TW202403046A

TW202403046A - 用於治療脂蛋白相關的疾病之方法及組成物

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Publication number: TW202403046A
Application number: TW112110263A
Authority: TW
Inventors: 桑傑迪索薩; 勞拉瑟維; 喬納森泰瑞特; 約翰庫爾曼
Original assignee: 瑞士商Ｃｒｉｓｐｒ治療公司
Priority date: 2022-03-21
Filing date: 2023-03-20
Publication date: 2024-01-16
Also published as: US20230293646A1; WO2023180904A1

Abstract

本揭示關於藉由基因編輯來調節個體 LPA基因表現及治療脂蛋白相關的疾病(例如心血管疾病)之方法、組成物及套組。

Description

用於治療脂蛋白相關的疾病之方法及組成物

本揭示概括關於分子生物學及生物技術領域，包括基因編輯。相關申請案之交叉參考

本申請案係根據35 U.S.C. §119(e)主張在2022年3月21日申請之美國臨時專利申請案第63/322,078號、在2022年6月13日申請之美國臨時專利申請案第63/351,542號及在2022年11月28日申請之美國臨時專利申請案第63/385,093號之權益。藉由引用將該等相關申請案的內容整體併入本文以適用於所有目的。參考序列表

本申請案係連同電子格式之序列表一起提出。序列表係以2023年3月15日創建之標題為80EM-341712-TW_SeqList之檔案提供，其大小為35.9千拜。藉由引用將電子格式之序列表的資訊整體併入本文。

脂蛋白(a)(Lp(a))為致動脈粥樣硬化脂蛋白，其係由經共價結合至低密度脂蛋白(LDL)粒子的脂蛋白元B-100(apoB)組分之蛋白質脂蛋白元(a)[apo(a)]所組成。高水平的Lp(a)係與增加之心血管疾病風險相關聯，該疾病包括例如鈣化性主動脈瓣疾病(高水平的Lp(a)引起更高的發病率及更快的疾病進展)、心肌梗塞(MI)、冠狀動脈心臟病、動脈粥樣硬化、血栓形成和中風。目前沒有經批准直接靶向Lp(a)之藥物。

使用CRISPR(成簇規律間隔短回文重複序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats))-Cas(CRISPR相關)系統的經RNA引導之DNA靶向原理的DNA靶向已被廣泛地使用。CRISPR-Cas系統可分成兩類，第1類系統利用多個Cas蛋白質之複合體(諸如I、III和IV型CRISPR-Cas系統)及第2類系統利用單一Cas蛋白質(諸如II、V和VI型CRISPR-Cas系統)。基於II型CRISPR-Cas之系統已被用於基因組編輯，且需要由可訂製的引導RNA(gRNA)引導之Cas多肽或其變異體用於可編程的DNA靶向。

對藉由降低Lp(a)水平來治療脂蛋白相關的疾病(諸如心血管疾病和鈣化性主動脈瓣疾患)之安全且有效的基因編輯策略有需要。

本文之揭示包括用於治療脂蛋白相關的疾病之方法、組成物及套組。一些實施態樣提供用於治療有其需要的個體之脂蛋白相關的疾病之方法，其包含對個體投予與下列複合之複數種奈米粒子：(a)靶向 LPA基因之引導RNA(gRNA)( LPAgRNA)或編碼 LPAgRNA之核酸；及(b)編碼經RNA引導之核酸內切酶的核酸，由此治療個體的脂蛋白相關的疾病。個體可被投予二或更多次複數種奈米粒子。在一些實施態樣中，二或更多次投予的每兩次係相隔約兩週至約四週。在一些實施態樣中，二或更多次投予的每兩次係相隔至少三個月。在一些實施態樣中，該方法包含對個體單次投予複數種奈米粒子。

在一些實施態樣中，在個體血漿中的LPA表現在投予之後降低至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、或至少90%。在一些實施態樣中，在個體血漿中的LPA蛋白質濃度在投予之後降低至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、或至少90%。在一些實施態樣中，該降低係在投予之後歷經三週、四週、五週、兩個月、三個月、六個月、一年、兩年、三年、五年、十年、十五年或更久。在一些實施態樣中，該降低在投予之後一個月為65%。在一些實施態樣中，該降低在投予之後三個月為75%。在一些實施態樣中，該降低係相對於：(a)在投予複數種奈米粒子之前，在個體血漿中的LPA表現及LPA蛋白質濃度；(b)在一或多個未治療之個體中的LPA表現及LPA蛋白質濃度；及/或(c)健康個體的LPA表現或LPA蛋白質濃度之參考水平。

有需要的個體可具有超過50 mg/dl之Lp(a)水平，例如60 mg/dl、70 mg/dl、80 mg/dl、90 mg/dl、100 mg/dl、110 mg/dl、120 mg/dl、130 mg/dl、140 mg/dl、150 mg/dl、200 mg/dl、250 mg/dl、300 mg/dl、或更高。在一些實施態樣中，有需要的個體具有超過100 mg/dL之Lp(a)水平。在一些實施態樣中，有需要的個體具有與經確立之心血管疾病(CVD)風險因子無關的增加之心肌梗塞(MI)風險或動脈粥樣硬化的心血管疾病(ASCVD)之增加終生風險。

本文所述之方法可包含在投予之前、期間及/或之後測量個體之Lp(a)的血液或血漿水平。在一些實施態樣中，該方法包含鑑定有治療需要的個體。

脂蛋白相關的疾病可為代謝疾病、心血管疾病、脂質代謝疾病或其組合。在一些實施態樣中，脂蛋白相關的疾病為鈣化性主動脈瓣疾病、心肌梗塞、冠狀動脈心臟病、動脈粥樣硬化、血栓形成、中風、冠狀動脈疾病、家族性高脂血症、心肌梗塞、周邊動脈疾病、鈣化性主動脈瓣膜狹窄或其組合。在一些實施態樣中，使個體之脂蛋白相關的疾病中之一或多種症狀減輕或緩解。在一些實施態樣中，對個體投予複合之複數種奈米粒子降低心血管風險、與心血管事件相關的死亡可能性或其組合。

在一些實施態樣中，編碼經RNA引導之核酸內切酶的核酸為經RNA引導之核酸內切酶(例如Cas9核酸內切酶)之mRNA。Cas9核酸內切酶的非限制性實例包括化膿鏈球菌Cas9、金黃色葡萄球菌Cas9、腦膜炎雙球菌(N. meningitides)Cas9、嗜熱鏈球菌(S. thermophilus)Cas9、嗜熱鏈球菌3 Cas9、齒垢密螺旋體(T. denticola)Cas9和其變異體。gRNA可為單股引導RNA(sgRNA)。在一些實施態樣中，gRNA靶向 LPA基因之外顯子3。在一些實施態樣中， LPAgRNA包含SEQ ID NO：18至25中任一者之間隔子序列(spacer sequence)。在一些實施態樣中， LPAgRNA包含SEQ ID NO：18之間隔子序列。在一些實施態樣中， LPAgRNA為包含SEQ ID NO：32之序列的單股引導RNA(sgRNA)。在一些實施態樣中， LPAgRNA為包含SEQ ID NO：11之序列的單股引導RNA(sgRNA)。

LPAgRNA或編碼 LPAgRNA之核酸及經RNA引導之核酸酶可囊封在複數種奈米粒子中。在一些實施態樣中，奈米粒子為脂質奈米粒子。個體可為靈長類動物個體，例如人類。

在一些實施態樣中，該方法包含對個體單次投予複數種奈米粒子。例如，複數種奈米粒子可以或可以約0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、0.6 mg/kg或1 mg/kg之(a)與(b)之總核酸的單次投予劑量投予個體。

在一些實施態樣中，複數種奈米粒子為脂質奈米粒子。在一些實施態樣中，脂質奈米粒子包含一或多種中性脂質、帶電脂質、可離子化脂質、類固醇和經聚合物共軛之脂質。在一些實施態樣中，脂質奈米粒子包含膽固醇、聚乙二醇(PEG)脂質或兩者。

該方法可進一步包含在投予之前、在投予之後或兩者測定個體的(i)丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)、γ-麩胺醯轉移酶(GGT)、膽紅素、鹼性磷酸酶(Alk Phos)和白蛋白中之一或多者的水平；(ii)凝血酶原時間(PT)；及/或(iii)部份血栓形成素時間(PTT)。在一些實施態樣中，個體被投予附加治療，其中附加治療包含投予皮質類固醇、抗H1抗組織胺、抗H2抗組織胺或其任何組合。附加治療可在對個體投予複數種奈米粒子之前1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週或更久投予個體。在一些實施態樣中，附加治療及複數種奈米粒子係同時投予。

本文之揭示包括組成物，其包含與下列複合之複數種奈米粒子：(a)靶向LPA基因之引導RNA(gRNA)(LPA gRNA)，及(b)編碼Cas9核酸內切酶之mRNA，其中gRNA包含SEQ ID NO：18至25中任一者之間隔子序列。本文之揭示亦包括用於治療脂蛋白相關的疾病之組成物，其包含與下列複合之複數種奈米粒子：(a)靶向LPA基因之引導RNA(gRNA)(LPA gRNA)，及(b)編碼Cas9核酸內切酶之mRNA，其中gRNA包含SEQ ID NO：18至25中任一者之間隔子序列。脂蛋白相關的疾病可為代謝疾病、心血管疾病、脂質代謝疾病或其組合。在一些實施態樣中，脂蛋白相關的疾病為鈣化性主動脈瓣疾病、心肌梗塞、冠狀動脈心臟病、動脈粥樣硬化、血栓形成、中風、冠狀動脈疾病、家族性高脂血症、心肌梗塞、周邊動脈疾病、鈣化性主動脈瓣膜狹窄或其組合。在一些實施態樣中，gRNA包含SEQ ID NO：18之間隔子序列。在一些實施態樣中，gRNA包含SEQ ID NO：32之序列。在一些實施態樣中，gRNA包含SEQ ID NO：11之序列。Cas9核酸內切酶可為化膿鏈球菌Cas9核酸內切酶。在一些實施態樣中，複數種奈米粒子為脂質奈米粒子。在一些實施態樣中，脂質奈米粒子包含一或多種中性脂質、帶電脂質、可離子化脂質、類固醇和經聚合物共軛之脂質。在一些實施態樣中，脂質奈米粒子包含膽固醇、聚乙二醇(PEG)脂質或兩者。在一些實施態樣中，組成物為包含一或多種醫藥上可接受的賦形劑之醫藥組成物。

在以下的詳細說明中，參考構成其一部分的附圖。在圖中，類似的符號通常標識類似的部分，除非上下文另有規定。在詳細說明、圖及申請專利範圍中所述之例證性實施態樣不意味著限制。可利用其他的實施態樣且可進行其他改變而不脫離本文所呈現之主題的精神或範圍。可輕易地理解的是如本文概括說明及圖中所例證的本揭示之觀點可以各種廣泛不同的組態佈置、取代、組合、分離及設計，所有該等為本文明確地預期的且構成本文揭示的一部分。

將本文提及的所有專利、公告之專利申請、其他出版物及來自GenBank和其他數據庫之序列以其與相關技術有關的全部內容併入以供參考。

高水平的Lp(a)已與增加之心血管疾病風險相關聯。大於50 mg/dL(例如＞125 nmol/L)之Lp(a)水平可引起鈣化性主動脈瓣疾病(CAVD)及心血管疾病(CVD)。與低密度脂蛋白不同，Lp(a)水平不可能以環境、飲食、運動或現有的降脂藥物(諸如斯他汀(statin))調節，使其成為經基因驅動之疾病風險因子。目前沒有經批准直接靶向Lp(a)之藥物。本揭示提供用於調節(例如降低)Lp(a)水平之方法、組成物、系統及套組，以降低有其需要的個體之心血管疾病風險及/或治療心血管疾病。

本文之揭示包括用於治療個體(例如靈長類動物個體)之心血管疾病或疾患之方法、組成物及套組。在一些實施態樣中，該方法包含對有其需要的個體投予與下列複合之複數種奈米粒子：(a)靶向LPA基因之引導RNA(gRNA)或編碼靶向 LPA基因之gRNA的核酸，及(b)編碼經RNA引導之核酸內切酶的核酸(例如mRNA)，由此治療個體之心血管疾病或疾患。定義

如本文所使用之術語「約」意指所提供之值的加或減5%。

如本文所使用之術語「經RNA引導之核酸內切酶」係指能夠結合RNA(例如gRNA)以形成靶向特異性DNA序列(例如在靶DNA中)的複合體之多肽。經RNA引導之核酸內切酶的非限制性實例為Cas多肽(例如Cas核酸內切酶，諸如Cas9核酸內切酶)。在一些實施態樣中，如本文所述的經RNA引導之核酸內切酶係藉由與其結合之RNA分子而靶向靶DNA中的特異性DNA序列。RNA分子可包括與靶DNA內的靶序列互補或能夠與該靶序列雜交之序列，因此容許經結合之多肽靶向靶DNA內的特定位置。

如本文所使用之術語「引導RNA」或「gRNA」係指位點特異性靶向RNA，其可結合經RNA引導之核酸內切酶以形成複合體，且將結合的經RNA引導之核酸內切酶(諸如Cas核酸內切酶)之活性導向靶核酸內的特異性靶序列。引導RNA可包括一或多種RNA分子。

如本文所使用之核酸分子的「第二結構」(例如RNA片段或gRNA)係指在核酸分子內的鹼基配對相互作用。

如本文所使用之術語「靶DNA」係指包括「靶位點」或「靶序列」之DNA。本文所使用之術語「靶序列」係指存在於靶DNA中的核酸序列，gRNA之DNA靶向序列或區段(或在本文亦稱為「間隔子」)可與其雜交，先決條件為有足夠的雜交條件存在。例如，在靶DNA內的靶序列5'-GAGCATATC-3'係以RNA序列5'-GAUAUGCUC-3'靶向(或能夠與RNA序列5'-GAUAUGCUC-3'雜交或互補)。在gRNA之DNA靶向序列或區段與靶序列之間的雜交可例如基於華特生-克里克鹼基配對規則，其使得DNA靶向序列或片段具有可編程性。可設計gRNA之DNA靶向序列或區段例如與任何靶序列雜交。

如本文所使用之術語「Cas核酸內切酶」或「Cas核酸酶」係指與CRISPR後天免疫系統相關聯的經RNA引導之DNA核酸內切酶。

除非另有指示，否則「核酸酶」及「核酸內切酶」在本文可互換使用，其係指對多核苷酸切割具有核酸內切酶催化活性之酶。

如本文所使用之術語gRNA之「不可變區域」係指與經RNA引導之核酸內切酶相關聯的gRNA之核苷酸序列。在一些實施態樣中，gRNA包含crRNA及轉活化crRNA(tracrRNA)，其中crRNA及tracrRNA彼此雜交以形成雙股螺旋。在一些實施態樣中，crRNA包含5’至3’：間隔子序列及最小的CRISPR重複序列(在本文亦稱為「crRNA重複序列」)；且tracrRNA包含與最小的CRISPR重複序列互補的最小的tracrRNA序列(在本文亦稱為「tracrRNA反向重複序列」)及3’ tracrRNA序列。在一些實施態樣中，gRNA之不可變區域係指一部分的crRNA，其為最小的CRISPR重複序列及tracrRNA。

如本文所使用之術語「供體模板」係指含有外源性基因物質之核酸股，其可引入基因組中(例如藉由同源定向修復(homology directed repair))以導致外源性基因物質之靶向整合。在一些實施態樣中，供體模板可與DNA中的靶向位置不具有同源區域，且可在靶位點上切割之後以NHEJ依賴端接合來整合。供體模板可為單股或雙股DNA或RNA，且可以線或環形式引入細胞中。

術語「多核苷酸」及「核酸」在本文可互換使用，且係指核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸的任何長度之核苷酸的聚合物形式。多核苷酸可為單股、雙股或多股DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜交體/三股螺旋、或包括嘌呤及嘧啶鹼基或其他天然、經化學或生物化學修飾、非天然或經衍生之核苷酸鹼基的聚合物。

如本文所使用之術語「結合」係指巨分子之間(例如蛋白質與核酸之間)的非共價相互作用。在非共價相互作用的狀態時，據稱巨分子經「締合」或「相互作用」或「結合」(例如當據稱分子X與分子Y相互作用時，其意指分子X係以非共價方式結合至分子Y)。結合相互作用可以解離常數(Kd)特徵化，例如下列數值之Kd或小於下列數值之Kd：10 ^-6M、10 ^-7M、10 ^-8M、10 ^-9M、10 ^-10M、10 ^-11M、10 ^-12M、10 ^-13M、10 ^-14M、10 ^-15M、或在該等值中任兩者之間的數值或範圍。Kd可取決於環境條件，例如pH和溫度。「親和力」係指結合強度，且增加之結合親和力係與較低的Kd有相關性。

如本文所使用之術語「雜交(hybridizing或hybridize)」係指在兩個不同的分子內實質上互補或互補的核酸序列之配對。配對可以任何方法達成，其中核酸序列係通過鹼基配對與實質上或完全互補的序列接合以形成雜交複合體。「雜交(hybridizing或hybridize)」可包含使分子變性以破壞分子中的分子內結構(例如第二結構)。在一些實施態樣中，使分子變性包含將包含分子的溶液加熱至足以破壞分子的分子內結構之溫度。在一些事例中，使分子變性包含將包含分子的溶液之pH調整至足以破壞分子的分子內結構之pH。出於雜交的目的，若兩個核酸序列或序列區段的個別鹼基之至少80%彼此互補，則彼等為「實質上互補的」。在一些實施態樣中，夾板(splint)寡核苷酸序列與經設計為互補的兩個多核苷酸(例如RNA片段)中之一者的同一性不超過約50%。各序列之互補部分在本文可稱為「區段」，且若該等區段具有80%或更高的同一性，則該等區段為實質上互補的。

術語「互補性」及「互補的」意指核酸可基於傳統的華特生-克里克鹼基配對規則與另一核酸形成氫鍵，亦即腺嘌呤(A)係與胸腺嘧啶(U)配對及鳥嘌呤(G)係與胞嘧啶(C)配對。互補性可為完美的(例如完全互補性)或不完美的(例如部分互補性)。完美或完全互補性表明一股的各或每一核酸鹼基皆能夠根據華特生-克里克規範鹼基配對與另一反向平行的核酸序列中之對應鹼基形成氫鍵。部分互補性表明核酸序列之僅一定百分比的連續殘基可與另一反向平行的核酸序列中之相同數量的連續殘基形成華特生-克里克鹼基配對。在一些實施態樣中，互補性可為至少70%、80%、90%、100%、或在該等值中任兩者之間的數值或範圍。在一些實施態樣中，互補性為完美的，亦即100%。例如，互補的候選序列區段係與候選序列區段完全互補，其序列可使用華特生-克里克鹼基配對規則自候選序列區段推論。

如本文所使用之術語「載體」係指用於傳輸基因物質至宿主細胞之多核苷酸構築體，通常為質體或病毒。載體可為例如病毒、質體、黏質體或噬菌體。如本文所使用之載體可由DNA或RNA所組成。在一些實施態樣中，載體係由DNA所組成。「表現載體」為存在於適當的環境時能夠指導由載體攜帶的一或多種基因編碼之蛋白質的表現。載體較佳地能夠自主複製。表現載體通常包含轉錄啟動子、基因及轉錄終止子。基因表現通常處於啟動子的控制下，且據稱基因「可操作地鍵聯至」啟動子。

如本文所使用之術語「核酸」及「多核苷酸」可互換使用且係指任何核酸，無論是否由磷酸二酯鍵聯或經修飾之鍵聯所組成，諸如磷酸三酯、磷醯胺酸酯、矽氧烷、碳酸酯、羧基甲酯、乙醯胺酸酯、胺甲酸酯、硫醚、橋連磷醯胺酸酯、橋連亞甲基膦酸酯、橋連磷醯胺酸酯、橋連磷醯胺酸酯、橋連亞甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、橋連硫代磷酸酯或磺內酯(sultone)鍵聯及此等鍵聯之組合。術語「核酸」及「多核苷酸」亦特別包括由除了五種生物存在的鹼基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)以外的鹼基所組成之核酸。

如本文所使用之術語「轉染」或「傳染」係指將核酸引入宿主細胞中，諸如藉由令細胞與如本文所述之重組MVA病毒或無腸微小核糖核酸病毒(picornaviral)粒子接觸。

如本文所使用之術語「轉基因」係指藉由人為干預而整合至靶細胞的一或多個染色體中之任何核苷酸或DNA序列。在一些實施態樣中，轉基因包含編碼關注的蛋白質之多核苷酸。蛋白質編碼多核苷酸通常可操作地鍵聯至可用於獲得關注的基因之所欲表現的其他序列，諸如轉錄調控序列。在一些實施態樣中，轉基因可另外包含用於標誌其中整合的染色體之核酸或其他分子。

如本文所使用之「治療」係指反應由患者出現或患者可能易遭受的疾病、疾患或生理狀況而進行的臨床干預。治療的目標包括但不限於減輕或預防症狀、減緩或阻止疾病、疾患或症狀的進展或惡化、及/或緩和疾病、病症或病症。「治療」係指治療性治療及預防性(prophylactic或preventative)措施中之一或兩者。需要治療的個體包括已罹患疾病或疾患或非所欲生理狀況的個體，以及欲預防疾病或疾患或非所欲生理狀況的個體。

如本文所使用之術語「有效量」或「醫藥有效量」或「治療有效量」係指足以實現有益或所欲生物學及/或臨床結果的量。

如本文所使用之術語「醫藥上可接受的賦形劑」係指提供用於對個體投予關注的化合物之醫藥上可接受的載劑、添加劑或稀釋劑之任何適合的物質。醫藥上可接受的賦形劑可包含稱為醫藥上可接受的稀釋劑、醫藥上可接受的添加劑及醫藥上可接受的載劑之物質。

如本文所使用之「個體」係指需要對其進行診斷、治療或治療法的動物。在一些實施態樣中，個體為哺乳動物。如本文所使用之「哺乳動物」係指屬於哺乳動物綱的個體，且包括但不限於人類、家畜和農場動物、動物園動物、運動動物及寵物動物。哺乳動物的非限制實例包括小鼠；大鼠；兔子；天竺鼠；狗；貓；綿羊；山羊；乳牛；馬；靈長類動物，諸如猴子、黑猩猩和猿，特別為人類。在一些實施態樣中，哺乳動物為靈長類動物。在一些實施態樣中，哺乳動物為人類。在一些實施態樣中，哺乳動物不為人類。在一些態樣中，個體可能患有或被懷疑患有心血管疾病及/或具有心血管疾病的一或多種症狀。在一些態樣中，個體為在診斷時或之後被診斷出具有心血管疾病風險的人類。在一些例子中，具有心血管疾病風險的診斷可基於內源性脂蛋白元(a)(LPA)基因或在基因組中靠近LPA基因之基因組序列中存在的一或多個突變來確定，該突變影響脂apo(a)蛋白質的表現。

在分子的本上下文中所使用之術語「血漿水平」係指在給出之血漿體積中存在的分子之濃度或量，例如分子之莫耳數或重量。

高水平的Lp(a)已與增加之心血管疾病風險相關聯。大於50 mg/dL之Lp(a)水平可引起鈣化性主動脈瓣疾病(CAVD)及心血管疾病(CVD)。與低密度脂蛋白不同，Lp(a)水平不可能以環境、飲食、運動或現有的降脂藥物(諸如斯他汀)調節，使其成為經基因驅動之疾病風險因子。對經延長的時間段可穩定地降低Lp(a)水平或永久地降低Lp(a)水平之新穎的基因療法有需求。本揭示提供高效率的基因編輯方法和相關的組成物及套組，直接地靶向 LPA基因或其變體而自基因組永久地敲除 LPA基因，由此永久地降低個體血液(例如血漿)中的Lp(a)水平。在一些實施態樣中，本文所述之方法、組成物及套組可降低至少20%、至少30%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%或更多的血漿Lp(a)水平。在一些實施態樣中，在進行該方法之後，使個體中的血漿Lp(a)水平降低至或至約60 mg/dL、55 mg/dL、50 mg/dL、45 mg/dL、40 mg/dL、35 mg/dL、30 mg/dL或更低。本文所述之gRNA序列亦可顯著地使脫靶效應的次數及頻率減至最低，由此降低基因毒性的風險。本文所述之方法、組成物及套組可用於治療個體的心血管疾病及/或降低心血管疾病的風險。脂蛋白(a)(Lp(a))

本文之提供包括用於編輯 LPA基因(包括例如與增加之心血管疾病風險及/或增加之Lp(a)表現相關聯的 LPA基因變異體)之載體、組成物、方法、系統及套組，該 LPA基因編碼細胞基因組中的脂蛋白(a)(Lp(a))之脂蛋白元(a)蛋白質以調節(例如降低)細胞中的Lp(a)表現、功能或活性。如本文所使用之術語「 LPA基因」包括基因組區域，其包含 LPA調控啟動子及增強子序列，以及 LPA編碼序列。

Lp(a)為致動脈粥樣硬化脂蛋白，其係由經共價結合至低密度脂蛋白(LDL)粒子的脂蛋白元B-100(apoB)組分之蛋白質脂蛋白元(a)(apo(a))所組成(參見例如圖1)。apo(a)蛋白質係以 LPA基因編碼，在肝細胞中產生且分泌至循環中。然而，儘管已知apo(a)係與LDL對接且與apoB形成共價二硫鍵而成為Lp(a)，但是Lp(a)組裝的精確位點尚不清楚。apo(a)與apoB的此結合阻斷apoB之LDL受體結合位點且因此阻止通過LDL受體途徑清除。Apo(a)已自纖維蛋白溶酶原基因進化且含有相關的蛋白質結構域。apo(a)蛋白質係由一個kringle V(KV)結構域、多重拷貝的kringle IV(KIV)結構域及無活性的蛋白酶樣結構域所組成，全部皆源自纖維蛋白溶酶原。將KIV分解成10個亞型，以KIVi和KIV3-10出現在1個拷貝中及KIV ₂出現在1至超過40個拷貝中。apo(a)的大小在每個人之間有差異且與經基因決定之KIV2拷貝數成正比。Lp(a)之血漿水平係與apo(a)蛋白質的大小具有負相關性且這被認為是較大的同功型分泌較慢的功能。高血漿水平的Lp(a)為許多心血管疾病的獨立風險因子，包括鈣化性主動脈瓣疾病、冠狀動脈心臟病、動脈粥樣硬化、血栓形成和中風(綜述於Kronenberg, F.(2016). Cardiovasc. Drugs Ther., 30(l):87-100中)。

Lp(a)之致病機制係通過其促動脈粥樣硬化、促發炎及促血栓形成性質調介。apo(a)與Lp(a)之LDL組分的組合對心血管系統導致調合效應。單獨的LDL可通過LDL進入血管壁中而引起以動脈粥樣硬化為特徵的免疫及發炎反應，使磷脂於血管壁中氧化。Lp(a)於血漿中循環且與經氧化之磷脂結合，其引起促發炎反應。Apo(a)本身含有可與損壞之血管壁上的暴露表面結合之位點，調介其在該等位置的進入及積累。已證明apo(a)之小的同功型以抑制纖維蛋白分解來促進血栓形成。

已對Lp(a)之血漿水平與心血管疾病的關係進行廣泛的檢查且多項研究已使高水平的Lp(a)與較高的心血管疾病風險具有正關聯性(綜述於Kronenberg, F.(2016). Cardiovasc. Drugs Ther., 30(l):87-100中)。在人類中的血漿Lp(a)水平範圍可在每個人之間有1000倍的差異(例如自0.1 mg/dL至＞300 mg/dL或自＜30 nmol/L至＞400 nmol/L)。可變的血清水平係藉由例如Apo(a)等位基因大小(KIV-2重複序列的數量)、5'五核苷酸重複序列多型性、在 LPA基因之5'和其他區域中的SNP而以基因方式測定。在血清中的Lp(a)水平可使用如熟習本技術領域者理解的ELISA檢定法或免疫比濁分析來檢測。

LPA基因(亦稱為LP、AK38和APOA)具有6q25.3-q26之細胞遺傳學位置，且基因組坐標係在位置160531482-160664275之反向股的6號染色體上。 LPA之核苷酸序列可在NCBI網站上以NCBI參考序列：NC_000006.12找到。 LPA具有4018之NCBI基因ID、P08519之Uniprot ID及ENSG00000198670之Ensembl基因ID。基因編輯

本文之提供包括用於編輯 LPA基因或其變異體之方法、組成物及套組，由此降低個體的Lp(a)表現水平(例如Lp(a)之血漿濃度)。基因編輯(包括基因組編輯)為其中在DNA序列中(諸如在經靶向之細胞的基因組中)插入、刪除及/或取代核苷酸/核酸之基因工程類型。經靶向之基因編輯能夠在經靶向之細胞的基因組中(例如在經靶向之基因或經靶向之DNA序列中)的預選位點上插入、刪除及/或取代。當編輯內源性基因之序列時，例如藉由刪除、插入或取代核苷酸/核酸，包含受影響之序列的內源性基因可由於序列改變而敲除或減弱。因此，經靶向之編輯可用於破壞內源性基因表現。「經靶向之整合」係指涉及插入一或多個外源性序列之方法，在插入位點上刪除或不刪除內源性序列。當含有外源性序列的供體模板存在時，經靶向之整合可源於經靶向之基因編輯。

經靶向之編輯可通過核酸酶非依賴性方法或核酸酶依賴性方法來達成。在經核酸酶非依賴性靶向之編輯方法中，同源性重組係藉由側接通過宿主細胞之酶促機制引入內源性序列的外源性多核苷酸之同源性序列引導。外源性多核苷酸可在內源性序列中引入核苷酸之刪除、插入或置換。

另一選擇地，核酸酶依賴性方法可通過藉由特定稀有的切割核酸酶(例如核酸內切酶)而特定引入的雙股斷裂(DSB)來達成較高頻率的經靶向之編輯。此等經核酸酶依賴性靶向之編輯亦利用DNA修復機制，例如反應DSB發生的非同源性末端接合(NHEJ)。以NHEJ之DNA修復常導致少量的內源性核苷酸之隨機插入或刪除(indel)。與經NHEJ調介之修復相反，修復亦可藉由同源定向修復(HDR)發生。當含有以一對同源臂側接之外源性基因物質的供體模板存在時，外源性基因物質可以HDR引入基因組中，其導致外源性基因物質的經靶向之整合。

能夠引入特異性及經靶向之DSB之可用的核酸內切酶包括但不限於鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化子樣效應子核酸酶(TALEN)和經RNA引導之CRISPR-Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9；成簇規律間隔短回文重複序列相關性9)。另外，利用phiC31及Bxb1整合酶之DICE(雙整合酶匣交換)系統亦可用於經靶向之整合。

ZFN為包含與鋅指DNA結合結構域(ZFBD)融合之核酸酶的經靶向之核酸酶，ZFBD為通過一或多個鋅指以序列特異性方式結合DNA之多肽結構域。鋅指為鋅指結合結構域內約30個胺基酸的結構域，其結構係通過鋅離子的配位穩定化。鋅指的實例包括但不限於C2H2鋅指、C3H鋅指和C4鋅指。經設計之鋅指結構域為不於自然界中存在的結構域，其設計/組成主要源自於合理的準則，例如應用取代規則及用於處理現有ZFP設計及綁定數據之數據庫儲存資料中的資料之電腦化演算法。參見例如美國專利第6,140,081號；第6,453,242號；和第6,534,261號；亦參見WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。經選擇之鋅指結構域為不於自然界中發現之結構域，其產生主要源自於經驗性方法，諸如噬菌體展示技術、相互作用陷阱或雜交種選擇。ZFN更詳細地說明於美國專利第7,888,121號和美國專利第7,972,854號中。ZFN之最好識別的實例為FokI核酸酶與鋅指DNA結合結構域之融合物。

TALEN為包含與TAL效應子DNA結合結構域融合之核酸酶的經靶向之核酸酶。「轉錄活化子樣效應子DNA結合結構域」、「TAL效應子DNA結合結構域」或「TALE DNA結合結構域」為負責TAL效應子蛋白質與DNA結合之TAL效應子蛋白質之多肽結構域。TAL效應子蛋白質係由黃單胞菌屬(genus Xanthomonas)的植物病原體在傳染期間分泌。該等蛋白質進入植物細胞核，經由其DNA結合結構域結合效應子特異性DNA序列，且在該等序列上經由其轉活化結構域活化基因轉錄。TAL效應子DNA結合結構域特異性係取決於不完美的34個胺基酸重複序列的效應子可變數量而定，該重複序列包含在稱為重複的可變雙殘基(RVD)之選定的重複位置上的多型性。TALEN更詳細地說明於美國專利申請案第2011/0145940號中。在本技術中的TALEN之最好識別的實例為FokI核酸酶與TAL效應子DNA結合結構域之融合多肽。

適合如本文提供之方式使用的經靶向之核酸酶的額外實例包括但不限於無論是單獨或組合使用之Bxb1、phiC31、R4、PhiBT1和Wβ/SPBc/TP901-1。

經靶向之核酸酶的其他非限制性實例包括天然存在和重組核酸酶，例如CRISPR/Cas9、限制性核酸內切酶、巨型核酸酶、歸巢核酸內切酶(homing endonuclease)及類似者。 CRISPR-Cas基因編輯系統及經RNA引導之核酸酶

在一些實施態樣中，本文所述之載體、組成物、方法及套組可用於基因編輯系統中，諸如CRISPR-Cas基因編輯系統，以基因編輯 LPA基因。例如，CRISPR-Cas9系統為原核生物中的天然存在防禦機制，已重新利用為用於基因編輯的經RNA引導之DNA靶向平台。其依賴於DNA核酸酶Cas9及兩個非編碼RNA-crisprRNA(crRNA)和轉活化RNA(tracrRNA)，以靶向DNA切割。crRNA係通過通常在靶DNA中具有20個核苷酸(nt)序列之華特生-克里克鹼基配對來驅動CRISPR-Cas9複合體之序列識別及特異性。若靶序列緊接著稱為前間隔子相鄰基序(protospacer adjacent motif)(PAM)之特定的短DNA基序(具有序列NGG)，則CRISPR-Cas9複合體僅結合含有與crRNA，單股引導RNA(sgRNA)的前20 nt匹配的序列之DNA序列。TracrRNA係與crRNA之3’端雜交以形成 RNA雙股螺旋結構，其係藉由Cas9核酸內切酶結合以形成催化活性CRISPR-Cas9複合體，該複合物接著可切割靶DNA。一旦CRISPR-Cas9複合體在靶位點與DNA結合，則在Cas9酶內的兩個獨立的核酸酶結構域各自切割PAM位點上游的DNA股中之一者，留下雙股斷裂(DSB)，其中DNA的兩個股係以鹼基對為末端(鈍端)。在CRISPR-Cas9複合體在特定的靶位點與DNA結合且形成位點特異性DSB之後，下一關鍵步驟為DSB修復。細胞係使用兩種主要DNA修復路徑來修復DSB：非同源性末端接合(NHEJ)及同源定向修復(HDR)。在一些實施態樣中，CRISPR-Cas9基因編輯系統包含經RNA引導之核酸酶及靶向一或多個靶基因之一或多個引導RNA。

如本文所述，經RNA引導之核酸內切酶可為天然存在或非天然存在。經RNA引導之核酸內切酶的非限制性實例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(亦稱為Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cpf1核酸內切酶及其功能性衍生物。在一些事例中，經RNA引導之核酸內切酶為Cas9核酸內切酶。Cas9核酸內切酶可為例如化膿鏈球菌(SpyCas9)、路鄧葡萄球菌( Staphylococcus lugdunensis)(SluCas9)、肺炎巴斯德菌( P. pneumotropica) Cas9(PpCas9)、耳葡萄球菌( Staphylococcus auricularis) Cas9(SauriCas9)、路鄧葡萄球菌Cas9(SlugCas9)、水獺葡萄球菌( Staphylococcus lutrae)Cas9(SlutrCas9)、溶血性葡萄球菌( Staphylococcus haemolyticus)Cas9(ShaCas9)、空腸彎曲桿菌(CjCas9)、金黃色葡萄球菌(SaCas9)或其變異體。在一些實施態樣中，經RNA引導之核酸內切酶為Cas9之變異體，包括但不限於小Cas9、死亡Cas9(dCas9)和Cas9切口酶。在一些實施態樣中，Cas核酸酶可包含RuvC或RuvC樣核酸酶結構域(例如Cpf1)及/或HNH或HNH樣核酸酶結構域(例如Cas9)。在一些實施態樣中，Cas9核酸內切酶為化膿鏈球菌Cas9、金黃色葡萄球菌Cas9、腦膜炎雙球菌Cas9、嗜熱鏈球菌Cas9、嗜熱鏈球菌3 Cas9、齒垢密螺旋體Cas9或其變異體。

經RNA引導之核酸內切酶可為經小RNA引導之核酸內切酶。經小RNA引導之核酸內切酶可自本文所述及本技術中已知的經RNA引導之核酸內切酶中任一者衍生的經RNA引導之核酸內切酶的部分進行工程化。經小RNA引導之核酸內切酶可為例如小Cas核酸內切酶。在一些例子中，經小RNA引導之核酸酶的長度少於約1,100個胺基酸。

經RNA引導之核酸內切酶可為突變的經RNA引導之核酸內切酶。例如，經RNA引導之核酸內切酶可為天然存在的經RNA引導之核酸內切酶的突變體。與天然存在的經RNA引導之核酸內切酶相比，突變的經RNA引導之核酸內切酶亦可為具有活性改變的突變的經RNA引導之核酸內切酶，諸如改變的核酸內切酶活性(例如改變或消除的DNA核酸內切酶活性而不實質地減少與DNA之結合親和力)。此等修飾可容許以轉錄調節(例如活化或抑制)為目的之突變的經RNA引導之核酸內切酶的序列特異性DNA靶向；以甲基化、去甲基化、乙醯化或去乙醯化之表觀遺傳修飾或染色質修飾、或本技術中已知的DNA結合及/或DNA修飾蛋白之任何其他修飾。在一些實施態樣中，突變的經RNA引導之核酸內切酶不具有DNA核酸內切酶活性。

經RNA引導之核酸內切酶可為切口酶，其切割靶DNA之互補股，但是降低切割靶DNA之非互補股的能力，或其切割靶DNA之非互補股，但是降低切割靶DNA之互補股的能力。在一些實施態樣中，經RNA引導之核酸內切酶具有降低切割靶DNA之互補股及非互補股兩者的能力。

在一些實施態樣中，將編碼經RNA引導之核酸內切酶的核酸投予個體。在一些實施態樣中，核酸可藉由試管內轉錄反應來產生。在一些實施態樣中，在試管內產生經轉錄之RNA包含在容許(運轉關閉(run-off))RNA試管內轉錄的條件下以RNA聚合酶及核苷酸混合物培育線性DNA模板。核苷酸混合物可為試管內轉錄混合物(IVT-混合物)的一部分。在一些實施態樣中，RNA聚合酶為T7 RNA聚合酶。用於RNA試管內轉錄之核苷酸混合物可另外含有如下定義的經修飾之核苷酸。在一些實施態樣中，用於RNA試管內轉錄反應之核苷酸混合物(例如在混合物中的各核苷酸部分)可最適化於給出之RNA序列(最適化之NTP混合物)。此等方法說明於例如WO2015/188933中。在一些實施態樣中，以使用最適化之NTP混合物之方法獲得的RNA係以降低的免疫刺激性質為特徵。

在一些實施態樣中，核苷酸混合物包含未經修飾之核糖核苷三磷酸(NTP)GTP、ATP、CTP和UTP。在一些實施態樣中，試管內轉錄可包括至少一個端帽類似物的存在，例如端帽1三核苷酸端帽類似物、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)pG、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG或 rn7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG。在一些實施態樣中，5’-端帽結構係經由使用加帽酶(capping enzyme)(例如牛痘病毒加帽酶及/或端帽依賴性2’-O-甲基轉移酶)之酶促加帽來形成，以產生端帽0或端帽1或端帽2結構。5’-端帽結構(端帽0或端帽1)亦可使用固定化加帽酶及/或端帽依賴性2’-O-甲基轉移酶添加，該添加係使用WO2016/193226中所揭示之方法及設備。在一些實施態樣中，至少一個(核糖)核苷三磷酸的一部分或全部係經修飾之核苷三磷酸置換。在一些實施態樣中，經修飾之核苷三磷酸包含假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1 ψ)、5-甲基胞嘧啶或5-甲氧基尿苷。在一些實施態樣中，在核苷酸混合物中的尿嘧啶核苷酸係經假尿苷(ψ)及/或N1-甲基假尿苷(m1 ψ)置換(部分或完全)以獲得經修飾之RNA。在一些實施態樣中，經化學修飾之核苷酸為假尿苷(ψ)。在一些實施態樣中，經化學修飾之核苷酸為N1-甲基假尿苷(m1ψ)。在一些實施態樣中，核苷酸混合物包含用於併入RNA之至少一種經修飾之核苷酸及/或至少一種核苷酸類似物或核苷酸衍生物。例如，如本文所定義的經修飾之核苷酸可包括核苷酸類似物/修飾物，例如主鏈修飾物、糖修飾物或鹼修飾物。主鏈修飾物可包含其中核苷酸主鏈之磷酸經化學修飾之修飾物。糖修飾物可包含核苷酸的糖之化學修飾。此外，鹼修飾物可包含核苷酸的鹼部分之化學修飾。在此上下文中，核苷酸類似物或修飾物可包含適用於轉錄及/或轉譯之核苷酸類似物。在一些實施態樣中，核苷酸混合物包含至少一個經修飾之核苷酸及/或至少一個核苷酸類似物，其係選自主鏈經修飾之核苷酸、糖經修飾之核苷酸及/或鹼經修飾之核苷酸或其任何組合。

可包括在核苷酸混合物中及併入RNA中的經修飾之核苷及核苷酸可在糖部分中修飾。例如，2’羥基(OH)可經一些不同的「氧基」或「去氧基」取代基修飾或置換。「氧基」-2’羥基修飾物的實例包括但不限於烷氧基或芳氧基(-OR，例如R=H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)， -O(CH ₂CH ₂₀)nCH ₂CH ₂OR；其中2’羥基經例如亞甲基橋連接至同一核糖的4'碳之「鎖」核酸(LNA)；及胺基(-O-胺基，其中胺基可為烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺、聚胺基)或胺基烷氧基。「去氧基」修飾物包括氫、胺基(例如NH ₂；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)；或胺基可通過鍵聯子附接至糖，其中鍵聯子包含原子C、N和O中之一或多者。糖基團亦可含有一或多個與核糖中的對應碳具有相反的立體化學組態之碳。因此，經修飾之RNA分子可包括含有例如阿拉伯糖作為糖的核苷酸。

磷酸主鏈可在經修飾之核苷及核苷酸中進一步修飾，其可包括在核苷酸混合物中及併入經修飾之試管內轉錄之RNA中。主鏈之磷酸基團可藉由以不同的取代基置換氧原子中之一或多者來修飾。再者，經修飾之核苷及核苷酸可包括如本文所述以經修飾之磷酸完全置換的未經修飾之磷酸部分。經修飾之磷酸基團的實例包括但不限於硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenate)、硼代磷酸酯(borano phosphate)、硼代磷酸酯(borano phosphate ester)、氫膦酸酯、磷醯胺酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯具有以硫置換的兩個非鍵聯氧。磷酸鍵聯子亦可藉由以氮(橋連之磷醯胺酸酯)、硫(橋連之硫代磷酸酯)及碳(橋連之亞甲基膦酸酯)置換鍵聯氧來修飾。

如本文所述之核苷酸可在核鹼基部分中修飾。在RNA中發現之核鹼基的實例包括但不限於腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。例如，本文所述之核苷及核苷酸可在大溝面(major groove face)上經化學修飾。在一些實施態樣中，大溝化學修飾物包括胺基、硫醇基、烷基或鹵基。

核苷酸類似物/修飾物包含2-胺基-6-氯嘌呤核糖苷-5’-三磷酸、2-胺基嘌呤-核糖苷-5’-三磷酸；2-胺基腺苷-5‘-三磷酸、2’-胺基-2’-去氧胞苷-三磷酸、2-硫代胞苷-5’-三磷酸、2-硫代尿苷-5’-三磷酸、2’-氟胸苷-5’-三磷酸、2’-O-甲基-肌苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、5-胺基烯丙基胞苷-5’-三磷酸、5-胺基烯丙基尿苷-5’-三磷酸、5-溴胞苷-5’-三磷酸、5-溴尿苷-5’-三磷酸、5-溴-2’-去氧胞苷-5’-三磷酸、5-溴-2’-去氧尿苷-5’-三磷酸、5-碘胞苷-5’-三磷酸、5-碘-2’-去氧胞苷-5’-三磷酸、5-碘尿苷-5’-三磷酸、5-碘-2’-去氧尿苷-5’-三磷酸、5-甲基胞苷-5’-三磷酸、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、5-丙炔基-2’-去氧胞苷-5’-三磷酸、5-丙炔基-2’-去氧尿苷-5’-三磷酸、6-氮雜胞苷-5’-三磷酸、6-氮雜尿苷-5’-三磷酸、6-氯嘌呤核糖苷-5’-三磷酸、7-去氮雜腺苷-5’-三磷酸、7-去氮雜鳥苷-5’-三磷酸、8-氮雜腺苷-5’-三磷酸、8-疊氮基腺苷-5’-三磷酸、苯并咪唑-核糖苷-5’-三磷酸、N1-甲基腺苷-5’-三磷酸、N1-甲基鳥苷-5’-三磷酸、N6-甲基腺苷-5’-三磷酸、O6-甲基鳥苷-5’-三磷酸、假尿苷-5’-三磷酸、嘌呤黴素-5’-三磷酸、黃苷-5'-三磷酸。經鹼修飾之核苷酸可包含5-甲基胞苷-5’-三磷酸、7-去氮雜鳥苷-5’-三磷酸、5-溴胞苷-5’-三磷酸和假尿苷-5’-三磷酸、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羥基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧基甲基-尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基(taurinomethyl)尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、二氫尿苷、二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙醯基胞苷、5-甲醯基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羥基甲基胞苷、1-甲基-假異胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假異胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮雜-假異胞苷、1-甲基-1-去氮雜-假異胞苷、澤布拉林(zebularine)、5-氮雜-澤布拉林、5-甲基-澤布拉林、5-氮雜-2-硫代-澤布拉林、2-硫代-澤布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、7-去氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-2-胺基嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-2-胺基嘌呤、7-去氮雜-2,6-二胺基嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、N6-甘胺醯基胺甲醯基腺苷、N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、2-甲硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、懷俄苷(wyosine)、懷俄丁苷(wybutosine)、7-去氮雜-鳥苷、7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷、6-硫代-鳥苷、6-硫代-7-去氮雜-鳥苷、6-硫代-7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷、6-硫代-7-甲基-鳥苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基鳥苷、N2-甲基鳥苷、N2,N2-二甲基鳥苷、8-側氧鳥苷、7-甲基-8-側氧鳥苷、1-甲基-6-硫代-鳥苷、N2-甲基-6-硫代-鳥苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鳥苷、5’-O-(1-硫代磷酸)-腺苷、5’-O-(1-硫代磷酸)-胞苷、5’-O-(1-硫代磷酸)-鳥苷、5’-O-(1-硫代磷酸)-尿苷、5’-O-(1-硫代磷酸)-假尿苷、6-氮雜-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假異胞苷、5-胺基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1 -甲基-假尿苷、5,6-二氫尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮雜-尿苷、5-羥基-尿苷、去氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯并胞苷、肌苷、α-硫代-鳥苷、6-甲基-鳥苷、5-甲基-鳥苷、8-側氧鳥苷、7-去氮雜-鳥苷、N1-甲基-腺苷、2-胺基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-胺基-嘌呤、假異胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-疊氮基-腺苷或7-去氮雜-腺苷。

本文所述之至少一種經修飾之核苷酸及/或至少一種核苷酸類似物可包含1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、2'-O-甲基腺苷、2-甲硫基-N6-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺苷、N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、2-甲硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、N6-甲基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基腺苷、2-甲硫基-N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基腺苷、肌苷、3-甲基胞苷、2-O-甲基胞苷、2-硫代胞苷、N4-乙醯基胞苷、立西啶、1-甲基鳥苷、7-甲基鳥苷、2'-O-甲基鳥苷、Q核苷(queuosine)、環氧基Q核苷、7-氰基-7-去氮雜鳥苷、7-胺基甲基-7-去氮雜鳥苷、假尿苷、二氫尿苷、5-甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷、3-(3-胺基-3-羧丙基)尿苷'、5-羥基尿苷、5-甲氧基尿苷、尿苷5-氧乙酸、尿苷5-氧乙酸甲酯、5-胺基甲基-2-硫代尿苷、5-甲基胺基甲基尿苷、5-甲基胺基甲基-2-硫代尿苷、5-甲基胺基甲基-2-硒代尿苷(selenouridine)、5-羧基甲基胺基甲基尿苷、5-羧基甲基胺基甲基-2'-O-甲基尿苷、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫代尿苷、5-(異戊烯基胺基甲基)尿苷、5-(異戊烯基胺基甲基)-2-硫代尿苷或5-(異戊烯基胺基甲基)-2'-O-甲基尿苷。

在一些實施態樣中，化學修飾物包含假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲氧基尿苷、2’-O-甲基尿苷或其組合。

在一些實施態樣中，在編碼序列中的100%之尿嘧啶可具有化學修飾物。在一些實施態樣中，化學修飾物係在尿嘧啶的5'-位置。在一些實施態樣中，在RNA之編碼序列(cds)中的100%之尿嘧啶可具有化學修飾物，例如在尿嘧啶的5'-位置之化學修飾物。在一些實施態樣中，在cds中的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%之尿嘧啶核苷酸具有化學修飾物，例如在該尿嘧啶核苷酸的5-位置之化學修飾物。此等修飾物可降低先天免疫系統的刺激(在活體內投予包含此經修飾之核苷酸的RNA之後)。

如本文所使用之術語「cds」或「編碼序列」或「編碼區域」係由熟習本技術領域者識別及理解，且例如可指幾個核苷酸三聯體之序列，其可轉譯成肽或蛋白質。RNA之cds可包含至少一種經修飾之核苷酸，其中該至少一種經修飾之核苷酸可選自假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶和5-甲氧基尿苷。

如本文所使用之術語「經修飾之核苷酸」或「經化學修飾之核苷酸」可指RNA構建塊之所有可能的天然及非天然化學修飾物，即核糖核苷酸A、G、C和U。

在一些實施態樣中，在試管內轉錄反應中的核苷酸混合物包含端帽類似物。因此，在一些實施態樣中，端帽類似物為如下述之端帽0、端帽1、端帽2、經修飾之端帽0或經修飾之端帽1類似物、或端帽1類似物。本文所使用之術語「端帽類似物」或「5’-端帽結構」可指位於RNA(例如mRNA)之5’端的RNA之5’結構，特別為鳥嘌呤核苷酸。在一些實施態樣中，5’-端帽結構係經由5’-5’-三磷酸鍵聯連接至RNA。在一些實施態樣中，「5’-端帽結構」或「端帽類似物」不被認為是「經修飾之核苷酸」或「經化學修飾之核苷酸」。可能適合的5’-端帽結構包括端帽0(第一核鹼基之甲基化，例如m7GpppN)、端帽1(m7GpppN之相鄰核苷酸的核糖之額外甲基化)、端帽2(m7GpppN下游之第二核苷酸的核糖之額外甲基化)、cap3(m7GpppN下游之第三核苷酸的核糖之額外甲基化)、cap4(m7GpppN下游之第四核苷酸的核糖之額外甲基化)、ARCA(抗逆轉端帽類似物)、modARCA(例如硫代磷酸酯modARCA)、肌苷、N1-甲基-鳥苷、2’-氟-鳥苷、7-去氮雜-鳥苷、8-側氧鳥苷、2-胺基-鳥苷、LNA-鳥苷和2-疊氮基-鳥苷。

5’-端帽(端帽0或端帽1)結構可以使用加帽酶之化學RNA合成法或使用端帽類似物之RNA試管內轉錄(共轉錄加帽)來形成。如本文所使用之術語「端帽類似物」可指不可聚合的二核苷酸或三核苷酸，當在RNA之5’端併入時，其具有促成RNA轉譯或定位及/或防止RNA降解之端帽功能性。不可聚合的意指端帽類似物僅在5'-末端併入，因為其不具有5'三磷酸且因此不可能藉由模板依賴性聚合酶(例如DNA依賴性RNA聚合酶)在3'方向延伸。端帽類似物的實例包括m7GpppG、m7GpppA、m7GpppC；未甲基化端帽類似物(例如GpppG)；二甲基化端帽類似物(例如m2,7GpppG)、三甲基化端帽類似物(例如m2,2,7GpppG)、二甲基化對稱性端帽類似物(例如m7Gpppm7G)或抗逆轉端帽類似物(例如ARCA；m7,2’OmeGpppG、m7,2’dGpppG、m7,3’OmeGpppG、m7,3’dGpppG和其四磷酸衍生物)。更多的端帽類似物已在先前說明於例如WO2008/016473、WO2008/157688、WO2009/149253、WO2011/015347和WO2013/059475中。在此上下文中，更多適合的端帽類似物說明於例如WO2017/066793、WO2017/066781、WO2017/066791、WO2017/066789、WO2017/053297、WO2017/066782、WO2018/075827和WO2017/066797中，其中藉引用將關於端帽類似物的揭示內容併入本文。

在一些實施態樣中，端帽1結構係使用三核苷酸端帽類似物產生，如WO2017/053297、WO2017/066793、WO2017/066781、WO2017/066791、WO2017/066789、WO2017/066782、WO2018/075827和WO2017/066797中所揭示。例如，自WO2017/053297之請求項1至5中所揭示之結構可衍生的任何端帽類似物可適合用於共轉錄地產生端帽1結構。在一些實施態樣中，自WO2018/075827中所述之結構可衍生的任何端帽類似物可適合用於共轉錄地產生端帽1結構。在一些實施態樣中，端帽1類似物為端帽1三核苷酸端帽類似物。在一些實施態樣中，經試管內轉錄之RNA的端帽1結構係使用共轉錄加帽來形成，該共轉錄加帽係使用三核苷酸端帽類似物m7G(5’)ppp(5')(2’OMeA)pG或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG) pG。在一些實施態樣中，端帽1類似物為 m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG。

在一些實施態樣中，RNA(例如mRNA)包含5’端帽結構，例如端帽1結構。在一些實施態樣中，5’端帽結構可改進mRNA的穩定性及/或表現。包含mRNA之端帽1結構(藉由例如試管內轉錄生產)具有幾個有利的特性，包括增加的轉譯效率及降低的先天免疫系統刺激。在一些實施態樣中，經試管內轉錄之RNA包含至少一個編碼至少一個肽或蛋白質之編碼序列。在一些實施態樣中，蛋白質為經RNA引導之核酸內切酶。在一些實施態樣中，經RNA引導之核酸內切酶為Cas9或其衍生物。

本揭示提供編碼化膿鏈球菌Cas9核酸內切酶之最適化mRNA(「SpCas9 mRNA」)，且其視需要地包括經化學修飾之核苷酸，當以一或多種gRNA投予時，其對靶細胞群提供有效的基因組編輯。在一些實施態樣中，本揭示提供包含下列之mRNA：(i)5′非轉譯區域(UTR)；(ii)開讀框(ORF)，其包含編碼定點核酸內切酶之核苷酸序列；及(iii)3′非轉譯區域(UTR)。在一些實施態樣中，定點核酸內切酶為Cas核酸酶。在一些實施態樣中，Cas核酸酶為Cas9多肽。在一些實施態樣中，Cas9多肽為化膿鏈球菌衍生之Cas9(SpCas9)多肽。在一些實施態樣中，ORF進一步包含一或多種編碼核定位信號之核苷酸序列，諸如一種本文所述之核苷酸序列。在一些實施態樣中，ORF包含編碼定點核酸內切酶(諸如SpCas9多肽)之核苷酸序列及至少一種為核質素(nucleoplasmin)及/或SV40 NLS之NLS。在一些實施態樣中，ORF包含編碼可操作地鍵聯至定點核酸內切酶(諸如SpCas9多肽)的N末端及/或C末端NLS之核苷酸序列。在一些實施態樣中，ORF包含編碼可操作地鍵聯至定點核酸內切酶(諸如SpCas9多肽)的N末端SV40 NLS及可操作地鍵聯至定點核酸內切酶(諸如SpCas9多肽)的C末端核質素NLS之核苷酸序列。

在一些實施態樣中，mRNA可包含至少一種經化學修飾之核苷及/或核苷酸。在一些實施態樣中，經化學修飾之核苷係選自假尿苷、N1-甲基假尿苷和5-甲氧基尿苷。在一些實施態樣中，經化學修飾之核苷為N1-甲基假尿苷(例如1-甲基假尿苷)。在一些實施態樣中，在mRNA中的至少約80%或更多(例如約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)之尿苷經N1-甲基假尿苷修飾或置換。在一些實施態樣中，在mRNA中的100%之尿苷(例如尿嘧啶)經N1-甲基假尿苷修飾或置換。在一些實施態樣中，mRNA之尿苷或尿嘧啶殘基中之二或更多(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800或更多)為N1-甲基假尿苷。引導RNA(gRNA)

在一些實施態樣中，用於基因編輯 LPA基因的經CRISPR/Cas調介之基因編輯系統包含基因組靶向核酸(例如引導RNA)，其可將經RNA引導之核酸內切酶之活性導向 LPA基因內的特異性靶序列。引導RNA包含至少與關注的靶核酸序列雜交之間隔子序列及CRISPR重複序列。gRNA可為單分子引導RNA或雙分子引導RNA。經RNA引導之核酸內切酶可為例如Cas核酸內切酶，包括Cas9核酸內切酶。Cas9核酸內切酶可為例如SpyCas9、SaCas9或SluCas9核酸內切酶。在一些實施態樣中，RNA核酸內切酶為Cas9變異體。在一些實施態樣中，經RNA引導之核酸內切酶為經小RNA引導之核酸內切酶。在一些實施態樣中，經RNA引導之核酸內切酶為小Cas核酸內切酶。

在一些實施態樣中，gRNA包含5’至3’：crRNA及tracrRNA，其中crRNA與tracrRNA雜交以形成雙股螺旋。在一些實施態樣中，crRNA包含能夠靶向靶核酸(例如基因組DNA分子)中的靶序列之間隔子序列及crRNA重複序列。在一些實施態樣中，tracrRNA包含tracrRNA反向重複序列及3’ tracrRNA序列。在一些實施態樣中，crRNA重複序列之3’端係與tracrRNA反向重複序列之5’端鍵聯，例如藉由四鹼基環圈(tetraloop)，其中crRNA重複序列與tracrRNA反向重複序列雜交以形成sgRNA。在一些實施態樣中，sgRNA包含5’至3’：間隔子序列、crRNA重複序列、四鹼基環圈、tracrRNA反向重複序列及3’ tracrRNA序列。在一些實施態樣中，sgRNA包含5’間隔子延伸序列。在一些實施態樣中，sgRNA包含3’ tracrRNA延伸序列。3’ tracrRNA可包含一或多個主幹環圈，或由彼等所組成，例如一、二、三或更多個主幹環圈。

在一些實施態樣中，sgRNA之不可變序列包含GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO：1)之核苷酸序列或具有相對於SEQ ID NO：1而至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸刪除、插入或取代之核苷酸序列。在一些實施態樣中，sgRNA係與SpCa9或SpyCas9核酸內切酶一起使用。

本文所揭示之引導RNA可經由crRNA中的間隔子序列靶向關注的任何序列。在gRNA中的間隔子序列為界定關注的靶基因(例如 LPA基因)之靶序列(例如DNA靶序列，諸如基因組靶序列)之序列(例如20個核苷酸序列)。在一些實施態樣中，間隔子序列的範圍為15至30個核苷酸。例如，間隔子序列可為、可為約或可為至多10、15、16、17、18、19、29、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50個、或該等值中任一者之間的數值或範圍之核苷酸長度。在一些實施態樣中，間隔子序列含有20個核苷酸。在一些實施態樣中，gRNA能夠與靶dsDNA之正向股雜交。在一些實施態樣中，gRNA能夠與靶dsDNA之反向股雜交。

「靶序列」係位於與PAM序列相鄰的靶基因中且為經RNA引導之核酸酶(例如Cas9)修飾之序列。「靶序列」係位於「靶核酸」中所謂的PAM股上，該靶核酸為含有PAM股及互補的非PAM股之雙股分子。熟習本技術領域者識別出gRNA間隔子序列係與位於關注的靶核酸之非PAM股中的互補序列雜交。因此，gRNA間隔子序列為靶序列之RNA等效物。gRNA之間隔子係經由雜交(亦即鹼基配對)以序列特異性方式與關注的靶核酸相互作用。間隔子之核苷酸序列因此取決於關注的靶核酸之靶序列而改變。在一些實施態樣中， LPA基因之靶序列係於 LPA基因之外顯子3內。

在本文所使用之CRISPR/Cas系統中，設計間隔子序列與位於以系統中所使用之Cas9酶可識別的PAM之5’的靶核酸區域雜交。間隔子可與靶序列完美匹配或可具有錯配。各Cas9酶具有在靶DNA中識別出的特定PAM序列。例如，化膿鏈球菌在靶核酸中識別出PAM，其包含序列5'-NRG-3'，其中R包含A或G，其中N為任何核苷酸且N緊接以間隔子序列靶向之靶核酸序列的3'。

在一些實施態樣中，靶核酸序列具有20個核苷酸長度。在一些實施態樣中，靶核酸具有少於20個核苷酸長度。在一些實施態樣中，靶核酸具有超過20個核苷酸長度。在一些實施態樣中，靶核酸具有至少：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多個核苷酸長度。在一些實施態樣中，靶核酸具有至多：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多個核苷酸長度。在一些實施態樣中，靶核酸序列具有緊接PAM之第一核苷酸的5’之20個鹼基。例如，在包含5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NRG-3'之序列(SEQ ID NO：2)中，靶核酸可為對應於N之序列，其中N可為任何核苷酸，且畫底線之NRG序列(R為G或A)為化膿鏈球菌PAM。在一些實施態樣中，在本揭示之組成物及方法中用作為以SpCas9識別之序列的PAM序列為NGG，其中N可為A、T、C或G。

在間隔子序列與靶核酸之間的互補性百分比可為約、至少、至少約、至多或至多約30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、或100%。在一些實施態樣中，在靶基因中的引導RNA之間隔子序列與靶核酸為100%之互補性。在一些實施態樣中，在間隔子序列與靶核酸之間的互補性百分比以靶核酸的互補股之靶序列的六個連續的5'端核苷酸為100%。在一些實施態樣中，在間隔子序列與靶核酸之間的互補性百分比以約20個連續的核苷酸為至少60%。在其他的實施態樣中，在靶基因中的引導RNA之間隔子序列及靶核酸可含有至多10個錯配，例如至多9、至多8、至多7、至多6、至多5、至多4、至多3、至多2、或至多1個錯配。

LPAgRNA可靶向 LPA基因之外顯子3內的靶序列。在一些實施態樣中， LPAgRNA包含對應於表1中所列出之SEQ ID NO：3至10中所提出之靶序列中任一者之間隔子序列。在一些實施態樣中， LPAgRNA包含選自表1中所列出之SEQ ID NO：18至25之間隔子序列。

在一些實施態樣中，gRNA包含對應於以SEQ ID NO：3至10所提出之靶序列中任一者之間隔子序列或其變異體。在一些實施態樣中，gRNA包含對應於以SEQ ID NO：3至10所提出之靶序列中任一者之間隔子序列。在一些實施態樣中，gRNA包含與對應於以SEQ ID NO：3至10所提出之靶序列中任一者之RNA序列具有一、二或三個錯配之間隔子序列。在一些實施態樣中，gRNA包含以SEQ ID NO：18至25所提出之間隔子序列或其變異體。在一些實施態樣中，gRNA包含選自SEQ ID NO：18至25之間隔子序列。在一些實施態樣中，gRNA包含與選自SEQ ID NO：18至25之序列具有一、二或三個錯配之間隔子序列。在一些實施態樣中，gRNA為sgRNA。

在一些實施態樣中，將包含與 LPA基因之靶序列互補的間隔子之兩個gRNA提供給細胞。在一些實施態樣中，gRNA為包含對應於以SEQ ID NO：3至10所提出之靶序列中任一者之間隔子或其變異體的任何兩個gRNA。在一些實施態樣中，兩個gRNA中之一或兩者包含對應於以SEQ ID NO：3至10所提出之靶序列中任一者之間隔子序列。在一些實施態樣中，兩個gRNA中之一或兩者包含與對應於以SEQ ID NO：3至10所提出之靶序列中任一者之RNA序列具有一、二或三個錯配之間隔子序列。在一些實施態樣中，兩個gRNA中之一或兩者包含以SEQ ID NO：18至25所提出之間隔子序列或其變異體。在一些實施態樣中，兩個gRNA中之一或兩者包含選自SEQ ID NO：18至25之間隔子序列。在一些實施態樣中，兩個gRNA中之一或兩者包含與選自SEQ ID NO：18至25之序列具有一、二或三個錯配之間隔子序列。

在一些實施態樣中，gRNA包含第一gRNA，其包含具有SEQ ID NO：18之序列或與SEQ ID NO：18具有至少85%(例如至少90%或至少95%)之同源性之序列的間隔子，及第二gRNA，其包含具有SEQ ID NO：19至25中任一者之序列或與SEQ ID NO：19至25中任一者具有至少85%(例如至少90%或至少95%)之同源性之序列的間隔子。在一些實施態樣中，gRNA包含第一gRNA，其包含具有SEQ ID NO：18之序列的間隔子，及第二gRNA，其包含具有SEQ ID NO：19至25中任一者之序列的間隔子。

在一些實施態樣中，gRNA包含以SEQ ID NO：18所提出之間隔子序列或與SEQ ID NO：18具有約、至少、至少約80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、或100%之同源性之序列。在一些實施態樣中，gRNA包含相對於SEQ ID NO：18具有不超過3個錯配(例如1或2個錯配)之間隔子序列。在一些實施態樣中，gRNA包含SEQ ID NO：18之間隔子序列。

在一些實施態樣中， LPAgRNA包含對應於以下表2中所列出之SEQ ID NO：12至17所提出之靶序列中任一者之間隔子序列。在一些實施態樣中， LPAgRNA包含選自表2中所列出之SEQ ID NO：26至31之間隔子序列。

在一些實施態樣中，gRNA為經化學修飾之gRNA。可將各種類型的RNA修飾引入gRNA中以增強穩定性、降低先天免疫反應的可能性或程度及/或增強如本技術中所述之其他屬性。本文所述之gRNA可包含一或多種修飾，包括核苷間鍵聯、嘌呤或嘧啶鹼或糖。在一些實施態樣中，修飾係以化學合成或聚合酶在gRNA的末端引入。經修飾之核酸及其合成的實例揭示於WO2013/052523中。經修飾之多核苷酸的合成亦說明於Verma and Eckstein, Annual Review of Biochemistry, vol. 76, 99-134(1998)中。

經化學修飾之gRNA可包含一或多個在gRNA的3’端及/或5’端之硫代磷酸化2'-O-甲基核苷酸。在一些實施態樣中，經化學修飾之gRNA包含在gRNA的3’端之硫代磷酸化2'-O-甲基核苷酸。在一些實施態樣中，經化學修飾之gRNA包含在gRNA的5’端之硫代磷酸化2'-O-甲基核苷酸。在一些實施態樣中，經化學修飾之gRNA包含在gRNA的3’端之三或四個硫代磷酸化2'-O-甲基核苷酸及/或在gRNA的5’端之三或四個硫代磷酸化2'-O-甲基核苷酸。在一些實施態樣中，SEQ ID NO：18至25及26至31中任一者可經化學修飾而在gRNA的3’端具有一、二、三或四個硫代磷酸化2'-O-甲基核苷酸；在gRNA的5’端具有一、二或三個硫代磷酸化2'-O-甲基核苷酸；或其組合。硫代磷酸酯鍵聯的數量及位置可改變。在一些實施態樣中，鍵聯可在自gRNA的5’端起第一與第二、第二與第三、第三與第四位置、第四與第五、第五與第六、第六與第七、第七與第八、第八與第九、第九或第十、或更遠的位置之間。在一些實施態樣中，鍵聯可在自gRNA的3’端起第一與第二、第二與第三、第三與第四位置、第四與第五、第五與第六、第六與第七、第七與第八、第八與第九、第九或第十、或更遠的位置之間。在一些實施態樣中，經化學修飾之gRNA具有本文所述之gRNA中任一者之序列(例如SEQ ID NO：32)，且具有一或多個本文所述的經化學修飾之核苷酸及/或硫代磷酸酯鍵聯中之一或多者。經化學修飾之gRNA為作為實例的SEQ ID NO：11。

在一些實施態樣中，核苷酸類似物/修飾物可包含2-胺基-6-氯嘌呤核糖苷-5’-三磷酸、2-胺基嘌呤-核糖苷-5'-三磷酸、2-胺基腺苷-5‘-三磷酸、2’-胺基-2’-去氧胞苷-三磷酸、2-硫代胞苷-5’-三磷酸、2-硫代尿苷-5’-三磷酸、2’-氟胸苷-5’-三磷酸、2’-O-甲基-肌苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、5-胺基烯丙基胞苷-5’-三磷酸、5-胺基烯丙基尿苷-5’-三磷酸、5-溴胞苷-5’-三磷酸、5-溴尿苷-5’-三磷酸、5-溴-2’-去氧胞苷-5’-三磷酸、5-溴-2’-去氧尿苷-5’-三磷酸、5-碘胞苷-5’-三磷酸、5-碘-2’-去氧胞苷-5’-三磷酸、5-碘尿苷-5’-三磷酸、5-碘-2’-去氧尿苷-5’-三磷酸、5-甲基胞苷-5’-三磷酸、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、5-丙炔基-2’-去氧胞苷-5’-三磷酸、5-丙炔基-2’-去氧尿苷-5’-三磷酸、6-氮雜胞苷-5’-三磷酸、6-氮雜尿苷-5’-三磷酸、6-氯嘌呤核糖苷-5’-三磷酸、7-去氮雜腺苷-5’-三磷酸、7-去氮雜鳥苷-5’-三磷酸、8-氮雜腺苷-5’-三磷酸、8-疊氮基腺苷-5’-三磷酸、苯并咪唑-核糖苷-5’-三磷酸、N1-甲基腺苷-5’-三磷酸、N1-甲基鳥苷-5’-三磷酸、N6-甲基腺苷-5’-三磷酸、O6-甲基鳥苷-5’-三磷酸、假尿苷-5’-三磷酸、嘌呤黴素-5’-三磷酸或黃苷-5'-三磷酸。經鹼修飾之核苷酸可包含5-甲基胞苷-5’-三磷酸、7-去氮雜鳥苷-5’-三磷酸、5-溴胞苷-5’-三磷酸和假尿苷-5’-三磷酸、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羥基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧基甲基-尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、二氫尿苷、二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙醯基胞苷、5-甲醯基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羥基甲基胞苷、1-甲基-假異胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假異胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮雜-假異胞苷、1-甲基-1-去氮雜-假異胞苷、澤布拉林、5-氮雜-澤布拉林、5-甲基-澤布拉林、5-氮雜-2-硫代-澤布拉林、2-硫代-澤布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、7-去氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-2-胺基嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-2-胺基嘌呤、7-去氮雜-2,6-二胺基嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、N6-甘胺醯基胺基甲醯基腺苷、N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、2-甲硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、懷俄苷、懷俄丁苷、7-去氮雜-鳥苷、7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷、6-硫代-鳥苷、6-硫代-7-去氮雜-鳥苷、6-硫代-7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷、6-硫代-7-甲基-鳥苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基鳥苷、N2-甲基鳥苷、N2,N2-二甲基鳥苷、8-側氧鳥苷、7-甲基-8-側氧鳥苷、1-甲基-6-硫代-鳥苷、N2-甲基-6-硫代-鳥苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鳥苷、5’-O-(1-硫代磷酸)-腺苷、5’-O-(1-硫代磷酸)-胞苷、5’-O-(1-硫代磷酸)-鳥苷、5’-O-(1-硫代磷酸)-尿苷、5’-O-(1-硫代磷酸)-假尿苷、6-氮雜-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假異胞苷、5-胺基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氫尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮雜-尿苷、5-羥基-尿苷、去氧胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯并胞苷、肌苷、α-硫代-鳥苷、6-甲基-鳥苷、5-甲基-鳥苷、8-側氧鳥苷、7-去氮雜-鳥苷、N1-甲基-腺苷、2-胺基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-胺基-嘌呤、假異胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-疊氮基-腺苷或7-去氮雜-腺苷。

至少一種經修飾之核苷酸及/或至少一種核苷酸類似物可包含1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、2'-O-甲基腺苷、2-甲硫基-N6-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺苷、N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、2-甲硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、N6-甲基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基腺苷、2-甲硫基-N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基腺苷、肌苷、3-甲基胞苷、2-O-甲基胞苷、2-硫代胞苷、N4-乙醯基胞苷、立西啶、1-甲基鳥苷、7-甲基鳥苷、2'-O-甲基鳥苷、Q核苷、環氧基Q核苷、7-氰基-7-去氮雜鳥苷、7-胺基甲基-7-去氮雜鳥苷、假尿苷、二氫尿苷、5-甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷、3-(3-胺基-3-羧基丙基)尿苷'、5-羥基尿苷、5-甲氧基尿苷、尿苷 5-氧乙酸、尿苷 5-氧乙酸甲酯、5-胺基甲基-2-硫代尿苷、5-甲基胺基甲基尿苷、5-甲基胺基甲基-2-硫代尿苷、5-甲基胺基甲基-2-硒代尿苷、5-羧基甲基胺基甲基尿苷、5-羧基甲基胺基甲基-2'-O-甲基尿苷、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫代尿苷、5-(異戊烯基胺基甲基)尿苷、5-(異戊烯基胺基甲基)-2-硫代尿苷或5-(異戊烯基胺基甲基)-2'-O-甲基尿苷。

在一些實施態樣中，化學修飾物包含假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲氧基尿苷或2’-O-甲基尿苷。在一些實施態樣中，修飾物包含2’-O-甲基尿苷(2'OMe-rU)、2-O-甲基胞苷(2'OMe-rC)、2'-O-甲基腺苷(2'OMe-rA)或2'-O-甲基鳥苷(2'OMe-rG)。

gRNA可包含任何數量的經修飾之核苷酸。例如，在經修飾之gRNA分子中的核苷酸百分比可為、可為至少、可為約或可為至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、或75%。

作為實例的SEQ ID NO：3可經化學修飾為：「g*a*u* UAA UGA CAU ACG CAU UU」(將T轉換成U)，其中u=2'OMe-rU；a=2'OMe-rA；g=2'OMe-rG；*=硫醇化磷酸(Thiolated Phosphate)。在一些實施態樣中， LPAgRNA包含經化學修飾之SEQ ID NO：18，例如「g*a*u* UAA UGA CAU ACG CAU UU」，其中u=2'OMe-rU；a=2'OMe-rA；g=2'OMe-rG；*=硫醇化磷酸。

在一些實施態樣中，gRNA包含GAUUAAUGACAUACGCAUUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO：32)或由其所組成。gRNA(例如SEQ ID NO：32)的核苷酸中之一或多者可為經修飾之核苷酸，例如gRNA(例如SEQ ID NO：32)的一或多個U可為2'OMe-rU，gRNA(例如SEQ ID NO：32)的一或多個A可為2'OMe-rA，gRNA(例如SEQ ID NO：32)的一或多個C可為2'OMe-rC，及gRNA(例如SEQ ID NO：32)的一或多個G可為2'OMe-rG。gRNA(例如SEQ ID NO：32)的一或多個位置可經修飾，例如硫醇化磷酸。在一些實施態樣中，gRNA包含SEQ ID NO：11: 5'- g*a*u* UAA UGA CAU ACG CAU UUG UUU UAG Agc uag aaa uag cAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU Caa cuu gaa aaa gug gca ccg agu cgg ugc u*u*u*u-3’之序列或由其所組成，其中u=2'OMe-rU；a=2'OMe-rA；c=2'OMe-rC；g=2'OMe-rG；*=硫醇化磷酸。劃底線之序列對應於間隔子。

在一些實施態樣中，可以一種以上的引導RNA與CRISPR/Cas核酸酶系統一起使用。各引導RNA可含有不同的靶向序列，使得CRISPR/Cas系統可切割一種以上的靶核酸。在一些實施態樣中，一或多種引導RNA可具有相同或不同的性質，諸如在Cas9 RNP複合體內的活性或穩定性。在使用一種以上的引導RNA的情況下，各引導RNA可在相同或不同的載體上編碼。

本文所述之gRNA可以試管內轉錄(IVT)、合成及/或化學合成方法或其組合生產。利用酶促(IVT)、固相、液相、組合之合成方法、小區域合成法及接合方法。在一個實施態樣中，gRNAs係使用IVT酶促合成方法製造。以IVT製造多核苷酸之方法為本技術中已知且說明於WO2013/151666中。多核苷酸構築體及載體可用於試管內轉錄本文所述之gRNA。編輯 LPA之方法

本文之提供包括使用基因組編輯之方法，其藉由功能性敲除或降低細胞基因組中的 LPA基因表現來編輯 LPA。該方法可用於治療患有脂蛋白相關的疾病或疾患的個體，例如患有心血管疾病的患者。在一些實施態樣中，該方法包含對個體(例如靈長類動物個體)投予與下列複合之複數種奈米粒子：(a)靶向 LPA基因之引導RNA(gRNA)或編碼gRNA之核酸，及(b)編碼經RNA引導之核酸內切酶的核酸，由此治療靈長類動物個體之心血管疾病。

個體可被投予二或更多次，例如兩次用於治療的複數種奈米粒子。對個體的兩次奈米粒子投予可以適合的時間段隔開，例如一週、兩週、三週、四週、五週、六週、七週、八週、三個月、四個月、五個月、六個月、一年、十八個月、兩年、三年、五年、十年、十五年或更久。在一些實施態樣中，二或更多次投予中的兩次係相隔約兩週至約兩個月，例如約三週。在一些實施態樣中，二或更多次投予的每兩次係相隔約兩週至約兩個月，例如約三週。在兩次投予之間適合的時間段可與另兩次投予之間適合的時間段相同或不同。在一些實施態樣中，本文所述之方法包含以所提供的時間段對個體投予單次劑量的複數種奈米粒子，例如一年、兩年、三年、五年、六年、八年、十年、十五年、二十年或更久。在一些實施態樣中，本文所述之方法包含在個體的終生對個體投予單次劑量的複數種奈米粒子。在一些實施態樣中，本文所述之方法包含對個體投予單次劑量的複數種奈米粒子。在一些實施態樣中，複數種奈米粒子係以每次投予約0.01至5 mg/kg，例如0.05至2 mg/kg、0.5至3 mg/kg或0.1至1 mg/kg之gRNA的劑量投予個體。在一些實施態樣中，複數種奈米粒子係以每次投予約0.01至5 mg/kg，例如0.05至2 mg/kg、0.5至3 mg/kg或0.1至1 mg/kg之總核酸(亦即 LPAgRNA及編碼經RNA引導之核酸內切酶之RNA(例如Cas9 mRNA)的總量)的劑量投予個體。

在一些實施態樣中，gRNA靶向 LPA基因中的編碼序列內或附近。在一些實施態樣中，gRNA靶向 LPA基因的外顯子中任一者。在一些實施態樣中，gRNA靶向 LPA基因的外顯子3內之序列。gRNA可包含與 LPA基因的外顯子3內之靶序列互補的間隔子序列。在一些實施態樣中，間隔子係與 LPA基因的外顯子3內或附近(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個鹼基中任一者內)之序列互補。在gRNA之間隔子與 LPA基因中的靶序列之間的互補性可為完美的或不完美的。在一些實施態樣中，互補性可為至少70%、80%、90%、100%、或在該等值中任兩者之間的數值或範圍。在一些實施態樣中，互補性為完美的，亦即100%。

在一些實施態樣中，gRNA包含來自SEQ ID NO：18至25中任一者之間隔子序列或與SEQ ID NO：18至25中任一者具有至少或至少約80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、或100%之同源性之序列。在一些實施態樣中，gRNA包含來自SEQ ID NO：18至25中任一者之間隔子序列或相對於SEQ ID NO：18至25中任一者具有一、二或三個錯配之序列。

在一些實施態樣中，gRNA包含SEQ ID NO：11之序列或與SEQ ID NO：11具有約、至少或至少約80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、或100%之序列同源性之序列。在一些實施態樣中，gRNA包含SEQ ID NO：11之序列。

本文所使用之gRNA可增強中靶(on-target)活性，同時顯著地降低可能的脫靶效應(亦即在除了 LPA基因以外的非所欲位置切割基因組DNA)。在一些實施態樣中，脫靶結合降低約、至少或至少約80%、85%、90%、95%、98%、99%、或100%。

經RNA引導之核酸內切酶可為本文所述或本技術中已知的Cas核酸內切酶。Cas核酸內切酶可為天然存在或非天然存在(例如重組或具有突變)。在一些實施態樣中，Cas核酸內切酶為Cas9核酸內切酶或其變異體。在一些實施態樣中，DNA核酸內切酶係選自由下列所組成之群組：Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(亦稱為Csnl和Csxl2)、Casl00、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csxl0、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4、或Cpfl核酸內切酶或其功能性衍生物。在一些實施態樣中，DNA核酸內切酶為Cas9核酸內切酶或其變異體。在一些實施態樣中，Cas9核酸內切酶係來自化膿鏈球菌(SpyCas9)。在一些實施態樣中，Cas9核酸內切酶係來自路鄧葡萄球菌(SluCas9)。

在一些實施態樣中， LPA基因之基因修飾導致個體(例如哺乳動物、NHP、人類個體)中顯著降低的血液或血漿Lp(a)水平。在一些實施態樣中，血漿Lp(a)水平降低20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、或在該等值中任兩者之間的數值或範圍。在一些實施態樣中，降低的血漿Lp(a)水平為約、至少或至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%、或在該等值中任兩者之間的數值或範圍。

在一些實施態樣中，當與對應的未經修飾之哺乳動物相比時，在經基因修飾之個體(例如哺乳動物、NHP、人類個體)中的血漿Lp(a)水平為約、少於或少於約20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、或在該等值中任兩者之間的數值或範圍。

在一些實施態樣中，降低係相對於以複數種奈米粒子投予之前在個體(例如哺乳動物、NHP、人類個體)血漿中的LPA表現或LPA蛋白質濃度。在一些實施態樣中，降低係相對於一或多位未經治療之個體中的LPA表現或LPA蛋白質濃度。在一些實施態樣中，降低係相對於健康及/或未經修飾之個體的LPA表現或LPA蛋白質濃度之參考水平。

在一些實施態樣中，在進行該方法之後的血漿Lp(a)水平降低至約50 mg/dL或更低(例如約、至多或至多約40 mg/dL、30 mg/dL、20 mg/dL或更低)。在一些實施態樣中，在進行該方法之後的血漿Lp(a)水平降低至約40 mg/dL或更低。在一些實施態樣中，在進行該方法之後的血漿Lp(a)水平降低至約30 mg/dL或更低。在一些實施態樣中，在進行該方法之後的血漿Lp(a)水平降低至約20 mg/dL或更低。醫藥組成物及治療應用

本文之提供亦包括用於進行本文所揭示之方法的醫藥組成物。組成物可包括一或多種gRNA、經RNA引導之核酸內切酶或本文所述之編碼經RNA引導之核酸內切酶的核苷酸序列。在一些實施態樣中，組成物可另外包含欲插入之多核苷酸(例如供體模板)以實現本文所揭示之方法的所欲基因修飾。

在一些實施態樣中，一或多種gRNA各自包含與 LPA基因的外顯子3內或附近(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個鹼基中任一者內)之基因組序列互補的間隔子。gRNA可包含與 LPA基因的外顯子3內之靶序列互補的間隔子序列。在一些實施態樣中，在本文之方法中所使用之gRNA包含SEQ ID NO：18至25中任一者之間隔子序列。在一些實施態樣中，gRNA包含SEQ ID NO：18之間隔子序列或與SEQ ID NO：18之序列具有至少85%之同源性之序列。在一些實施態樣中，gRNA包含SEQ ID NO：11之序列或與SEQ ID NO：11之序列具有至少85%之同源性之序列。

在一些實施態樣中，經RNA引導之核酸內切酶係選自Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(亦稱為Csnl和Csxl2)、CaslOO、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4和Cpfl核酸內切酶或其功能性衍生物。在一些實施態樣中，DNA核酸內切酶為Cas9。在一些實施態樣中，Cas9核酸內切酶係來自化膿鏈球菌(SpyCas9)。在一些實施態樣中，Cas9核酸內切酶係來自路鄧葡萄球菌(SluCas9)。在一些實施態樣中，轉錄成編碼DNA核酸內切酶的核酸之DNA序列經密碼子最適化。在一些實施態樣中，編碼DNA核酸內切酶的核酸包含5’端帽結構及3’端聚腺苷酸尾(poly(A)tail)。在一些實施態樣中，編碼DNA核酸內切酶的核酸係經由共價鍵與gRNA鍵聯。

在一些實施態樣中，核酸序列及/或多肽中之一或多者可經由基於病毒或基於非病毒之遞送系統於試管內或活體內遞送至細胞，該遞送系統包括腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體、皰疹病毒載體、奈米粒子、脂質體、脂質奈米粒子、痘病毒、裸DNA投予、質體、黏質體、噬菌體、囊封之細胞技術及類似者。

在一些實施態樣中，本文所揭示的組成物之化合物(例如LPA gRNA及編碼經RNA引導之核酸內切酶的核酸)可在脂質體或脂質奈米粒子中調配。在一些實施態樣中，組成物之化合物係在脂質奈米粒子(LNP)中調配。術語「脂質奈米粒子」係指由具有以奈米測量的大小(例如1至5,000 nm)之脂質所組成的奈米級粒子。在一些實施態樣中，包含在脂質奈米粒子中的脂質包含陽離子脂質及/或可離子化脂質。本技術中已知的任何適合的陽離子脂質及/或可離子化脂質可用於調配LNP以遞送gRNA及Cas核酸內切酶至細胞。例示性陽離子脂質包括一或多種攜有正電荷之胺基。在一些實施態樣中，陽離子脂質是可離子化的，使得其可取決於pH而以帶正電或中性形式存在。在一些實施態樣中，脂質奈米粒子之陽離子脂質包含可質子化的三級胺頭部基團，其在低的pH下顯示正電荷。脂質奈米粒子可另外包含一或多種中性脂質、帶電脂質、類固醇和經聚合物共軛之脂質。

在一些實施態樣中，脂質奈米粒子可具有約、至少、至少約、至多或至多約30 nm、40 nm、50 nm、60 nm、70 nm、80 nm、90 nm、100 nm、110 nm、120 nm、130 nm、140 nm、150 nm、或該等值中任一者之間的數值或範圍之平均直徑。在一些實施態樣中，脂質奈米粒子粒度為約50至約100 nm直徑、或約70至約90 nm直徑、或約55至約95 nm直徑。在一些實施態樣中，複數種奈米粒子係以每次投予約0.1至5 mg/kg(由核酸總量(例如LPA gRNA及Cas9 mRNA的總量)確定)的劑量投予個體，包括0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.3 mg/kg、0.4 mg/kg、0.5 mg/kg、0.6 mg/kg、0.7 mg/kg、0.8 mg/kg、0.9 mg/kg、1 mg/kg、1.1 mg/kg、1.2 mg/kg、1.3 mg/kg、1.4 mg/kg、1.5 mg/kg、1.6 mg/kg、1.7 mg/kg、1.8 mg/kg、1.9 mg/kg、2 mg/kg、2.1 mg/kg、2.2 mg/kg、2.3 mg/kg、2.4 mg/kg、2.5 mg/kg、2.6 mg/kg、2.7 mg/kg、2.8 mg/kg、2.9 mg/kg、3 mg/kg、3.5 mg/kg、4 mg/kg、4.5 mg/kg、或5 mg/kg、或在該等值中任兩者之間的數值或範圍。在一些實施態樣中，複數種奈米粒子係以或以約0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.3 mg/kg、0.4 mg/kg、0.5 mg/kg、0.6 mg/kg、0.7 mg/kg、0.8 mg/kg、0.9 mg/kg、1 mg/kg、1.1 mg/kg、1.2 mg/kg、1.3 mg/kg、1.4 mg/kg、1.5 mg/kg、2 mg/kg、2.5 mg/kg、或3.0 mg/kg(在一些實施態樣中，由 LPAgRNA及SpCas9 mRNA的總量確定)的劑量投予個體。

在一些實施態樣中，將本文所述的組成物之化合物囊封在脂質奈米粒子之脂質部分中或由脂質奈米粒子之一些或全部脂質部分包圍的水性空間中。囊封可為完全囊封、部分囊封或兩者。在一些實施態樣中，將核酸及/或多肽完全囊封在脂質奈米粒子中。

在一些實施態樣中，本文所述之一或多種化合物係經由共價鍵或非共價鍵與脂質體或脂質奈米粒子締合。在一些實施態樣中，組成物之化合物中任一者可單獨或一起容納在脂質體或脂質奈米粒子中。

在一些實施態樣中，上述之組成物可另外具有一或多種額外的試劑，其中此等額外的試劑係選自緩衝劑、用於引入多肽或多核苷酸至細胞中的緩衝劑、清洗緩衝劑、對照試劑、對照載體、對照RNA多核苷酸、用於自DNA於試管內生產多肽之試劑、用於測序之轉接子及類似者。緩衝劑可為穩定緩衝劑、重構緩衝劑、稀釋緩衝劑或類似者。在一些實施態樣中，組成物亦可包括一或多種可用於促成或增強以核酸內切酶的DNA中靶結合或切割，或改進靶向特異性之組分。

在一些實施態樣中，組成物之任何組分係取決於特定的投予模式及劑型而與醫藥上可接受的賦形劑一起調配，諸如載劑、溶劑、穩定劑、佐劑、稀釋劑等。在實施態樣中，引導RNA組成物通常係取決於調配物及投予途徑來調配以達成生理上可相容的pH，且其範圍為約3之pH至約11之pH、約pH 3至約pH 7。在一些實施態樣中，將pH調整至約pH 5.0至約pH 8之範圍。

適合的賦形劑可包括例如載劑分子，其包括緩慢代謝之大型巨分子，諸如蛋白質、多醣、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物和無活性病毒粒子。其他的例示性賦形劑包括抗氧化劑(例如及不限於抗壞血酸)、鉗合劑(例如及不限於EDTA)、碳水化合物(例如及不限於糊精、羥烷基纖維素和羥烷基甲基纖維素)、硬脂酸、液體(例如及不限於油、水、鹽水、甘油和乙醇)、潤濕劑或乳化劑、pH緩衝物質及類似者。

生理上可耐受的載劑為本技術中所熟知。例示性液體載劑為無菌水溶液，其不含有除了活性成分和水以外的物質或含有緩衝液，諸如在生理pH值之磷酸鈉、生理鹽水或兩者，諸如經磷酸鹽緩衝之鹽水。水性載劑可含有一種以上的緩衝鹽，以及鹽(諸如氯化鈉和氯化鉀)、右旋糖、聚乙二醇和其他溶質。液體組成物亦可含有除了及排除水以外的液相。此等額外的例示性液相為甘油、植物油(諸如棉籽油)和水油乳液。在用於細胞組成物中有效治療特定疾患或病症之活性化合物的量係取決於疾患或病症的本質而定，且可以標準的臨床技術來確定。

在一些實施態樣中，組成物的本文所述之化合物(例如經RNA引導之核酸內切酶或編碼經RNA引導之核酸內切酶的核酸及/或gRNA)可經由轉染遞送，諸如磷酸鈣轉染、經DEAE-聚葡萄糖調介之轉染、經陽離子脂質調介之轉染、電穿孔、電核運輸、化學轉導、電轉導、經脂染胺(Lipofectamine)調介之轉染、經Effectene調介之轉染、經脂質奈米粒子(LNP)調介之轉染或其任何組合。在一些實施態樣中，組成物係經由使用脂質奈米粒子的經脂質調介之轉染引入細胞中。

本文所述之組成物可投予有其需要的個體以治療心血管疾病或降低發展出心血管疾病的風險。因此，本揭示亦提供用於治療患者的心血管疾病或降低個體發展出心血管疾病的風險之基因療法，其係藉由編輯個體的 LPA基因。在一些實施態樣中，基因療法在功能上敲除患者的相關細胞類型之基因組中的 LPA基因。在個體的相關細胞(例如肝細胞)之 LPA基因係使用本文所述之材料及方法編輯，其使用經RNA引導之核酸內切酶(諸如Cas9)以永久地刪除、插入、編輯、校正或置換來自基因組之靶序列或插入外源性序列，由此在功能上敲除 LPA基因。這可藉由永久地降低血液中的Lp(a)水平而提供永久的心血管疾病痊癒。

在一些實施態樣中，揭示用於治療有其需要的個體(例如靈長類動物個體)的心血管疾病或疾患之方法。該方法可包含對靈長類動物個體投予與下列複合之複數種奈米粒子：(a)靶向 LPA基因之引導RNA(gRNA)或編碼gRNA之核酸，及(b)編碼經RNA引導之核酸內切酶的核酸，由此緩解靈長類動物個體的心血管疾病或疾患。個體可被投予二或更多次，例如兩次用於治療的複數種奈米粒子。對個體的兩次奈米粒子投予可以適合的時間段隔開。在一些實施態樣中，適合的時間段為或為約一週、兩週、三週、四週、五週、六週、七週、八週、三個月、四個月、五個月、六個月、一年、兩年、三年或更久。在一些實施態樣中，二或更多次投予中的兩次係相隔約兩週至約兩個月，例如約三週。在一些實施態樣中，二或更多次投予的每兩次係相隔約兩週至約兩個月，例如約三週。在一些實施態樣中，二或更多次投予中的兩次係相隔約一個月至約四個月，例如約兩個月或三個月或更久。在一些實施態樣中，二或更多次投予的每兩次係相隔約一個月至約四個月，例如約兩個月或三個月。在一些實施態樣中，二或更多次投予中的兩次係相隔至少兩個月或三個月。在一些實施態樣中，二或更多次投予的每兩次係相隔至少兩個月或三個月。在一些實施態樣中，在接受單次投予的本文所述之組成物的個體中之Lp(a)水平在投予之後可實質地降低(例如至少20%、30%、40%、50%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更高)，且在降低的水平下維持至少兩個月、三個月、四個月、六個月、十個月、一年、十八個月、兩年、三年、四年、五年、十年、十五年、二十年或更久。在兩次投予之間適合的時間段可與另兩次投予之間適合的時間段相同或不同。在一些實施態樣中，複數種奈米粒子係以每次投予約0.1至5 mg/kg之總RNA(例如 LPAgRNA及Cas9 mRNA)，例如0.5至3 mg/kg之總RNA的劑量投予個體。在一些實施態樣中， LPAgRNA或編碼 LPAgRNA之核酸係以每次投予0.1至5 mg/kg，例如0.1 mg/kg至5 mg/kg之gRNA的劑量或約該劑量投予個體。在一些實施態樣中，編碼經RNA引導之核酸內切酶的核酸係以每次投予0.1至5 mg/kg之gRNA，例如0.5至3 mg/kg之gRNA的劑量或約該劑量投予個體。每次投予個體的劑量可相同或不同。在一些實施態樣中，複數種奈米粒子係以每次投予約0.02至約1 mg/mL之總RNA(例如LPA gRNA及Cas9 mRNA的總量)，例如約0.1至0.6 mg/mL之總RNA的劑量投予個體。在一些實施態樣中，本文所揭示之方法包含對個體單次投予複數種奈米粒子。例如，複數種奈米粒子可以單次投予約0.5 mg/kg、0.6 mg/kg、1 mg/kg、1.5 mg/kg、2.0 mg/kg、2.5 mg/kg、或3.0 mg/kg之下列的RNA含量的劑量投予個體：(a) LPAgRNA或編碼 LPAgRNA之核酸，及(b)編碼經RNA引導之核酸內切酶的核酸。如本文所述，單次投予治療可對個體有效，且因此個體不需要任何附加的後續治療。例如，在一些實施態樣中，個體係以下列的時間段接受一次複數種奈米粒子的單次投予：三個月、四個月、五個月、六個月、一年、兩年、三年、四年、五年、六年、七年、八年、九年、十年、十五年、二十年、二十五年、三十年、三十五年、四十年、五十年、六十年或更久、或在該等值中任兩者之間的數值或範圍。

在一些實施態樣中，用於本文所述之組成物及方法的靶組織為肝組織。在一些實施態樣中，用於本文所述之組成物及方法的靶細胞為肝細胞。

在一些實施態樣中，其醫藥組成物可藉由氣霧劑遞送、經鼻遞送、陰道遞送、直腸遞送、頰內遞送、經眼遞送、局部(local)遞送、局部(topical)遞送、腦池內遞送、腹膜內遞送、經口遞送、肌內注射、靜脈內注射、皮下注射、結節內注射、瘤內注射、腹膜內注射及/或皮內注射或其任何組合來投予。投予可為局部性或全身性。全身性投予包括經腸和非經腸投予。在一些實施態樣中，可在各種間隔時段(例如每天、每週、每月或每年)使用一種以上的投予以達成所欲基因表現水平。

其醫藥組成物可以醫藥有效量投予有其需要的個體。如本文所使用之術語「醫藥有效量」意指引起組織、系統、動物或人類的所欲治療效果及/或生物學或醫學反應之醫藥組成物的量。投予可導致所欲降低的 LPA基因表現，諸如所欲降低的Lp(a)之血漿水平。

如本文所使用之術語「心血管疾病」係指心臟及血管的疾患，且包括動脈、靜脈、小動脈、小靜脈和毛細血管的疾患。在一些實施態樣中，心血管疾病為中風、心肌梗塞、動脈粥樣硬化、家族性高膽固醇血症、動脈粥樣硬化、血栓形成、鈣化性主動脈瓣疾病、冠狀動脈疾病、周邊動脈疾病、腦血管疾病、腎動脈狹窄、主動脈瘤、心肌病、高血壓性心臟病、心衰竭、肺心病、先天性心臟病或風濕性心臟病。在一些實施態樣中，本文所述之方法及組成物可用於治療鈣化性主動脈瓣疾病、心肌梗塞、冠狀動脈心臟病、動脈粥樣硬化、血栓形成、中風或其組合。

在一些實施態樣中，個體患有影響心臟、腦、單腿或雙腿、骨盆、單臂或雙臂及/或肩膀的心血管疾患症狀中之一或多者。影響心臟的心血管疾患症狀包括但不限於胸痛、胸部不適及單臂或雙臂、單肩或雙肩、頸部、下巴或背部的疼痛、呼吸短促、暈眩、心跳加快、噁心、心跳異常、疲勞及/或心肌梗塞。影響腦的心血管疾病症狀包括但不限於面部、單臂或雙臂或單腿或雙腿突然麻木或無力；突然意識混亂或說話或理解言語困難；單眼或雙眼突然視覺困難；突然暈眩；行走困難或失去平衡或協調；及/或不明原因的突然劇烈頭痛。影響單腿或雙腿、骨盆、單臂或雙臂及/或肩膀的心血管疾病症狀包括但不限於肌肉疼痛、肌肉痙攣；單腳或雙腳及/或腳趾、單手或雙手及/或手指的冷感；及/或單腳或雙腳及/或腳趾、單手或雙手及/或手指麻木或無力。

在一些實施態樣中，需要治療的個體可具有下列異常的水平(比健康個體的水平高或低)：總膽固醇、三酸甘油酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、全血細胞計數分級(complete blood count with differential)、Lp(a)、脂蛋白元B、同半胱胺酸、血紅素A1c、空腹血糖、胰島素、肌酸激酶、丙胺酸轉胺酶、天冬胺酸轉胺酶、纖維生成、甲狀腺促素、超敏性C反應蛋白質、尿液白蛋白/肌酸酐比值、MPO、維生素D、三甲胺N氧化物、N端前腦利鈉尿肽(aminoterminal, pro-brain natriuretic peptide)、血清肌酸酐、心血管疾病風險表(global risk score)或其組合之水平。

在一些實施態樣中，個體可能已經類固醇及/或抗組織胺藥物預治療。例如，個體可能已經地塞米松(dexamethasone)、啡莫替定、苯海拉明或其組合預治療。預治療可在投予之前約、至少、至少約、至多或至多約30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、16小時、1天、2天、5天、10天執行。

在一些實施態樣中，該方法進一步包含鑑定需要治療的個體。在一些實施態樣中，該方法進一步包含在投予之前、期間及/或之後測量在靈長類動物個體中的Lp(a)之血液水平。

在一些實施態樣中，個體在投予之前具有高水平的Lp(a)(例如血漿Lp(a))。具有高水平的Lp(a)的個體可包括例如具有比90%之人類族群更高的Lp(a)水平的個體。在一些實施態樣中，個體具有心血管疾病的症狀。在一些實施態樣中，個體不具有心血管疾病的症狀。在一些實施態樣中，個體處於發展出心血管疾病的風險。在一些實施態樣中，個體被懷疑患有或正發展出心血管疾病。

在一些實施態樣中，個體在投予之前具有超過約30 mg/dL之血漿Lp(a)水平(諸如超過約下列中任一者：40 mg/dL、50 mg/dL、60 mg/dL、70 mg/dL、80 mg/dL、100 mg/dL、125 mg/dL、150 mg/dL、175 mg/dL、200 mg/dL、225 mg/dL、250 mg/dL、275 mg/dL、300 mg/dL、或更高)。在一些實施態樣中，需要治療的個體具有高於50 mg/dL之血漿Lp(a)水平。在一些實施態樣中，個體在投予之前具有超過約30 mg/dL之血漿Lp(a)水平(諸如超過約下列中任一者：100 nmol/L、125 nmol/L、150 nmol/L、175 nmol/L、200 nmol/L、225 nmol/L、250 nmol/L、275 nmol/L、300 nmol/L、350 nmol/L、400 nmol/L、或更高)。在一些實施態樣中，個體具有一或多個在內源性LPA基因或其調控序列中的基因標誌物(例如刪除、插入及/或突變)，使得apo(a)蛋白質的活性(包括表現水平或功能性)與正常的健康個體相比而實質地增加。

在一些實施態樣中，需要治療的個體為具有經定義為比90%之人類族群更高的Lp(a)水平之高水平的Lp(a)(例如高於60 mg/dL)及具有脂蛋白相關的疾病(例如心血管疾病)之症狀的患者。在一些實施態樣中，個體可為被懷疑患有脂蛋白相關的疾病的人類。另一選擇地，個體可為經診斷具有脂蛋白相關的疾病風險的人類，由於超過60 mg/dL或70 mg/dL或80 mg/dL或100 mg/dL或200 mg/dL或300 mg/dL之Lp(a)水平的存在。在一些實施態樣中，需要治療的個體可具有與增加之脂蛋白相關的疾病風險及/或增加之Lp(a)表現相關聯的 LPA基因變異體。在一些實施態樣中，個體為哺乳動物。在一些實施態樣中，個體為靈長類動物。在一些實施態樣中，個體為人類。

本文所述之方法及組成物可降低血漿低密度脂蛋白(LDL)水平，諸如血漿Lp(a)水平，因此降低心血管疾病的風險，諸如心臟病發作、中風、血凝塊、在靜脈和其他冠狀動脈疾病中的脂肪堆積、與心血管事件相關的死亡可能性或其組合的風險。在一些實施態樣中，本文所述之方法及組成物可降低或緩解心血管疾病之一或多種症狀。

在一些實施態樣中，在個體中的血漿Lp(a)水平在進行該方法之後降低至約50 mg/dL或更低(例如約、至多或至多約40 mg/dL、30 mg/dL、20 mg/dL、或更低)。在一些實施態樣中，在個體中的血漿Lp(a)水平在進行該方法之後降低至約40 mg/dL或更低。在一些實施態樣中，在個體中的血漿Lp(a)水平在進行該方法之後降低至約30 mg/dL或更低。在一些實施態樣中，在個體中的血漿Lp(a)水平在進行該方法之後降低至約20 mg/dL或更低。

在一些實施態樣中，在個體中的血漿Lp(a)水平在進行該方法之後降低約、至少或至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或該等值中任一者之間的數值或範圍。

在一些實施態樣中，在個體中的血漿LDL水平在進行該方法之後降低約、至少或至少約25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或該等值中任一者之間的數值或範圍。

本文之提供亦包括用於進行本文所述之方法的套組。套組可包括基因組靶向核酸(例如靶向 LPA基因之gRNA)及經RNA引導之核酸內切酶(例如Cas9)或編碼經RNA引導之核酸內切酶的核酸。在上述套組之任一者中，套組可另外包含欲插入之多核苷酸以實現所欲基因修飾(例如供體模板)。套組之組分可於單獨的容器中或組合在單一容器中。

上述之任何套組可另外包含一或多種額外的試劑，其係選自緩衝劑、用於引入多肽或多核苷酸至細胞中的緩衝劑、清洗緩衝劑、對照試劑、對照載體、對照RNA多核苷酸、用於自DNA於試管內生產多肽之試劑、用於測序之轉接子及類似者。緩衝劑可為穩定緩衝劑、重構緩衝劑、稀釋緩衝劑或類似者。套組亦可包含一或多種可用於促成或增強以核酸內切酶的DNA中靶結合或切割，或改進靶向特異性之組分。

在一些實施態樣中，套組可另外包括使用套組之組分以實施本文所述之方法的用法說明。用於實施該方法的用法說明通常記錄在適合的記錄媒體上。例如，用法說明可印刷在基材上，諸如紙張或塑膠等。用法說明可作為藥品仿單存在於套組中，存在於套組或其組分(亦即與包裝或分包裝相關聯)之容器的標籤中等。用法說明可作為電子儲存數據檔案存在於適合的電腦可讀取的儲存媒體上，例如CD-ROM、磁碟、快閃驅動器等。在一些事例中，實際的用法說明不存在於套組中，但是可提供自遠端資源(例如經由網際網路)獲得用法說明的方式。此實施態樣的實例為包括可查看及/或可下載用法說明的網址之套組。用於獲得用法說明的此方式與用法說明一樣可記錄在適合的基材上。

上文所討論的實施態樣之一些觀點更詳細地揭示於下列的實施例中，其不意欲以任何方式限制本揭示之範圍。實施例1 經LPA靶向之gRNA間隔子的試管內驗證

評估gRNA影響靶向切割的能力。本文表1中所述之空間序列係藉由試管內轉錄(IVT gRNA)來合成，且在使用轉染至經工程化以組成型表現SpCas9核酸酶之人類胎腎(HEK)細胞系中的系統中評估。在中靶位點上對各gRNA之切割效率係使用TIDES方案測量(Brinkman, E. K.等人之(2014). Nucleic Acids Research, 42(22):e168)，其中使用側接預測之切割位點的PCR引子以擴增來自經處理之細胞的基因組DNA，隨後進行PCR產物之Sanger測序。當在細胞的基因組中引起雙鏈斷裂時，細胞嘗試修復雙股斷裂。此修復過程容易出錯，其可導致雙股斷裂位點的核苷酸刪除或插入。因為完美修復之斷裂被Cas9核酸酶重新切割，而核苷酸之插入或刪除防止Cas9切割，所以有代表切割效率之插入及刪除的累積。接著使用電腦演算法分析測序層析圖數據，該演算法計算在預測之切割位點插入或刪除鹼基的頻率。使用插入或刪除之鹼基的頻率(INDEL)計算整體切割頻率。然而，由於一些kringle IV區域的重複本質，使PCR擴增是不可能的。關於該等引導RNA標靶，使INDEL無法使用此方法檢定。來自HEK細胞中的IVT gRNA實驗結果顯示於表3中，其中gRNA係根據其觀察到的切割效率排名。在表3中，Y=與食蟹獼猴100%之匹配。實施例2 在非人類靈長類動物(NHP)中的 LPA基因編輯效率之評估

此實施例係藉由測量在治療之前及之後的血漿Lp(a)水平來評估在NHP中的 LPA基因編輯效率。

以 LPA基因中的SNP進行NHP預篩選且測量Lp(a)血漿基線水平。選擇T4 gRNA(SEQ ID NO：3)以匹配NHP之 LPA基因。使用脂質奈米粒子(LNP)遞送媒劑遞送Cas9 mRNA及T4 gRNA分子至NHP。將LNP囊封之gRNA分子及Cas9 mRNA根據圖2中所示之研究設計注射至NHP中。各NHP特別以2次劑量之囊封在Gen3 LNP中之RNA097 Cas9 mRNA(經修飾之假尿苷)及T4 gRNA(第4組)或一次劑量之囊封在Gen3 LNP中之RNA010 Cas9 mRNA(經修飾之N-甲基假尿苷)及T4 gRNA(第5組)注射。在治療之前及之後收集血漿樣品且監測血漿Lp(a)水平。使用三明治式酶聯免疫吸附檢定法(Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)(ELISA)以檢測所收集之血漿中的Lp(a)蛋白質濃度。觀察到有效的編輯，包括在2 mg/kg之劑量下約50%之肝臟編輯。

圖3A至B為兩個顯示第4組NHP(圖3A)和第5組NHP(圖3B)之血漿Lp(a)水平的圖。圖4A至B為兩個顯示第4組NHP(圖4A)和第5組NHP(圖4B)之血漿Lp(a)自基線的變化百分比的圖。

結果證明使用T4 gRNA及Cas9 mRNA顯著地降低NHP血漿Lp(a)水平。在第4組中觀察到自基線降低66%和87%及在第5組中觀察到自基線降低75%和86%。實施例3 LPA gRNA調配物之毒性研究

在此實施例中，在NHP中進行毒性研究。將脂質奈米粒子囊封之SEQ ID NO：3之gRNA分子(T4 gRNA)及Cas9 mRNA調配成LPA gRNA調配物，稱為「CTX320」。將CTX320調配物分別以0.5 mg/kg、1.5 mg/kg和3.0 mg/kg之劑量水平的單次劑量投予三組NHP(例如食蟹獼猴)。血漿Lp(a)蛋白質水平係使用Mercodia ELISA檢定法測量。圖5描述非限制的例示性實驗設計。

圖6為顯示在治療之前十四天(第-14天)在NHP血漿中的基線Lp(a)水平的圖。基線值係由於Kringle IV-2重複的數量而在個別的NHP之間有差異。

圖7描述非限制的例示性NHP研究設計。血漿Lp(a)蛋白質水平係在治療之前7天及在治療之後8天、15天和29天測量。

圖8A為顯示在以三種不同劑量：0.5 mg/kg、1.5 mg/kg和3 mg/kg之CTX320治療之後，與對照組相比的NHP之血漿Lp(a)蛋白質水平自基線的變化百分比的圖。圖8B為顯示在以三種不同劑量：0.5 mg/kg、1.5 mg/kg和3 mg/kg之CTX320治療之後，與對照組相比的NHP之血清Lp(a)蛋白質水平自基線的變化百分比的圖。數據證明在CTX320給藥之後以劑量依賴性降低血漿及血清Lp(a)蛋白質。在以1.5 mg/kg之CTX320治療之NHP中觀察到Lp(a)蛋白質自基線降低約66%及以3.0 mg/kg之CTX320治療之NHP中觀察到Lp(a)蛋白質自基線降低約92%。以0.5 mg/kg之CTX320給藥沒有觀察到顯著降低的血漿Lp(a)蛋白質。

圖9A至C為顯示在以三種不同劑量：0.5 mg/kg(圖9A)、1.5 mg/kg(圖9B)和3.0 mg/kg(圖9C)之CTX320治療之前及之後，NHP之血漿Lp(a)蛋白質水平的圖。圖9D為顯示在CTX320治療之後第29天，NHP之血漿Lp(a)水平自基線的變化百分比的圖。在以1.5 mg/kg和3 mg/kg之CTX320調配物治療之NHP中觀察到血漿Lp(a)水平自基線平均降低50%或更多。

在CTX320治療之後，亦對NHP進行血清試驗，包括肝功能試驗、血漿脂質水平(例如三酸甘油酯、HDL、LDL和總膽固醇)、腎功能試驗(例如血尿素氮、肌酸酐、葡萄糖和鈣)、損傷標誌物(例如乳酸脫氫酶(LDH)、γ麩胺醯轉移酶和c反應性蛋白質(CRP))、白細胞、電解質組、紅細胞指數、凝血曲線及尿液試驗。數據(未顯示)證明肝酶及總膽紅素的瞬時劑量依賴性增加在治療之後約2至4天達到高峰且在第15天恢復至基線。瞬時增加的LDH及CRP在第2天達到高峰且在第7天恢復至基線。NHP的體重在CTX320治療之後亦維持穩定。數據亦示意3 mg/kg之CTX320調配物不改變膽固醇水平且誘導瞬時增加的三酸甘油及LDL水平，其在治療之後第2至4天達到高峰，以及在治療之後第4天急劇下降的HDL水平。此外，發現以CTX320治療不改變腎臟標誌物(包括血尿素氮和肌酸酐)的功能。實施例4 LPA gRNA調配物之功效評鑑及毒性研究

此實施例報告實施例3之CTX320調配物的另一非限制的例示性功效和毒性評鑑。

根據圖5的實驗設計，將CTX320調配物分別以0.5 mg/kg、1.5 mg/kg和3.0 mg/kg之劑量水平的單次劑量投予三組NHP(例如食蟹獼猴)。血漿Lp(a)蛋白質水平在整個研究期間使用Mercodia ELISA檢定法測量。使動物在治療之後第85天安樂死。

圖10A為顯示在以三種不同劑量：0.5 mg/kg、1.5 mg/kg和3 mg/kg之CTX320治療之後，與對照組相比的NHP之血清Lp(a)蛋白質水平自基線的變化百分比的圖。數據證明在CTX320給藥之後以劑量依賴性降低血漿及血清Lp(a)蛋白質。在以1.5 mg/kg之CTX320治療之NHP中觀察到Lp(a)蛋白質自基線降低約78%及在以3.0 mg/kg之CTX320治療之NHP中觀察到Lp(a)蛋白質自基線降低約90%。以0.5 mg/kg之CTX320給藥觀察到血漿Lp(a)蛋白質降低約19%。如圖10A中所示，單次劑量之CTX320導致持續降低的Lp(a)，且在以中及高劑量的研究持續期間持續顯著降低的Lp(a)水平。

圖10B顯示在約3個月的CTX320治療之後，NHP之血漿Lp(a)水平自基線的變化百分比。在以1.5 mg/kg和3 mg/kg之CTX320調配物治療之NHP中觀察到Lp(a)水平自基線顯著的降低。結果證明在以中及高劑量治療之後，單次劑量之CTX320可導致Lp(a)自基線持續降低，甚至在3個月之後。

圖11為顯示在肝臟及其他器官組織(包括脾臟、腎上腺、腦、腎臟、肺臟、附睪、睪丸和卵巢)中的 LPA基因編輯百分比的標繪圖。結果證明肝臟為 LPA基因編輯的主要器官，而在約3個月的CTX320治療之後，在脾臟中僅觀察到約0.1至5%之 LPA基因編輯。另外，在治療之後85天亦在肝臟中觀察到劑量依賴性編輯。在以1.5 mg/kg之CTX320和3 mg/kg之CTX320治療之後分別觀察到約40%之 LPA及65%之基因編輯。在組織中之LPA中靶編輯的一些結果顯示於表4中。

額外的數據(圖12A至12C)亦證明在睪丸、附睪和卵巢之生殖組織中的劑量依賴性編輯，在以3 mg/kg之CTX320治療之後85天少於0.5%之編輯，且以0.5 mg/kg和1.5 mg/kg之CTX320甚至更低。

圖13A至B為顯示在治療之後的LNP組分A之血漿水平的標繪圖。圖14A至B為顯示在治療之後的LNP組分B之血漿水平的標繪圖。毒物動力學分析示意大部分的LNP組分A和B在以CTX320治療之後一週自血漿清除。LNP組分A和B兩者皆在注射之後168小時內排出。

數據(未顯示)表明CTX320在肝功能試驗中引起瞬時劑量依賴性升高(例如丙胺酸轉胺酶、天冬胺酸轉胺酶、鹼性磷酸酶和膽紅素)。在治療之後(例如在投予之後85天)，未檢測到肝功能損傷或損壞。

包括體重、臨床體徵(例如天冬胺酸轉胺酶(AST)、丙胺酸轉胺酶(ALT)、鹼性磷酸酶(ALP)、總膽紅素)、尿分析法、血液學和凝血、心電圖及組織病理學之附加的終點分析(兼具整體及微觀評估)揭露在整個研究持續期間沒有CTX320相關變化。實施例5 第1期研究設計

用於本文所述之 LPA基因編輯奈米粒子(例如CTX320)中之一或多者的第1期安全性及耐受性臨床研究之非限制的例示性設計顯示於圖15中。

在一些例子中，CTX320之第1期臨床研究係在具有升高的Lp(a)水平的患者中進行。例如，患者可具有Lp(a)≥50 mg/dL或≥100 nmol/L，伴隨與經確立之CVD風險因子無關的增加之心肌梗塞(MI)風險。在一些例子中，患者可具有Lp(a)≥50 mg/dL或≥125 nmol/L。在一些例子中，患者可具有Lp(a)水平＞180 mg/dL(＞430 nmol/L)，伴隨動脈粥樣硬化的心血管疾病(ASCVD)之增加終生風險。患者的年齡可介於18與75歲之間。在一些例子中，約每3個月對患者執行HBA1C試驗。

在一些例子中，將患有晚期肝病的個體排除在研究之外。晚期肝病可包括：(a)天冬胺酸轉胺酶(AST)、丙胺酸轉胺酶(ALT)＞3 x正常值上限(ULN)，或直接膽紅素值＞2 x ULN，及/或(b)基線凝血酶原時間(國際標準化比值[INR])＞1.5 x ULN，及/或(c)肝纖維化掃描(Fibroscan)或MRE讀值≥7.5kpa，及/或(d)肝硬化病史，及/或(e)酒精或藥物濫用史，及/或(f)通過D30的緊急監測之ALT、AST、GGT、Bili.、Alk. Phos.、白蛋白、INR、PT和PTT。持續監測至研究結束(12個月)。實施例6 LPA gRNA調配物之耐久性研究

此實施例報告實施例3的CTX320調配物之非限制的例示性耐久性試驗研究。此實施例特別地使用ELISA來評估血漿中的LPA蛋白質減弱之耐久性且評鑑在肝組織中的 LPA破壞。耐久性研究亦評鑑以類固醇及/或抗組織胺劑之預處理是否降低肝功能試驗升高。表5顯示此實施例中所使用之耐久性研究設計。

所選擇的患者具有超過100 mg/dL的升高之LP(a)水平。患者可以類固醇及/或抗組織胺藥物預治療。例如，患者可在LNP投予之前一天及接著再在LNP投予之前30至60分鐘以1 mg/kg之地塞米松、0.5 mg/kg之啡莫替定和5 mg/kg之苯海拉明預治療。

圖16為顯示在CTX320治療之後的患者之血清Lp(a)蛋白質水平自基線的變化百分比的圖。在投予之後56天，在以CTX320治療的患者中仍觀察Lp(a)蛋白質自基線降低至少90%。

在CTX320治療之後亦對患者進行血清試驗，包括肝功能試驗(LFT)及血漿脂質水平(例如三酸甘油酯、HDL、LDL和總膽固醇)。

圖17比較在經預治療及經2.0 mg/kg之CTX320調配物的患者中與在未經預治療及經1.5 mg/kg和3 mg/kg之CTX320調配物的患者中之天冬胺酸轉胺酶(AST)、丙胺酸轉胺酶(ALT)、鹼性磷酸酶(ALP)和總膽紅素水平。數據示意伴隨預治療之CTX320調配物誘導LFT升高，與那些未經預治療的先前研究之觀察類似，且以抗組織胺劑的預治療不抑制患者的LFT反應。

亦觀察到CTX320亦誘導總膽固醇和LDL降低。未發現以CTX320調配物誘導之其他血清化學標誌物有明顯差異。術語

在至少一些先前所述之實施態樣中，在實施態樣中所使用之一或多個元件可在另一實施態樣中互換使用，除非此置換在技術上不可行。那些熟習本技術領域者應理解可對上述方法及結構進行各種其他省略、添加及修飾而不脫離所主張之主題的範圍。意欲使所有此等修飾及改變落在如所附申請專利範圍所定義之主題的範圍內。

關於本文實質上任何複數及/或單數術語的使用，那些具有本技術之技能者可在適合於上下文及/或應用時自複數轉變成單數及/或自單數轉變成複數。為了清楚起見，可在本文明確地提出各種單數/複數排列。如本說明書及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包括複數指示物，除非上下文另有明確的規定。意欲使本文任何提及之「或」涵蓋「及/或」，除非另有其他陳述。

那些熟習本技術領域者應理解通常本文及尤其在所附申請專利範圍(例如所附申請專利範圍的主體)中所使用之術語通常意欲為「開放(open)」術語(例如術語「包括(including)」應被解釋為「包括但不限於」，術語「具有」應被解釋為「具有至少」，術語「包括(include)」應被解釋為「包括但不限於」等)。那些熟習本技術領域者應進一步理解若意欲使所引介之請求項敘述具有特定的數量，則此意願應在請求項中明確地敘述，且此意願在沒有此敘述下不存在。例如，為了有助於理解，下列所附申請專利範圍可能含有引介性短語「至少一」及「一或多」的用法以引介請求項敘述。然而，此等短語的使用不應被解釋為暗示以不定冠詞「一(a或an)」引介之請求項敘述將含有此等引介之請求項敘述之任何特定的請求項限制成僅含有一種此敘述的實施態樣，甚至當相同的請求項包括引介性短語「一或多」或「至少一」和不定冠詞時，諸如「一(a或an)」（例如「一(a及/或an)」應被解釋為意指「至少一」及「一或多」）；這同樣適用於引介請求項敘述所使用之定冠詞。另外，即使明確地敘述引介之請求項敘述的特定數量，熟習本技術領域者亦應識別出此敘述應被解釋為意指至少所敘述之數量(例如沒有其他修飾語意的「兩個敘述」之直白敘述意指至少兩個敘述，或二或更多個敘述)。此外，在那些其中使用類似於「A、B和C等中之至少一者」的常規之情況下，通常意欲以此構型使熟習本技術領域者能理解此常規的意義(例如「具有A、B和C中之至少一者的系統」可包括但不限於具有單獨的A、單獨的B、單獨的C、A與B一起、A與C一起、B與C一起及/或A、B與C一起等的系統」)。在那些其中使用類似於「A、B或C等中之至少一者」的常規之情況下，通常意欲以此構型使熟習本技術領域者能理解此常規的意義(例如「具有A、B或C中之至少一者的系統」可包括但不限於具有單獨的A、單獨的B、單獨的C、A與B一起、A與C一起、B與C一起及/或A、B與C一起等的系統」)。那些熟習本技術領域者應進一步理解實際上表示二或更多個替代術語的任何轉折字及/或短語(無論在說明書、申請專利範圍或圖式中)應理解為涵蓋包括該等術語中之一者、該等術語中任一者或所有術語的可能性。例如，短語「A或B」應理解為包括「A」或「B」或「A和B」的可能性。

另外，在本揭示之特性或觀點係根據馬庫西群組(Markush group)說明的情況下，那些熟習本技術領域者應識別出本揭示亦由此根據馬庫西群組的任何個別元件或元件的子群組來說明。

如熟習本技術領域者所理解，出於任何及所有目的，諸如在提供書面說明方面，本文所揭示之所有範圍亦涵蓋任何和所有可能的子範圍及其子範圍的組合。任何列出的範圍可容易地被認為經充分說明，且能使相同的範圍分解成至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作為非限制性實例，本文所討論的各範圍可輕易地分解成下三分之一、中三分之一及上三分之一等。亦如熟習本技術領域者所理解，諸如「至多」、「至少」、「大於」、「少於」及類似者的所有語言包括所敘述的數字，且係指可隨後分解成如上文所討論的子範圍之範圍。最後，如熟習本技術領域者所理解，範圍包括各單獨的元件。因此，例如具有1至3個項目的群組係指具有1、2或3個項目的群組。同樣地，具有1至5個項目的群組係指具有1、2、3、4或5個項目的群組，諸如此類。

儘管各種觀點及實施態樣已於本文揭示，但是其他觀點及實施態樣亦為那些熟習本技術領域者顯而易知的。本文所揭示之各種觀點及實施態樣係以例證為目的且不意欲為限制，真正的範圍及精神係由隨後的申請專利範圍表明。

[圖1]描述例示性脂蛋白(a)(Lp(a))結構。

[圖2]描述非限制的例示性非人類靈長類動物(NHP)研究設計。

[圖3A至B]描述顯示第4組NHP(圖3A)和第5組NHP(圖3B)之血漿Lp(a)水平的標繪圖。

[圖4A至B]描述顯示第4組NHP(圖4A)和第5組NHP(圖4B)之血漿Lp(a)水平自基線的變化百分比的標繪圖。

[圖5]描述非限制的例示性實驗設計。終點包括且不受限於：血液學：d-14(亦即第-14天)、d-7(亦即第-7天)、d7(亦即第7天)、d15、d29、d43、d57、d71及/或d84；血清化學：d-14、d-7、d2、d4、d7、d10、d15、d29、d43、d57、d71及/或d84；凝血：d-14、d-7、d15、d29、d43、d57、d71及/或d84；ECG：d-12、d2、d22及/或d84；生物分析：d-7、d1、d2、d4、d8、d15、d29、d43、d57、d71及/或d84；生物標誌物：d-14、d-7、d8、d15、d29、d43、d57、d71及/或d84；及在組織中編輯：組織列表包括生殖組織。

[圖6]為顯示在治療之前十四天(第-14天)在NHP血漿中的基線Lp(a)水平的圖。

[圖7]描述非限制的例示性NHP研究設計。

[圖8A]為顯示在以三種不同劑量：0.5 mg/kg、1.5 mg/kg和3 mg/kg之CTX320治療之後，與對照組相比的NHP之血漿Lp(a)蛋白質水平自基線的變化百分比的圖。[圖8B]為顯示在以三種不同劑量：0.5 mg/kg、1.5 mg/kg和3 mg/kg之CTX320治療之後，與對照組相比的NHP之血清Lp(a)蛋白質水平自基線的變化百分比的圖。

[圖9A至C]為顯示在以三種不同劑量之CTX320：0.5 mg/kg(圖9A)、1.5 mg/kg(圖9B)和3.0 mg/kg(圖9C)治療之前及之後，NHP之血漿Lp(a)蛋白質水平的圖。[圖9D]為顯示在CTX320治療之後第29天，NHP之血漿Lp(a)水平自基線的變化百分比的圖。

[圖10A]為顯示在以三種不同劑量：0.5 mg/kg、1.5 mg/kg和3 mg/kg之CTX320治療之後，與對照組相比的NHP之血清Lp(a)蛋白質水平自基線的變化百分比的圖。[圖10B]顯示在約3個月的CTX320治療之後，NHP之血漿Lp(a)水平自基線的變化百分比。

[圖11]為顯示在肝臟及其他器官組織(包括脾臟、腎上腺、腦、腎臟、肺臟、附睪、睪丸和卵巢)中的 LPA基因編輯百分比的標繪圖。

[圖12A至12C]為顯示在以CTX320給藥之後的生殖組織編輯的標繪圖。

[圖13A至13B]為顯示在治療之後的LNP組分A之血漿水平的標繪圖。

[圖14A至14B]為顯示在治療之後的LNP組分B之血漿水平的標繪圖。

[圖15]顯示用於本文所述之 LPA基因編輯奈米粒子(例如CTX320)中之一或多者的第1期安全性及耐受性臨床研究之非限制的例示性設計。

[圖16]為顯示在CTX320治療之後的患者之血清Lp(a)蛋白質水平自基線的變化百分比的圖。患者係以類固醇和抗組織胺藥物預治療。

[圖17]提供比較在CTX320(2.0 mg/kg)投予之前以類固醇和抗組織胺藥物預治療的患者中與在未經預治療及以1.5 mg/kg和3 mg/kg之CTX320投予的患者中之天冬胺酸轉胺酶(AST)、丙胺酸轉胺酶(ALT)、鹼性磷酸酶(ALP)和總膽紅素水平的標繪圖。

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Claims

一種用於治療有其需要的個體之脂蛋白相關的疾病之方法，其包含對該個體投予與下列複合之複數種奈米粒子： (a) 靶向 LPA基因之引導RNA(gRNA)( LPAgRNA)或編碼 LPAgRNA之核酸；及 (b) 編碼經RNA引導之核酸內切酶的核酸，由此治療該個體之脂蛋白相關的疾病。
如請求項1之方法，其中該個體被投予二或更多次該複數種奈米粒子。
如請求項1至2中任一項之方法，其中該二或更多次投予的每兩次係相隔約兩週至約四週。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該二或更多次投予的每兩次係相隔至少三個月。
如請求項1之方法，其中該方法包含對該個體單次投予該複數種奈米粒子。
如請求項1至5中任一項之方法，其中在該個體血漿中的該LPA表現在投予之後降低至少20%、至少40%、至少70%、或至少90%。
如請求項1至5中任一項之方法，其中在該個體血漿中的該LPA蛋白質濃度在投予之後降低至少20%、至少40%、至少70%、或至少90%。
如請求項5至7中任一項之方法，其中該降低係在投予之後歷經三週、四週、五週、兩個月、三個月或更久。
如請求項5至7中任一項之方法，其中該降低在投予之後一個月為65%。
如請求項5至9中任一項之方法，其中該降低係相對於：(a)在投予該複數種奈米粒子之前，在該個體血漿中的該LPA表現或該LPA蛋白質濃度；(b)在一或多個未治療之個體中的該LPA表現或該LPA蛋白質濃度；及/或(c)健康個體的LPA表現或該LPA蛋白質濃度之參考水平。
如請求項1至10中任一項之方法，其中該有需要的個體具有超過50 mg/dl之Lp(a)水平。
如請求項1至10中任一項之方法，其中該有需要的個體具有超過100 mg/dL之Lp(a)水平。
如請求項1至12中任一項之方法，其中該有需要的個體具有與經確立之心血管疾病(CVD)風險因子無關的增加之心肌梗塞(MI)風險或動脈粥樣硬化的心血管疾病(ASCVD)之增加終生風險。
如請求項1至13中任一項之方法，其包含在投予之前、期間及/或之後測量該個體之Lp(a)的血液或血漿水平。
如請求項1至13中任一項之方法，其包含鑑定有治療需要的個體。
如請求項1至15中任一項之方法，其中該脂蛋白相關的疾病為代謝疾病、心血管疾病、脂質代謝疾病或其組合。
如請求項1至15中任一項之方法，其中該脂蛋白相關的疾病為鈣化性主動脈瓣疾病、心肌梗塞、冠狀動脈心臟病、動脈粥樣硬化、血栓形成、中風、冠狀動脈疾病、家族性高脂血症、心肌梗塞、周邊動脈疾病、鈣化性主動脈瓣膜狹窄或其組合。
如請求項1至17中任一項之方法，其中使該個體之該脂蛋白相關的疾病中之一或多種症狀減輕或緩解。
如請求項1至18中任一項之方法，其中對該個體投予複合之複數種奈米粒子降低心血管風險、與心血管事件相關的死亡可能性或其組合。
如請求項1至19中任一項之方法，其中編碼經RNA引導之核酸內切酶之該核酸為該經RNA引導之核酸內切酶之mRNA。
如請求項1至20中任一項之方法，其中該經RNA引導之核酸內切酶為Cas9核酸內切酶。
如請求項21之方法，其中該Cas9核酸內切酶為化膿鏈球菌Cas9、金黃色葡萄球菌Cas9、腦膜炎雙球菌( N. meningitides) Cas9、嗜熱鏈球菌( S. thermophilus) Cas9、嗜熱鏈球菌3 Cas9、齒垢密螺旋體( T. denticola) Cas9或其變異體。
如請求項1至22中任一項之方法，其中該gRNA為單股引導RNA(sgRNA)。
如請求項1至23中任一項之方法，其中該gRNA靶向 LPA基因之外顯子3。
如請求項1至24中任一項之方法，其中該gRNA包含SEQ ID NO：18至25中任一者之間隔子序列(spacer sequence)。
如請求項1至24中任一項之方法，其中該 LPAgRNA包含SEQ ID NO：18之間隔子序列。
如請求項1至24中任一項之方法，其中該 LPAgRNA為包含SEQ ID NO：32之序列的單股引導RNA (sgRNA)。
如請求項1至24中任一項之方法，其中該 LPAgRNA為包含SEQ ID NO：11之序列的單股引導RNA (sgRNA)。
如請求項1至28中任一項之方法，其中將該 LPAgRNA或編碼該 LPAgRNA之該核酸及該經RNA引導之核酸酶囊封在複數種奈米粒子中。
如請求項29之方法，其中該奈米粒子為脂質奈米粒子。
如請求項1至30中任一項之方法，其中該個體為靈長類動物個體。
如請求項1至31中任一項之方法，其中該個體為人類。
如請求項1至32中任一項之方法，其中該方法包含對該個體單次投予該複數種奈米粒子。
如請求項33之方法，其中該複數種奈米粒子係以或以約0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、0.6 mg/kg或1 mg/kg之(a)與(b)之總核酸的單次投予劑量投予該個體。
如請求項1至34中任一項之方法，其中該複數種奈米粒子為脂質奈米粒子。
如請求項35之方法，其中該脂質奈米粒子包含一或多種中性脂質、帶電脂質、可離子化脂質、類固醇和經聚合物共軛之脂質。
如請求項35之方法，其中該脂質奈米粒子包含膽固醇、聚乙二醇(PEG)脂質或兩者。
如請求項1至37中任一項之方法，其進一步包含在投予之前、在投予之後或在投予前後皆測定該個體的(i)丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)、γ-麩胺醯轉移酶(GGT)、膽紅素、鹼性磷酸酶(Alk Phos)和白蛋白中之一或多者的水平；(ii)凝血酶原時間(PT)；及/或(iii)部份血栓形成素時間(PTT)。
如請求項1至38中任一項之方法，其中該個體被投予附加治療，其中該附加治療包含投予皮質類固醇、抗H1抗組織胺、抗H2抗組織胺或其任何組合。
如請求項39之方法，其中該附加治療係在對該個體投予複數種奈米粒子之前1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週或更久投予該個體。
如請求項39至40中任一項之方法，其中該附加治療及該複數種奈米粒子係同時投予。
一種組成物，其包含與下列複合之複數種奈米粒子：(a)靶向 LPA基因之引導RNA(gRNA)( LPAgRNA)，及(b)編碼Cas9核酸內切酶之mRNA，其中該gRNA包含SEQ ID NO：18至25中任一者之間隔子序列。
一種用於治療脂蛋白相關的疾病之組成物，其包含與下列複合之複數種奈米粒子：(a)靶向 LPA基因之引導RNA (gRNA) ( LPAgRNA)，及(b)編碼Cas9核酸內切酶之mRNA，其中該gRNA包含SEQ ID NO：18至25中任一者之間隔子序列。
如請求項43之組成物，其中該脂蛋白相關的疾病為代謝疾病、心血管疾病、脂質代謝疾病或其組合。
如請求項43之組成物，其中該脂蛋白相關的疾病為鈣化性主動脈瓣疾病、心肌梗塞、冠狀動脈心臟病、動脈粥樣硬化、血栓形成、中風、冠狀動脈疾病、家族性高脂血症、心肌梗塞、周邊動脈疾病、鈣化性主動脈瓣膜狹窄或其組合。
如請求項42至45中任一項之組成物，其中該gRNA包含SEQ ID NO：18之間隔子序列。
如請求項42至45中任一項之組成物，其中該gRNA包含SEQ ID NO：32之序列。
如請求項42至45中任一項之組成物，其中該gRNA包含SEQ ID NO：11之序列。
如請求項42至48中任一項之組成物，其中該Cas9核酸內切酶為化膿鏈球菌Cas9核酸內切酶。
如請求項42至49中任一項之組成物，其中該複數種奈米粒子為脂質奈米粒子。
如請求項50之組成物，其中該脂質奈米粒子包含一或多種中性脂質、帶電脂質、可離子化脂質、類固醇和經聚合物共軛之脂質。
如請求項50之組成物，其中該脂質奈米粒子包含膽固醇、聚乙二醇(PEG)脂質或兩者。
如請求項42至52中任一項之組成物，其中該組成物為包含一或多種醫藥上可接受的賦形劑之醫藥組成物。