/Sweden/02-03病毒株)，(NCBI-ID410246)；人呼吸道合胞病毒(RSP183/Sweden/02-03病毒株)，(NCBI-ID 410249)；人呼吸道合胞病毒(RSP191/Sweden/02-03病毒株)，(NCBI-ID 410240)；人呼吸道合胞病毒(RSP199/Sweden/02-03病毒株)，(NCBI-ID 410250)；人呼吸道合胞病毒(RSP212/Sweden/02-03病毒株)，(NCBI-ID 410251)；人呼吸道合胞病毒(RSP41/Sweden/02-03病毒株)，(NCBI-ID410234)；人呼吸道合胞病毒(RSP45/Sweden/02-03病毒株)，(NCBI-ID 410235)；人呼吸道合胞病毒(RSP56/Sweden/02-03病毒株)，(NCBI-ID 410243)；人呼吸道合胞病毒(RSP58/Sweden/02-03病毒株)，(NCBI-ID 410236)；人呼吸道合胞病毒(RSP67/Sweden/02-03病毒株)，(NCBI-ID 410244)；人呼吸道合胞病毒(RSP94/Sweden/02-03病毒株)，(NCBI-ID410245)；呼吸道合胞病毒分离株RSV Memphis-37(Memphis-37病毒株)(NCBI-ID 12814)。
在本发明的优选实施方案中，至少一种抗原肽或蛋白衍生自呼吸道合胞病毒分离株RSV Memphis-37(Memphis-37病毒株)(NCBI-ID：12814)。贯穿本发明，包括ST25序列表中包含的信息，缩写“HRSV(Memphis-37)”用于所述特别优选的RSV病毒。
在本发明的优选实施方案中，至少一种抗原肽或蛋白衍生自人呼吸道合胞病毒A2，人呼吸道合胞病毒(A2病毒株)(NCBI-ID：11259)。贯穿本发明，包括ST25序列表中包含的信息，缩写“HRSV(A2)”用于所述特别优选的RSV病毒。
应当理解，技术人员还可以使用衍生自列表1中提供的任何RSV病毒株的氨基酸序列和核酸序列，以适应本发明的教导并获得根据本发明的RNA构建体、组合物和疫苗。
在不同的实施方案中，至少一种抗原肽或蛋白可以选自呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白(F)、糖蛋白G、短疏水蛋白SH、基质蛋白M、核蛋白N、大聚合酶L、M2-1蛋白、M2-2蛋白、磷蛋白P、非结构蛋白NS1或非结构蛋白NS2或其片段、变体或衍生物。
在第一方面的特别优选的实施方案中，至少一种抗原肽或蛋白衍生自RSV融合(F)蛋白。在这种情况下，至少一种抗原肽或蛋白的氨基酸序列可以选自衍生自RSV融合蛋白F或其片段、变体或衍生物的任何肽或蛋白。
RSV F蛋白最初(感染宿主细胞后)表达为单一多肽前体，称为全长融合蛋白F(在本文中称为“F0”)。F0在内质网中形成三聚体，并在两个保守位点被细胞/宿主弗林蛋白酶样蛋白酶加工，生成F1、F2和Pep27多肽。Pep27多肽被切除，不形成成熟F蛋白的一部分。F2多肽衍生自F0前体的N末端部分，并通过两个二硫键与F1多肽相连。F1多肽从F0前体的C末端部分开始，并通过跨膜结构域将成熟的F蛋白锚定在膜中，该成熟的F蛋白与胞质尾区相连。三个F2-F1异二聚体单元(“原聚体”)组装形成成熟的F蛋白。最初，成熟的F蛋白为亚稳定形式(在本文中称为“融合前构象”)。触发后，它会发生剧烈且不可逆的构象变化(在此称为“融合后构象”)，使病毒膜和靶细胞膜融合。
因此，第一方面的人工RNA，优选适合疫苗接种的人工RNA，编码至少一种衍生自RSV F蛋白或其片段或变体的抗原肽或蛋白。
在优选的实施方案中，衍生自RSV F蛋白的至少一种抗原肽或蛋白可以衍生自以下列表2中提供的以下氨基酸序列(NCBI蛋白登录号)中的任何一种。
列表2：RSV融合(F)蛋白的NCBI蛋白登录号：
蛋白登录号、AJF44801.1、AJF44759.1、AJF44661.1、AJF44602.1、2207424A、AAB38520.1、AAB38517.1、AAB38519.1、AAB38518.1、AVQ93587.1、AVQ93599.1、AVQ93571.1、AVQ93568.1、AVQ93589.1、AVQ93597.1、AVQ93563.1、AVQ93594.1、AVQ93606.1、AVQ93601.1、AVQ93562.1、AVQ93561.1、AVQ93607.1、AVQ93588.1、AVQ93575.1、AVQ93468.1、AVQ93467.1、AVQ93590.1、AVQ93552.1、AVQ93556.1、AVQ93471.1、AVQ93458.1、AVQ93494.1、AVQ93470.1、AVQ93489.1、AVQ93542.1、AVQ93472.1、AVQ93514.1、AVQ93485.1、AVQ93533.1、AVQ93481.1、AVQ93546.1、AVQ93512.1、AVQ93554.1、AVQ93551.1、AVQ93547.1、AVQ93558.1、AVQ93461.1、AVQ93500.1、AVQ93426.1、AVQ93398.1、AVQ93401.1、AVQ93361.1、AVQ93408.1、AVQ93443.1、AVQ93429.1、AVQ93359.1、AVQ93365.1、AVQ93366.1、AVQ93402.1、AVQ93377.1、AVQ93412.1、AVQ93391.1、AVQ93457.1、AVQ93372.1、AVQ93455.1、AVQ93364.1、AVQ93378.1、AVQ93393.1、AVQ93362.1、AVQ93585.1、ART28504.1、AVQ93404.1、AOS49123.1、AOS48496.1、AMT78271.1、AHX57174.1、AHW81390.1、AHV81506.1、AFX60128.1、AFX60129.1、AEQ63389.1、ARB66328.1、ANZ80034.1、AMN91253.1、P03420.1、AIO08046.1、NP_056863.1、AFX60234.1、AFX60231.1、AFX60232.1、AFX60222.1、AFX60219.1、AFX60215.1、AFX60214.1、AFX60212.1、AFX60208.1、AFX60202.1、AFX60220.1、AFX60213.1、AFX60190.1、AFX60187.1、AFX60201.1、AFX60173.1、AFX60169.1、AFX60162.1、AFX60156.1、AFX60151.1、AFX60150.1、AFX60148.1、AFX60141.1、AFX60127.1、AFX60137.1、AFX60135.1、AFV46420.1、AFX60200.1、AFV46419.1、AFV46417.1、AFV46413.1、AFV46414.1、AFV46410.1、AFV46403.1、AFV46409.1、AFP99061.1、AFM95400.1、AFV46401.1、AFP99064.1、AFM95376.1、AFX60138.1、AFP99060.1、AFM95365.1、AFM55563.1、AFM55530.1、AFM55442.1、AFM55420.1、AFM55552.1、AFM55365.1、AFP99059.1、AFM95385.1、AFM55354.1、AFM55343.1、AFM55387.1、AFM55299.1、AFM55288.1、AFM55266.1、AFM55277.1、AFM55255.1、AFM55222.1、AFM55211.1、AFI25262.1、AFD34266.1、AFM55332.1、AFD34264.1、AFD34262.1、AFD34265.1、AFD34261.1、AFD34260.1、AFD34259.1、AEQ63641.1、AEQ63487.1、AEQ63520.1、AEQ63378.1、AEQ63367.1、4CCF_A、AEQ63334.1、AEO45949.1、AEO45939.1、AEQ63312.1、AEQ63586.1、AEO45919.1、AEO45909.1、AEO45889.1、AEO45879.1、AEO45869.1、AEO45929.1、AEO45850.1、AEO45859.1、AEQ63444.1、AEO23054.1、AEO23052.1、AEO23051.1、AEC32087.1、ADZ95785.1、AEC32085.1、ADZ95784.1、ADZ95783.1、ADZ95782.1、ADZ95781.1、ADZ95779.1、ADZ95780.1、ADZ95777.1、ADZ95778.1、ADZ95776.1、ADZ95775.1、ACY68435.1、ACO83302.1、ABI35685.1、AFI25251.1、AAX23994.1、AAQ97026.1、AAR14266.1、AAQ97027.1、AAQ97030.1、AAQ97028.1、AAC57027.1、AAQ97029.1、AAQ97031.1、AAM68160.1、AAM44851.1、P11209.2、P13843.1、AAO72325.1、AAM68157.1、CAA26143.1、1512372A、AAB86664.1、AAO72324.1、AAB82446.1、AAO72323.1、AAM68154.1、AAA47410.1、P12568.1、ARB07894.1、AGG39517.1、BBC54612.1、BBC54636.1、BBC54627.1、BBC54621.1、BBC54570.1、BBC54579.1、BBC54595.1、BBC54555.1、BBC54552.1、BBC54564.1、BBC54581.1、BBC54571.1、BBC54553.1、BBC54565.1、BBC54245.1、BBC54243.1、BBC54238.1、BBC54242.1、BBC54239.1、BBC54235.1、BBC54234.1、BBC54236.1、BBC54244.1、BBC54186.1、BBC54178.1、BBC54202.1、BBC54151.1、BBC54142.1、BBC54134.1、BBC54170.1、BBC54210.1、BBC54169.1、BBC54213.1、BBC54203.1、BBC54160.1、BBC54163.1、BBC54215.1、BBC54156.1、BBC54179.1、BBC54150.1、BBC54207.1、BBC54194.1、BBC54149.1、BBC54138.1、BBC54199.1、BBC54220.1、BBC54181.1、BBC54132.1、BBC54146.1、BBC54122.1、BBC54124.1、BBB35202.1、BBB35201.1、BBB35192.1、BBB35193.1、BBB35199.1、BBB35184.1、BBB35126.1、BBB35133.1、BBB35130.1、BBB35160.1、BBB35162.1、BBB35181.1、BBB35165.1、BBB35121.1、BBB35138.1、BBB35176.1、BBB35142.1、BBB35136.1、BBB35153.1、BBB35115.1、BBB35150.1、BBB35097.1、BBB35109.1、BBB35094.1、BBB35183.1、BBB35104.1、BBB35099.1、BBB35188.1、AKA45871.1、ASV65838.1、AGG39373.1、AII22107.1、AGG39400.1、AGG39457.1、ARR29240.1、ARR29251.1、ARR29189.1、ARR29207.1、AUH15164.1、ATV81343.1、AUC68654.1、AUC68577.1、AUC68566.1、AUC68555.1、AUC68478.1、AUC68445.1、AUC68500.1、AUC68522.1、AUC68291.1、AUC68149.1、AUC68094.1、AMA67097.1、AMA66866.1、AMA66580.1、AIZ95750.1、AIZ95541.1、AIZ95519.1、AHY21419.1、AHY21331.1、AHY21165.1、AHY21143.1、AHY21132.1、AGG39478.1、ATV93506.1、ATV93509.1、AIZ95717.1、ATV81354.1、ART28317.1、BBA57890.1、BBA57901.1、ASZ70099.1、ART28361.1、AQX36844.1、ASK05520.1、ART28427.1、ART28339.1、ART28297.1、ART28328.1、ARQ15966.1、ARN61507.1、ARA15413.1、AGG39394.1、APW78845.1、APW78867.1、APW78900.1、APW78878.1、APW78779.1、APW78702.1、APW78713.1、APW78680.1、APW78658.1、APW78647.1、APW78636.1、AOS48870.1、APW78614.1、AMT78905.1、AMT77402.1、AOZ15479.1、AGN28484.1、AHX57240.1、AHX57031.1、AOS48980.1、AOS48848.1、AOS48815.1、AOS48738.1、AOS49068.1、AOS48727.1、AOS48716.1、AOS48683.1、AOS48551.1、AOS48485.1、AOS48518.1、AOS48441.1、AOS48397.1、AOS48375.1、AOS48353.1、AOS48287.1、AOS48320.1、AOS48265.1、AOS48254.1、AOS48221.1、ANZ79638.1、ALC74025.1、AHV81286.1、AOD40888.1、AOD40516.1、AOD40214.1、AOD40125.1、AOD40104.1、AOD40082.1、AOD39908.1、AJF44826.1、AJF44506.1、AJF44535.1、ANZ80463.1、ANZ80408.1、ANZ80397.1、ANZ80386.1、ANZ80331.1、ANZ80320.1、ANZ80364.1、ANZ80276.1、ANZ80221.1、ANZ80188.1、ANZ80144.1、ANZ80133.1、ANZ80111.1、ANZ80122.1、ANZ80056.1、ANZ80012.1、ANZ80067.1、ANZ79979.1、ANZ79935.1、ANZ79990.1、ANZ79902.1、ANZ79759.1、ANZ79715.1、ANZ79671.1、AMT79718.1、AMT79586.1、AMT79553.1、AMT79542.1、AMT79476.1、AMT79388.1、AMT79201.1、AMT79190.1、AMT79157.1、AMT79124.1、AMT79091.1、AMT79047.1、AMT79014.1、AMT79003.1、AMT78872.1、AMT78832.1、AMT78689.1、AMT78645.1、AMT78513.1、AMT78480.1、AMT78447.1、AMT78392.1、AMT78194.1、AMT78084.1、AMT78051.1、AMT77963.1、AMT77908.1、AMT77776.1、AMT77710.1、AMT77424.1、AMN91385.1、AMN91264.1、AMN91242.1、AHX57504.1、CUS01881.1、CUS01880.1、CUS01877.1、CUS01874.1、CUS01870.1、CUS01875.1、AMA67350.1、AMA67251.1、AMA67262.1、AMA67229.1、AMA67196.1、AMA67130.1、AMA67185.1、AMA67163.1、AMA67086.1、AMA67075.1、AMA66998.1、AMA66987.1、AMA66976.1、AMA66965.1、AMA66921.1、AMA66844.1、AMA66833.1、AMA66624.1、AMA66613.1、AMA66591.1、AMA66569.1、AMA66547.1、AMA66503.1、AMA66492.1、AMA66481.1、AMA66448.1、AMA66415.1、AMA66393.1、AMA66360.1、AGG39553.1、AGG39469.1、AJZ70144.1、AJZ70166.1、AJZ70155.1、AJZ70133.1、AJZ70067.1、AJZ70001.1、AJZ69990.1、AJZ69968.1、AJZ69946.1、AJZ69913.1、AJZ69880.1、AJZ69847.1、AJZ69869.1、AJZ69770.1、AJZ69748.1、AJZ69726.1、AJZ69682.1、AJZ69671.1、AJZ69704.1、AJZ69660.1、AJZ69715.1、AJZ69627.1、AJZ69616.1、AJZ69638.1、AJO16077.1、AJO16055.1、AKE31881.1、AKE31882.1、AKE31878.1、AJF44835.1、AJF44790.1、AJF44737.1、AJF44716.1、AJF44725.1、AJF44643.1、AJF44628.1、AJF44624.1、AJF44613.1、AJF44566.1、AJF44555.1、AJF44526.1、AJF44517.1、AKA45882.1、AKA45849.1、AHA83913.1、AGN28715.1、AHA83902.1、AHA83837.1、AHA83826.1、AHA83705.1、AHA83630.1、AGG39505.1、AIY70242.1、AIY70198.1、AII30203.1、AHY21463.1、AHY21397.1、AHY21320.1、AHY21298.1、AHY21287.1、AHY21276.1、AHY21254.1、AHY21199.1、AHY21176.1、AHX57537.1、AHX57471.1、AHX57427.1、AHX57042.1、AIZ95981.1、AIZ95893.1、AIZ95871.1、AIZ95816.1、AIZ95772.1、AIZ95629.1、AIZ95673.1、AIZ95596.1、AIZ95585.1、AIZ95552.1、AEQ63553.2、AEQ63542.2、AEQ63575.1、AEQ63531.1、AEQ63498.1、AEQ63422.1、AEQ63411.1、AHX57570.1、AHX57152.1、AHX57064.1、AHX57009.1、AHX56987.1、AHV82100.1、AHV82001.1、AHV81891.1、AHV81880.1、AHV81836.1、AHV81682.1、AHV81649.1、AHV81484.1、AHV81462.1、AHV81385.1、AHV81363.1、AHV81330.1、AHV81253.1、AHV81154.1、AHV81122.1、AHV81089.1、AHV81012.1、AHV80957.1、AHV80880.1、AHV80869.1、AHV80836.1、AHV80803.1、AGG39559.1、AGG39562.1、AGG39556.1、AGG39550.1、AGG39547.1、AGG39544.1、AGG39541.1、AGG39529.1、AGG39526.1、AGG39523.1、AGG39514.1、AGG39502.1、AGG39499.1、AGG39496.1、AGG39493.1、AGG39484.1、AGG39490.1、AGG39487.1、AGG39475.1、AGG39472.1、AGG39466.1、AGG39463.1、AGG39454.1、AGG39442.1、AGG39439.1、AGG39436.1、AGG39415.1、AGG39403.1、AGG39397.1、AGG39391.1、AGG39379.1、AHL84194.1、AHA84012.1、AHJ60043.1、BAO49770.1、BAO49766.1、BAO49767.1、AHA84034.1、AHA84023.1、AHA83990.1、AHA83957.1、AHA83924.1、AHA83891.1、AHA83880.1、AHA83782.1、AHA83760.1、AHA83694.1、AGT75357.1、AGN92848.1、AGN28792.1、AGN28781.1、AGN28759.1、AGN28748.1、AGN28693.1、AGN28638.1、AGN28627.1、AGN28539.1、AGN28528.1、AGN28462.1、AGN28440.1、AGL96787.1、AGL96786.1、AGL96784.1、AAS93662.1、AAS93657.1、AAS93656.1、AAS93659.1、AAS93660.1、AAS93663.1、AAS93664.1、AAS93655.1、CUS01869.1、AHG54517.1、ASF87348.1、ASF87341.1、ASF87344.1、ASF87351.1、ASF87338.1、ASF87342.1、ASF87352.1、ASF87337.1、ASF87336.1、AEQ98756.1、AEQ98757.1、AEQ98755.1、AEQ98752.1、AEQ98753.1、AEQ98747.1、ASF87325.1、ASF87326.1、5W23_A、5EA3_F、5UDD_A、5EA8_F、AHG54458.1、AEN74947.1、AHG54485.1、AHG54477.1、AHG54451.1、AHG54463.1、AHG54445.1、AEO12131.1、AEN74945.1、AEN74944.1、ASF87335.1、AHG54515.1、AHA61605.1、AHV81660.1、AHG54441.1或AIY60640.1。
在本发明的上下文中，“RSV F蛋白”、“RSV融合蛋白(F)”、“RSV F”或“F”可以最广义地理解，并指F0(F多肽前体)、F1、F2和Pep27多肽、F2-F1异二聚体、或成熟的F蛋白(包含三个F2-F1异二聚体)、或其中任何一个的片段和变体。因此，术语“衍生自RSV融合(F)蛋白的肽或蛋白”是指衍生自例如F0(F蛋白多肽前体)、F1、F2和Pep27多肽、F2-F1异二聚体或成熟F蛋白的肽的蛋白、片段或变体。另外，术语“衍生自RSV融合(F)蛋白的肽或蛋白”指如上定义的衍生自“RSV F蛋白”或“RSV融合蛋白(F)”的肽、蛋白、片段或变体，其可以被基因工程改造为例如缺乏某些蛋白元件(例如胞质尾区、弗林蛋白酶切割位点、Pep27)或例如包含其他元件(例如接头元件、异源性信号肽等)。例如，术语“衍生自RSV融合(F)蛋白的肽或蛋白”是指衍生自F0、F-del、F0_DSCav1、F_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F_DSCav1_mut3、F_DSCav1_mut4、F_DSCav1_mut5、F_DSCav1_mut6、F_DSCav1_mut7、F_DSCav1_mut8、F_DSCav1_mut0、F-del_DSCav1、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut4、F-del_DSCav1_mut5、F-del_DSCav1_mut6、F-del_DSCav1_mut7、F-del_DSCav1_mut8、F-del_DSCav1_mut0的肽、蛋白、片段或变体(有关结构的说明，参见表1)。可以由第一方面的RNA编码的特别合适的F蛋白变体在下文中指定，并在表1中提供。
需要注意的是，在提及氨基酸(aa)残基及其在RSV F蛋白中的位置时，除非另有说明，否则本文所用的任何编号均涉及相应aa残基在HRSV(A2)的相应F0前体蛋白(SEQ IDNO：68)或HRSV(Memphis-37)的相应F0前体蛋白(SEQ ID NO：8937或11726)中的位置，其中位置“1”对应于第一个aa残基，即HRSV(A2)F0前体蛋白或HRSV(Memphis-37)F0前体蛋白N末端的aa残基。
在优选的实施方案中，第一方面的RNA的至少一个编码序列编码至少一种来自RSVF蛋白的抗原肽或蛋白，其中RSV F蛋白是全长F蛋白(F0)或缺失了C末端的F蛋白(F-del)或其片段或变体。
在这种情况下，任何RSV F全长蛋白(前体蛋白，称为“F0”)都可用作合适的抗原，并且优选地可以衍生自列表2中提供的任何NCBI蛋白登录号，或者可以选自SEQ ID NO：68、8279至8967或11726中的任何一个。在本发明的优选实施方案中，适当地使用HRSV(A2)的全长F蛋白(F0)(SEQ ID NO：68)，参见总览表1。在本发明的其他优选实施方案中，适当地使用HRSV(Memphis-37)的全长F蛋白(F0)(SEQ ID NO：8937或11726)，参见总览表1。
在这种情况下，任何缺失了C末端的RSV F(F-del)都可用作合适的抗原，并且优选地可以衍生自列表2中提供的任何NCBI蛋白登录号，或者可以选自SEQ ID NO：483、8968至9683或12095中的任何一个。这种缺失突变体的一个实例是根据(Oomens等人，2006.J.Virol.80(21)：10465-77)的RSV-Fdel554-574蛋白，其中除去了全长F0蛋白的氨基酸残基554至574。F0的胞质尾区的主要部分(aa 554至574)的缺失使体外细胞内运输/细胞表面运输改善，并显著增加RSV F的细胞表面表达。增加的细胞表面呈递B细胞识别改善(与公开的数据一致；参见WO2015024668)。在本发明的优选实施方案中，适当地使用缺失了C末端的F蛋白，在本文中称为“F-del”(SEQ ID NO：483、9653或12095)，参见总览表1。鉴于不同RSV病毒株之间RSV F蛋白的结构保守性较高(参见例如Hause等人，2017，PLOS ONE 12(6)：e0180623)，氨基酸554至574的缺失适用于不同RSV分离株的不同RSV F蛋白序列。
在特别优选的实施方案中，第一方面的人工RNA编码至少一种衍生自RSV F蛋白的抗原肽或蛋白，其中所述RSV F蛋白被设计成使融合前构象中的抗原稳定。在有效的RSV疫苗的情况下，融合前构象特别有利，因为用于中和抗体的几种潜在表位仅在所述蛋白构象中是可及的。
在某些实施方案中，RSV F蛋白包含一个或多于一个在融合前构象中稳定F蛋白的氨基酸置换，例如，在融合前构象中稳定F蛋白膜远端部分(包括F1多肽的N末端区域)的置换。例如，氨基酸置换可以引入非天然的二硫键或可以是填充空腔的氨基酸置换。
因此，在某些实施方案中，优选的RSV F蛋白包括形成非天然二硫键的S155C和S290C置换，所述非天然二硫键使融合前构象的蛋白稳定；即，以与一种或多于一种融合前特异性抗体特异性结合的构象，和/或呈现出在融合前构象上存在但在RSV F蛋白的融合后构象中不存在的合适的抗原性位点。在其他实施方案中，重组RSV F蛋白可以在位置190、位置207或位置190和207处另外包含F、L、W、Y、H或M置换。
被设计为使融合前构象的抗原稳定的RSV F蛋白的实例是包含DSCav1突变(S155C、S290C、S190F和V207L)或其片段或变体的RSV F蛋白。此类RSV F DSCav1蛋白已在本领域(WO2014160463)中描述。
因此，在特别优选的实施方案中，第一方面的人工RNA编码至少一种衍生自RSV F蛋白的抗原肽或蛋白，其中所述RSV F蛋白包含DSCav1突变(S155C、S290C、S190F和V207L)或其片段或变体。
应当理解，在本发明的上下文中，任何RSV F可以在位置S155C、S290C、S190F和V207L处突变，以使蛋白稳定在融合前构象中，并且可以适当地用于本发明的上下文中。因此，以上提供的任何NCBI蛋白登录号、或选自SEQ ID NO：68、8279至8967、483、8968至9683、12095或11726的任何蛋白或其片段或变体可以被本领域技术人员选择以引入根据S155C、S290C、S190F和V207L的此类氨基酸变化，以生成各种RSV F DSCav1蛋白。
在优选的实施方案中，HRSV(A2)的RSV F全长蛋白(前体蛋白，“F0”)(SEQ ID NO：68)用于引入S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸变化，从而产生根据SEQ ID NO：898的氨基酸序列。贯穿本发明，这种RSV F蛋白在本文中被称为“FO_DSCav1”(参见总览表1(优选的RSV F蛋白抗原设计))。
在其他优选的实施方案中，HRSV(A2)(SEQ ID NO：483)的RSV F_del蛋白(缺失的胞质尾区(aa 554-574))被用于引入S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸变化，从而产生根据SEQ ID NO：1267的氨基酸序列。贯穿本发明，这种RSV F蛋白在本文中被称为“F-del_DSCav1”(参见总览表1(优选的RSV F蛋白抗原设计))。
在优选的实施方案中，HRSV(Memphis-37)的RSV F全长蛋白(前体蛋白，“F0”)(SEQID NO：8937或11726)用于引入S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸变化，从而产生根据SEQID NO：12464的氨基酸序列。贯穿本发明，这种RSV F蛋白在本文中被称为“FO_DSCav1”(参见总览表1(优选的RSV F蛋白抗原设计))。
在其他优选的实施方案中，HRSV(Memphis-37)的RSV F_del蛋白(缺失的胞质尾区(aa 554-574))(SEQ ID NO：9653或12095)被用于引入S155C、S290C、S190F和V207L氨基酸变化，从而产生根据SEQ ID NO：12833的氨基酸序列。贯穿本发明，这种RSV F蛋白在本文中被称为“F-del_DSCav1”(参见总览表1(优选的RSV F蛋白抗原设计))。
在优选的实施方案中，至少一种抗原肽或蛋白可以是工程改造的蛋白，其包含成熟F的两个亚基F1和F2作为单一多肽链，其中F2和F1优选通过接头(GS)连接。所述工程改造的F2-接头-F1融合蛋白(例如，F(1-103)-GS-F(145-574)或F(1-103)-GS-F(145-553))的实例已在本领域中描述(Joyce，M.Gordon等人″Iterative structure-based improvementof a fusion-glycoprotein vaccine against RSV.″Nature structural&molecularbiology23.9(2016)：811；WO2017172890)。所述F2-接头-F1 RSV F蛋白缺乏aa104至144(包含弗林蛋白酶切割位点和Pep27)，并且在F2多肽和F1多肽之间包含接头元件(例如GS接头)。所述F2-接头-F1蛋白在稳定性和/或抗原性方面可以显示出优异的特性。
因此，在优选的实施方案中，RSV F蛋白包含两个亚基F2和F1，它们融合为单一多肽链，其中F2和F1通过接头元件，优选如本文所述的GS接头连接，优选产生稳定的F2-接头-F1蛋白。
优选地，所述F2-接头-F1融合蛋白，例如F(1-103)-GS-F(145-574)或F(1-103)-GS-F(145-553)另外包含如上所述的DScav1突变(在本文中称为“mut0”；例如，SEQ ID NO：3850、4219或13940、14309)。
在特别优选的实施方案中，RSV F蛋白可另外包含至少一种选自(S46G、A149C、S215P、Y458C、K465Q)、(S46G、E92D、A149C、S215P、Y458C、K465Q)、(S46G、N67I、E92D、A149C、S215P、Y458C、K465Q)、(A149C、Y458C)、(N183GC、N428C)、(Q98C、Q361C、S46G、E92D、L95M、S215P、I217P、I221M、R429K、K465Q)、(Q98C、Q361C、L95M、I221M、R429K)或(N183GC、N428C、S46G、N67I、E92D、S215P、K465Q)或其片段或变体的其他突变。
在特别优选的实施方案中，所述F2-接头-F1蛋白(F(1-103)-GS-F(145-574)或F(1-103)-GS-F(145-553))除DSCav1突变外，可以优选包含选自S46G、A149C、S215P、Y458C、K465Q，在本文中称为“mut1”，例如，SEQ ID NO：1636、2005或14678、15047；或S46G、E92D、A149C、S215P、Y458C、K465Q，在本文中称为“mut2”，例如SEQ ID NO：2374、2743或15416、15785；或S46G、N67I、E92D、A149C、S215P、Y458C、K465Q，本文称为“mut3”，例如SEQ ID NO：3112、3481或13202、13571或其中任何一个的片段或变体的至少一种突变(参见总览表1(优选的RSV F蛋白抗原设计))。
在其他实施方案中，所述F2-接头-F1蛋白(F(1-103)-GS-F(145-574)或F(1-103)-GS-F(145-553))除DSCav1突变外，可以优选包含选自A149C、Y458C，在本文中称为“mut4”，例如，SEQ ID NO：4588、4957或16154、16523；或N183GC、N428C，在本文中称为“mut5”，例如SEQ ID NO：5326、5695或16892、17261；或Q98C、Q361C、S46G、E92D、L95M、S215P、I217P、I221M、R429K、K465Q，在本文中称为“mut6”，例如SEQ ID NO：6064、6433或17630、17999；或Q98C、Q361C、L95M、I221M、R429K，在本文中称为“mut7”，例如SEQ ID NO：6802、7171或18368、18737；或N183GC、N428C、S46G、N67I、E92D、S215P、K465Q，在本文中称为“mut8”，例如SEQ ID NO：7540、7909或19106、19475，或其片段或变体的至少一种突变。
应当理解，在本发明的上下文中，任何RSV F都可以通过以下方式进行修饰：两个亚基F1和F2包含在单独的多肽链中，其中F2和F1可以通过接头例如(GS)接头连接，以增强蛋白的稳定性，如突变“mut1”、“mut2”和“mut3”所述，例如通过(如上文所解释的)使F0多肽链的aa104-144缺失、通过如上文所解释的在F2和F1之间引入接头元件和通过如上文所解释的引入适当的氨基酸置换来增强蛋白的稳定性。因此，本领域技术人员可以调整以上提供的任何NCBI蛋白登录号(参见列表2)或选自SEQ ID NO：68、8279至8967、483、8968至9683、11726、12095的任何蛋白或其片段或变体，以产生本文所述的F2-接头-F1融合蛋白，还可通过引入(S46G、A149C、S215P、Y458C、K465Q)、(S46G、E92D、A149C、S215P、Y458C、K465Q)、(S46G、N67I、E92D、A149C、S215P、Y458C、K465Q)、(A149C、Y458C)、(N183GC、N428C)、(Q98C、Q361C、S46G、E92D、L95M、S215P、I217P、I221M、R429K、K465Q)、(Q98C、Q361C、L95M、I221M、R429K)或(N183GC、N428C、S46G、N67I、E92D、S215P、K465Q)氨基酸置换和/或DSCav1突变来调整。此外，除了使用如上所述的GS接头之外，本领域技术人员当然可以在各种已知的接头元件之间进行选择，以得到类似的同样合适的RSV F蛋白变体(例如选自专利申请WO2017/172890的SEQ ID NO：117至162或这些序列的片段或变体，或选自专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1509至1565或这些序列的片段或变体)。
在优选的实施方案中，F2-接头-F1蛋白(F(1-103)-GS-F(145-574)或F(1-103)-GS-F(145-553))包含如上所述的DSCav-1突变，在本文中称为F_DSCav1_mut0或F-del_DSCav1_mut0。在优选的实施方案中，F2-接头-F1蛋白(F(1-103)-GS-F(145-574)或F(1-103)-GS-F(145-553))包含如上所述的DSCav-1突变，以及另外的上文定义的氨基酸置换mut1，在本文中称为F_DSCav1_mut1或F-del_DSCav1_mut1。在优选的实施方案中，F2-接头-F1蛋白(F(1-103)-GS-F(145-574)或F(1-103)-GS-F(145-553))包含如上所述的DSCav-1突变，以及另外的上文定义的氨基酸置换mut2，在本文中称为F_DSCav1_mut2或F-del_DSCav1_mut2。在优选的实施方案中，F2-接头-F1蛋白(F(1-103)-GS-F(145-574)或F(1-103)-GS-F(145-553))包含如上所述的DSCav-1突变，以及另外的上文定义的氨基酸置换mut3，在本文中称为F_DSCav1_mut3或F-del_DSCav1_mut3。在优选的实施方案中，F2-接头-F1蛋白(F(1-103)-GS-F(145-574)或F(1-103)-GS-F(145-553))包含如上所述的DSCav-1突变，以及另外的上文定义的氨基酸置换mut4，在本文中称为F_DSCav1_mut4或F-del_DSCav1_mut4。在优选的实施方案中，F2-接头-F1蛋白(F(1-103)-GS-F(145-574)或F(1-103)-GS-F(145-553))包含如上所述的DSCav-1突变，以及另外的上文定义的氨基酸置换mut5，在本文中称为F_DSCav1_mut5或F-del_DSCav1_mut5。在优选的实施方案中，F2-接头-F1蛋白(F(1-103)-GS-F(145-574)或F(1-103)-GS-F(145-553))包含如上所述的DSCav-1突变，以及另外的上文定义的氨基酸置换mut6，在本文中称为F_DSCav1_mut6或F-del_DSCav1_mut6。在优选的实施方案中，F2-接头-F1蛋白(F(1-103)-GS-F(145-574)或F(1-103)-GS-F(145-553))包含如上所述的DSCav-1突变，以及另外的上文定义的氨基酸置换mut7，在本文中称为F_DSCav1_mut7或F-del_DSCav1_mut7。在优选的实施方案中，F2-接头-F1蛋白(F(1-103)-GS-F(145-574)或F(1-103)-GS-F(145-553))包含如上所述的DSCav-1突变，以及另外的上文定义的氨基酸置换mut8，在本文中称为F_DSCav1_mut8或F-del_DSCav1_mut8。
表1提供了特别优选的RSV F蛋白的详细说明。
在表1中，关于氨基酸(aa)残基及其在RSV F蛋白中的位置的所有参考均涉及相应的aa残基在HRSV(A2)(SEQ ID NO：68)或HRSV(Memphis-37)(SEQ ID NO：8937或11726)的相应F0前体蛋白中的位置。此外，在本发明的整个说明书中，使用表1中合适的RSV F蛋白抗原设计的缩写(例如“F0”、“F-del”、“F0_DSCav1”、“F-del_DSCav1”、“F_DSCav1_mut1”、“F-del_DSCav1_mut1”、“F_DSCav1_mut2”、“F-del_DSCav1_mut2”、“F_DSCav1_mut3”、“F-del_DSCav1_mut3”、“F_DSCav1_mut4”、“F-del_DSCav1_mut4”、“F_DSCav1_mut5”、“F-del_DSCav1_mut5”、“F_DSCav1_mut6”、“F-del_DSCav1_mut6”、“F_DSCav1_mut7”、“F-del_DSCav1_mut7”、“F_DSCav1_mut8”、“F-del_DSCav1_mut8”、“F_DSCav1_mut0”、“F-del_DSCav1_mut0”)。表1的A列提供了衍生自HRSV(A2)的各个RSV F蛋白抗原设计的蛋白SEQ IDNO；表1的B列提供了衍生自HRSV(Memphis-37)的各个RSV F蛋白抗原设计的蛋白SEQ IDNO。特别地，本发明的描述明确地包括在本申请的ST25序列表的<223>标识符下提供的信息。
表1优选的RSV F蛋白抗原设计
Figure BPA0000294887150000511
Figure BPA0000294887150000521
Figure BPA0000294887150000531
Figure BPA0000294887150000541
在特别优选的实施方案中，根据第一方面的人工RNA编码至少一种衍生自RSV融合(F)蛋白的抗原肽或蛋白，其中RSV F蛋白选自F0、F-del、F0_DSCav1、F_DSCav1_mut0、F_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F_DSCav1_mut3、F_DSCav1_mut4、F_DSCav1_mut5、F_DSCav1_mut6、F_DSCav1_mut7、F_DSCav1_mut8、F-del_DSCav1、F-del_DSCav1_mut0、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut4、F-del_DSCav1_mut5、F-del_DSCav1_mut6、F-del_DSCav1_mut7、F-del_DSCav1_mut8或其片段或变体(参见例如表1)。
在本发明的上下文中，特别优选和有利的是选自F-del_DSCav1、F-del_DSCav1_mut0、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut4、F-del_DSCav1_mut5、F-del_DSCav1_mut6、F-del_DSCav1_mut7、F-del_DSCav1_mut8或其片段或变体的RSV F蛋白(参见例如表1)。
在优选的实施方案中，第一方面的人工RNA包含至少一个编码序列，其编码至少一个抗原肽或蛋白，该抗原肽或蛋白包含或组成为与SEQ ID NO：68、483、898、1267、1636、2005、2374、2743、3112、3481、3850、4219、4588、4957、5326、5695、6064、6433、6802、7171、7540、7909、11726、12095、12464、12833、13940、14309、14678、15047、15416、15785、13202、13571、16154、16523、16892、17261、17630、17999、18368、18737、19106、19475(参见例如表1)、或8279至9683中的任一个或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列中的至少一个。关于这些编码RSV蛋白的合适氨基酸序列中的每一个的附加信息也可以从序列表中获得，特别是从其中以标识符<223>提供的细节中获得，如下文所述。
在优选的实施方案中，第一方面的人工RNA包含至少一个编码序列，其编码至少一个抗原肽或蛋白，该抗原肽或蛋白包含或组成为与SEQ ID NO：68、483、898、1267、1636、2005、2374、2743、3112、3481、3850、4219、4588、4957、5326、5695、6064、6433、6802、7171、7540、7909、11726、12095、12464、12833、13940、14309、14678、15047、15416、15785、13202、13571、16154、16523、16892、17261、17630、17999、18368、18737、19106、19475(参见例如表1)中的任一个或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列中的至少一个。关于这些编码RSV蛋白的合适氨基酸序列中的每一个的附加信息也可以从序列表中获得，特别是从其中以标识符<223>提供的详细内容中获得，如下文所述。
在特别优选的实施方案中，第一方面的人工RNA包含至少一个编码序列，其编码至少一个抗原肽或蛋白，该抗原肽或蛋白包含或组成为与SEQ ID NO：1267、2005、2743、3481、4219、4957、5695、6433、7171、7909、12833、14309、15047、15785、13571、16523、17261、17999、18737、19475(参见例如表1)中的任一个或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列中的至少一个。关于这些编码RSV蛋白的合适氨基酸序列中的每一个的附加信息也可以从序列表中获得，特别是从其中以标识符<223>提供的详细内容中获得，如下文所述。
在其他实施方案中，根据第一方面的人工RNA包含至少一个编码序列，其编码至少一个与SEQ ID NO：8279至9683中的任一个或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列中的至少一个。关于这些编码RSV蛋白的合适氨基酸序列中的每一个的附加信息也可以从序列表中获得，特别是从其中以标识符<223>提供的详细内容中获得，如下文所述。
在其他实施方案中，本文所定义的人工RNA包含至少一个编码序列，其编码至少一个衍生自RSV的抗原肽或蛋白，该衍生自RSV的抗原肽或蛋白包含或组成为与专利申请WO2014/160463的SEQ ID NO：1至1428中的任一个或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列中的至少一个。在这种情况下，专利申请WO2014/160463的SEQ ID NO：1至1428及其相关公开内容通过引用并入本文。
在其他实施方案中，本文所定义的人工RNA包含至少一个编码序列，其编码至少一个衍生自RSV的抗原肽或蛋白，该衍生自RSV的抗原肽或蛋白包含或组成为与专利申请WO2015/024668的SEQ ID NO：1至11中的任一个或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列中的至少一个。在这种情况下，专利申请WO2015/024668的SEQ ID NO：1至11及其相关公开内容通过引用并入本文。
在其他实施方案中，本文所定义的人工RNA包含至少一个编码序列，其编码至少一个衍生自RSV的抗原肽或蛋白，该衍生自RSV的抗原肽或蛋白包含或组成为与专利申请WO2017/070622的SEQ ID NO：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243或245中的任一个或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列中的至少一个。在这种情况下，专利申请WO2017/070622的SEQ ID NO：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243或245及其相关公开内容通过引用并入本文。
在其他实施方案中，本文所定义的人工RNA包含至少一个编码序列，其编码至少一个衍生自RSV的抗原肽或蛋白，该衍生自RSV的抗原肽或蛋白包含或组成为与专利申请WO2017/172890的SEQ ID NO：1至65、81至95、110至116中的任一个或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列中的至少一个。在这种情况下，专利申请WO2017/172890的SEQ ID NO：1至65、81至95、110至116及其相关公开内容通过引用并入本文。
根据另一个优选的实施方案，本发明的人工RNA编码至少一种如上定义的抗原肽或蛋白，并且可以另外编码至少一种其他的异源性肽或蛋白元件。
适当地，至少一种其他肽或蛋白元件可以促进本发明的编码的抗原肽或蛋白的分泌(例如，通过分泌信号序列)，促进本发明的编码的抗原肽或蛋白在质膜中的锚定(例如通过跨膜元件)，促进抗原复合物的形成(例如通过多聚化结构域)，促进病毒样颗粒形成(VLP形成序列)。另外，根据本发明的人工核酸序列可以另外编码肽接头元件、自切割肽、免疫佐剂序列或树突细胞靶向序列。合适的多聚化结构域可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1116至1167的氨基酸序列的列表或者这些序列的片段或变体。三聚化和四聚化元件可以选自例如工程改造的亮氨酸拉链(采用平行三聚体状态的工程化的α-螺旋卷曲螺旋肽)、来自肠细菌噬菌体T4、GCN4pII、GCN4-pLI和p53的纤维蛋白折叠结构域。在这种情况下，来自肠杆菌噬菌体T4、GCN4pII、GCN4-pLI和p53的纤维蛋白折叠结构域是优选的。合适的跨膜元件可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1228至1343的氨基酸序列的列表或者这些序列的片段或变体。合适的VLP形成序列可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1168至1227的氨基酸序列的列表、或者这些序列的片段或变体。合适的肽接头可选自专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1509至1565的氨基酸序列的列表或这些序列的片段或变体。合适的自切割肽可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ IDNO：1434至1508的氨基酸序列的列表或这些序列的片段或变体。合适的免疫佐剂序列可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1360至1421的氨基酸序列的列表或者这些序列的片段或变体。合适的树突状细胞(DC)靶向序列可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1344至1359的氨基酸序列的列表、或者这些序列的片段或变体。合适的分泌信号肽可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1至1115和SEQ ID NO：1728的氨基酸序列的列表、或者这些序列的片段或变体。在核酸水平上，可以选择编码此类氨基酸序列的任何核酸序列(例如RNA序列)。在这种情况下，WO2017/081082的公开内容通过引用并入本文。异源性分泌信号序列可以增加编码的抗原肽或蛋白的分泌。
根据实施方案，分泌信号序列包含与SEQ ID NO：21329至21362中的任一个或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列。关于这些编码分泌信号序列的合适氨基酸序列中的每一个的附加信息也可以从序列表中获得，特别是从其中以标识符<223>提供的详细内容中获得。
根据优选的实施方案，人工核酸，特别是人工RNA包含至少一个编码序列，其编码至少一种衍生自本文定义的RSV，优选衍生自RSV F蛋白或其片段和变体的抗原肽或蛋白。在这种情况下，编码至少一种衍生自RSV，优选衍生自RSV F蛋白或其片段和变体的抗原肽或蛋白的任何编码序列可以理解为合适的编码序列，因此可以包含在第一方面的人工RNA中。
在优选的实施方案中，第一方面的人工RNA可以包含或组成为至少一种编码序列，其编码至少一种衍生自本文定义的RSV F蛋白的抗原肽或蛋白，优选编码SEQ ID NO：68、483、898、1267、1636、2005、2374、2743、3112、3481、3850、4219、4588、4957、5326、5695、6064、6433、6802、7171、7540、7909、11726、12095、12464、12833、13940、14309、14678、15047、15416、15785、13202、13571、16154、16523、16892、17261、17630、17999、18368、18737、19106、19475中的任一个或其变体的片段。必须理解的是，在核酸水平上，可以选择任何核酸序列，特别是任何编码与SEQ ID NO：68、483、898、1267、1636、2005、2374、2743、3112、3481、3850、4219、4588、4957、5326、5695、6064、6433、6802、7171、7540、7909、11726、12095、12464、12833、13940、14309、14678、15047、15416、15785、13202、13571、16154、16523、16892、17261、17630、17999、18368、18737、19106、19475或其片段或变体相同的氨基酸序列的RNA序列，或编码与SEQ ID NO：68、483、898、1267、1636、2005、2374、2743、3112、3481、3850、4219、4588、4957、5326、5695、6064、6433、6802、7171、7540、7909、11726、12095、12464、12833、13940、14309、14678、15047、15416、15785、13202、13571、16154、16523、16892、17261、17630、17999、18368、18737、19106、19475中的任一个或其片段或变体至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的任何核酸序列(例如DNA序列、RNA序列)，并且因此可以将其理解为合适的编码序列，并且因此可以包含在本发明的第一方面的人工RNA中。
在其他实施方案中，第一方面的人工RNA可以包含或组成为编码SEQ ID NO：8279至9683中的任一个或其片段或变体的至少一个编码序列。必须理解的是，在核酸水平上，可以选择任何核酸序列，特别是任何编码与SEQ ID NO：8279至9683或其片段或变体相同的氨基酸序列的RNA序列，或编码与SEQ ID NO：8279至9683中的任何一个或其片段或变体至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的任何核酸序列(例如DNA序列、RNA序列)，并且可以因此将其理解为合适的编码序列，并且因此可以包含在本发明的第一方面的人工RNA中。
在其他实施方案中，第一方面的人工RNA可以包含或组成为编码专利申请WO2014/160463的SEQ ID NO：1至1428中的任一个或其片段或变体的至少一个编码序列。必须理解的是，在核酸水平上，可以选择任何核酸序列，特别是任何编码与专利申请WO2014/160463的SEQ ID NO：1至1428或其片段或变体相同的氨基酸序列的RNA序列，或编码与专利申请WO2014/160463的SEQ ID NO：1至1428中的任一个或其片段或变体至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的任何核酸序列(例如DNA序列、RNA序列)，并且可以因此将其理解为合适的编码序列，并且因此可以包含在本发明的第一方面的人工RNA中。
在其他实施方案中，第一方面的人工RNA可以包含或组成为编码专利申请WO2015/024668的SEQ ID NO：1至11中的任一个或其片段或变体的至少一个编码序列。必须理解的是，在核酸水平上，可以选择任何核酸序列，特别是任何编码与专利申请WO2015/024668的SEQ ID NO：1至11或其片段或变体相同的氨基酸序列的RNA序列，或编码与专利申请WO2015/024668的SEQ ID NO：1至11中的任一个或其片段或变体至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的任何核酸序列(例如DNA序列、RNA序列)，并且可以因此将其理解为合适的编码序列，并且因此可以包含在本发明的第一方面的人工RNA中。
在其他实施方案中，第一方面的人工RNA可以包含或组成为至少一个编码序列，所述编码序列编码专利申请WO2017/070622的SEQ ID NO：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243或245中的任一个或其变体的片段。必须理解的是，在核酸水平上，可以选择任何核酸序列，特别是任何编码与专利申请WO2017/070622的SEQ ID NO：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243或245或其片段或变体相同的氨基酸序列的RNA序列，或编码与专利申请WO2017/070622的SEQ ID NO：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243或245中的任一个或其片段或变体至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的任何核酸序列(例如DNA序列、RNA序列)，并且可以因此将其理解为合适的编码序列，并且因此可以包含在本发明的第一方面的人工RNA中。
在其他实施方案中，第一方面的人工RNA可以包含或组成为编码专利申请WO2017/172890的SEQ ID NO：1至65、81至95、110至116中的任一个或其片段或变体的至少一个编码序列。必须理解的是，在核酸水平上，可以选择任何核酸序列，特别是任何编码与专利申请WO2017/172890的SEQ ID NO：1至65、81至95、110至116或其片段或变体相同的氨基酸序列的RNA序列，或编码与专利申请WO2017/172890的SEQ ID NO：1至65、81至95、110至116中的任一个或其片段或变体至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的任何核酸序列(例如DNA序列、RNA序列)，并且可以因此将其理解为合适的编码序列，并且因此可以包含在本发明的第一方面的人工RNA中。
适当地，在特别优选的实施方案中，第一方面的人工RNA包含位于所述5′-UTR和所述3′-UTR之间的编码序列，优选在所述5′-UTR的下游和所述3′-UTR的上游。
在优选的实施方案中，第一方面的人工RNA编码序列包含至少一个与SEQ ID NO：69至482、484至897、899至1266、1268至1635、1637至2004、2006至2373、2375至2742、2744至3111、3113至3480、3482至3849、3851至4218、4220至4587、4589至4956、4958至5325、5327至5694、5696至6063、6065至6432、6434至6801、6803至7170、7172至7539、7541至7908、7910至8277、8278、11727至12094、12096至12463、12465至12832、12834至13201、13941至14308、14310至14677、14679至15046、15048至15415、15417至15784、15786至16153、13203至13570、13572至13939、16155至16522、16524至16891、16893至17260、17262至17629、17631至17998、18000至17998、18369至18736、18738至19105、19107至19474、19476至19843、21363至21706或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列(另参见表3至表6)。关于这些合适的核酸序列编码中的每一个的附加信息也可以从序列表中获得，特别是从其中在标识符<223>下提供的详细内容中获得。
在特别优选的实施方案中，第一方面的人工RNA包含的编码序列包含至少一个与SEQ ID NO：69至77、484至492、899至906、1268至1275、1637至1644、2006至2013、2375至2382、2744至2751、3113至3120、3482至3489、3851至3858、4220至4227、4589至4596、4958至4965、5327至5334、5696至5703、6065至6072、6434至6441、6803至6810、7172至7179、7541至7548、7910至7917、21363至21384、11727至11734、12096至12103、12465至12472、12834至12841、13941至13948、14310至14317、14679至14686、15048至15055、15417至15424、15786至15793、13203至13210、13572至13579、16155至16162、16524至16531、16893至16900、17262至17269、17631至17638、18000至18007、18369至18376、18738至18745、19107至19114、19476至19483、21389至21410或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列(另参见表3至表6)。关于这些合适的核酸序列编码中的每一个的附加信息也可以从序列表中获得，特别是从其中在标识符<223>下提供的详细内容中获得。
在其他实施方案中，根据第一方面的人工RNA包含的编码序列包含与专利申请WO2014/160463的SEQ ID NO：383至388或这些序列中任一个的片段或片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的至少一个核酸序列。
在其他实施方案中，根据第一方面的人工RNA包含的编码序列包含与专利申请WO2015/024668的SEQ ID NO：12至22或这些序列中任一个的片段或片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的至少一个核酸序列。
在其他实施方案中，根据第一方面的人工RNA包含的编码序列包含与专利申请WO2017/070622的SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、244、246、257、258至280或这些序列中任一个的片段或片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的至少一个核酸序列。
在其他实施方案中，根据第一方面的人工RNA包含的编码序列包含与专利申请WO2017/172890的SEQ ID NO：96至99或这些序列中任一个的片段或片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的至少一个核酸序列。
根据优选的实施方案，人工RNA是经修饰的和/或稳定化的人工RNA。
根据优选的实施方案，本发明的人工RNA因此可以作为“稳定化的人工RNA”提供，也就是说，显示出对体内降解的抗性提高的RNA和/或表现出体内稳定性提高的人工RNA，和/或在体内显示改善的可翻译性的人工RNA。在下文中，描述了在上下文中的特定的合适的修饰，其适合于“稳定化”人工RNA。
这样的稳定化可以通过提供本文指定的“干燥的RNA”和/或“纯化的RNA”来实现。可替代地或除此之外，这种稳定化可以例如通过本发明的人工RNA的修饰的磷酸骨架来实现。与本发明有关的骨架修饰是其中包含在RNA中的核苷酸的骨架的磷酸盐被化学修饰的修饰。在这方面可以优选使用的核苷酸包含例如硫代磷酸酯修饰的磷酸酯骨架，优选包含在磷酸酯骨架中的至少一个磷酸氧被硫原子取代。稳定的RNA还可以包括，例如：非离子磷酸酯类似物，例如，其中带电的膦酸酯氧被烷基或芳基取代的烷基和芳基膦酸酯，或其中带电的氧残基以烷基化形式存在的磷酸二酯和烷基磷酸三酯。这样的骨架修饰通常包括但不限于甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(例如胞苷-5′-O-(1-硫代磷酸酯))的修饰。
在下文中，描述了能够“稳定化”本发明的人工RNA的合适的修饰。
根据实施方案，根据本发明的人工RNA是经修饰的人工RNA，其中所述修饰是指包括骨架修饰以及糖修饰或碱基修饰的化学修饰。
在这种情况下，本文定义的经修饰的人工RNA可以包含核苷酸类似物/修饰，例如骨架修饰、糖修饰或碱基修饰。与本发明有关的骨架修饰是其中例如人工RNA的核酸中所含核苷酸的骨架的磷酸酯被化学修饰的修饰。与本发明有关的糖修饰是本文所定义的RNA的核苷酸的糖的化学修饰。此外，与本发明有关的碱基修饰是RNA核苷酸的碱基部分的化学修饰。在这种情况下，核苷酸类似物或修饰优选地选自可用于转录和/或翻译的核苷酸类似物。
在本发明的特别优选的实施方案中，可以掺入本文所述的经修饰的核酸或特别是经修饰的RNA中的核苷酸类似物/修饰优选地选自2-氨基-6-氯嘌呤核苷-5′-三磷酸、2-氨基嘌呤核苷-5′-三磷酸、2-氨基腺苷-5′-三磷酸、2′-氨基-2′-脱氧胞苷三磷酸、2-硫胞苷-5′-三磷酸、2-硫尿苷-5′-三磷酸、2′-氟代胸苷-5′-三磷酸、2′-O-甲基-肌苷-5′-三磷酸、4-硫尿苷-5′-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷-5′-三磷酸酯、5-氨基烯丙基尿苷-5′-三磷酸、5-溴胞苷-5′-三磷酸、5-溴尿苷-5′-三磷酸、5-溴-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸、5-溴-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸、5-碘胞苷-5′-三磷酸、5-碘-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸、5-碘尿苷-5′-三磷酸、5-碘-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸、5-甲基胞苷-5′-三磷酸、5-甲基尿苷-5′-三磷酸、5-丙炔基-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸、5-丙炔基-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸、6-氮杂胞苷-5′-三磷酸、6-氮杂尿苷-5′-三磷酸、6-氯嘌呤核糖苷-5′-三磷酸、7-脱氮腺苷-5′-三磷酸、7-脱氮鸟苷-5′-三磷酸、8-氮杂腺苷-5′-三磷酸、8-叠氮腺苷-5′-三磷酸、苯并咪唑-核糖苷5′-三磷酸、N1-甲基腺苷-5′-三磷酸、N1-甲基鸟苷-5′-三磷酸、N6-甲基腺苷-5′-三磷酸、O6-甲基鸟苷-5′-三磷酸、假尿苷-5′-三磷酸或嘌呤霉素-5′-三磷酸、黄嘌呤-5′-三磷酸。特别优选用于碱基修饰的核苷酸，选自5-甲基胞苷-5′-三磷酸、7-脱氮鸟苷-5′-三磷酸、5-溴胞苷-5′-三磷酸和假尿苷-5′-三磷酸、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺基甲基尿苷、1-牛磺基甲基假尿苷、5-牛磺基甲基-2-硫代尿苷、1-牛磺基甲基-4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代二氢尿苷、2-硫代二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫代假尿苷、5-氮杂胞苷、假异胞苷、3-甲基胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假异胞苷、2-硫代胞苷、2-硫代-5-甲基胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、嘧啶酮-B-核苷(zebularine)、5-氮杂-嘧啶酮-B-核苷、5-甲基-嘧啶酮-B-核苷、5-氮杂-2-硫代-嘧啶酮-B-核苷、2-硫代-嘧啶酮-B-核苷、2-甲氧基胞苷、2-甲氧基-5-甲基胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-氮杂-2，6-二氨基嘌呤、7-氮杂-8-氮杂-2，6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰基腺苷、N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、N6，N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代腺嘌呤和2-甲氧基腺嘌呤、肌苷、1-甲基肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2，N2-二甲基鸟苷、8-氧代鸟苷、7-甲基-8-氧代鸟苷、1-甲基-6-硫代鸟苷、N2-甲基-6-硫代鸟苷和N2，N2-二甲基-6-硫代鸟苷、5′-O-(1-硫代磷酸)-腺苷、5′-O-(1-硫代磷酸)-胞苷、5′-O-(1-硫代磷酸)-鸟苷、5′-O-(1-硫代磷酸)-尿苷、5′-O-(1-硫代磷酸)-假鸟苷、6-氮杂胞苷、2-硫代胞苷、α-硫代胞苷、假异胞苷，5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘代-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5，6-二氢尿苷、α-硫代尿苷、4-硫代尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧胸苷、5-甲基尿苷、吡咯并胞苷、肌苷、α-硫代鸟苷、6-甲基鸟苷、5-甲基胞嘧啶、8-氧代鸟嘌呤、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基腺苷、2-氨基-6-氯嘌呤、N6-甲基-2-氨基嘌呤、假异胞苷、6-氯嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代腺苷、8-叠氮基腺苷、7-脱氮腺苷。在本发明的上下文中特别优选和合适的是假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶和5-甲氧基尿苷。因此，本文定义的人工RNA可包含至少一种选自假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶和5-甲氧基尿苷的修饰核苷酸。
在优选的实施方案中，本发明的人工RNA包含至少一个编码序列，其中至少一个编码序列是假尿苷(ψ)修饰的编码序列。
因此，在优选的实施方案中，本发明的人工RNA或至少一种编码序列包含其中至少一个或多于一个优选其中所有尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸取代的核酸序列。
在其他优选的实施方案中，本发明的人工RNA包含至少一个编码序列，其中至少一个编码序列是N1-甲基假尿苷(m1ψ)修饰的编码序列。
因此，在优选的实施方案中，本发明的人工RNA或至少一种编码序列包含其中至少一个或多于一个优选其中所有尿嘧啶核苷酸被N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸取代的核酸序列。
在优选的实施方案中，本发明的人工RNA包含至少一个编码序列，其中至少一个编码序列是密码子经修饰的编码序列。
在优选的实施方案中，本发明的至少一个编码序列是密码子经修饰的编码序列，其中与由相应的野生型编码序列编码的氨基酸序列相比，由至少一个密码子经修饰的编码序列编码的氨基酸序列优选未被修饰。
术语“密码子经修饰的编码序列”涉及与相应的野生型编码序列相比在至少一个密码子(编码一个氨基酸的核苷酸的三联体)上不同的编码序列。适当地，在本发明的上下文中，密码子经修饰的编码序列可以显示出对体内降解的抗性提高和/或体内的稳定性提高和/或体内的可翻译性提高。广义上的密码子修饰利用遗传密码的简并性，其中多个密码子可以编码相同的氨基酸，并且可以互换使用(参见表2)，以优化/修饰如上所述的体内应用的编码序列。
在第一方面的特别优选的实施方案中，至少一个序列是密码子经修饰的编码序列，其中密码子经修饰的编码序列选自C最大化的编码序列、CAI最大化的编码序列、人密码子使用适应的编码序列、G/C含量修饰的编码序列和G/C优化的编码序列或其任何组合。
根据优选的实施方案，本发明的人工RNA可以被修饰，其中至少一个编码序列的C含量与相应的野生型编码序列的C含量相比可以增加，优选最大化(本文称为“C最大化的编码序列”)。与由相应的野生型核酸编码序列编码的氨基酸序列相比，由RNA的C最大化编码序列编码的氨基酸序列优选未被修饰。可以使用根据WO2015/062738的修饰方法适当地进行C最大化的核酸序列的产生。在这种情况下，通过引用将WO2015/062738的公开内容包括在本文中。在本发明的整个公开中，包括序列表的标识符<223>所示内容，合适的RSV核酸序列的C最大化的编码序列由缩写“opt2”指示。
根据实施方案，本发明的人工RNA可以被修饰，其中与相应的野生型编码序列的G/C含量相比，本发明的至少一个编码序列的G/C含量可以被修饰(在本文中称为“G/C含量修饰的编码序列”)。在这种情况下，术语“G/C优化”或“G/C含量修饰”涉及与相应的野生型核酸序列相比包含经修饰的、优选增加数量的鸟苷和/或胞嘧啶核苷酸的本发明的核酸、优选本发明的人工核酸。这种增加的数量可以通过用含有鸟苷或胞嘧啶核苷酸的密码子置换含有腺苷或胸苷核苷酸的密码子来产生。如果富集的G/C含量出现在DNA或RNA的编码序列中，则它将利用遗传密码的简并性。特别地，在RNA的情况下，G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量增加的序列比A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量增加的序列更稳定。与由相应的野生型核酸编码序列编码的氨基酸序列相比，由核酸序列的G/C含量修饰的编码序列编码的氨基酸序列优选未被修饰。优选地，与相应的野生型核酸序列(例如RNA序列)的编码序列的G/C含量相比，人工核酸序列，例如本发明的RNA序列的编码序列的G/C含量增加了至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，最优选至少40％，野生型核酸序列编码如本文定义的RSV抗原或其片段或变体。
根据优化的实施方案，本发明的人工RNA可以被修饰，其中与相应的野生型编码序列的G/C含量相比，本发明的至少一个编码序列的G/C含量可以被优化(在本文中称为“G/C含量优化的编码序列”)。在上下文中，“优化”是指其中G/C含量优选增加至基本上最高的可能的G/C含量的编码序列。与由相应的野生型核酸编码序列编码的氨基酸序列相比，由核酸序列的G/C含量优化的编码序列编码的氨基酸序列优选未被修饰。可以使用根据WO2002/098443的G/C含量优化方法来适当地进行G/C含量优化的核酸RNA序列的产生。在这种情况下，WO2002/098443的公开内容完全包含在本发明中。在本发明的整个公开中，包括序列表的标识符<223>所示内容，合适的RSV核酸序列的G/C优化的编码序列由缩写“opt1、opt5、opt6、opt11”指示。
根据实施方案，可以修饰本发明的人工RNA，其中可以将本发明的至少一种编码序列中的密码子适应于人密码子使用(本文称为“适应人密码子使用的编码序列”)。编码相同氨基酸的密码子在例如人的对象中以不同的频率出现。因此，优选地修饰人工RNA的编码序列，使得编码相同氨基酸的密码子频率对应于根据人类密码子使用方式的该密码子的天然频率，例如如表2所示。例如，在氨基酸Ala的情况下，野生型编码序列优选地以如下方式适应：密码子“GCC”以0.40的频率使用，密码子“GCT”以0.28的频率使用，密码子“GCA”以0.22的频率使用，密码子“GCG”以0.10的使用频率使用等(参见表2)。因此，对由本发明的人工核酸的编码序列编码的每个氨基酸都采用这样的程序(如Ala所示)，以获得适合于人密码子使用的序列。在本发明的整个公开中，包括序列表的标识符<223>所示内容，合适的RSV核酸序列的人密码子使用适应性编码序列由缩写“opt3”指示。
表2人密码子使用表，其中对于每个氨基酸标明了频率
氨基酸 密码子 频率 氨基酸 密码子 频率
Ala GCG 0.10 Pro CCG 0.11
Ala GCA 0.22 Pro CCA 0.27
Ala GCT 0.28 Pro CCT 0.29
Ala GCC<sup>＊</sup> 0.40 Pro CCC<sup>＊</sup> 0.33
Cys TGT 0.42 Gln CAG<sup>＊</sup> 0.73
Cys TGC<sup>＊</sup> 0.58 Gln CAA 0.27
Asp GAT 0.44 Arg AGG 0.22
Asp GAC<sup>＊</sup> 0.56 Arg AGA<sup>＊</sup> 0.21
Glu GAG<sup>＊</sup> 0.59 Arg CGG 0.19
Glu GAA 0.41 Arg CGA 0.10
Phe TTT 0.43 Arg CGT 0.09
Phe TTC<sup>＊</sup> 0.57 Arg CGC 0.19
Gly GGG 0.23 Ser AGT 0.14
Gly GGA 0.26 Ser AGC<sup>＊</sup> 0.25
Gly GGT 0.18 Ser TCG 0.06
Gly GGC<sup>＊</sup> 0.33 Ser TCA 0.15
His CAT 0.41 Ser TCT 0.18
His CAC<sup>＊</sup> 0.59 Ser TCC 0.23
Ile ATA 0.14 Thr ACG 0.12
Ile ATT 0.35 Thr ACA 0.27
Ile ATC<sup>＊</sup> 0.52 Thr ACT 0.23
Lys AAG<sup>＊</sup> 0.60 Thr ACC<sup>＊</sup> 0.38
Lys AAA 0.40 Val GTG<sup>＊</sup> 0.48
Leu TTG 0.12 Val GTA 0.10
Leu TTA 0.06 Val GTT 0.17
Leu CTG<sup>＊</sup> 0.43 Val GTC 0.25
Leu CTA 0.07 Trp TGG<sup>＊</sup> 1
Leu CTT 0.12 Tyr TAT 0.42
Leu CTC 0.20 Tyr TAC<sup>＊</sup> 0.58
Met ATG<sup>＊</sup> 1 Stop TGA<sup>＊</sup> 0.61
Asn AAT 0.44 Stop TAG 0.17
Asn AAC<sup>＊</sup> 0.56 Stop TAA 0.22
＊：最常见的人类密码子
根据实施方案，本发明的人工RNA可以被修饰，其中在本发明的至少一个编码序列中密码子适应指数(CAI)可以增加或优选最大化(本文称为“CAI最大化编码序列”)。因此，优选将例如人类细胞中相对罕见的所有野生型核酸序列密码子交换为例如人类细胞中常见的相应密码子，其中常见的密码子编码与相对罕见密码子相同的氨基酸。适当地，最常用的密码子用于每个编码的氨基酸(参见表2，最常用的人密码子标有星号)。合适地，本发明的人工RNA包含至少一种编码序列，其中至少一种编码序列的密码子适应指数(CAI)为至少0.5，至少0.8，至少0.9或至少0.95。最优选地，至少一个编码序列的密码子适应指数(CAI)为1。例如，在氨基酸Ala的情况下，野生型编码序列以如下方式进行修饰：最常见的人密码子“GCC”始终用于所述氨基酸。因此，对于由本发明的人工RNA的编码序列编码的每个氨基酸都采用这种方法(如Ala所示)，以获得CAI最大化的编码序列。在本发明的整个公开中，包括序列表的标识符<223>所示内容，合适的RSV核酸序列的CAI最大化的编码序列由缩写“opt4”指示。
因此，在一个特别优选的实施方案中，第一方面的人工RNA包含至少一个编码序列，其包含密码子经修饰的核酸序列，该密码子经修饰的核酸序列与选自SEQ ID NO：70至77、485至492、899至906、1268至1275、1637至1644、2006至2013、2375至2382、2744至2751、3113至3120、3482至3489、3851至3858、4220至4227、4589至4596、4958至4965、5327至5334、5696至5703、6065至6072、6434至6441、6803至6810、7172至7179、7541至7548、7910至7917、11728至11734、12097至12103、12465至12472、12834至12841、13941至13948、14310至14317、14679至14686、15048至15055、15417至15424、15786至15793、13203至13210、13572至13579、16155至16162、16524至16531、16893至16900、17262至17269、17631至17638、18000至18007、18369至18376、18738至18745、19107至19114、19476至19483、21363至21384、21389至21410中的密码子经修饰的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同(另参见表3和表4)。关于这些合适的核酸序列编码中的每一个的附加信息也可以从序列表中获得，特别是从其中在标识符<223>下提供的详细内容中获得。
在特别优选的实施方案中，第一方面的人工RNA包含至少一个编码序列，其包含密码子经修饰的核酸序列，其与根据SEQ ID NO：70至71、75至77、485至486、490至492、899至900、904至906、1268至1269、1273至1275、1637至1638、1642至1644、2006至2007、2011至2013、2375至2376、2380至2382、2744至2745、2749至2751、3113至3114、3118至3120、3482至3483、3487至3489、3852、4221、4590、4959、5328、5697、6066、6435、6804、7173、7542、7911、3856至3858、4225至4227、4594至4596、4963至4965、5332至5334、5701至5703、6070至6072、6439至6441、6808至6810、7177至7179、7546至7548、7915至7917、11728、11732至11734、12097、12101至12103、12465、12466、12470至12472、12834、12835、12839至12841、13941、13942、13946至13948、14310、14311、14315至14317、14679、14680、14684至14686、15048、15049、15053至15055、15417、15418、15422至15424、15786、15787、15791至15793、13203、13204、13208至13210、13572、13573、13577至13579、16155、16156、16160至16162、16524、16525、16529至16531、16893、16894、16898至16900、17262、17263、17267至17269、17631、17632、17636至17638、18000、18001、18005至18007、18369、18370、18374至18376、18738、18739、18743至18745、19107、19108、19112至19114、19476、19477、19481至19483、21363至21384、21389至21410的G/C优化或G/C含量修饰的核酸序列中的任一个或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同(另参见表3和4；opt1、5、6、11)。关于这些合适的核酸序列编码中的每一个的附加信息也可以从序列表中获得，特别是从其中在标识符<223>下提供的详细内容中获得。
在优选的实施方案中，本发明的人工RNA包含至少一个编码序列，其包含密码子经修饰的核酸序列，其与根据SEQ ID NO：73、488、902、1271、1640、2009、2378、2747、3116、3485、3854、4223、4592、4961、5330、5699、6068、6437、6806、7175、7544、7913、11730、12099、12468、12837、13944、14313、14682、15051、15420、15789、13206、13575、16158、16527、16896、17265、17634、18003、18372、18741、19110、19479的任一种经人密码子使用适应的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同(另参见表3和4；opt3)。关于这些合适的核酸序列编码中的每一个的附加信息也可以从序列表中获得，特别是从其中在标识符<223>下提供的详细内容中获得。
在特别优选的实施方案中，第一方面的人工RNA包含至少一个编码序列，其包含密码子经修饰的核酸序列，其与根据SEQ ID NO：72、487、901、1270、1639、2008、2377、2746、3115、3484、3853、4222、4591、4960、5329、5698、6067、6436、6805、7174、7543、7912、11729、12098、12467、12836、13943、14312、14681、15050、15419、15788、13205、13574、16157、16526、16895、17264、17633、18002、18371、18740、19109、19478的任一种C最大化的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同(另请参见表3和4；opt2)。关于这些合适的核酸序列编码中的每一个的附加信息也可以从序列表中获得，特别是从其中在标识符<223>下提供的详细内容中获得。
在优选的实施方案中，本发明的人工RNA包含至少一个编码序列，其包含密码子经修饰的核酸序列，其与根据SEQ ID NO：74、489、903、1272、1641、2010、2379、2748、3117、3486、3855、4224、4593、4962、5331、5700、6069、6438、6807、7176、7545、7914、11731、12100、12469、12838、13945、14314、14683、15052、15421、15790、13207、13576、16159、16528、16897、17266、17635、18004、18373、18742、19111、19480的任一种CAI最大化的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同(另请参见表3和4；opt4)。关于这些合适的核酸序列编码中的每一个的附加信息也可以从序列表中获得，特别是从其中在标识符<223>下提供的详细内容中获得。
在实施方案中，与野生型核酸的核糖体结合位点环境中的A/U含量相比，可以增加相应人工核酸，特别是本发明的人工RNA的核糖体结合位点环境中的A/U含量。这种修饰(核糖体结合位点周围的A/U含量增加)提高了核糖体与核酸，优选与RNA结合的效率。核糖体与核糖体结合位点的有效结合进而具有使RNA有效翻译的作用。因此，在特别优选的实施方案中，本发明的人工核酸包含核糖体结合位点，也称为“Kozak序列”，其与SEQ ID NO：41、42的任一个或其片段或变体相同或至少80％、85％、90％、95％相同
表3A和表3B以及表4A和表4B提供了优选的RSV多肽和核酸编码序列(“cds”)。
在表3A和表3B中，A列至J列表述衍生自RSV融合(F)蛋白的本发明的特定合适的构建体，其中A列提供F0的合适序列，B列提供F-del的合适序列，C列提供F0_DSCav1的合适序列，D列提供F-del_DSCav1的合适序列，E列提供F_DSCav1_mut1的合适序列，F列提供F-del_DSCav1_mut1的合适序列，G列提供F_DSCav1_mut2的合适序列，H列提供F-del_DSCav1_mut2的合适序列，I列提供F_DSCav1_mut3的合适序列，J列提供F-del_DSCav1_mut3的合适序列。序列表中提供的特定蛋白SEQ ID NO位于第2行(“PRT”)。在第3行(“wt”)中提供了相应的野生型/未修饰的编码序列的SEQ ID NO。在第4行至第10行中提供了每个蛋白构建体的相应密码子经修饰的编码序列的SEQ ID NO(“opt1”、“opt2”、“opt3”、“opt4”、“opt5”、“opt6”、“opt11”)。在表3A中，提供了衍生自HRSV(A2)的编码序列，在表3B中，提供了衍生自HRSV(Memphis-37)的编码序列。<223>标识符中提供了序列表中的各个SEQ ID NO的更多信息。
表3A：衍生自HRSV(A2)的编码RSV F的优选编码序列(A列至J列)
Figure BPA0000294887150000721
表3B：衍生自HRSV(Memphis-37)的编码RSV F的优选编码序列(A列至J列)
Figure BPA0000294887150000731
在表4A和4B中，K列至V列表示衍生自RSV融合(F)蛋白的本发明的特定合适的构建体，其中K列提供F_DSCav1_mut0的合适序列，L列提供F-del_DSCav1_mut0的合适序列，M列提供F_DSCav1_mut4的合适序列，N列提供F-del_DSCav1_mut4的合适序列，O列提供F_DSCav1_mut5的合适序列，P列提供F-del_DSCav1_mut5的合适序列，Q列提供F_DSCav1_mut6的合适序列，R列提供F-del_DSCav1_mut6的合适序列，S列提供F_DSCav1_mut7的合适序列，T列提供F-del_DSCav1_mut7的合适序列，U列提供F_DSCav1_mut8的合适序列，V列提供F-del_DSCav1_mut8的合适序列。序列表中提供的特定蛋白SEQ ID NO位于第2行(“PRT”)。在第3行至第9行中提供了每个蛋白构建体的相应密码子经修饰编码序列的SEQ ID NO(“opt1”、“opt2”、“opt3”、“opt4”、“opt5”、“opt6”、“opt11”)。在表4A中，提供了衍生自HRSV(A2)的编码序列，在表4B中，提供了衍生自HRSV(Memphis-37)的编码序列。<223>标识符中提供了序列表中的各个SEQ ID NO的更多信息。
表4A：衍生自HRSV(A2)的编码RSV F的优选编码序列(K列至V列)
Figure BPA0000294887150000741
表4B：衍生自HRSV(Memphis-37)的编码RSV F的优选编码序列(K列至V列)|
Figure BPA0000294887150000742
在实施方案中，第一方面的人工RNA是单顺反子、双顺反子或多顺反子。
在优选的实施方案中，本发明的人工RNA是单顺反子。
术语“单顺反子核酸”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如旨在表示仅包含本文定义的一个编码序列的人工RNA。如本文所使用的术语“双顺反子核酸、多顺反子核酸”或“单顺反子RNA”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如旨在表示可具有两个(双顺反子)或甚至多于两个(多顺反子)编码序列的人工RNA。
在实施方案中，本发明的人工RNA是单顺反子的，并且所述单顺反子的人工RNA的编码序列编码至少两种不同的衍生自本文定义的RSV F的抗原肽或蛋白、或其片段或变体。因此，单顺反子人工RNA的至少一个编码序列可以编码至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个和多于八个抗原肽或蛋白，这些肽或蛋白衍生自RSV，优选本文定义的RSV F，其与或不与氨基酸接头序列相连，其中所述接头序列可包含如上文所定义的刚性接头、柔性接头、可裂解的接头(例如自裂解肽)或其组合(本文称为“多抗原构建体/核酸”)。
在实施方案中，本发明的人工RNA是双顺反子或多顺反子的，并包含至少两个编码序列，其中至少两个编码序列编码衍生自RSV，优选如本文定义的RSV F的两个或多于两个不同的抗原肽或蛋白，或这些中任一个的片段或变体。因此，双顺反子或多顺反子人工RNA中的编码序列适当地编码本文定义的不同抗原蛋白或肽或其片段或变体。优选地，双顺反子或多顺反子人工RNA中的编码序列可以被至少一个IRES(内部核糖体进入位点)序列分开。因此，术语“编码两个或多于两个抗原肽或蛋白”可以表示但不限于在本文提供的定义内编码例如至少两个、三个、四个、五个、六个或多于六个(优选不同的)不同RSV的抗原肽或蛋白或其片段或变体的双顺反子或多顺反子人工RNA。或者，双顺反子或多顺反子人工RNA可以编码例如至少两个、三个、四个、五个、六个或多于六个(优选不同的)抗原肽或蛋白，这些抗原肽或蛋白衍生自本文提供的定义内的相同RSV或片段或变体。在这种情况下，合适的IRES序列可以选自专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1566至1662的核酸序列的列表，或者这些序列的片段或变体。在这种情况下，涉及IRES序列的WO2017/081082的公开内容通过引用并入本文。
应当理解，在本发明的上下文中，编码序列的某些组合可以通过单顺反子、双顺反子和多顺反子人工核酸和/或多抗原构建体/核酸的任意组合产生，以获得编码如本文定义的多个抗原肽或蛋白的核酸组合物。
优选地，包含至少一个如本文所定义的编码序列的人工RNA通常包含约50个至约20000个、或500个至约20000个核苷酸、或约500个至约20000个核苷酸、或约500个至约10000个核苷酸、或约1000个至约10000个核苷酸、或优选约1000个至约5000个核苷酸、或者甚至更优选约1000个至约2500个核苷酸的长度。
根据优选的实施方案，第一方面的人工RNA可以是mRNA、自复制RNA、环状RNA或复制子RNA。
在实施方案中，人工RNA是环状RNA。如本文所用，“环状RNA”或“circRNA”必须被理解为可以编码如本文所定义的至少一种抗原肽或蛋白的环状多核苷酸。因此，在优选的实施方案中，所述环状RNA包含至少一种编码序列，其编码至少一种如本文所定义的衍生自RSV的抗原肽或蛋白或其片段或变体。circRNA的产生可以使用本领域提供的各种方法进行。例如，US6210931教导了一种通过将DNA片段插入包含具有自发切割和自环化能力的序列的质粒中来合成circRNA的方法。US5773244教导了通过制备编码RNA环化酶核酶的DNA构建体，将DNA构建体表达为RNA，然后使RNA自剪接来产生circRNA，这在体外产生不含内含子的circRNA。WO1992/001813教导了通过合成线性多核苷酸，在杂交条件下将线性核苷酸与互补的连接寡核苷酸组合，并连接线性多核苷酸来制备单链环状核酸的方法。本领域技术人员还可以使用WO2015/034925或WO2016/011222中提供的方法来产生环状RNA。因此，如US6210931、US5773244、WO1992/001813、WO2015/034925和WO2016/011222中提供的产生环状RNA的方法通过引用并入本文。
在实施方案中，人工RNA是复制子RNA。术语“复制子RNA”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在优化的自复制人工RNA构建体。这样的构建体包含衍生自α病毒的复制元件(复制酶)和结构病毒蛋白被目标的人工核酸置换，在本发明的上下文中，人工核酸包含至少一个编码序列，其编码至少一种衍生自RSV的抗原肽或蛋白。或者，可以在独立的构建体上提供复制酶，包含衍生自例如Semliki森林病毒(SFV)、Sindbis病毒(SIN)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、Ross-River病毒(RRV)或其他属于α病毒家族的复制酶RNA序列。复制酶的下游是控制本发明人工核酸复制的亚基因组启动子，即包含编码至少一种衍生自RSV的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的人工核酸。
在优选的实施方案中，第一方面的人工RNA是mRNA。
术语“RNA”和“mRNA”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如旨在表示核糖核酸分子，即由核苷酸组成的聚合物。这些核苷酸通常是腺苷-单磷酸酯、尿苷-单磷酸酯、鸟苷-单磷酸酯和胞苷-单磷酸酯单体，它们沿着所谓的骨架相互连接。骨架是通过第一相邻单体的糖即核糖和第二相邻单体的磷酸部分之间的磷酸二酯键形成的。单体的特定顺序称为RNA序列。mRNA(信使RNA)通常提供可被翻译成特定肽或蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。
人工RNA，优选本发明的mRNA可以使用本领域已知的任何方法制备，包括化学合成，例如固相RNA合成，以及体外方法，例如RNA体外转录反应。
在优选的实施方案中，人工RNA，优选mRNA是通过RNA体外转录获得的。
因此，本发明的RNA优选是体外转录的RNA。
术语“RNA体外转录”或“体外转录”涉及其中RNA在无细胞系统中(体外)合成的过程。RNA可以通过合适的DNA模板的DNA依赖性体外转录而获得，根据本发明，该模板是线性质粒DNA模板或PCR扩增的DNA模板。用于控制RNA体外转录的启动子可以是任何依赖DNA的RNA聚合酶的启动子。DNA依赖性RNA聚合酶的具体实例是T7、T3、SP6或Syn5 RNA聚合酶。在本发明的优选实施方案中，将DNA模板在进行RNA体外转录之前用合适的限制酶线性化。
RNA体外转录中使用的试剂通常包括：DNA模板(线性化质粒DNA或PCR产物)，其启动子序列对其各自的RNA聚合酶如噬菌体编码的RNA聚合酶(T7、T3、SP6或Syn5)具有高结合亲和力；四个碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶)的核糖核苷酸三磷酸(NTP)；任选地，本文定义的帽类似物(例如，m7G(5′)ppp(5′)G(m7G、m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)pG或m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)pG))；任选地，本文定义的其他经修饰的核苷酸；能够结合DNA模板内启动子序列的DNA依赖性RNA聚合酶(例如T7、T3、SP6或Syn5RNA聚合酶)；任选地，核糖核酸酶(RNA酶)抑制剂，使任何可能污染的RNA酶失活；任选地，焦磷酸酶降解焦磷酸，其可抑制RNA体外转录；MgCl2，提供Mg2+离子作为聚合酶的辅助因子；用于保持合适的pH值的缓冲液(TRIS或HEPES)，其也可以以最佳浓度包含抗氧化剂(例如DTT)和/或多胺例如亚精胺，例如在WO2017/109161中所公开的包含TRIS-柠檬酸盐的缓冲系统。
在实施方案中，RNA体外转录中使用的核苷酸混合物还可包含本文定义的经修饰的核苷酸。在这种情况下，优选的经修饰的核苷酸包括假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶和/或5-甲氧基尿苷。
在优选的实施方案中，可以针对给定的RNA序列优化用于RNA体外转录反应的核苷酸混合物(即混合物中每个核苷酸的分数)，优选如WO2015/188933所述。
在必须产生一种以上本文定义的不同人工RNA，例如其中必须产生2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或甚至多于10种不同的人工RNA的实施方案(例如编码不同的RSV F抗原，或例如RSV F和RSV G的组合；参见第二方面)中，可以适当地使用WO2017/109134中描述的方法。
在RNA疫苗生产中，可能需要提供GMP级RNA。GMP级RNA可以使用监管机构批准的制造工艺制备。因此，在特别优选的实施方案中，RNA生产是在当前的良好生产规范(GMP)下进行的，优选根据WO2016/180430，在DNA和RNA水平上实施各种质量控制步骤。在优选的实施方案中，本发明的RNA是GMP级RNA，特别是GMP级mRNA。
所获得的RNA产物优选地使用
Figure BPA0000294887150000781
(CureVac，Tübingen，德国；根据WO2008/077592的RP-HPLC)和/或切向流过滤(如WO2016/193206中所述)纯化。
在进一步优选的实施方案中，根据WO2016/165831或WO2011/069586将RNA，特别是纯化的RNA冻干，以产生如本文所定义的温度稳定的干燥人工RNA(粉末)。根据WO2016/184575或WO2016184576，也可以使用喷雾干燥或喷雾冷冻干燥来干燥本发明的RNA，特别是纯化的RNA，以产生本文所定义的温度稳定的RNA(粉末)。因此，在制造和纯化RNA的背景下，WO2017/109161、WO2015/188933、WO2016/180430、WO2008/077592、WO2016/193206、WO2016/165831、WO2011/069586、WO2016/184575和WO2016/184576的公开内容通过引用并入本文中。
因此，在优选的实施方案中，RNA是干燥的RNA，特别是干燥的mRNA。
如本文所使用的术语“干燥的RNA”必须被理解为已经如上文所定义冻干、或喷雾干燥或喷雾冷冻干燥以获得温度稳定的干燥RNA(粉末)的RNA。
在优选的实施方案中，本发明的人工RNA是纯化的RNA，特别是纯化的mRNA。
如本文所使用的术语“纯化的RNA”或“纯化的mRNA”必须理解为在某些纯化步骤(例如HPLC、TFF、Oligo d(T)纯化、沉淀步骤)后具有比原料(例如体外转录的RNA)更高纯度的RNA。纯化的RNA中基本不存在的典型杂质包括肽或蛋白(例如衍生自依赖DNA的RNA体外转录的酶，例如RNA聚合酶、RNA酶、焦磷酸酶、限制性内切核酸酶、DNA酶)、亚精胺、BSA、流产性RNA序列、RNA片段(短双链RNA片段、流产性序列等)、游离核苷酸(经修饰的核苷酸、常规NTP、帽类似物)、模板DNA片段、缓冲液成分(HEPES、TRIS、MgCl2)等。可能衍生自例如发酵程序的其他潜在杂质包括细菌杂质(生物负载、细菌DNA)或衍生自纯化程序的杂质(有机溶剂等)。因此，在这方面，希望“RNA纯度”尽可能接近100％。对于RNA纯度来说，也希望全长RNA转录物的量尽可能接近100％。因此，本文使用的“纯化的RNA”具有大于75％、80％、85％，非常特别地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％并且最有利地99％或高于99％的纯度。纯度可以例如通过分析型HPLC确定，其中以上提供的百分比对应于靶RNA的峰面积与代表副产物的所有峰的总面积之间的比率。或者，纯度可以例如通过分析性琼脂糖凝胶电泳或毛细管凝胶电泳确定。
应当理解，如本文定义的“干燥的RNA”和如本文定义的“纯化的RNA”或如本文定义的“GMP级mRNA”可以具有优异的稳定性特征(体外、体内)和改善的效率(例如，体内mRNA的更好的可翻译性)，因此特别适用于本发明。此外，如本文定义的“干燥的RNA”和如本文定义的“纯化的RNA”或“GMP级mRNA”可能特别适合于如本文定义的医药用途。
可以通过添加5′-帽结构来适当地修饰人工RNA，所述5′-帽结构优选地使本文所述的核酸稳定。因此，在优选的实施方案中，第一方面的人工RNA包含5′-帽结构，优选m7G、cap0(例如m7G(5′)ppp(5′)G)、cap1(例如m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)或m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA))、cap2、经修饰的cap0或经修饰的cap1结构(使用下面定义的cap类似物产生)。
如本文中所使用的术语“5′-帽结构”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在表示经修饰的核苷酸(帽类似物)，特别是鸟嘌呤核苷酸，其添加到RNA分子例如mRNA分子的5′端。优选地，使用5′-5′-三磷酸键(也称为m7GpppN)添加5′-帽。5′-帽结构的其他实例包括甘油基、反向脱氧无碱基残基(部分)、4′，5′亚甲基核苷酸、1-(β-D-赤型呋喃糖基)核苷酸、4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸、1，5-脱水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、经修饰的碱基核苷酸、苏型-五呋喃糖基核苷酸、无环的3′，4′-seco核苷酸、无环的3，4-二羟基丁基核苷酸、无环的3，5-二羟基戊基核苷酸、3′-3′-倒位核苷酸部分、3′-3′-倒位无碱基部分、3′-2′-倒位核苷酸部分、3′-2′-倒位无碱基部分、1，4-丁二醇磷酸酯、3′-氨基磷酸酯、磷酸己酯、磷酸氨基己酯、3′-磷酸酯、3’硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或桥连或非桥连的甲基膦酸酯部分。
适用于本发明的其他5′-帽结构是cap1(核糖额外甲基化的m7GpppN相邻核苷酸)、cap2(核糖额外甲基化的m7GpppN下游第2个核苷酸)、cap3(核糖额外甲基化的m7GpppN下游第3个核苷酸的)、cap4(核糖额外甲基化的m7GpppN下游第4个核苷酸)、ARCA(抗反向帽类似物)、经修饰的ARCA(例如，硫代磷酸酯修饰的ARCA)、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2′-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
5′-帽(cap0或cap1)结构也可以在化学RNA合成中形成，或者优选使用帽类似物在RNA体外转录(共转录加帽)中形成。
如本文所使用的术语“帽类似物”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在表示具有帽功能的不可聚合的二核苷酸，当掺入核酸分子的5′端时，它有助于翻译或定位和/或防止核酸分子特别是RNA分子的降解。不可聚合表示帽类似物仅在5′末端掺入，因为它没有5′三磷酸酯，因此不能通过模板依赖性聚合酶，特别是模板依赖性RNA聚合酶在3’方向上延伸。帽类似物的实例包括但不限于化学结构，其选自m7GpppG、m7GpppA、m7GpppC；未甲基化的帽类似物(例如GpppG)；二甲基化帽类似物(例如m2，7GpppG)、三甲基化帽类似物(例如m2，2，7GpppG)、二甲基化对称帽类似物(例如m7Gpppm7G)或抗反向帽类似物(例如ARCA；m7，2′OmeGpppG、m7，2′dGpppG、m7，3′OmeGpppG、m7，3′dGpppG及其四磷酸酯衍生物)。先前已经描述了其他帽类似物(WO2008/016473、WO2008/157688、WO2009/149253、WO2011/015347和WO2013/059475)。在这种情况下，其他合适的帽类似物在WO2017/066793、WO2017/066781、WO2017/066791、WO2017/066789、WO2017/053297、WO2017/066782、WO2018075827和WO2017/066797中描述，其中涉及帽类似物的公开内容通过引用结合到本文中。
5′-帽结构可以使用如本文定义的帽类似物在如本文定义的RNA体外转录反应中适当地共转录地添加。
在优选的实施方案中，使用如在WO2017/053297、WO2017/066793、WO2017/066781、WO2017/066791、WO2017/066789、WO2017/066782、WO2018075827和WO2017/066797中公开的帽类似物产生经修饰的cap1结构。特别地，可从WO2017/053297的权利要求1至5中公开的结构衍生的任何帽结构可适合用于共转录产生经修饰的cap1结构。此外，可衍生自WO2018075827的权利要求1或权利要求21中限定的结构的任何帽结构可适合用于共转录产生经修饰的cap1结构。
优选的帽类似物是二核苷酸帽类似物m7G(5′)ppp(5′)G(m7G)或3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G，以共转录生成cap0结构。特别优选的帽类似物是三核苷酸帽类似物m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)pG或m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)pG，以共转录生成cap1结构。
在这种情况下，优选本发明的RNA包含如上定义的Cap1结构，其优选地例如通过高加帽效率和增加的翻译效率而导致增加的蛋白表达。进一步合适地，与相同核酸序列的Cap0构建体相比，包含Cap1结构的本发明的RNA显示出对先天免疫系统的刺激减少。普通技术人员知道如何确定翻译效率、加帽度和免疫刺激。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的第一方面的人工RNA包含cap1结构，其中所述cap1结构可通过酶促或共转录形成(例如使用m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)pG或m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)pG类似物形成)。
在优选的实施方案中，第一方面的人工RNA包含m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)pG帽结构。在这些实施方案中，编码RNA包含一个5′末端的m7G帽，以及核糖额外甲基化的m7GpppN相邻核苷酸，在这种情况下为2′O甲基化的腺苷。
在其他优选的实施方案中，第一方面的人工RNA包含m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)pG帽结构。在这些实施方案中，编码RNA包含5′末端的m7G帽，以及核糖额外甲基化的相邻核苷酸，在这种情况下为2′O甲基化的鸟苷。
因此，每当在本发明的上下文中提及合适的RNA或mRNA序列时，所述RNA或mRNA序列的第一个核苷酸，即m7G(5′)ppp结构的下游核苷酸可以是2′O甲基化的鸟苷或2′O甲基化的腺苷。
因此，在其他实施方案中，本发明的人工RNA可以包含根据SEQ ID NO：43或21321的5’-帽序列元件、或其片段或变体。
在其他实施方案中，使用加帽酶(例如牛痘病毒加帽酶、可商购获得的加帽试剂盒)通过酶促加帽法添加5′-帽结构，以生成cap0或cap1或cap2结构。在其他实施方案中，使用固定的加帽酶，例如通过使用加帽反应器(WO2016/193226)，通过酶促加帽添加5′-帽结构(cap0、cap1)。
在优选的实施方案中，本发明的人工RNA包含至少一个多聚腺苷酸序列，优选包含30个至150个腺苷核苷酸。
在优选的实施方案中，合适地位于3′末端的多聚腺苷酸序列包含10个至500个腺苷核苷酸，10个至200个腺苷核苷酸，40个至200个腺苷核苷酸或40个至150个腺苷核苷酸。在一个特别优选的实施方案中，多聚腺苷酸序列包含约64个腺苷核苷酸。在还特别优选的实施方案中，多聚腺苷酸序列包含约75个腺苷核苷酸。在还特别优选的实施方案中，多聚腺苷酸序列包含约100个腺苷核苷酸。
如本文所使用的术语“多聚腺苷酸序列”、“多聚腺苷酸尾”或“3′-多聚腺苷酸尾”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如旨在表示腺苷核苷酸序列，通常位于RNA的3′末端，最多约1000个腺苷核苷酸。优选地，所述多聚腺苷酸序列基本上是均聚物的，例如100个腺苷核苷酸的多聚腺苷酸序列基本上具有100个核苷酸的长度。在其他实施方案中，多聚腺苷酸序列可以被至少一个不同于腺苷核苷酸的核苷酸中断，例如100个腺苷核苷酸的例如多聚腺苷酸序列的长度可以大于100个核苷酸(包含100个腺苷核苷酸和另外所述至少一个不同于腺苷核苷酸的核苷酸)。
在本发明的上下文中，多聚腺苷酸序列可以位于mRNA或任何其他核酸分子内，例如在DNA载体中，例如在通过转录所述DNA载体而用作产生RNA优选mRNA的模板的载体中。
优选地，人工RNA的多聚腺苷酸序列是在RNA体外转录过程中由DNA模板获得的。在其他实施方案中，多聚腺苷酸序列可通过化学合成的常规方法在体外获得，而不必由DNA模板转录。在其他实施方案中，多聚腺苷酸序列使用可商购获得的多聚腺苷酸化试剂盒和本领域已知的相应方案或者可替代地通过例如使用多聚腺苷酸化反应器使用固定化的多聚腺苷酸聚合酶(如WO2016/174271中所述)通过RNA的酶促多聚腺苷酸化(RNA体外转录后)生成。
在实施方案中，本发明的人工RNA可以包含衍生自载体的多聚腺苷酸序列，并且可以包含通过酶促多聚腺苷酸化产生的至少一个其他多聚腺苷酸序列，如WO2016/091391中所述。
在优选的实施方案中，本发明的人工RNA包含至少一个多聚胞苷酸序列，优选包含10个至40个胞嘧啶核苷酸。
在优选的实施方案中，适当地位于3′末端的多聚胞苷酸序列包含10个至200个胞嘧啶核苷酸，10个至100个胞嘧啶核苷酸，20个至70个胞嘧啶核苷酸，20个至60个胞嘧啶核苷酸或10个至40个胞嘧啶核苷酸。在特别优选的实施方案中，多聚胞苷酸序列包含约30个胞嘧啶核苷酸。
如本文所使用的术语“多聚胞苷酸序列”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如旨在表示胞嘧啶核苷酸序列，其通常位于RNA的3′末端，最多约200个胞嘧啶核苷酸。在本发明的上下文中，多聚胞苷酸序列可以位于mRNA或任何其他核酸分子内，例如在DNA载体中，例如在通过载体的转录而用作产生RNA优选mRNA的模板的载体中。
优选地，本发明的RNA序列中的多聚胞苷酸序列通过RNA体外转录由DNA模板衍生。在其他实施方案中，多聚胞苷酸序列可通过化学合成的常规方法在体外获得，而不必由DNA模板转录。
在其他实施方案中，本发明的人工RNA不包含本文定义的多聚胞苷酸序列。
在优选的实施方案中，第一方面的人工RNA包含至少一个组蛋白茎环。
如本文所使用的术语“组蛋白茎环”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在表示主要在组蛋白mRNA中发现的核酸序列。Lopez等人描述了示例性的组蛋白茎环序列(Davila Lopez等人，(2008)，RNA，14(1))。组蛋白前mRNA中的茎环通常后接富含嘌呤的序列，称为组蛋白下游元件(HDE)。这些前mRNA在细胞核中通过茎环下游约5个核苷酸的单次核酸内切酶裂解处理，这是通过U7 snRNA与HDE的碱基配对而被催化的。
组蛋白茎环序列/结构可以适当地选自如WO2012/019780中公开的组蛋白茎环序列，该公开涉及与组蛋白茎环序列/结构相关的公开内容，通过引用并入本文。可以在本发明中使用的组蛋白茎环序列可以优选衍生自专利申请WO2012/019780的式(I)或(II)。根据另一个优选的实施方案，如本文所定义的RNA可以包含至少一个衍生自专利申请WO2012/019780的特定式(Ia)或(IIa)中的至少一个的组蛋白茎环序列。
在特别优选的实施方案中，本发明的人工RNA包含至少一个组蛋白茎环，其中所述组蛋白茎环包含根据SEQ ID NO：39或40的核酸序列或其片段或变体。
在其他实施方案中，第一方面的人工RNA不包含本文定义的组蛋白茎环。
在其他实施方案中，本发明的人工RNA包含3′端序列元件。所述3′-末端序列元件必须理解为包含多聚腺苷酸序列和组蛋白茎环序列的序列元件，其中所述序列元件位于本发明的人工RNA的3′末端。
在其他实施方案中，本发明的人工RNA可以包含根据SEQ ID NO：44至63或21322至21328的3’-末端序列元件、或其片段或变体。
在优选的实施方案中，本发明的人工RNA包含至少一个假尿苷(ψ)修饰的编码序列。
因此，在优选的实施方案中，本发明的人工RNA或至少一种编码序列，包含其中至少一个或多于一个，优选其中所有尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸取代的核酸序列。
在进一步优选的实施方案中，本发明的人工RNA包含至少一个N1-甲基假尿苷(m1ψ)修饰的编码序列。
因此，在优选的实施方案中，本发明的人工RNA或至少一种编码序列，包含其中至少一个或多于一个，优选其中所有尿嘧啶核苷酸被N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸取代的核酸序列。
在第一方面的优选实施方案中，人工RNA，优选mRNA优选以5′至3′方向包含以下元件a)至i)：
a)5′-帽结构，优选如本文所述的5′-帽结构；
b)任选地，如本文所述的5′-UTR，优选选自SEQ ID NO：1至22的至少一种5′-UTR；
c)核糖体结合位点，优选如本文所述的核糖体结合位点；
d)至少一个本文所述的编码序列，优选地如表3和表4所示的编码序列；
e)如本文所述的3′-UTR，优选选自SEQ ID NO：23至38的至少一种的3′-UTR；
f)任选地，多聚腺苷酸序列，优选如本文所述的多聚腺苷酸序列；
g)任选地，多聚胞苷酸序列，优选如本文所述的多聚胞苷酸序列；
h)任选地，组蛋白茎环，优选如本文所述的组蛋白茎环；
i)任选地，本文所述的3′-末端序列元件，优选根据SEQ ID NO：44至63或21322至21328的3′-末端序列元件；并且
其中任选地至少一个或多于一个，优选地其中所有尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸取代。
在第一方面的其他优选实施方案中，人工RNA，优选mRNA优选以5′至3′方向包含以下元件：
a)5’-帽结构，优选如本文所述的5’-帽结构，最优选Cap1结构；
b)根据本文所述的a-1、a-4、c-1、e-4、g-2、i-2或i-3的3′-UTR和5′-UTR元件；
c)核糖体结合位点，优选如本文所述的核糖体结合位点；
d)至少一个本文所述的编码序列，其中所述编码序列位于所述5′-UTR和所述3′-UTR之间，优选地在所述5′-UTR的下游和所述3′-UTR的上游，其中编码序列优选选自表3和表4中指定的任何一个；
e)任选地，多聚腺苷酸序列，优选如本文所述的多聚腺苷酸序列；
f)任选地，多聚胞苷酸序列，优选如本文所述的多聚胞苷酸序列；
g)任选地，组蛋白茎环，优选如本文所述的组蛋白茎环；
h)任选地，本文所述的3′-末端序列元件，优选根据SEQ ID NO：44至63或21322至21328的3′-末端序列元件；并且
其中任选地至少一个或多于一个，优选地其中所有尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸取代。
在第一方面的其他优选实施方案中，人工RNA，优选mRNA优选以5′至3′方向包含以下元件：
a)5’-帽结构，优选如本文所述的5’-帽结构，最优选Cap1结构；
b)根据本文所述的a-1或i-3的3′-UTR和5′-UTR元件；
c)核糖体结合位点，优选如本文所述的核糖体结合位点；
d)至少一个本文所述的编码序列，其中所述编码序列位于所述5′-UTR和所述3′-UTR之间，优选地在所述5′-UTR的下游和所述3′-UTR的上游，其中编码序列优选选自表3和表4中指定的任何一个；
e)任选地，组蛋白茎环，优选如本文所述的组蛋白茎环；
f)多聚腺苷酸序列，优选包含约100个腺苷核苷酸；
g)任选地，本文所述的3′-末端序列元件，优选根据SEQ ID NO：21322至21328的3′-末端序列元件；并且
其中任选地至少一个或多于一个，优选地其中所有尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸取代。
在第一方面的其他优选实施方案中，人工RNA，优选mRNA以5′至3′方向包含以下元件：
a)5’-帽结构，优选如本文所述的5’-帽结构，最优选Cap1结构；
b)根据本文所述的a-1、a-4、c-1、e-4、g-2、i-2或i-3的3′-UTR和5′-UTR元件；
c)核糖体结合位点，优选如本文所述的核糖体结合位点；
d)至少一个本文所述的编码序列，其中所述编码区位于所述5′-UTR和所述3′-UTR之间，优选位于所述5′-UTR的下游和所述3′-UTR的上游，其中所述编码序列优选选自SEQID NO：69至77、484至492、899至906、1268至1275、1637至1644、2006至2013、2375至2382、2744至2751、3113至3120、3482至3489、3851至3858、4220至4227、4589至4596、4958至4965、5327至5334、5696至5703、6065至6072、6434至6441、6803至6810、7172至7179、7541至7548、7910至7917、11727至11734、12096至12103、12465至12472、12834至12841、13941至13948、14310至14317、14679至14686、15048至15055、15417至15424、15786至15793、13203至13210、13572至13579、16155至16162、16524至16531、16893至16900、17262至17269、17631至17638、18000至18007、18369至18376、18738至18745、19107至19114、19476至19483、21363至21384、21389至21410中的任一个(或其片段或变体)；
e)包含约64个腺苷的多聚腺苷酸序列；
f)包含约30个半胱氨酸的多聚胞苷酸序列；
g)根据SEQ ID NO：39或40的组蛋白茎环，并且
其中任选地至少一个或多于一个，优选地其中所有尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸取代。
在第一方面的其他优选实施方案中，人工RNA，优选mRNA以5′至3′方向包含以下元件：
a)5’-帽结构，优选如本文所述的5’-帽结构，最优选Cap1结构；
b)根据本文所述的a-1、a-4、c-1、e-4、g-2、i-2或i-3的3′-UTR和5′-UTR元件；
c)核糖体结合位点，优选如本文所述的核糖体结合位点；
d)至少一个本文所述的编码序列，其中所述编码区位于所述5′-UTR和所述3′-UTR之间，优选位于所述5′-UTR的下游和所述3′-UTR的上游，其中所述编码序列优选选自SEQID NO：69至77、484至492、899至906、1268至1275、1637至1644、2006至2013、2375至2382、2744至2751、3113至3120、3482至3489、3851至3858、4220至4227、4589至4596、4958至4965、5327至5334、5696至5703、6065至6072、6434至6441、6803至6810、7172至7179、7541至7548、7910至7917、11727至11734、12096至12103、12465至12472、12834至12841、13941至13948、14310至14317、14679至14686、15048至15055、15417至15424、15786至15793、13203至13210、13572至13579、16155至16162、16524至16531、16893至16900、17262至17269、17631至17638、18000至18007、18369至18376、18738至18745、19107至19114、19476至19483、21363至21384、21389至21410中的任一个(或其片段或变体)；
e)包含约64个腺苷的多聚腺苷酸序列；
f)根据SEQ ID NO：39或40的组蛋白茎环，并且
其中任选地至少一个或多于一个，优选地其中所有尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸取代。
表5A、表5B和表6A、表6B提供了优选的RSV多肽、核酸和mRNA序列。
在表5A和表5B中，蛋白设计列在第1行中。其中，A列到J列代表衍生自RSV融合(F)蛋白的本发明的特定合适构建体，其中A列提供F0的合适序列，B列提供F-del的合适序列，C列提供F0_DSCav1的合适序列，D列提供F-del_DSCav1的合适序列，E列提供F_DSCav1_mut1的合适序列，F列提供F-del_DSCav1_mut1的合适序列，G列提供F_DSCav1_mut2的合适序列，H列提供F-del_DSCav1_mut2的合适序列，I列提供F_DSCav1_mut3的合适序列，J列提供F-del_DSCav1_mut3的合适序列。
蛋白设计显示在第1行(A列至J列)，序列表中提供的特定蛋白SEQ ID NO位于第2行(“蛋白”)。在第3行中提供了每种蛋白构建体的相应编码序列的SEQ ID NO(“cds”，与表3进行比较以了解不同的cds优化)。例如有关密码子修饰编码序列类型(opt1、opt2、opt3、opt4、opt5、opt6、opt11等)的更多信息，请参见序列表和表3中相应SEQ ID NO的<223>标识符。在第4行至47行中提供了包含所述编码序列以及合适的根据本发明的3′-UTR和5′-UTR的相应mRNA构建体的SEQ ID NO(如本文所指定的mRNA Design a-1至i-3)。在表5A中，提供了衍生白HRSV(A2)的mRNA序列，在表5B中，提供了衍生自HRSV(Memphis-37)的mRNA序列。序列表中相应SEQ ID NO的<223>标识符中提供了例如有关mRNA构建体中包含的编码序列类型的更多信息(wt、opt1、opt2、opt3、opt4、opt5、opt6、opt11等)。
表5A：衍生自HRSV(A2)的编码RSV F的优选mRNA构建体(A列至J列)
Figure BPA0000294887150000891
Figure BPA0000294887150000901
Figure BPA0000294887150000911
表5B：衍生自HRSV(Memphis-37)的编码RSV F的优选mRNA构建体(A列至J列)
Figure BPA0000294887150000912
Figure BPA0000294887150000921
Figure BPA0000294887150000931
Figure BPA0000294887150000941
在表6A和表6B中，蛋白设计列在第1行中。其中，K列至V列代表衍生自RSV融合(F)蛋白的本发明的特定合适构建体，其中，K列提供F_DSCav1_mut0的合适序列，L列提供F-del_DSCav1_mut0的合适序列，M列提供F_DSCav1_mut4的合适序列，N列提供F-del_DSCav1_mut4的合适序列，O列提供F_DSCav1_mut5的合适序列，P列提供F-del_DSCav1_mut5的合适序列，Q列提供F_DSCav1_mut6的合适序列，R列提供F-del_DSCav1_mut6的合适序列，S列提供F_DSCav1_mut7的合适序列，T列提供F-del_DSCav1_mut7的合适序列，U列提供F_DSCav1_mut8的合适序列，V列提供F-del_DSCav1_mut8的合适序列。
蛋白设计显示在第1行(K列至V列)，序列表中提供的特定蛋白SEQ ID NO位于第2行，“PRT”。在第3行中提供了每种蛋白构建体的相应编码序列的SEQ ID NO，“cds”(与表4进行比较以了解不同的cds优化)。例如有关密码子修饰编码序列类型(opt1、opt2、opt3、opt4、opt5、opt6、opt11等)的更多信息，参见序列表和表4中相应SEQ ID NO的标识符<223>所示内容。在接下来的每一行中提供了包含所述编码序列以及合适的根据本发明的3′-UTR和5′-UTR的相应mRNA构建体的SEQ ID NO(如本文所指定的mRNA Design a-1至i-3)。在表6A中，提供了衍生自HRSV(A2)的mRNA序列，在表6B中，提供了衍生自HRSV(Memphis-37)的mRNA序列。
序列表中相应SEQ ID NO的标识符<223>中提供了例如有关mRNA构建体中包含的编码序列类型的更多信息(wt、opt1、opt2、opt3、opt4、opt5、opt6、opt11等)。
表6A：衍生自HRSV(A2)的编码RSV F的优选mRNA构建体(K列至V列)
Figure BPA0000294887150000951
Figure BPA0000294887150000961
Figure BPA0000294887150000971
表6B：衍生自HRSV(Memphis-37)的编码RSV F的优选mRNA构建体(K列至V列)
Figure BPA0000294887150000981
Figure BPA0000294887150000991
Figure BPA0000294887150001001
在优选的实施方案中，人工RNA包含或组成为RNA序列，其与选自SEQ ID NO：78至482、493至897、907至1266、1276至1635、1645至2004、2014至2373、2383至2742、2752至3111、3121至3480、3490至3849、3859至4218、4228至4587、4597至4956、4966至5325、5335至5694、5704至6063、6073至6432、6442至6801、6811至7170、7180至7539、7549至7908、7918至8277、8278、21415至21480、21561至21626、11735至12094、12104至12463、12473至12832、12842至13201、13949至14308、14318至14677、14687至15046、15056至15415、15425至15784、15794至16153、13211至13570、13580至13939、16163至16522、16532至16891、16901至17260、17270至17629、17639至17998、18008至18367、18377至18736、18746至19105、19115至19474、19484至19843、21489至21552、21635至21698中的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，其中任选地，至少一个或多于一个或其中所有尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸置换。
在优选的实施方案中，人工RNA包含a)至少一个异源性5′非翻译区(5′-UTR)和/或至少一个异源性3′非翻译区(3′-UTR)，和b)与所述3′-UTR和/或5′-UTR可操作地连接的至少一个编码序列，其编码至少一种衍生自RSV F蛋白或其片段或变体的抗原肽或蛋白，其中
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：78至482、11735至12094、21415至21417、21561至21563、21489、21490、21635、21636的核酸序列(编码F0)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：493至897、12104至12463、21418至21420、21564至21566、21491、21492、21637、21638的核酸序列(编码F-del)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：907至1266、12473至12832、21421至21423、21567至21569、21493至21495、21639至21641的核酸序列(编码F0_DSCav1)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：1276至1635、8278、12842至13201、21424至21426、21570至21572、21496至21498、21642至21644的核酸序列(编码F-del_DSCav1)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：1645至2004、13949至14308、21433至21435、21579至21581、21505至21507、21651至21653的核酸序列(编码F_DSCav1_mut1)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：2014至2373、14318至14677、21436至21438、21582至21584、21508至21510、21654至21656的核酸序列(编码F-del_DSCav1_mut1)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：2383至2742、14687至15046、21439至21441、21585至21587、21511至21513、21657至21659的核酸序列(编码F_DSCav1_mut2)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：2752至3111、15056至15415、21442至21444、21588至21590、21514至21516、21660至21662的核酸序列(编码F-del_DSCav1_mut2)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：3121至3480、15425至15784、21445至21447、21591至21593、21517至21519、21663至21665的核酸序列(编码F_DSCav1_mut3)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：3490至3849、15794至16153、21448至21450、21594至21596、21520至21522、21666至21668的核酸序列(编码F-del_DSCav1_mut3)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：3859至4218、13211至13570、21427至21429、21573至21575、21499至21501、21645至21647的核酸序列(编码F_DSCav1_mut0)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：4228至4587、13580至13939、21430至21432、21576至21578、21502至21504、21648至21650的核酸序列(编码F-del_DSCav1_mut0)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：4597至4956、16163至16522、21451至21453、21597至21599、21523至21525、21669至21671的核酸序列(编码F_DSCav1_mut4)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：4966至5325、16532至16891、21454至21456、21600至21602、21526至21528、21672至21674的核酸序列(编码F-del_DSCav1_mut4)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：5335至5694、16901至17260、21457至21459、21603至21605、21529至21531、21675至21677的核酸序列(编码F_DSCav1_mut5)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：5704至6063、17270至17629、21460至21462、21606至21608、21532至21534、21678至21680的核酸序列(编码F-del_DSCav1_mut5)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：6073至6432、17639至17998、21463至21465、21609至21611、21535至21537、21681至21683的核酸序列(编码F_DSCav1_mut6)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：6442至6801、18008至18367、21466至21468、21612至21614、21538至21540、21684至21686的核酸序列(编码F-del_DSCav1_mut6)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：6811至7170、18377至18736、21469至21471、21615至21617、21541至21543、21687至21689的核酸序列(编码F_DSCav1_mut7)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：7180至7539、18746至19105、21472至21474、21618至21620、21544至21546、21690至21692的核酸序列(编码F-del_DSCav1_mut7)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：7549至7908、19115至19474、21475至21477、21621至21623、21547至21549、21693至21695的核酸序列(编码F_DSCav1_mut8)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：7918至8277、19484至19843、21478至21480、21624至21626、21550至21552、21696至21698的核酸序列(编码F-del_DSCav1_mut8)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列，并且
其中任选地至少一个或多于一个，或其中所有尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸置换。
在特别优选的实施方案中，人工RNA包含a)至少一个异源性5′非翻译区(5′-UTR)和/或至少一个异源性3′非翻译区(3′-UTR)，和
(b)与所述3′-UTR和/或5′-UTR可操作地连接的至少一种编码序列，其编码至少一种衍生自RSV F的抗原肽或蛋白或其片段或变体，其中所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：5704至6063、17270至17629、21460至21462、21606至21608、21532至21534、21678至21680的核酸序列(编码F-del_DSCav1_mut5)或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列。
如整个说明书中概述的，有关合适的氨基酸序列或核酸序列(编码序列，mRNA序列)的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从其中以标识符<223>提供的详细内容中获得，如下文所述。
例如，SEQ ID NO：68的序列表中的数字标识符<223>读取如下所示：
“由HRSV(A2)_F0衍生和/或修饰的(人工)蛋白序列”。必须注意的是，在整个序列表中，在数字标识符<223>下提供的信息遵循相同的结构：“来自<构建体_标识符>的<序列_描述>。<序列_描述>是关于序列的类型(例如“衍生和/或修饰的蛋白序列”、“衍生和/或修饰的CDS”、“包含衍生和/或修饰的序列的mRNA产品设计a-1”或“包含衍生和/或修饰的序列的mRNA产品设计b-4”、或“包含衍生和/或修饰的序列的mRNA产品设计c-5”、或“包含衍生和/或修饰的序列的mRNA产品设计g-4”等)以及该序列是否包含或组成为野生型序列(“wt”)或该序列是否包含或组成为序列优化的序列(例如“opt1”、“opt2”、“opt3”、“opt4”、“opt5”、“opt6”、“opt11”；序列优化将在下面详细介绍)。例如，在SEQ ID NO：68的数字标识符<223>下提供的<序列_描述>的读取如下：“衍生和/或修饰的(人工)蛋白序列”。在数字标识符<223>下提供的<构建体_标识符>具有以下结构：(“生物体_构建体名称”，或“生物体_登录号_构建体名称”)，并旨在帮助本领域技术人员明确衍生出编码根据本发明的相同RSV蛋白的合适核酸序列(例如RNA、mRNA)。例如，SEQ ID NO：68的数字标识符<223>下提供的<构建体_标识符>读取如下：“HRSV(A2)_F0”。在该示例中，相应的蛋白序列衍生自“HRSV(A2)”(生物体)，其中蛋白包含结构元件“F0”(构建体名称，全长F)。如果技术人员使用SEQID NO：68的构建体标识符，即“HRSV(A2)_F0”，则所述人员容易地找到可以容易地从本发明的序列表中检索到的合适的核酸编码序列，例如RNA编码序列和mRNA序列的列表。
组合物：
第二方面涉及包含至少一个第一方面的人工RNA的组合物。
在第二方面的一个优选实施方案中，组合物包含至少一个第一方面的人工RNA和任选的至少一种药学上可接受的载体。
本文所使用的术语“药学上可接受的载体”优选包括组合物的液体或非液体基础。如果以液体形式提供组合物，则载体将优选是水，通常是无热原的水；等渗盐水或缓冲(水)溶液，例如磷酸盐、柠檬酸盐等的缓冲溶液。可以使用水或优选缓冲液，更优选水缓冲液，其含有钠盐，优选至少50mM的钠盐、钙盐，优选至少0.01mM的钙盐和任选的钾盐，优选至少3mM的钾盐。根据一个优选的实施方案，钠盐、钙盐和钾盐可能以其卤化物例如氯化物、碘化物或溴化物的形式存在，也可能以其氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或硫酸盐等的形式存在。不希望受理论束缚，钠盐的实例包括例如NaCl、NaI、NaBr、Na2CO3、NaHCO3、Na2SO4，任选的钾盐的实例包括例如KCl、KI、KBr、K2CO3、KHCO3、K2SO4，钙盐的实例包括例如CaCl2、CaI2、CaBr2、CaCO3、CaSO4、Ca(OH)2。此外，在缓冲液中可以包含上述阳离子的有机阴离子。
在实施方案中，本文定义的组合物可包含多个或至少多于一个在本发明的第一方面或第二方面的上下文中定义的人工RNA。
在实施方案中，组合物中包含的至少一种RNA是双顺反子或多顺反子核酸，特别是本文定义的双顺子或多顺反子核酸，其编码至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个不同的抗原肽或蛋白，这些肽或蛋白衍生自相同的RSV和/或不同的RSV。
在实施方案中，组合物可包含至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或甚至多于10种不同的在本发明的第一方面的上下文中定义的人工RNA，每种人工RNA编码衍生自基因上相同的RSV或其片段或变体的至少一种抗原肽或蛋白。在病毒上下文中使用的术语“相同”或“相同RSV”，例如“相同病毒”，应当理解为在基因上相同。特别地，所述(基因上)相同的病毒表达相同的蛋白或肽，其中所有蛋白或肽具有相同的氨基酸序列。特别地，所述(基因上)相同的RSV表达基本相同的蛋白、肽或多蛋白，其中这些蛋白、肽或多蛋白优选在其氨基酸序列上没有差异。列表1中提供了示例性RSV病毒的非限制性列表。
在实施方案中，组合物包含至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或甚至多于10种不同的在本发明的第一方面的上下文中定义的人工RNA，每种人工RNA编码衍生自基因上不同的RSV或其片段或变体的至少一种肽或蛋白。在整个说明书中在病毒的上下文中使用的术语“不同”或“不同RSV”，例如“不同”病毒应当理解为至少两种各自的病毒之间的差异，其中所述差异表现在各自不同的病毒RNA基因组上。特别地，所述(基因上)不同的RSV表达至少一种不同的蛋白、肽或多蛋白，其中所述至少一种不同的蛋白、肽或多蛋白优选在至少一个氨基酸上不同。
在其他实施方案中，组合物包含至少1个、2个、3个、4、5个、6个、7个、8个、9个、10个或甚至多于10个编码RSV抗原的其他RNA构建体，该RSV抗原选自糖蛋白G、短疏水蛋白SH、基质蛋白M、核蛋白N、大聚合酶L、M2-1蛋白、M2-2蛋白、磷蛋白P、非结构蛋白NS1或非结构蛋白NS2或其任意组合。
为了产生包含至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种编码RSV的其他RNA构建体的组合物，优选使用并相应地修改在PCT申请PCT/EP2016/082487或在公开专利申请WO2017/1090134A1中公开的方法。
在优选的实施方案中，第二方面的组合物包含至少一种第一方面的人工RNA和至少一种其他人工RNA，其包含编码至少一种衍生自RSV的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列，所述抗原肽或蛋白选自基质蛋白M、核蛋白N、M2-1蛋白和/或磷蛋白P或其组合。添加其他人工RNA，其包含至少一个编码序列，该编码序列编码至少一种衍生自RSV M、N、M2-1和/或磷蛋白P(或其组合)的抗原肽或蛋白，特别有利于例如促进T-细胞免疫应答。
值得注意的是，与第一方面的人工RNA有关的实施方案可以同样地阅读并理解为第二方面的至少一种其他人工RNA的合适实施方案(例如，与UTR组合、cds优化、组蛋白茎环、多聚腺苷酸、多聚胞苷酸、帽结构、mRNA结构、mRNA产生和mRNA纯化等有关的实施方案)。
因此，第二方面的组合物可以合适地包含编码RSF F的第一方面的至少一种人工RNA和包含编码至少一种衍生自RSV基质蛋白M的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA。
或者，第二方面的组合物可以合适地包含编码RSF F的第一方面的至少一种人工RNA和包含编码至少一种衍生自RSV N的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA。
或者，第二方面的组合物可以合适地包含编码RSF F的第一方面的至少一种人工RNA和包含编码至少一种衍生自RSV M2-1的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA。
或者，第二方面的组合物可以合适地包含编码RSF F的第一方面的至少一种人工RNA和包含编码至少一种衍生自RSV P的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA。
在优选的实施方案中，第二方面的组合物包含两种其他人工RNA，其各自包含编码至少一种衍生自RSV的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列，所述抗原肽或蛋白选自基质蛋白M、核蛋白N、M2-1和磷蛋白P。
因此，第二方面的组合物可以合适地包含编码RSF F的第一方面的至少一种人工RNA，包含编码至少一种衍生自RSV M的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA，和包含编码至少一种衍生自RSV N的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA。
因此，第二方面的组合物可以合适地包含编码RSF F的第一方面的至少一种人工RNA，包含编码至少一种衍生自RSV N的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA，和包含编码至少一种衍生自RSV M2-1的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA。
因此，第二方面的组合物可以合适地包含编码RSF F的第一方面的至少一种人工RNA，包含编码至少一种衍生自RSV P的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA，和包含编码至少一种衍生自RSV M2-1的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA。
因此，第二方面的组合物可以合适地包含编码RSF F的第一方面的至少一种人工RNA，包含编码至少一种衍生自RSV P的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA，和包含编码至少一种衍生自RSV N的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA。
因此，第二方面的组合物可以合适地包含编码RSF F的第一方面的至少一种人工RNA，包含编码至少一种衍生自RSV M的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA，和包含编码至少一种衍生自RSV M2-1的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA。
因此，第二方面的组合物可以合适地包含编码RSF F的第一方面的至少一种人工RNA，包含编码至少一种衍生自RSV M的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA，和包含编码至少一种衍生自RSV P的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA。
在优选的实施方案中，第二方面的组合物包含三个其他人工RNA种类，每个包含三个其他人工RNA种类，每个种类包含至少一个编码序列，该编码序列编码至少一种衍生自RSV的抗原肽或蛋白，所述抗原肽或蛋白选自基质蛋白M、核蛋白N、M2-1和磷蛋白P。
因此，第二方面的组合物可以合适地包含编码RSF F的第一方面的至少一种人工RNA，包含编码至少一种衍生自RSV M的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA，包含编码至少一种衍生自RSV N的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA，和包含编码至少一种衍生自RSV P的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA。
因此，第二方面的组合物可以合适地包含编码RSF F的第一方面的至少一种人工RNA，包含编码至少一种衍生自RSV M2-1的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA，包含编码至少一种衍生自RSV N的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA，和包含编码至少一种衍生自RSV P的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA。
因此，第二方面的组合物可以合适地包含编码RSF F的第一方面的至少一种人工RNA，包含编码至少一种衍生自RSV M2-1的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA，包含编码至少一种衍生自RSV M的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA，和包含编码至少一种衍生自RSV P的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA。
因此，第二方面的组合物可以合适地包含编码RSF F的第一方面的至少一种人工RNA，包含编码至少一种衍生自RSV M2-1的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA，包含编码至少一种衍生自RSV M的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA，和包含编码至少一种衍生自RSV N的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA。
因此，第二方面的组合物可以合适地包含编码RSF F的第一方面的至少一种人工RNA和包含编码至少一种衍生自RSV M2-1的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA。
在优选的实施方案中，第二方面的组合物包含四个其他人工RNA种类，每个包含三个其他人工RNA种类，每个种类包含至少一个编码序列，该编码序列编码至少一种衍生自RSV的抗原肽或蛋白，所述抗原肽或蛋白选自基质蛋白M、核蛋白N、M2-1和磷蛋白P。
因此，第二方面的组合物可以合适地包含编码RSF F的第一方面的至少一种人工RNA，包含编码至少一种衍生自RSV M的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA，包含编码至少一种衍生自RSV N的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA，包含编码至少一种衍生自RSV P的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA，和包含编码至少一种衍生自RSV M2-1的抗原肽或蛋白的至少一个编码序列的至少一种其他人工RNA。
在第二方面的优选实施方案中，其他人工RNA的编码序列编码至少一个与SEQ IDNO：9684、10053至10133、10134、10503至10636、10637、11006至11182、11183、11552至11725、19844、20213、20582、20951的任一个或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。关于这些编码RSV蛋白的合适氨基酸序列中的每一个的附加信息也可以从序列表中获得，特别是从其中以标识符<223>提供的详细内容中获得，如下文所述。
在第二方面的其他实施方案中，其他人工RNA的编码序列编码至少一种如本文所定义的抗原肽或蛋白以及另外的异源性分泌信号序列或异源性分泌信号肽。异源性分泌信号序列可以增加编码的抗原肽或蛋白的分泌。
合适的分泌信号肽可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1至1115和SEQ ID NO：1728的氨基酸序列的列表、或者这些序列的片段或变体。在核酸水平上，可以选择编码这些氨基酸序列的任何核酸序列(例如RNA序列)。在这种情况下，WO2017/081082的公开内容通过引用并入本文。
根据实施方案，分泌信号序列包含与SEQ ID NO：21329至21362或这些序列中任何一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列。关于这些编码分泌信号序列的合适氨基酸序列中的每一个的附加信息也可以从序列表中获得，特别是从其中以标识符<223>提供的详细内容中获得。
在优选的实施方案中，组合物的其他人工RNA包含
a)至少一个异源性5′非翻译区(5′-UTR)和/或至少一个异源性3′非翻译区(3′-UTR)；和
b)与所述3′-UTR和/或5′-UTR可操作地连接的至少一个编码序列，其编码至少一种衍生自RSV M、N、M2-1和/或磷蛋白P或其片段或变体的抗原肽或蛋白，优选编码选自SEQID NO：9684、10053至10133、10134、10503至10636、10637、11006至11182、11183、11552至11725、19844、20213、20582、20951中任一个或这些序列中任一个的片段或变体的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，组合物的其他人工RNA包含
a)至少一个异源性5′非翻译区(5′-UTR)和/或至少一个异源性3′非翻译区(3′-UTR)；和
b)与所述3′-UTR和/或5′-UTR可操作地连接的至少一个编码序列，其编码至少一种衍生自RSV M2-1或其片段或变体的抗原肽或蛋白，优选编码选自SEQ ID NO：11183、20953、21414中任一个或这些序列中任一个的片段或变体的氨基酸序列。
合适地，组合物的其他人工RNA包含编码序列，其可操作地连接至选自a-1、a-2、a-3、a-4、a-5、b-1、b-2、b-3、b-4、b-5、c-1、c-2、c-3、c-4、c-5、d-1、d-2、d-3、d-4、d-5、e-1、e-2、e-3、e-4、e-5、e-6、f-1、f-2、f-3、f-4、f-5、g-1、g-2、g-3、g-4、g-5、h-1、h-2、h-3、h-4、h-5、i-1、i-2或i-3(在第一个方面的上下文中定义)的3′-UTR和5’-UTR。
合适地，组合物的其他人工RNA包含编码序列，其中至少一个或多于一个或优选所有尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸置换。
因此，在其他实施方案中，组合物的其他人工RNA可以包含根据SEQ ID NO：43或21321的5’-帽序列元件或其片段或变体。
在第二方面的优选实施方案中，其他RNA的编码序列包含至少一个核酸序列，其与SEQ ID NO：9685至9692、10135至10142、10638至10645、11184至11119、19845至19852、20214至20221、20583至20590、20952至20959、21385至21388、21411至21414或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同(在第一方面的上下文中定义的cds优化)。关于这些编码RSV蛋白的合适氨基酸序列中的每一个的附加信息也可以从序列表中获得，特别是从其中以标识符<223>提供的详细内容中获得，如下文所述。
在第二方面的优选实施方案中，组合物的其他人工RNA，优选组合物的其他mRNA优选以5′至3′方向包含以下元件a)至i)：
a)5’-帽结构，优选如在第一方面的上下文中所指定的5’-帽结构，最优选为Cap1结构；
b)任选地，如在第一方面的上下文中所指定的5’-UTR，优选地选自SEQ ID NO：1至22中的至少一个；
c)核糖体结合位点，优选如本文所述的；
d)至少一个选自SEQ ID NO：9685至9692、10135至10142、10638至10645、11184至11119、19845至19852、20214至20221、20583至20590、20952至20959、21385至21388、21411至21414的编码序列；
e)如第一方面的上下文中所指定的3’-UTR，优选地选自SEQ ID NO：23至38中的至少一个；
f)任选地，多聚腺苷酸序列，优选在第一方面的上下文中指定的多聚腺苷酸序列；
g)任选地，多聚胞苷酸序列，优选在第一方面的上下文中指定的多聚胞苷酸序列；
h)任选地，组蛋白茎环，优选在第一方面的上下文中指定的组蛋白茎环；
i)任选地，如在第一方面的上下文中所指定的，优选根据SEQ ID NO：44至63或21322至21328的3′-末端序列元件，并且
其中任选地至少一个或多于一个，优选其中所有尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸置换。
在第二方面的特别的优选实施方案中，组合物的其他人工RNA，优选组合物的其他mRNA优选以5′至3′方向包含以下元件a)至i)：
a)5’-帽结构，优选如在第一方面的上下文中所指定的5’-帽结构，最优选为Cap1结构；
b)任选地，如在第一方面的上下文中所指定的5’-UTR，优选地选自SEQ ID NO：1至22中的至少一个；
c)核糖体结合位点，优选如本文所述的核糖体结合位点；
d)至少一个选自SEQ ID NO：11185至11191、21388、20952至20959、21414的编码序列；
e)如第一方面的上下文中所指定的3’-UTR，优选地选自SEQ ID NO：23至38中的至少一个的3’-UTR；
f)任选地，多聚腺苷酸序列，优选在第一方面的上下文中指定的多聚腺苷酸序列；
g)任选地，多聚胞苷酸序列，优选在第一方面的上下文中指定的多聚胞苷酸序列；
h)任选地，组蛋白茎环，优选在第一方面的上下文中指定的组蛋白茎环；
i)任选地，如在第一方面的上下文中所指定的，优选根据SEQ ID NO：44至63或21322至21328的3′-末端序列元件，并且
其中任选地至少一个或多于一个，优选地其中所有尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸取代。
在这种情况下，表7A提供了第二方面的优选的RSV多肽、核酸和mRNA序列。
在表7A中，A列至D列代表第二方面的特定合适的构建体，其衍生自RSV蛋白，其中A列提供M的合适序列，B列提供N的合适序列，C列提供P的合适序列，D列提供M2-1的合适序列。
蛋白名称/设计在第1行(A列至D列)中指明，序列表中提供的蛋白SEQ ID NO在第2行(“PRT”)中。第3行提供了HRSV(A2)的优选蛋白SEQ ID NO(“HRSV(A2)PRT”)。第4行至第11行提供了每种所示HRSV(A2)蛋白的相应编码序列的SEQ ID NO(分别为“cds wt”、“cdsopt1”、“cds opt2”、“cds opt3”、“cds opt4”、“cds opt5”、“cds opt6”、“cds opt11”)。在第12行至55行中提供了包含所述编码序列以及合适的根据本发明的3′-UTR和5′-UTR的相应mRNA构建体的SEQ ID NO(如本文所述，“mRNA Design a-1”至“mRNA Design i-3”)。
第56行提供了HRSV(Memphis-37)的优选蛋白SEQ ID NO(“Memphis-37 PRT”)。第57行至第64行提供了每种所示HRSV(Memphis-37)蛋白的相应编码序列的SEQ ID NO(分别为“cds wt”、“cds opt1”、“cds opt2”、“cds opt3”、“cds opt4”、“cds opt5”、“cds opt6”、“cds opt11”)。在第65行至108行中提供了包含所述编码序列以及合适的根据本发明的3′-UTR和5′-UTR的相应mRNA构建体的SEQ ID NO(如本文所述，“mRNA Design a-1”至“mRNADesign i-3”)。
序列表中相应SEQ ID NO的标识符<223>中提供了例如有关指示的mRNA构建体中包含的编码序列类型的更多信息。
表7A：组合物或疫苗的优选的其他编码序列和mRNA构建体
Figure BPA0000294887150001141
Figure BPA0000294887150001151
Figure BPA0000294887150001161
Figure BPA0000294887150001171
因此，在优选的实施方案中，第二方面的组合物包含至少一种其他人工RNA，其包含至少一个编码序列，该编码序列编码至少一种衍生自RSV的抗原肽或蛋白，所述抗原肽或蛋白选自基质蛋白M、核蛋白N、M2-1蛋白、磷蛋白P，其中其他人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：9693至10052、10143至10502、10646至11005、11192至11551、19853至20212、20222至20581、20591至20950、20960至21319、21481至21488、21627至21634、21553至21560、21699至21706的核酸序列或任何这些序列的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列，其中，任选地，至少一个或多于一个或其中所有尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸置换。关于这些编码RSV蛋白的合适氨基酸序列中的每一个的附加信息也可以从序列表中获得，特别是从其中以标识符<223>提供的详细内容中获得，如下文所述。
在第二方面特别优选的实施方案中，第二方面的组合物包含
-至少一种与选自SEQ ID NO：78至482、493至897、907至1266、1276至1635、1645至2004、2014至2373、2383至2742、2752至3111、3121至3480、3490至3849、3859至4218、4228至4587、4597至4956、4966至5325、5335至5694、5704至6063、6073至6432、6442至6801、6811至7170、7180至7539、7549至7908、7918至8277、8278、11735至12094、12104至12463、12473至12832、12842至13201、13949至14308、14318至14677、14687至15046、15056至15415、15425至15784、15794至16153、13211至13570、13580至13939、16163至16522、16532至16891、16901至17260、17270至17629、17639至17998、18008至18367、18377至18736、18746至19105、19115至19474、19484至19843、21415至21480、21561至21626、21489至21552、21635至21698(编码第一方面中定义的RSV F)的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人工RNA和与选自SEQ ID NO：9693至10052、19853至20212、21481、21482、21627、21628、21553、21554、21699、21700(编码RSV M)的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的其他人工RNA；或
-至少一种与选自SEQ ID NO：78至482、493至897、907至1266、1276至1635、1645至2004、2014至2373、2383至2742、2752至3111、3121至3480、3490至3849、3859至4218、4228至4587、4597至4956、4966至5325、5335至5694、5704至6063、6073至6432、6442至6801、6811至7170、7180至7539、7549至7908、7918至8277、8278、11735至12094、12104至12463、12473至12832、12842至13201、13949至14308、14318至14677、14687至15046、15056至15415、15425至15784、15794至16153、13211至13570、13580至13939、16163至16522、16532至16891、16901至17260、17270至17629、17639至17998、18008至18367、18377至18736、18746至19105、19115至19474、19484至19843、21415至21480、21561至21626、21489至21552、21635至21698(编码第一方面中定义的RSV F)的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人工RNA和与选自SEQ ID NO：10143至10502、20222至20581、21483、21484、21629、21630、21555、21556、21701、21702(编码RSV N)的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的其他人工RNA；或
-至少一种与选自SEQ ID NO：78至482、493至897、907至1266、1276至1635、1645至2004、2014至2373、2383至2742、2752至3111、3121至3480、3490至3849、3859至4218、4228至4587、4597至4956、4966至5325、5335至5694、5704至6063、6073至6432、6442至6801、6811至7170、7180至7539、7549至7908、7918至8277、8278、11735至12094、12104至12463、12473至12832、12842至13201、13949至14308、14318至14677、14687至15046、15056至15415、15425至15784、15794至16153、13211至13570、13580至13939、16163至16522、16532至16891、16901至17260、17270至17629、17639至17998、18008至18367、18377至18736、18746至19105、19115至19474、19484至19843、21415至21480、21561至21626、21489至21552、21635至21698(编码第一方面中定义的RSV F)的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人工RNA和至少一个与选自SEQ ID NO：10646至11005、20591至20950、21485、21486、21631、21632、21557、21558、21703、21704(编码RSV P)的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的其他人工RNA；或
-至少一种与选自SEQ ID NO：78至482、493至897、907至1266、1276至1635、1645至2004、2014至2373、2383至2742、2752至3111、3121至3480、3490至3849、3859至4218、4228至4587、4597至4956、4966至5325、5335至5694、5704至6063、6073至6432、6442至6801、6811至7170、7180至7539、7549至7908、7918至8277、8278、11735至12094、12104至12463、12473至12832、12842至13201、13949至14308、14318至14677、14687至15046、15056至15415、15425至15784、15794至16153、13211至13570、13580至13939、16163至16522、16532至16891、16901至17260、17270至17629、17639至17998、18008至18367、18377至18736、18746至19105、19115至19474、19484至19843、21415至21480、21561至21626、21489至21552、21635至21698(编码第一方面中定义的RSV F)的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人工RNA和至少一种与选自SEQ ID NO：11192至11551、20960至21319、21487、21488、21633、21634、21559、21560、21705、21706(编码RSV M2-1)的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的其他人工RNA；或
-至少一种与选自SEQ ID NO：78至482、493至897、907至1266、1276至1635、1645至2004、2014至2373、2383至2742、2752至3111、3121至3480、3490至3849、3859至4218、4228至4587、4597至4956、4966至5325、5335至5694、5704至6063、6073至6432、6442至6801、6811至7170、7180至7539、7549至7908、7918至8277、8278、11735至12094、12104至12463、12473至12832、12842至13201、13949至14308、14318至14677、14687至15046、15056至15415、15425至15784、15794至16153、13211至13570、13580至13939、16163至16522、16532至16891、16901至17260、17270至17629、17639至17998、18008至18367、18377至18736、18746至19105、19115至19474、19484至19843、21415至21480、21561至21626、21489至21552、21635至21698(编码第一方面中定义的RSV F)的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人工RNA，至少一个与选自SEQ ID NO：9693至10052、19853至20212、21481、21482、21627、21628、21553、21554、21699、21700(编码RSV M)的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的其他人工RNA，和与选自SEQ ID NO：10646至11005、20591至20950、21485、21486、21631、21632、21557、21558、21703、21704(编码RSV P)的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的其他人工RNA；
-至少一种与选自SEQ ID NO：78至482、493至897、907至1266、1276至1635、1645至2004、2014至2373、2383至2742、2752至3111、3121至3480、3490至3849、3859至4218、4228至4587、4597至4956、4966至5325、5335至5694、5704至6063、6073至6432、6442至6801、6811至7170、7180至7539、7549至7908、7918至8277、8278、11735至12094、12104至12463、12473至12832、12842至13201、13949至14308、14318至14677、14687至15046、15056至15415、15425至15784、15794至16153、13211至13570、13580至13939、16163至16522、16532至16891、16901至17260、17270至17629、17639至17998、18008至18367、18377至18736、18746至19105、19115至19474、19484至19843、21415至21480、21561至21626、21489至21552、21635至21698(编码第一方面中定义的RSV F)的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人工RNA，至少一个与选自SEQ ID NO：9693至10052、19853至20212、21481、21482、21627、21628、21553、21554、21699、21700(编码RSV M)的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的其他人工RNA，与选自SEQ ID NO：10646至11005、20591至20950、21485、21486、21631、21632、21557、21558、21703、21704(编码RSV P)的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的其他人工RNA，和与选自SEQ ID NO：10143至10502、20222至20581、21483、21484、21629、21630、21555、21556、21701、21702(编码RSV N)的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的其他人工RNA；或
-至少一种与选自SEQ ID NO：78至86、21415至21417、21561至21563、474至482、11735至11742、21489、21490、21635、21636、12087至12094、493至501、21418至21420、21564至21566、889至897、12104至12111、21491、21492、21637、21638、12456至12463、907至914、21421至21423、21567至21569、1259至1266、12473至12480、21493至21495、21639至21641、12825至12832、1276至1283、21424至21426、21570至21572、1628至1635、12842至12849、21496至21498、21642至21644、13194至13201、1645至1652、21433至21435、21579至21581、1997至2004、13949至13956、21505至21507、21651至21653、14301至14308、2014至2021、21436至21438、21582至21584、2366至2373、14318至14325、21508至21510、21654至21656、14670至14677、2383至2390、21439至21441、21585至21587、2735至2742、14687至14694、21511至21513、21657至21659、15039至15046、2752至2759、21442至21444、21588至21590、3104至3111、15056至15063、21514至21516、21660至21662、15408至15415、3121至3128、21445至21447、21591至21593、3473至3480、15425至15432、21517至21519、21663至21665、15777至15784、3490至3497、21448至21450、21594至21596、3842至3849、15794至15801、21520至21522、21666至21668、16146至16153、3859至3866、21427至21429、21573至21575、4211至4218、13211至13218、21499至21501、21645至21647、13563至13570、4228至4235、21430至21432、21576至21578、4580至4587、13580至13587、21502至21504、21648至21650、13932至13939、4597至4604、21451至21453、21597至21599、4949至4956、16163至16170、21523至21525、21669至21671、16515至16522、4966至4973、21454至21456、21600至21602、5318至5325、16532至16539、21526至21528、21672至21674、16884至16891、5335至5342、21457至21459、21603至21605、5687至5694、16901至16908、21529至21531、21675至21677、17253至17260、5704至5711、21460至21462、21606至21608、6056至6063、17270至17277、21532至21534、21678至21680、17622至17629(编码第一方面中定义的RSV F)的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人工RNA，和至少一个与选自SEQ ID NO：11192至11551、20960至21319、21487、21488、21633、21634、21559、21560、21705、21706(编码RSV M2-1)的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的其他人工RNA，
其中任选地至少一个或多于一个，或其中所有尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸置换。
在不同的实施方案中，组合物中适当包含不同组合的RSV(F0、F-del、F0_DSCav1、F-del_DSCav1、F_DSCav1_mut0、F-del_DSCav1_mut0、F_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut2、F_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut3、F_DSCav1_mut4、F-del_DSCav1_mut4、F_DSCav1_mut5、F-del_DSCav1_mut5、F_DSCav1_mut6、F-del_DSCav1_mut6、F_DSCav1_mut7、F-del_DSCav1_mut7、F_DSCav1_mut8、F-del_DSCav1_mut8)RNA构建体和RSV T细胞抗原RNA构建体(RSV M、N、M2-1或P)(如表7B中公开；组合1至64)。组合49至64是优选的，组合64是特别优选的。
表7B：编码RSV F的RNA构建体和编码T细胞抗原的RNA构建体的合适组合
Figure BPA0000294887150001231
Figure BPA0000294887150001241
Figure BPA0000294887150001251
表7B公开了第二方面的组合物，其包含至少一种来自第一方面所定义的病毒株A2的编码RSV F的RNA，以及至少一种其他人工RNA，其包含至少一个编码序列，该编码序列编码至少一种选自病毒株A2的RSV衍生的抗原肽或蛋白，所述抗原肽或蛋白选自基质蛋白M、核蛋白N、M2-1蛋白、磷蛋白P。在本发明的其他实施方案中，表7B中所有公开的组合物也适用于衍生自RSV分离株Memphis-37(病毒株Memphis-37)的抗原肽或蛋白。
在特别优选的实施方案中，组合物包含一种RSV F RNA构建体(F0、F-del、F0_DSCav1、F-del_DSCav1、F_DSCav1_mut0、F-del_DSCav1_mut0、F_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut2、F_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut3、F_DSCav1_mut4、F-del_DSCav1_mut4、F_DSCav1_mut5、F-del_DSCav1_mut5、F_DSCav1_mut6、F-del_DSCav1_mut6、F_DSCav1_mut7、F-del_DSCav1_mut7、F_DSCav1_mut8、F-del_DSCav1_mut8)，以及一种RSV M2-1 RNA构建体，优选F-del_DSCav1_mut5和M2-1。
在特别优选的实施方案中，本发明的组合物包含一种编码RSV F的RNA构建体，其选自SEQ ID NO：5704至5711、21460至21462、21606至21608、17270至17277、21532至21534、21678至21680，和一种编码M2-1的RNA构建体，其选自SEQ ID NO：11192至11199、21487、21488、21633、21634、20960至20967、21559、21560、21705、21706。
在不同的实施方案中，第一方面的至少一种人工RNA和本文指定的至少一种其他人工RNA衍生自相同的RSV病毒(例如，选自列表1的任何病毒)。
在优选的实施方案中，第一方面的至少一种人工RNA衍生自HRSV(A2)，并且本文指定的至少一种其他人工RNA衍生自HRSV(A2)。
在优选的实施方案中，第一方面的至少一种人工RNA衍生自HRSV(Memphis-37)，并且本文指定的至少一种其他人工RNA衍生自HRSV(Memphis-37)。
应当理解，在本发明的上下文中，编码序列的某些组合可以通过单顺反子、双顺反子和多顺反子人工核酸和/或多抗原构建体/核酸的任意组合产生，以获得编码如本文定义的多种抗原肽或蛋白的核酸组合物。
此外，也可以使用适合于对人施用的一种或多于一种相容的固体或液体填充剂或稀释剂或封装化合物。如本文所使用的术语“相容”是指组合物的成分能够以不发生相互作用的方式与组合物的至少一种RNA和任选的其他人工RNA混合，因为相互作用在典型的使用条件下会显著降低组合物的生物学活性或药物效力。药学上可接受的载体、填充剂和稀释剂必须具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使其适于施用于待治疗的人。可用作药学上可接受的载体、填充剂或其成分的化合物是糖类，例如乳糖、葡萄糖、海藻糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉或马铃薯淀粉；右旋糖；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、乙酸纤维素；粉末状黄芪胶；麦芽；明胶；牛脂；固体助流剂，例如硬脂酸、硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，例如聚丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸。
可以包含在组合物中的其他添加剂是乳化剂，例如吐温；润湿剂，例如月桂基硫酸钠；着色剂；增味剂、药物载体；片剂形成剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂。
复合作用：
在第二方面的优选实施方案中，第一方面的至少一种人工RNA和第二方面的其他人工RNA与一种或多于一种阳离子或聚阳离子化合物、优选阳离子或聚阳离子聚合物、阳离子或聚阳离子多糖、阳离子或聚阳离子脂质、阳离子或聚阳离子蛋白、阳离子或聚阳离子肽或其任何组合复合或缔合或至少部分复合或部分缔合。
如本文所使用的术语“阳离子或聚阳离子化合物”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在表示带电荷的分子，其在pH值约1至9、pH值约3至8、pH值约4至8、pH值约5至8、更优选pH值约6至8、甚至更优选pH值约7至8、最优选在生理pH例如约7.2至约7.5下带正电荷。因此，阳离子组分，例如阳离子肽、阳离子蛋白、阳离子聚合物、阳离子多糖、阳离子脂质可以是在生理条件下带正电荷的任何带正电荷的化合物或聚合物。“阳离子或聚阳离子肽或蛋白”可包含至少一种带正电荷的氨基酸，或多于一种带正电荷的氨基酸，例如选自Arg、His、Lys或Orn。因此，“聚阳离子”组分也落入在给定条件下表现出多于一个正电荷的范围。
在本文中特别优选的阳离子或聚阳离子化合物可以选自以下阳离子或聚阳离子肽或蛋白或其片段：鱼精蛋白、核仁蛋白、精胺或亚精胺、或其他阳离子肽或蛋白例如聚L-赖氨酸(PLL)、聚精氨酸、碱性多肽、细胞穿透肽(CPP)，包括HIV结合肽、HIV-1Tat(HIV)、Tat衍生肽、穿膜肽、VP22衍生或类似肽、HSV VP22(单纯疱疹)、MAP、KALA或蛋白转导域(PTD)、PpT620、富含脯氨酸的肽、富含精氨酸的肽、富含赖氨酸的肽、MPG肽、Pep-1、L-寡聚物、降钙素肽、触角足动物衍生的肽、pAntp、pIs1、FGF、乳铁蛋白、转运素、抗菌肽-2、Bac715-24、SynB、SynB(1)、pVEC、hCT衍生肽、SAP或组蛋白。更优选地，本文定义的核酸，优选本文定义的mRNA，与一种或多于一种聚阳离子，优选与鱼精蛋白或寡转染胺，最优选与鱼精蛋白复合。
在第二方面的一个优选实施方案中，将第一方面的至少一种人工RNA和任选的第二方面的其他人工RNA与鱼精蛋白复合。
可用作转染或复合剂的其他优选的阳离子或聚阳离子化合物可包括阳离子多糖，例如壳聚糖、凝聚胺等；阳离子脂质，例如DOTMA、DMRIE、二-C14-脒、DOTIM、SAINT、DC-胆固醇、BGTC、CTAP、DOPC、DODAP、DOPE：二油酰基磷脂酰乙醇胺、DOSPA、DODAB、DOIC、DMEPC、DOGS、DIMRI、DOTAP、DC-6-14、CLIP1、CLIP6、CLIP9、oligofectamine；或阳离子或聚阳离子聚合物，例如改性的聚氨基酸，例如β-氨基酸聚合物或反向聚酰胺等，改性的聚乙烯，例如PVP等，改性的丙烯酸酯，如pDMAEMA等；改性的酰胺基胺，如pAMAM等；改性的聚β氨基酯(PBAE)，如二胺端改性的1，4丁二醇二丙烯酸酯-co-5-氨基-1-戊醇聚合物等，树枝状大分子，例如聚丙胺树枝状大分子或基于pAMAM的树枝状大分子等；聚亚胺，例如PEI，聚(丙烯亚胺)等；聚烯丙胺；糖骨架型聚合物，例如基于环糊精的聚合物、基于右旋糖酐的聚合物等，基于硅烷骨架的聚合物，例如PMOXA-PDMS共聚物等，由一种或多于一种阳离子嵌段(例如选自上述阳离子聚合物)和一种或多于一种亲水或疏水嵌段(例如聚乙二醇)的组合组成的嵌段聚合物等。
在这种情况下，特别优选将本文定义的至少一种人工RNA和任选的第二方面的其他人工RNA与阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合物载体优选阳离子蛋白或肽复合或至少部分复合。在这种情况下，WO2010/037539和WO2012/113513的公开内容通过引用并入本文。部分复合是指仅一部分人工核酸与阳离子化合物复合，而其余的人工核酸(包含在本发明的(药物)组合物中)为未复合形式(“游离”)。
在第二方面的一个优选实施方案中，将第一方面的至少一种人工RNA和任选的第二方面的其他人工RNA与一种或多于一种阳离子或聚阳离子化合物，优选鱼精蛋白，和第一方面的至少一种游离人工RNA，以及任选的第二方面的其他RNA复合。
在这种情况下，特别优选将本文定义的至少一种人工RNA和任选的第二方面的其他人工RNA与鱼精蛋白复合或至少部分复合。优选地，核酸，特别是复合鱼精蛋白的RNA的RNA与游离RNA的摩尔比可以选自约0.001∶1至约1∶0.001的摩尔比，包括约1∶1的比。合适地，通过以2∶1的RNA∶鱼精蛋白重量与重量比(w/w)将鱼精蛋白-海藻糖溶液添加到RNA样品中来将复合的RNA与鱼精蛋白复合。
可用于复合的其他优选的阳离子或聚阳离子蛋白或肽可衍生自专利申请WO2009/030481或WO2011/026641的式(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x，与之相关的WO2009/030481或WO2011/026641的公开内容通过引用并入本文。
在第二方面的一个优选实施方案中，第一方面的至少一种人工RNA和任选的第二方面的其他人工RNA与至少一种优选选自SEQ ID NO：64至67、21320或其任何组合的阳离子或聚阳离子蛋白或肽复合或至少部分复合。
根据实施方案，本发明的组合物包含本文定义的RNA和聚合物载体。
如本文所使用的术语“聚合物载体”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在表示促进另一种化合物(货物)的运输和/或复合的化合物。聚合物载体通常是由聚合物形成的载体。聚合载体可以通过共价或非共价相互作用与其货物(核酸、RNA)结合。
合适的聚合物载体可以是由二硫化物交联的阳离子化合物形成的聚合物载体。二硫键交联的阳离子化合物可以彼此相同或不同。聚合物载体还可包含其他组分。根据本发明使用的聚合物载体可以包含阳离子肽、蛋白或聚合物以及任选的如本文所定义的其他成分的混合物，它们通过二硫键(经由-SH基团)交联。
在这种情况下，优选专利申请WO2012/013326的根据式{(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa’)x(Cys)y}和式Cys，{(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x}Cys2的聚合物载体，与之相关的WO2012/013326的公开内容通过引用并入本文。
在实施方案中，本文定义的用于复合RNA的聚合物载体可以衍生自专利申请WO2011/026641的式(L-P1-S-[S-P2-S]n-S-P3-L)的聚合物载体分子，与之相关的WO2011/026641的公开内容通过引用并入本文。
在实施方案中，聚合物载体化合物由肽元件CysArg12Cys(SEQ ID NO：64)或CysArg12(SEQ ID NO：65)或TrpArg12Cys(SEQ ID NO：66)形成，或包含或组成为肽元件CysArg12Cys(SEQ ID NO：64)或CysArg12(SEQ ID NO：65)或TrpArg12Cys(SEQ ID NO：66)。在特别优选的实施方案中，聚合物载体化合物由(R12C)-(R12C)二聚体，(WR12C)-(WR12C)二聚体或(CR12)-(CR12C)-(CR12)三聚体组成，其中二聚体中的各个肽元件(例如(WR12C))或三聚体中的各个肽元件(例如(CR12))通过-SH基团连接。
在第二方面的一个优选实施方案中，第一方面的至少一种人工RNA和任选的第二方面的其他人工RNA与包含HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)7-S-PEG5000-OH(SEQ ID NO：67作为肽单体)的聚乙二醇/肽聚合物复合或缔合。
在第二方面的又一个优选实施方案中，第一方面的至少一种人工RNA和任选的第二方面的其他人工RNA与包含HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)4-S-PEG5000-OH(SEQ ID NO：67作为肽单体)的聚乙二醇/肽聚合物复合或缔合。
在第二方面的又一个优选实施方案中，第一方面的至少一种人工RNA和任选的第二方面的其他人工RNA与包含HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)7-S-PEG5000-OH(SEQ ID NO：21320作为肽单体)的聚乙二醇/肽聚合物复合或缔合。
在第二方面的又一个优选实施方案中，第一方面的至少一种人工RNA和任选的第二方面的其他人工RNA与包含HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)4-S-PEG5000-OH(SEQ ID NO：21320作为肽单体)的聚乙二醇/肽聚合物复合或缔合。
在其他实施方案中，组合物包含至少一种本文所述的人工RNA和任选的第二方面的其他人工RNA，其中至少一种人工RNA和任选的第二方面的其他人工RNA与聚合物载体以及任选的与至少一种脂质组分复合或缔合，如公开的PCT申请WO2017/212008A1、WO2017/212006A1、WO2017/212007A1和WO2017/212009A1中所述。在这种情况下，通过引用将WO2017/212008A1、WO2017/212006A1、WO2017/212007A1和WO2017/212009A1的公开内容并入本文。
在特别优选的实施方案中，聚合物载体是肽聚合物，优选如上定义的聚乙二醇/肽聚合物，和脂质组分，优选脂质体组分，更优选脂质体组分。
在第二方面的优选实施方案中，第一方面的至少一种人工RNA和任选的第二方面的其他人工RNA与聚合物载体，优选与如上定义的聚乙二醇/肽聚合物以及脂质体组分复合或缔合，其中脂质体组分是根据式A的化合物
Figure BPA0000294887150001301
其中
-每个出现的RA独立地选择未经取代的、环状或无环的、带支链或不带支链的C1-20脂肪族基团；经取代或未经取代的、环状或无环的、带支链或不带支链的C1-20杂脂肪族基团；经取代或未经取代的芳基；经取代或未经取代的杂芳基；
Figure BPA0000294887150001311
其中至少一个RA是
Figure BPA0000294887150001312
-每个出现的R5独立地选自未经取代的、环状或无环的、带支链或不带支链的C8-16脂肪族基团；经取代或未经取代的芳基；或经取代或未经取代的杂芳基；
-每个出现的x是1至10的整数；
-每个出现的y是1至10的整数；
或其药学上可接受的盐。
在一个优选的实施方案中，脂质体组分为根据式B的3-C12-OH
Figure BPA0000294887150001313
在优选的实施方案中，包含上述脂质体3-C12-OH的肽聚合物用于复合第一个方面的RNA以及任选的第二个方面的其他人工RNA，以形成N/P比约0.1至约20、或约0.2至约15、或约2至约15、或约2至约12的复合物，其中N/P比定义为阳离子肽或聚合物的碱性基团的氮原子与人工核酸的磷酸基团的摩尔比。在这种情况下，WO2017/212009A1的公开内容，特别是WO2017/212009A1的权利要求1至10，以及与之有关的具体公开内容通过引用并入本文。
LNP中的封装/复合：
在第二方面优选的实施方案中，第一方面的人工RNA和任选的第二方面的其他人工RNA与一种或多于一种脂质(例如阳离子脂质和/或中性脂质)复合或缔合，从而形成脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质复合物和/或纳米脂质体。
对于包含多于一种本文定义的人工RNA构建体(例如，F-del和M2-1)的组合物，可以在例如LNP中共配制所述构建体以形成相应的组合物。
或者，可以单独配制所述多于一种的人工RNA构建体，然后可以将其组合以形成相应的组合物。
在这种情况下，术语“复合”或“缔合”是指第一方面的人工RNA和任选的第二方面的其他人工RNA与一种或多于一种脂质的基本稳定的组合，成为没有共价结合的更大的复合物或组装体。
术语“脂质纳米颗粒”，也称为“LNP”，不限于任何特定的形态，并且包括在例如含水环境中和/或在RNA的存在下当阳离子脂质和任选的一种或多于一种其他脂质结合时产生的任何形态。例如，脂质体、脂质复合物、脂复合体等在脂质纳米颗粒(LNP)的范围内。
因此，在第二方面优选的实施方案中，将第一方面的人工RNA以及任选的第二方面的其他人工RNA与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)。
LNP通常包含阳离子脂质和一种或多于一种选自中性脂质、带电脂质、类固醇和聚合物缀合脂质(例如聚乙二醇化脂质)的赋形剂。RNA可以被包封在LNP的脂质部分或被LNP的一些或整个脂质部分包围的水性空间中。RNA或其一部分也可以与LNP缔合并复合。LNP可以包含能够形成颗粒的任何脂质，核酸附着于颗粒上或一个或多于一个核酸封装在颗粒中。优选地，包含LNP的核酸包含一种或多于一种阳离子脂质和一种或多于一种稳定脂质。稳定脂质包括中性脂质和聚乙二醇化脂质。
LNP的阳离子脂质可以是可阳离子化的，即当pH降低到脂质的可电离基团的pK以下时，它会质子化，但它在较高的pH值下逐渐变为中性。在低于pK的pH值下，脂质能够与带负电荷的核酸缔合。在一些实施方案中，阳离子脂质包括两性离子脂质，该两性离子脂质在pH降低时呈现正电荷。
LNP可包含任何其他阳离子或可阳离子化的脂质，即在选择的pH例如生理pH下带有净正电荷的多种脂质中的任何一种。
此类脂质包括但不限于：N，N-二油酰基-N，N-二甲基氯化铵(DODAC)、N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化铵(DDAB)、1，2-二油酰基三甲基丙烷氯化铵(DOTAP)(也称为N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵和1，2-二油酰氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐)、N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N，N-二甲基-2，3-二油酰氧基)丙胺(DODMA)、1，2-二亚油酰氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1，2-二亚油酰氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1，2-二-γ-亚油酰氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(γ-DLenDMA)、1，2-二亚油酰氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1，2-二油酰氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1，2-二油酰氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1，2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1，2-二亚油酰基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1，2-二亚油酰氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1，2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1，2-二亚油酰氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N，N-二亚油酰基氨基)-1，2-丙二醇(DLinAP)、3-(N，N-二油酰氨基)-1，2-丙二醇(DOAP)、1，2-二亚油酰氧基-3-(2-N，N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DM A)、2，2-二亚油酰基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR，5s，6aS)-N，N-二甲基-2，2-二((9Z，12Z)-十八-9，12-二烯基)四氢-3aH-环戊二烯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-胺、(6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七-6，9，28，31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)、1，1′-(2-(4-(2-((2-(双(2-(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮杂二基)双十二-2-醇(C12-200)、2，2-二亚油酰基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-C2-DMA)、2，2-二亚油酰基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、3-((6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七-6，9，28，31-四烯-19-基氧)-N，N-二甲基丙-1-胺(MC3醚)、4-((6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七-6，9，28，31-四烯-19-基氧)-N，N-二甲基丁-1-胺(MC4醚)、
Figure BPA0000294887150001341
(可从纽约州格兰德岛的GIBCO/BRL商购获得的阳离子脂质体，其包含DOTMA和1，2-二油酰基-sn-3磷酸乙醇胺(DOPE))；
Figure BPA0000294887150001342
(可从GIBCO/BRL商购获得的阳离子脂质体，其包含N-(1-(2，3-二油酰氧基丙基)-N-(2-(精胺羧酰胺基)乙基)-N，N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)和(DOPE))；和
Figure BPA0000294887150001343
(可从威斯康星州麦迪逊市的Promega Corp.商购获得的阳离子脂质，其包含在乙醇中的二十八烷基酰氨基甘氨酰基羧基精胺(DOGS))或上述的任意组合。
在一些实施方案中，脂质选自98N12-5、C12-200和ckk-E12。
在一个实施方案中，其他阳离子脂质是氨基脂质。
代表性的氨基脂质包括但不限于：1，2-二亚油酰氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1，2-二亚油酰氧基-3吗啉基丙烷(DLin-MA)、1，2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1，2-二亚油酰基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1，2-二亚油酰氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1，2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1，2-二亚油酰氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N，N二亚油酰氨基)-1，2-丙二醇(DLinAP)、3-(N，N-二油酰氨基)-1，2-丙二醇(DOAP)、1，2-二亚油酰氧基-3-(2-N，N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、和2，2-二亚油酰基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、2，2-二亚油酰基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)；二亚油酰基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)；MC3(US20100324120)。
在一个实施方案中，可以将第一方面的人工RNA和任选的第二方面的其他人工RNA配制为氨基醇类脂质体。可用于本发明的氨基醇类脂质可以通过美国专利第8450298号中描述的方法制备，其通过引用整体并入本文。合适的(可电离的)脂质也可以是如表1、表2和表3中所公开的以及如WO2017/075531A1的权利要求1至24中所定义的化合物，其通过引用并入本文。
在另一个实施方案中，可电离的脂质也可以是如WO2015/074085A1(即ATX-001至ATX-032或权利要求1至26所述的化合物)、美国专利申请第61/905724号和第15/614499号或美国专利第9593077号和第9567296号中公开的化合物，其全部内容通过引用并入本文。
在这种情况下，可以适当地使用衍生自通式(X1)的任何脂质
Figure BPA0000294887150001351
其中，R1和R2相同或不同，各自为由1个至9个碳组成的直链或带支链的烷基，由2个至11个碳组成的烯基或炔基，L1和L2相同或不同，分别为5个至18个碳原子的直链亚烷基或亚烯基或与N形成杂环，X1是一个键，或是-CO-O-，从而形成-L2-CO-O-R2，X2是S或O，L3是一个键或由1个至6个碳组成的直链或带支链的亚烷基，或与N形成一个杂环，R3是由1个至6个碳组成的直链或带支链的亚烷基，R4和R5相同或不同，各自为氢或由1个至6个碳组成的直链或带支链的烷基；或其药学上可接受的盐。
在其他实施方案中，合适的阳离子脂质也可以是在WO2017/117530A1中公开的化合物(即脂质13、14、15、15、16、17、18、19、20或在权利要求中指定的化合物)，在此通过引用整体并入本文。
在这种情况下，衍生自通式(X2)的任何脂质
Figure BPA0000294887150001352
其中
X是直链或带支链的亚烷基或亚烯基，单环、双环或三环的芳基或杂亚芳基；
Y是键、乙烯、或未经取代或经取代的芳香族或杂芳香族环；Z为S或O；
L为1个至6个碳的直链或带支链的亚烷基；
R3和R4独立地是1个至6个碳的直链或带支链的烷基；
R1和R2独立地为1个至20个碳的直链或带支链的烷基或烯基；r为0至6；且
m、n、p和q独立地为1至18；
其中，当n＝q、m＝p且R1＝R2时，X和Y不同；
其中，当X＝Y、n＝q、m＝p时，R1和R2不同；
其中，当X＝Y、n＝q、R1＝R2时，m和p不同；并且
其中，当X＝Y、m＝p且R1＝R2时，n和q不同；
或其药学上可接受的盐。
在优选的实施方案中，可以使用衍生自式(X2)的脂质，其中X为键、直链或带支链的亚烷基、亚烯基或单环、双环或三环的芳基或杂芳基；Y是单环、双环或三环芳基或杂芳基；Z为S或O；L为1个至6个碳的直链或带支链的亚烷基；R3和R4独立地是1个至6个碳的直链或带支链的烷基；R1和R2独立地为1个至20个碳的直链或带支链的烷基或烯基；r为0至6；m、n、p和q分别为1至18；或其药学上可接受的盐可以合适地使用。
在优选的实施方案中，可电离的脂质也可以选自PCT申请第PCT/EP2017/077517号中公开的脂质化合物(例如衍生自PCT/EP2017/077517的式I、II和III的脂质化合物，或PCT/EP2017/077517的权利要求1至12所述的脂质化合物)，PCT/EP2017/077517的公开内容通过引用整体并入本文。在这种情况下，PCT/EP2017/077517的表7中公开的脂质化合物(例如衍生自式I-1至I-41的脂质化合物)和PCT/EP2017/077517的表8中公开的脂质化合物(例如衍生自式II-1至II-36的脂质化合物)可适合用于本发明的情况。因此，PCT/EP2017/077517的式I-1至式I-41和式II-1至式II-36以及与之相关的具体公开内容通过引用并入本文。
在第二方面的特别优选的实施方案中，合适的脂质可以是根据式(III)的阳离子脂质
Figure BPA0000294887150001371
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中，R1、R2、R3、L1、L2、G1、G2和G3如下。
式(III)的还定义为：
L1或L2之一为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，L1或L2的另一个为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接键合；
G1和G2各自独立地为未经取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；
G3为C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1和R2各自独立地为C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3为H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；
R4是C1-C12烷基；
R5是H或C1-C6烷基；并且
x为0、1或2。
在式(III)的前述某些实施方案中，脂质具有以下结构(IIIA)或(IIIB)之一：
Figure BPA0000294887150001372
其中：
A为3元至8元的环烷基或亚环烷基；在每次出现时，R6独立地为H、OH或C1-C24烷基；n为1至15的整数。
在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有结构(IIIA)，在其他实施方案中，脂质具有结构(IIIB)。
在式(III)的其他实施方案中，脂质具有以下结构(IIIC)或(IIID)之一：
Figure BPA0000294887150001381
其中y和z各自独立地是1至12的整数。
在式(III)的任何前述实施方案中，L1或L2之一是-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L1和L2各自为-O(C＝O)-。在前述任一项的一些不同实施方案中，L1和L2各自独立地为-(C＝O)O-或-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L1和L2各自为-(C＝O)O-。
在第二方面的优选实施方案中，LNP的阳离子脂质是式III的化合物，其中：
L1和L2各自独立地为-O(C＝O)-或(C＝O)-O-；
G3为C1-C24亚烷基或C1-C24亚烯基；和
R3为H或OR5。
在式(III)的一些不同实施方案中，脂质具有以下结构(IIIE)或(IIIF)之一：
Figure BPA0000294887150001382
在式(III)的前述某些实施方案中，脂质具有以下结构(IIIG)、(IIIH)、(IIII)或(IIIJ)之一：
Figure BPA0000294887150001391
在式(III)的前述某些实施方案中，n是2至12、例如2至8或2至4的整数。在一些实施方案中，n为3、4、5或6。在一些实施方案中，n为3。在一些实施方案中，n为4。在一些实施方案中，n为5。在一些实施方案中，n为6。在式(III)的前述实施方案的一些其他实施方案中，y和z各自独立地为2至10的整数。例如，在一些实施方案中，y和z各自独立地是4至9或4至6的整数。在式(III)的前述实施方案的一些实施方案中，R6是H。在其他前述实施方案中，R6为C1-C24烷基。在其他实施方案中，R6为OH。在式(III)的一些实施方案中，G3是未经取代的。在其他实施方案中，G3被取代。在不同的实施方案中，G3为直链的C1-C24亚烷基或直链的C1-C24亚烯基。在式(III)的其他前述实施方案中，R1或R2或两者为C6-C24烯基。例如，在一些实施方案中，R1和R2各自独立地具有以下结构：
Figure BPA0000294887150001392
其中：
每个出现的R7a和R7b独立地为H或C1-C12烷基；a为2至12的整数，其中分别选择R7a、R7b和a以使R1和R2各自独立地包含6个至20个碳原子。例如，在一些实施方案中，a为5至9或8至12的整数。在式(III)的前述某些实施方案中，出现的至少一个R7a为H。例如，在一些实施方案中，每个出现的R7a为H。在前述的其他不同实施方案中，出现的至少一个R7b为C1-C8烷基。例如，在一些实施方案中，C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在式(III)的不同实施方案中，R1或R2或两者具有以下结构之一：
Figure BPA0000294887150001401
在第二方面的优选实施方案中，LNP的阳离子脂质是式III的化合物，其中：
L1和L2各自独立地为-O(C＝O)-或(C＝O)-O-；且
R1和R2各自独立地具有以下结构之一：
Figure BPA0000294887150001402
在式(III)的一些前述实施方案中，R3为OH、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NHC(＝O)R4。在一些实施方案中，R4为甲基或乙基。
在第二方面的优选实施方案中，LNP的阳离子脂质是式III的化合物，其中R3为OH。
在第二方面的一个特别优选的实施方案中，将第一方面的人工RNA以及任选的第二方面的其他人工RNA与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，其中LNP选自结构III-1至III-36(参见表8)。
表8衍生自式(III)的代表性脂质化合物
Figure BPA0000294887150001411
Figure BPA0000294887150001421
Figure BPA0000294887150001431
Figure BPA0000294887150001441
Figure BPA0000294887150001451
在一些实施方案中，LNP包含式(III)的脂质、第一方面的人工RNA和任选地第二方面的其他人工RNA，以及一种或多于一种选自中性脂质、类固醇和聚乙二醇化脂质的赋形剂。在一些实施方案中，式(III)的脂质是化合物III-3。在一些实施方案中，式(III)的脂质是化合物III-7。
在优选的实施方案中，LNP包含选自以下的阳离子脂质：
Figure BPA0000294887150001452
Figure BPA0000294887150001461
在第二方面的一个特别优选的实施方案中，将第一方面的人工RNA以及任选地第二方面的其他人工RNA与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，其中LNP包含以下阳离子脂质(根据表8的式III-3的脂质)：
Figure BPA0000294887150001462
在某些实施方案中，本文所定义的阳离子脂质，优选如表8中所公开，更优选阳离子脂质化合物III-3，相对于LNP的总脂质含量以约30摩尔％至约95摩尔％的量存在于LNP中。如果在LNP中掺入一种以上的阳离子脂质，则这些百分比适用于组合的阳离子脂质。
在一个实施方案中，阳离子脂质在LNP中的存在量为约30摩尔％至约70摩尔％。在一个实施方案中，阳离子脂质在LNP中的存在量为约40摩尔％至约60摩尔％，例如分别为约40摩尔％、41摩尔％、42摩尔％、43摩尔％、44摩尔％、45摩尔％、46摩尔％、47摩尔％、48摩尔％、49摩尔％、50摩尔％、51摩尔％、52摩尔％、53摩尔％、54摩尔％、55摩尔％、56摩尔％、57摩尔％、58摩尔％、59摩尔％或60摩尔％。在实施方案中，阳离子脂质在LNP中的存在量为约47摩尔％至约48摩尔％，例如分别为约47.0摩尔％、47.1摩尔％、47.2摩尔％、47.3摩尔％、47.4摩尔％、47.5摩尔％、47.6摩尔％、47.7摩尔％、47.8摩尔％、47.9摩尔％、50.0摩尔％，其中47.7摩尔％是特别优选的。
在一些实施方案中，阳离子脂质以LNP中存在的总脂质的约20摩尔％至约70摩尔％或75摩尔％或约45摩尔％至约65摩尔％或约20摩尔％、25摩尔％、30摩尔％、35摩尔％、40摩尔％、45摩尔％、50摩尔％、55摩尔％、60摩尔％、65摩尔％或约70摩尔％的比例存在。在其他实施方案中，基于阳离子脂质的摩尔量(基于脂质纳米颗粒中脂质的100％总摩尔)，LNP占阳离子脂质的摩尔量的约25％至约75％，例如约20％至约70％，约35％至约65％，约45％至约65％，约60％，约57.5％，约57.1％，约50％或约40％。在一些实施方案中，阳离子脂质相对于核酸，优选相对于第一方面的人工RNA，以及任选地第二方面的其他人工RNA的比例为约3至约15，例如约5至约13或约7至约11。
在本发明的一些实施方案中，LNP包括上述任何脂质的组合或混合物。
其他合适的(阳离子)脂质公开于WO2009/086558、WO2009/127060、WO2010/048536、WO2010/054406、WO2010/088537、WO2010/129709、WO2011/153493、US201I/0256175、US2012/0128760、US2012/0027803、US8158601、WO2016/118724、WO2016/118725、WO2017/070613、WO2017/070620、WO2017/099823和WO2017/112865。在这种情况下，WO2009/086558、WO2009/127060、WO2010/048536、WO2010/054406、WO2010/088537、WO2010/129709、WO2011/153493、US201I/0256175、US2012/0128760、US2012/0027803、US8158601、WO2016/118724、WO2016/118725、WO2017/070613、WO2017/070620、WO2017/099823和WO2017/112865的公开内容特别涉及适合于LNP的(阳离子)脂质，通过引用并入本文。
在一些实施方案中，脂质选自98N12-5、C12-200和ckk-E12。
在一些实施方案中，本文定义的氨基或阳离子脂质具有至少一个可质子化或可去质子化的基团，使得脂质在等于或低于生理pH(例如pH 7.4)的pH下带正电荷，并且在第二pH，优选等于或高于生理pH的条件下呈中性。当然，应当理解，质子随pH的增加或减少的变化是平衡过程，并且提及带电荷或中性脂质是指主要种类的性质，不需要所有脂质都必须以带电荷或中性形式存在。不排除具有多于一个可质子化或可去质子化基团或两性离子基团的脂质，它们同样适用于本发明。
在一些实施方案中，可质子化脂质的可质子化基团的pKa为约4至约11，例如pKa约5至约7。
LNP可以包含两种或多于两种(不同的)阳离子脂质。可以选择阳离子脂质以贡献不同的有利性质。例如，LNP中可以使用性质不同的阳离子脂质，例如胺pKa、化学稳定性、循环半衰期、组织半衰期、组织净积累或毒性。特别地，可以选择阳离子脂质，使得混合LNP的性质比具有单个脂质的单个LNP的性质更理想。
可以考虑核酸货物的量来选择永久性阳离子脂质或类脂质的量。在一个实施方案中，选择这些量以使得纳米颗粒或组合物的N/P比为约0.1至约20。在这种情况下，N/P比定义为脂质或类脂质的碱性含氮基团的氮原子(“N”)与用作货物的RNA的磷酸基团(“P”)的摩尔比。可以基于例如1μgRNA通常包含约3nmol磷酸残基的条件来计算N/P比，只要该RNA表现出碱基的统计分布即可。脂质或类脂质的“N”值可基于其分子量和永久性阳离子基团和如果存在的话可阳离子化基团的相对含量进行计算。
可通过向LNP表面添加亲水性聚合物涂层，例如聚乙二醇(PEG)来修改LNP的体内特性和行为，以赋予空间稳定性。此外，通过将配体(例如抗体、肽和碳水化合物)附着于LNP的表面或所附着的PEG链的末端(例如经由聚乙二醇化脂质)，LNP可用于特异性靶向。
在一些实施方案中，LNP包含聚合物缀合脂质。术语“聚合物缀合脂质”是指既包含脂质部分又包含聚合物部分的分子。聚合物缀合脂质的实例是聚乙二醇化脂质。术语“聚乙二醇化脂质”是指既包含脂质部分又包含聚乙二醇部分的分子。聚乙二醇化的脂质是本领域已知的，并且包括1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2，3-二肉豆蔻基甘油(PEG-s-DMG)等。
在一些实施方案中，LNP包含另外的稳定脂质，其是聚乙二醇脂质(聚乙二醇化脂质)。合适的聚乙二醇脂质包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油。代表性的聚乙二醇脂质包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA和PEG-s-DMG。在一个实施方案中，聚乙二醇脂质是N-[((甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1，2-二肉豆蔻基氧丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。在一个优选的实施方案中，聚乙二醇脂质是PEG-2000-DMG。在一个实施方案中，聚乙二醇脂质是PEG-c-DOMG。在其他实施方案中，LNP包括聚乙二醇化的二酰基甘油(PEG-DAG)，例如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2，3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)，聚乙二醇化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)，PEG琥珀酸二酰基甘油(PEG-S-DAG)，例如4-O-(2′，3′-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)，聚乙二醇化神经酰胺(PEG-cer)，或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯，例如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2，3二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2，3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。
在第二方面的优选实施方案中，将第一方面的人工RNA以及任选地第二方面的其他人工RNA与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，其中LNP还包含具有式(IV)的聚乙二醇化脂质：
Figure BPA0000294887150001491
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中R8和R9各自独立地是含有10个至30个碳原子的直链或带支链的饱和或不饱和烷基链，其中烷基链任选地被一个或多于一个酯键中断；w的平均值为30至60。
在根据式(IV)的聚乙二醇化脂质的前述一些实施方案中，当w为42时，R8和R9都不是正十八烷基。在一些其他的实施方案中，R8和R9各自独立地是含有10个至18个碳原子的直链或带支链的饱和或不饱和烷基链。在一些实施方案中，R8和R9各自独立地是含有12个至16个碳原子的直链或带支链的饱和或不饱和烷基链。在一些实施方案中，R8和R9各自独立地是含有12个碳原子的直链或带支链的饱和或不饱和烷基链。在一些实施方案中，R8和R9各自独立地是含有14个碳原子的直链或带支链的饱和或不饱和烷基链。在其他实施方案中，R8和R9各自独立地是含有16个碳原子的直链或带支链的饱和或不饱和烷基链。在更多实施方案中，R8和R9各自独立地是含有18个碳原子的直链或带支链的饱和或不饱和烷基链。在其他实施方案中，R8是含有12个碳原子的直链或带支链的饱和或不饱和烷基链，R9是含有14个碳原子的直链或带支链的饱和或不饱和烷基链。
在不同的实施方案中，w的选择范围使得根据式(IV)的聚乙二醇化脂质的PEG部分具有约400g/mol至约6000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，平均w约为50。
在第二方面的优选实施方案中，式(IV)的聚乙二醇化脂质的R8和R9为饱和烷基链。
在第二方面的一个特别优选的实施方案中，将第一方面的人工RNA以及任选地第二方面的其他人工RNA与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，其中LNP还包含聚乙二醇化脂质，其中聚乙二醇化脂质具有式(IVa)
Figure BPA0000294887150001501
其中n的平均值为30至60，例如约28至约32、约30至约34、32至约36、约34至约38、36至约40、约38至约42、40至约44、约42至约46、44至约48、约46至约50、48至约52、约50至约54、52至约56、约54至约58、56至约60、约58至约62。在优选的实施方案中，n为约45、46、47、48、49、50、51、52、53、54。在一个最优选的实施方案中，n的平均值为49。
在其他实施方案中，聚乙二醇化脂质具有以下结构之一：
Figure BPA0000294887150001502
其中n为整数，选择n以使聚乙二醇化脂质的平均分子量为约2500g/mol，最优选n为约49。
在US2015/0376115A1和WO2015/199952中提供了在该情况下合适的PEG-脂质的其他实例，其每一个均通过引用整体并入。
在一些实施方案中，基于LNP中脂质的总摩尔数，LNP包括少于约3摩尔％、2摩尔％或1摩尔％的PEG或PEG修饰的脂质。在其他实施方案中，LNP以摩尔计占PEG修饰的脂质的约0.1％至约20％，例如以摩尔计(基于LNP中脂质的100％总摩尔)约0.5％至约10％、约0.5％至约5％、约10％、约5％、约3.5％、约3％、约2.5％、约2％、约1.5％、约1％、约0.5％或约0.3％。在优选的实施方案中，LNP以摩尔计占PEG修饰的脂质的约1.0％至约2.0％，例如以摩尔计(基于LNP中脂质的100％总摩尔)约1.2％至约1.9％、约1.2％至约1.8％、约1.3％至约1.8％、约1.4％至约1.8％、约1.5％至约1.8％、约1.6％至约1.8％，特别为约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％，最优选1.7％。在不同的实施方案中，阳离子脂质与聚乙二醇化脂质的摩尔比为约100∶1至约25∶1。
在优选的实施方案中，LNP还包含一种或多于一种在颗粒形成期间稳定颗粒形成的脂质(例如中性脂质和/或一种或多于一种类固醇或类固醇类似物)。
在第二方面的优选实施方案中，将第一方面的人工RNA以及任选地第二方面的其他人工RNA与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，其中LNP另外包含一种或多于一种中性脂质和/或一种或多于一种类固醇或类固醇类似物。
合适的稳定脂质包括中性脂质和阴离子脂质。术语“中性脂质”是指在生理pH下以不带电或中性两性离子形式存在的多种脂质中的任何一种。代表性的中性脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷。
在第二方面的实施方案中，LNP另外包含一种或多于一种中性脂质，其中所述中性脂质选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰脂酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰脂酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1，2-二戊酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。
在一些实施方案中，LNP包含选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM的中性脂质。在不同的实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比为约2∶1至约8∶1。
在第二方面的优选实施方案中，中性脂质是1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。阳离子脂质与DSPC的摩尔比可以为约2∶1至8∶1。
在第二方面的优选实施方案中，类固醇是胆固醇。阳离子脂质与胆固醇的摩尔比可以为约2∶1至1∶1。
固醇可以为脂质颗粒的约10摩尔％至约60摩尔％或约25摩尔％至约40摩尔％。在一个实施方案中，固醇占脂质颗粒中总脂质的约10摩尔％、15摩尔％、20摩尔％、25摩尔％、30摩尔％、35摩尔％、40摩尔％、45摩尔％、50摩尔％、55摩尔％或约60摩尔％。在另一个实施方案中，基于阳离子脂质的摩尔量(基于脂质纳米颗粒中脂质的100％总摩尔)，LNP占固醇摩尔量的约5％至约50％，例如约15％至约45％，约20％至约40％，约48％，约40％，约38.5％，约35％，约34.4％，约31.5％或约31％。
优选地，脂质纳米颗粒(LNP)包含：(a)第一方面的至少一种人工RNA，和任选的第二方面的其他人工RNA，(b)阳离子脂质，(c)聚集减少剂(例如聚乙二醇(PEG)脂质或PEG修饰的脂质)，(d)任选地非阳离子脂质(例如中性脂质)，和(e)任选地固醇。
在其他优选的实施方案中，脂质纳米颗粒(LNP)包括：(a)至少一个编码第一方面的F或其衍生物或片段的人工RNA，以及至少一个编码第二方面的N、M、P或M2-1的人工RNA或其衍生物或片段，(b)阳离子脂质，(c)聚集减少剂(例如聚乙二醇(PEG)脂质或PEG修饰的脂质)，(d)任选地非阳离子脂质(例如中性脂质)，和(e)任选地固醇。
在一些实施方案中，LNP包含式(III)的脂质、本文定义的人工RNA、中性脂质、类固醇和聚乙二醇化脂质。在优选的实施方案中，式(III)的脂质为脂质化合物III-3，中性脂质为DSPC，类固醇为胆固醇，聚乙二醇化脂质为式(IVa)化合物。
在第二方面的一个优选实施方案中，LNP基本组成为(i)至少一种阳离子脂质；(ii)中性脂质；(iii)固醇，例如胆固醇；和(iv)PEG-脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，摩尔比为约20％至60％阳离子脂质：5％至25％中性脂质：25％至55％固醇；0.5％至15％PEG-脂质。
在第二方面的特别优选的实施方案中，将第一方面的人工RNA以及任选地第二方面的其他人工RNA与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，其中LNP基本组成为：
(i)至少一种本文所定义的阳离子脂质，优选式(III)的脂质，更优选脂质III-3；
(ii)本文所定义的中性脂质，优选1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DSPC)；
(iii)本文所定义的类固醇或类固醇类似物，优选胆固醇；和
(iv)本文所定义的PEG-脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，优选式(IVa)的聚乙二醇化脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20％至60％阳离子脂质：5％至25％中性脂质：25％至55％固醇：0.5％至15％PEG-脂质。
在一个优选的实施方案中，脂质纳米颗粒包含：具有式(III)的阳离子脂质和/或具有式(IV)的PEG脂质，任选地中性脂质，优选1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DSPC)，和任选地类固醇，优选胆固醇，其中阳离子脂质与DSPC的摩尔比任选地为约2∶1至8∶1，其中阳离子脂质与胆固醇的摩尔比任选地为约2∶1至1∶1。
在一个特别优选的实施方案中，包含第一方面的人工RNA和任选地第二方面的其他人工RNA的第二方面的组合物，包含脂质纳米颗粒(LNP)，摩尔比约为50∶10∶38.5∶1.5，优选47.5∶10∶40.8∶1.7或更优选47.4∶10∶40.9∶1.7(即，阳离子脂质(优选脂质III-3)、DSPC、胆固醇和PEG-脂质((优选n＝49的式(IVa)的PEG-脂质)的比例(摩尔％)；溶于乙醇)。
在一个特别优选的实施方案中，第二方面的组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)，摩尔比约为50∶10∶38.5∶1.5，优选47.5∶10∶40.8∶1.7或更优选47.4∶10∶40.9∶1.7(即，阳离子脂质(优选脂质III-3)、DSPC、胆固醇和PEG-脂质((优选n＝49的式(IVa)的PEG-脂质)的比例(摩尔％)；溶于乙醇)，其中脂质纳米颗粒包含至少一种编码F的RNA(F0、F-del、F0_DSCav1、F-del_DSCav1、F_DSCav1_mut0、F-del_DSCav1_mut0、F_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut2、F_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut3、F_DSCav1_mut4、F-del_DSCav1_mut4、F_DSCav1_mut5、F-del_DSCav1_mut5、F_DSCav1_mut6、F-del_DSCav1_mut6、F_DSCav1_mut7、F-del_DSCav1_mut7、F_DSCav1_mut8或F-del_DSCav1_mut8)，另外还包含脂质纳米颗粒(LNP)，其摩尔比约为50∶10∶38.5∶1.5，优选47.5∶10∶40.8∶1.7或更优选47.4∶10∶40.9∶1.7(即，阳离子脂质(优选脂质III-3)、DSPC、胆固醇和PEG-脂质((优选n＝49的式(IVa)的PEG-脂质)的比例(摩尔％)；溶于乙醇)，其中脂质纳米颗粒包含至少一种编码M、N、M2-1或P的RNA。
在一个特别优选的实施方案中，第二方面的组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)，摩尔比约为50∶10∶38.5∶1.5，优选47.5∶10∶40.8∶1.7或更优选47.4∶10∶40.9∶1.7(即，阳离子脂质(优选脂质III-3)、DSPC、胆固醇和PEG-脂质((优选n＝49的式(IVa)的PEG-脂质)的比例(摩尔％)；溶于乙醇)，其中脂质纳米颗粒包含至少一种编码F的RNA(F0、F-del、F0_DSCav1、F-del_DSCav1、F_DSCav1_mut0、F-del_DSCav1_mut0、F_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut2、F_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut3、F_DSCav1_mut4、F-del_DSCav1_mut4、F_DSCav1_mut5、F-del_DSCav1_mut5、F_DSCav1_mut6、F-del_DSCav1_mut6、F_DSCav1_mut7、F-del_DSCav1_mut7、F_DSCav1_mut8或F-del_DSCav1_mut8)，和至少一种编码M、N、M2-1或P的RNA。
脂质纳米颗粒中RNA的总量可以变化，并取决于例如RNA与总脂质的重量/重量比。在本发明的一个实施方案中，人工RNA与总脂质的比率小于0.06重量/重量，优选为0.03重量/重量至0.04重量/重量。
在不同的实施方案中，如本文所定义的LNP的平均直径为约50nm至约200nm、约60nm至约200nm、约70nm至约200nm、约80nm至约200nm、约90nm至约200nm、约90nm至约190nm、约90nm至约180nm、约90nm至约170nm、约90nm至约160nm、约90nm至约150nm、约90nm至约140nm、约90nm至约130nm、约90nm至约120nm、约90nm至约100nm、约70nm至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm或约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、或200nm，并且基本上无毒。如本文中所使用的，平均直径可以由如通过本领域通常已知的通过动态光散射确定的z平均来表示。
在本发明的另一个优选实施方案中，脂质纳米颗粒的流体力学直径分别为约50nm至约300nm、或约60nm至约250nm、约60nm至约150nm、或约60nm至约120nm。
根据其他实施方案，第二方面的组合物可以包含至少一种佐剂。适当地，优选添加佐剂以增强组合物的免疫刺激特性。
如本文所使用的术语“佐剂”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在表示可以改变，例如增强其他药物作用(本文中：本发明的人工核酸的作用)或适于支持组合物的施用和递送的药理学和/或免疫学药物。术语“佐剂”是指多种类型的物质。通常，这些物质能够增加抗原的免疫原性。例如，佐剂可以被先天免疫系统所识别，并且例如可以引起先天免疫应答(即，非特异性免疫应答)。“佐剂”通常不引起适应性免疫应答。在本发明的上下文中，佐剂可以增强由本文定义的人工核酸或本文定义的多蛋白提供的抗原肽或蛋白的作用。
在这种情况下，至少一种佐剂可以选自技术人员已知并且适合本情况的任何佐剂，即支持诱导对象例如人类对象的免疫应答。
因此，第二方面的组合物可以包含至少一种佐剂，其中所述至少一种佐剂可以适当地选自公开的PCT申请WO2016/203025中提供的任何佐剂。WO2016/203025的权利要求2至17中任一项所公开的佐剂，特别是WO2016/203025的权利要求17中所公开的佐剂是特别合适的，与之相关的具体内容通过引用并入本文。
第二方面的组合物除了本文指定的组分外，还可以包含至少一种其他组分，所述其他组分可以选自其他抗原(例如，以肽或蛋白的形式)或其他编码抗原的核酸；其他免疫治疗剂；一种或多于一种辅助物质(细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白介素或趋化因子)；或任何其他已知因其与人Toll样受体的结合亲和力(作为配体)而具有免疫刺激性的化合物；和/或佐剂核酸，优选免疫刺激性RNA(isRNA)，例如CpG-RNA等。
多肽和包含多肽的组合物
在第三方面，本发明提供了一种多肽，优选地是一种抗原性多肽，其中多肽包含由第一方面的人工RNA编码的氨基酸序列或其片段。
在实施方案中，所述多肽具有与SEQ ID NO：68、483、898、1267、1636、2005、2374、2743、3112、3481、3850、4219、4588、4957、5326、5695、6064、6433、6802、7171、7540、7909、11726、12095、12464、12833、13940、14309、14678、15047、15416、15785、13202、13571、16154、16523、16892、17261、17630、17999、18368、18737、19106、19475或这些多肽中任一个的变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，所述多肽具有与SEQ ID NO：1267、2005、2743、3481、4219、4957、5695、6433、7171、7909、12833、14309、15047、15785、13571、16523、17261、17999、18737、19475或这些多肽中任一个的变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在第四方面，本发明涉及包含第三方面的多肽的免疫原性组合物。在优选的实施方案中，第四方面的组合物可另外包含至少一种本文定义的药学上可接受的载体。在优选的实施方案中，第四方面的组合物可另外包含至少一种第一方面的人工RNA，和任选地，至少一种第二方面的其他人工RNA，或第二方面的RNA组合物。
值得注意的是，与第二方面的组合物或第五方面的疫苗有关的实施方案可以同样被阅读并理解为第四方面的组合物的合适的实施方案。
疫苗：
在第五方面，本发明提供了一种疫苗，其中疫苗包含第一方面的RNA，以及任选地第二方面的组合物，第三方面的多肽或第四方面的组合物。
值得注意的是，与第二方面的组合物或第四方面的组合物有关的实施方案可以同样被阅读并理解为第五方面的疫苗的合适的实施方案。同样，与第五方面的疫苗有关的实施方案可以同样地阅读并理解为第二方面的组合物(包含第一方面的RNA，以及任选地，第二方面的其他人工RNA)或第四方面的组合物(包含第三方面的多肽)的合适的实施方案。
术语“疫苗”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在指提供至少一种表位或抗原、优选免疫原的预防或治疗材料。在本发明的上下文中，抗原或抗原功能由第一方面的本发明RNA(所述RNA包含编码衍生自RSV F蛋白的抗原肽或蛋白的编码序列)、第二方面的组合物(包含第一方面的RNA，以及任选地，第二方面的其他人工RNA)、第三方面的多肽或第四方面的组合物(包含所述多肽)提供。
在第五方面的优选实施方案中，疫苗包含第一方面的RNA、第二方面的组合物(包含第一方面的RNA和任选地第二方面的其他人工RNA)、第三方面的多肽或第四方面的组合物，其中所述RNA、第二方面的所述组合物、所述多肽或第四方面的所述组合物(包含所述多肽)引起适应性免疫应答。
在特别优选的实施方案中，疫苗包含第一方面的RNA或第二方面的组合物，其中所述RNA或所述组合物引发针对RSV的适应性免疫应答，优选地为适应性免疫应答。
在特别优选的实施方案中，疫苗包含第一方面的RNA或第二方面的组合物，其中所述RNA或所述组合物诱导T细胞免疫应答。
根据第五方面的一个优选实施方案，如本文所定义的疫苗还可以包含药学上可接受的载体和任选地至少一种如第二方面上下文中所述的佐剂。
就此而言，合适的佐剂可以选自WO2016/203025的权利要求17中公开的佐剂。
在一个优选的实施方案中，疫苗是单价疫苗。
在实施方案中，疫苗是多价疫苗，其包含在第一方面的上下文中定义的多种或至少多于一种的人工RNA，以及任选地，在第二方面的上下文中定义的至少多于一种的其他人工RNA。在第二方面的上下文中所公开的与多价组合物有关的实施方案同样可以被阅读并被理解为第五方面的多价疫苗的合适的实施方案。
第五方面的疫苗通常包含安全有效量的第一方面的RNA，以及任选地第二方面的其他RNA。如本文所用，“安全有效量”是指足以显著诱导与RSV感染有关的疾病或病症的阳性修饰的RNA的量。同时，“安全有效量”足够小，以避免严重的副作用。关于本发明的疫苗或组合物，表述“安全有效量”优选地是指适于以不会实现过度或有害免疫应答的方式来刺激适应性免疫系统的RNA的量，但是优选地，也没有低于可测量水平的此类免疫应答。
此外，如上定义的组合物或疫苗的RNA的“安全有效量”将根据待治疗的特定病症以及待治疗患者的年龄和身体状况、病情的严重程度、治疗的持续时间、伴随疗法的性质、所使用的特定药学上可接受的载体以及类似因素而变化，其在随诊医生的知识和经验范围内。此外，RNA、组合物、疫苗的“安全有效量”可以取决于施用途径(皮内、肌内)、施用器械(喷射注射、针头注射、微针贴片)和/或复合(鱼精蛋白复合或LNP封装)。此外，人工RNA、组合物、疫苗的“安全有效量”可以取决于治疗对象(婴儿、孕妇、免疫功能低下的人类对象等)的状况。因此，适当的“安全有效量”必须相应地调整，并且将由技术人员选择和定义。
根据本发明，疫苗可以作为药物组合物或疫苗用于人类医学目的，也可以用于兽医医学目的(哺乳动物、脊椎动物、禽类)。
在一个优选的实施方案中，以冻干形式(使用例如WO2016/165831、WO2011/069586、WO2016/184575或WO2016/184576中描述的冻干方法)提供RNA、组合物(包含所述RNA和任选的其他RNA)、多肽、组合物(包含所述多肽)或疫苗。优选地，在施用之前，将冻干的RNA、冻干的组合物、冻干的多肽、包含该多肽的冻干的组合物或冻干的疫苗在合适的缓冲液中复溶，有利地基于水性载体，例如乳酸林格液或磷酸盐缓冲液。
因此，本文所用的药学上可接受的载体优选包括本发明疫苗的液体或非液体基础。如果以液体形式提供本发明的疫苗，则载体将是水，通常是无热原的水；等渗盐水或缓冲(水溶液)溶液，例如磷酸盐、柠檬酸盐等的缓冲溶液。优选地，WO2006/122828中所述的乳酸林格氏液用作根据本发明的疫苗或组合物的液体基础，该涉及合适缓冲溶液的公开内容通过引用并入本文。
本文所定义的药学上可接受的载体的选择原则上取决于施用本发明的药物组合物或疫苗的方式。疫苗可以例如全身或局部施用。全身施用途径通常包括例如透皮、口服、肠胃外途径，包括皮下、静脉内、肌内、动脉内、真皮内和腹膜内注射和/或鼻内施用途径。局部施用途径通常包括例如局部施用途径，但也包括皮内、透皮、皮下或肌内注射或病灶内、颅内、肺内、心内、关节内和舌下注射。更优选地，本发明的组合物或疫苗可以通过皮内、皮下或肌内途径，优选通过注射施用，所述注射可以是无针和/或针注射。因此，组合物/疫苗优选以液体或固体形式配制。待施用的根据本发明的疫苗或组合物的合适量可以通过常规实验确定，例如，通过使用动物模型确定。这样的模型包括但不限于兔、绵羊、小鼠、大鼠、狗和非人灵长类动物模型。用于注射的优选的单位剂型包括水、生理盐水或其混合物的无菌溶液。这种溶液的pH值应调节到约7.4。合适的注射载体包括水凝胶、控释或缓释装置、聚乳酸和胶原蛋白基质。用于局部施用的合适的药学上可接受的载体包括适合用于洗剂、霜剂、凝胶等中的那些。如果本发明的组合物或疫苗经口施用，则片剂、胶囊剂等是优选的单位剂型。用于制备可用于口服施用的单位剂型的药学上可接受的载体在现有技术中是众所周知的。其选择将取决于次要考虑因素，例如味道、成本和可储存性，这对于本发明的目的不是至关重要的，并且本领域技术人员可以毫无困难地进行选择。
如本文定义的本发明的疫苗或组合物可以另外包含一种或多于一种如上定义的辅助物质，以进一步提高免疫原性。由此，优选地实现了本发明的组合物中包含的核酸和可以任选地与如上所述的本发明的疫苗或组合物共同配制(或单独配制)的辅助物质的协同作用。这样的免疫原性增加剂或化合物可以分开提供(不与本发明的疫苗或组合物共同配制)并单独施用。
可以包含在本发明的疫苗或组合物中的其他添加剂是乳化剂，例如吐温；润湿剂，例如月桂基硫酸钠；着色剂；增味剂，药物载体；片剂形成剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂。
试剂盒或试剂盒套装、应用、医疗用途、治疗方法：
在第六方面，本发明提供了试剂盒或试剂盒套装，其中试剂盒或试剂盒套装包含第一方面的RNA，第二方面的组合物(包含所述RNA)，第三方面的多肽，第四方面的组合物(包含所述多肽)和/或第五方面的疫苗，其任选地包含用于增溶的液体载剂，以及任选地提供有关组分的施用和剂量信息的技术说明。
在一个优选的实施方案中，第六方面的试剂盒至少包括以下成分
a)第一方面的至少一种RNA，其优选编码至少一种衍生自RSV融合(F)蛋白的抗原肽或蛋白(RNA序列优选选自表5或表6)，其中所述人工RNA优选与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)；和
b)至少一种、两种或三种其他人工RNA，其编码选自M、N、M2-1或P的衍生自RSV的抗原肽或蛋白(RNA序列优选选自表7A)，其中所述其他RNA优选与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，
其中组分a)和b)作为单独的实体或作为单个实体提供。
在一个优选的实施方案中，第六方面的试剂盒至少包括以下成分
a)第一方面的至少一种RNA，其优选编码至少一种衍生自RSV融合(F)蛋白的抗原肽或蛋白(RNA序列优选选自表5或表6)，其中所述人工RNA优选与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)；和
b)至少一种其他人工RNA，其编码选自M的衍生自RSV的抗原肽或蛋白(RNA序列优选选自表7A，A列)，其中所述其他RNA优选与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)；和
c)至少一种其他人工RNA，其编码选自P的衍生自RSV的抗原肽或蛋白(RNA序列优选选自表7A，C列)，其中所述其他RNA优选与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，
其中组分a)、b)和c)作为单独的实体或作为单个实体提供。
在一个优选的实施方案中，第六方面的试剂盒至少包括以下成分
a)第一方面的至少一种RNA，其优选编码至少一种衍生自RSV融合(F)蛋白的抗原肽或蛋白(RNA序列优选选自表5或表6)，其中所述人工RNA优选与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)；和
b)至少一种其他人工RNA，其编码选自M的衍生自RSV的抗原肽或蛋白(RNA序列优选选自表7A，A列)，其中所述其他RNA优选与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)；和
c)至少一种其他人工RNA，其编码选自P的衍生自RSV的抗原肽或蛋白(RNA序列优选选自表7A，C列)，其中所述其他RNA优选与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)；和
d)至少一种其他人工RNA，其编码选自P的衍生自RSV的抗原肽或蛋白(RNA序列优选选自表7A，B列)，其中所述其他RNA优选与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，
其中组分a)、b)、c)和d)作为单独的实体或作为单个实体提供。
试剂盒还可以包含如第二方面的组合物、第三方面的多肽、第四方面的组合物和/或第五方面的疫苗中所述的其他组分。
所述试剂盒的技术说明书可能包含有关施用和剂量以及患者组的信息。这样的试剂盒，优选地是试剂盒套装，可以应用于例如本文提到的任何应用或用途，优选用于第一方面的RNA、第二方面的组合物、第三方面的多肽、第四方面的组合物或第五方面的疫苗的用途，用于治疗或预防由RSV或与其相关的疾病引起的感染或疾病。优选地，在试剂盒的单独部件中提供了第一方面的RNA、第二方面的组合物、第三方面的多肽、第四方面的组合物或第五方面的疫苗，其中优选将第一方面的RNA、第二方面的组合物、第三方面的多肽、第四方面的组合物或第五方面的疫苗冻干。试剂盒还可以包含用于溶解第一方面的RNA、第二方面的组合物、第三方面的多肽、第四方面的组合物或第五方面的疫苗的载剂(例如缓冲溶液)作为一部分。
在优选的实施方案中，如本文所定义的试剂盒或试剂盒套装包含乳酸林格氏液。
以上任何试剂盒均可用于本文定义的治疗或预防。更优选地，上述试剂盒中的任何一种都可以用作疫苗，优选针对本文所定义的由RSV引起的感染的疫苗。
医药用途：
在另一方面，本发明涉及第一方面的RNA、第二方面的组合物、第三方面的多肽、第四方面的组合物、第五方面的疫苗或第六方面的试剂盒或试剂盒套装的第一医药用途。
因此，第一方面的RNA、第二方面的组合物、第三方面的多肽、第四方面的组合物、第五方面的疫苗或第六方面的试剂盒或试剂盒套装是被用作药物。
本发明还提供第一方面的RNA、第二方面的组合物、第三方面的多肽、第四方面的组合物、第五方面的疫苗或第六方面的试剂盒或试剂盒套装的几种应用和用途。
特别地，所述RNA、组合物(包含所述RNA)、多肽、组合物(包含所述多肽)、疫苗或试剂盒或试剂盒套装可用于人类医学目的，也可用于兽医医学目的，优选用于人类医学目的。
特别地，所述RNA、组合物(包含所述RNA)、多肽、组合物(包含所述多肽)、疫苗或试剂盒或试剂盒套装可被用作用于人类医学目的的药物，其中所述RNA、组合物(包含所述RNA)、多肽、组合物(包含所述多肽)、疫苗或试剂盒或试剂盒套装可以特别适合于婴幼儿、新生儿、免疫功能低下的接受者、以及孕妇和哺乳期的妇女和老年人。
在又一方面，本发明涉及第一方面的RNA、第二方面的组合物、第三方面的多肽、第四方面的组合物、第五方面的疫苗或第六方面的试剂盒或试剂盒套装的第二医药用途。
因此，第一方面的RNA、第二方面的组合物、第三方面的多肽、第四方面的组合物、第五方面的疫苗或第六方面的试剂盒或试剂盒套装用于治疗或预防病原体(例如病毒)，特别是呼吸道合胞病毒(RSV)或与这种感染有关的病症的感染。
特别地，第一方面的RNA、第二方面的组合物、第三方面的多肽、第四方面的组合物、第五方面的疫苗或第六方面的试剂盒或试剂盒套装可用于治疗或预防病毒，特别是RSV的感染，或与这种感染有关的病症，用于人类以及兽医医学目的，优选用于人类医学目的。
特别地，所述RNA、组合物(包含所述RNA)、多肽、组合物(包含所述多肽)、疫苗或试剂盒或试剂盒套装可以特别适合于婴儿、新生儿、免疫功能低下的接受者、以及孕妇和哺乳期的妇女和老年人，用于治疗或预防RSV感染。
如本文所用，“与RSV感染有关的病症”可优选包括RSV感染的典型症状或并发症。
特别地，第一方面的人工RNA、第二方面的组合物、第三方面的多肽、第四方面的组合物、第五方面的疫苗或第六方面的试剂盒或试剂盒套装可以用于由RSV引起的感染的预防(暴露前预防或暴露后预防)和/或治疗性方法。
本文所定义的组合物或疫苗可优选局部施用。特别地，可以通过皮内、皮下、鼻内或肌内途径施用组合物或疫苗。因此，本发明的组合物或疫苗优选以液体(或有时以固体)形式配制。在实施方案中，本发明的疫苗可以通过常规的针头注射或无针头喷射注射施用。在这种情况下，优选的是RNA、组合物、疫苗通过肌内针注射施用。
如本文所用，术语“喷射注射”是指无针注射方法，其中迫使包含例如至少一个第一方面的RNA的流体(疫苗、本发明的组合物)通过孔，因而产生了超细的高压液流，该液流能够穿透哺乳动物的皮肤，并根据注射设置而穿透皮下组织或肌肉组织。原则上，液流穿刺皮肤，液流经皮肤推入目标组织。优选地，喷射注射用于本文公开的RNA、组合物、疫苗的皮内、皮下或肌内注射。
在实施方案中，本文定义的组合物或疫苗中包含的RNA的含量为约100ng至约500μg，约1μg至约200μg，约1μg至约100μg，约5μg至约100μg，优选约10μg至约50μg，特别是约5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg或100μg。
取决于施用途径(皮内、肌内、鼻内)、施用装置(喷射注射、针头注射、微针贴剂)和/或复合物(优选LNP封装)，必须相应地调整合适的量，并且本领域技术人员将对其进行选择和定义。
如本文所定义的用于治疗或预防感染的免疫方案，即针对RSV的对象免疫，通常包括一系列单剂量或一系列剂量的组合物或疫苗。如本文所用，单剂量分别指优选地为了“增强”免疫应答而施用的初始/第一剂量、第二剂量或任何其他剂量。
在一个实施方案中，用于治疗或预防本文所定义的感染的免疫方案，即针对RSV的对象免疫，包括一剂单剂量的组合物或疫苗。
在优选的实施方案中，预防RSV感染的免疫方案包括至少一剂单剂量的本文定义的组合物或疫苗，其中所述至少一剂单剂量向孕妇进行母体免疫接种，从而实现对未出生婴儿的免疫和/或其中将所述至少一剂单剂量给予母乳喂养的妇女，从而实现对母乳喂养婴儿的被动免疫。
如上文所定义的治疗或预防可包括施用其他活性药物成分。在基于第一方面的人工RNA的本发明的疫苗或组合物的情况下，可以将多肽、优选第三方面的多肽作为其他活性药物成分共同施用。
例如，可以共同施用至少一种本文所述的RSV蛋白或肽、或其片段或变体，以诱导或增强免疫应答。此外，第一个方面的两个不同的人工RNA和第二个方面任选的其他RNA可以在不同的时间点优选是在初免-加强方案中施用，例如使用包含至少一种RSV多肽的组合物作为初次疫苗接种，并且使用包含至少一个第一方面的人工RNA的组合物/疫苗作为加强疫苗接种。
适当地，上述定义的治疗或预防包括施用其他活性药物成分，其中其他活性药物成分可以是免疫治疗剂，其可以选自免疫球蛋白，优选为IgG、单克隆或多克隆抗体、多克隆血清或血清等，最优选为针对本文所定义的RSV蛋白或肽的免疫球蛋白。优选地，这样的另一种免疫治疗剂可以肽/蛋白的形式提供，或者可以由核酸，优选地由DNA或RNA，更优选地，由mRNA编码。除了由本发明的人工RNA或由本发明的多肽触发的主动接种之外，这种免疫治疗剂还允许提供被动接种。
治疗和使用方法，诊断和使用方法：
在另一方面，本发明涉及一种治疗或预防疾病的方法。
在优选的实施方案中，本发明涉及一种治疗或预防疾病的方法，其中所述方法包括向有此需要的对象施用或应用第一方面的RNA、第二方面的组合物、第三方面的多肽、第四方面的组合物、第五方面的疫苗或第六方面的试剂盒或试剂盒套装。
在优选的实施方案中，所述疾病是呼吸道合胞病毒(RSV)感染或与这种感染有关的病症。
在优选的实施方案中，本发明涉及一种治疗或预防疾病的方法，其中所述方法包括向有此需要的对象施用或应用第一方面的RNA、第二方面的组合物、第三方面的多肽、第四方面的组合物、第五方面的疫苗或第六方面的试剂盒或试剂盒套装，其中有需要的对象优选是哺乳动物对象。在特别优选的实施方案中，哺乳动物对象是人类对象，尤其是婴儿、新生儿、孕妇、哺乳妇女、老年人或免疫受损的人类对象。
特别地，该方法可以优选地包括以下步骤：
a)提供第一方面的RNA、第二方面的组合物、第三方面的多肽、第四方面的组合物、第五方面的疫苗或第六方面的试剂盒或试剂盒套装；
b)将第一方面的所述RNA、第二方面的组合物、第三方面的多肽、第四方面的组合物、第五方面的疫苗或第六方面的试剂盒或试剂盒套装应用或施用至组织或生物体；
c)任选地，施用免疫球蛋白(IgG)对抗RSV；
d)任选地，施用其他物质(佐剂、辅助物质、其他抗原)。
根据另一方面，本发明还提供了表达至少一种多肽的方法，所述多肽包含至少一种衍生自RSV的肽或蛋白、或其片段或变体，其中该方法优选包括以下步骤：
a)提供第一方面的RNA或第二方面的组合物；和
b)将所述RNA或组合物应用或施用至表达系统(细胞)、组织、生物体。
该方法可以应用于实验室，用于研究、诊断肽或蛋白的商业生产和/或用于治疗目的。该方法还可以在特定疾病的治疗中，特别是在传染性疾病，特别是RSV感染的治疗中进行。
同样地，根据另一方面，本发明还提供了第一方面的人工RNA、第二方面的组合物、第三方面的多肽、第四方面的组合物、第五方面的疫苗或第六方面的试剂盒或试剂盒套装的用途，优选用于诊断或治疗目的，例如用于表达编码的RSV抗原肽或蛋白，例如通过向例如无细胞表达系统、细胞(例如表达宿主细胞或体细胞)、组织或生物体施用或施用所述RNA，包含所述RNA的组合物，包含所述RNA的疫苗。在特定的实施方案中，向组织或生物体施用或应用所述RNA，包含所述RNA的组合物，包含所述RNA的疫苗，随后是例如获得诱导的例如RSV F抗体RSV F特异性(单克隆)抗体的步骤。
该用途可应用于(诊断)实验室，用于研究、诊断肽、蛋白或RSV抗体的商业生产和/或用于治疗目的。该应用可以在体外、体内或离体进行。此外，可以在特定疾病的治疗中，特别是在RSV感染或相关疾病的治疗中进行应用。
在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了第一方面的RNA、第二方面的组合物、第三方面的多肽、第四方面的组合物、第五方面的疫苗或第六方面的试剂盒或试剂盒套装被用作药物的应用，用于治疗或预防，优选治疗或预防RSV感染或相关病症，或用作疫苗应用。
列表和表格的简要描述：
列表1：合适的RSV病毒株
列表2：合适的RSV融合(F)蛋白的NCBI蛋白登录号
表1优选的RSV F蛋白抗原设计
表2人密码子使用表，其中每个氨基酸均标明了频率
表3A：衍生自HRSV(A2)的编码RSV F的优选编码序列(A列至J列)
表3B：衍生自HRSV(Memphis-37)的编码RSV F的优选编码序列(A列至J列)
表4A：衍生自HRSV(A2)的编码RSV F的优选编码序列(K列至V列)
表4B：衍生自HRSV(Memphis-37)的编码RSV F的优选编码序列(K列至V列)
表5A：衍生自HRSV(A2)的编码RSV F的优选mRNA构建体(A列至J列)
表5B：衍生自HRSV(Memphis-37)的编码RSV F的优选mRNA构建体(A列至J列)
表6A：衍生自HRSV(A2)的编码RSV F的优选mRNA构建体(K列至V列)
表6B：衍生自HRSV(Memphis-37)的编码RSV F的优选mRNA构建体(K列至V列)
表7A：组合物或疫苗的优选的其他编码序列和mRNA构建体
表7B：RNA构建体的合适组合
表8：衍生自式(III)的代表性脂质化合物
表9：本实施例中使用的mRNA构建体(参见“实施例”部分)
表10：实施例2的动物组和疫苗接种时间表(参见实施例部分)
表11：实施例3的动物组和疫苗接种时间表(参见实施例部分)
表12：具有实施例4的不同UTR组合的mRNA构建体(参见实施例部分)
表13：实施例5的动物组和疫苗接种时间表(参见实施例部分)
表14：实施例6的动物组和疫苗接种时间表(参见实施例部分)
表15：实施例7的动物组和疫苗接种时间表(参见实施例部分)
表15：实施例7的动物组和疫苗接种时间表(参见实施例部分)
表16：实施例8中使用的mRNA构建体的概述(参见实施例部分)
表17：实施例9的动物组和疫苗接种时间表(参见实施例部分)
表18：实施例10的动物组和疫苗接种时间表(参见实施例部分)
表19：实施例11中使用的mRNA构建体的概述(参见实施例部分)
表20：实施例12的动物组和疫苗接种时间表(参见实施例部分)
附图说明
图1显示了在肌肉注射和皮内注射疫苗接种后，配制成LNP的编码RSV F蛋白(F-del_DSCav1)的mRNA在棉鼠(cotton rat)血清中诱导高病毒中和滴度(VNT)。用鱼精蛋白配制的mRNA进行的疫苗接种仅诱导弱应答。接种时间表见表10。实施例2中提供了更多详细信息。
图2显示了在肌肉注射和皮内注射疫苗接种后，配制成LNP的编码RSV F蛋白(F-del_DSCav1)的mRNA减少了棉鼠肺部的RSV感染。接种时间表见表10。实施例2中提供了更多详细信息。
图3显示了来自实施例2中所述的RSV攻击棉鼠的研究的肺组织病理学分析结果。与用福尔马林灭活的RSV病毒疫苗接种相比，用配制成LNP的mRNA进行了疫苗接种的动物在病毒攻击后并未显示出肺组织病理学增强/炎症增强。接种时间表见表10。实施例2中提供了更多详细信息。
图4显示了在两次肌肉注射疫苗接种后，配制成LNP的编码RSV F蛋白(F0、F-del和F-del_DSCav1)的mRNA在棉鼠血清中诱导高(病毒中和滴度)VNT。在第48天确定VNT。接种时间表见表11。实施例3中提供了更多详细信息。
图5显示了配制成LNP的编码RSV F蛋白(F0、F-del和F-del_DSCav1)的mRNA在棉鼠中诱导了针对RSV-F蛋白的特定体液免疫应答。如实施例3中所述进行实验，并通过ELISA确定抗体总IgG滴度。RSV-F(配制成LNP)和RSV-F-del(配制成LNP)疫苗在初次接种疫苗后(第28天)已经诱导了比活病毒更高的RSV-F特异性IgG滴度。图5a：在第49天确定抗体滴度；图5b和5c：血清中具有编码RSV F蛋白(F、F-del和F-del_DSCav1)的10μg的mRNA(图5b)或100μg的mRNA(图5c)的IgG滴度随时间的变化。接种时间表见表11。实施例3中提供了更多详细信息。
图6显示了在肌肉注射疫苗接种后，配制成LNP的编码RSV F蛋白(F0、F-del和F-del_DSCav1)的mRNA减少了棉鼠肺部的RSV感染。如实施例3所述进行实验。接种了mRNA疫苗的所有动物组的病毒滴度均低于检测水平，表明在病毒肺滴度方面，疫苗接种的棉鼠受到了保护。与mRNA疫苗相比，基于福尔马林灭活病毒的疫苗无法预防肺中的病毒滴度。接种时间表见表11。实施例3中提供了更多详细信息。
图7显示了在肌肉注射疫苗接种后，配制成LNP的编码RSV F蛋白(F0、F-del和F-del_DSCav1)的mRNA减少了棉鼠鼻子中的RSV滴度。如实施例3所述进行实验。在病毒攻击感染实验中，接种了mRNA疫苗的所有动物组在鼻组织中均显示出病毒滴度大幅度降低。与mRNA疫苗相比，基于福尔马林灭活病毒的疫苗无法降低鼻病毒滴度。接种时间表见表11。实施例3中提供了更多详细信息。
图8显示了来自实施例3中所述的RSV攻击棉鼠的研究的肺组织病理学分析结果。与用福尔马林灭活的RSV病毒疫苗进行接种相比，用配制成LNP的mRNA进行了疫苗接种的动物在病毒攻击后并未显示出肺组织病理学增强/炎症增强。接种时间表见表11。实施例3中提供了更多详细信息。
图9显示了根据本发明的UTR组合在体外增加了RSV F-蛋白的表达。将HEK 293T细胞用不同的Lipofectamine配制的mRNA构建体转染，这些构建体均包含编码融合前稳定的截短RSV-F(F-del_DSCav1)的相同编码序列，但使用5′和3′-UTR的不同组合(请参见表12)。通过流式细胞术分析RSV-F表达。值显示检测到的RSV-F信号的百分比。根据参考mRNA构建体(UTR组合RPL32/LB7)的表达的值归一化为100％。注射用水(WFI)作为对照。N＝2。实施例4中提供了更多详细信息。
图10显示了使用的编码RSV F蛋白(图10a：F0、F-del、F0_DSCav1、F-del_DSCav1、F_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut2、F_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut3，图10b：F0、F-del、F0_DSCav1、F-del_DSCav1、F_DSCav1_mut0、F-del_DSCav1_mut0、F_DSCav1_mut4、F-del_DSCav1_mut4、F_DSCav1_mut5、F-del_DSCav1_mut5)的mRNA构建体产生可检测的细胞内RSV F蛋白表达以及产生在细胞表面的可检测蛋白表达。表16和实施例8中提供了更多详细信息。
图11示出了所有测试的编码不同RSV F蛋白(F0、F0_DSCav1、F_DSCav1_mut3、F_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F-del、F-del_DSCav1、F-del_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2)的配制成LNP的mRNA构建体在棉鼠中诱导针对RSV-F蛋白的体液免疫应答。通过ELISA确定抗体的总IgG滴度。接种时间表见表17。实施例9中提供了更多详细信息。
图12显示了所有配制成LNP的RSV-F(F0、F0_DSCav1、F_DSCav1_mut3、F_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F-del、F-del_DSCav1、F-del_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2)mRNA疫苗均在棉鼠中诱导了RSV特异性功能抗体的形成，如高病毒中和抗体滴度所示。接种时间表见表17。实施例9中提供了更多详细信息。
图13显示了来自RSV攻击棉鼠的研究的肺组织病理学分析。接种过福尔马林灭活的RSV疫苗的接种组中，接种过mRNA的组中均未显示出肺部病理增强，参见表17。实施例9中提供了更多详细信息。
图14显示了用RSV病毒攻击的棉鼠的肺病毒滴度(图14a)和鼻病毒滴度(图14b)的分析结果。接种时间表见表17。实施例9中提供了更多详细信息。
图15示出了所有测试的配制成LNP的编码不同RSV F蛋白(F-del、F-del_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut0、F-del_DSCav1_mut5、F-del_DSCav1_mut4)的mRNA构建体在棉鼠中诱导针对RSV-F蛋白的体液免疫应答。通过ELISA确定抗体的总IgG滴度。接种时间表见表18。实施例10中提供了更多详细信息。
图16显示了所有配制成LNP的RSV-F(F-del、F-del_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut0、F-del_DSCav1_mut5、F-del_DSCav1_mut4)mRNA疫苗均在棉鼠中诱导了RSV特异性功能抗体的形成，如高病毒中和抗体滴度所示。用于融合前稳定化的配制成LNP的构建体比F-del诱导更高或相当的应答。接种时间表见表18。实施例10中提供了更多详细信息。
图17显示了来自RSV攻击棉鼠的研究的肺组织病理学分析。接种过福尔马林灭活的RSV疫苗的组中，接种过mRNA的组中均未显示出肺部病理增强，参见表18。实施例10中提供了更多详细信息。
图18显示了用RSV病毒攻击的棉鼠的肺病毒滴度(图18a)和鼻病毒滴度(图18b)的分析结果。接种时间表见表18。实施例10中提供了更多详细信息。
图19显示了使用兔网织红细胞裂解物系统，编码RSV基质蛋白M、磷蛋白P、核蛋白N和基质蛋白M2-1蛋白的mRNA构建体产生可检测的蛋白表达。表19和实施例11中提供了更多详细信息。
图20显示了小鼠免疫原性研究的结果(ELISA)。体液免疫应答可见于图20a：抗RSVF IgG和图20b：抗RSV F IgG2a。所有组诱导体液免疫应答。通常，IgG2a滴度比IgG1滴度高10倍，表明主要的是Th1应答。接种时间表见表20。实施例12中提供了更多详细信息。
图21显示在免疫小鼠的血清类中检测到特异性抗原IgG，表明所应用的mRNA构建体适合于诱导特异性体液免疫应答。接种时间表见表20。实施例12中提供了更多详细信息。
图22显示了所有配制成LNP的mRNA疫苗(F、M+F、P+F、N+F、M2-1+F)都诱导了小鼠中RSV特异性功能抗体的形成，如高病毒中和抗体滴度所显示。接种时间表见表20。实施例12中提供了更多详细信息。
图23显示了在肌肉内免疫后，所有含有RSV F、RSV M2-1或两者的疫苗均出乎意料地在肺中诱导组织驻留记忆T细胞(TRM)应答。脾细胞分析显示，用RSV F以及尤其是用RSVM2-1免疫使分泌IFN-γ和TNF的抗原特异性CD8+和CD4+T细胞增加，表明除了位点特异性应答外，还诱导了全身性T细胞应答(图23b和图23c)。
实施例
在下文中，呈现了说明本发明的各种实施方案和方面的特定实施例。然而，本发明的范围不应受到本文所述的具体实施方案的限制。给出以下制备和实施例以使本领域技术人员能够更清楚地理解和实施本发明。然而，本发明的范围不受示例性实施方案的限制，这些示例性实施方案仅旨在作为本发明的单个方面的说明，并且功能上等效的方法在本发明的范围内。通过前面的描述、附图和下面的实施例，本文中的内容对于本领域技术人员将变得显而易见。所有这些修改都落入所附权利要求的范围内。
实施例1：用于体外和体内实验的DNA和mRNA构建体及组合物的制备
本实施例提供了获得本发明的人工RNA的方法以及产生本发明的组合物或疫苗的方法。
1.1.DNA和mRNA构建体的制备：
对于本实施例，制备了编码不同RSV F蛋白(例如，F0、F-del、F-del_DSCav1、F-del_DSCav1_mut5等)的DNA序列，并将其用于随后的RNA体外转录反应。通过引入用于稳定化的G/C优化的编码序列(例如“cds opt1”)修饰野生型编码DNA序列来制备所述DNA序列。将序列引入衍生自pUC19的载体中，以包含稳定化的3′-UTR序列，该3′-UTR序列衍生自选自PSMB3、ALB7、α-珠蛋白、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9的基因的3′-UTR，和5′-UTR序列，该5′-UTR序列衍生自选自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B和UBQLN2的基因的5′-UTR，还包含一段腺苷(例如64A或A100)和组蛋白-茎环(hSL)结构，以及任选的一段30个胞嘧啶(例如C30)，如表9所示。
使用本领域已知的常规方案，将获得的质粒DNA构建体转化到细菌中并在细菌中繁殖。最终，提取、纯化质粒DNA构建体，并用于随后的RNA体外转录(参见1.2节)。
或者，将根据章节1制备的DNA质粒用作基于PCR的扩增的DNA模板。最终，纯化生成的PCR产物并用于随后的RNA体外转录(参见1.3节)。
1.2.从质粒DNA模板进行RNA体外转录：
使用EcoRI或SapI将根据章节1.1制备的DNA质粒酶促线性化，并在适当的缓冲液条件下，在核苷酸混合物(ATP/GTP/CTP/UTP)和帽类似物(例如m7GpppG、m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)pG或m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)pG))存在下，使用T7RNA聚合酶进行DNA依赖性RNA体外转录。使用RP-HPLC(
Figure BPA0000294887150001721
CureVac AG，Tübingen，德国；WO2008/077592)纯化获得的mRNA构建体，并将其用于体外和体内实验。在当前的良好生产规范下生产用于临床开发的RNA(参见实施例6)，该方法例如根据WO2016/180430在DNA和RNA水平上实施了各种质量控制步骤。在表9中提供了产生的RNA序列/构建体以及编码的F蛋白和相应的UTR元件。除了表9中提供的信息外，还可以从ST.25序列表中提供的<223>标识符下提供的信息中获取与特定mRNA构建体SEQ-ID NO相关的其他信息。
或者，EcoRI或SapI线性化的DNA用于DNA依赖性RNA体外转录，在合适的缓冲液条件下，在修饰的核苷酸混合物(ATP、GTP、CTP、N(1)-甲基假尿核苷(m1Ψ)或假尿苷(Ψ))和帽类似物(m7GpppG、m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)pG或m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)pG)存在下，使用RNA聚合酶进行该转录。使用RP-HPLC(
Figure BPA0000294887150001731
CureVac，Tübingen，德国；WO2008/077592)纯化获得的m1Ψ或Ψ修饰的mRNA，并用于进一步实验。
一些mRNA构建体是在不存在帽类似物的情况下体外转录的。帽结构(cap1)是使用本领域公知的加帽酶以酶促方式添加的。简而言之，使用带有2′-O-甲基转移酶的m7G加帽试剂盒对体外转录的mRNA进行加帽，以获得加帽cap1的mRNA。使用RP-HPLC(
Figure BPA0000294887150001732
CureVac，Tübingen，德国；WO2008/077592)纯化加帽cap1的mRNA，并将其用于进一步的实验。
1.3.从PCR扩增的DNA模板进行RNA体外转录：
在适当的缓冲液条件下，在核苷酸混合物(ATP/GTP/CTP/UTP)和帽类似物(m7GpppG)存在下，使用DNA依赖性T7RNA聚合酶体外转录根据章节1.1制备的纯化的PCR扩增DNA模板。或者，在合适的缓冲液条件下，使用DNA依赖性T7RNA聚合酶在修饰的核苷酸混合物(ATP、GTP、CTP、N(1)-甲基假尿苷(m1Ψ))和帽类似物(m7GpppG)存在下，体外转录PCR扩增的DNA。在不存在帽类似物的情况下体外转录一些mRNA构建体，并使用本领域中通常已知的加帽酶例如使用带有2′-O-甲基转移酶的m7G加帽试剂盒酶促地添加帽结构(cap1)。例如使用RP-HPLC(
Figure BPA0000294887150001733
CureVac AG，Tübingen，德国；WO2008/077592)纯化所获得的mRNA，并用于体外和体内实验。
表9：本实施例中使用的mRNA构建体
Figure BPA0000294887150001741
Figure BPA0000294887150001751
1.4.配制成LNP的mRNA组合物的制备：
基本上根据WO2015/199952、WO2017/004143和WO2017/075531中描述的一般程序制备和测试脂质纳米颗粒(LNP)、阳离子脂质和聚合物缀合脂质(PEG-脂质)，其全部公开内容通过引用并入本文。使用可电离的氨基脂质(阳离子脂质)、磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质制备配制成LNP的mRNA。简而言之，将式III-3的阳离子脂质化合物、DSPC、胆固醇和式IVa的PEG-脂质以约50∶10∶38.5∶1.5或47.4∶10∶40.9∶1.7的摩尔比(％)溶解在乙醇中。以0.03重量/重量至0.04重量/重量的mRNA与总脂质的比例制备包含式III-3的阳离子脂质化合物和式IVa的PEG-脂质化合物的LNP。在pH4的10mM至50mM柠檬酸盐缓冲液中将mRNA稀释至0.05mg/mL至0.2mg/mL。使用注射泵将乙醇脂质溶液与mRNA水溶液以约1∶5至1∶3(体积/体积)的比例混合，总流速高于15ml/min。然后除去乙醇，并通过透析用含有蔗糖的PBS缓冲液代替外部缓冲液。最后，将脂质纳米颗粒通过0.2um孔的无菌过滤器过滤，并将配制成LNP的mRNA组合物调整为总mRNA为约1mg/ml。脂质纳米颗粒的粒径尺寸为60nm至90nm，这是通过使用Malvern Zetasizer Nano(Malvern，UK)的准弹性光散射测定的。对于本说明书中提到的其他阳离子脂质化合物，其配制过程基本相似。在体内应用之前，使用盐水将获得的配制成LNP的mRNA组合物(总mRNA量为1mg/ml)稀释至所需的目标浓度。
1.5.鱼精蛋白复合的mRNA组合物的制备：
在用于体内免疫实验之前，将mRNA构建体与鱼精蛋白复合。mRNA制剂由50％游离mRNA和50％与鱼精蛋白复合的mRNA的重量比为2∶1的混合物组成。首先，通过向mRNA中添加鱼精蛋白-林格氏乳酸盐溶液将mRNA与鱼精蛋白复合。孵育10分钟后，当稳定生成复合物时，添加游离mRNA，并用林格氏乳酸溶液调节最终浓度。
实施例2：用配制成LNP的编码RSV-F的mRNA对棉鼠进行疫苗接种和RSV攻击棉鼠的 研究
本实施例表明，配制成LNP的编码RSV-F的mRNA在棉鼠中诱导强的和功能性的免疫应答。
为了开发RSV疫苗，棉鼠是公认的动物模型，尤其是对于攻击感染。接受福尔马林灭活的RSV病毒疫苗制剂的棉鼠对RSV感染的应答具有增强的肺部病理。这使得能够根据增强的疾病现象评估疫苗接种的安全性。
为了优化RSV特异性免疫应答，根据实施例1，制备编码融合前稳定的RSV F蛋白F-del_DSCav的mRNA疫苗，其用LNP(参见实施例1.4.)或鱼精蛋白(参见实施例1.5.)配制，并且如表10所示，分别在第0天和第28天肌内(i.m.)或皮内(i.d)施用不同剂量的RNA。对照动物在第0天接受鼻内105pfu的活RSV/A2病毒的单次疫苗接种，或在第0天和第28天肌注福尔马林灭活的RSV病毒(FI-RSV)进行两次疫苗接种。其他对照动物仅接受缓冲液。对于本实施例，使用了UTR组合HSD17B4/ALB7，在本文中称为“i-4”。
表10：实施例2的动物组和疫苗接种时间表
组 棉鼠 治疗 mRNA 剂量 施用途径 体积
1 5 mRNA/LNP R4745 10μg i.m. 1x100uL
2 5 mRNA/LNP R4745 2μg i.m. 1x100uL
3 5 mRNA/LNP R4745 10μg i.d. 2x50uL
4 5 mRNA/LNP R4745 2μg i.d. 2x50uL
5 5 mRNA/鱼精蛋白 R5717 80μg i.m. 1x100uL
6 5 mRNA/鱼精蛋白 R5717 80μg i.d. 2x50uL
7 5 活RSv/A2病毒 10<sup>5</sup>pfu i.n. 1x100uL
8 5 FI-RSV 1∶100 i.m. 1x100uL
9 5 缓冲液 - i.m 1x100uL
10 5 未经治疗/未感染 - -
病毒中和滴度的测定：
在第49天收集血清，并使用噬斑减少中和测试(PRNT)测量RSV病毒中和滴度(VNT)。将稀释的血清样品在室温下与RSV/A2孵育1小时，并一式两份接种到24孔板中的汇合HEp-2单层上。在5％CO2培养箱中于37℃培养1小时后，将孔用0.75％甲基纤维素培养基覆盖。培养4天后，除去覆盖物，将细胞固定并染色。在病毒对照的60％降低终点确定相应的相互中和抗体滴度。
攻击棉鼠的研究：
在第63天，用100uL的105pfu活RSV/A2病毒鼻内攻击接种疫苗的动物。一个对照组保持未治疗和未感染(第10组)。在第68天处死所有动物，并收获鼻组织和肺。
受攻击的棉鼠肺中的RSV滴度：
在第68天(即用105pfu活RSV/A2病毒鼻内攻击后5天)收集动物的肺，并通过噬菌斑测定在一个肺叶中定量RSV/A2滴度。通过离心澄清肺匀浆，并在EMEM中稀释。将汇合的HEp-2单层一式两份用稀释的匀浆在24孔板中感染。在5％CO培养箱中于37℃培养1小时后，将孔用0.75％甲基纤维素培养基覆盖。孵育4天后，除去覆盖物，将细胞固定并用0.1％结晶紫染色1小时，然后漂洗并风干。对噬菌斑计数并以每克组织的噬菌斑形成单位表示病毒滴度。对于给定时间的一组中的所有动物，将病毒滴度计算为几何平均值±标准误差。
受攻击的棉鼠的肺组织病理学：
在第68天(即用105pfu的活RSV/A2病毒鼻内攻击后5天)收集动物的肺，并通过组织病理学分析一个肺叶。解剖肺，并用10％中性福尔马林缓冲液充盈至其正常体积，然后浸入相同的固定液中。固定后，将肺部包埋在石蜡中，切片并用苏木精和曙红(H&E)染色。评价了肺部炎症的四个参数：细支气管周围炎(细支气管周围的炎性细胞浸润)、血管周炎(细血管周围的炎性细胞浸润)、间质性肺炎(炎性细胞浸润和肺泡壁增厚)和肺泡炎(肺泡空间内的细胞)。在0-4严重性等级上对切片进行盲评分。随后将分数转换为0-100％的组织病理学量表。
结果：
从图1中可以看出，配制成LNP的RSV-F(F-del_DSCav1)mRNA疫苗可诱导棉鼠中RSV特异性功能抗体的形成，如高病毒中和抗体滴度所示(第1组至第4组)。用鱼精蛋白配制的mRNA进行的疫苗接种仅诱导弱应答。
从图2可以看出，配制成LNP的RSV-F(F-del_DSCav1)mRNA疫苗降低了受到RSV病毒攻击的棉鼠的肺病毒滴度，因此限制了肺的RSV感染(第1组至第4组)。用配制成LNP的mRNA疫苗接种过的所有动物组均显示病毒滴度低于进行的病毒滴定的检测水平，这表明接种的棉鼠在病毒肺滴度方面得到了保护。相比之下，与缓冲液对照组相比，鱼精蛋白配制的mRNA疫苗(肌肉注射)和福尔马林灭活的病毒疫苗仅使肺病毒滴度降低最小。
从图3可以看出，来自RSV攻击棉鼠的研究的肺组织病理学分析揭示了各种动物组的不同病理学评分。从组织病理学可以得出结论，与使用福尔马林灭活的RSV疫苗接种的组一样，接种mRNA的组均未显示出肺部病理学增强。与福尔马林灭活的RSV组(第8组)相比，所有接种了mRNA的组(第1组至第6组)的平均细支气管周炎、血管周炎、间质性肺炎和肺泡炎的病理评分均低得多。
实施例3：用配制成LNP的编码RSV-F的mRNA对棉鼠进行疫苗接种和RSV攻击棉鼠的 研究
本实施例表明，对于具有UTR组合RPL32/ALB7(i-2)的mRNA构建体，配制成LNP的编码不同的RSV-F抗原的mRNA在棉鼠中诱导强的和功能性的免疫应答。
该实验比较了编码三种不同RSV-F变体的mRNA-LNP：全长RSV F0、截短的RSV F-del和融合前稳定的截短的F-del_DSCav1。根据实施例1制备mRNA-LNP疫苗。棉鼠在第0天和第28天接受了两次肌肉注射mRNA-LNP疫苗的接种。每个剂量包含10μg或100μg mRNA-LNP。对照动物在第0天接受鼻内105pfu的活RSV/A2病毒的单次疫苗接种，或在第0天和第28天接受肌注福尔马林灭活的RSV病毒(FI RSV)的两次疫苗接种。其他对照动物仅接受缓冲液(参见表11)。
表11：实施例3的动物组和疫苗接种时间表
Figure BPA0000294887150001791
ELISA测定抗RSV F蛋白抗体：
在第28天、第49天和第63天收集血液样品，以确定抗RSV F抗体的滴度。ELISA板涂有重组人RSV融合糖蛋白(以冻干粉形式提供在杆状病毒昆虫细胞中表达的在C末端与多组氨酸标签融合的人RSV融合糖蛋白的胞外结构域(529))。使用给定的血清稀释液培养经涂覆的板。使用生物素化同种型特异性抗小鼠抗体结合链霉亲和素-HRP(辣根过氧化物酶)和ABTS底物，可以检测特异性抗体与F蛋白的结合。
病毒中和滴度的测定：
在第49天收集血清，并使用噬斑减少中和测试(PRNT)测量RSV病毒中和滴度(VNT)。将稀释的血清样品在室温下与RSV/A2孵育1小时，并一式两份接种到24孔板中的汇合HEp-2单层上。在5％CO2培养箱中于37℃培养1小时后，将孔用0.75％甲基纤维素培养基覆盖。培养4天后，除去覆盖物，将细胞固定并染色。在病毒对照的60％降低终点确定相应的相互中和抗体滴度。
攻击棉鼠的研究：
在第63天，用100uL的105pfu活RSV/A2病毒鼻内接种疫苗的动物。一个对照组保持未治疗和未感染。在第68天处死所有动物，并收获鼻组织和肺。
受攻击的棉鼠肺中的RSV滴度：
在第68天(即用105pfu的活RSV/A2病毒鼻内攻击后5天)收集动物的肺，并通过如上所述的噬菌斑测定在一个肺叶中定量RSV/A2滴度。
受攻击的棉鼠鼻组织中的RSV滴度
在第68天(即用105pfu活的RSV/A2病毒鼻内攻击后5天)收集动物的鼻组织。通过离心将鼻匀浆与肺匀浆进行相同的澄清，并在EMEM中稀释。将汇合的HEp-2单层一式两份用稀释的匀浆在24孔板中感染。在5％CO培养箱中于37℃培养1小时后，将孔用0.75％甲基纤维素培养基覆盖。培养4天后，除去覆盖物，将细胞固定并用0.1％结晶紫染色1小时，然后漂洗并风干。对噬菌斑计数并以每克组织的噬菌斑形成单位表示病毒滴度。对于给定时间的一组中的所有动物，将病毒滴度计算为几何平均值±标准误差。
受攻击的棉鼠的肺组织病理学：
在第68天(即用105pfu的活RSV/A2病毒鼻内攻击后5天)收集动物的肺，并通过如上所述的组织病理学分析一个肺叶。
结果：
从图4中可以看出，所有配制成LNP的RSV-F(F0、F-del、F-del_DSCav1)mRNA疫苗均可诱导棉鼠中RSV特异性功能抗体的形成，如高病毒中和抗体滴度所示。
图5a、图5b和图5c显示，配制成LNP的编码RSV F蛋白(F0、F-del和F-del_DSCav1)的mRNA在棉鼠中诱导针对RSV-F蛋白的体液免疫应答。通过ELISA确定抗体的总IgG滴度。图5a：在第49天确定抗体滴度；图5b和5c：血清中具有编码RSV F蛋白(F0、F-del和F-del_DSCav1)的10μg mRNA(图5b)或100μg mRNA(图5c)的IgG滴度随时间的变化。与活病毒疫苗相比，初次接种后(第28天)，10μg和100μg两种剂量的F0和F-del疫苗都诱导更高的RSV-F特异性IgG滴度。加强疫苗接种后，所有测试的配制成LNP的RSV-F(F0、F-del、F-del_DSCav1)mRNA疫苗均可诱导通过ELISA检测到的体液免疫应答，这比对照疫苗的应答更为突出。
从图6中可以看出，配制成LNP的RSV-F(F0、F-del、F-del_DSCav1)mRNA疫苗降低了受到RSV病毒攻击的棉鼠的肺病毒滴度，因此限制了肺的RSV感染。用配制成LNP的mRNA疫苗接种过的所有动物组均显示病毒滴度低于进行的病毒滴定的检测水平。结果证明就肺病毒滴度而言，接种疫苗的棉鼠受到了保护。相比之下，与缓冲液对照组相比，福尔马林灭活的病毒疫苗(FI RSV)仅使肺病毒滴度降低最小。
从图7中可以看出，配制成LNP的RSV-F(F0、F-del、F-del_DSCav1)mRNA疫苗可大大降低受RSV病毒攻击的棉鼠鼻组织中的病毒滴度，从而减少鼻子的RSV感染。与mRNA疫苗相比，基于福尔马林灭活病毒(FI RSV)的疫苗无法降低鼻病毒滴度。
从图8可以看出，来自RSV攻击棉鼠的研究的肺组织病理学分析揭示了各种动物组的不同病理学评分。从组织病理学可以得出结论，与使用福尔马林灭活的RSV疫苗接种的组一样，接种mRNA的组均未显示出肺部病理学增强。与福尔马林灭活的RSV组相比，所有接种了mRNA的组的平均毛细支气管炎、血管周炎、间质性肺炎和肺泡炎的病理评分均低得多。
为了进一步提高基于mRNA的疫苗的效率，设计了几种具有不同UTR组合的替代RSV-F mRNA构建体，以潜在地提高mRNA的翻译效率。如在以下实施例中所见，测试了那些mRNA构建体。
实施例4：RSV-F mRNA构建体的体外表达筛选
本实施例表明，与例如实施例3中使用的参考mRNA构建体(携带RPL32/ALB7UTR)相比(UTR组合RPL32/ALB7(i-2))，根据本发明的UTR组合极大地改善了所述mRNA构建体的表达性能。
为了进一步改善RSV-F mRNA的表达性能，进行了筛选实验以鉴定根据本发明的有利的UTR组合。为了确定包含不同UTR组合的RSV-F mRNA构建体的蛋白表达性能，将HEK293T细胞用不同脂质体配制的mRNA构建体转染，其均包含编码融合前稳定的截短F-del_DSCav1的相同编码序列，但使用不同的5′-和3′-UTR(参见表12)。转染后24小时通过流式细胞术分析RSV-F表达。
表12：实施例4中使用的具有不同UTR组合的mRNA构建体的概述
抗原 UTR设计 SEQ ID NO：RNA SEQ ID NO：蛋白质
F-del_DSCav1 HSD17B4/PSMB3；a-1 1276 1267
F-del_DSCav1 Ndufa4/PSMB3；a-2 1284 1267
F-del_DSCav1 Slc7a3/PSMB3；a-3 1292 1267
F-del_DSCav1 Nosip/PSMB3；a-4 1300 1267
F-del_DSCav1 Mp68/PSMB3；a-5 1308 1267
F-del_DSCav1 Ubqln2/RPS9；b-1 1316 1267
F-del_DSCav1 ASAH1/RPS9；b-2 1324 1267
F-del_DSCav1 HSD17B4/RPS9；b-3 1332 1267
F-del_DSCav1 HSD17B4/CASP1；b-4 1340 1267
F-del_DSCav1 Nosip/COX6B1；b-5 1348 1267
F-del_DSCav1 Ndufa4/RPS9；c-1 1356 1267
F-del_DSCav1 Nosip/Ndufa1；c-2 1364 1267
F-del_DSCav1 Ndufa4/COX6B1；c-3 1372 1267
F-del_DSCav1 Ndufa4/Ndufa1；c-4 1380 1267
F-del_DSCav1 ATP5A1/PSMB3；c-5 1388 1267
F-del_DSCav1 Rpl31/PSMB3；d-1 1396 1267
F-del_DSCav1 ATP5A1/CASP1；d-2 1404 1267
F-del_DSCav1 Slc7a3/Gnas；d-3 1412 1267
F-del_DSCav1 HSD17B4/Ndufa1；d-4 1420 1267
F-del_DSCav1 Slc7a3/Ndufa1；d-5 1428 1267
F-del_DSCav1 TUBB4B/RPS9；e-1 1436 1267
F-del_DSCav1 Rpl31/RPS9；e-2 1444 1267
F-del_DSCav1 Mp68/RPS9；e-3 1452 1267
F-del_DSCav1 Nosip/RPS9；e-4 1460 1267
F-del_DSCav1 ATP5A1/RPS9；e-5 1468 1267
F-del_DSCav1 ATP5A1/COX6B1；e-6 1476 1267
F-del_DSCav1 ATP5A1/Gnas；f-1 1484 1267
F-del_DSCav1 ATP5A1/Ndufa1；f-2 1492 1267
F-del_DSCav1 HSD17B4/COX6B1；f-3 1500 1267
F-del_DSCav1 HSD17B4/Gnas；f-4 1508 1267
F-del_DSCav1 Mp68/COX6B1；f-5 1516 1267
F-del_DSCav1 Mp68/Ndufa1；g-1 1524 1267
F-del_DSCav1 Ndufa4/CASP1；g-2 1532 1267
F-del_DSCav1 Ndufa4/Gnas；g-3 1540 1267
F-del_DSCav1 Nosip/CASP1；g-4 1548 1267
F-del_DSCav1 Rpl31/CASP1；g-5 1556 1267
F-del_DSCav1 Rpl31/COX6B1；h-1 1564 1267
F-del_DSCav1 Rpl31/Gnas；h-2 1572 1267
F-del_DSCav1 Rpl31/Ndufa1；h-3 1580 1267
F-del_DSCav1 Slc7a3/CASP1；h-4 1588 1267
F-del_DSCav1 Sic7a3/COX6B1；h-5 1596 1267
F-del_DSCav1 Slc7a3/RPsg；i-1 1604 1267
F-del_DSCav1 RPL32(32L4)/ALB7；i-2 1612 1267
转染和流式细胞仪分析的详细说明：
将293T细胞以200000个细胞/孔(200000个细胞/2ml)的密度接种在6孔板中。在Opti-MEM中，将每种RNA与Lipofectamine2000以1/1.5(重量/体积)的比例复合20分钟。然后将脂质复合的mRNA添加到细胞中，以每孔2μg RNA总体积为500uL进行转染。转染开始后4h，将转染溶液换成2000uL/孔的完全培养基。在进行FACS分析之前，将细胞进一步保持在37℃和5％CO2下。
转染24小时后，使用标准程序通过FACS分析定量目的抗原的表达。简而言之，将细胞分离(40mM Tris HCl pH 7.5 150mM NaCl，1mM EDTA在H2O中；在室温下5分钟)，用PBS洗涤，并用抗RSV-F的小鼠抗体(Millipore，目录号：MAB8262)和荧光标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Sigma，目录号：F5262)在表面上染色。将细胞重悬于100uL PFEA缓冲液(PBS+2％FCS+2mM EDTA+0.01％NaN3)中，并使用BD FACS Canto II分析。用Aqua荧光活性染料(Invitrogen)进行活/死染色。
将结果与设置为100％水平的来自实施例3的参考构建体的表达进行比较，该参考构建体包含RPL32/ALB7 UTR组合(SEQ ID NO：1612)。分析结果如图9所示。
结果
从图9可以看出，与包含参考UTR组合(RPL32/ALB7；i-2)的构建体相比，根据本发明的包含UTR组合的mRNA构建体的表达性能大大提高。
实施例5：用配制成LNP的编码RSV-F的mRNA对棉鼠进行疫苗接种和攻击棉鼠的研 究
基于实施例4的UTR筛选的结果，在疫苗接种实验中使用具有用于优化mRNA表达的UTR组合的mRNA构建体。
在该实验中，比较了根据本发明的编码具有不同UTR组合的RSV-F(F\F-del或F-del_DSCav1)的mRNA疫苗。根据实施例1制备mRNA-LNP疫苗。棉鼠在第0天和第28天接受了两次肌肉注射mRNA-LNP疫苗的接种。每个剂量包含2μg或10μg mRNA-LNP。对照动物在第0天接受鼻内105pfu的活RSV/A2病毒或肌内福尔马林灭活的RSV病毒的单次疫苗接种。其他对照动物仅接受缓冲液(参见表13)。
表13：实施例5的动物组和疫苗接种时间表
Figure BPA0000294887150001851
使用ELISA或PRNT确定抗RSV免疫应答
如前所述确定抗RSV免疫应答的诱导。
攻击棉鼠的研究
在第63天，用100uL的10exp5pfu的活RSV/A2病毒鼻内攻击接种疫苗的动物。一个对照组保持未治疗和未感染。在第68天处死所有动物，并收获鼻组织和肺组织。
受攻击的棉鼠肺中的RSV滴度
在第68天(即用10exp5pfu的活RSV/A2病毒鼻内攻击后5天)收集动物的肺，并通过如上所述的噬菌斑测定在一个肺叶中定量RSV/A2滴度。另外，通过定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)确定RSV病毒基因组拷贝数(通过测量RSV NS-1基因的拷贝数)和细胞因子mRNA水平。
受攻击的棉鼠鼻组织中的RSV滴度
在第68天(即用105pfu的活RSV/A2病毒鼻内攻击后5天)收集动物的鼻组织。如上所述定量病毒滴度。另外，通过定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)确定RSV病毒基因组拷贝数(通过测量RSV NS-1基因的拷贝数)和细胞因子mRNA水平。
受攻击的棉鼠的肺组织病理学
在第68天(即用105pfu的活RSV/A2病毒鼻内攻击后5天)收集动物的肺，并通过如上所述的组织病理学分析一个肺叶。
实施例6：用配制成LNP的编码RSV-F的mRNA对棉鼠进行疫苗接种和攻击棉鼠的研 究
在该实验中，比较了编码RSV-F(F_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut3(和/或另外使用F_DSCav1_mut0、_mut4、_mut5、_mut6、_mut7、_mut8和/或F-del_DSCav1_mut0、_mut4、_mut5、_mut6、_mut7、_mut8)的mRNA疫苗。根据实施例1制备mRNA-LNP疫苗。棉鼠在第0和28天接受了两次肌肉注射mRNA-LNP疫苗的接种。每个剂量包含2μg或10μg mRNA-LNP。对照动物在第0天接受鼻内105pfu的活RSV/A2病毒或肌内福尔马林灭活的RSV病毒的单次疫苗接种。其他对照动物仅接受缓冲液(参见表14)。
表14：实施例6的动物组
组 测试项 RNA ID SEQ ID NO：RNA SEQ ID NO：蛋白 施用途径
1 F_DSCav1_mut1 R6771 1997 1636 i.m.
2 F-del_DSCav1_mut1 R6774 2366 2005 i.m.
3 F_DSCav1_mut2 R6772 2735 2374 i.m.
4 F-del_DSCav1_mut2 R6773 3104 2743 i.m.
5 F_DSCav1_mut3 R6770 3473 3112 i.m.
6 F-del_DSCav1_mut3 R6775 3842 3481 i.m.
7 活RSV/A2病毒 i.n.
8 UV-灭活的RSV/A2 i.m.
9 FI-RSV i.m.
10 缓冲液 i.m.
11 未经治疗/未感染
使用ELISA或PRNT确定抗RSV免疫应答
如前所述确定抗RSV免疫应答的诱导。
攻击棉鼠的研究
在第63天，用100uL的10exp5pfu活RSV/A2病毒鼻内攻击接种疫苗的动物。一个对照组保持未治疗和未感染。在第68天处死所有动物，并收获鼻组织和肺组织。
受攻击的棉鼠肺中的RSV滴度
在第68天(即用10exp5 pfu的活RSV/A2病毒鼻内攻击后5天)收集动物的肺，并通过如上所述的噬菌斑测定在一个肺叶中定量RSV/A2滴度。另外，通过定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)确定RSV病毒基因组拷贝数(通过测量RSV NS-1基因的拷贝数)和细胞因子mRNA水平。
受攻击的棉鼠鼻组织中的RSV滴度
在第68天(即用105pfu的活RSV/A2病毒鼻内攻击后5天)收集动物的鼻组织。如上所述定量病毒滴度。另外，通过定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)确定RSV病毒基因组拷贝数(通过测量RSV NS-1基因的拷贝数)和细胞因子mRNA水平。
受攻击的棉鼠的肺组织病理学
在第68天(即用105pfu的活RSV/A2病毒鼻内攻击后5天)收集动物的肺，并通过如上所述的组织病理学分析一个肺叶。
实施例7：用配制成LNP的编码RSV-F的mRNA和其他RSV抗原对棉鼠进行疫苗接种和 攻击棉鼠的研究
为了扩大和优化RSV特异性免疫应答，特别是增加T细胞依赖性免疫应答，根据实施例1制备了编码不同RSV蛋白(RSV F(F0、F、F-del、F_DSCav1 F-del_DSCav1或F_DSCav1mut0至F_DSCav1mut8或F-del_DSCav1mut0至F-del_DSCav1mut8)的mRNA疫苗。为了评估单一或组合疫苗的效果，如表9所示，这些疫苗可以单独或组合施用。棉鼠在第0天和第28天接受两次肌内注射(i.m.)接种每种抗原分别含2μg或10μg mRNA的mRNA-LNP疫苗。用福尔马林灭活的RSV和/或活RSV/A2肌内注射(i.m.)免疫其他组，以比较它们与mRNA疫苗的免疫原性。其他对照动物仅接受缓冲液(参见表15)。RSV特异性免疫应答通过Elisa或细胞内细胞因子染色(ICS)确定。
表15：实施例7的动物组
Figure BPA0000294887150001881
Figure BPA0000294887150001891
对于实施例7的疫苗接种实验，使用至少两种不同的序列优化的DNA模板(每个均如实施例1中所述产生)根据PCT申请WO2017/109134中公开的方法产生多价mRNA组合物/疫苗(例如第6组至第10组)。简而言之，将DNA构建体混合物(每个构建体均包含不同的编码序列和T7启动子)用作同时进行RNA体外转录以生成mRNA构建体混合物的模板。随后，将获得的RNA混合物用于使用RP-HPLC进行共纯化。之后，将获得的纯化的RNA混合物配制成LNP(如1.4节所述)，以生成配制成LNP的多价RNA组合物/疫苗。
使用ELISA PRNT确定抗RSV免疫应答：
如前所述，用合适的重组蛋白或肽进行检测来确定抗RSV免疫应答的诱导。
细胞内细胞因子染色(ICS)：
根据标准方案从接种的小鼠和对照小鼠分离脾细胞。简要地，将分离的脾脏通过细胞滤网研磨，并在PBS/1％FBS中洗涤，然后进行红细胞裂解。用PBS/1％FBS进行充分洗涤后，将脾细胞接种到96孔板中(2x106个细胞/孔)。第二天，在存在GolgiPlugTM/GolgiStopTM混合物(分别包含布雷菲德菌素A和莫能菌素的蛋白转运抑制剂；BD Biosciences)的情况下，在37℃用合适的RSV肽或无关的对照肽和2.5μg/ml的抗CD28抗体(BD Biosciences)刺激细胞6小时。刺激后，根据制造商的说明，使用Cytofix/Cytoperm试剂(BD Biosciences)洗涤细胞并对其细胞内细胞因子进行染色。以下抗体用于染色：CD8-PECy7(1∶200)、CD3-FITC(1∶200)、IL2-PerCP-Cy5.5(1∶100)、TNFα-PE(1∶100)、IFNγ-APC(1∶100)(eBioscience)、CD4-BD Horizon V450(1∶200)(BD Biosciences)，并与1∶100稀释的Fcγ-block一起孵育。Aqua Dye用于区分活/死细胞(Invitrogen)。使用Canto II流式细胞仪(Becton Dickinson)收集细胞。使用FlowJo软件(Tree Star，Inc.)分析流式细胞仪数据。
攻击棉鼠的研究：
在第63天，用100uL的10exp5pfu的活RSV/A2病毒鼻内攻击接种疫苗的动物。一个对照组保持未治疗和未感染。在第68天处死所有动物，并收获鼻组织和肺组织。
攻击棉鼠的研究：
在第63天，用100uL的10exp5pfu的活RSV/A2病毒鼻内攻击接种疫苗的动物。一个对照组保持未治疗和未感染。在第68天处死所有动物，并收获鼻组织和肺组织。如实施例2所述，在第49天收集血清，并使用噬斑减少中和试验(PRNT)测量RSV病毒中和滴度(VNT)。
受攻击的棉鼠肺中的RSV滴度：
在第68天(即用10exp5pfu的活RSV/A2病毒鼻内攻击后5天)收集动物的肺，并通过如上所述的噬菌斑测定在一个肺叶中定量RSV/A2滴度。另外，通过定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)确定RSV病毒基因组拷贝数(通过测量RSV NS-1基因的拷贝数)和细胞因子mRNA水平。
受攻击的棉鼠鼻组织中的RSV滴度：
在第68天(即用105pfu的活RSV/A2病毒鼻内攻击后5天)收集动物的鼻组织。如上所述定量病毒滴度。另外，通过定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)确定RSV病毒基因组拷贝数(通过测量RSV NS-1基因的拷贝数)和细胞因子mRNA水平。
受攻击的棉鼠的肺组织病理学：
在第68天(即用105pfu的活RSV/A2病毒鼻内攻击后5天)收集动物的肺，并通过如上所述的组织病理学分析一个肺叶。
实施例8：不同RSV F蛋白在HeLa细胞中的表达及FACS分析
为了确定mRNA构建体的体外蛋白表达，用编码RSV F抗原的mRNA瞬时转染HeLa细胞，并用合适的抗F蛋白抗体(在小鼠中培养)染色RSV F，并用FITC偶联的抗小鼠二抗(来自Sigma的F5262)复染。转染前24小时，将HeLa细胞以400000个细胞/孔的密度接种在6孔板中的细胞培养基(RPMI，10％FCS，1％L-谷氨酰胺，1％Pen/Strep)中。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)将HeLa细胞用2μg未配制的mRNA转染。根据实施例1制备并在表16中列出的mRNA构建体用于实验中(也参见表9)，包括阴性对照(注射用水)。转染后24小时，HeLa细胞用合适的抗RSV-F抗体(在小鼠中培养；1∶500)和抗小鼠FITC标记的二抗(1∶500)染色，随后使用FACS Diva软件在BD FACS Canto II上通过流式细胞仪(FACS)进行分析。使用FlowJo软件包(Tree Star，Inc.)对荧光FITC信号进行定量分析。对细胞进行细胞内或细胞表面染色。结果显示在图10a和10b中，代表两个不同的独立实验。
表16：实施例8中使用的mRNA构建体的概述
RNA ID 抗原 UTR设计 SEQ ID NO：RNA SEQ ID NO：蛋白 参见图
<u>R6939</u> F0 -/muag；i-3 475 68 10a，10b
<u>R6808</u> F0_DSCav1 -/muag；i-3 1259 898 10a，10b
<u>R6770</u> F_DSCav1_mut3 -/muag；i-3 3473 3112 10a
<u>R6771</u> F_DSCav1_mut1 -/muag；i-3 1997 1636 10a
<u>R6772</u> F_DSCav1_mut2 -/muag；i-3 2735 2374 10a
<u>R6940</u> F-del -/muag；i-3 890 483 10a，10b
<u>R5453</u> F-del_DSCav1 -/muag；i-3 1628 1267 10a，10b
<u>R6775</u> F-del_DSCav1_mut3 -/muag；i-3 3842 3481 10a
<u>R6774</u> F-del_DSCav1_mut1 -/muag；i-3 2366 2005 10a
<u>R6773</u> F-del_DSCav1_mut2 -/muag；i-3 3104 2743 10a
<u>R7454</u> F_DSCav1_mut0 -/muag；i-3 4211 3850 10b
<u>R7456</u> F_DSCav1_mut5 -/muag；i-3 5687 5326 10b
<u>R7458</u> F_DSCav1_mut4 -/muag；i-3 4949 4588 10b
<u>R7455</u> F-del_DSCav1_mut0 -/muag；i-3 4580 4219 10b
<u>R7457</u> F-del_DSCav1_mut5 -/muag；i-3 6056 5695 10b
<u>R7459</u> F-del_DSCav1_mut4 -/muag；i-3 5318 4957 10b
结果：
结果表明，使用的mRNA构建体导致可检测的细胞内RSV F蛋白表达以及在细胞表面的可检测蛋白表达。与F全长构建体相比，具有缺失的C末端(F-del)的RSV F构建体(例如R6940、R5453、R6775、R6774、R6773、R7455、R7457、R7459)显示出增加的细胞表面蛋白表达。编码F-del_DSCav1_mut0(R7455)的构建体表现出最高的表达。
结果例证了本发明的编码F蛋白(F0、F-del、F0_DSCav1、F-del_DSCav1、F_DSCav1_mut0、F-del_DSCav1_mut0、F_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut2、F_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut3、F_DSCav1_mut4、F-del_DSCav1_mut4、F_DSCav1_mut5、F-del_DSCav1_mut5)的mRNA在细胞中翻译并存在于细胞表面，这是基于mRNA的RSV疫苗的先决条件。
实施例9：用配制成LNP的编码RSV-F的mRNA对棉鼠进行疫苗接种和RSV攻击棉鼠的 研究
本实施例表明，编码不同的融合前稳定的RSV-F抗原的根据本发明的配制成LNP的mRNA在棉鼠中诱导强的、功能性的和保护性的免疫应答。
该实验比较了全长F或截短F(F-del)编码不同融合前稳定的RSV-F变体(mut1、mut2、mut3)的mRNA-LNP。根据实施例1制备mRNA-LNP疫苗。棉鼠在第0天和第28天接受了两次肌肉注射mRNA-LNP疫苗的接种。每个剂量包含100μg mRNA-LNP。对照动物在第0天接受了105pfu的活RSV/A2病毒或UV灭活的RSV/A2病毒的单次疫苗接种，或在第0天和第28天接受了福尔马林灭活的RSV病毒(FI RSV)的两次疫苗接种。其他对照动物仅接受缓冲液(参见表17)。
表17：实施例9的动物组和疫苗接种时间表
Figure BPA0000294887150001941
ELISA测定抗RSV F蛋白抗体：
在第0天、第28天、第49天和第63天收集血液样本，以确定抗RSV F抗体的滴度。用从感染了RSV/A2的HEp-2细胞或甲醇/丙酮固定的感染了RSV/B的HEp-2细胞提取的纯化F蛋白涂覆ELISA板。使用给定的血清稀释液孵育经涂覆的板。使用同种型特异性抗棉鼠抗体，结合链霉亲和素-HRP(辣根过氧化物酶)和TMB底物，检测特异性抗体与F蛋白的结合。
病毒中和滴度的测定：
在第0天、第28天、第49天和第63天收集血清，并使用噬斑减少中和测试(PRNT)测量RSV病毒中和滴度(VNT)。将稀释的血清样品在室温下与RSV/A2或RSV/B(25PFU至50PFU)孵育1小时，并一式两份接种到24孔板的汇合HEp-2单层中。在5％CO2培养箱中于37℃培养1小时后，将孔用0.75％甲基纤维素培养基覆盖。培养4天后，除去覆盖物，将细胞固定并染色。在病毒对照的60％降低终点确定相应的相互中和抗体滴度。
攻击棉鼠的研究：
在第63天，用100uL的105pfu的活RSV/A2病毒鼻内攻击接种疫苗的动物。一个对照组保持未治疗和未感染。在第68天处死所有动物，并收获鼻组织和肺。
受攻击的棉鼠鼻组织中的RSV滴度
在第68天(即用105pfu的活RSV/A2病毒鼻内攻击后5天)收集动物的肺和鼻组织。通过离心将鼻匀浆与肺匀浆一样进行澄清，并在EMEM中稀释。将汇合的HEp-2单层一式两份用稀释的匀浆在24孔板中感染。在5％CO2培养箱中于37℃培养1小时后，将孔用0.75％甲基纤维素培养基覆盖。培养4天后，除去覆盖物，将细胞固定并用0.1％结晶紫染色1小时，然后漂洗并风干。对噬菌斑计数并以每克组织的噬菌斑形成单位表示病毒滴度。
肺组织病理学
解剖肺，并用10％中性福尔马林缓冲液充盈至其正常体积，然后浸入相同的固定液中。固定后，将肺部包埋在石蜡中，切片并用苏木精和曙红(H&E)染色。评价了肺部炎症的四个参数：细支气管周围炎(细支气管周围的炎性细胞浸润)、血管周炎(细血管周围的炎性细胞浸润)、间质性肺炎(炎性细胞浸润和肺泡壁增厚)和肺泡炎(肺泡空间内的细胞)。在0-4严重性等级上对切片进行盲评分。随后将分数转换为0-100％的组织病理学量表。
结果：
图11示出了根据本发明的配制成LNP的编码不同RSV F蛋白(F0、F0_DSCav1、F_DSCav1_mut3、F_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F-del、F-del_DSCav1、F-del_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2)的mRNA构建体在棉鼠中诱导针对RSV-F蛋白的体液免疫应答。通过ELISA确定抗体的总IgG滴度。
编码截短的F(F-del)(F-del、F-del_DSCav1、F-del_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2)的mRNA构建体比在d28具有全长F序列的构建体诱导更高和更快的应答，在随后的时间点没有可检测到显著差异。与野生型构建体(F0和F-del)相比，稳定构建体(F0_DSCav1、F_DSCav1_mut3、F_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1、F-del_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2)最初产生较低的ELISA滴度。在以后的时间点水平没有显著差异。
与接种活病毒疫苗相比，初次疫苗接种后(第28天)，编码稳定化和截短的F蛋白(F-del_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2)的构建体以100μg的剂量诱导了更高的RSV-F特异性IgG滴度。加强疫苗接种后，所有测试的配制成LNP的RSV-F mRNA疫苗均可诱导通过ELISA检测到的体液免疫应答，这比对照疫苗的应答更为突出。
从图12中可以看出，所有配制成LNP的RSV-F(F0、F0_DSCav1、F_DSCav1_mut3、F_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F-del、F-del_DSCav1、F-del_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2)mRNA疫苗均可诱导棉鼠中RSV特异性功能抗体的形成，如高病毒中和抗体滴度所示。配制成LNP的RSV-F截短构建体(F-del、F-del_DSCav1、F-del_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2)诱导应答比F全长构建体更高和更快。根据本发明的用于融合前稳定的构建体(F_DSCav1_mut3、F_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2)引起的应答高于F0、F0_DSCav1、F-del、F-del_DSCav1。
从图13可以看出，来自RSV攻击棉鼠的研究的肺组织病理学分析揭示了各种动物组的不同病理学评分。从组织病理学可以得出结论，与使用福尔马林灭活的RSV疫苗接种的组一样，接种mRNA的接种组均未显示出肺部病理学增强。与福尔马林灭活的RSV组相比，所有接种了mRNA的组的平均毛细支气管炎病理评分均较低。配制成LNP的RSV-F截短构建体(F-del、F-del_DSCav1、F-del_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2)的病理评分通常低于F全长构建体。相比于F0、F0_DSCav1、F-del、F-del_DSCav1，根据本发明的用于融合前稳定的构建体(F_DSCav1_mut3、F_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2)产生更好的应答(较低的病理学评分)。
从图14a可以看出，所有在该实验中测试的配制成LNP的RSV-F mRNA疫苗均降低了受RSV病毒攻击的棉鼠的肺病毒滴度，从而限制了肺的RSV感染。用配制成LNP的mRNA疫苗接种过的所有动物组均显示病毒滴度低于进行的病毒滴定的检测水平。结果证明就病毒肺滴度而言，接种疫苗的棉鼠受到了保护。相比之下，与缓冲液对照组相比，福尔马林灭活的病毒疫苗(FI RSV)和UV灭活的RSV/A2病毒控制仅使肺病毒滴度减少最小。
从图14b中可以看出，配制成LNP的配制成LNP的RSV-F mRNA疫苗可大大降低受RSV病毒攻击的棉鼠鼻组织中的病毒滴度，从而减少鼻子的RSV感染。与mRNA疫苗相比，基于福尔马林灭活病毒(FI RSV)和UV灭活的RSV/A2病毒对照的疫苗无法降低鼻病毒滴度。仅通过根据本发明的融合前稳定化来实现对鼻子的完全保护(F_DSCav1_mut3、F_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2)。
总之，结果表明，配制成LNP的编码RSV-F截短蛋白(F-del、F-del_DSCav1、F-del_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2)的RNA构建体通常比编码完整的F蛋白的RNA构建体更具免疫原性。与编码根据本发明的进一步稳定的F蛋白的构建体(F_DSCav1_mut3、F_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2)相比，仅具有DSCav1突变的构建体(F0_DSCav1和F-del_DSCav1)作为基于mRNA的疫苗是次优的。
为了进一步提高基于mRNA的疫苗的效率，设计了几种替代的RSV-F mRNA构建体，结合了有益的截短的F-del蛋白，这些突变体具有稳定融合前构象的其他突变。如在以下实施例中所见，测试了那些mRNA构建体。
实施例10：用配制成LNP的编码RSV-F的mRNA对棉鼠进行疫苗接种和RSV攻击棉鼠 的研究
本实施例表明，根据本发明的配制成LNP的编码不同的融合前稳定的RSV-F抗原的mRNA在棉鼠中诱导强的、功能性的和保护性的免疫应答。
根据实施例1制备mRNA-LNP疫苗。棉鼠在第0天或第0天和第28天接受一次或两次肌内注射mRNA-LNP疫苗。每个剂量包含100μg mRNA-LNP。对照动物在第28天肌肉内接种了105pfu的活RSV/A2病毒或福尔马林灭活的RSV病毒(FI RSV)。其他对照动物仅接受缓冲液(参见表18)。
表18：实施例10的动物组和疫苗接种时间表
Figure BPA0000294887150001981
Figure BPA0000294887150001991
ELISA和病毒中和滴度测定抗RSV F蛋白抗体
如前所述，在第0天、第28天、第49天和第63天收集血样，以确定抗RSV F抗体滴度和使用斑块减少中和测试(PRNT)测量的RSV病毒中和滴度(VNT)(参见实施例9)。
攻击棉鼠的研究：
在第63天，用100uL的105pfu的活RSV/A2病毒鼻内攻击接种疫苗的动物。一个对照组保持未治疗和未感染。在第68天处死所有动物，并收获鼻组织和肺。如前所述，对被攻击的棉鼠的鼻组织中的RSV滴度和肺组织病理学进行了分析(参见实施例9)。
结果：
图15显示了所有测试的本发明的配制成LNP的编码不同RSV F蛋白(F-del、F-del_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut0、F-del_DSCav1_mut5、F-del_DSCav1_mut4)的mRNA构建体在棉鼠中诱导针对RSV-F蛋白的体液免疫应答。通过ELISA确定抗体的总IgG滴度。与编码截短的野生型F蛋白F-del的RNA构建体相比，编码稳定的F蛋白(F-del_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut0、F-del_DSCav1_mut5、F-del_DSCav1_mut4)的RNA构建体最初产生较低的ELISA滴度。通过使用较高的血清稀释度进行ELISA，在以后的时间点也可以检测到这种趋势(数据未显示)。二次免疫可以显著增强IgG应答。
从图16可以看出，所有的配制成LNP的RSV-F(F-del、F-del_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut0、F-del_DSCav1_mut5、F-del_DSCav1_mut4)mRNA疫苗均在棉鼠中诱导了RSV特异性功能抗体的形成，如高病毒中和抗体滴度所示。根据本发明的用于融合前稳定化的配制成LNP的构建体(F-del_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut0、F-del_DSCav1_mut5、F-del_DSCav1_mut4)诱导比F-del更高或相当的应答。编码融合前稳定的蛋白F-del_DSCav1_mut5的RNA构建体R7457诱导最高的VNT(与先前实验中最佳融合前稳定的构建体诱导的最佳结果相比(实施例9，R6773)。
肺组织病理学分析表明，与使用福尔马林灭活的RSV疫苗接种的组一样，接种mRNA的组均未显示出肺部病理学增强(参见图17a(关于周围纤维化炎和皮囊炎)和图17b(关于间质性肺炎和肺泡炎))。根据本发明的用于融合前稳定的构建体(F-del_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut0、F-del_DSCav1_mut5、F-del_DSCav1_mut4)比F-del产生更好的应答(较低的病理学评分)。与仅接受一次疫苗接种的动物相比，接受两次疫苗接种的动物显示出较低的病理学评分。
从图18a可以看出，所有在该实验中测试的配制成LNP的RSV-F mRNA疫苗均降低了受RSV病毒攻击的棉鼠的肺病毒滴度，从而限制了肺的RSV感染。即使只接受一次疫苗接种的组也是如此。结果证明就肺病毒滴度而言，接种疫苗的棉鼠受到了保护。相比之下，与缓冲液对照组相比，福尔马林灭活的病毒疫苗(FI RSV)仅使肺部病毒滴度降低最小。
从图18b中可以看出，配制成LNP的RSV-F mRNA疫苗大大降低了受RSV病毒攻击的棉鼠鼻组织中的病毒滴度，从而减少鼻子的RSV感染。与mRNA疫苗相比，基于福尔马林灭活病毒(FI RSV)的疫苗无法降低鼻病毒滴度。仅接受过两次疫苗接种的某些组(例如R7457(F-del_DSCav_mut4)和R7459(F-del_DSCav_mut5))获得完全的鼻子保护。
总之，结果表明，与编码野生型截短的F蛋白F_del的RNA构建体相比，配制成LNP的编码融合前稳定的RSV-F截短的蛋白(F-del_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut0、F-del_DSCav1_mut5、F-del_DSCav1_mut4)的RNA构建体通常具有更高的功能滴度，并且实现了更明显的抗感染保护能力。编码F-del_DSCav1_mut2或F-del_DSCav1_mut5(R6773，R7457)的RNA构建体达到了最佳结果。
实施例11：使用兔网织红细胞裂解液系统表达不同的RSV T细胞抗原
为了确定根据本发明第二方面的mRNA构建体(编码RSV基质蛋白M、磷蛋白P、核蛋白N和基质蛋白M2-1蛋白的mRNA构建体)的体外蛋白表达，根据制造方案将未配制的RNA(根据实施例1制备)与Promega兔网状细胞裂解液系统的组分混合。裂解物含有蛋白合成所需的细胞成分(tRNA，核糖体，氨基酸，起始、延伸和终止因子)。使用来自Lysate System Kit的荧光素酶RNA作为阳性对照，通过SDS-Page和蛋白质印迹法分析(IRDye 800CW链霉亲和素抗体(1∶2000))分析翻译结果。
表19总结了测试的RNA构建体。
表19：实施例11中使用的mRNA构建体的概述
RNA ID 抗原 UTR设计 SEQ ID NO：RNA SEQ ID NO：蛋白 预测kDa
R7595 M -/muag；i-3 10046 9684
R7596 P -/muag；i-3 10999 10637 27.1
R7597 N -/muag；i-3 10496 10134 43.4
R7598 M2-1 -/muag；i-3 11545 11183 22.1
Luc 61
结果：
结果(见图19)显示，所用的mRNA构建体产生可检测的蛋白表达，这是基于mRNA的RSV疫苗的前提条件(凝胶上RSV P和M2-1的大小变化可能是由于磷酸化引起的，如Richard等人，2018或Hardy和Wertz，2000 PMID：29489893和10846068中所述)。
实施例12：单独使用配制成LNP的编码不同RSV T细胞抗原的mRNA和将其与RSV F (F-del)联合使用对小鼠进行疫苗接种
本实施例分析了单独使用根据本发明第二方面的配制成LNP的编码不同RSV T细胞抗原的mRNA(RSV M、P、N和M2-1)或将其与配制成LNP的编码截短的RSV F(F-del)的mRNA组合使用。根据实施例1制备mRNA-LNP疫苗。Balb/c小鼠在第0天和第28天接受了两次肌肉注射mRNA-LNP疫苗的接种。每个剂量包含5μg、2.5μg或2.5μg+2.5μg mRNA-LNP(对于接受编码不同抗原的mRNA的组，分别配制LNP，并在施用前混合)。对照动物仅接受缓冲液(参见表20)。通过ELISA、FACS、PRNT和ICS分析体液以及细胞免疫应答和中和抗体。
表20：实施例12的动物组和疫苗接种时间表
Figure BPA0000294887150002021
Figure BPA0000294887150002031
ELISA测定抗RSV F蛋白抗体：
在第0天、第14天、第28天和第49天收集血液样本，以确定抗RSV F抗体的滴度。ELISA板涂有重组人RSV融合糖蛋白(hRSV F蛋白(A2；His-标签；Sino Biological；目录号：11049-V08B))。使用给定的血清稀释液培养经涂覆的板。使用同种型特异性抗小鼠大鼠抗体，结合链霉亲和素-HRP(辣根过氧化物酶)和
Figure BPA0000294887150002032
UltraRed试剂(Invitrogen，参考号A36006)，检测特异性抗体与F蛋白的结合。
通过FACS检测抗原特异性体液抗体应答的检测。
使用脂转染胺将Hela细胞用2μg RSV mRNA构建体(R7595、R7596、R7597、R7598)转染。转染后20小时收获细胞，并以每孔1x105的密度接种到96孔板中。将细胞与接种的小鼠的相应血清(第28天和第49天的血清，以1∶50稀释)一起孵育，然后进行FITC缀合的抗小鼠IgG抗体染色。使用DIVA软件在BD FACS Canto II上采集细胞，并通过FlowJo进行分析。结果显示在图21a(第28天)和图21b(第49天)中。作为读出，使用FITC阳性细胞的百分比(活细胞中的百分比)。
病毒中和滴度的测定：
在第49天收集血清，并使用噬斑减少中和测试(PRNT)测量RSV病毒中和滴度(VNT)。将稀释的血清样品在室温下与RSV/A2(25PFU至50PFU)孵育1小时，并一式两份接种到24孔板的汇合HEp-2单层中。在5％CO2培养箱中于37℃培养1小时后，将孔用0.75％甲基纤维素培养基覆盖。培养4天后，除去覆盖物，将细胞固定并染色。在病毒对照的60％降低终点确定相应的相互中和抗体滴度。
使用FACS通过ICS测定小鼠细胞免疫应答
根据标准方案从接种的小鼠和对照小鼠分离脾细胞和肺细胞。简要地，将分离的脾脏通过细胞滤网研磨并在PBS(1％FCS)中洗涤。离心后，将细胞沉淀物重悬于剩余的上清液，用红细胞裂解缓冲液处理，并用PBS(1％FCS)反复洗涤。最后，将脾细胞重悬于FCS/10％DMSO中，转移至冷冻管中并保存在-80℃下。使用RPMI-1640培养基(10％FCS；2mM谷氨酰胺；1％Pen/Strep)灌注肺，收获，然后在4℃下储存在RPMI-1640培养基(10％FCS；2mM谷氨酰胺；1％Pen/Strep)中，直到根据制造商的说明使用Miltenyi Biotec的Lung DissociationKit从小鼠分离出肺细胞。对于ICS，将2 x 106个细胞(脾细胞或肺细胞)一式两份接种在圆底平板中，并用RSV M2-1特异性肽(VYNTVISYI、SYIGSINNI、SYIESNRKN、KSIDTLSEI)、RSV F特异性肽(FYQSTCSAV、TYMLTNSEL、KYKNAVTEL、KIMTSKTDV)、RSF M特异性肽(KHTATRFAI、AQMPSKFTI、KYIKPQSQF、TYLRSISVR)、RSV P特异性肽(SPITSNSTI、SYEEINDQT)或RSV N特异性肽(SYKKMLKEM、FYHILNNPK、KYTIQRSTG、GYHVKANGV)刺激。高尔基体封闭(GolgiPlug 1/1000)并培养至细胞内细胞因子蓄积后，使用Aqua-dye对细胞进行活/死染色。然后，使用针对脾细胞的抗体α-CD8-APC-H7(1/100)、α-CD4-BD-Horizon V450(1/200)、α-Thy1.2-FITC(1/300)和α-CD107a PE-Cy7(1/100)和针对肺细胞的抗体α-CD8-APC-H7(1/100)、α-CD4-BD-Horizon V450(1/200)、α-Thy1.2-FITC(1/300)、α-CD69-PE(1/100)和α-CD103-PE-Cy7(1/60)对细胞进行表面染色。用Cytofix/Cytoperm处理后，肺细胞用α-IFNg-APC(1/100)进行细胞内染色，脾细胞另外用α-TNFα-PE(1/100)进行染色。最后，使用DIVA软件在BD FACSCanto II上采集细胞，并通过FlowJo进行分析。
结果：
小鼠免疫原性研究的结果，例如体液免疫应答可见于图20(图20a：抗RSV F IgG，图20b：抗RSV F IgG2a)。通常，所有组均诱导体液免疫应答，而单独的F-del与F-del+T细胞抗原组之间没有显著差异。向编码RSV F-del的mRNA疫苗中添加T细胞抗原M、P、N和M2-1不会影响或干扰针对RSV F的免疫应答。这些发现表明，T细胞抗原的共表达不影响RSV F诱导的抗体应答。第二次免疫可以增强免疫应答(参见第49天的应答)。通常，IgG2a滴度比IgG1滴度高10倍，表明主要的是Th1应答。Th1偏倚的免疫应答被认为是潜在的RSV疫苗的重要先决条件，因为Th2偏倚的应答与动物模型中增强的呼吸道疾病(ERD)相关。
如图21a和图21b所示，在免疫小鼠的血清中检测到特异性抗原IgG，表明所施加的mRNA构建体适合于诱导特异性体液免疫应答。此外，结果表明，在第28天已经检测到针对N和M2-1的抗原特异性抗体应答的诱导，而对于M和P免疫，则需要加强免疫。RSV F共免疫后抗原特异性抗体应答降低可能是由于不同的免疫剂量(5μg对2.5μg)引起的。
从图22可以看出，所有的配制成LNP的mRNA疫苗(F、M+F、P+F、N+F、M2-1+F)均可在小鼠中诱导RSV特异性功能抗体的形成，如高病毒中和抗体滴度所显示。针对RSV/A2的血清中和抗体滴度测定显示免疫组之间无显著差异。
从图23中可以看出(图23a肺ICS CD8、图23b脾ICS CD8、图23c脾ICS CD4)，肌肉免疫后，所有含有RSV F，RSV M2-1或两者的疫苗都令人惊讶地在肺中诱导了组织驻留记忆T细胞(TRM)应答，因为可以观察到针对F或特别是M2-1的CD8+TRM细胞增加。肺中TRM细胞应答的诱导可能对潜在的RSV疫苗有利，因为有人提出肺TRM细胞(CD69+和CD103+)可以预防RSV感染。脾细胞分析显示，用RSV F并且尤其是用RSV M2-1免疫使分泌IFNγ和TNF的抗原特异性CD8+和CD4+T细胞增加，表明除了位点特异性应答外，还诱导了全身性T细胞应答。
总而言之，结果表明RSV M2-1诱导了最有希望的T细胞免疫应答，而不影响RSV F诱导的抗体应答。因此，包含编码RSV F的mRNA和RSV M2-1的mRNA的疫苗可能会增强针对RSV感染的保护效力。
实施例13：RSV mRNA疫苗组合物的临庆开发：
为了证明RSV mRNA疫苗组合物的安全性和有效性，启动了临床试验(I期)。对于临床开发，使用已经在GMP条件下产生的RNA(例如，使用WO2016/180430中描述的程序)。
在临床试验中，向一批健康的人类志愿者肌肉内注射包含有利的UTR组合的各个配制成LNP的疫苗组合物。
为了评估根据本发明的疫苗组合物的安全性，在施用后监测对象(重要信号，疫苗接种部位耐受性评估，血液学分析)。
通过确定来自接种对象的血清类中的病毒中和滴度(VNT)来分析免疫的功效。在第0天和完成疫苗接种后收集血样。分析血清中的病毒中和抗体。

Claims (68)

1.一种人工RNA，其包含
a)至少一个异源性5′非翻译区(5′-UTR)和/或至少一个异源性3′非翻译区(3′-UTR)；和
b)与所述3′-UTR和/或5′-UTR可操作地连接的至少一个编码序列，其编码至少一种衍生自RSV融合(F)蛋白或其片段或变体的抗原肽或蛋白。
2.根据权利要求1所述的人工RNA，其中所述至少一个异源性3′-UTR包含衍生自选自PSMB3、ALB7、α-珠蛋白、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9的基因或这些基因中任一个的同源物、片段或变体的3′-UTR的核酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的人工RNA，其中所述至少一个异源性5′-UTR包含衍生自选自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B和UBQLN2的基因或这些基因中任一个的同源物、片段或变体的5′-UTR的核酸序列。
4.根据前述权利要求中任一项所述的人工RNA，其包含
a-1.至少一个衍生自HSD17B4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自PSMB3基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
a-2.至少一个衍生自NDUFA4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自PSMB3基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
a-3.至少一个衍生自SLC7A3基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自PSMB3基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
a-4.至少一个衍生自NOSIP基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自PSMB3基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
a-5.至少一个衍生自MP68基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自PSMB3基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
b-1.至少一个衍生自UBQLN2基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
b-2.至少一个衍生自ASAH1基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
b-3.至少一个衍生自HSD17B4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
b-4.至少一个衍生自HSD17B4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自CASP1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
b-5.至少一个衍生自NOSIP基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自COX6B1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
c-1.至少一个衍生自NDUFA4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
c-2.至少一个衍生自NOSIP基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自NDUFA1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
c-3.至少一个衍生自NDUFA4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自COX6B1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
c-4.至少一个衍生自NDUFA4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自NDUFA1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
c-5.至少一个衍生自ATP5A1基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自PSMB3基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
d-1.至少一个衍生自RPL31基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自PSMB3基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
d-2.至少一个衍生自ATP5A1基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自CASP1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
d-3.至少一个衍生自SLC7A3基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自GNAS基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
d-4.至少一个衍生自HSD17B4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自NDUFA1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
d-5.至少一个衍生自SLC7A3基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自NDUFA1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
e-1.至少一个衍生自TUBB4B基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
e-2.至少一个衍生自RPL31基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
e-3.至少一个衍生自MP68基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
e-4.至少一个衍生自NOSIP基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
e-5.至少一个衍生自ATP5A1基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
e-6.至少一个衍生自ATP5A1基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自COX6B1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
f-1.至少一个衍生自ATP5A1基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自GNAS基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
f-2.至少一个衍生自ATP5A1基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自NDUFA1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
f-3.至少一个衍生自HSD17B4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自COX6B1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
f-4.至少一个衍生自HSD17B4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自GNAS基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
f-5.至少一个衍生自MP68基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自COX6B1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
g-1.至少一个衍生自MP68基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自NDUFA1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
g-2.至少一个衍生自NDUFA4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自CASP1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
g-3.至少一个衍生自NDUFA4基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自GNAS基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
g-4.至少一个衍生自NOSIP基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自CASP1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
g-5.至少一个衍生自RPL31基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自CASP1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
h-1.至少一个衍生自RPL31基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自COX6B1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
h-2.至少一个衍生自RPL31基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自GNAS基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
h-3.至少一个衍生自RPL31基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自NDUFA1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
h-4.至少一个衍生自SLC7A3基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自CASP1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
h-5.至少一个衍生自SLC7A3基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自COX6B1基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
i-1.至少一个衍生自SLC7A3基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自RPS9基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
i-2.至少一个衍生自RPL32基因的5′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的5′-UTR，和至少一个衍生自ALB7基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR；或
i-3.至少一个衍生自α-珠蛋白基因的3′-UTR或其对应的RNA序列、同源物、片段或变体的3′-UTR。
5.根据权利要求4所述的人工RNA，其包含根据a-1(HSD17B4/PSMB3)、a-4(NDUFA4/PSMB3)、c-1(NDUFA4/RPS9)、e-4(NOSIP/RPS9)、g-2(NDUFA4/CASP1)、i-2(RPL32/ALB7)或i-3(α-珠蛋白)的UTR元件，优选根据a-1(HSD17B4/PSMB3)的UTR元件。
6.根据前述权利要求中任一项所述的人工RNA，其中
-衍生自HSD17B4基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：1或2或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-衍生自ASAH1基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：3或4或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-衍生自ATP5A1基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：5或6或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-衍生自MP68基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：7或8或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-衍生自NDUFA4基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：9或10或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-衍生自NOSIP基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：11或12或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-衍生自RPL31基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：13或14或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-衍生自RPL32基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：21或22或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-衍生自SLC7A3基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：15或16或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-衍生自TUBB4B基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：17或18或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-衍生自UBQLN2基因的5′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：19或20或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-衍生自PSMB3基因的3′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：23或24或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-衍生自CASP1基因的3′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：25或26或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-衍生自COX6B1基因的3′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：27或28或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-衍生自GNAS基因的3′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：29或30或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-衍生自NDUFA1基因的3′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：31或32或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-衍生自RPS9基因的3′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：33或34或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-衍生自ALB7基因的3′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：35或36或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-衍生自α-珠蛋白基因的3′-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：37或38或其片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
7.根据前述权利要求所述的人工RNA，其中至少一种衍生自RSV F蛋白的抗原肽或蛋白是全长F蛋白(F0)或具有缺失的C末端的F蛋白(F-del)或其片段或变体。
8.根据前述权利要求所述的人工RNA，其中RSV F蛋白被设计为在融合前构象中稳定抗原。
9.根据前述权利要求中任一项所述的人工RNA，其中RSV F蛋白包含DSCav1突变(S155C、S290C、S190F和V207L)或具有其的片段或变体。
10.根据前述权利要求中任一项所述的人工RNA，其中RSV F蛋白在单个多肽链中包含两个亚基F2和F1，其中F2和F1通过接头元件，优选GS接头连接，以产生稳定的F2-接头-F1蛋白，其中所述F2-接头-F1蛋白优选缺少aa104至aa144。
11.根据前述权利要求中任一项所述的人工RNA，其中RSV F蛋白包含至少一种选自(S46G、A149C、S215P、Y458C、K465Q)、(S46G、E92D、A149C、S215P、Y458C、K465Q)、(S46G、N67I、E92D、A149C、S215P、Y458C、K465Q)、(A149C、Y458C)、(N183GC、N428C)、(Q98C、Q361C、S46G、E92D、L95M、S215P、I217P、I221M、R429K、K465Q)、(Q98C、Q361C、L95M、I221M、R429K)或(N183GC、N428C、S46G、N67I、E92D、S215P、K465Q)或其片段或变体的其他突变。
12.根据前述权利要求中任一项所述的人工RNA，其中RSV F蛋白选自F0、F-del、F0_DSCav1、F_DSCav1_mut0、F_DSCav1_mut1、F_DSCav1_mut2、F_DSCav1_mut3、F_DSCav1_mut4、F_DSCav1_mut5、F_DSCav1_mut6、F_DSCav1_mut7、F_DSCav1_mut8、F-del_DSCav1、F-del_DSCav1_mut0、F-del_DSCav1_mut1、F-del_DSCav1_mut2、F-del_DSCav1_mut3、F-del_DSCav1_mut4、F-del_DSCav1_mut5、F-del_DSCav1_mut6、F-del_DSCav1_mut7、F-del_DSCav1_mut8或其片段或变体。
13.根据前述权利要求中任一项所述的人工RNA，其中至少一个编码序列编码与SEQ IDNO：68、483、898、1267、1636、2005、2374、2743、3112、3481、3850、4219、4588、4957、5326、5695、6064、6433、6802、7171、7540、7909、8279至9683、11726、12095、12464、12833、13940、14309、14678、15047、15416、15785、13202、13571、16154、16523、16892、17261、17630、17999、18368、18737、19106、19475中的任一个或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的至少一个氨基酸序列。
14.根据前述权利要求中任一项所述的人工RNA，其中至少一个编码序列包含与SEQ IDNO：69至77、484至492、899至906、1268至1275、1637至1644、2006至2013、2375至2382、2744至2751、3113至3120、3482至3489、3851至3858、4220至4227、4589至4596、4958至4965、5327至5334、5696至5703、6065至6072、6434至6441、6803至6810、7172至7179、7541至7548、7910至7917、11727至11734、12096至12103、12465至12472、12834至12841、13941至13948、14310至14317、14679至14686、15048至15055、15417至15424、15786至15793、13203至13210、13572至13579、16155至16162、16524至16531、16893至16900、17262至17269、17631至17638、18000至18007、18369至18376、18738至18745、19107至19114、19476至19483、21363至21384、21389至21410中的任一个或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的至少一个核酸序列。
15.根据前述权利要求中任一项所述的人工RNA，其中至少一个编码序列是密码子经修饰的编码序列，其中与由相应的野生型编码序列编码的氨基酸序列相比，由至少一个密码子经修饰的编码序列编码的氨基酸序列优选是未被修饰的。
16.根据权利要求15所述的人工RNA，其中至少一个密码子经修饰的编码序列选自C最大化的编码序列、CAI最大化的编码序列、人密码子使用适应性编码序列、G/C含量修饰的编码序列和G/C优化的编码序列或其任意组合。
17.根据权利要求15或16所述的人工RNA，其中至少一个编码序列包含密码子经修饰的编码序列，其包含的核酸序列与选自SEQ ID NO：70至77、485至492、899至906、1268至1275、1637至1644、2006至2013、2375至2382、2744至2751、3113至3120、3482至3489、3851至3858、4220至4227、4589至4596、4958至4965、5327至5334、5696至5703、6065至6072、6434至6441、6803至6810、7172至7179、7541至7548、7910至7917、11728至11734、12097至12103、12465至12472、12834至12841、13941至13948、14310至14317、14679至14686、15048至15055、15417至15424、15786至15793、13203至13210、13572至13579、16155至16162、16524至16531、16893至16900、17262至17269、17631至17638、18000至18007、18369至18376、18738至18745、19107至19114、19476至19483、21363至21384、21389至21410中的任一个或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
18.根据权利要求15至17所述的人工RNA，其中至少一个编码序列包含密码子经修饰的编码序列，其包含的核酸序列与SEQ ID NO：70至71、75至77、485至486、490至492、899至900、904至906、1268至1269、1273至1275、1637至1638、1642至1644、2006至2007、2011至2013、2375至2376、2380至2382、2744至2745、2749至2751、3113至3114、3118至3120、3482至3483、3487至3489、3852、4221、4590、4959、5328、5697、6066、6435、6804、7173、7542、7911、3856至3858、4225至4227、4594至4596、4963至4965、5332至5334、5701至5703、6070至6072、6439至6441、6808至6810、7177至7179、7546至7548、7915至7917、11728、11732至11734、12097、12101至12103、12465、12466、12470至12472、12834、12835、12839至12841、13941、13942、13946至13948、14310、14311、14315至14317、14679、14680、14684至14686、15048、15049、15053至15055、15417、15418、15422至15424、15786、15787、15791至15793、13203、13204、13208至13210、13572、13573、13577至13579、16155、16156、16160至16162、16524、16525、16529至16531、16893、16894、16898至16900、17262、17263、17267至17269、17631、17632、17636至17638、18000、18001、18005至18007、18369、18370、18374至18376、18738、18739、18743至18745、19107、19108、19112至19114、19476、19477、19481至19483、21363至21384、21389至21410中的任一个或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
19.根据前述权利要求中任一项所述的人工RNA，其中RNA是mRNA、自复制RNA、环状RNA或复制子RNA。
20.根据权利要求19所述的人工RNA，其中RNA是mRNA。
21.根据前述权利要求中任一项所述的人工RNA，其中RNA包含5′-帽结构，优选m7G、cap0、cap1、cap2、经修饰的cap0或经修饰的cap1结构。
22.根据前述权利要求中任一项所述的人工RNA，其中RNA包含至少一个多聚腺苷酸序列，优选包含30个至150个腺苷核苷酸，更优选包含100个腺苷核苷酸，和/或至少一个多聚胞苷酸序列，优选包含10个至40个胞嘧啶核苷酸。
23.根据前述权利要求中任一项所述的人工RNA，其中RNA包含至少一个组蛋白茎环，其中所述组蛋白茎环包含根据SEQ ID NO：39或40的核酸序列或其片段或变体。
24.根据前述权利要求中任一项所述的人工RNA，其包含以下元件，优选以5′至3′方向包含以下元件：
a)5′-帽结构，优选如本文所限定的5′-帽结构；
b)任选地，如本文所限定的5′-UTR，优选选自SEQ ID NO：1至22的至少一种的5′-UTR；
c)核糖体结合位点，优选如本文所限定的核糖体结合位点；
d)至少一个本文所限定的编码序列，优选地如表3和表4所示的编码序列；
d)如本文所限定的3′-UTR，优选选自SEQ ID NO：23至38的至少一种的3′-UTR；
e)任选地，多聚腺苷酸序列，优选如本文所限定的多聚腺苷酸序列；
f)任选地，多聚胞苷酸序列，优选如本文所限定的多聚胞苷酸序列；
g)任选地，组蛋白茎环，优选如本文所限定的组蛋白茎环；
h)任选地，本文所限定的3′-末端序列元件，优选根据SEQ ID NO：44至63，或21322至21328的3′-末端序列元件；并且
其中任选地至少一个或多于一个，优选其中所有尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸取代。
25.根据权利要求1至24所述的人工RNA，其包含以下元件，优选以5′至3′方向包含以下元件：
a)5’-帽结构，优选如权利要求21所限定的5’-帽结构，最优选Cap1结构；
b)根据a-1、a-4、c-1、e-4、g-2、i-2或i-3的5′-UTR和3′-UTR元件；
c)至少一个如权利要求13至18中任一项所定义的编码序列或编码如权利要求7至12中任一项所定义的蛋白的编码序列；或
d)任选地，多聚腺苷酸序列，优选如权利要求22所定义的多聚腺苷酸序列；
e)任选地，多聚胞苷酸序列，优选如权利要求22所定义的多聚胞苷酸序列；
f)任选地，组蛋白茎环，优选如权利要求23的任一个所定义的组蛋白茎环；
g)任选地，根据SEQ ID NO：44至63、21322至21328的3′-末端序列，并且其中任选地至少一个或多于一个，优选其中所有尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸取代。
26.根据权利要求1至25所述的人工RNA，其以5′至3′方向包含以下元件：
a)5’-帽结构，优选如权利要求21所定义的5’-帽结构，最优选Cap1结构；
b)根据a-1、a-4、c-1、e-4、g-2、i-2或i-3，优选a-1的5′-UTR和3′-UTR；
c)至少一个如权利要求13至18中任一项所定义的编码序列或编码如权利要求7至12中任一项所定义的蛋白的编码序列，其中所述编码序列位于所述5′-UTR和所述3′-UTR之间，优选在所述5′-UTR的下游和所述3′-UTR的上游；
d)组蛋白茎环，优选如权利要求23的任一个所定义的组蛋白茎环；
e)多聚腺苷酸序列，优选如权利要求22所定义的多聚腺苷酸序列；
f)根据SEQ ID NO：21322至21328的3′-末端序列，
其中任选地至少一个或多于一个，优选其中所有尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸取代。
27.根据前述权利要求中任一项所述的人工RNA，其中所述人工RNA包含或组成为RNA序列，所述RNA序列与选自SEQ ID NO：78至482、493至897、907至1266、1276至1635、1645至2004、2014至2373、2383至2742、2752至3111、3121至3480、3490至3849、3859至4218、4228至4587、4597至4956、4966至5325、5335至5694、5704至6063、6073至6432、6442至6801、6811至7170、7180至7539、7549至7908、7918至8277、8278、11735至12094、12104至12463、12473至12832、12842至13201、13949至14308、14318至14677、14687至15046、15056至15415、15425至15784、15794至16153、13211至13570、13580至13939、16163至16522、16532至16891、16901至17260、17270至17629、17639至17998、18008至18367、18377至18736、18746至19105、19115至19474、19484至19843、21415至21480、21561至21626、21489至21552、21635至21698的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
28.根据权利要求27所述的人工RNA，其中
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：78至482、11735至12094、21415至21417、21561至21563、21489、21490、21635、21636的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：493至897、12104至12463、21418至21420、21564至21566、21491、21492、21637、21638的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：907至1266、12473至12832、21421至21423、21567至21569、21493至21495、21639至21641的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：1276至1635、8278、12842至13201、21424至21426、21570至21572、21496至21498、21642至21644的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：1645至2004、13949至14308、21433至21435、21579至21581、21505至21507、21651至21653的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：2014至2373、14318至14677、21436至21438、21582至21584、21508至21510、21654至21656的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：2383至2742、14687至15046、21439至21441、21585至21587、21511至21513、21657至21659的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：2752至3111、15056至15415、21442至21444、21588至21590、21514至21516、21660至21662的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：3121至3480、15425至15784、21445至21447、21591至21593、21517至21519、21663至21665的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：3490至3849、15794至16153、1448至21450、21594至21596、21520至21522、21666至21668的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：3859至4218、13211至13570、21427至21429、21573至21575、21499至21501、21645至21647的核酸序列或这些序列中何一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：4228至4587、13580至13939、21430至21432、21576至21578、21502至21504、21648至21650的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：4597至4956、16163至16522、21451至21453、21597至21599、21523至21525、21669至21671的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：4966至5325、16532至16891、21454至21456、21600至21602、21526至21528、21672至21674的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：5335至5694、16901至17260、21457至21459、21603至21605、21529至21531、21675至21677的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：5704至6063、17270至17629、21460至21462、21606至21608、21532至21534、21678至21680的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：6073至6432、17639至17998、21463至21465、21609至21611、21535至21537、21681至21683的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：6442至6801、18008至18367、21466至21468、21612至21614、21538至21540、21684至21686的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：6811至7170、18377至18736、21469至21471、21615至21617、21541至21543、21687至21689的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：7180至7539、18746至19105、21472至21474、21618至21620、21544至21546、21690至21692的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：7549至7908、19115至19474、21475至21477、21621至21623、21547至21549、21693至21695的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列；
-所述人工RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：7918至8277、19484至19843、21478至21480、21624至21626、21550至21552、21696至21698的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列。
29.一种组合物，其包含至少一种如权利要求1至28中任一项所述的人工RNA，其中所述组合物任选地包含至少一种药学上可接受的载体。
30.根据权利要求29所述的组合物，其包含至少一种其他人工RNA，其包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自基质蛋白M、核蛋白N、M2-1蛋白和/或磷蛋白P或其组合，优选选自M2-1的至少一种衍生自RSV的抗原肽或蛋白。
31.根据权利要求29或30所述的组合物，其包含两种其他人工RNA，其各自包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自基质蛋白M、核蛋白N、M2-1和磷蛋白P的至少一种衍生自RSV的抗原肽或蛋白。
32.根据权利要求29或30所述的组合物，其包含三种其他人工RNA，其各自包含至少一个编码序列，所述编码序列编码选自基质蛋白M、核蛋白N、M2-1和磷蛋白P的至少一种衍生自RSV的抗原肽或蛋白。
33.根据权利要求30至32所述的组合物，其中其他人工RNA的编码序列编码至少一个与SEQ ID NO：9684、10053至10133、10134、10503至10636、10637、11006至11182、11183、11552至11725、19844、20213、20582、20951或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
34.根据权利要求30至33所述的组合物，其中编码序列可操作地连接至选自a-1、a-2、a-3、a-4、a-5、b-1、b-2、b-3、b-4、b-5、c-1、c-2、c-3、c-4、c-5、d-1、d-2、d-3、d-4、d-5、e-1、e-2、e-3、e-4、e-5、e-6、f-1、f-2、f-3、f-4、f-5、g-1、g-2、g-3、g-4、g-5、h-1、h-2、h-3、h-4、h-5、i-1、i-2或i-3的3′-UTR和5’-UTR。
35.根据权利要求30至34所述的组合物，其中编码序列包含与SEQ ID NO：9685至9692、10135至10142、10638至10645、11184至11191、19845至19852、20214至20221、20583至20590、20952至20959、21385至21388、21411至21414或这些序列中任一个的片段或片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的至少一个核酸序列。
36.根据权利要求30至35所述的组合物，其中其他人工RNA包含或组成为与选自SEQ IDNO：9693至10052、10143至10502、10646至11005、11192至11551、19853至20212、20222至20581、20591至20950、20960至21319、21481至21634、21553至21706的核酸序列或这些序列中任一个的片段或变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列。
37.根据权利要求29至36所述的组合物，其包含
-与选自SEQ ID NO：78至482、493至897、907至1266、1276至1635、1645至2004、2014至2373、2383至2742、2752至3111、3121至3480、3490至3849、3859至4218、4228至4587、4597至4956、4966至5325、5335至5694、5704至6063、6073至6432、6442至6801、6811至7170、7180至7539、7549至7908、7918至8277、8278、11735至12094、12104至12463、12473至12832、12842至13201、13949至14308、14318至14677、14687至15046、15056至15415、15425至15784、15794至16153、13211至13570、13580至13939、16163至16522、16532至16891、16901至17260、17270至17629、17639至17998、18008至18367、18377至18736、18746至19105、19115至19474、19484至19843、21415至21480、21561至21626、21489至21552、21635至21698的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人工RNA和与选自SEQ ID NO：9693至10052、19853至20212、21481、21482、21627、21628、21553、21554、21699、21700的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的其他人工RNA；或
-与选自SEQ ID NO：78至482、493至897、907至1266、1276至1635、1645至2004、2014至2373、2383至2742、2752至3111、3121至3480、3490至3849、3859至4218、4228至4587、4597至4956、4966至5325、5335至5694、5704至6063、6073至6432、6442至6801、6811至7170、7180至7539、7549至7908、7918至8277、8278、11735至12094、12104至12463、12473至12832、12842至13201、13949至14308、14318至14677、14687至15046、15056至15415、15425至15784、15794至16153、13211至13570、13580至13939、16163至16522、16532至16891、16901至17260、17270至17629、17639至17998、18008至18367、18377至18736、18746至19105、19115至19474、19484至19843、21415至21480、21561至21626、21489至21552、21635至21698的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人工RNA和与选自SEQ ID NO：10143至10502、20222至20581、21483、21484、21629、21630、21555、21556、21701、21702的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的其他人工RNA；或
-与选自SEQ ID NO：78至482、493至897、907至1266、1276至1635、1645至2004、2014至2373、2383至2742、2752至3111、3121至3480、3490至3849、3859至4218、4228至4587、4597至4956、4966至5325、5335至5694、5704至6063、6073至6432、6442至6801、6811至7170、7180至7539、7549至7908、7918至8277、8278、11735至12094、12104至12463、12473至12832、12842至13201、13949至14308、14318至14677、14687至15046、15056至15415、15425至15784、15794至16153、13211至13570、13580至13939、16163至16522、16532至16891、16901至17260、17270至17629、17639至17998、18008至18367、18377至18736、18746至19105、19115至19474、19484至19843、21415至21480、21561至21626、21489至21552、21635至21698的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人工RNA和与选自SEQ ID NO：10646至11005、20591至20950、21485、21486、21631、21632、21557、21558、21703、21704的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的其他人工RNA；或
-与选自SEQ ID NO：78至482、493至897、907至1266、1276至1635、1645至2004、2014至2373、2383至2742、2752至3111、3121至3480、3490至3849、3859至4218、4228至4587、4597至4956、4966至5325、5335至5694、5704至6063、6073至6432、6442至6801、6811至7170、7180至7539、7549至7908、7918至8277、8278、11735至12094、12104至12463、12473至12832、12842至13201、13949至14308、14318至14677、14687至15046、15056至15415、15425至15784、15794至16153、13211至13570、13580至13939、16163至16522、16532至16891、16901至17260、17270至17629、17639至17998、18008至18367、18377至18736、18746至19105、19115至19474、19484至19843、21415至21480、21561至21626、21489至21552、21635至21698的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人工RNA和与选自SEQ ID NO：11192至11551、20960至21319、21487、21488、21633、21634、21559、21560、21705、21706的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的其他人工RNA；或
-与选自SEQ ID NO：78至482、493至897、907至1266、1276至1635、1645至2004、2014至2373、2383至2742、2752至3111、3121至3480、3490至3849、3859至4218、4228至4587、4597至4956、4966至5325、5335至5694、5704至6063、6073至6432、6442至6801、6811至7170、7180至7539、7549至7908、7918至8277、8278、11735至12094、12104至12463、12473至12832、12842至13201、13949至14308、14318至14677、14687至15046、15056至15415、15425至15784、15794至16153、13211至13570、13580至13939、16163至16522、16532至16891、16901至17260、17270至17629、17639至17998、18008至18367、18377至18736、18746至19105、19115至19474、19484至19843、21415至21480、21561至21626、21489至21552、21635至21698的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人工RNA和与选自SEQ ID NO：9693至10052、19853至20212、21481、21482、21627、21628、21553、21554、21699、21700的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的其他人工RNA和与选自SEQ ID NO：10646至11005、20591至20950、21485、21486、21631、21632、21557、21558、21703、21704的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的其他人工RNA；或
-与选自SEQ ID NO：78至482、493至897、907至1266、1276至1635、1645至2004、2014至2373、2383至2742、2752至3111、3121至3480、3490至3849、3859至4218、4228至4587、4597至4956、4966至5325、5335至5694、5704至6063、6073至6432、6442至6801、6811至7170、7180至7539、7549至7908、7918至8277、8278、11735至12094、12104至12463、12473至12832、12842至13201、13949至14308、14318至14677、14687至15046、15056至15415、15425至15784、15794至16153、13211至13570、13580至13939、16163至16522、16532至16891、16901至17260、17270至17629、17639至17998、18008至18367、18377至18736、18746至19105、19115至19474、19484至19843、21415至21480、21561至21626、21489至21552、21635至21698的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的人工RNA和与选自SEQ ID NO：9693至10052、19853至20212、21481、21482、21627、21628、21553、21554、21699、21700的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的其他人工RNA和与选自SEQ ID NO：10646至11005、20591至20950、21485、21486、21631、21632、21557、21558、21703、21704的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的其他人工RNA和与选自SEQ ID NO：10143至10502、20222至20581、21483、21484、21629、21630、21555、21556、21701、21702的核酸序列相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的其他人工RNA。
38.根据权利要求29至37所述的组合物，其中至少一种人工RNA和任选的其他人工RNA与一种或多于一种阳离子或聚阳离子化合物、优选阳离子或聚阳离子聚合物、阳离子或聚阳离子多糖、阳离子或聚阳离子脂质、阳离子或聚阳离子蛋白、阳离子或聚阳离子肽或其任何组合复合或缔合或至少部分复合或部分缔合。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中人工RNA和任选的其他人工RNA与一种或多于一种脂质复合或缔合，从而形成脂质体、脂质纳米颗粒、脂质复合物和/或纳米脂质体。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中人工RNA和任选的其他人工RNA与一种或多于一种脂质复合或缔合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述LNP包括具有式III的阳离子脂质：
Figure FPA0000294887140000221
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1或L2各自独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，优选L1或L2为-O(C＝O)-或-(C＝O)O-；
G1和G2各自独立地为未经取代的C1至C12亚烷基或C1至C12亚烯基；
G3为C1至C24亚烷基、C1至C24亚烯基、C3至C8亚环烷基或C3至C8亚环烯基；
Ra是H或C1至C12烷基；
R1和R2各自独立地为C6至C24烷基或C6至C24烯基；
R3为H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；
R4是C1至C12烷基；
R5是H或C1至C6烷基；和
x为0、1或2。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中阳离子脂质是式III的化合物，其中：
L1和L2各自独立地为-O(C＝O)-或(C＝O)-O-；
G3为C1至C24亚烷基或C1至C24亚烯基；和
R3为H或OR5。
43.根据权利要求41或42所述的组合物，其中阳离子脂质是式III的化合物，其中：
L1和L2各自独立地为-O(C＝O)-或(C＝O)-O-；和
R1和R2各自独立地具有以下结构中的一种：
Figure FPA0000294887140000231
44.根据权利要求41至43中任一项所述的组合物，其中阳离子脂质是式III的化合物，其中R3为OH。
45.根据权利要求41至44中任一项所述的组合物，其中阳离子脂质选自结构式III-1至III-36：
Figure FPA0000294887140000241
Figure FPA0000294887140000251
Figure FPA0000294887140000261
Figure FPA0000294887140000271
Figure FPA0000294887140000281
46.根据权利要求41至45中任一项所述的组合物，其中阳离子脂质为
Figure FPA0000294887140000291
47.根据权利要求40至46中任一项所述的组合物，其中LNP包含具有式(IV)的PEG脂质：
Figure FPA0000294887140000292
其中R8和R9各自独立地是含有10个至30个碳原子的直链或带支链的饱和或不饱和的烷基链，其中烷基链任选地被一个或多于一个酯键中断；
并且w的平均值为30至60。
48.根据权利要求47所述的组合物，其中PEG脂质中的R8和R9为饱和的烷基链。
49.根据权利要求47或48所述的组合物，其中PEG脂质为
Figure FPA0000294887140000293
其中n的平均值为30至60，优选其中n的平均值为约45、46、47、48、49、50、51、52、53、54，最优选其中n的平均值为49。
50.根据权利要求40至49中任一项所述的组合物，其中LNP包含一种或多于一种中性脂质和/或类固醇或类固醇类似物。
51.根据权利要求50所述的组合物，其中中性脂质选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1，2-二反油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。
52.根据权利要求50或51所述的组合物，其中中性脂质是1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，并且其中阳离子脂质与DSPC的摩尔比任选地为约2∶1至8∶1。
53.根据权利要求50所述的组合物，其中类固醇是胆固醇，并且其中阳离子脂质与胆固醇的摩尔比任选地为约2∶1至1∶1。
54.根据权利要求40至53中任一项所述的组合物，其中LNP基本组成为
(i)至少一种阳离子脂质，优选如权利要求41至46中任一项所定义的阳离子脂质；
(ii)中性脂质，优选如权利要求50至52中任一项所定义的中性脂质；
(iii)类固醇或类固醇类似物，优选如权利要求53所定义的类固醇或类固醇类似物；和
(iv)PEG-脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，优选如权利要求47至49中任一项所定义的PEG-脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20％至60％阳离子脂质，5％至25％中性脂质，25％至55％固醇和0.5％至15％PEG-脂质。
55.一种多肽，其由根据权利要求1至28中任一项所述的人工RNA编码，优选具有与SEQID NO：1267、2005、2743、3481、4219、4957、5695、6433、7171、7909、12833、14309、15047、15785、13571、16523、17261、17999、18737、19475或这些多肽中任一个的变体相同或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
56.一种组合物，其包含权利要求55所定义的多肽，其中组合物任选地包含至少一种药学上可接受的载体或如权利要求1至28中任一项所定义的至少一种人工RNA或如权利要求29至54中任一项所定义的组合物。
57.一种疫苗，其包含权利要求1至28中任一项所述的人工RNA、权利要求29至54中任一项所述的组合物、权利要求55所述的多肽或权利要求56所述的组合物。
58.根据权利要求49所述的疫苗，其中如权利要求1至28中任一项所述的人工RNA、如权利要求29至54中任一项所述的组合物、如权利要求55所述的多肽或如权利要求56所述的组合物引起适应性免疫应答。
59.根据权利要求57或58所述的疫苗，其中所述疫苗还包含药学上可接受的载体和任选地至少一种佐剂。
60.一种试剂盒或试剂盒套装，其包含如权利要求1至28中任一项所述的人工RNA、如权利要求29至54中任一项所述的组合物、如权利要求55所述的多肽、如权利要求56所述的组合物和/或如权利要求57至59中任一项所述的疫苗，任选地包含用于增溶的液体载剂，以及任选的提供有关成分的施用和剂量的信息的技术说明书。
61.根据权利要求60所述的试剂盒或试剂盒套装，其包括至少以下成分
a)至少一种如权利要求1至28中任一项所述的人工RNA，其编码至少一种衍生自RSV融合(F)蛋白的抗原肽或蛋白，其中所述人工RNA优选与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)；和
b)至少一个、至少两个或至少三个其他人工RNA种类，其各自编码衍生自选自M、N、M2-1或P的RSV的抗原肽或蛋白，其中每个所述其他人工RNA种类优选与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，
其中组分a)和b)作为单独的实体或作为单个实体提供。
62.根据权利要求60或61所述的试剂盒或试剂盒套装，其还包含乳酸林格溶液。
63.权利要求1至28中任一项所述的人工RNA、权利要求29至54中任一项所述的组合物、权利要求55所述的多肽、权利要求56所述的组合物、权利要求57至59中任一项所述的疫苗或权利要求60至62中任一项所述的试剂盒或试剂盒套装，其用作药物。
64.权利要求1至28中任一项所述的人工RNA、权利要求29至54中任一项所述的组合物、权利要求55所述的多肽、权利要求56所述的组合物、权利要求57至59中任一项所述的疫苗或权利要求60至62中任一项所述的试剂盒或试剂盒套装，其用于治疗或预防病毒感染，优选RSV感染或与这种感染有关的病症。
65.一种治疗或预防病症的方法，其中所述方法包括向有需要的对象施用或应用权利要求1至28中任一项所述的人工RNA、权利要求29至54中任一项所述的组合物、权利要求55所述的多肽、权利要求56所述的组合物、权利要求57至59中任一项所述的疫苗或权利要求60至62中任一项所述的试剂盒或试剂盒套装。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述病症是RSV感染或与这种感染有关的病症。
67.根据权利要求65或66所述的方法，其中所述有需要的对象是哺乳动物对象。
68.根据权利要求67所述的方法，其中哺乳动物对象是人类对象，优选新生儿、孕妇、哺乳妇女、老年人和/或免疫受损的人类对象。
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