JP2023529316A - ゲノム編集のための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

ゲノムを標的化し、編集するための組成物を本明細書に記載する。また、本開示の組成物を利用してゲノムを標的化し、編集するための方法も本明細書に記載する。【選択図】図８

Description

相互参照
本出願は、２０２０年５月２６日に出願された仮出願第６３／０３０，１２１号、２０２０年１１月１１日に出願された仮出願第６３／１１２，３２８号、２０２０年１２月１日に出願された仮出願第６３／１１９，８８１号、２０２１年４月２２日に出願された仮出願第６３／１７８，２２１号に対する米国特許法第１１９条に基づく優先権を主張し、その開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

操作されたガイドＲＮＡであって、（ａ）少なくとも１個の化学修飾と、（ｂ）標的化ドメインであって、標的化ドメインが、対象に投与されると標的ＲＮＡにハイブリダイズし、それによって対象の細胞中に存在するＲＮＡ編集エンティティを動員する複合体を形成する、標的化ドメインと、を含み、ＲＮＡ編集エンティティが、操作されたガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡと会合すると、標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の標的化編集を行う、操作されたガイドＲＮＡが本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡに対するミスマッチを含む。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、標的ＲＮＡ分子中の塩基に対して対向しており、かつ対形成しない、操作されたガイドＲＮＡ中の塩基を含む。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、Ａ／Ｃミスマッチを含み、Ａは、標的ＲＮＡ分子中にあり、Ｃは、操作されたガイドＲＮＡ中にある。いくつかの実施形態において、Ａ／Ｃミスマッチ中のＡは、ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された標的ＲＮＡ分子中のヌクレオチドの塩基を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基と対向するＣを含む。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基に隣接し、かつ５’のＧを含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドは、ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された標的ＲＮＡ分子中のＡに対して対向しており、かつ対形成しないＣに隣接し、かつ５’のＧを更に含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ミスマッチのいずれかの側に非修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ミスマッチの２個のヌクレオチド内に第２のミスマッチを含まない。いくつかの実施形態において、化学修飾は、（ａ）操作されたガイドＲＮＡの５’末端の近位、（ｂ）操作されたガイドＲＮＡのある領域の５’末端の近位、又は（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方に配置される。いくつかの実施形態において、化学修飾は、（ａ）操作されたガイドＲＮＡの３’末端の近位、（ｂ）操作されたガイドＲＮＡのある領域の３’末端の近位、又は（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方に配置される。いくつかの実施形態において、化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡの５’末端の近位、操作されたガイドＲＮＡのある領域の５’末端の近位、操作されたガイドＲＮＡの３’末端の近位、操作されたガイドＲＮＡのある領域の３’末端の近位、又はこれらの任意の組み合わせに配置される。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、水溶液中に存在し、かつ標的ＲＮＡに結合していない場合には、約１００ｎＭ未満の解離定数であり、ＲＮＡ編集エンティティに結合しない。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供される操作されたガイドＲＮＡのホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素原子の片方又は両方の置換を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供される操作されたガイドＲＮＡのホスホジエステル骨格連結中の連結リン酸酸素原子のうちの１つ以上の置換を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供される操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの糖に対する修飾を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの糖に対する修飾は、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの糖に対する修飾は、少なくとも１つのアンロックド核酸（ＵＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、糖に対する修飾は、糖の構成要素の修飾を含み、糖は、リボース糖を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドのリボース糖の構成要素に対する修飾は、２’－Ｏ－メチル基を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供されるデホスホリンカーによる、操作されたガイドＲＮＡのリン酸部分の置き換えを含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供される操作されたガイドＲＮＡのリン酸骨格の修飾を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ホスホチオエート基を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの塩基に対する修飾を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供されるヌクレオチドの非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、モルホリノ基、シクロブチル基、ピロリジン基、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代理物を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供される少なくとも立体化学的に純粋な核酸を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、１～１００個の化学修飾を含み、その各々が独立して同じであってもよいか、又は異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、化学修飾は、真核細胞中の核酸に対して天然に存在する化学修飾を含まない。いくつかの実施形態において、化学修飾は、少なくとも１個の化学修飾を含まない、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドの特異性と比較して、標的ＲＮＡに対する操作されたガイドＲＮＡの結合の特異性を増加させる。いくつかの実施形態において、化学修飾は、インビトロアッセイで測定される場合に、少なくとも１個の化学修飾を含まない、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド消化に対する抵抗性と比較して、操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチド消化に対する抵抗性を増加させる。いくつかの実施形態において、化学修飾は、インビトロアッセイで測定される場合に、少なくとも１個の化学修飾を含まない、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドの免疫原性と比較して、操作されたガイドＲＮＡの免疫原性を減少させる。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、ＲＡＢ７Ａ、ＡＢＣＡ４、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＡＰＰ、Ｔａｕ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ Ｇ１２２６Ｒ、ＨＦＥ Ｃ２８２Ｙ、ＬＩＰＡ ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ、ＰＣＳＫ９開始部位、若しくはＳＣＮＮ１Ａ開始部位、これらのいずれかの断片、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋを含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、配列番号１～２のうちのいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、ＡＢＣＡ４をコードする。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティは、（ａ）ＡＤＡＲ若しくはＡＰＯＢＥＣ、（ｂ）（ａ）の触媒的に活性な断片、（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）を含む融合ポリペプチド、又は（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＤＡＲを含み、ＡＤＡＲは、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティは、対象の細胞に対して内因性である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティは、外因的に提供される。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、構造的なループ安定化骨格を更に含む。いくつかの実施形態において、構造的なループ安定化骨格は、ステムループ、接合部、Ｔ接合部、クローバーリーフ、シュードノット、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、構造的なループ安定化骨格は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０個のステムループ構造を含む。いくつかの実施形態において、構造的なループ安定化骨格は、ｔＲＮＡ骨格を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを更に含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、標的化部分にコンジュゲート化される。いくつかの実施形態において、標的化部分は、神経細胞を標的化する。いくつかの実施形態において、標的化部分は、肝臓細胞を標的化する。いくつかの実施形態において、標的化部分は、黄斑細胞を標的化する。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、粒子中に封入される。いくつかの実施形態において、粒子は、ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、粒子は、リポソームを含む。

また、単位用量形態の薬学的組成物であって、（ａ）本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡと、（ｂ）薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤と、を含む、薬学的組成物が本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、（ａ）少なくとも１個の化学修飾と、（ｂ）標的化ドメインであって、標的化ドメインが、対象に投与されると標的ＲＮＡにハイブリダイズし、それによって対象の細胞中に存在するＲＮＡ編集エンティティを動員する複合体を形成する、標的化ドメインと、を含み、ＲＮＡ編集エンティティが、操作されたガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡと会合すると、標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の標的化編集を行う。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡに対するミスマッチを含む。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、標的ＲＮＡ分子中の塩基に対して対向しており、かつ対形成しない、操作されたガイドＲＮＡ中の塩基を含む。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、Ａ／Ｃミスマッチを含み、Ａは、標的ＲＮＡ分子中にあり、Ｃは、操作されたガイドＲＮＡ中にある。いくつかの実施形態において、Ａ／Ｃミスマッチ中のＡは、ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された標的ＲＮＡ分子中のヌクレオチドの塩基を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基と対向するＣを含む。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基に隣接し、かつ５’のＧを含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドは、ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された標的ＲＮＡ分子中のＡに対して対向しており、かつ対形成しないＣに隣接し、かつ５’のＧを更に含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ミスマッチのいずれかの側に非修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ミスマッチの２個のヌクレオチド内に第２のミスマッチを含まない。いくつかの実施形態において、化学修飾は、（ａ）操作されたガイドＲＮＡの５’末端の近位、（ｂ）操作されたガイドＲＮＡのある領域の５’末端の近位、又は（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方に配置される。いくつかの実施形態において、化学修飾は、（ａ）操作されたガイドＲＮＡの３’末端の近位、（ｂ）操作されたガイドＲＮＡのある領域の３’末端の近位、又は（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方に配置される。いくつかの実施形態において、化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡの５’末端の近位、操作されたガイドＲＮＡのある領域の５’末端の近位、操作されたガイドＲＮＡの３’末端の近位、操作されたガイドＲＮＡのある領域の３’末端の近位、又はこれらの任意の組み合わせに配置される。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、水溶液中に存在し、かつ標的ＲＮＡに結合していない場合には、約１００ｎＭ未満の解離定数であり、ＲＮＡ編集エンティティに結合しない。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供される操作されたガイドＲＮＡのホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素原子の片方又は両方の置換を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供される操作されたガイドＲＮＡのホスホジエステル骨格連結中の連結リン酸酸素原子のうちの１つ以上の置換を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供される操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの糖に対する修飾を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの糖に対する修飾は、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの糖に対する修飾は、少なくとも１つのアンロックド核酸（ＵＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、糖に対する修飾は、糖の構成要素の修飾を含み、糖は、リボース糖を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドのリボース糖の構成要素に対する修飾は、２’－Ｏ－メチル基を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供されるデホスホリンカーによる、操作されたガイドＲＮＡのリン酸部分の置き換えを含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供される操作されたガイドＲＮＡのリン酸骨格の修飾を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ホスホチオエート基を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの塩基に対する修飾を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供されるヌクレオチドの非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、モルホリノ基、シクロブチル基、ピロリジン基、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代理物を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供される少なくとも立体化学的に純粋な核酸を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、１～１００個の化学修飾を含み、その各々が独立して同じであってもよいか、又は異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、化学修飾は、真核細胞中の核酸に対して天然に存在する化学修飾を含まない。いくつかの実施形態において、化学修飾は、少なくとも１個の化学修飾を含まない、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドの特異性と比較して、標的ＲＮＡに対する操作されたガイドＲＮＡの結合の特異性を増加させる。いくつかの実施形態において、化学修飾は、インビトロアッセイで測定される場合に、少なくとも１個の化学修飾を含まない、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド消化に対する抵抗性と比較して、操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチド消化に対する抵抗性を増加させる。いくつかの実施形態において、化学修飾は、インビトロアッセイで測定される場合に、少なくとも１個の化学修飾を含まない、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドの免疫原性と比較して、操作されたガイドＲＮＡの免疫原性を減少させる。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、ＲＡＢ７Ａ、ＡＢＣＡ４、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＡＰＰ、Ｔａｕ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ Ｇ１２２６Ｒ、ＨＦＥ Ｃ２８２Ｙ、ＬＩＰＡ ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ、ＰＣＳＫ９開始部位、若しくはＳＣＮＮ１Ａ開始部位、これらのいずれかの断片、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋを含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、配列番号１～２のうちのいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、ＡＢＣＡ４をコードする。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティは、（ａ）ＡＤＡＲ若しくはＡＰＯＢＥＣ、（ｂ）（ａ）の触媒的に活性な断片、（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）を含む融合ポリペプチド、又は（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＤＡＲを含み、ＡＤＡＲは、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティは、対象の細胞に対して内因性である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティは、外因的に提供される。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、構造的なループ安定化骨格を更に含む。いくつかの実施形態において、構造的なループ安定化骨格は、ステムループ、接合部、Ｔ接合部、クローバーリーフ、シュードノット、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、構造的なループ安定化骨格は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０個のステムループ構造を含む。いくつかの実施形態において、構造的なループ安定化骨格は、ｔＲＮＡ骨格を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを更に含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、標的化部分にコンジュゲート化される。いくつかの実施形態において、標的化部分は、神経細胞を標的化する。いくつかの実施形態において、標的化部分は、肝臓細胞を標的化する。いくつかの実施形態において、標的化部分は、黄斑細胞を標的化する。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、粒子中に封入される。いくつかの実施形態において、粒子は、ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、粒子は、リポソームを含む。

また、疾患又は状態を治療又は予防することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、その方法が、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡ、又は本明細書に記載の薬学的組成物を、対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド又は薬学的組成物は、対象に、髄腔内、眼内、硝子体内、網膜内、静脈内、筋肉内、脳室内、大脳内、小脳内、側脳室内、実質内、皮下、又はこれらの組み合わせにより投与される。いくつかの実施形態において、疾患又は状態は、神経性疾患又は状態を含む。いくつかの実施形態において、神経性疾患若しくは状態、又は神経発達的疾患若しくは状態は、パーキンソン病、アルツハイマー病、又は認知症を含む。いくつかの実施形態において、疾患又は状態は、肝臓疾患又は状態を含む。いくつかの実施形態において、肝臓疾患又は状態は、肝硬変を含む。いくつかの実施形態において、肝臓疾患又は状態は、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴ欠乏症）を含む。いくつかの実施形態において、疾患又は状態は、黄斑変性を含む。いくつかの実施形態において、黄斑変性は、スターガルト病を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、（ａ）少なくとも１個の化学修飾と、（ｂ）標的化ドメインであって、標的化ドメインが、対象に投与されると標的ＲＮＡにハイブリダイズし、それによって対象の細胞中に存在するＲＮＡ編集エンティティを動員する複合体を形成する、標的化ドメインと、を含み、ＲＮＡ編集エンティティが、操作されたガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡと会合すると、標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の標的化編集を行う。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡに対するミスマッチを含む。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、標的ＲＮＡ分子中の塩基に対して対向しており、かつ対形成しない、操作されたガイドＲＮＡ中の塩基を含む。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、Ａ／Ｃミスマッチを含み、Ａは、標的ＲＮＡ分子中にあり、Ｃは、操作されたガイドＲＮＡ中にある。いくつかの実施形態において、Ａ／Ｃミスマッチ中のＡは、ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された標的ＲＮＡ分子中のヌクレオチドの塩基を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基と対向するＣを含む。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基に隣接し、かつ５’のＧを含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドは、ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された標的ＲＮＡ分子中のＡに対して対向しており、かつ対形成しないＣに隣接し、かつ５’のＧを更に含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ミスマッチのいずれかの側に非修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ミスマッチの２個のヌクレオチド内に第２のミスマッチを含まない。いくつかの実施形態において、化学修飾は、（ａ）操作されたガイドＲＮＡの５’末端の近位、（ｂ）操作されたガイドＲＮＡのある領域の５’末端の近位、又は（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方に配置される。いくつかの実施形態において、化学修飾は、（ａ）操作されたガイドＲＮＡの３’末端の近位、（ｂ）操作されたガイドＲＮＡのある領域の３’末端の近位、又は（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方に配置される。いくつかの実施形態において、化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡの５’末端の近位、操作されたガイドＲＮＡのある領域の５’末端の近位、操作されたガイドＲＮＡの３’末端の近位、操作されたガイドＲＮＡのある領域の３’末端の近位、又はこれらの任意の組み合わせに配置される。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、水溶液中に存在し、かつ標的ＲＮＡに結合していない場合には、約１００ｎＭ未満の解離定数であり、ＲＮＡ編集エンティティに結合しない。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供される操作されたガイドＲＮＡのホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素原子の片方又は両方の置換を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供される操作されたガイドＲＮＡのホスホジエステル骨格連結中の連結リン酸酸素原子のうちの１つ以上の置換を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供される操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの糖に対する修飾を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの糖に対する修飾は、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの糖に対する修飾は、少なくとも１つのアンロックド核酸（ＵＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、糖に対する修飾は、糖の構成要素の修飾を含み、糖は、リボース糖を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドのリボース糖の構成要素に対する修飾は、２’－Ｏ－メチル基を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供されるデホスホリンカーによる、操作されたガイドＲＮＡのリン酸部分の置き換えを含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供される操作されたガイドＲＮＡのリン酸骨格の修飾を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ホスホチオエート基を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの塩基に対する修飾を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供されるヌクレオチドの非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、モルホリノ基、シクロブチル基、ピロリジン基、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代理物を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾は、表２に提供される少なくとも１つの立体化学的に純粋な核酸を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、１～１００個の化学修飾を含み、その各々が独立して同じであってもよいか、又は異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、化学修飾は、真核細胞中の核酸に対して天然に存在する化学修飾を含まない。いくつかの実施形態において、化学修飾は、少なくとも１個の化学修飾を含まない、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドの特異性と比較して、標的ＲＮＡに対する操作されたガイドＲＮＡの結合の特異性を増加させる。いくつかの実施形態において、化学修飾は、インビトロアッセイで測定される場合に、少なくとも１個の化学修飾を含まない、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド消化に対する抵抗性と比較して、操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチド消化に対する抵抗性を増加させる。いくつかの実施形態において、化学修飾は、インビトロアッセイで測定される場合に、少なくとも１個の化学修飾を含まない、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドの免疫原性と比較して、操作されたガイドＲＮＡの免疫原性を減少させる。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、ＲＡＢ７Ａ、ＡＢＣＡ４、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＡＰＰ、Ｔａｕ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ Ｇ１２２６Ｒ、ＨＦＥ Ｃ２８２Ｙ、ＬＩＰＡ ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ、ＰＣＳＫ９開始部位、若しくはＳＣＮＮ１Ａ開始部位、これらのいずれかの断片、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋを含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、配列番号１～２のうちのいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、ＡＢＣＡ４をコードする。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティは、（ａ）ＡＤＡＲ若しくはＡＰＯＢＥＣ、（ｂ）（ａ）の触媒的に活性な断片、（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）を含む融合ポリペプチド、又は（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＤＡＲを含み、ＡＤＡＲは、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティは、対象の細胞に対して内因性である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティは、外因的に提供される。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、構造的なループ安定化骨格を更に含む。いくつかの実施形態において、構造的なループ安定化骨格は、ステムループ、接合部、Ｔ接合部、クローバーリーフ、シュードノット、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、構造的なループ安定化骨格は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０個のステムループ構造を含む。いくつかの実施形態において、構造的なループ安定化骨格は、ｔＲＮＡ骨格を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを更に含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、標的化部分にコンジュゲート化される。いくつかの実施形態において、標的化部分は、神経細胞を標的化する。いくつかの実施形態において、標的化部分は、肝臓細胞を標的化する。いくつかの実施形態において、標的化部分は、黄斑細胞を標的化する。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、粒子中に封入される。いくつかの実施形態において、粒子は、ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、粒子は、リポソームを含む。

参照による組み込み
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により具体的かつ個別に組み込まれたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

本特許出願は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を含む本特許又は特許出願の複写は、請求及び必要な料金の支払いによって、庁により提供される。

３つの化学修飾されたガイドＲＮＡによる核酸編集の増加を示す。図１Ａは、例示的な化学修飾されたｇＲＮＡを示す。図１Ｂは、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって、又はＳａｎｇｅｒ配列決定によって決定される場合のＨＥＰＧ２細胞における図１ＡのｇＲＮＡ２～３によって編集されたＲＡＢ７Ａの割合の増加を示す。図１Ｃは、Ｋ５６２細胞における図１ＡのｇＲＮＡ２～４によって編集されたＲＡＢ７Ａの割合の増加を示す。図１Ｄは、ＡからＧへのＲＡＢ７Ａの編集成功を示すＳａｎｇｅｒ配列決定トレースを示す（矢印によって示される）。 同上。 同上。 同上。 化学修飾されたｇＲＮＡによる核酸編集の増加を示す。図２Ａは、４つの例示的な化学修飾されたｇＲＮＡを示す。図２Ｂは、ｄｄＰＣＲによって決定される場合の図２ＡのｇＲＮＡ２及び３によって編集されたＲＡＢ７Ａの割合の増加を示す。図２Ｃは、Ｓａｎｇｅｒ配列決定によって決定される場合の図２ＡのｇＲＮＡ２及び３によって編集された標的率ＲＡｂ７Ａの増加を示す。図２Ｄは、ＡからＧへのＲＡＢ７Ａの編集（標的）及びオフターゲット編集（＋９ｎｔ及び－９ｎｔを示す矢印）を示すＳａｎｇｅｒ配列決定トレースを示す。 同上。 同上。 同上。 ４８時間にわたる化学修飾されたｇＲＮＡ（図２ＡのｇＲＮＡ２）による一時的なＲＡＢ７Ａ編集を示す。 本開示の化学修飾されたガイドＲＮＡを使用して（図１Ａの非修飾ｇＲＮＡ１と比較した図１ＡのｇＲＮＡ３）、網膜上皮細胞におけるＲＡＢ７Ａ編集を示すＳａｎｇｅｒ配列決定トレースを示す。 本開示の化学修飾されたガイドＲＮＡを使用したＳＮＣＡ ３’ＵＴＲ編集を示す。 様々な長さの本開示の化学修飾されたガイドＲＮＡを使用してＫ５６２細胞におけるＲＡＢ７Ａ編集を示す。 試験した様々なｇＲＮＡの概略図（左上）、ＲＮＡ編集の結果（右上）、及びｇＲＮＡ安定性（下）を示す。 １００及び５０の長さのガイドについてのＲＮＡアガロースゲル及びＲＮＡ編集のグラフを示す。 化学修飾されたｇＲＮＡが、修飾を有しないＩＶＴガイドよりも高いレベルで、３つ全ての標的の編集を首尾良く媒介したことを示す。

本開示の新規特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に述べられる。例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明を参照することにより、本開示の特徴及び利点のより良好な理解が得られる。

遺伝子編集のための標的核酸に酵素を動員するためのポリヌクレオチドの使用は、治療目的に利用され得る。例えば、核酸誘導Ｃａｓタンパク質は、疾患又は状態を治療するために遺伝子変異を編集することができる。ＤＮＡの遺伝子編集は、依然として危険である。オフターゲット効果を介して永続的な遺伝子変異を導入する可能性は、顕著なものであり得る。ＲＮＡレベルでの遺伝子編集の効率性及び特異性もまた、依然として限定的である。特筆すべきであるが、核酸編集エンティティを誘導して核酸を編集するためのポリヌクレオチドは、オフターゲット編集を誘導する可能性があり、加水分解又はヌクレアーゼ消化に起因して分解する可能性があり、核酸編集エンティティを標的核酸に動員するのに効果的ではない場合がある。したがって、疾患又は状態を治療するために標的核酸を編集するために、核酸編集エンティティを効率的かつ特異的に動員するための組成物及び方法が依然として必要である。増加した効率及び特異性で核酸を標的化し、核酸編集エンティティを動員することができるポリヌクレオチドも依然として必要である。投与を必要とする対象に投与すると、分解に対する抵抗性の増加、及び免疫原性の減少を示すポリヌクレオチドも依然として必要である。いくつかの遺伝子編集方法は、ＲＮＡレベルで編集するための酵素等の核酸編集エンティティを誘導するためにポリヌクレオチドを使用することを含み、核酸編集酵素は、プレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ等のＲＮＡを編集することができる。

概要
疾患又は状態に関与する標的ＲＮＡポリヌクレオチドの編集を容易にするように操作された化学修飾されたガイドＲＮＡが本明細書に記載される。かかる化学修飾されたガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡポリヌクレオチドに対する標的化ドメインアンチセンスを含む。本明細書に開示されるように、哺乳動物細胞における標的ＲＮＡポリヌクレオチドに対する化学修飾されたｇＲＮＡの標的化ドメインのハイブリダイゼーションは、標的ＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の標的化した化学修飾を行う哺乳動物細胞におけるＲＮＡ編集酵素（例えば、デアミナーゼ）によって認識される二本鎖基質を提供し、それによって塩基の異なる塩基部位への変換を特異的にもたらす。したがって、本明細書に記載の化学修飾されたｇＲＮＡを展開して、標的ＲＮＡポリヌクレオチドの部位指向性編集によって、疾患又は状態を治療することができる。

疾患又は状態を治療するための遺伝子又は転写産物を編集するための組成物及び方法が本明細書に記載される。本明細書に記載の組成物及び方法は、疾患又は状態を治療するための遺伝子を編集するための現時点で利用可能なモダリティを超える改善を提示する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物及び方法は、疾患又は状態を引き起こす遺伝子又は遺伝子の転写産物を編集する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物及び方法は、細胞と、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡとを接触させることを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物及び方法は、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡを投与することを必要とする対象にそれを行うことを含む。いくつかの場合において、本明細書に記載の組成物及び方法は、操作されたガイドＲＮＡを利用して、核酸編集エンティティを動員し、疾患又は状態を引き起こす遺伝子又は遺伝子の転写差物を編集することによって、疾患又は状態を治療することを含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、核酸編集エンティティを動員し、疾患又は状態を引き起こす変異を編集し、野生型へと回復させ、それによって、その疾患又は状態を治療する。いくつかの実施形態において、核酸編集エンティティは、核酸編集酵素である。いくつかの実施形態において、核酸編集エンティティは、ＲＮＡ編集酵素である。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、少なくとも１個の化学修飾を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１個の化学修飾は、遺伝子又は転写産物を生じさせる疾患又は状態を編集するために核酸編集エンティティを動員する際の操作されたガイドＲＮＡの効率を増加させる。いくつかの実施形態において、少なくとも１個の化学修飾は、遺伝子又は転写産物を生じさせる疾患又は状態を編集するために核酸編集エンティティを動員するための操作されたガイドＲＮＡの特異性を増加させる。いくつかの場合において、疾患又は状態は、ＡＢＣＡ４、ＡＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＡＰＰ、Ｔａｕ、ＧＢＡ、ＰＩＮＫ１、ＲＡＢ７Ａ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ Ｇ１２２６Ｒ、ＨＦＥ Ｃ２８２Ｙ、ＬＩＰＡ ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ、ＰＣＳＫ９開始部位、又はＳＣＮＮ１Ａ開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせをコードするＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子中の変異と関連する。いくつかの例において、ＡＢＣＡ４、ＡＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＡＰＰ、Ｔａｕ、ＧＢＡ、ＰＩＮＫ１、ＲＡＢ７Ａ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ Ｇ１２２６Ｒ、ＨＦＥ Ｃ２８２Ｙ、ＬＩＰＡ ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ、ＰＣＳＫ９開始部位、又はＳＣＮＮ１Ａ開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせをコードする変異したＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質は、ある疾患の病因又は進行に少なくとも部分的に寄与する。いくつかの例において、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子中の変異は、それ以外は同一の参照ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に対するものである。

いくつかの場合において、少なくとも１個の化学修飾は、ヌクレアーゼ分解又は加水分解に対する操作されたガイドＲＮＡの抵抗性を増加させる。いくつかの場合において、少なくとも１個の化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡの半減期を増加させる。いくつかの場合において、少なくとも１個の化学修飾は、細胞中の操作されたガイドＲＮＡの半減期を増加させる。いくつかの場合において、少なくとも１個の化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡが投与されることを必要とする対象にそれを行う場合に、操作されたガイドＲＮＡの半減期を増加させる。いくつかの場合において、少なくとも１個の化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡが投与されることを必要とする対象にそれを行う場合に、操作されたガイドＲＮＡによって誘導される免疫原性を減少させる。

組成物
本明細書に記載されるのは、いくつかの場合において、化学修飾された操作されたガイドＲＮＡを含む組成物である。いくつかの実施形態において、化学修飾の前に、核酸編集エンティティを標的核酸に動員するための操作された修飾ガイドＲＮＡは、ベクターポリヌクレオチドによってコードされ得る。いくつかの場合において、操作された修飾ガイドＲＮＡを、直接的に化学合成することができる。いくつかの場合において、ガイド核酸は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であり得る。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡは、核酸編集エンティティを標的核酸に動員する。いくつかの実施形態において、核酸編集エンティティは、ＤＮＡ編集エンティティ（例えば、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２）であり得る。いくつかの実施形態において、核酸編集エンティティは、ＲＮＡ編集エンティティであり得る。いくつかの実施形態において、核酸編集エンティティは、操作されたガイドＲＮＡによって接触された細胞に対して内因性である。いくつかの場合において、核酸編集エンティティは、ベクターによってコードされる。いくつかの場合において、核酸編集エンティティは、ベクターによってコードされない。いくつかの場合において、核酸編集エンティティは、化学修飾されていない操作されたガイドＲＮＡもコードする同じベクターによってコードされる。核酸編集エンティティとしては、シトシンＣをＵ／Ｔに変換するためのシチジンデアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、若しくはＡＰＯＢＥＣ３Ｈ）、アデノシンＡをＩ／Ｇに変換するためのアデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡＲ、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、若しくはＡＤＡＲ３）、シトシンをメチルシトシンに変換するためのメチルトランスフェラーゼ（Ｄｎｍｔ１トランスフェラーゼ、Ｄｎｍｔ３ａ、若しくはＤｎｍｔ３ｂ）、メチルシトシンをシトシンに変換するためのデメチラーゼ、又はＴｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ１を挙げることができる。

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集酵素は、不活化するように変異され得る。上述の「死Ｃａｓ」又は「ｄＣａｓ」系を、本開示の標的ＲＮＡのＲＮＡ編集のためにＲＮＡ編集エンティティ（例えば、ＡＤＡＲ）に連結することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡを使用して、核酸を標的化することができる。標的核酸は、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであってもよい。いくつかの場合において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡを使用して、ＲＮＡを標的化することができる。ＲＮＡを標的化することは、ＲＮＡが特定のヌクレオシド上での合成後に酵素的に修飾され得るプロセスであってもよい。ＲＮＡの標的化は、ヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換のうちのいずれか１つを含み得る。ＲＮＡ標的化の例としては、シュードウリジル化（ウリジン残基の異性化）及び脱アミノ化（シチジンからのアミノ基の除去によりウリジンを生じさせること、又はＣからＵへの編集、又はアデノシンからイノシンへの、又はＡからＩへの編集）が挙げられる。

ＲＮＡの標的化は、ポリペプチドの発現を調節するための方式であり得る。例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に入るポリペプチドをコードするｄｓＲＮＡ基質の調節を介する。次いで、この調節は、ポリペプチドの発現を調節するためにクロマチンレベルで作用し得る。

ＲＮＡの標的化は、遺伝子翻訳を調節するための方式でもあり得る。ＲＮＡ編集は、サイレント変異及び／又は非同義変異を導入するためにトリプレットコドンを調節することによって転写物の再コード化を調節する機構であり得る。

ＲＮＡ編集エンティティ又はその生物学的に活性な断片を含む組成物、及びそれらを使用する方法が本明細書で提供される。ある態様において、ＲＮＡ編集エンティティは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、ｔＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）、及びこれらのいずれかの生物学的に活性な断片を含み得る。ＡＤＡＲ及びＡＤＡＴは、ＲＮＡにおけるアデノシンからイノシンへの化学的変換を触媒する酵素であり得る。イノシンの特性は、グアノシンの特性を模倣するため（イノシンは、例えば、シトシンとの２つの水素結合を形成する）、イノシンは、翻訳細胞機構によってグアノシンとして認識され得る。したがって、「アデノシンからイノシン（ＡからＩ）へのＲＮＡ編集」は、ＲＮＡ標的の一次配列を効果的に変化させる。一般に、ＡＤＡＲ及びＡＤＡＴ酵素は、様々な数のアミノ末端ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）及び単一のカルボキシ末端触媒デアミナーゼドメインを含む共通のドメインアーキテクチャを共有する。ヒトＡＤＡＲ及びＡＤＡＴは、２つ又は３つのｄｓＲＢＤを保有する。証拠は、ＡＤＡＲ及びＡＤＡＴが、ホモ二量体を形成することができ、二本鎖ＲＮＡに結合する場合には、他のＡＤＡＲ及びＡＤＡＴとヘテロ二量体を形成することができることを示唆しているが、編集を行うために二量体化が必要である場合は、現在のところ結論が出ていない場合がある。

３つのヒトＡＤＡＲ遺伝子が特定されており（ＡＤＡＲ１～３）、ＡＤＡＲ１（公式の記号ＡＤＡＲ）及びＡＤＡＲ２（ＡＤＡＲＢ１）タンパク質は、十分に特性決定されたアデノシン脱アミノ化活性を有する。ＡＤＡＲは、そのＮ末端領域にｄｓＲＮＡ結合ドメインの少なくとも２つのコピー（ｄｓＲＢＤ、３つのｄｓＲＢＤを有するＡＤＡＲ１、各々２つのコピーを有するＡＤＡＲ２及びＡＤＡＲ３）、その後にＣ末端デアミナーゼドメインを含む典型的なモジュールドメイン組織を有する。ＡＤＡＴは、ｔＲＮＡ上の脱アミノ化を触媒する。ＡＤＡＴは、Ｅ．ｃｏｌｉではｔａｄＡと名付けられることもある。３つのヒトＡＤＡＴ遺伝子が特定されている（ＡＤＡＴ１～３）。

特異的なＲＮＡ編集は、転写産物の再コード化につながる可能性がある。イノシンは、グアノシンの塩基対形成特性を共有するため、翻訳機構は、編集されたアデノシンをグアノシンと解釈し、トリプレットコドンを変化させ、タンパク質産物中のアミノ酸置換を引き起こす可能性がある。遺伝暗号中の半分より多いトリプレットコドンが、ＲＮＡ編集によって再割り当てされ得る。遺伝暗号の縮重に起因して、ＲＮＡ編集は、サイレントアミノ酸置換及び非同義アミノ酸置換の両方を引き起こす可能性がある。

いくつかの場合において、ＲＮＡを標的化することは、スプライシングに影響を及ぼす可能性がある。編集のために標的化されたアデノシンは、プレｍＲＮＡ中のスプライス接合部の付近に過度に局在化され得る。したがって、ｄｓＲＮＡ ＡＤＡＲ基質の形成中に、イントロンシス作用配列は、スプライシング部位を包含するＲＮＡ二本鎖を形成し、スプライシング機構からそれらを不明瞭なものにする可能性がある。更に、選択されたアデノシンの修飾によって、ＡＤＡＲは、スプライシング部位を生成するか、又は除外することができ、転写産物のスプライシング後に広く影響を及ぼす。翻訳機構と同様に、スプライセオソームは、イノシンをグアノシンと解釈し、したがって、典型的なＧＵ５’スプライス部位及びＡＧ３’アクセプター部位は、それぞれＡＵ（ＩＵ＝ＧＵ）及びＡＡ（ＡＩ＝ＡＧ）の脱アミノ化を介して作成することができる。これに対応して、ＲＮＡ編集は、典型的なＡＧ３’スプライス部位（ＩＧ＝ＧＧ）を破壊し得る。

ある態様において、ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＤＡＲを含む。いくつかの実施形態において、ＡＤＡＲは、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ１ｐ１１０、ＡＤＡＲ１ｐ１５０、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、ＡＰＯＢＥＣタンパク質、又はこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つを含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＤＡＲ ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＤＡＲ１である。加えて、又は代替的に、ＡＤＡＲ ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＤＡＲ２であってもよい。加えて、又は代替的に、ＡＤＡＲ ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＤＡＲ３であってもよい。ある態様において、ＲＮＡ編集エンティティは、非ＡＤＡＲであり得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ１ｐ１１０、ＡＤＡＲ１ｐ１５０、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、又はこれらの任意の組み合わせに対して少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。代替の編集エンティティ、例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系からのものも企図される。

いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティは、ウイルスコードＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティは、麻疹、ムンプス、又はパラインフルエンザに由来するウイルスコードＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティは、標的ＲＮＡ中の１つ又は複数のヌクレオチドを付加又は欠失することが可能なＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ由来の酵素であり得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティは、標的ＲＮＡ中のウラシル、又は１つより多いウラシルを付加又は欠失することが可能なＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ由来の酵素であり得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティは、組換え酵素を含み得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティは、融合ポリペプチドを含み得る。

ある態様において、ＲＮＡ編集エンティティは、主題の操作されたガイドＲＮＡによって動員され得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡ編集エンティティを動員することができ、操作されたガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡと会合するとき、又は標的ＲＮＡと会合しないとき、標的ＲＮＡの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集、ＲＡＢ７Ａ、ＡＢＣＡ４、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＡＰＰ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ Ｇ１２２６Ｒ、ＨＦＥ Ｃ２８２Ｙ、ＬＩＰＡ ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ、ＰＣＳＫ９開始部位、ＳＣＮＮ１Ａ開始部位、ＧＢＡ、ＰＩＮＫ１、Ｔａｕ、又はこれらの組み合わせ等の主題の標的ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現の調節を容易にする。操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡ編集エンティティを動員することができるようなＲＮＡ編集動員ドメインを含有し得る。

操作されたポリヌクレオチド
本明細書に記載されるのは、いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、操作されたＲＮＡである。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、操作されたガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡに結合すると、標的ＲＮＡと会合して構造的特徴を形成し、上述の構造的特徴は、ＲＮＡ編集エンティティ（例えば酵素）を標的ＲＮＡに少なくとも部分的に動員する。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、本明細書に記載の構造的なループ安定化骨格を含み得る。動員されたＲＮＡ編集エンティティは、標的ＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも１つの塩基を化学修飾することができる。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、一本鎖である。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、少なくとも部分的に一本鎖である。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、部分的に一本鎖である。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、少なくとも１個の化学修飾を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、水溶液中に存在し、かつ標的ＲＮＡに結合していない場合には、約１ｐＭ、５ｐＭ、１０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、５００ｐＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、５００μＭ、又は１ｍＭの解離定数であり、ＲＮＡ編集エンティティに結合しない。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、分子内の構造的特徴を有しない。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、水溶液中に存在し、かつ標的ＲＮＡに結合していない場合には、ヘアピン、バルジ、ポリヌクレオチドループ、構造化ドメイン、又はこれらの任意の組み合わせ等の分子内の構造的特徴を有しない。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、本明細書において操作されたポリヌクレオチドと称され得る。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡに結合すると、ＲＮＡ編集エンティティを動員するための少なくとも１つの構造的特徴を形成し、上述の構造的特徴は、本明細書に記載の構造的特徴のうちのいずれか１つ、又は任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、構造的特徴は、バルジ、内部ループ、ヘアピン、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、構造的特徴は、バルジであってもよく、バルジは、非対称バルジ又は対称バルジであってもよい。いくつかの実施形態において、構造的特徴は、内部ループであってもよく、内部ループは、非対称内部ループ又は対称内部ループであってもよい。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００個、又はそれより多くの化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、又は２００個以下の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡの５’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００個、又はそれより多くの化学修飾されたヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡの３’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００個、又はそれより多くの化学修飾されたヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡの５’末端及び３’末端の両方に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００個、又はそれより多くの化学修飾されたヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡの標的化ドメイン中に少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、標的化ドメインに隣接するヌクレオチド塩基中に少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１個の化学修飾を分子内二次構造内に導入することができる。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡの化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡのホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素原子の片方又は両方のうちの少なくとも１つの置換を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡの少なくとも１個の化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡのホスホジエステル骨格連結中の連結リン酸酸素原子のうちの１つ以上の置換を含み得る。リン酸酸素原子の化学修飾の非限定的な例は、硫黄原子である。追加の非限定的な例は、表２に含まれる。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡの化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの糖に対する少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡの化学修飾は、ヌクレオチドの糖に対する少なくとも１個の化学修飾を含み得、化学修飾は、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡの化学修飾は、少なくとも１つのアンロックド核酸（ＵＮＡ）を含む操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの糖に対する少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡの化学修飾は、糖の構成要素の修飾を含む糖に対する少なくとも１個の化学修飾を含んでいてもよく、糖は、リボース糖である。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡの化学修飾は、２’－Ｏ－メチル基を含む操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドのリボース糖の構成要素に対する少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡの化学修飾は、デホスホリンカーを有する操作されたガイドＲＮＡのリン酸部分の置き換えを含む少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡの化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡのリン酸骨格の少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ホスホチオエート基を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡの化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの塩基に対する修飾を含む少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡの化学修飾は、ヌクレオチドの非天然塩基を含む少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡの化学修飾は、モルホリノ基、シクロブチル基、ピロリジン基、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代理物を含む少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡの化学修飾は、少なくとも１個の立体化学的に純粋な核酸を含む少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１個の化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡの５’末端の近位に配置され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１個の化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡの３’末端の近位に配置され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１個の化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡの５’末端及び３’末端の両方の近位に配置され得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドポリヌクレオチドであり得る。本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であり得る。本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡ又は操作されたガイドＲＮＡは、様々なドメインを含み得る。「ドメイン」は、操作されたガイドＲＮＡのある領域を指すことができる。いくつかの場合において、ドメインは、ドメインの機能の観点で説明することができる。例えば、「標的化ドメイン」は、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的であり得る操作されたガイドＲＮＡの領域を指すことができ、「ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメイン」は、本明細書に記載のＲＮＡ編集エンティティと会合するか、又はこれを動員することができ得るドメインを指すことができ、「スペーサードメイン」は、他のドメイン間の空間を提供するドメインを指すことができる。いくつかの場合において、ドメイン名の列挙は、ドメインを特定の機能に限定しない。例えば、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的であり得る「標的化ドメイン」は、いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティを動員することができる。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のために構成された配列をコードする配列を含まない。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡｉのために構成された配列を含まなくてもよい。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡは、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、又はダイサー基質をコードする配列を含まなくてもよい。

いくつかの態様において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡの前駆体から産生され得る。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡの前駆体は、線形であり得る。例えば、操作されたガイドＲＮＡの前駆体は、プラスミドから転写された線形ｍＲＮＡであり得る。別の例において、操作されたガイドＲＮＡの前駆体は、細胞における操作されたガイドＲＮＡの環化を可能にするリボザイムドメイン及びライゲーションドメイン等のドメインを有する線形ポリヌクレオチドであるように構築することができる。ライゲーションドメイン及びリボザイムドメインを有する線形の操作されたガイドＲＮＡを、細胞へトランスフェクトすることができ、環化することができる。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡは、環状であり得る。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方を含み得る。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡの前駆体は、操作されたガイドＲＮＡの前駆体を含み得る。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡの前駆体を使用して、操作されたガイドＲＮＡを産生することができる。

いくつかの場合において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡ（すなわち、化学修飾されたガイドＲＮＡ）、又は本明細書に記載の操作された化学修飾されたガイドＲＮＡの前駆体（例えば、化学修飾前に操作されたガイドＲＮＡをコードするベクター）は、スペーサードメインを含み得る。いくつかの場合において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡ、又は操作されたガイドＲＮＡの前駆体は、スペーサードメインを含まない。いくつかの実施形態において、標的化ドメインが、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に結合する場合、スペーサードメインは、少なくとも１個のヌクレオチドによって標的化ドメインから分離することができ、スペーサードメインが、標的ＲＮＡに結合する場合、スペーサードメインの結合は、スペーサードメインに結合する標的ＲＮＡの一部分で、標的ＲＮＡの編集を引き起こさない。いくつかの場合において、スペーサードメインが、標的化ドメインの５’末端又は３’末端に隣接し得る場合、スペーサードメインは、標的ＲＮＡに対して相補的でなくてもよい。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡ、又は操作されたガイドＲＮＡの前駆体は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２５００、又は５０００ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡ、又は操作されたガイドＲＮＡの前駆体は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２５００、又は５０００ヌクレオチド長以下である。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡ（例えば、操作されたガイドポリヌクレオチド）、又は操作されたガイドＲＮＡの前駆体は、約２０ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチド、２０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド～約１４０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド～約１６０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド～約２５０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド～約３５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド～約５００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド～約８００ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド～約１２５０ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド～約２０００ヌクレオチド、又は約２０００ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチドを含み得る。

いくつかの実施形態において、スペーサードメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、又はそれより多いヌクレオチドによって、標的化ドメインから分離され得る。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、溶媒に曝露することができる、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、又は両方を含んでいない。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡは、ヒト細胞中に天然に存在するｍＲＮＡよりも加水分解の影響を受けにくい可能性がある二次構造を含み得る。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、例えば、ＲＮＡ編集エンティティを介して、標的ＲＮＡの編集を容易にすることができる。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡは、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、又は両方を含み得ること以外は同等のポリヌクレオチドと比較して、標的ＲＮＡに対する編集効率を少なくとも約９０％増加させることができる。いくつかの実施形態において、編集効率は、標的ＲＮＡを初代細胞株へトランスフェクトすること、操作されたガイドＲＮＡ、及び５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、又は両方を含み得ること以外は同等のポリヌクレオチドを初代細胞株へトランスフェクトすること、並びに標的ＲＮＡを配列決定することによって決定することができる。いくつかの実施形態において、編集効率は、標的ＲＮＡを細胞へトランスフェクトすること、操作されたガイドＲＮＡ、及び５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、又は両方を含み得ること以外は同等のポリヌクレオチドを初代細胞株へトランスフェクトすること、並びに標的ＲＮＡの質量分析によって決定することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集は、標的ＲＮＡを細胞に直接的若しくは間接的に導入する（例えば、トランスフェクトする）ことと、操作されたガイドＲＮＡを細胞に直接的若しくは間接的に導入する（例えば、トランスフェクトする）ことと、標的ＲＮＡを配列決定することと、を含むインビトロアッセイで決定することができる。いくつかの場合において、標的ＲＮＡを細胞にトランスフェクトすることは、標的ＲＮＡをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトすることを含み得る。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡを細胞にトランスフェクトすることは、操作されたガイドＲＮＡの前駆体、又は操作されたガイドＲＮＡの前駆体をコードする操作されたガイドＲＮＡ（例えば、プラスミド）を細胞にトランスフェクトすることを含み得る。いくつかの場合において、配列決定することは、標的ＲＮＡが逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換された後に、標的ＲＮＡのＳａｎｇｅｒ配列決定することを含み得る。いくつかの実施形態において、配列決定することは、ｄｄＰＣＲ産物から実施することができる。

いくつかの場合において、標的化ドメインは、約２０ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、５０ヌクレオチド～約５００ヌクレオチド、又は約４００ヌクレオチド～約１０００ヌクレオチド長の配列長さを有し得る。

いくつかの場合において、標的ＲＮＡは、核ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、又はミトコンドリアＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、遺伝子間ＤＮＡ（ヘテロクロマチンＤＮＡを含むが、これらに限定されない）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、配列の単離されたＤＮＡ、配列の単離されたＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、核酸プローブ、プライマー、ｓｎＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、小さなＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ由来の小さなＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又は小さなｒＤＮＡ由来のＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）を含み得る。

本明細書で提供されるのは、ポリヌクレオチド、及びそれを含む組成物である。ある態様において、ポリヌクレオチドは、操作されたポリヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、操作されたガイドＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡ編集のために、例えば、疾患又は状態を予防又は治療するために利用され得る。

いくつかの場合において、疾患又は状態は、ＡＢＣＡ４、ＡＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＡＰＰ、Ｔａｕ、ＧＢＡ、ＰＩＮＫ１、ＲＡＢ７Ａ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ Ｇ１２２６Ｒ、ＨＦＥ Ｃ２８２Ｙ、ＬＩＰＡ ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ、ＰＣＳＫ９開始部位、又はＳＣＮＮ１Ａ開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせをコードするＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子中の変異と関連する。いくつかの例において、ＡＢＣＡ４、ＡＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＡＰＰ、Ｔａｕ、ＧＢＡ、ＰＩＮＫ１、ＲＡＢ７Ａ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ Ｇ１２２６Ｒ、ＨＦＥ Ｃ２８２Ｙ、ＬＩＰＡ ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ、ＰＣＳＫ９開始部位、又はＳＣＮＮ１Ａ開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせをコードする変異したＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質は、ある疾患の病因又は進行に少なくとも部分的に寄与する。いくつかの例において、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子中の変異は、それ以外は同一の参照ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に対するものである。

いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡを、主題のＲＮＡ編集エンティティと会合した状態で使用して、標的ＲＮＡを編集するか、又は標的ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現を調節することができる。ある実施形態において、本明細書に開示される組成物は、ＡＤＡＲ若しくはＡＤＡＴポリペプチド等の主題のＲＮＡ編集エンティティ、又はそれらの生物学的に活性な断片によって、編集を容易にすることができる操作されたガイドＲＮＡを含み得る。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡ、操作されたガイドＲＮＡ、又は前駆体操作されたガイドＲＮＡは、ステムループ、十字型、トーホールド（ｔｏｅ ｈｏｌｄ）、ミスマッチバルジ、又はこれらの任意の組み合わせを含む二次構造を形成することができる。いくつかの場合において、二次構造は、ステム、ヘアピンループ、シュードノット、バルジ、内部ループ、マルチループ、Ｇ四重鎖、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡ、操作されたガイドＲＮＡ、又は前駆体操作されたガイドＲＮＡは、Ａ形態、Ｂ形態、Ｚ形態、又はこれらの任意の組み合わせを採用し得る。

二次構造を含む操作されたガイドＲＮＡ、操作されたガイドＲＮＡ、又は前駆体は、操作されたガイドＲＮＡが二次構造を含む場合には、二次構造を欠く同等のガイドＲＮＡ又は同等のポリヌクレオチドと比較して、標的ＲＮＡへの結合の親和性を有意に増強し、標的ＲＮＡへの結合の特異性を増強し、標的ＲＮＡの編集の効率を増強し、オフターゲット編集を低減し、非標的ＲＮＡの編集を低減し、ＲＮＡ編集エンティティの動員効率を増強するか、又はこれらの組み合わせであり得る。バルジを含む操作されたガイドＲＮＡ、操作されたガイドＲＮＡ、又は操作されたガイドＲＮＡの前駆体は、バルジを欠く同等のガイドＲＮＡ又は同等のポリヌクレオチドと比較して、標的ＲＮＡへの結合の親和性を有意に増強し、標的ＲＮＡへの結合の特異性を増強し、標的ＲＮＡの編集の効率を増強し、オフターゲット編集を低減し、非標的ＲＮＡの編集を低減し、ＲＮＡ編集エンティティの動員効率を増強するか、又はこれらの組み合わせであり得る。ステムループ、十字型、トーホールド（ｔｏｅ ｈｏｌｄ）、ミスマッチバルジ、ステム、ヘアピンループ、シュードノット、内部ループ、マルチループ、Ｇ四重鎖、又はこれらの任意の組み合わせを含む操作されたガイドＲＮＡ、操作されたガイドＲＮＡ、又は操作されたガイドＲＮＡの前駆体は、ステムループ、十字型、トーホールド（ｔｏｅ ｈｏｌｄ）、ミスマッチバルジ、ステム、ヘアピンループ、シュードノット、内部ループ、マルチループ、Ｇ四重鎖、又はこれらの任意の組み合わせを欠く同等のガイドＲＮＡ又は同等のポリヌクレオチドと比較して、標的ＲＮＡへの結合の親和性を有意に増強し、標的ＲＮＡへの結合の特異性を増強し、標的ＲＮＡの編集の効率を増強し、オフターゲット編集を低減し、非標的ＲＮＡの編集を低減し、ＲＮＡ編集エンティティの動員効率を増強するか、又はこれらの組み合わせであり得る。

ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、Ａｌｕドメイン、ＡＰＯＢＥＣ動員ドメイン、ＧｌｕＲ２ドメイン、ＴＡＬＥＮ動員ドメイン、Ｚｎフィンガーポリペプチド動員ドメイン、メガ－ＴＡＬ動員ドメイン、又はＣａｓ１３動員ドメインの少なくとも約２０ヌクレオチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、Ａｌｕドメインの少なくとも約２０ヌクレオチドに対して少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、Ａｌｕ動員ドメインに対して少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、Ａｌｕドメインの少なくとも約１５、２０、２５、３０、又は３５核酸に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、Ａｌｕドメインコード配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、Ａｌｕドメインコード配列に対して少なくとも約８５％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、Ａｌｕドメインコード配列に対して少なくとも約９０％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、Ａｌｕドメインコード配列に対して少なくとも約９５％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合において、Ａｌｕドメインコード配列は、天然に存在しない配列であり得る。いくつかの実施形態において、Ａｌｕドメインコード配列は、修飾された部分を含み得る。いくつかの場合において、Ａｌｕドメインコード配列は、天然に存在するＡｌｕドメインコード配列の一部分を含み得る。

いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、ＡＰＯＢＥＣドメインの少なくとも約２０ヌクレオチドに対して少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、ＡＰＯＢＥＣ動員ドメインに対して少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、ＡＰＯＢＥＣドメインの少なくとも約１５、２０、２５、３０、又は３５核酸に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、ＡＰＯＢＥＣドメインコード配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、ＡＰＯＢＥＣドメインコード配列に対して少なくとも約８５％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、ＡＰＯＢＥＣドメインコード配列に対して少なくとも約９０％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、ＡＰＯＢＥＣドメインコード配列に対して少なくとも約９５％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合において、ＡＰＯＢＥＣドメインコード配列は、天然に存在しない配列であり得る。いくつかの実施形態において、ＡＰＯＢＥＣドメインコード配列は、修飾された部分を含み得る。いくつかの場合において、ＡＰＯＢＥＣドメインコード配列は、天然に存在するＡＰＯＢＥＣドメインコード配列の一部分を含み得る。

いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、ＧｌｕＲ２ドメインの少なくとも約２０ヌクレオチドに対して少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、ＧｌｕＲ２動員ドメインに対して少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、ＧｌｕＲ２ドメインの少なくとも約１５、２０、２５、３０、又は３５核酸に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、ＧｌｕＲ２ドメインコード配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、ＧｌｕＲ２ドメインコード配列に対して少なくとも約８５％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、ＧｌｕＲ２ドメインコード配列に対して少なくとも約９０％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、ＧｌｕＲ２ドメインコード配列に対して少なくとも約９５％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態において、ＧｌｕＲ２ドメインコード配列は、天然に存在しない配列であり得る。いくつかの場合において、ＧｌｕＲ２ドメインコード配列は、修飾された部分を含み得る。いくつかの実施形態において、ＧｌｕＲ２ドメインコード配列は、天然に存在するＧｌｕＲ２ドメインコード配列の一部分を含み得る。いくつかの場合において、動員ドメインの少なくとも一部分は、ＡＤＡＲを動員するコード配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を含み得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、ＭＳ２－バクテリオファージコートタンパク質動員ドメインに対して少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。

ＲＮＡ編集エンティティは、内因性酵素を含み得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティは、組換え酵素を含み得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティは、融合ポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（「ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ」は、本明細書ではこのように称される）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４、活性化誘導（シチジン）デアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ１ｐ１１０、ＡＤＡＲ１ｐ１５０、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（「ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ」は、本明細書ではこのように称される）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４、活性化誘導（シチジン）デアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ１ｐ１１０、ＡＤＡＲ１ｐ１５０、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、又はこれらの任意の組み合わせに対して少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティは、ウイルスコードＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティは、麻疹、ムンプス、又はパラインフルエンザに由来するウイルスコードＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティは、標的ＲＮＡ中の１つ又は複数のヌクレオチドを付加又は欠失することが可能なＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ由来の酵素であり得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティは、標的ＲＮＡ中のウラシル、又は１つより多いウラシルを付加又は欠失することが可能なＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ由来の酵素であり得る。

操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡ標的化に好適な任意の方式で操作され得る。ある態様において、操作されたガイドＲＮＡは、一般に、標的ＲＮＡのある領域に対してハイブリダイズすることが可能な標的化配列を少なくとも含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的化ドメイン又は標的化領域とも称され得る。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡの標的化配列は、操作されたガイドＲＮＡに、ワトソン－クリック塩基対形成等の塩基対形成によってＲＮＡ配列を標的化することを可能にする。ある実施形態において、標的化配列は、操作されたガイドＲＮＡのＮ末端又はＣ末端のいずれかに位置し得る。いくつかの場合において、標的化配列は、両端に位置する。標的化配列は、任意の長さのものであり得る。いくつかの場合において、標的化配列は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、又は最大約２００ヌクレオチド長である。ある実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、約７５～１００、８０～１１０、９０～１２０、又は９５～１１５ヌクレオチド長である標的化配列を含む。ある実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、操作されたガイドＲＮＡである。

いくつかの場合において、主題の標的化配列は、主題のポリペプチド、例えば、ＲＡＢ７Ａ、ＡＢＣＡ４、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＡＰＰ、Ｔａｕ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ Ｇ１２２６Ｒ、ＨＦＥ Ｃ２８２Ｙ、ＬＩＰＡ ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ、ＰＣＳＫ９開始部位、ＳＣＮＮ１Ａ開始部位、ＧＢＡ、ＰＩＮＫ１、又はＴａｕを少なくとも部分的にコードする標的ＲＮＡのある領域に対して少なくとも部分的な配列相補性を含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的ＲＮＡに対して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列相補性を含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的ＲＮＡ配列に対して１００％未満の相補性を含む。例えば、標的化配列、及び標的化配列によって結合され得る標的ＲＮＡの領域は、単一塩基ミスマッチを有し得る。他の場合において、対象の操作されたガイドＲＮＡの標的化配列は、１つより多いミスマッチを含む。理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載の化学修飾されたガイドポリヌクレオチドは、同等の非修飾ガイドポリヌクレオチドと比較して、より大きな程度のミスマッチを含み得る。例えば、化学修飾されたガイドは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２０、３０、４０、又は最大５０塩基ミスマッチを有し得る。いくつかの態様において、ヌクレオチドミスマッチは、本明細書で提供される構造的特徴と関連し得る。いくつかの態様において、標的化配列は、主題の標的ＲＮＡの野生型ＲＮＡと相補性が異なる少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は最大約１５ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する少なくとも５０ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する５０～１５０ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する５０～２００ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する５０～２５０ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する５０～３００ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的ＲＮＡに対して相補性を有する５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、又は３００ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、合計で５０より多いヌクレオチドを含み、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する少なくとも５０のヌクレオチドを有する。いくつかの場合において、標的化配列は、合計で５０～４００ヌクレオチドを含み、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する５０～１５０ヌクレオチドを有する。いくつかの場合において、標的化配列は、合計で５０～４００ヌクレオチドを含み、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する５０～２００ヌクレオチドを有する。いくつかの場合において、標的化配列は、合計で５０～４００ヌクレオチドを含み、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する５０～２５０ヌクレオチドを有する。いくつかの場合において、標的化配列は、合計で５０～４００ヌクレオチドを含み、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する５０～３００ヌクレオチドを有する。いくつかの場合において、標的ＲＮＡに対して相補性を有する少なくとも５０ヌクレオチドは、１つ以上のミスマッチ、１つ以上のバルジ、又は１つ以上のループ、又はこれらの任意の組み合わせによって分離される。いくつかの場合において、標的ＲＮＡに対して相補性を有する５０～１５０ヌクレオチドは、１つ以上のミスマッチ、１つ以上のバルジ、又は１つ以上のループ、又はこれらの任意の組み合わせによって分離される。いくつかの場合において、標的ＲＮＡに対して相補性を有する５０～２００ヌクレオチドは、１つ以上のミスマッチ、１つ以上のバルジ、又は１つ以上のループ、又はこれらの任意の組み合わせによって分離される。いくつかの場合において、標的ＲＮＡに対して相補性を有する５０～２５０ヌクレオチドは、１つ以上のミスマッチ、１つ以上のバルジ、又は１つ以上のループ、又はこれらの任意の組み合わせによって分離される。いくつかの場合において、標的ＲＮＡに対して相補性を有する５０～３００ヌクレオチドは、１つ以上のミスマッチ、１つ以上のバルジ、又は１つ以上のループ、又はこれらの任意の組み合わせによって分離される。例えば、標的化配列は、合計で５４ヌクレオチドを含み、連続して、２５ヌクレオチドが、標的ＲＮＡに対して相補的であり、４ヌクレオチドがバルジを形成し、２５ヌクレオチドが、標的ＲＮＡに対して相補的である。別の例として、標的化配列は、合計で１１８ヌクレオチドを含み、連続して、２５ヌクレオチドが、標的ＲＮＡに対して相補的であり、４ヌクレオチドがバルジを形成し、２５ヌクレオチドが、標的ＲＮＡに対して相補的であり、１４ヌクレオチドがループを形成し、５０ヌクレオチドが、標的ＲＮＡに対して相補的である。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、表１に示されるような核酸配列に少なくとも部分的に相補的である標的化配列又は標的化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、配列番号１～２と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列相補性である標的化配列又は標的化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、表１に示されるような核酸配列に対して少なくとも部分的に同一である標的化配列又は標的化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、配列番号１～２と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一である標的化配列又は標的化ドメインを含む。

いくつかの態様において、操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含む。ＲＮＡ編集エンティティは、操作されたガイドＲＮＡ上のＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインによって動員され得る。いくつかの場合において、主題の操作されたガイドＲＮＡは、主題の標的ＲＮＡのある領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集、主題の標的ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの調節発現、又はその両方を容易にするように構成される。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡは、主題のＲＮＡ編集エンティティによるＲＮＡのある領域のヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基の編集を容易にするように構成され得る。編集を容易にするために、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡ編集エンティティを動員し得る。特定の実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを欠いている。いずれにせよ、主題の操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡ編集エンティティに結合するか、又はＲＮＡ編集エンティティによって結合されることが可能であり、主題の標的ＲＮＡの編集を容易にする。

様々なＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを利用することができる。ある実施形態において、動員ドメインは、グルタミン酸イオンチャネル型受容体ＡＭＰＡ型サブユニット２（ＧｌｕＲ２）、ＡＰＯＢＥＣ、ＭＳ２－バクテリオファージコートタンパク質動員ドメイン、Ａｌｕ、ＴＡＬＥＮ動員ドメイン、Ｚｎ－フィンガーポリペプチド動員ドメイン、メガ－ＴＡＬ動員ドメイン、又はＣａｓ１３動員ドメイン、これらの組み合わせ、又はこれらの修飾された態様を含む。特定の実施形態において、１つより多い動員ドメインが、本開示の操作されたガイドＲＮＡ中に含まれ得る。動員配列が存在する場合において、動員配列を利用して、標的化配列（例えば、アンチセンス配列）の後の主題の標的ＲＮＡと効果的に反応させるようにＲＮＡ編集エンティティを配置し、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる。いくつかの場合において、動員配列は、操作されたガイドＲＮＡに対するＲＮＡ編集エンティティの一過性の結合を可能にし得る。他の場合において、動員配列は、ポリヌクレオチドに対するＲＮＡ編集エンティティの永続的結合を可能にする。動員配列は、任意の長さのものであり得る。いくつかの場合において、動員配列は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、又は５００ヌクレオチド長である。いくつかの場合において、動員配列は、約４５ヌクレオチド長である。いくつかの場合において、動員配列の少なくとも一部分は、少なくとも１～約７５ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、動員配列の少なくとも一部分は、約４５ヌクレオチド～約６０ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、動員配列の少なくとも一部分は、少なくとも１～約５００ヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、ＧｌｕＲ２配列、又はその機能的断片を含む。いくつかの場合において、ＧｌｕＲ２配列は、ＲＮＡ編集エンティティ、例えば、ＡＤＡＲ又はその生物学的に活性な断片によって認識することができる。いくつかの実施形態において、ＧｌｕＲ２配列は、天然に存在しない配列であり得る。いくつかの場合において、ＧｌｕＲ２配列は、例えば、増強された動員のために修飾され得る。いくつかの実施形態において、ＧｌｕＲ２配列は、天然に存在するＧｌｕＲ２配列及び合成配列の一部分を含み得る。

いくつかの実施形態において、動員ドメインは、ＧｌｕＲ２配列、又はＧＵＧＧＡＡＵＡＧＵＡＵＡＡＣＡＡＵＡＵＧＣＵＡＡＡＵＧＵＵＧＵＵＡＵＡＧＵＡＵＣＣＣＡＣ（配列番号３）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの場合において、動員ドメインは、配列番号３の少なくとも約１０、１５、２０、２５、又は３０ヌクレオチドに対して少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの実施形態において、動員ドメインは、配列番号３に対して少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相同性を含み得る。

追加のＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを本明細書に記載する。いくつかの場合において、動員ドメインは、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集エンティティ、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ドメインを含む。いくつかの場合において、ＡＰＯＢＥＣドメインは、天然に存在しない配列又は天然に存在する配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＰＯＢＥＣドメインコード配列は、修飾された部分を含み得る。いくつかの場合において、ＡＰＯＢＥＣドメインコード配列は、天然に存在するＡＰＯＢＥＣドメインコード配列の一部分を含み得る。別の実施形態において、動員ドメインは、ＭＳ２－バクテリオファージコートタンパク質動員ドメインに由来し得る。別の実施形態において、動員ドメインは、Ａｌｕドメインに由来し得る。いくつかの場合において、動員ドメインは、ＡＰＯＢＥＣ、ＭＳ２－バクテリオファージコートタンパク質動員ドメイン、又はＡｌｕドメインの少なくとも約１５、２０、２５、３０、又は３５ヌクレオチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列相同性を含み得る。

任意の数の動員配列は、本開示のポリヌクレオチド中に見出され得る。いくつかの場合において、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は最大約１０の動員配列が、ポリヌクレオチド中に含まれ得る。動員配列は、主題のポリヌクレオチドの任意の位置に位置し得る。いくつかの場合において、動員配列は、ポリヌクレオチドのＮ末端、中央、又はＣ末端上にある。動員配列は、標的化配列の上流又は下流であり得る。いくつかの場合において、動員配列は、主題のポリヌクレオチドの標的化配列に隣接する。動員配列は、全てのリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含み得るが、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドを両方とも含む動員配列は、いくつかの場合において、除外されない。

動員配列が存在しない場合、操作されたポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡの編集を容易にし、及び／又は主題の標的ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現を調節するために、主題のＲＮＡ編集エンティティ（例えば、ＡＤＡＲ）と依然として会合することが可能な場合がある。このことは、構造的特徴によって達成され得る。構造的特徴は、ミスマッチ、対称バルジ、非対称バルジ、対称内部ループ、非対称内部ループ、ヘアピン、ゆらぎ塩基対、構造化モチーフ、環状化ＲＮＡ、化学修飾、又はこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つを含み得る。ある態様において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質、例えば、ハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成され得る。本開示のｄｓＲＮＡ基質中に存在し得るいくつかの構造的特徴の１つに対応する特徴が本明細書に記載される。特徴の例としては、ミスマッチ、バルジ（対称バルジ若しくは非対称バルジ）、内部ループ（対称内部ループ若しくは非対称内部ループ）、又はヘアピン（非標的化ドメインを含むヘアピン）が挙げられる。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、１～５０個の特徴を有し得る。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５～２０、１～３、４～５、２～１０、２０～４０、１０～４０、２０～５０、３０～５０、４～７、又は８～１０個の特徴を有し得る。

本明細書に開示されるように、構造化モチーフは、ｄｓＲＮＡ基質中に２つ以上の特徴を含む。

二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成され得る。本明細書で開示されるように、ミスマッチは、ｄｓＲＮＡ内の標的ＲＮＡ中の対向するヌクレオチドに対して対形成していないガイドＲＮＡ中のヌクレオチドを指し得る。ミスマッチは、塩基対を形成しないか、相補的ではないか、又は両方である任意の２つのヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、Ａ／Ｃミスマッチである。Ａ／Ｃミスマッチは、標的ＲＮＡ中のＡと対向する本開示の操作されたガイドＲＮＡ中にＣを含み得る。Ａ／Ｃミスマッチは、標的ＲＮＡ中のＣと対向する本開示の操作されたガイドＲＮＡ中にＡを含み得る。ある実施形態において、Ｇ／Ｇミスマッチは、標的ＲＮＡ中のＧと対向する本開示の操作されたガイドＲＮＡ中にＧを含み得る。いくつかの実施形態において、編集部位の５’に配置されるミスマッチは、編集される標的Ａの塩基フリッピングを容易にし得る。ミスマッチは、配列特異性を付与するのにも役立ち得る。ある実施形態において、ミスマッチは、Ｇ／Ｇミスマッチを含む。ある実施形態において、ミスマッチは、Ａ／Ｃミスマッチを含み、Ａは標的ＲＮＡ中にあり、Ｃは、操作されたポリヌクレオチドの標的化配列中にある。別の実施形態において、Ａ／Ｃミスマッチ中のＡは、主題のＲＮＡ編集エンティティによって編集される標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基である。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡは、少なくとも１つのミスマッチを有し得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡは、１つのミスマッチを有し得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡは、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｇ、Ｕ／Ｃ、Ｕ／Ｇ、Ｃ／Ａ、Ｃ／Ｕ、Ｇ／Ａ、Ｇ／Ｕミスマッチ、又はこれらの任意の組み合わせを有し得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡは、Ａ／Ｃミスマッチを有し得る。いくつかの実施形態において、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｇ、Ｃ／Ａ、又はＧ／Ａ中のＡは、ＲＮＡ編集エンティティによって修飾され得る。他の場合において、Ａ／Ｃ、Ｃ／Ａ、Ｃ／Ｕ、又はＵ／Ｃ中のＣは、ＲＮＡ編集エンティティによって修飾され得る。他の場合において、Ｕ／Ｃ、Ｃ／Ｕ、Ｇ／Ｕ、又はＵ／Ｇ中のＵは、ＲＮＡ編集エンティティによって修飾され得る。他の場合において、Ｕ／Ｇ、Ｇ／Ｕ、Ｇ／Ａ、又はＡ／Ｇ中のＧは、ＲＮＡ編集エンティティによって修飾され得る。いくつかの実施形態において、Ａ／Ｃミスマッチ中のＡは、ＲＮＡ編集エンティティによって修飾され得る。かかる修飾は、任意の修飾、例えば、本明細書に記載される任意のＲＮＡ編集エンティティによって誘導される化学修飾を含むことができる。ある実施形態において、修飾は、標的ＲＮＡ中のミスマッチを、それ以外は同等のＷＴ ＲＮＡ中に存在する残基に戻す。

いくつかの実施形態は、ミスマッチを含む操作されたガイドＲＮＡに関する。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ミスマッチを形成するヌクレオチドの第１の側（例えば、ミスマッチに対して５’である側、又はミスマッチに対して３’である側）に非修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ミスマッチを形成するヌクレオチドのいずれかの側に非修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ミスマッチを形成するヌクレオチドに対向するヌクレオチドの第１の側（例えば、ミスマッチに対して５’であり、ミスマッチに対向する側、又はミスマッチに対して３’であり、ミスマッチに対向する側）に非修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ミスマッチを形成するヌクレオチドに対向するヌクレオチドのいずれかの側に非修飾ヌクレオチドを含む。

いくつかの態様において、操作されたガイドＲＮＡは、タイリングを含む方法を利用して設計することができる。例えば、操作されたガイドＲＮＡは、主題の標的ＲＮＡの核酸又はポリペプチドに対してタイリングされている複数の候補の操作されたガイドＲＮＡから選択することができる。ある実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ＡＰＰ、ＳＮＣＡ、及び／又はＴａｕ等の主題の標的ＲＮＡの核酸又はポリペプチドに対してタイリングされている操作されたガイドＲＮＡの群から選択することができる。いくつかの場合において、タイリングは、主題の標的の調節要素にわたって、操作されたガイドＲＮＡをタイリングすることを含み得る。いくつかの場合において、タイリングは、ポリ（Ａ）テール、マイクロＲＮＡ応答要素（ＭＲＥ）、ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又は主題の標的配列のこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つにわたって、操作されたガイドＲＮＡをタイリングすることを含み得る。

いくつかの態様において、標的ＲＮＡ又は核酸に対してタイリングされる操作されたガイドＲＮＡは、本明細書に記載の方法において使用するためにプールすることができる。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡは、単一のアッセイにおいて標的を検出するためにプールすることができる。単一の標的に対してタイリングされる操作されたガイドＲＮＡのプールは、本明細書に記載の方法を使用して、標的ＲＮＡの検出を増強することができる。タイリングは、例えば、標的核酸又は標的ポリペプチドに沿って、連続的であり得る。場合によっては、タイリングは、標的核酸又は標的ＲＮＡに沿って重複していてもよい。いくつかの場合において、タイリングは、標的核酸又は標的ＲＮＡに沿ってタイリングされた操作されたガイドＲＮＡの間のギャップを含む。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡのタイリングは、非連続的であり得る。多くの場合、標的核酸及び／又は標的ＲＮＡを検出するための方法は、標的核酸又は標的ＲＮＡを、操作されたガイドＲＮＡ及びＲＮＡ編集エンティティ及び／又はヌクレアーゼのプールに接触することであって、操作されたガイドＲＮＡのプールのうちの操作されたガイドＲＮＡは、標的の配列に対する標的化配列を含む、接触することと、編集のためにアッセイすることと、を含み得る。

ある態様において、構造的特徴は、独立して、操作されたポリヌクレオチド中に形成し得る。他の場合において、構造的特徴は、操作されたポリヌクレオチドが標的ＲＮＡに結合するときに形成し得る。構造的特徴は、操作されたポリヌクレオチドが、ペプチド、ヌクレオチド、又は小分子等の他の分子と会合するときにも形成し得る。特定の実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの構造的特徴は、標的ＲＮＡとは独立して形成することができ、その構造は、標的ＲＮＡ領域との操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの結果として変化し得る。特定の実施形態において、構造的特徴は、操作されたポリヌクレオチドが標的ＲＮＡと会合しているときに存在する。

いくつかの場合において、構造的特徴は、ヘアピンである。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、ヘアピンドメインを欠いていてもよい。他の場合において、操作されたポリヌクレオチドは、１個のヘアピンドメイン、又は１個より多いヘアピンドメインを含有し得る。ヘアピンは、ポリヌクレオチド中の任意の場所に位置し得る。本明細書に開示されるように、ヘアピンは、単一のＲＮＡ鎖がそれ自体で折り畳まれてＲＮＡ二本鎖を形成する、ＲＮＡ二本鎖であり得る。一本鎖ＲＮＡ鎖は、互いに対して折り畳み領域塩基対の上流及び下流にヌクレオチド配列を有することに起因して、それ自体で折り畳まれる。ヘアピンは、二本鎖構造全体が１０～５００ヌクレオチド長を有し得る。ヘアピンのステムループ構造は、３～１５ヌクレオチド長であり得る。ヘアピンは、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドのいずれかに存在し得る。本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、１～１０個のヘアピンを有し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、１個のヘアピンを有する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、２個のヘアピンを有する。本明細書に開示されるように、ヘアピンは、動員ヘアピン又はヘアピン又は非動員ヘアピンを指し得る。ヘアピンは、本開示の操作されたポリヌクレオチド内の任意の場所に位置し得る。いくつかの実施形態において、１つ以上のヘアピンは、本開示の操作されたポリヌクレオチドの３’末端に、本開示の操作されたポリヌクレオチドの５’末端に、又は本開示の操作されたポリヌクレオチドの標的化配列内に、又はこれらの任意の組み合わせに存在する。

態様において、構造的特徴は、本明細書に開示されるように、動員ヘアピンを含む。動員ヘアピンは、ＡＤＡＲ等のＲＮＡ編集エンティティを動員し得る。いくつかの実施形態において、動員ヘアピンは、ＧｌｕＲ２ドメインを含む。いくつかの実施形態において、動員ヘアピンは、Ａｌｕドメインを含む。

更に別の態様において、構造的特徴は、非動員ヘアピンを含む。非動員ヘアピンは、本明細書に開示されるように、標的ＲＮＡに対する操作されたポリヌクレオチドの局在化を改善する機能性を示し得る。いくつかの実施形態において、非動員ヘアピンは、核保持性を改善する。いくつかの実施形態において、非動員ヘアピンは、Ｕ７ ｓｎＲＮＡ由来のヘアピンを含む。

別の態様において、構造的特徴は、ゆらぎ塩基を含む。ゆらぎ塩基対は、弱く対形成する２つの塩基を指し得る。例えば、本開示のゆらぎ塩基対は、Ｕと対形成したＧを指してもよい。

本開示のヘアピンは、任意の長さのものであり得る。ある態様において、ヘアピンは、約５～２００個、又はそれより多くのヌクレオチドであり得る。いくつかの場合において、ヘアピンは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、又は４００個、又はそれより多くのヌクレオチドを含み得る。他の場合において、ヘアピンはまた、５～１０、５～２０、５～３０、５～４０、５～５０、５～６０、５～７０、５～８０、５～９０、５～１００、５～１１０、５～１２０、５～１３０、５～１４０、５～１５０、５～１６０、５～１７０、５～１８０、５～１９０、５～２００、５～２１０、５～２２０、５～２３０、５～２４０、５～２５０、５～２６０、５～２７０、５～２８０、５～２９０、５～３００、５～３１０、５～３２０、５～３３０、５～３４０、５～３５０、５～３６０、５～３７０、５～３８０、５～３９０、又は５～４００個のヌクレオチドを含み得る。ヘアピンは、ヌクレオチドループによって分離された二本鎖ハイブリダイズされたＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡモチーフ／構造へとハイブリダイズするために、自身に対して十分な相補性を有するＲＮＡの一本鎖から形成される構造的特徴であり得る。

いくつかの場合において、構造的特徴は、バルジであり得る。バルジは、標的鎖と操作されたポリヌクレオチド鎖との間の単一の（意図的な）核酸ミスマッチを含み得る。他の場合において、鎖間の１個より多い連続ミスマッチは、バルジ領域（塩基のミスマッチ伸長部）が、ハイブリダイズされた相補的ｄｓＲＮＡ領域の両側に隣接し得る限り、バルジを構成する。バルジは、ポリヌクレオチドの任意の位置に位置し得る。いくつかの場合において、バルジは、５’ヒドロキシル又は３’ヒドロキシルから約３０～約７０ヌクレオチドに位置し得る。

ある実施形態において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成され得る。本明細書に開示されるように、バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の形成時に形成される構造を指してもよく、操作されたポリヌクレオチド又は標的ＲＮＡのいずれかの中のヌクレオチドは、対向する鎖上のそれらの位置的な対応物に対して相補的ではない。バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の二次構造又は三次構造を変化させ得る。バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側、又はｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側に１～４個のヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、２個のバルジを有する。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、３個のバルジを有する。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、４個のバルジを有する。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ基質中のバルジの存在は、標的ＲＮＡ中の標的Ａを選択的に編集し、非標的のオフターゲット編集を低減するようにＡＤＡＲを配置し得る。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ基質中のバルジの存在は、追加のＡＤＡＲを動員し得る。本明細書に開示されるｄｓＲＮＡ基質中のバルジは、他のＲＮＡ編集エンティティ等の他のタンパク質を動員し得る。いくつかの実施形態において、編集部位の５’に配置されるバルジは、編集される標的Ａの塩基フリッピングを容易にし得る。バルジは、配列特異性を付与するのにも役立ち得る。バルジは、標的Ａの選択的な編集をもたらす方向に制約することによって、ＡＤＡＲ編集を指示するのに役立ち得る。いくつかの実施形態において、標的Ａの選択的な編集は、標的Ａを２つのバルジ間に配置する（例えば、操作されたポリヌクレオチドに基づいて、５’末端バルジと３’末端バルジとの間に配置される）ことによって達成される。いくつかの実施形態において、２つのバルジは、両方とも対称バルジである。いくつかの実施形態において、２つのバルジは各々、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある２個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドとによって形成される。いくつかの実施形態において、２つのバルジは各々、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある３個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドとによって形成される。いくつかの実施形態において、２つのバルジは各々、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある４個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成される。いくつかの実施形態において、標的Ａは、２つのバルジ間に配置されており、バルジから（例えば、５’末端バルジ又は３’末端バルジから）少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、又は４００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、追加の構造的特徴は、バルジ間（例えば、５’末端バルジと３’末端バルジとの間）に位置する。いくつかの実施形態において、バルジ中のミスマッチは、標的ＲＮＡ中で編集するためのヌクレオチド塩基を含む（例えば、バルジ中のＡ／Ｃミスマッチは、操作されたポリヌクレオチド中のバルジの一部分が、標的ＲＮＡ中のバルジの一部分中のＡに対してミスマッチしたＣを含み、Ａが編集される）。

ある態様において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成され得る。バルジは、対称バルジ又は非対称バルジであり得る。バルジは、ｄｓＲＮＡ基質のガイドＲＮＡ側又は標的ＲＮＡ側のいずれかにある１～４個の参加するヌクレオチドによって形成され得る。対称バルジは、バルジの各々の側に同数のヌクレオチドが存在し得るときに形成され得る。対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側、又はｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側に２～４個のヌクレオチドを有し得る。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質中の対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側及び標的ＲＮＡ側に同数のヌクレオチドを有し得る。本開示の対称バルジは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある２個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称バルジは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある３個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称バルジは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある４個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成され得る。

二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成され得る。バルジは、対称バルジ又は非対称バルジであり得る。非対称バルジは、バルジの各々の側に異なる数のヌクレオチドが存在し得るときに形成され得る。非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質のガイドＲＮＡ側又は標的ＲＮＡ側のいずれかに１～４個の参加するヌクレオチドを有し得る。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質中の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側又は標的ＲＮＡ側に異なる数のヌクレオチドを有し得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある１個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある１個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある１個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある１個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成され得る。いくつかの実施形態において、非対称バルジは、標的Ａの編集の効率を増加させる。いくつかの実施形態において、標的Ａの編集の効率を増加させる非対称バルジは、操作されたポリヌクレオチドの配列におけるアデノシンの数を低減させるように形成される非対称バルジである。標的Ａの編集効率を高める非対称バルジの非限定的な例は、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１個のヌクレオチドとによって形成される非対称バルジ、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドとによって形成される非対称バルジ、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドとによって形成される非対称バルジ、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成される非対称バルジ、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドとによって形成される非対称バルジ、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドとによって形成される非対称バルジ、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成される非対称バルジ、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある２個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドとによって形成される非対称バルジ、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある２個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成される非対称バルジ、及びｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある３個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成される非対称バルジである。

いくつかの場合において、構造的特徴は、ループであり得る。ループは、ハイブリダイズされない２つ以上のヌクレオチド（ｎｔ）で構成されてもよいが、それに代えて、ループは、ハイブリダイズされたＲＮＡによって両側で隣接されてもよく、ハイブリダイズされていないヌクレオチドの拡張された「ループ」が押し出される。標的ｍＲＮＡに対してハイブリダイズした操作されたガイドＲＮＡの場合において、ループは、２つの鎖のうちの１つによって形成されてもよく、編集ランドスケープが変化する。ループはまた、ヘアピンの末端に形成されてもよく、ループは、ＲＮＡの一本鎖からのハイブリダイズされたＲＮＡと共に、両側に隣接していてもよい。そのようなループ構造は、ループ構造を形成することができる人工ＲＮＡ配列、ループ構造を形成することができる人工配列、又は細胞中に常在する編集エンティティのために既知の基質ＲＮＡから得られたＲＮＡ配列から生じ得る。

ある態様において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成され得る。本明細書に開示されるように、内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の形成時に形成される構造を指してもよく、操作されたポリヌクレオチド又は標的ＲＮＡのいずれかの中のヌクレオチドは、対向する鎖上のそれらの位置的な対応物に対して相補的ではなく、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側又は操作されたポリヌクレオチド側のいずれかにある、内部ループの一方の側は、５個より多いヌクレオチドを有する。編集部位の近傍に存在する内部ループは、編集される標的ＲＮＡ中の標的Ａの塩基フリッピングに役立ち得る。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成される。内部ループは、対称内部ループ又は非対称内部ループであり得る。いくつかの実施形態において、標的Ａの選択的な編集は、標的Ａを２つのループ間に配置する（例えば、操作されたポリヌクレオチドに基づいて、５’末端ループと３’末端ループとの間に配置される）ことによって達成される。いくつかの実施形態において、２つのループは、両方とも対称ループである。いくつかの実施形態において、２つのループは各々、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドとによって形成される。いくつかの実施形態において、２つのループは各々、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある６個のヌクレオチドとによって形成される。いくつかの実施形態において、２つのループは各々、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある７個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７個のヌクレオチドとによって形成される。いくつかの実施形態において、２つのループは各々、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある８個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８個のヌクレオチドとによって形成される。いくつかの実施形態において、２つのループは各々、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある９個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある９個のヌクレオチドとによって形成される。いくつかの実施形態において、２つのループは各々、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０個のヌクレオチドとによって形成される。いくつかの実施形態において、標的Ａは、２つのループ間に配置されており、ループから（例えば、５’末端ループ又は３’末端ループから）少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、又は４００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、追加の構造的特徴は、ループ間（例えば、５’末端ループと３’末端ループとの間）に位置する。いくつかの実施形態において、ループ中のミスマッチは、標的ＲＮＡ中で編集するためのヌクレオチド塩基を含む（例えば、ループ中のＡ／Ｃミスマッチは、操作されたポリヌクレオチド中のバルジの一部分が、標的ＲＮＡ中のループの一部分中のＡに対してミスマッチしたＣを含み、Ａが編集される）。

対称内部ループは、内部ループの各々の側に同数のヌクレオチドが存在するときに形成される。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質中の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側及び標的ＲＮＡ側に同数のヌクレオチドを有し得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある６個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある７個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある８個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある９個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある９個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０個のヌクレオチドとによって形成され得る。ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側又は操作されたポリヌクレオチド側のいずれかにある、内部ループの一方の側は、５～１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１２０、１３５、１４０、１４５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００個のヌクレオチド、又はその間の任意の数のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、１０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、１５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、２０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、２５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、３０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、３５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、４０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、４５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、５５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、６０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、６５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、７０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、７５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、８０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、８５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、９０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、９５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、１００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、１１０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、１２０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、１３０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、１４０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、２００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、２５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、３００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、３５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、４００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、４５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、５００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、６００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、７００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、８００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、９００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループは、対称内部ループ又は非対称内部ループであり得る。編集部位の近傍に存在する内部ループは、編集される標的ＲＮＡ中の標的Ａの塩基フリッピングに役立ち得る。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成される。内部ループは、対称内部ループ又は非対称内部ループであり得る。対称内部ループは、内部ループの各々の側に同数のヌクレオチドが存在するときに形成される。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質中の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側及び標的ＲＮＡ側に同数のヌクレオチドを有し得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある５～１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５～１５０個のヌクレオチドとによって形成されてもよく、ヌクレオチドの数は、ｄｓＲＮＡ標的の操作された側及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側で同じである。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある５～１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５～１０００個のヌクレオチドとによって形成されてもよく、ヌクレオチドの数は、ｄｓＲＮＡ標的の操作された側及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側で同じである。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある６個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある７個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある８個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある９個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある９個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある２０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある３０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある４０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある６０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある６０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある７０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある８０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある９０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある９０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１１０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１１０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１２０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１２０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１３０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１３０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１４０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１４０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある２００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある２５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある３００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある３５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある４００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオ

チド側にある４５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある５００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある６００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある６００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある７００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある８００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある９００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある９００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０００個のヌクレオチドとによって形成され得る。

ある態様において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成される。内部ループは、対称内部ループ又は非対称内部ループであり得る。非対称内部ループは、内部ループの各々の側に異なる数のヌクレオチドが存在するときに形成される。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質中の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側及び標的ＲＮＡ側に異なる数のヌクレオチドを有し得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５～１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５～１５０個のヌクレオチドとによって形成されてもよく、ヌクレオチドの数は、ｄｓＲＮＡ標的の操作された側で、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側でのヌクレオチドの数とは異なる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５～１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５～１０００個のヌクレオチドとによって形成されてもよく、ヌクレオチドの数は、ｄｓＲＮＡ標的の操作された側で、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側でのヌクレオチドの数とは異なる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある６個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある６個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある７個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある８個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある９個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある９個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある７個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある８個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある９個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある９個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある７個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある８個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある７個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある９個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある９個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある７個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある８個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある９個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある９個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある８個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある９個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある９個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある２００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある３００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある４００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある２００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある３００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある

４００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある２００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある３００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある４００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある２００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある３００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある４００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある３００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある４００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある２００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある２００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある２００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある２００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある４００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある３００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある３００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある３００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある４００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある４００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５００個のヌクレオチドとによって形成され得る。いくつかの実施形態において、非対称ループは、標的Ａの編集の効率を増加させる。いくつかの実施形態において、標的Ａの編集の効率を増加させる非対称ループは、操作されたポリヌクレオチドの配列におけるアデノシンの数を低減させるように形成される非対称バルジである。標的Ａの編集効率を高める非対称ループの非限定的な例は、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２０個のヌクレオチドとによって形成される非対称ループ、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドとによって形成される非対称バルジ、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある６０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８０個のヌクレオチドとによって形成される非対称バルジ、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１８個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２４個のヌクレオチドとによって形成される非対称バルジ、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオ

チド側にある１００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５０個のヌクレオチドとによって形成される非対称バルジ、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある７０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７５個のヌクレオチドとによって形成される非対称バルジ、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある８個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５個のヌクレオチドとによって形成される非対称バルジ、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある４５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４６個のヌクレオチドとによって形成される非対称バルジ、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある４５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドとによって形成される非対称バルジ、及びｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある７個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５個のヌクレオチドとによって形成される非対称バルジである。

バルジ又はループを含む構造的特徴は、任意のサイズのものであり得る。いくつかの場合において、バルジ又はループは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００個の塩基を含む。いくつかの場合において、バルジ又はループは、全体で少なくとも約１～１０、５～１５、１０～２０、１５～２５、２０～３０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１～７０、１～８０、１～９０、１～１００、１～１１０、１～１２０、１～１３０、１～１４０、１～１５０、１～２００、１～２５０、１～３００、１～３５０、１～４００、１～４５０、１～５００、１～６００、１～７００、１～８００、１～９００、１～１０００、２０～５０、２０～６０、２０～７０、２０～８０、２０～９０、２０～１００、２０～１１０、２０～１２０、２０～１３０、２０～１４０、２０～１５０、１～２００、１～２５０、１～３００、１～３５０、１～４００、１～４５０、１～５００、１～６００、１～７００、１～８００、１～９００、１～１０００、３０～４０、３０～５０、３０～６０、３０～７０、３０～８０、３０～９０、３０～１００、３０～１１０、３０～１２０、３０～１３０、３０～１４０、３０～１５０、３０～２００、３０～２５０、３０～３００、３０～３５０、３０～４００、３０～４５０、３０～５００、３０～６００、３０～７００、３０～８００、３０～９００、３０～１０００、４０～５０、４０～６０、４０～７０、４０～８０、４０～９０、４０～１００、４０～１１０、４０～１２０、４０～１３０、４０～１４０、４０～１５０、４０～２００、４０～２５０、４０～３００、４０～３５０、４０～４００、４０～４５０、４０～５００、４０～６００、４０～７００、４０～８００、４０～９００、４０～１０００、５０～６０、５０～７０、５０～８０、５０～９０、５０～１００、５０～１１０、５０～１２０、５０～１３０、５０～１４０、５０～１５０、５０～２００、５０～２５０、５０～３００、５０～３５０、５０～４００、５０～４５０、５０～５００、５０～６００、５０～７００、５０～８００、５０～９００、５０～１０００、６０～７０、６０～８０、６０～９０、６０～１００、６０～１１０、６０～１２０、６０～１３０、６０～１４０、６０～１５０、６０～２００、６０～２５０、６０～３００、６０～３５０、６０～４００、６０～４５０、６０～５００、６０～６００、６０～７００、６０～８００、６０～９００、６０～１０００、７０～８０、７０～９０、７０～１００、７０～１１０、７０～１２０、７０～１３０、７０～１４０、７０～１５０、７０～２００、７０～２５０、７０～３００、７０～３５０、７０～４００、７０～４５０、７０～５００、７０～６００、７０～７００、７０～８００、７０～９００、７０～１０００、８０～９０、８０～１００、８０～１１０、８０～１２０、８０～１３０、８０～１４０、８０～１５０、８０～２００、８０～２５０、８０～３００、８０～３５０、８０～４００、８０～４５０、８０～５００、８０～６００、８０～７００、８０～８００、８０～９００、８０～１０００、９０～１００、９０～１１０、９０～１２０、９０～１３０、９０～１４０、９０～１５０、９０～２００、９０～２５０、９０～３００、９０～３５０、９０～４００、９０～４５０、９０～５００、９０～６００、９０～７００、９０～８００、９０～９００、９０～１０００、１００～１１０、１００～１２０、１００～１３０、１００～１４０、１００～１５０、１００～２００、１００～２５０、１００～３００、１００～３５０、１００～４００、１００～４５０、１００～５００、１００～６００、１００～７００、１００～８００、１００～９００、１００～１０００、１１０～１２０、１１０～１３０、１１０～１４０、１１０～１５０、１１０～２００、１１０～２５０、１１０～３００、１１０～３５０、１１０～４００、１１０～４５０、１１０～５００、１１０～６００、１１０～７００、１１０～８００、１１０～９００、１１０～１０００、１２０～１３０、１２０～１４０、１２０～１５０、１２０～２００、１２０～２５０、１２０～３００、１２０～３５０、１２０～４００、１２０～４５０、１２０～５００、１２０～６００、１２０～７００、１２０～８００、１２０～９００、１２０～１０００、１３０～１４０、１３０～１５０、１３０～２００、１３０～２５０、１３０～３００、１３０～３５０、１３０～４００、１３０～４５０、１３０～５００、１３０～６００、１３０～７００、１３０～８００、１３０～９００、１３０～１０００、１４０～１５０、１４０～２００、１４０～２５０、１４０～３００、１４０～３５０、１４０～４００、１４０～４５０、１４０～５００、１４０～６００、１４０～７００、１４０～８００、１４０～９００、１４０～１０００、１５０～２００、１５０～２５０、１５０～３００、１５０～３５０、１５０～４００、１５０～４５０、１５０～５００、１５０～６００、１５０～７００、１５０～８００、１５０～９００、１５０～１０００、２００～２５０、２００～３００、２００～３５０、２００～４００、２００～４５０、２００～５００、２００～６００、２００～７００、２００～８００、２００～９００、２００～１０００、２５０～３００、２５０～３５０、２５０～４００、２５０～４５０、２５０～５００、２５０～６００、２５０～７００、２５０～８００、２５０～９００、２５０～１０００、３００～３５０、３００～４００、３００～４５０、３００～５００、３００～６００、３００～７００、３００～８００、３００～９００、３００～１０００、３５０～４００、３５０～４５０、３５０～５００、３５０～６００、３５０～７００、３５０～８００、３５０～９００、３５０～１０００、４００～４５０、４００～５００、４００～６００、４００～７００、４００～８００、４００～９００、４００～１０００、５００～６００、５００～７００、５００～８００、５００～９００、５００～１０００、６００～７００、６００～８００、６００～９００、６００～１０００、７００～８００、７００～９００、７００～１０００、８００～９００、８００～１０００、又は９００～１０００個の塩基を含む。

いくつかの場合において、構造的特徴は、構造化モチーフであり得る。本明細書に開示されるように、構造化モチーフは、ｄｓＲＮＡ基質中に２つ以上の構造的特徴を含む。構造化モチーフは、正確な位置でのＡＤＡＲ編集のための理想的な基質を生成するために、上述の請求項等の構造的特徴の任意の組み合わせで構成され得る。これらの構造モチーフは、最大化されたＡＤＡＲ編集のために人工的に操作することができ、及び／又はこれらの構造モチーフは、既知のＡＤＡＲ基質を反復するようにモデル化することができる。

いくつかの場合において、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、環化されてもよく、又は環状構成であってもよい。いくつかの態様において、少なくとも部分的に環状のポリヌクレオチドは、５’ヒドロキシル又は３’ヒドロキシルを欠いている。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、一緒に共有結合された複数の糖及びリン酸部分を含む骨格を含み得る。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡの骨格は、ＤＮＡ中のデオキシリボース又はＲＮＡ中のリボースの５’炭素上のリン酸基中の第１のヒドロキシル基と、ＤＮＡ中のデオキシリボース又はＲＮＡ中のリボースの３’炭素上の第２のヒドロキシル基との間にホスホジエステル結合連結を含み得る。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡの骨格は、溶媒に曝露することができる、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、又は両方を欠いていてもよい。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡの骨格は、ヌクレアーゼに曝露することができる、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、又は両方を欠いていてもよい。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡの骨格は、加水分解酵素に曝露することができる、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、又は両方を欠いていてもよい。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡの骨格は、他方のヌクレオチドの後に一方のヌクレオチドを有する環状二次元形式でのポリヌクレオチド配列として表すことができる。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡの骨格は、他方のヌクレオチドの後に一方のヌクレオチドを有するループ状二次元形式でのポリヌクレオチド配列として表すことができる。いくつかの場合において、５’ヒドロキシル、３’ヒドロキシル、又はその両方が、リン－酸素結合によって連結され得る。いくつかの場合において、５’ヒドロキシル、３’ヒドロキシル、又はその両方が、リン含有部分を有するホスホエステルへと修飾され得る。

本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、任意の頻度の塩基を有し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１～５％、３～８％、５～１２％、１０～１５％、８～２０％、１５～２５％、２０～３０％、２５～３５％、又は最大で約３０～４０％のアデニン率を有し得る。ポリヌクレオチドは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１～５％、３～８％、５～１２％、１０～１５％、８～２０％、１５～２５％、２０～３０％、２５～３５％、又は最大で約３０～４０％のシトシン率を有し得る。ポリヌクレオチドは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１～５％、３～８％、５～１２％、１０～１５％、８～２０％、１５～２５％、２０～３０％、２５～３５％、又は最大で約３０～４０％のチミン率を有し得る。ポリヌクレオチドは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１～５％、３～８％、５～１２％、１０～１５％、８～２０％、１５～２５％、２０～３０％、２５～３５％、又は最大で約３０～４０％のグアニン率を有し得る。ポリヌクレオチドは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１～５％、３～８％、５～１２％、１０～１５％、８～２０％、１５～２５％、２０～３０％、２５～３５％、又は最大で約３０～４０％のウラシル率を有し得る。

いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡは、修飾後に品質管理を受けることができる。いくつかの場合において、品質管理は、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ＭＳ、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドの質量を決定することができる。質量は、ＬＣ－ＭＳアッセイによって決定することができる。質量は、３０，０００ａｍｕ、５０，０００ａｍｕ、７０，０００ａｍｕ、９０，０００ａｍｕ、１００，０００ａｍｕ、１２０，０００ａｍｕ、１５０，０００ａｍｕ、１７５，０００ａｍｕ、２００，０００ａｍｕ、２５０，０００ａｍｕ、３００，０００ａｍｕ、３５０，０００ａｍｕ、４００，０００ａｍｕから、約５００，０００ａｍｕまでであり得る。質量は、ポリヌクレオチドのナトリウム塩の質量であってもよい。

いくつかの場合において、ポリヌクレオチドのエンドトキシンレベルを決定することができる。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、３ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、１０ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、８ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、５ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、４ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、３ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、２ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、１ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、０．５ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。

いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡは、無菌試験を受けることができる。無菌試験の臨床的／治療的に許容されるレベルは、０であり得るか、又は培養物上の成長がないことによって示され得る。無菌試験の臨床的／治療的に許容されるレベルは、０．５％成長未満であり得る。無菌試験の臨床的／治療的に許容されるレベルは、１％成長未満であり得る。

いくつかの場合において、動員配列を含む操作されたガイドＲＮＡのうちのいずれか１つは、本明細書に記載の構造的特徴も含み得る。

また、線形の操作されたガイドＲＮＡも提供される。線形の操作されたガイドＲＮＡは、本明細書で提供される構造的特徴を実質的に欠いていてもよい。例えば、線形ポリヌクレオチドは、構造的特徴を欠いていてもよく、又は約２個未満の構造的特徴若しくは部分構造を有していてもよい。部分構造は、本明細書に記載の構造的特徴を達成するために必要とされる塩基の一部分を含み得る。いくつかの場合において、線形の操作されたガイドＲＮＡは、標的核酸（例えば、標的ＲＮＡ）に結合すると、本明細書に記載の少なくとも１つの構造的特徴を形成する。いくつかの場合において、少なくとも１つの構造的特徴の形成は、標的核酸の編集のために、核酸編集エンティティ（例えば、ＲＮＡ編集エンティティ）を標的核酸に動員する。他の場合において、線形の操作されたガイドＲＮＡは、５’ヒドロキシル、３’ヒドロキシル、又はその両方のうちのいずれか１つを含み得る。これらのうちのいずれか１つは、溶媒に曝露され、線形を維持することができる。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作された骨格を含み得る。いくつかの実施形態において、操作された骨格は、構造的なループ安定化骨格であり得る。いくつかの場合において、構造的なループ安定化骨格は、ＲＮＡ構造等の核酸構造を含む。いくつかの実施形態において、構造的なループ安定化骨格は、二次ＲＮＡ構造、三次ＲＮＡ構造、四次構造、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの場合において、構造的なループ安定化骨格は、ＲＮＡアプタマーの構造を含む。いくつかの場合において、構造的なループ安定化骨格は、任意のＲＮＡ種（例えば、リボソームＲＮＡ、調節ＲＮＡ、又はｔＲＮＡ）の構造を含む。いくつかの場合において、構造的なループ安定化骨格は、リボヌクレオチド鎖の５’末端の複数のリボヌクレオチド、リボヌクレオチド鎖の３’末端の最後の４個のリボヌクレオチドの前にある複数のリボヌクレオチドで構成されるアクセプターステムを含む二次構造を含み、したがって、複数のリボヌクレオチドの対を含む二本鎖構造を形成する。いくつかの場合において、リボヌクレオチド鎖の５’末端のリボヌクレオチドによって構築されるリボヌクレオチド、及びリボヌクレオチド鎖の３’末端の最後の４個のリボヌクレオチドに先行するリボヌクレオチドは、対形成することができない。構造的なループ安定化骨格は、リボヌクレオチド鎖の５’末端の複数のリボヌクレオチドに続くリボヌクレオチド鎖の一部分の折り畳みによって形成される、複数のリボヌクレオチドの対を含むＤアームと、１～１００個のリボヌクレオチドを含むＤループと、を含む二次構造を更に含み得る。いくつかの実施形態において、構造的なループ安定化骨格は、Ｄアーム及びＤループに続くリボヌクレオチド鎖の一部分の折り畳みによって形成される、ｔＲＮＡのアンチコドン領域の等価物であり得るステムと、ｔＲＮＡのアンチコドン領域のループと（アンチコドンのステム－ループ）を含む二次構造を含む。いくつかの実施形態において、構造的なループ安定化骨格は、１～１００個のリボヌクレオチドによって構築される可変ループを含み、アンチコドンのステム及びアンチコドンのループに続くリボヌクレオチド鎖の一部分によって形成される、二次構造を含む。いくつかの実施形態において、構造的なループ安定化骨格は、可変ループに続き、アクセプターステムのリボヌクレオチド鎖の３’末端のリボヌクレオチドに先行するリボヌクレオチド鎖の一部分の折り畳みによって形成される、複数のリボヌクレオチドの対を含むＴアームと、１～１００個のリボヌクレオチドを含むＴループと、を含む二次構造を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の骨格は、ｔＲＮＡ骨格を含み、ｔＲＮＡの構造は、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡに組み込むことができる。

いくつかの実施形態において、操作された骨格を含む操作されたガイドＲＮＡは、環状又はループ状の骨格であり得る。いくつかの場合において、骨格を含む操作されたガイドＲＮＡは、ループであり得る。いくつかの場合において、環状形状は、ループ形状を含み得る。いくつかの場合において、ループ形状は、環状形状を含み得る。ループ形成及び環化は、ポリヌクレオチドの露出した末端が分解されるのを防ぐことができ、インビボ、エクスビボ、又はインビトロで、ポリヌクレオチドの半減期を有意に増加させることができる。いくつかの実施形態において、環状又はループ状の操作されたガイドＲＮＡは、１つ以上の露出した末端が加水分解されるのを防ぐことができる。いくつかの場合において、環状又はループ状の操作されたガイドＲＮＡは、環状ではなくてもよいか、又はループでなくてもよい同等のポリヌクレオチドと比較して、ポリヌクレオチドの半減期を有意に増加させることができる。いくつかの実施形態において、環状又はループ状の操作されたガイドＲＮＡを形成することで、いくつかの場合において環状ではないか、又はループではない同等の操作されたガイドＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）と比較して、インビボで送達される場合に操作されたガイドＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）の半減期を有意に増加させることができる。いくつかの場合において、環状又はループ状の操作されたガイドＲＮＡを形成することで、環状ではなくてもよいか、又はループでなくてもよい同等の操作されたガイドＲＮＡと比較して、対象に投与される操作されたガイドＲＮＡの量（例えば、治療有効量）を有意に低減することができる。いくつかの実施形態において、環状又はループ状の操作されたガイドＲＮＡを形成することで、環状ではなくてもよいか、又はループでなくてもよい同等の操作されたガイドＲＮＡと比較して、編集の効率を有意に増強することができ、オフターゲット編集を有意に低減することができ、ＲＮＡ編集エンティティの動員効率を増強することができるか、又はこれらの組み合わせである。いくつかの場合において、環状又はループ状の操作されたガイドＲＮＡは、環状ではなくてもよいか、又はループでなくてもよい同等の操作されたガイドＲＮＡと比較して、操作されたガイドＲＮＡの合成を有意に増加させることができる。いくつかの実施形態において、環状又はループ状の操作されたガイドＲＮＡは、環状ではなくてもよいか、又はループでなくてもよい同等の操作されたガイドＲＮＡと比較して、細胞への操作されたガイドＲＮＡの輸送を有意に増加させることができる。いくつかの場合において、環状又はループ状の操作されたガイドＲＮＡは、環状ではなくてもよいか、又はループでなくてもよい同等の操作されたガイドＲＮＡと比較して、操作されたガイドＲＮＡの細胞内保持を有意に増加させることができる。

一態様において、骨格は、ｔＲＮＡ骨格を含む。一態様において、ＳＬＳ骨格は、アンチコドン領域に挿入された操作されたガイドＲＮＡ（標的化配列を含む）を含むｔＲＮＡを含み、操作された標的化配列は、標的ＲＮＡの少なくとも一部分に結合する。一態様において、ｔＲＮＡは、変異を含む標的ＲＮＡにおいてコドンを認識する修飾されたアンチコドンステム領域を有する内因性ｔＲＮＡであり得る。一態様において、ＳＬＳは、アミノ酸で帯電させることができないｔＲＮＡ骨格であり得る。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡは、非典型的なアミノ酸で帯電した直交ｔＲＮＡであり得る。一態様において、操作されたポリヌクレオチドは、対応するｔＲＮＡシンセターゼと共に投与され得る。いくつかの実施形態において、対応するシンセターゼは、Ｅ．ｃｏｌｉグルタミニル－ｔＲＮＡシンセターゼであってもよい。直交ｔＲＮＡを伴ういくつかの実施形態では、非典型的なアミノ酸は、ピロリジンであってもよい。

一態様において、操作された骨格は、Ｔループ二次構造を形成するｔＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、又は９９％の類似性を有する少なくとも１つの配列を含む。一態様において、ＳＬＳ骨格は、Ｔループ二次構造を形成するｔＲＮＡ配列に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、又は９９％以下の類似性を有する少なくとも１つの配列を含む。一態様において、ＳＬＳ骨格は、Ｄループ二次構造を形成するｔＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、又は９９％の類似性を有する少なくとも１つの配列を含む。一態様において、ＳＬＳ骨格は、Ｄループ二次構造を形成するｔＲＮＡ配列に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、又は９９％以下の類似性を有する少なくとも１つの配列を含む。一態様において、ＳＬＳ骨格は、アンチコドンループ二次構造を形成するｔＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、又は９９％の類似性を有する少なくとも１つの配列を含む。一態様において、ＳＬＳ骨格は、アンチコドンループ二次構造を形成するｔＲＮＡ配列に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、又は９９％以下の類似性を有する少なくとも１つの配列を含む。一態様において、ＳＬＳ骨格は、ｔＲＮＡ可変アーム二次構造を形成するｔＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、又は９９％の類似性を有する少なくとも１つの配列を含む。一態様において、ＳＬＳ骨格は、ｔＲＮＡ可変アーム二次構造を形成するｔＲＮＡ配列に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、又は９９％以下の類似性を有する少なくとも１つの配列を含む。一態様において、ＳＬＳ骨格は、ｔＲＮＡアクセプターステム二次構造を形成するｔＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、又は９９％の類似性を有する少なくとも１つの配列を含む。一態様において、ＳＬＳ骨格は、ｔＲＮＡアクセプターステム二次構造を形成するｔＲＮＡ配列に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、又は９９％以下の類似性を有する少なくとも１つの配列を含む。一態様において、ＳＬＳ骨格は、アクセプターアーム中にｔＲＮＡシュードノット二次構造を形成するｔＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、又は９９％の類似性を有する少なくとも１つの配列を含む。一態様において、ＳＬＳ骨格は、アクセプターアーム中にｔＲＮＡシュードノット二次構造を形成するｔＲＮＡ配列に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、又は９９％以下の類似性を有する少なくとも１つの配列を含む。

一態様において、ＳＬＳ骨格は、二次構造を含む。一態様において、二次構造は、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含む。一態様において、ＳＬＳ骨格は、ＲＮＡ編集エンティティのための動員配列を含む。一態様において、ＳＬＳ骨格は、少なくとも１個のステムループ構造を含む。一態様において、ＳＬＳ骨格は、標的ＲＮＡに対する標的化配列の結合を安定化する。

操作されたガイドＲＮＡ等の環状又はループ状の操作されたガイドポリヌクレオチドは、５’末端及び３’末端等のＲＮＡ配列の１つより多い末端の間に連結（例えば、共有結合）を形成することによって直接的又は間接的に形成することができる。ＲＮＡ配列は、操作されたガイドＲＮＡ（例えば、動員ドメイン、標的化ドメイン、又はその両方）を含み得る。結合は、リガーゼ等の酵素を用いることによって形成することができる。好適なリガーゼ（又はシンセターゼ）は、共有結合を形成するリガーゼを含み得る。共有結合は、炭素－酸素結合、炭素－硫黄結合、炭素－窒素結合、炭素－炭素結合、リン酸エステル結合、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。連結は、リコンビナーゼを用いることによっても形成することができる。酵素をＲＮＡ配列に動員して連結を形成することができる。環状又はループ状のＲＮＡは、連結要素を使用してＲＮＡ配列の１つより多い末端をライゲーションすることによって形成することができる。いくつかの実施形態において、連結は、ライゲーション反応によって形成することができる。いくつかの場合において、連結は、相同組換え反応によって形成することができる。連結要素は、クリック化学を使用して、環状又はループ状のＲＮＡを形成することができる。連結要素は、アジド系連結であり得る。環状又はループ状のＲＮＡは、環状又はループ状のＲＮＡを遺伝的にコードするか、又は化学的に合成することによって形成することができる。環状又はループ状のＲＮＡは、リボザイム、ｔＲＮＡ、アプタマー、これらのいずれかの触媒的に活性な断片、又はこれらの組み合わせ等の自己切断酵素を用いることによって形成することができる。例えば、リボザイム、ｔＲＮＡ、アプタマー、これらのいずれかの触媒的に活性な断片、又はこれらの組み合わせは、操作されたＲＮＡの前駆体の３’端、５’端、又は両方に付加することができる。別の例において、リボザイム、ｔＲＮＡ、アプタマー、これらのいずれかの触媒的に活性な断片、又はこれらの組み合わせは、操作されたＲＮＡの前駆体の３’末端の端、５’末端の端、又は両方に付加することができる。自己切断リボザイムは、例えば、ＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡ、Ｈａｍｍｅｒｈｅａｄリボザイム（例えば、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉリボザイム）、ｇｌｍＳリボザイム、ＨＤＶ様リボザイム、Ｒ２要素、又はグループＩイントロンを含み得る。いくつかの場合において、自己切断リボザイムは、それが存在し得る１つのＲＮＡ端を別個のＲＮＡ端に接続するトランス作用リボザイムであり得る。いくつかの場合において、自己切断要素又はアプタマーは、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡの自己環化を容易にするように構成され得る。

操作されたガイドＲＮＡ等のループ状又は環状の操作されたガイドポリヌクレオチドは、非環状又は非ループ状のガイドポリヌクレオチドと比較して、様々な利点を提供することができる。ループ状又は環状の操作されたガイドＲＮＡは、環状ではなくてもよいか、又はループでなくてもよい同等の操作されたガイドＲＮＡと比較して、より高い安定性、ＲＮＡ編集エンティティ（例えば、内因性ＲＮＡ編集エンティティ）の動員の改善、より長い半減期、ＲＮＡ編集効率の改善、又はこれらの任意の組み合わせを提供することができる。ループ状又は環状の操作されたポリヌクレオチドは、これらの改善された品質のうちの１つ以上を提供することができ、ガイド安定性を改善するように設計された他の種類の修飾、例えば、化学修飾又は糖付加を含むガイドポリヌクレオチドと比較して、遺伝暗号化を保持することができる。化学修飾を欠くループ状又は環状の操作されたガイドポリヌクレオチドは、遺伝的に暗号化することができ、ベクターによって送達することができ、改善された安定性を保持することができる。

いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集は、標的ＲＮＡのＲＮＡ編集率によって決定することによって評価することができる。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集は、タンパク質のレベルの変化によって決定することができる。いくつかの場合において、タンパク質のレベルは、ウェスタンブロットによって測定することができる。いくつかの場合において、タンパク質のレベルは、定量的タンパク質ゲルによる密度測定によって測定することができる。いくつかの場合において、標的ＲＮＡのＲＮＡ編集率は、標的ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次いで、Ｓａｎｇｅｒ配列決定を使用することによって、操作されたガイドＲＮＡによるトランスフェクション後の異なる時点（例えば、２４時間、４８時間、９６時間）で決定することができ、標的ＲＮＡのＲＮＡ編集率を決定することができる。いくつかの場合において、ｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応によって配列決定される前に増幅させることができる。Ｓａｎｇｅｒ配列決定からのＳａｎｇｅｒトレースを分析して、ガイドＲＮＡの編集効率を評価することができる。いくつかの場合において、次世代配列決定技術（例えば、合成による配列決定）を使用して、標的ＲＮＡのＲＮＡ編集率を決定することができる。例えば、ＲＮＡ配列決定を使用して、ガイドＲＮＡ又はガイドポリヌクレオチドによるトランスフェクションの後に、標的ＲＮＡのＲＮＡ編集率を決定することができる。いくつかの場合において、個々の配列決定リードを分析して、ＲＮＡ編集率を決定することができる。

いくつかの場合において、ガイド安定性、合成、局在化、細胞内保持を増強するか、又は半減期を延長するための化学修飾は、遺伝暗号化可能でない場合がある。操作されたガイドＲＮＡは、環状、実質的に環状、又はそれ以外の方法で連続した様式で連結することができ（例えば、ループとして配置することができ）、環状ではなくてもよいか、又はループでなくてもよい実質的に同様の操作されたガイドＲＮＡとして実質的に同様の二次構造も保持することができる。環状又はループ状の操作されたガイドＲＮＡは、予ひずみが与えられていてもよい。

本明細書で提供される組成物及び方法を利用して、標的の発現を調節することができる。調節は、遺伝子又は遺伝子中の変異と関連する疾患又は状態を緩和する目的で、様々な段階のうちの１つで遺伝子又はその一部分の発現を変化させることを指すことができる。調節は、転写又は転写後のレベルで媒介され得る。転写を調節することで、遺伝子中の変異によって生成されるスプライスバリアントの異常な発現を修正することができる。いくつかの場合において、本明細書で提供される組成物及び方法を利用して、標的の遺伝子翻訳を調節することができる。調節は、転写産物の存在量を減少させることによって遺伝子又はその一部分の発現を減少させること、又はノックダウンすることを指し得る。転写産物の存在量を減少させることは、転写産物のプロセシング、スプライシング、ターンオーバー若しくは安定性を減少させることによって、又はリボソーム等の翻訳機構によって転写産物のアクセス性を減少させることによって、媒介され得る。いくつかの場合において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、ノックダウンを容易にすることができる。ノックダウンは、標的ＲＮＡの発現を低減することができる。いくつかの場合において、ノックダウンは、ｍＲＮＡの編集を伴い得る。いくつかの場合において、ノックダウンは、ｍＲＮＡの編集が実質的にほとんど行われないか、又は全く行われない状態で起こり得る。いくつかの場合において、ノックダウンは、標的ＲＮＡの非翻訳領域、例えば、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、又はその両方を標的化することによって起こり得る。いくつかの場合において、ノックダウンは、標的ＲＮＡのコード領域を標的化することによって起こり得る。いくつかの場合において、ノックダウンは、ＲＮＡ編集エンティティ（例えば、ＡＤＡＲ）によって媒介され得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティは、ＲＮＡ中の複数のアデノシンの加水分解脱アミノ化によってノックダウンを引き起こし得る。ＲＮＡ中の複数のアデノシンの加水分解脱アミノ化は、過剰編集と称され得る。いくつかの場合において、過剰編集は、シスで（例えば、Ａｌｕ要素で）、又はトランスで（例えば、操作されたガイドＲＮＡによって標的ＲＮＡで）起こり得る。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡに結合すると、ＲＮＡ編集エンティティを動員して、標的ＲＮＡを編集することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＤＡＲ若しくはＡＰＯＢＥＣ、ＡＤＡＲ若しくはＡＰＯＢＥＣの触媒的に活性な断片、ＡＤＡＲ若しくはＡＰＯＢＥＣ、又はＡＤＡＲ若しくはＡＰＯＢＥＣの触媒的に活性な断片を含む融合ポリペプチド、あるいはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、又はこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティは、細胞に対して内因性であり得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティは、外因性であり得る（例えば、外因性ベクターから発現され得る）。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡを特定の細胞型に誘導するために標的化部分に融合され得る。例えば、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡを特定の細胞型に誘導するために抗体を含む標的化部分に融合され得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ナノ粒子及びリポソーム等の粒子に封入され得る。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡを封入する粒子は、標的化部分を含み得る。標的化部分によって標的化され得る細胞の例示的な種類としては、皮膚細胞、肺細胞、心臓細胞、上皮細胞、生殖細胞、眼細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、腸細胞、筋肉細胞、腺細胞、眼細胞、脳細胞、又は血液細胞が挙げられる。いくつかの場合において、細胞は、ニューロン、光受容体細胞、網膜色素上皮細胞、グリア細胞、筋芽細胞、筋管細胞、肝細胞、肺上皮細胞、又は線維芽細胞を含み得る。いくつかの場合において、細胞は、胚性幹細胞、多能性幹細胞、又は全能性幹細胞等の幹細胞であり得る。いくつかの場合において、細胞は、ヒト細胞を含み得る。いくつかの場合において、細胞は、白血球を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞は、リンパ球を含み得る。いくつかの場合において、細胞は、Ｔ細胞を含み得る。いくつかの場合において、細胞は、ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、調節ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｂ細胞を含み得る。いくつかの場合において、細胞は、形質芽球、形質細胞、リンパ形質細胞様細胞、メモリーＢ細胞、濾胞Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、Ｂ－１細胞、調節Ｂ細胞、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、標的化部分によって標的化される細胞は、神経細胞、肝臓細胞、又は黄斑細胞であり得る。

化学修飾
対象において疾患又は状態を治療する際に使用するための本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、少なくとも１個の化学修飾を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、５０、１００、又はそれより多くの化学修飾を含む。

例示的な化学修飾は、５’アデニレート、５’グアノシン－トリホスフェートキャップ、５’Ｎ７－メチルグアノシン－トリホスフェートキャップ、５’トリホスフェートキャップ、３’ホスフェート、３’チオホスフェート、５’ホスフェート、５’チオホスフェート、Ｃｉｓ－Ｓｙｎチミジン二量体、三量体、Ｃ１２スペーサー、Ｃ３スペーサー、Ｃ６スペーサー、ｄスペーサー、ＰＣスペーサー、ｒスペーサー、スペーサー１８、スペーサー９，３’－３’修飾、５’－５’修飾、非塩基部位、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンＢＢ、ビオチンＴＥＧ、コレステリルＴＥＧ、デスチオビオチンＴＥＧ、ＤＮＰ ＴＥＧ、ＤＮＰ－Ｘ、ＤＯＴＡ、ｄＴ－ビオチン、二重ビオチン、ＰＣビオチン、ソラレンＣ２、ソラレンＣ６、ＴＩＮＡ、３’ＤＡＢＣＹＬ、ブラックホールクエンチャー１、ブラックホールクエンチャー２、ＤＡＢＣＹＬ ＳＥ、ｄＴ－ＤＡＢＣＹＬ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－９、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、２’デオキシリボヌクレオシド類似体プリン、２’デオキシリボヌクレオシド類似体ピリミジン、リボヌクレオシド類似体、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオシド類似体、糖修飾された類似体、ゆらぎ／ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、２’フルオロＲＮＡ、２’Ｏ－メチルＲＮＡ、メチルホスホネート、ホスホジエステルＤＮＡ、ホスホジエステルＲＮＡ、ホスホロチオエートＤＮＡ、ホスホロチオエートＲＮＡ、ＵＮＡ、シュードウリジン－５’－トリホスフェート、５－メチルシチジン－５’－トリホスフェート、２－Ｏ－メチル ３ホスホロチオエート、又はこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つを含む。

化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡの任意の位置で行われ得る。いくつかの場合において、修飾は、５’末端又は３’末端に位置し得る。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、又は１５０から選択される塩基での修飾を含む。操作されたガイドＲＮＡに対して、１つより多い修飾を行うことができる。いくつかの場合において、修飾は、永続的であり得る。他の場合において、修飾は、一過性であり得る。いくつかの場合において、複数の修飾は、操作されたガイドＲＮＡに対して行われ得る。操作されたポリヌクレオチド修飾は、ヌクレオチドの立体配座、極性、疎水性、化学反応性、塩基対相互作用、又はこれらの任意の組み合わせ等のヌクレオチドの物理化学的特性を変更することができる。

化学修飾は、ホスホロチオエート置換体でもあり得る。いくつかの場合において、天然ホスホジエステル結合は、細胞ヌクレアーゼによる迅速な分解を受けやすい場合があり、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合置換体を使用したヌクレオチド間連結の修飾は、細胞分解による加水分解に対して、より安定であり得る。修飾は、ポリ核酸における安定性を増加させることができる。修飾はまた、生物学的活性を増強することができる。いくつかの場合において、ホスホロチオエートによって増強されたＲＮＡポリ核酸は、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、子ウシ血清ヌクレアーゼ、又はこれらの任意の組み合わせを阻害することができる。これらの特性は、ヌクレアーゼへの曝露がインビボ又はインビトロでの高い可能性である用途において、使用されるべきＰＳ－ＲＮＡポリ核酸の使用を可能にすることができる。例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を、エクソヌクレアーゼ分解を阻害することができるポリ核酸の５’末端又は３’末端の最後の３～５ヌクレオチド間に導入することができる。いくつかの場合において、ホスホロチオエート結合を、ポリ核酸全体にわたって付加し、エンドヌクレアーゼによる攻撃を低減することができる。

いくつかの実施形態において、化学修飾は、３’ＯＨ基、５’ＯＨ基で、骨格で、糖構成要素で、又はヌクレオチド塩基で生じ得る。化学修飾には、鎖間架橋又は鎖内架橋の天然に存在しないリンカー分子が含まれ得る。一態様において、化学修飾された核酸は、３’ＯＨ若しくは５’ＯＨ基、骨格、糖構成要素、又はヌクレオチド塩基のうちの１つ以上の修飾、又は天然に存在しないリンカー分子の付加を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾された骨格は、ホスホジエステル骨格以外の骨格を含む。いくつかの実施形態において、修飾された糖は、デオキシリボース以外の糖（修飾ＤＮＡにおいて）、又はリボース以外の糖（修飾ＲＮＡにおいて）を含む。いくつかの実施形態において、修飾された塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、又はウラシル以外の塩基を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、少なくとも１個の化学修飾された塩基を含む。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個、又はそれより多くの修飾された塩基を含む。いくつかの場合において、塩基部分に対する化学修飾としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、又はウラシル、及びプリン又はピリミジン塩基の天然及び合成の修飾が挙げられる。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡの少なくとも１つの化学修飾は、ホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素の片方若しくは両方の修飾、ホスホジエステル骨格連結中の連結リン酸酸素のうちの１つ以上の修飾、リボース糖の構成要素の修飾、「デホスホ」リンカーによるホスフェート部分の置き換え、天然に存在する核酸塩基の修飾若しくは置き換え、リボース－ホスフェート骨格の修飾、ポリヌクレオチドの５’末端の修飾、ポリヌクレオチドの３’末端の修飾、デオキシリボースホスフェート骨格の修飾、ホスフェート基の置換、リボホスフェート骨格の修飾、ヌクレオチドの糖に対する修飾、ヌクレオチドの塩基に対する修飾、又はヌクレオチドの立体化学的に純粋なもののうちのいずれか１つ、又は任意の組み合わせの修飾を含む。操作されたガイドＲＮＡに対する化学修飾は、本明細書に含有される任意の修飾を含むが、いくつかの例示的な修飾は、表２で列挙される。

ホスフェート骨格の修飾
いくつかの実施形態において、化学修飾は、ホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素の片方若しくは両方の修飾、又はホスホジエステル骨格連結中の連結リン酸酸素原子のうちの１つ以上の修飾を含む。本明細書で使用される場合、「アルキル」は、直鎖又は分岐鎖であってもよい飽和炭化水素基を指すことを意味し得る。例示的なアルキル基としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（例えば、ｎ－プロピル若しくはイソプロピル）、ブチル（例えば、ｎ－ブチル、イソブチル、若しくはｔ－ブチル）、又はペンチル（例えば、ｎ－ペンチル、イソペンチル、若しくはネオペンチル）が挙げられる。アルキル基は、１～約２０、２～約２０、１～約１２、１～約８、１～約６、１～約４、又は１～約３個の炭素原子を含有し得る。本明細書で使用される場合、「アリール」は、単環式若しくは多環式（例えば、２、３、若しくは４個の縮合環を有する）芳香族炭化水素、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、インダニル、又はインデニルを指し得る。いくつかの実施形態において、アリール基は、６～約２０個の炭素原子を有する。本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有する脂肪族基を指し得る。本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、２～１２個の炭素原子を含有し、１つ以上の三重結合を有することを特徴とする、直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を指し得る。アルキニル基の例としては、エチニル、プロパルギル、又は３－ヘキシニルを挙げることができる。「アリールアルキル」又は「アラルキル」は、アルキル水素原子がアリール基によって置き換えられ得るアルキル部分を指し得る。アラルキルは、１個より多い水素原子がアリール基によって置き換えられた基を含む。「アリールアルキル」又は「アラルキル」の例としては、ベンジル、２－フェニルエチル、３－フェニルプロピル、９－フルオレニル、ベンズヒドリル、及びトリチル基が挙げられる。「シクロアルキル」は、３～１２個の炭素を有する、環式、二環式、三環式、又は多環式の非芳香族炭化水素基を指し得る。シクロアルキル部分の例としては、限定されないが、シクロプロピル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルが挙げられる。「ヘテロシクリル」は、複素環式環系の一価のラジカルを指し得る。代表的なヘテロシクリルとしては、限定されないが、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、及びモルホリニルが挙げられる。「ヘテロアリール」は、複素芳香族環系の一価のラジカルを指し得る。ヘテロアリール部分の例としては、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、ピローリル、フラニル、インドリル、チオフェニルピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、キノリル、及びプテリジニルが挙げられ得る。

いくつかの実施形態において、化学修飾されたヌクレオチドのホスフェート基は、酸素のうちの１つ以上を別の置換基で置き換えることによって修飾され得る。いくつかの実施形態において、化学修飾されたヌクレオチドは、修飾されていないホスフェート部分を、本明細書に記載の修飾されたホスフェートで置き換えることを含み得る。いくつかの実施形態において、ホスフェート骨格の修飾は、帯電していないリンカー、又は非対称電荷分布を有する帯電したリンカーのいずれかをもたらす変化を含み得る。修飾されたホスフェート基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホノチオアセテート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキル又はアリールホスホネート及びホスホトリエステルが挙げられ得る。いくつかの実施形態において、ホスフェート骨格部分中の非架橋リン酸酸素原子の１つが、以下の基のいずれかによって置き換えられ得る。硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、ＢＲ３（Ｒは、例えば、水素、アルキル、又はアリールであり得る）、Ｃ（例えば、アルキル基、アリール基等）、Ｈ、ＮＲ２（ここで、Ｒは、例えば、水素、アルキル、又はアリールであり得る）か、又は（Ｒは、例えば、アルキル又はアリールであり得る）。修飾されていないホスフェート基のリン原子は、アキラルであり得る。しかしながら、非架橋酸素のうちの１つの、上述の原子又は原子群のうちの１つによる置き換えによって、リン原子をキラルにすることができる。このように修飾されたリン酸基中のリン原子は、立体中心であり得る。立体中心のリン原子は、「Ｒ」立体配座（本明細書ではＲｐ）又は「Ｓ」立体配座（本明細書ではＳｐ）のいずれかを有し得る。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡは、ホスホロチオエートのＳ立体配座又はホスホロチオエートのＲ立体配座を含む立体化学的に純粋なヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート生成物は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれより多いジアステレオマー過剰で存在し得る。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート生成物は、９５％のジアステレオマー過剰で存在し得る。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート生成物は、９６％のジアステレオマー過剰で存在し得る。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート生成物は、９７％のジアステレオマー過剰で存在し得る。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート生成物は、９８％のジアステレオマー過剰で存在し得る。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート生成物は、９９％のジアステレオマー過剰で存在し得る。いくつかの実施形態において、ホスホロジチオエートの非架橋酸素を両方とも硫黄によって置き換えることができる。ホスホロジチオエートのリン中心は、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を妨げるアキラルであり得る。いくつかの実施形態において、一方又は両方の非架橋酸素に対する修飾は、非架橋酸素を、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、及びＯＲ（Ｒは、例えば、アルキル又はアリールであり得る）から独立して選択される基で置き換えることも含むことができる。いくつかの実施形態において、ホスフェートリンカーは、架橋酸素（すなわち、ホスフェートをヌクレオシドに連結する酸素）、窒素（架橋したホスホロアミデート）、硫黄（架橋したホスホロチオエート）、及び炭素（架橋したメチレンホスホネート）の置き換えによっても修飾することができる。置き換えは、連結酸素のいずれか又は両方で生じ得る。

特定の実施形態において、核酸は、連結した核酸を含む。核酸は、任意の核酸間連結を使用して、共に連結することができる。核酸間連結基の２つの主要な種類は、リン原子の存在又は不在によって定義される。代表的なリン含有核酸間連結として、限定されないが、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、及びホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）が挙げられる。代表的な非リン含有核酸間連結基として、限定されないが、メチレンメチルイミノ（－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｏ－ＣＨ_２－）、チオジエステル（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－）、チオノカルバメート（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）－Ｓ－）、シロキサン（－Ｏ－Ｓｉ（Ｈ）_２－Ｏ－）、及びＮ，Ｎ＊－ジメチルヒドラジン（－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｎ（ＣＨ_３））が挙げられる。特定の実施形態において、キラル原子を有する核酸間連結は、ラセミ体混合物として、別個のエナンチオマー（例えば、アルキルホスホネート及びホスホロチオエート）として調製することができる。非天然核酸は、単一の修飾を含有し得る。非天然核酸は、部分のうちの１つの中に、又は異なる部分間に複数の修飾を含有し得る。

核酸に対する骨格ホスフェート修飾としては、限定されないが、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート（架橋又は非架橋）、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエート、ホスホジチオエート、及びボラノホスフェートが挙げられるが、任意の組み合わせで使用することができる。他の非ホスフェート連結も使用し得る。

いくつかの実施形態において、骨格修飾（例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、及びホスホロジチオエートヌクレオチド間連結）は、修飾核酸に免疫調節活性を付与し、及び／又はインビボでのその安定性を増強することができる。

いくつかの場合において、リン誘導体（又は修飾されたホスフェート基）を、糖又は糖類似体部分に接続してもよく、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート等であり得る。

いくつかの場合において、骨格修飾は、ホスホジエステル連結を、アニオン性基、中性基、又はカチオン性基等の代替部分で置き換えることを含む。かかる修飾の例としては、アニオン性ヌクレオシド間連結、Ｎ３’からＰ５’のホスホロアミデート修飾、ボラノホスフェートＤＮＡ、プロオリゴヌクレオチド、メチルホスホネート等の中性ヌクレオシド間連結、アミド連結ＤＮＡ、メチレン（メチルイミノ）連結、ホルムアセタール及びチオホルムアセタール連結、スルホニル基を含有する骨格、モルホリノオリゴ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及び正に帯電したデオキシリボ核酸グアニジン（ＤＮＧ）オリゴが挙げられる。修飾核酸は、１個以上の修飾、例えば、ホスホジエステル連結及びホスホロチオエート連結の組み合わせ等のホスフェート連結の組み合わせを含む、キメラ又は混合骨格を含み得る。

ホスフェートの置換体として、例えば、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子若しくはヘテロ環式ヌクレオシド間連結が挙げられる。これらとしては、モルホリノ連結（一部にはヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの；並びに混合したＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ_２構成要素部分を有するその他のものが挙げられる。また、ヌクレオチド置換において、ヌクレオチドの糖及びリン酸部分の両方が、例えば、アミド型連結（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）によって置き換えられ得ることも理解され得る。他の種類の分子（コンジュゲート）をヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に連結して、例えば、細胞取り込みを増強することも可能であり得る。コンジュゲートは、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に化学的に連結され得る。かかるコンジュゲートとしては、限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロール又はトリエチルアンモニウム ｌ－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－Ｓ－Ｈ－ホスホネート、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖、又はアダマンタン酢酸、パルミチル部分、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分が挙げられる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾は、ホスフェート骨格の修飾を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、少なくとも１個の化学修飾されたホスフェート骨格を含む。ホスフェート基又は骨格の例示的な化学修飾は、酸素のうちの１つ以上を異なる置換基で置き換えることを含み得る。更に、操作されたガイドＲＮＡ中に存在する修飾ヌクレオチドは、修飾されていないホスフェート部分を、本明細書に記載の修飾されたホスフェートで置き換えることを含み得る。いくつかの実施形態において、ホスフェート骨格の修飾は、帯電していないリンカー、又は非対称電荷分布を有する帯電したリンカーのいずれかをもたらす変化を含み得る。例示的な修飾されたホスフェート基としては、ホスホロチオエート、ホスホノチオアセテート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキル又はアリールホスホネート及びホスホトリエステルを挙げることができる。いくつかの実施形態において、ホスフェート骨格部分中の非架橋リン酸酸素原子の１つが、以下の基のいずれかによって置き換えられ得る。硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、ＢＲ_３（Ｒは、例えば、水素、アルキル、又はアリールであり得る）、Ｃ（例えば、アルキル基、アリール基等）、Ｈ、ＮＲ_２（ここで、Ｒは、例えば、水素、アルキル、又はアリールであり得る）か、又はＯＲ（Ｒは、例えば、アルキル又はアリールであり得る）。修飾されていないホスフェート基のリン原子は、アキラルであり得る。しかしながら、非架橋酸素のうちの１つの、上述の原子又は原子群のうちの１つによる置き換えによって、リン原子をキラルにすることができる。このように修飾されたホスフェート基中のリン原子は、立体中心であり得ると言われてもよい。立体中心のリン原子は、「Ｒ」立体配座（本明細書ではＲｐ）又は「Ｓ」立体配座（本明細書ではＳｐ）のいずれかを有し得る。そのような場合において、化学修飾された操作されたガイドＲＮＡは、立体化学的に純粋なもの（例えば、Ｓ又はＲコンファメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ））であり得る。いくつかの場合において、化学修飾された操作されたガイドＲＮＡは、立体化学的に純粋なホスフェート修飾を含む。例えば、化学修飾された操作されたガイドＲＮＡは、ホスホロチオエートのＳ立体配座又はホスホロチオエートのＲ立体配座を含み得る。

ホスホロジチオエートは、非架橋酸素が両方とも硫黄に置き換えられたものを有する。ホスホロジチオエートのリン中心は、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を妨げるアキラルであり得る。いくつかの実施形態において、一方又は両方の非架橋酸素に対する修飾は、非架橋酸素を、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、及びＯＲ（Ｒは、例えば、アルキル又はアリールであり得る）から独立して選択される基で置き換えることも含むことができる。

ホスフェートリンカーは、架橋酸素（すなわち、ホスフェートをヌクレオシドに連結する酸素）、窒素（架橋したホスホロアミデート）、硫黄（架橋したホスホロチオエート）、及び炭素（架橋したメチレンホスホネート）の置き換えによっても修飾することができる。置き換えは、いずれかの架橋酸素又は両方の架橋酸素において生じ得る。

ホスフェート部分の置き換え
いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡの少なくとも１つのホスフェート基は、化学修飾され得る。いくつかの実施形態において、ホスフェート基は、リンを含有しないコネクターによって置き換えられ得る。いくつかの実施形態において、ホスフェート部分は、デホスホリンカーによって置き換えられ得る。いくつかの実施形態において、帯電ホスフェート基は、中性基によって置き換えられ得る。いくつかの場合において、ホスフェート基は、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、及びメチレンオキシメチルイミノによって置き換えられ得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のヌクレオチド類似体は、ホスフェート基で修飾することもできる。修飾されたホスフェート基は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート（例えば、３’－アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデート）、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及びボラノホスフェートを有する２つのヌクレオチド間の連結に修飾を含み得る。２つのヌクレオチド間のホスフェート又は修飾ホスフェート連結は、３’－５’連結又は２’－５’連結を介したものであってもよく、連結は、３’－５’から５’－３’、又は２’－５’から５’－２’等の反転した極性を含有する。

ホスフェート基の置換
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾は、ホスフェート基の置き換えによる修飾を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、ホスフェート基の置換又は置き換えを含む少なくとも１個の化学修飾を含む。例示的なホスフェート基の置き換えとしては、リンを含有しないコネクターを挙げることができる。いくつかの実施形態において、ホスフェート基の置換又は置き換えは、帯電したホスフェート基を中性部分によって置き換えることを含み得る。ホスフェート基を置き換えることができる例示的な部分としては、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、及びメチレンオキシメチルイミノを挙げることができる。

リボホスフェート骨格の修飾
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡのリボホスフェート骨格を修飾することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、少なくとも１個の化学修飾されたリボホスフェート骨格を含む。例示的な化学修飾されたリボホスフェート骨格は、核酸を模倣することができる骨格を含んでいてもよく、ホスフェートリンカー及びリボース糖がヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオシド又はヌクレオチド代理物によって置き換えられ得るように構築することもできる。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、代理骨格によって係留され得る。例としては、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代理物を挙げることができる。

糖の修飾
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾は、糖を修飾することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、少なくとも１個の化学修飾された糖を含む。例示的な化学修飾された糖は、いくつかの異なる「オキシ」又は「デオキシ」置換で修飾されたか、又は置き換えられた２’ヒドロキシル基（ＯＨ）を含み得る。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基に対する修飾は、ヒドロキシルがもはや脱プロトン化されて２’－アルコキシドイオンを形成することができないため、核酸の安定性を増強することができる。２’－アルコキシドは、リンカーリン原子に対する分子内求核攻撃によって分解を触媒することができる。「オキシ」－２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシ又はアリールオキシ（ＯＲ、ここで、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、又は糖であり得る）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ２ＣＨ_２ＯＲ（ここで、Ｒは、Ｈ、又は任意選択的に置換されたアルキルであってもよく、ｎは、０～２０（例えば、０～４、０～８、０～１０、０～１６、１～４、１～８、１～１０、１～１６、１～２０、２～４、２～８、２～１０、２～１６、２～２０、４～８、４～１０、４～１６、及び４～２０）の整数であってもよい。いくつかの実施形態において、「オキシ」－２’ヒドロキシル基修飾は、（ＬＮＡ、２’ヒドロキシルが、例えば、Ｃｉ－_６アルキレン又はＣｊ－６ヘテロアルキレン架橋によって、同じリボース糖の４’炭素に接続していてもよく、例示的な架橋は、メチレン、プロピレン、エーテル、又はアミノ架橋を含み得る；Ｏ－アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、又はポリアミノであり得る）及びアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ－、（アミノは、例えば、ＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、又はポリアミノであり得る）を含み得る。いくつかの実施形態において、「オキシ」－２’ヒドロキシル基修飾は、メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、例えば、ＰＥＧ誘導体）を含み得る。いくつかの場合において、デオキシ修飾は、水素（すなわち、例えば、部分的なｄｓＲＮＡのオーバーハング部分にある、デオキシリボース糖）、ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、若しくはヨード）、アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ_２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、若しくはアミノ酸であり得る）、ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ）_ｎＣＨ２ＣＨ_２－アミノ（アミノは、例えば、本明細書に記載されるようなアミノであり得る）、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、若しくは糖であり得る）、シアノ、メルカプト、アルキル－チオ－アルキル、チオアルコキシ、並びに例えば、本明細書に記載のアミノで任意選択的に置換され得るアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、及びアルキニルを含み得る。いくつかの場合において、糖基はまた、リボース中の対応する炭素とは反対の立体化学配座を有する１つ以上の炭素を含有し得る。したがって、修飾核酸は、糖として例えばアラビノースを含有するヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド「単量体」は、糖上のΓ位にアルファ連結、例えば、アルファ－ヌクレオシドを有し得る。修飾核酸はまた、Ｃ－に核酸塩基を欠く「非塩基性」糖を含み得る。非塩基性糖はまた、構成要素の糖原子のうちの１つ以上で更に修飾され得る。修飾核酸はまた、Ｌ形態、例えばＬ－ヌクレオシドであり得る１つ以上の糖を含み得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、糖基リボースを含み、糖基リボースは、酸素を有する５員環であり得る。例示的な修飾されたヌクレオシド及び修飾されたヌクレオチドは、リボース中の酸素の置き換え（例えば、硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、又はアルキレン、例えば、メチレン若しくはエチレンによる）、二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニル又はシクロヘキセニルで置き換えるため）、リボースの環収縮（例えば、シクロブタン又はオキセタンの４員環を形成するため）、リボースの環拡大（例えば、追加の炭素若しくはヘテロ原子を有する６員環又は７員環の環、例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、及びホスホロアミデート骨格も有するモルホリノを形成するため）を含み得る。いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオチドは、多環式形態（例えば、トリシクロ；及び「アンロックド」形態、例えば、グリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、Ｒ－ＧＮＡ又はＳ－ＧＮＡ、リボースは、ホスホジエステル結合に接続したグリコール単位によって置き換えられ得る）、トレオース核酸を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡの糖に対する修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、又は架橋核酸（ＢＮＡ）を含むように操作されたガイドＲＮＡを修飾することを含む。

リボース糖の構成要素の修飾
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、リボース糖の構成要素の少なくとも１個の化学修飾を含む。いくつかの実施形態において、リボース糖の構成要素の化学修飾としては、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシ－エチル（２’－ＭＯＥ）、２’－フルオロ、２’－アミノエチル、２’－デオキシ－２’－フロアラビノ－クレイン酸（２’－ｄｅｏｘｙ－２’－ｆｕｌｏａｒａｂｉｎｏｕ－ｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、３’－ホスホロチオエート、３’－ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、又は３’－ホスホノチオアセテート（チオＰＡＣＥ）を挙げることができる。いくつかの実施形態において、リボース糖の構成要素の化学修飾は、非天然核酸を含む。いくつかの場合において、非天然核酸は、糖環の５’位及び２’位に修飾を含む（例えば、５’－ＣＨ_２置換された２’－Ｏ保護されたヌクレオシド）。いくつかの場合において、非天然核酸は、オリゴヌクレオチドへの組み込みのために調製されているアミド連結ヌクレオシド二量体を含み、二量体中の３’連結ヌクレオシド（５’から３’）は、２’－ＯＣＨ_３及び５’－（Ｓ）－ＣＨ_３を含む。非天然核酸は、２’－置換５’－ＣＨ_２（又はＯ）修飾されたヌクレオシドを含み得る。非天然核酸は、５’－メチレンホスホネートＤＮＡ及びＲＮＡ単量体、及び二量体を含み得る。非天然核酸は、２’－置換を有する５’ホスホネート単量体及び他の修飾された５’－ホスホネート単量体を含み得る。非天然核酸は、５’－修飾されたメチレンホスホネート単量体を含み得る。非天然核酸は、５’及び／又は６’位にヒドロキシル基を含む５’又は６’－ホスホネートリボヌクレオシドの類似体を含み得る。非天然核酸は、５’ホスフェート基を有する５’－ホスホネートデオキシリボヌクレオシド単量体及び二量体を含み得る。非天然核酸としては、６’－ホスホネート基を有するヌクレオシドを挙げることができ、５’位及び／又は６’位は、非置換であってもよく、又はチオ－ｔｅｒｔ－ブチル基（ＳＣ（ＣＨ_３）_３）（及びその類似体）、メチレンアミノ基（ＣＨ_２ＮＨ_２）（及びその類似体）、若しくはシアノ基（ＣＮ）（及びその類似体）で置換されていてもよい。

いくつかの実施形態において、非天然核酸はまた、糖部分の修飾を含む。いくつかの場合において、核酸は、糖基が修飾された１つ以上のヌクレオシドを含有する。そのような糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の増強、結合親和性の増加、又はいくつかの他の有益な生物学的特性を付与し得る。特定の実施形態において、核酸は、化学修飾されたリボフラノース環部分を含む。化学修飾されたリボフラノース環の例としては、限定されないが、置換基（５’及び／又は２’置換基を含む）の付加、二環式核酸を形成するための２つの環原子の架橋、リボシル環酸素原子のＳ、Ｎ（Ｒ）、又はＣ（Ｒ_１）（Ｒ_２）（Ｒ＝Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、又は保護基）による置き換え、及びこれらの組み合わせが挙げられる。

いくつかの場合において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、修飾された糖又は糖類似体を含む。したがって、リボース及びデオキシリボースに加えて、糖部分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、又は糖「類似体」シクロペンチル基であり得る。糖は、ピラノシル又はフラノシル形態であり得る。糖部分は、リボース、デオキシリボース、アラビノース、又は２’－Ｏ－アルキルリボースのフラノシドであってもよく、糖は、それぞれのヘテロ環塩基に、［アルファ］又は［ベータ］アノマー配座のいずれかで接続し得る。糖修飾としては、限定されないが、２’－アルコキシ－ＲＮＡ類似体、２’－アミノ－ＲＮＡ類似体、２’－フルオロ－ＤＮＡ、及び２’－アルコキシ又はアミノ－ＲＮＡ／ＤＮＡキメラが挙げられる。例えば、糖修飾は、２’－Ｏ－メチル－ウリジン又は２’－Ｏ－メチル－シチジンを含み得る。糖修飾としては、２’－Ｏ－アルキル置換されたデオキシリボヌクレオシド及び２’－Ｏ－エチレングリコール様リボヌクレオシドが挙げられる。

糖部分への修飾としては、リボース及びデオキシリボースの天然の修飾、並びに非天然の修飾が挙げられる。糖修飾としては、限定されないが、２’位における以下の修飾が挙げられる。ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、若しくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、若しくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－若しくはＮ－アルキニル；又はＯ－アルキル－Ｏ－アルキル、ここで、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ_１～Ｃ_１０、アルキル又はＣ_２～Ｃ_１０アルケニル及びアルキニルであり得る。２’糖修飾としては、また、限定されないが、－Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、及び－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）ｎＣＨ_３）］_２が挙げられ、ｎ及びｍは、１～約１０であり得る。２’位における他の化学修飾としては、限定されないが、Ｃ_１～Ｃ_１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリール、Ｏ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、及び同様の特性を有する他の置換基が挙げられる。同様の修飾はまた、糖上の他の位置、例えば、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位置、又は２’－５’連結したオリゴヌクレオチド及び５’末端ヌクレオチドの５’位置において、作製され得る。化学修飾された糖は、ＣＨ_２及びＳ等の架橋環酸素に修飾を含有するものも含まれる。ヌクレオチド糖類似体は、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分等の糖模倣物を有することもできる。修飾された糖部分を有する核酸の例としては、限定されないが、５’－ビニル、５’－メチル（Ｒ又はＳ）、４’－Ｓ、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ_３、及び２’－Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３置換基を含む核酸が挙げられる。２’位における置換基はまた、アリル、アミド、アジド、チオ、Ｏ－アリル、Ｏ－（Ｃ_１～Ｃ_１Ｏアルキル）、ＯＣＦ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２－Ｏ－Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）、及びＯ－ＣＨ_２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）から選択することができ、各Ｒ_ｍ及びＲ_ｎは、独立して、Ｈ、又は置換若しくは非置換のＣ_１～Ｃ_１０アルキルである。

特定の実施形態において、本明細書に記載の核酸は、１つ以上の二環式核酸を含む。特定のそのような実施形態において、二環式核酸は、４’リボシル環原子と２’リボシル環原子との間の架橋を含む。特定の実施形態において、本明細書で提供される核酸は、架橋が４’－２’二環式核酸を含む１つ以上の二環式核酸を含む。かかる４’－２’二環式核酸の例としては、限定されないが、以下の式のうちの１つが挙げられる。４’－（ＣＨ_２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）、４’－（ＣＨ_２）－Ｓ－２’、４’－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）、４’－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－２’、及び４’－ＣＨ（ＣＨ_２ＯＣＨ_３）－Ｏ－２’、及びその類似体、４’－Ｃ（ＣＨ_３）（ＣＨ_３）－Ｏ－２’、及びその類似体。

ヌクレオチドの塩基に対する修飾
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾は、ヌクレオチドの塩基（例えば、核酸塩基）の修飾を含む。例示的な核酸塩基としては、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を挙げることができる。これらの核酸塩基は、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡにおいて、修飾され得るか、又は置き換えられ得る。ヌクレオチドの核酸塩基は、独立して、プリン、ピリミジン、プリン類似体又はピリミジン類似体から選択され得る。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、塩基の天然に存在する誘導体又は合成誘導体であり得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾は、ウラシルを修飾することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、少なくとも１個の化学修飾されたウラシルを含む。例示的な化学修飾されたウラシルとしては、シュードウリジン、ピリジン－４－オンリボヌクレオチド、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン、４－チオ－ウリジン、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば、５－ヨード－ウリジン又は５－ブロモ－ウリジン）、３－メチル－ウリジン、５－メトキシ－ウリジン、ウリジン ５－オキシ酢酸、ウリジン ５－オキシ酢酸メチルエステル、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン、５－メチルアミノメチル－ウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン、５－カルバモイルメチル－ウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、ｌ－タウリノメチル－４－チオ－シュードウリジン、５－メチル－ウリジン、１ メチル－シュードウリジン、５－メチル－２－チオ－ウリジン、ｌ－メチル－４－チオ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、３－メチル－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウンジン（ｄｉｈｙｄｒｏｕｎｄｉｎｅ）、ジヒドロシュードウンジン（ｄｉｈｙｄｒｏｐｓｅｕｄｏｕｎｄｉｎｅ）、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピシュードウリジン（１－ｍｅｔｈｙｌ－３－（３－ａｍｉｎｏ－３－ｃａｒｂｏｘｙｐｒｏｐｙ ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン、５－（イソペンテニルアミノメチ］）－２－チオ－ウリジン（５－（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈｙ］）－２－ｔｈｉｏ－ｕｒｉｄｉｎｅ）、ａ－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン、５，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン、３，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン、ｌ－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、５－［３－（ｌ－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジン、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、キサンチン、及びヒポキサンチンを挙げることができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾は、シトシンを修飾することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、少なくとも１個の化学修飾されたシトシンを含む。例示的な化学修飾されたシトシンとしては、５－アザ－シチジン、６－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチル－シチジン、５－ホルミル－シチジン、Ｎ４－メチル－シチジン、５－メチル－シチジン、５－ハロ－シチジン、５－ヒドロキシメチル－シチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－ｌ－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－ｌ－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジン、リシジン、ａ－チオ－シチジン、２’－Ｏ－メチル－シチジン、５，２’－Ｏ－ジメチル－シチジン、Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチル－シチジン、Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチル－シチジン、５－ホルミル－２’－Ｏ－メチル－シチジン、Ｎ４，Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチル－シチジン、１－チオ－シチジン、２’－Ｆ－アラ－シチジン、２’－Ｆ－シチジン、及び２’－ＯＨ－アラ－シチジンを挙げることができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾は、アデニンを修飾することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、少なくとも１個の化学修飾されたアデニンを含む。例示的な化学修飾されたアデニンとしては、２－アミノ－プリン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノ－６－ハロ－プリン（例えば、２－アミノ－６－クロロ－プリン）、６－ハロ－プリン（例えば、６－クロイ－プリン（６－ｃｈｌｏｉ－ｐｕｒｉｎｅ））、２－アミノ－６－メチル－プリン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチル－アデノシン、２－メチル－アデニン、Ｎ６－メチル－アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－メチル－アデノシン、Ｎ６－イソペンテニル－アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニル－アデノシン、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイル－アデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイル－アデノシン、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイル－アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイル－アデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチル－アデノシン、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデノシン、Ｎ６－アセチル－アデノシン、７－メチル－アデニン、２－メチルチオ－アデニン、２－メトキシ－アデニン、ａ－チオ－アデノシン、２’－Ｏ－メチル－アデノシン、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン、Ｎ６－メチル－２’－デオキシアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチル－アデノシン、ｌ，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン、２’－Ｏ－リボシルアデノシン（ホスフェート）（Ａｒ（ｐ））、２－アミノ－Ｎ６－メチル－プリン、１－チオ－アデノシン、８－アジド－アデノシン、２’－Ｆ－アラ－アデノシン、２’－Ｆ－アデノシン、２’－ＯＨ－アラ－アデノシン、及びＮ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノナデシル）－アデノシンを挙げることができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾は、グアニンを修飾することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡは、少なくとも１個の化学修飾されたグアニンを含む。例示的な化学修飾されたグアニンとしては、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、メチルワイオシン、４－デメチル－ワイオシン、イソワイオシン、ワイブトシン、ペルオキシワイブトシン、ヒドロキシワイブトシン、非修飾（ｕｎｄｅｍｒｉｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、クエオシン、エポキシクエオシン、ガラクトシル－クエオシン、マンノシル－クエオシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン、アルケオシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチル－イノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチル－グアノシン、Ｎ２－メチル－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－グアノシン、Ｎ２，７－ジメチル－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２，７－ジメチル－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メトチオ－グアノシン（１－ｍｅｔｈｔｈｉｏ－ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン、ａ－チオ－グアノシン、２’－Ｏ－メチル－グアノシン、Ｎ２－メチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン、ｌ－メチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン、Ｎ２、７－ジメチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン、２’－Ｏ－メチル－イノシン、ｌ，２’－Ｏ－ジメチル－イノシン、６－Ｏ－フェニル－２’－デオキシイノシン、２’－Ｏ－リボシルグアノシン、１－チオ－グアノシン、６－Ｏ－メチグアノシン（６－Ｏ－ｍｅｔｈｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、Ｏ^６－メチル－２’－デオキシグアノシン、２’－Ｆ－アラ－グアノシン、及び２’－Ｆ－グアノシンを挙げることができる。

いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡの化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡに、核酸類似体又は非天然核酸を導入するか、又は置換することを含み得る。いくつかの実施形態において、核酸類似体は、本明細書に記載の化学修飾された核酸のうちのいずれか１つであり得る。例示的な核酸類似体は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２５１７５、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５０４２３、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６７３５３、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４１５０３、ＰＣＴ／ＵＳ１８／０４１５０９、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６、又はＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１８３３中に見出すことができ、これらは全て、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。本明細書に記載の化学修飾されたヌクレオチドは、例えば、アセチル化、メチル化、ヒドロキシル化によって化学的に変化した、任意の天然に存在するか、又は天然に存在しないグアノシン、ウリジン、アデノシン、チミジン、又はシチジンを含む、グアノシン、ウリジン、アデノシン、チミジン、及びシトシンのバリアントを含み得る。例示的な化学修飾されたヌクレオチドとしては、１－メチル－アデノシン、１－メチル－グアノシン、１－メチル－イノシン、２，２－ジメチル－グアノシン、２，６－ジアミノプリン、２’－アミノ－２’－デオキシアデノシン、２’－アミノ－２’－デオキシシチジン、２’－アミノ－２’－デオキシグアノシン、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン、２－アミノ－６－クロロプリンリボシド、２－アミノプリン－リボシド、２’－アラアデノシン、２’－アラシチジン、２’－アラウリジン、２’－アジド－２’－デオキシアデノシン、２’－アジド－２’－デオキシシチジン、２’－アジド－２’－デオキシグアノシン、２’－アジド－２’－デオキシウリジン、２－クロロアデノシン、２’－フルオロ－２’－デオキシアデノシン、２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン、２’－フルオロ－２’－デオキシグアノシン、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン、２’－フルオロチミジン、２－メチル－アデノシン、２－メチル－グアノシン、２－メチル－チオ－Ｎ６－イソペネニル－アデノシン（２－ｍｅｔｈｙｌ－ｔｈｉｏ－Ｎ６－ｉｓｏｐｅｎｅｎｙｌ－ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、２’－Ｏ－メチル－２－アミノアデノシン、２’－Ｏ－メチル－２’－デオキシアデノシン、２’－Ｏ－メチル－２’－デオキシシチジン、２’－Ｏ－メチル－２’－デオキシグアノシン、２，－Ｏ－メチル－２’－デオキシウリジン、２’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルイノシン、２’－Ｏ－メチルシュードウリジン、２－チオシチジン、２－チオ－シチジン、３－メチル－シチジン、４－アセチル－シチジン、４－チオウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－ウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－アミノアリルシチジン、５－アミノアリル－デオキシウリジン、５－ブロモウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチルアモノメチル－ウラシル（５－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ－ｕｒａｃｉｌ）、５－クロロ－アラ－シトシン、５－フルオロ－ウリジン、５－ヨードウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン、５－メトキシ－ウリジン、５－メチル－２－チオ－ウリジン、６－アザシチジン、６－アザウリジン、６－クロロ－７－デアザ－グアノシン、６－クロロプリンリボシド、６－メルカプト－グアノシン、６－メチル－メルカプトプリン－リボシド、７－デアザ－２’－デオキシ－グアノシン、７－デアザアデノシン、７－メチル－グアノシン、８－アザアデノシン、８－ブロモ－アデノシン、８－ブロモ－グアノシン、８－メルカプト－グアノシン、８－オキソグアノシン、ベンズイミダゾール－リボシド、ベータ－Ｄ－マンノシル－クエオシン、ジヒドロ－ウリジン、イノシン、Ｎ１－メチルアデノシン、Ｎ６－（［６－アミノヘキシル］カルバモイルメチル）－アデノシン、Ｎ６－イソペンテニル－アデノシン、Ｎ６－メチル－アデノシン、Ｎ７－メチル－キサントシン、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ピューロマイシン、クエオシン、ウラシル－５－オキシ酢酸、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ワイブトキシン、キサントシン、及びキシロ－アデノシンを挙げることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾された核酸は、２－アミノ－６－クロロプリンリボシド－５’－トリホスフェート、２－アミノプリン－リボシド－５’－トリホスフェート、２－アミノアデノシン－５’－トリホスフェート、２’－アミノ－２’－デオキシシチジン－トリホスフェート、２－チオシチジン－５’－トリホスフェート、２－チオウリジン－５’－トリホスフェート、２’－フルオロチミジン－５’－トリホスフェート、２’－Ｏ－メチル－イノシン－５’－トリホスフェート、４－チオウリジン－５’－トリホスフェート、５－アミノアリルシチジン－５’－トリホスフェート、５－アミノアリルウリジン－５’－トリホスフェート、５－ブロモシチジン－５’－トリホスフェート、５－ブロモウリジン－５’－トリホスフェート、５－ブロモ－２’－デオキシシチジン－５’－トリホスフェート、５－ブロモ－２’－デオキシウリジン－５’－トリホスフェート、５－ヨードシチジン－５’－トリホスフェート、５－ヨード－２’－デオキシシチジン－５’－トリホスフェート、５－ヨードウリジン－５’－トリホスフェート、５－ヨード－２’－デオキシウリジン－５’－トリホスフェート、５－メチルシチジン－５’－トリホスフェート、５－メチルウリジン－５’－トリホスフェート、５－プロピニル－２’－デオキシシチジン－５’－トリホスフェート、５－プロピニル－２’－デオキシウリジン－５’－トリホスフェート、６－アザシチジン－５’－トリホスフェート、６－アザウリジン－５’－トリホスフェート、６－クロロプリンリボシド－５’－トリホスフェート、７－デアザアデノシン－５’－トリホスフェート、７－デアザグアノシン－５’－トリホスフェート、８－アザアデノシン－５’－トリホスフェート、８－アジドアデノシン－５’－トリホスフェート、ベンズイミダゾール－リボシド－５’－トリホスフェート、Ｎ１－メチルアデノシン－５’－トリホスフェート、Ｎ１－メチルグアノシン－５’－トリホスフェート、Ｎ６－メチルアデノシン－５’－トリホスフェート、６－メチルグアノシン－５’－トリホスフェート、シュードウリジン－５’－トリホスフェート、ピューロマイシン－５’－トリホスフェート、又はキサントシン－５’－トリホスフェートから選択される少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾された核酸は、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、及び４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジンから選択される少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の人工核酸は、５－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、及び４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジンから選択される少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化学修飾された核酸は、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、及び２－メトキシ－アデニンから選択される少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオチドを含む。他の実施形態において、本明細書に記載の化学修飾された核酸は、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンから選択される少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、本明細書に記載の化学修飾された核酸は、６－アザ－シチジン、２－チオ－シチジン、アルファ－チオ－シチジン、シュード－イソ－シチジン、５－アミノアリル－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、アルファ－チオ－ウリジン、４－チオ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン、デオキシ－チミジン、５－メチル－ウリジン、ピロロ－シチジン、イノシン、アルファ－チオ－グアノシン、６－メチル－グアノシン、５－メチル－シトジン（５－ｍｅｔｈｙｌ－ｃｙｔｄｉｎｅ）、８－オキソ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、Ｎ１－メチル－アデノシン、２－アミノ－６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－２－アミノ－プリン、シュード－イソ－シチジン、６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－アデノシン、アルファ－チオ－アデノシン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデノシンから選択される少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオチドを含む。

非天然核酸の修飾された塩基としては、限定され得ないが、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、２－アミノアデニン－９－イル、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６－メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン及び３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンが挙げられる。５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン及びｎ－２置換プリン、ｎ－６置換プリン、Ｏ－６置換プリン、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、５－メチルシトシン、二本鎖形成の安定性を増加させるもの、普遍的核酸、疎水性核酸、無差別な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）核酸、サイズが拡大した核酸、フッ素化核酸、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン及びＮ－２、Ｎ－６及びＯ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、及び５－プロピニルシトシンを含む）等の特定の非天然核酸。５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－メチル、アデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル、５－ハロシトシン、５－プロピニル（－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ_３）ウラシル、５－プロピニルシトシン、ピリミジン核酸の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換されたアデニン及びグアニン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、他の５－置換されたウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニン、８－アザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニン、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４－ｂ］［ｌ，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［ｌ，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、Ｇ－クランプ、フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［ｌ，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）、プリン又はピリミジン塩基が他のヘテロ環と置き換えられてもよいもの、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン、２－ピリドン、アザシトシン、５－ブロモシトシン、ブロモウラシル、５－クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５－フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６－ジヒドロシトシン、５－ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５－ニトロシトシン、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシル、及び５－ヨードウラシル、２－アミノ－アデニン、６－チオ－グアニン、２－チオ－チミン、４－チオ－チミン、５－プロピニル－ウラシル、４－チオ－ウラシル、Ｎ４－エチルシトシン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、５－ヒドロキシシトシン、２’－デオキシウリジン、又は２－アミノ－２’－デオキシアデノシン。

いくつかの場合において、少なくとも１個の化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡの５’キャップ又は３’テール等の５’又は３’端を化学修飾することを含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、例えば、本明細書に記載の修飾されたヌクレオチドのうちの１つ以上を組み込むことによって、分解に対して安定化され得る３’ヌクレオチドを含む化学修飾を含み得る。この実施形態において、ウリジンを、修飾ウリジン、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、及び５－ブロモウリジンと、又は本明細書に記載の修飾ウリジンのいずれかと置き換えることができ、アデノシン及びグアノシンを、修飾アデノシン及びグアノシンと、例えば、８位での修飾、例えば、８－ブロモグアノシン、又は本明細書に記載の修飾アデノシン又はグアノシンのいずれかと置き換えることができる。いくつかの実施形態において、デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシンをｇＲＮＡに組み込むことができる。いくつかの実施形態において、Ｏ－及びＮ－アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６－メチルアデノシンをｇＲＮＡに組み込むことができる。いくつかの実施形態において、糖修飾リボヌクレオチドを組み込むことができ、例えば、２’－ＯＨ基は、Ｈ、－ＯＲ、－Ｒ（Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、若しくは糖であり得る）、ハロ、－ＳＨ、－ＳＲ（Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、若しくは糖であり得る）、アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ_２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、若しくはアミノ酸であり得る）、又はシアノ（－ＣＮ）から選択される基によって置き換えられ得る。いくつかの実施形態において、ホスフェート骨格は、本明細書に記載されるように、例えば、ホスホロチオエート基を用いて修飾され得る。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡのオーバーハング領域中のヌクレオチドは、各々独立して、限定されないが、２’－糖修飾された、例えば、２－Ｆ ２’－Ｏ－メチル、チミジン（Ｔ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、又はこれらの任意の組み合わせを含む、修飾又は非修飾ヌクレオチドであり得る。

送達方法
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡを細胞に送達する方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、本方法は、操作されたガイドＲＮＡを細胞に直接的又は間接的に送達することを含む。いくつかの場合において、操作されたガイドＲＮＡは、少なくとも１個の化学修飾を含み、二本鎖ポリヌクレオチドは、操作されたガイドＲＮＡの少なくとも一部分と標的ＲＮＡとの間に形成する。いくつかの場合において、二本鎖ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集エンティティを二本鎖ポリヌクレオチドに動員するための少なくとも１つの構造的特徴を含む。ＲＮＡ編集エンティティの動員は、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡの編集をもたらす。いくつかの実施形態において、本方法は、細胞と、本明細書に記載の組成物又は操作されたガイドＲＮＡとを接触させることを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、細胞において本明細書に記載の組成物又は操作されたガイドＲＮＡを発現することを含む。いくつかの実施形態において、化学修飾されていない操作されたガイドＲＮＡ又はＲＮＡ編集エンティティをコードする操作されたガイドＲＮＡ又はベクターは、本明細書に記載のトランスフェクション方法のうちのいずれかを介して細胞内に送達され得る。いくつかの実施形態において、化学修飾されていない操作されたガイドＲＮＡ又はＲＮＡ編集エンティティは、発現ベクターの使用を介して細胞内に送達され得る。発現ベクターの文脈で、ベクターは、当該技術分野における任意の方法によって、本明細書に記載される細胞に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的手段によって細胞に移行することができる。

操作されたガイドＲＮＡ、又は化学修飾されていない操作されたガイドＲＮＡ若しくはＲＮＡ編集エンティティをコードするベクターを細胞に導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子爆撃、マイクロインジェクション、遺伝子銃、エレクトロポレーション等を含み得る。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を産生するための方法は、本明細書の方法に好適であり得る。操作されたガイドＲＮＡ、又は化学修飾されていない操作されたガイドＲＮＡ若しくはＲＮＡ編集エンティティをコードするベクターを宿主細胞に導入するための１つの方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションであり得る。

操作されたガイドＲＮＡ、又は化学修飾されていない操作されたガイドＲＮＡ若しくはＲＮＡ編集エンティティをコードするベクターを細胞に導入するための化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、ビーズ等のコロイド分散系、並びに水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースの系を含み得る。インビトロ及びインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）であり得る。標的化されたナノ粒子又は他の好適なミクロン未満のサイズの送達系を用いた、操作されたガイドＲＮＡ、又は操作されたガイドＲＮＡ若しくはＲＮＡ編集エンティティをコードするベクターの送達等、核酸の最先端の他の標的送達方法が利用可能であり得る。

非ウイルス送達系が利用され得る場合において、例示的な送達ビヒクルは、リポソームであり得る。脂質製剤の使用は、（インビトロ、エクスビボ、又はインビボで）操作されたガイドＲＮＡ、又は化学修飾されていない操作されたガイドＲＮＡ若しくはＲＮＡ編集エンティティをコードするベクターを細胞に導入するために企図され得る。別の態様において、操作されたガイドＲＮＡ、又は化学修飾されていない操作されたガイドＲＮＡ若しくはＲＮＡ編集エンティティをコードするベクターは、脂質と会合し得る。脂質と会合した、操作されたガイドＲＮＡ、又は化学修飾されていない操作されたガイドＲＮＡ若しくはＲＮＡ編集エンティティをコードするベクターは、いくつかの実施形態において、リポソームの水性内側に封入され、リポソームの脂質二重層内に散在し、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの両方と会合し得る連結分子によってリポソームに接続し、リポソーム中に閉じ込められ、リポソームと複合体化し、脂質を含有する溶液に分散し、脂質と混合し、脂質と組み合わされ、液体中に懸濁液として含有され、ミセルと共に含有されるか、又は複合体化され、あるいはその他の方法で脂質と会合してもよい。脂質、脂質／ＤＮＡ又は脂質／発現ベクターに会合した組成物は、溶液中の任意の特定の構造に限定されない。例えば、いくつかの実施形態において、それらは二重層構造中に、ミセルとして、又は「崩壊した」構造と共に存在してもよい。代替的に、それらは、単に溶液中に散在してもよく、場合によっては、サイズ又は形状が均一ではない凝集体を形成する。脂質は、いくつかの実施形態において、天然に存在する脂質又は合成脂質である脂質基質であり得る。例えば、脂質には、細胞質内に天然に存在する脂肪小滴、並びに長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドを含有する化合物の一種が含まれる。

使用に好適な脂質は、商業的な供給源から得られ得る。例えば、いくつかの実施形態において、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．から得られてもよく、いくつかの実施形態において、ジセチルホスフェート（「ＤＣＰ」）は、Ｋ ＆ Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）から得られてもよく、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、いくつかの実施形態において、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから得られてもよく、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）。クロロホルム又はクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、多くの場合、約－２０℃で保存され得る。クロロホルムは、メタノールよりも容易に蒸発し得るため、唯一の溶媒として使用され得る。「リポソーム」は、閉じ込められた脂質二重層又は凝集体の生成によって形成された様々な単一及び多層の脂質ビヒクルを包含する一般用語であり得る。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内側水性媒体を有する小胞状構造を有することを特徴とし得る。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。多層リポソームは、リン脂質が過剰の水溶液中に懸濁されるときに自発的に形成され得る。脂質構成要素は、閉じられた構造の形成の前に自己再配列を受け、脂質二重層の間に水及び溶解した溶質を捕捉する。しかしながら、溶液中で通常の小胞体構造とは異なる構造を有する組成物もまた、包含され得る。例えば、脂質は、いくつかの実施形態において、ミセル構造を想定するか、又は単に脂質分子の不均一な凝集体として存在する。リポフェクタミン－核酸複合体も企図される。

いくつかの場合において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡ、又は化学修飾されていない操作されたガイドＲＮＡ若しくはＲＮＡ編集エンティティをコードするベクターを包装し、細胞外小胞体を介して細胞に送達することができる。細胞外小胞体は、任意の膜に結合した粒子であり得る。いくつかの実施形態において、細胞外小胞体は、少なくとも１つの細胞によって分泌される任意の膜に結合した粒子であり得る。いくつかの場合において、細胞外小胞体は、インビトロで合成された任意の膜に結合した粒子であり得る。いくつかの場合において、細胞外小胞体は、細胞なしで合成された任意の膜に結合した粒子であり得る。いくつかの場合において、細胞外小胞体は、エクソソーム、マイクロ小胞体、レトロウイルス様粒子、アポトーシス体、アポトソーム、オンコソーム、エクソファー、封入されたウイルス、エクソマー、又は他の非常に大きな細胞外小胞体であり得る。

いくつかの場合において、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡ、又は化学修飾されていない操作されたガイドＲＮＡ若しくはＲＮＡ編集エンティティをコードするベクターは、操作されたガイドＲＮＡ、又は化学修飾されていない操作されたガイドＲＮＡ若しくはＲＮＡ編集エンティティをコードするベクターをまず同種異系細胞又は自家細胞に導入することによって生成されるトランスジェニック細胞の使用を介して、それを必要とする対象に投与することができる。いくつかの場合において、細胞を単離することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、対象から単離され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｔ細胞等の免疫細胞であり得る。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡに結合すると、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチド（例えば、化学修飾を含まない参照ポリヌクレオチド）と比較して、標的ＲＮＡを編集するためのＲＮＡ編集エンティティを動員する際により効率的であり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、標的ＲＮＡを編集するためのＲＮＡ編集エンティティを動員する際に、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く効率的であり得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡを編集する効率を測定して、Ｓａｎｇｅｒ配列決定又はｄｄＰＣＲ産物の配列決定等の方法によって、編集された標的ＲＮＡを増幅し、配列決定することができる。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡに結合すると、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、標的ＲＮＡを編集するためのＲＮＡ編集エンティティを動員する際により特異的であり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、標的ＲＮＡを編集するためのＲＮＡ編集エンティティを動員する際に、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く特異的であり得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡを編集する特異性を決定して、Ｓａｎｇｅｒ配列決定又はｄｄＰＣＲ産物の配列決定等の方法によって、編集された標的ＲＮＡを増幅し、配列決定することができる。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、加水分解による分解に対する抵抗性の増加を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、加水分解による分解に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く抵抗性であり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡを細胞と接触させ得る場合に、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、加水分解による分解に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く抵抗性であり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡを投与されることを必要とする対象にそれを行い得る場合に、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、加水分解による分解に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く抵抗性であり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡが対象において循環中にあり得る場合に、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、加水分解による分解に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く抵抗性であり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡを標的ＲＮＡと接触させ得る場合に、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、加水分解による分解に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く抵抗性であり得る。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、ヌクレアーゼ消化による分解に対する抵抗性の増加を含む。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、ヌクレアーゼ消化による分解に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く抵抗性であり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡを細胞と接触させ得る場合に、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、ヌクレアーゼ消化による分解に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く抵抗性であり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡを投与されることを必要とする対象にそれを行い得る場合に、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、ヌクレアーゼ消化による分解に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く抵抗性であり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡが対象において循環中にあり得る場合に、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、ヌクレアーゼ消化による分解に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く抵抗性であり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡを標的ＲＮＡと接触させ得る場合に、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、ヌクレアーゼ消化による分解に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く抵抗性であり得る。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、より少ない免疫原性を誘導する。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドによって誘導される免疫原性と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く、免疫原性を誘導しにくくあり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、より少ない免疫原性を誘導する。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡが細胞中にあり得る場合に、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドによって誘導される免疫原性と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く、免疫原性を誘導しにくくあり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、より少ない免疫原性を誘導する。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡを投与されることを必要とする対象にそれを行い得る場合に、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドによって誘導される免疫原性と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く、免疫原性を誘導しにくくあり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、より少ない免疫原性を誘導する。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡが対象において循環中にあり得る場合に、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドによって誘導される免疫原性と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く、免疫原性を誘導しにくくあり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、より少ない免疫原性を誘導する。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡを標的ＲＮＡと接触させ得る場合に、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドによって誘導される免疫原性と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く、免疫原性を誘導しにくくあり得る。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、より少ない自然免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドによって誘導される自然免疫応答と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く、自然免疫応答を誘導しにくくあり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、より少ない自然免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡが細胞中にあり得る場合に、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドによって誘導される自然免疫応答と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く、自然免疫応答を誘導しにくくあり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、より少ない自然免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡを投与されることを必要とする対象にそれを行い得る場合に、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドによって誘導される自然免疫応答と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く、自然免疫応答を誘導しにくくあり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、より少ない自然免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡが対象において循環中にあり得る場合に、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドによって誘導される自然免疫応答と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く、自然免疫応答を誘導しにくくあり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、より少ない自然免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡを標的ＲＮＡと接触させ得る場合に、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドによって誘導される自然免疫応答と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く、自然免疫応答を誘導しにくくあり得る。

いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡと接触すると、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドによって誘導される同じＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのオフターゲット編集と比較して、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのオフターゲット編集を誘導しにくくあり得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、少なくとも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、又はそれより多く、オフターゲット編集を誘導しにくくあり得る。いくつかの実施形態において、オフターゲット化の有病率を測定して、Ｓａｎｇｅｒ配列決定又はｄｄＰＣＲ産物の配列決定等の方法によって、編集された標的ＲＮＡを増幅し、配列決定することができる。

治療方法
いくつかの実施形態において、治療有効量の本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡを含む薬学的組成物、又は本明細書に記載の組成物を対象に投与することによる、対象を治療する方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、疾患又は状態を治療又は予防することを必要とする対象においてそれを行う方法は、その疾患又は状態を有する対象に操作されたガイドＲＮＡを投与することによって、対象においてその疾患又は状態を治療又は予防し、操作されたガイドＲＮＡが、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドと比較して、少なくとも１個の化学修飾を含み、操作されたガイドＲＮＡが、標的ＲＮＡの少なくとも一部分と会合し、標的ＲＮＡと会合した少なくとも１つの構造的特徴を形成し、少なくとも１つの構造的特徴が、ＲＮＡ編集エンティティを動員し、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基の化学修飾を容易にする。

いくつかの場合において、本明細書に記載の方法によって治療される疾患又は状態は、ＲＡＢ７Ａ、ＡＢＣＡ４、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＡＰＰ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ Ｇ１２２６Ｒ、ＨＦＥ Ｃ２８２Ｙ、ＬＩＰＡ ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ、ＰＣＳＫ９開始部位、又はＳＣＮＮ１Ａ開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせ中の変異によって引き起こされ得る。いくつかの実施形態において、疾患又は状態は、神経性疾患又は状態を含み、神経性疾患若しくは状態、又は神経発達的疾患若しくは状態は、パーキンソン病、アルツハイマー病、又は認知症を含む。いくつかの実施形態において、疾患又は状態は、肝臓疾患又は状態、例えば、肝硬変を含む。いくつかの実施形態において、肝臓疾患又は状態は、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴ欠乏症）であり得る。いくつかの実施形態において、疾患又は状態は、黄斑変性を含む。いくつかの実施形態において、黄斑変性は、スターガルト病であり得る。

いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、対象に単独で投与され得る（例えば、スタンドアロン治療）。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、追加の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、疾患又は状態の第１選択治療であり得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、第２選択治療、第３選択治療、又は第４選択治療であり得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、又はそれより多くの操作されたガイドＲＮＡを含み得る。一般に、本明細書に開示される方法は、経口投与によって薬学的組成物を投与することを含む。しかしながら、いくつかの場合において、方法は、腹腔内注射によって薬学的組成物を投与することを含み得る。いくつかの場合において、方法は、肛門坐剤の形態で薬学的組成物を投与することを含み得る。いくつかの場合において、方法は、静脈内（「ｉ．ｖ．」）投与によって薬学的組成物を投与することを含み得る。皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、経皮注射経皮投与、鼻腔内投与、リンパ内注射、直腸投与、胃内投与、又は任意の他の好適な非経口投与等の他の経路によって、本明細書に開示される薬学的組成物を投与することも可能であると考えられ得る。いくつかの実施形態において、損傷又は炎症の部位に近い局所送達のための経路は、全身経路よりも好ましい場合がある。治療薬を投与する経路、投薬量、時点、及び期間を調整することができる。いくつかの実施形態において、治療薬の投与は、疾患又は状態の急性症状及び慢性症状のいずれか又は両方の発症の前又は後であり得る。

対象に投与される好適な用量及び投薬量は、限定されないが、特定の薬学的組成物、疾患状態及びその重症度、治療を必要とする対象の同一性（例えば、体重、性別、年齢）を含む因子によって決定されてもよく、例えば、投与される特定の薬剤、投与経路、治療される状態、及び治療される対象を含む、症例を取り巻く特定の状況に従って決定され得る。

いくつかの実施形態において、薬学的組成物の投与は、毎時、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間，７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間 ２２時間、２３時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１年間、２年間、３年間、４年間、又は５年間、又は１０年間に１回であり得る。有効投薬量範囲は、治療に対する対象の応答に基づいて調節することができる。いくつかの投与経路は、他の経路よりも高い濃度の有効量の治療薬を必要とする。

特定の実施形態において、対象の状態が改善しない場合、医師の裁量により、薬学的組成物の投与は、慢性的に、すなわち、対象の疾患又は状態の症状を軽減するか、又は他の方法で制御若しくは制限するために、対象の生涯を通じてを含め、長期間にわたって行われ得る。対象の状況が改善される特定の実施形態において、投与される薬学的組成物の用量は、一時的に減らされてもよく、又は特定の期間（すなわち、「休薬期間」）にわたって一時的に停止されてもよい。特定の実施形態において、休薬期間の長さは、単なる例として、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１０日間、１２日間、１５日間、２０日間、２８日間、又は２８日間より長くを含め、２日間～１年間であり得る。休薬期間中の用量減少は、単なる例として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、及び１００％を含め、単なる例として、１０％～１００％である。特定の実施形態において、投与される薬学的組成物の用量は、一時的に減らされてもよく、又は特定の期間（すなわち、「薬物離脱」）にわたって一時的に停止されてもよい。特定の実施形態において、薬学的組成物離脱の長さは、単なる例として、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１０日間、１２日間、１５日間、２０日間、２８日間、又は２８日間より長くを含め、２日間～１年間であり得る。薬学的組成物離脱中の用量減少は、単なる例として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、及び１００％を含め、単なる例として、１０％～１００％である。好適な期間の後、任意選択的に、通常の投薬スケジュールに復帰してもよい。

いくつかの実施形態において、対象の状態の改善が生じたら、必要に応じて維持用量を投与してもよい。その後、特定の実施形態において、改善された疾患、障害又は状態が保持され得るレベルまで、症状の関数として、投薬量又は投与頻度、又はその両方を低減してもよい。しかしながら、特定の実施形態において、対象は、症状の何らかの再発に応じて、長期的に断続的な治療を必要とする。

かかる治療レジメンの毒性及び治療有効性は、限定されないが、ＬＤ５０及びＥＤ５０の決定を含む、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であってもよく、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比率として表されてもよい。特定の実施形態において、細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトを含む哺乳動物において使用するための治療に有効な１日投薬量範囲及び／又は治療に有効な単位投薬量を製剤化する際に使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物の１日投薬量は、最小限の毒性を有するＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。特定の実施形態において、１日投薬範囲及び／又は単位投薬量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化する。

薬学的組成物を、単独で、又は追加の薬剤と組み合わせて使用することができる。いくつかの場合において、本明細書で使用される「追加の薬剤」は、単独で投与されてもよい。薬学的組成物及び追加の薬剤は、一緒に、又は連続して投与することができる。併用療法は、同じ日の間に投与することができ、又は１日以上、数週間、数ヶ月間、若しくは数年間間隔をあけて投与することができる。

疾患適用及び標的
本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチド（すなわち、化学修飾された操作されたポリヌクレオチド）を使用して、対象において疾患又は状態を治療することができる。疾患又は状態は、神経変性疾患、筋肉障害、代謝障害、眼障害（例えば、眼疾患）、がん、肝臓疾患（アルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠乏症）、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。疾患又は状態は、嚢胞性線維症、アルビノ、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、遠位脊髄筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性大腸、ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性へモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性汎血球凝集症候群、レーバー先天性黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィーＩ型及びＩＩ型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型、及びＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、パーキンソン病、ポイツ・イェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛運動不全症、プロトロンビン変異関連障害、例えば、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異、肺動脈性肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、タウオパチー、シヌクレイン病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球症、脊髄性筋萎縮症、スターガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全症、がんの様々な形態（例えば、ＢＲＣＡ１及び２に関連する乳がん及び卵巣がん）を含み得る。いくつかの場合において、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病）等の疾患又は状態の治療は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｔａｕ、アルファ－シヌクレイン、又はこれらの任意の組み合わせの編集、ノックダウン、又はその両方をもたらすことを含み得る。いくつかの場合において、ＡＰＰ、ｔａｕ、及びアルファ－シヌクレインは、病原性バリアントを含み得る。いくつかの場合において、ＡＰＰは、Ａ６７３Ｖ変異又はＡ６７３Ｔ変異等の病原性バリアントを含み得る。いくつかの場合において、神経変性疾患（パーキンソン病）等の疾患又は状態の治療は、ＬＲＲＫ２の病原性バリアントの編集、ノックダウン、又はその両方をもたらすことを含み得る。いくつかの場合において、ＬＲＲＫの病原性バリアントは、Ｇ２０１９Ｓ変異を含み得る。疾患又は状態は、筋ジストロフィー、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、網膜色素変性症、乳がん、卵巣がん、アルツハイマー病、疼痛、スターガルト黄斑ジストロフィー、シャルコー・マリー・トゥース病、レット症候群、タウオパチー、シヌクレイン病、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、Ｒｅｔｔを有する患者において、ミスセンス変異を修正する（例えば、Ｔｒｐをコードするように停止コドンを変異させる）ことができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、パーキンソン病を有する患者において、ミスセンス変異を修正するか、又はノックダウンを誘導することができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、アルツハイマー病を有する患者において、変異を誘導することができ、ＡＰＰにおける切断部位でのタンパク質による切断を低減することができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、筋ジストロフィーを有する患者において、エクソンスキッピングを生成することができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、テイ・サックス病を有する患者において、ＨｅｘＡの変異を修正することができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、テイ・サックス病を有する患者において、ＨｅｘＡの変異を修正することができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、ＡＡＴ欠乏症を有する患者において、変異を修正する（例えば、ＳＥＲＰＩＮＡ１を編集する）ことができる。いくつかの場合において、組成物の投与は、（ａ）投与前の遺伝子の発現と比較して、遺伝子の発現を減少させ、（ｂ）対象（例えばそれを必要とする対象）において少なくとも１つの点変異を編集し、（ｃ）対象において少なくとも１つの停止コドンを編集して、停止コドンのリードスルーをもたらし、（ｄ）対象においてエクソンスキップをもたらし、又は（ｅ）これらの任意の組み合わせにとって十分なものであり得る。疾患又は状態は、筋ジストロフィーを含み得る。筋ジストロフィーとしては、筋緊張性、デュシェンヌ型、ベッカー型、肢帯、顔面肩甲上腕型、先天性、眼咽頭型、遠位、エメリー・ドレイフス、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。疾患又は状態は、慢性疼痛等の疼痛を含み得る。疼痛には、神経障害性疼痛、侵害受容性疼痛、又はそれらの組み合わせが含まれ得る。侵害受容性疼痛には、内臓疼痛、体性疼痛、又はそれらの組み合わせが含まれ得る。特定の仕様の疾患又は状態、及び関連する標的を以下に言及する。

ＡＰＰ。いくつかの実施形態において、本開示は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のＲＮＡ編集を容易にすることができる、化学修飾された操作されたポリヌクレオチドのその使用の組成物及び方法を提供する。例えば、化学修飾され操作されたポリヌクレオチドは、ＡＰＰ中の切断部位の編集を容易にすることができ、その結果、ベータ／ガンマセクレターゼは、ＡＰＰの切断の低減を示すか、又はもはやＡＰＰを切断することができず、したがって、Ａｂｅｔａ ４０／４２のレベルが低減するか、又はＡｂｅｔａを産生することができない。いくつかの実施形態において、本開示の化学修飾された操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集のためのＡＰＰにおける以下の部位のうちの任意の１つ又は任意の組み合わせを標的化し得る。Ｋ６７０Ｅ、Ｋ６７０Ｒ、Ｋ６７０Ｇ、Ｍ６７１Ｖ、Ａ６７３Ｖ、Ａ６７３Ｔ、Ｄ６７２Ｇ、Ｅ６８２Ｇ、Ｈ６８４Ｒ、Ｋ６８７Ｒ、Ｋ６８７Ｅ、又はＫ６８７Ｇ、Ｉ７１２Ｘ、又はＴ７１４Ｘ。ＡＰＰ遺伝子又は転写産物を標的化する化学修飾された操作されたポリヌクレオチドの配列は、ＡＰＰ遺伝子又は転写産物に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の相補性を有する標的化ドメインを含み得る。上述の化学修飾された操作されたポリヌクレオチドを、本明細書に開示される任意の投与経路を介して、それを必要とする対象に投与され得る。対象は、ヒトであってもよく、アルツハイマー病を発症するリスクがあり得、又はアルツハイマー病を発症している。対象は、ヒトであってもよく、ＡＰＰが疾患の病態に影響を及ぼす神経性疾患を発症するリスクがあり得、又はその神経性疾患を発症している。したがって、化学修飾された操作されたポリヌクレオチドは、神経性疾患（例えば、アルツハイマー病）の治療方法において使用され得る。

ＡＢＣＡ４。いくつかの実施形態において、本開示は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）のＲＮＡ編集を容易にすることができる、操作されたポリヌクレオチド（すなわち、化学修飾された操作されたポリヌクレオチド）のその使用の組成物及び方法を提供する。例えば、化学修飾された操作されたポリヌクレオチドは、ＡＢＣＡ４遺伝子中のヌクレオチド位置６３２０にあるＡによるＧの修正、ＡＢＣＡ４遺伝子中のヌクレオチド位置５７１４にあるＡによるＧの修正、及び／又はＡＢＣＡ４遺伝子中のヌクレオチド位置５７１４にあるＡによるＧの修正を容易にすることができる。ＡＢＣＡ４遺伝子又は転写産物を標的化する化学修飾された操作されたポリヌクレオチドの配列は、ＡＢＣＡ４遺伝子又は転写産物に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の相補性を有する標的化ドメインを含み得る。上述の化学修飾された操作されたポリヌクレオチドを、本明細書に開示される任意の投与経路を介して、それを必要とする対象に投与され得る。対象は、ヒトであってもよく、スターガルト黄斑変性を発症するリスクがあり得、又はスターガルト黄斑変性を発症している。このようなスターガルト黄斑変性は、ＡＢＣＡ４の変異によって少なくとも部分的に引き起こされる可能性があり、このために、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチド配列は、ＡＢＣＡ４における編集を容易にし、したがって、ＡＢＣＡ４における変異を修正し、対象におけるスターガルト黄斑変性の発生を低減することができる。したがって、化学修飾された操作されたポリヌクレオチドは、スターガルト黄斑変性の治療方法において使用され得る。

アルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）。アルファ－シヌクレイン遺伝子は、５個のエクソンで構成され、予測分子量が約１４．５ｋＤａの１４０アミノ酸タンパク質をコードする。コードされた産物は、機能が未知の本質的に無秩序なタンパク質である。通常、アルファ－シヌクレインは、単量体である。特定のストレス条件又は他の未知の原因の下で、α－シヌクレインは、自己凝集してオリゴマーになる。レビー小体に関連する病態（ＬＲＰ）は、主に、解剖学的に確認されたアルツハイマー病患者の脳の５０％より多くにおけるアルファ－シヌクレインで構成されていた。アルファ－シヌクレインがアルツハイマー病の発症にどのように影響を与えるかの分子機構は不明であるが、実験的証拠は、アルファ－シヌクレインが、Ｔａｕ－ｐと相互作用し、Ｔａｕ－ｐの細胞内凝集の種となり得ることを示している。更に、アルファ－シヌクレインは、Ｔａｕ高リン酸化を媒介することができる、ＧＳＫ３βの活性を調節することができる。アルファ－シヌクレインは、自己組織化して、病原性凝集体（レビー小体）ともなり得る。Ｔａｕ及びα－シヌクレインの両方が、細胞外空間に放出され、他の細胞に拡散され得る。血管異常は、栄養素の共有及び代謝副産物の除去を損ない、微小梗塞を引き起こし、グリア細胞の活性化を促進する。したがって、Ｔａｕ形成、アルファ－シヌクレイン形成、又はこれらの組み合わせを実質的に低減するための多重戦略は、神経変性疾患を効果的に治療する際に重要であり得る。

アルファ－シヌクレインのドメイン構造は、Ｎ末端Ａ２脂質結合アルファらせんドメインと、非アミロイドβ構成要素（ＮＡＣ）ドメインと、Ｃ末端酸性ドメインと、を含む。脂質結合ドメインは、５つのＫＸＫＥＧＶ不完全リピートからなる。ＮＡＣドメインは、ＶＧＧＡＶＶＴＧＶコンセンサス配列及び３つのＧＸＸＸサブモチーフを有するＧＡＶモチーフからなり、Ｘは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、又はＭｅｔのうちのいずれかである。Ｃ末端酸性ドメインは、ＤＰＤＮＥＡコンセンサス配列を有する銅結合モチーフを含有する。分子学的には、アルファ－シヌクレインは、ニューロン伝達及びＤＮＡ修復において役割を果たすことが示唆されている。

いくつかの場合において、本明細書で提供される組成物を利用して、アルファ－シヌクレインのある領域を標的化し得る。いくつかの場合において、ノックダウンのために本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドを用い、アルファ－シヌクレインｍＲＮＡのある領域を標的化し得る。いくつかの場合において、アルファ－シヌクレインｍＲＮＡのエクソン又はイントロンのある領域を標的化し得る。いくつかの実施形態において、アルファ－シヌクレインｍＲＮＡの非コード配列のある領域（例えば、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ）を標的化し得る。他の場合において、アルファ－シヌクレインｍＲＮＡのコード配列のある領域を標的化し得る。好適な領域としては、限定されないが、Ｎ末端Ａ２脂質結合アルファらせんドメイン、非アミロイドβ構成要素（ＮＡＣ）ドメイン、又はＣ末端酸性ドメインが挙げられる。

いくつかの態様において、アルファ－シヌクレインｍＲＮＡ配列が標的とされる。いくつかの場合において、配列の３、１７７残基のうちのいずれか１つは、本明細書で提供される組成物及び方法を利用して標的とされ得る。いくつかの場合において、標的残基は、残基１～１００、１０１～２００、２０１～３００、３０１～４００、４０１～５００、５０１～６００、６０１～７００、７０１～８００、８０１～９００、９０１～１０００、１００１～１１００、１１０１～１２００、１２０１～１３００、１３０１～１４００、１４０１～１５００、１５０１～１６００、１６０１～１７００、１７０１～１８００、１８０１～１９００、１９０１～２０００、２００１～２１００、２１０１～２２００、２２０１～２３００、２３０１～２４００、２４０１～２５００、２５０１～２６００、２６０１～２７００、２７０１～２８００、２８０１～２９００、２９０１～３０００、３００１～３１００、及び／又は３１０１～３１７７の中に位置し得る。

いくつかの実施形態において、本開示は、ＳＮＣＡのＲＮＡ編集を容易にすることができる、操作されたポリヌクレオチド（すなわち、化学修飾された操作されたポリヌクレオチド）のその使用の組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態において、化学修飾された操作されたポリヌクレオチドは、例えば、ＳＮＣＡ遺伝子の３’ＵＴＲにおける編集を容易にすることによって、ＳＮＣＡの発現をノックダウンすることができる。ＳＮＣＡ遺伝子又は転写産物を標的化する化学修飾された操作されたポリヌクレオチドの配列は、ＳＮＣＡ遺伝子又は転写産物に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の相補性を有する標的化ドメインを含み得る。上述の化学修飾された操作されたポリヌクレオチドを、本明細書に開示される任意の投与経路を介して、それを必要とする対象に投与され得る。対象は、ヒトであってもよく、アルツハイマー病又はパーキンソン病を発症するリスクがあり得、又はアルツハイマー病又はパーキンソン病を発症している。対象は、ヒトであってもよく、ＳＮＣＡの過剰発現が疾患の病態に影響を及ぼす神経性疾患を発症するリスクがあり得、又はその神経性疾患を発症している。したがって、化学修飾された操作されたポリヌクレオチドは、神経性疾患（例えば、アルツハイマー病）の治療方法において使用され得る。

ＳＥＲＰＩＮＡ１。いくつかの実施形態において、本開示は、セルピンファミリーＡメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）のＲＮＡ編集を容易にすることができる、操作されたポリヌクレオチド（すなわち、化学修飾された操作されたポリヌクレオチド）のその使用の組成物及び方法を提供する。例えば、化学修飾された操作されたポリヌクレオチドは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のヌクレオチド位置９９８９におけるＧからＡへの変異の補正を容易にすることができる。いくつかの実施形態において、化学修飾された操作されたポリヌクレオチドは、例えば、ＳＥＲＰＩＮＡ１のＥ３４２を標的化し得る。ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子又は転写産物を標的化するように構成された、化学修飾された操作されたポリヌクレオチドの配列は、ＳＥＰＲＩＮＡ１遺伝子又は転写産物に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有する標的化ドメインを含み得る。上述の化学修飾された操作されたポリヌクレオチドを、本明細書に開示される任意の投与経路を介して、それを必要とする対象に投与され得る。対象は、ヒトであってもよく、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症を発症するリスクがあり得、又はアルファ－１－アンチトリプシン欠乏症を発症している。このようなアルファ－１－アンチトリプシン欠乏症は、ＳＥＲＰＩＮＡ１の変異によって少なくとも部分的に引き起こされる可能性があり、このために、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチド配列は、ＳＥＲＰＩＮＡ１における編集を容易にし、したがって、ＳＥＲＰＩＮＡ１における変異を修正し、対象におけるアルファ－１－アンチトリプシン欠乏症の発生を低減することができる。したがって、化学修飾された操作されたポリヌクレオチドは、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症の治療方法において使用され得る。

ＬＲＲＫ２。ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）は、パーキンソン病、及びクローン病等の免疫関連障害の家族性及び孤発性の症例と関連がある。その別名には、ＬＲＲＫ２、ＡＵＲＡ１７、ＤＡＲＤＡＲＩＮ、ＰＡＲＫ８、ＲＩＰＫ７、ＲＯＣＯ２、又はロイシンリッチリピートキナーゼ２が含まれる。ＬＲＲＫ２遺伝子は、５１個のエクソンで構成され、予測分子量が約２８６ｋＤａの２５２７アミノ酸タンパク質をコードする。コードされた産物は、キナーゼ及びＧＴＰアーゼ活性を有するマルチドメインタンパク質である。ＬＲＲＫ２は、限定されないが、副腎、虫垂、骨髄、脳、結腸、十二指腸、子宮内膜、食道、脂肪、胆嚢、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、甲状腺、及び膀胱を含む様々な組織及び臓器において見出され得る。ＬＲＲＫ２は、普遍的に発現可能であるが、一般的に、脳、腎臓、及び肺組織中により豊富に存在する。細胞学的に、ＬＲＲＫ２は、アストロサイト、内皮細胞、ミクログリア、ニューロン、及び末梢免疫細胞において見出されている。

ＬＲＲＫ２には１００を超える変異が特定されており、そのうちの６つ（Ｇ２０１９Ｓ、Ｒ１４４１Ｃ／Ｇ／Ｈ、Ｙ１６９９Ｃ、及びＩ２０２０Ｔ）は、分離分析によって、パーキンソン病を引き起こすことが示されている。Ｇ２０１９Ｓ及びＲ１４４１Ｃは、遺伝性の症例において、最も一般的な疾患を引き起こす変異である。孤発性の症例において、これらの変異は、年齢依存性の浸透率を示している。疾患を発症するＧ２０１９Ｓ変異を保有する個人の割合は、年齢が５０歳～７０歳まで増加すると、１７％～８５％まで跳ね上がる。いくつかの場合において、変異を保有する個人は、疾患を発症することはない。

ＬＲＲＫ２は、その触媒コアに、複合タンパク質（Ｒｏｃ）のＲａｓ、ＲＯＣのＣ末端（ＣＯＲ）、及びキナーゼドメインを含有する。このコアに隣接する複数のタンパク質－タンパク質相互作用ドメインである、アルマジロ反復（ＡＲＭ）領域、アンキリン反復（ＡＮＫ）領域、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）ドメインは、Ｃ末端ＷＤ４０ドメインによって接合されたＮ末端に見出される。Ｇ２０１９Ｓ変異は、キナーゼドメイン内に位置する。それがキナーゼ活性を増加させることが示されている。Ｒ１４４１Ｃ／Ｇ／Ｈ及びＹ１６９９Ｃについて、これらの変異はＲｏｃドメインのＧＴＰａｓｅ活性を低下させ得る。ゲノムワイド関連研究は、ＬＲＲＫ２における共通の変動が、孤発性パーキンソン病を発症するリスクを増加させることを発見した。これらの変動のいくつかは、タンパク質の結合又は触媒活性に影響を与える非保存的変異であるが、その他は、その発現を調節する。これらの結果は、特定の対立遺伝子又はハプロタイプが、ＬＲＲＫ２発現を調節することができることを示唆している。

炎症促進シグナルは、様々な免疫細胞型においてＬＲＲＫ２発現を上方調節し、このことは、ＬＲＲＫ２が、免疫応答における重要な調節因子であることを示唆している。研究から、全身及び中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症が両方とも、パーキンソン病の症状に関与することを発見した。更に、パーキンソン病と関連するＬＲＲＫ２変異は、炎症性刺激に応答して、その発現レベルを調節する。ＬＲＲＫ２の多くの変異は、炎症性腸疾患（例えばクローン病）等の免疫関連障害と関連している。例えば、Ｇ２０１９Ｓ及びＮ２０８１Ｄは両方とも、ＬＲＲＫ２のキナーゼ活性を増加させ、特定の集団内のクローン病患者において過剰に表される。これらの障害におけるその重要な役割のため、ＬＲＲＫ２は、パーキンソン病及びクローン病の重要な治療標的である。特に、Ｇ２０１９Ｓを含む点変異等の多くの変異は、これらの疾患の発症において役割を果たし、ＬＲＲＫ２を、ＲＮＡ編集等の治療戦略にとって魅力的なものとする。

いくつかの実施形態において、本開示は、ＬＲＲＫ２のＲＮＡ編集を容易にすることができる、操作されたポリヌクレオチド（すなわち、化学修飾された操作されたポリヌクレオチド）のその使用の組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態において、化学修飾された操作されたポリヌクレオチドは、ＬＲＲＫ２における以下の変異を標的化し得る。Ｅ１０Ｌ、Ａ３０Ｐ、Ｓ５２Ｆ、Ｅ４６Ｋ、Ａ５３Ｔ、Ｌ１１９Ｐ、Ａ２１１Ｖ、Ｃ２２８Ｓ、Ｅ３３４Ｋ、Ｎ３６３Ｓ、Ｖ３６６Ｍ、Ａ４１９Ｖ、Ｒ５０６Ｑ、Ｎ５４４Ｅ、Ｎ５５１Ｋ、Ａ７１６Ｖ、Ｍ７１２Ｖ、Ｉ７２３Ｖ、Ｐ７５５Ｌ、Ｒ７９３Ｍ、Ｉ８１０Ｖ、Ｋ８７１Ｅ、Ｑ９２３Ｈ、Ｑ９３０Ｒ、Ｒ１０６７Ｑ、Ｓ１０９６Ｃ、Ｑ１１１１Ｈ、Ｉ１１２２Ｖ、Ａ１１５１Ｔ、Ｌ１１６５Ｐ、Ｉ１１９２Ｖ、Ｈ１２１６Ｒ、Ｓ１２２８Ｔ、Ｐ１２６２Ａ、Ｒ１３２５Ｑ、Ｉ１３７１Ｖ、Ｒ１３９８Ｈ、Ｔ１４１０Ｍ、Ｄ１４２０Ｎ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｒ１４４１Ｈ、Ａ１４４２Ｐ、Ｐ１４４６Ｌ、Ｖ１４５０Ｉ、Ｋ１４６８Ｅ、Ｒ１４８３Ｑ、Ｒ１５１４Ｑ、Ｐ１５４２Ｓ、Ｖ１６１３Ａ、Ｒ１６２８Ｐ、Ｍ１６４６Ｔ、Ｓ１６４７Ｔ、Ｙ１６９９Ｃ、Ｒ１７２８Ｈ、Ｒ１７２８Ｌ、Ｌ１７９５Ｆ、Ｍ１８６９Ｖ、Ｍ１８６９Ｔ、Ｌ１８７０Ｆ、Ｅ１８７４Ｘ、Ｒ１９４１Ｈ、Ｙ２００６Ｈ、Ｉ２０１２Ｔ、Ｇ２０１９Ｓ、Ｉ２０２０Ｔ、Ｔ２０３１Ｓ、Ｎ２０８１Ｄ、Ｔ２１４１Ｍ、Ｒ２１４３Ｈ、Ｙ２１８９Ｃ、Ｔ２３５６Ｉ、Ｇ２３８５Ｒ、Ｖ２３９０Ｍ、Ｅ２３９５Ｋ、Ｍ２３９７Ｔ、Ｌ２４６６Ｈ、又はＱ２４９０ＮｆｓＸ３。ＬＲＲＫ２遺伝子又は転写産物を標的化するように構成された、化学修飾された操作されたポリヌクレオチドの配列は、ＬＲＲＫ２遺伝子又は転写産物に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の相補性を有する標的化ドメインを含み得る。上述の化学修飾された操作されたポリヌクレオチドを、本明細書に開示される任意の投与経路を介して、それを必要とする対象に投与され得る。対象は、ヒトであってもよく、ＬＲＲＫ２中の変異と関連する疾患又は状態（例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）又は胃腸（ＧＩ）管の疾患）を発症するリスクがあり得、又はそれを発症している。例えば、このような状態の疾患としては、クローン病又はパーキンソン病が挙げられる。このようなＣＮＳ又はＧＩ管疾患（例えば、クローン病又はパーキンソン病）は、ＬＲＲＫ２の変異によって少なくとも部分的に引き起こされる可能性があり、このために、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチド配列は、ＬＲＲＫ２における編集を容易にし、したがって、ＬＲＲＫ２における変異を修正し、対象におけるＣＮＳ又はＧＩ管疾患の発生を低減することができる。したがって、化学修飾された操作されたポリヌクレオチドは、クローン病又はパーキンソン病の疾患の治療方法において使用され得る。

ＤＭＤ。いくつかの実施形態において、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子のＲＮＡ編集を容易にすることができる、操作されたポリヌクレオチド（すなわち、化学修飾された操作されたポリヌクレオチド）のその使用の組成物及び方法を提供する）。いくつかの実施形態において、化学修飾された操作されたポリヌクレオチドは、ジストロフィンタンパク質を少なくとも部分的にコードするＤＭＤ遺伝子プレｍＲＮＡ中のエクソン５１、４５、５３、４４、４６、５２、５０、４３、６、７、８、５５、２、１１、１７、１９、２１、５７、５９、６２、６３、６５、６６、６９、７４、及び／又は７５等のＤＭＤ遺伝子のエクソンを標的化し得る。ＤＭＤ遺伝子又は転写産物を標的化するように構成された、化学修飾された操作されたポリヌクレオチドの配列は、ＤＭＤ遺伝子又は転写産物に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の相補性を有する標的化ドメインを含み得る。上述の化学修飾された操作されたポリヌクレオチドを、本明細書に開示される任意の投与経路を介して、それを必要とする対象に投与され得る。対象は、ヒトであってもよく、ＤＭＤ遺伝子中の変異と関連する疾患又は状態（例えばＤＭＤ）を発症するリスクがあり得、又はその神経性疾患を発症している。ＤＭＤは、ＤＭＤ遺伝子の変異によって少なくとも部分的に引き起こされる可能性があり、このために、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチド配列は、ＤＭＤ遺伝子における編集を容易にし、したがって、ＤＭＤ遺伝子における変異を修正し、対象におけるＤＭＤの発生を低減することができる。したがって、化学修飾された操作されたポリヌクレオチドは、ＤＭＤ等の疾患の治療方法において使用され得る。

ＴＵＢＢ４Ａ。いくつかの実施形態において、本開示は、ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子のＲＮＡ編集を容易にすることができる、操作されたポリヌクレオチド（すなわち、化学修飾された操作されたポリヌクレオチド）のその使用の組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態において、化学修飾された操作されたポリヌクレオチドは、７４５Ｇ＞Ａのヌクレオチド変異によって引き起こされ得るＴＵＢＢ４Ａ中のＤ２４９Ｎ変異を標的化し得る。ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子又は転写産物を標的化するように構成された、化学修飾された操作されたポリヌクレオチドの配列は、ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子又は転写産物に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の相補性を有する標的化ドメインを含み得る。上述の化学修飾された操作されたポリヌクレオチドを、本明細書に開示される任意の投与経路を介して、それを必要とする対象に投与され得る。対象は、ヒトであってもよく、大脳基底核及び小脳の萎縮症を伴う白質形成不全症（Ｈ－ＡＢＣ）等のＴＵＢＢ４Ａ遺伝子中の変異と関連する疾患又は状態を発症するリスクがあり得、又はそれを発症している。Ｈ－ＡＢＣは、ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子の変異によって少なくとも部分的に引き起こされる可能性があり、このために、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチド配列は、ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子における編集を容易にし、したがって、ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子における変異を修正し、対象におけるＨ－ＡＢＣの発生を低減することができる。したがって、化学修飾された操作されたポリヌクレオチドは、Ｈ－ＡＢＣ等の疾患の治療方法において使用され得る。

薬学的組成物
薬学的組成物は、本明細書で使用される場合、薬学的組成物と、他の化学構成要素（すなわち、薬学的に許容される不活性成分）、例えば、担体、賦形剤、結合剤、充填剤、懸濁剤、香味剤、甘味剤、崩壊剤、分散剤、界面活性剤、滑沢剤、着色剤、希釈剤、可溶化剤、湿潤剤、可塑剤、安定化剤、浸透性向上剤、湿潤剤、消泡剤、酸化防止剤、防腐剤、又はそれらの１つ以上の組み合わせとの混合物を指し得る。任意選択的に、組成物は、本明細書で考察される２つ以上の薬学的組成物を含む。本明細書で提供される治療又は使用の方法を実施する際に、本明細書に記載の治療有効量の薬学的組成物は、治療される疾患、障害、若しくは状態、例えば、炎症性疾患、線維狭窄性疾患、及び／又は線維性疾患を有する哺乳動物に、薬学的組成物で投与されてもよい。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトであり得る。治療有効量は、疾患の重症度、対象の年齢及び相対的な健康状態、使用される薬学的組成物の効力、並びに他の因子に応じて大きく変化し得る。薬学的組成物は、単独で、又は混合物の構成要素としての１つ以上の薬学的組成物と組み合わせて使用することができる。本明細書に記載の薬学的興奮（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｍｏｔｉｏｎ）は、操作されたガイドＲＮＡ、組成物、操作されたガイドＲＮＡと接触したか、若しくは操作されたガイドＲＮＡを含む組成物と接触した細胞、又はこれらの組み合わせを含む。

本明細書に記載の薬学的製剤は、限定されないが、静脈内、動脈内、経口、非経口、口腔内、局所、経皮、直腸、筋肉内、皮下、骨内、経粘膜、吸入、又は腹腔内投与経路を含む適切な投与経路によって対象に投与されてもよい。本明細書に記載される薬学的製剤としては、限定されないが、水性液体分散液、自己乳化分散液、固溶体、リポソーム分散液、エアロゾル、固体剤形、粉末、即時放出製剤、制御放出製剤、速溶融製剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、遅延放出製剤、徐放性製剤、脈動放出製剤、多粒子製剤、並びに即時放出製剤と制御放出製剤の混合物が挙げられる。

薬学的組成物を含む薬学的組成物は、一例として、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、浮遊、乳化、封入、捕捉、又は圧縮プロセス等によって、従来の様式で製造され得る。

薬学的組成物は、遊離酸若しくは遊離塩基形態、又は薬学的に許容される塩形態の活性成分として、少なくとも薬学的組成物を含み得る。加えて、本明細書に記載の方法及び薬学的組成物は、Ｎ－オキシド（適切な場合）、結晶形態、非晶相、並びに同じ種類の活性を有するこれらの化合物の活性代謝物の使用を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、非溶媒和形態で、又は水、エタノール等の薬学的に許容される溶媒との溶媒和形態で存在する。薬学的組成物の溶媒和形態もまた、本明細書に開示されるとみなされる。

いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、互変異性体として存在する。互変異性体は、本明細書に提示される薬剤の範囲内に含まれ得る。したがって、薬学的組成物又はその塩は、互変異性の現象を示し得ることが理解され得る。それにより、水素原子を２つの原子間で交換することにより、そのいずれかに共有結合を形成する、容易に相互変換することが可能であり得る２つの化合物が得られる。互変異性体化合物は互いに移動平衡で存在するため、同じ化合物の異なる異性体形態とみなすことができる。

いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、エナンチオマー、ジアステレオマー、又は他の立体異性体形態として存在する。本明細書に開示される薬剤は、全てのエナンチオマー、ジアステレオマー、及びエピマー形態、並びにそれらの混合物を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の薬学的組成物は、プロドラッグとして調製することができる。「プロドラッグ」は、インビボで親薬物に変換され得る薬剤を指し得る。プロドラッグは、いくつかの状況において、親薬物よりも投与が容易であり得るため、有用であり得る。それらは、例えば、経口投与によって生物学的に利用可能であってもよいが、親物質は、そうではない場合がある。プロドラッグはまた、薬学的組成物中で、親薬物を上回る改善された溶解性を有する場合もある。プロドラッグの例は、限定されないが、本明細書に記載される薬学的組成物であり得るが、エステル（「プロドラッグ」）として投与され、細胞膜を横断しての伝達を容易にしてもよく、水溶性は、移動に有害な場合があるが、次いで、水溶性が有益であり得る細胞内に入ると、カルボン酸、活性酵素に代謝的に加水分解され得る。プロドラッグの更なる例は、ペプチドが活性部分を明らかにするために代謝され得る酸基に結合した短いペプチド（ポリアミノ酸）であり得る。特定の実施形態において、インビボ投与時に、プロドラッグは、薬学的組成物の生物学的、薬学的、又は治療的に活性な形態へと化学的に変換され得る。特定の実施形態において、プロドラッグは、１つ以上のステップ又はプロセスによって、薬学的組成物の生物学的、薬学的、又は治療的に活性な形態へと酵素的に代謝され得る。

プロドラッグがインビボで代謝されて、本明細書に記載される薬剤を産生し得る薬学的組成物のプロドラッグ形態は、特許請求の範囲の範囲内に含まれ得る。プロドラッグがインビボで代謝されて、本明細書に記載される薬剤を産生し得る本明細書に記載の薬学的組成物のプロドラッグ形態は、特許請求の範囲の範囲内に含まれ得る。いくつかの場合において、本明細書に記載の薬学的組成物のいくつかは、別の誘導体又は活性化合物のプロドラッグであり得る。本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、ヒドラゾンは、インビボで代謝されて、薬学的組成物を産生し得る。

キット及び製造物品
特定の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上の方法と共に使用するためのキット及び製造物品が本明細書に開示される。いくつかの場合において、キット又は製造物品は、本明細書に記載の操作されたガイドＲＮＡ、組成物、細胞、又は薬学的組成物を含む。かかるキットは、バイアル、チューブ等の１つ以上の容器を受け入れるようにコンパートメント化され得る担体、包装体、又は容器を含み、容器の各々は、本明細書に記載の方法で使用される別個の要素のうちの１つを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。一実施形態において、容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。

いくつかの実施形態において、キットは、キットの内容物を収容するための好適な包装材料を含む。いくつかの場合において、包装材料は、周知の方法によって構築されてもよく、好ましくは、無菌で汚染物質を含まない環境を提供することができる。本明細書で使用される包装材料は、例えば、核酸配列決定システムと共に使用するために販売される市販のキットで慣習的に利用されるものを含み得る。例示的な包装材料としては、限定されないが、本明細書に記載される構成要素を固定制限内に保持することができるガラス、プラスチック、紙、ホイル等が挙げられる。

包装材料は、構成要素の特定の使用を示すラベルを含み得る。ラベルによって示され得るキットの使用は、キット中に存在する構成要素の特定の組み合わせに対して適切な本明細書に記載の方法のうちの１つ以上であってもよい。

包装された試薬又は構成要素の使用のための説明書も、キットに含まれてもよい。説明書は、典型的には、混合されるキット構成要素及び試料の相対量、試薬／試料混合物の維持期間、温度、緩衝条件等の反応パラメータを説明する有形の発現を含む。

特定の反応に必要な全ての構成要素が特定のキット中に存在する必要はないことが理解されるであろう。むしろ、１つ以上の追加の構成要素を他の供給源から提供することができる。キットと共に提供される説明書は、提供され得る追加の構成要素及びそれらが入手可能な場所を識別することができる。

例えば、「～であろう（ｗｉｌｌ）」、「～しないであろう（ｗｉｌｌ ｎｏｔ）」、「～すべきである（ｓｈａｌｌ）」、「～すべきではない（ｓｈａｌｌ ｎｏｔ）」、「～しなければならない（ｍｕｓｔ）」、「～してはならない（ｍｕｓｔ ｎｏｔ）」、「第１の（ｆｉｒｓｔ）」、「最初に」、「次に」、「その後に」、「～の前」、「～の後」、「最後に（ｌａｓｔｌｙ）」、及び「最後に（ｆｉｎａｌｌｙ）」等の絶対的な用語又は連続的な用語の使用は、いくつかの事象において、本明細書に開示される本実施形態の範囲を限定することを意味するものではなく、例示的なものである。

本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈により明らかにそうではないと指示されない限り、複数の形態も同様に含むことが意図され得る。更に、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語、又はその変形語が、詳細な説明及び／又は特許請求の範囲のいずれかにおいて使用され得る程度まで、そのような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様に、包括的なものであることが意図され得る。

本明細書で使用される場合、「少なくとも１つ」、「１つ以上」、及び／又は「及び／又は」という語句は、連言及び選言の両方が作用し得る、オープンエンドな表現であり得る。例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ、又はＣのうちの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの１つ以上」、「Ａ、Ｂ、又はＣのうちの１つ以上」、及び「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」という表現の各々は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、Ａ及びＢを一緒に、Ａ及びＣを一緒に、Ｂ及びＣを一緒に、又はＡ、Ｂ、及びＣを一緒にを意味する。

本明細書で使用される場合、「又は」は、「及び」、「又は」又は「及び／又は」を指してもよく、排他的及び包括的の両方で使用され得る。例えば、「Ａ又はＢ」という用語は、「Ａ又はＢ」、「ＡであるがＢではない」、「ＢであるがＡではない」、及び「Ａ及びＢ」を指し得る。いくつかの場合において、内容が、特定の意味を規定する場合がある。

本明細書に記載の任意のシステム、方法、ソフトウェア、及びプラットフォームは、モジュール式であり得る。したがって、「第１」及び「第２」等の用語は、必ずしも優先順位、重要性の順序、又は作業の順序を意味しない。

本明細書で使用される「約」又は「およそ」という用語は、量又は濃度等の測定可能な値を指す場合、指定された量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、又は更には０．１％の変動を包含することを意味し得る。例えば、「約」は、当該技術分野における実践によれば、プラス又はマイナス１０％を意味し得る。代替的に、「約」は、所与の値のプラス若しくはマイナス２０％、プラス若しくはマイナス１０％、プラス若しくはマイナス５％、又はプラス若しくはマイナス１％の範囲を意味し得る。代替的に、特に生物学的な系又はプロセスに関して、この用語は、ある値の５倍以内、又は２倍以内の倍数の範囲内を意味し得る。特定の値を、本出願及び特許請求の範囲に記載することができる場合、別途記載のない限り、「約」という用語は、その特定の値について許容可能な誤差範囲内を意味すると考えるべきである。また、値の範囲、部分範囲、又はその両方を提供することができる場合、その範囲又は部分範囲は、その範囲又は部分範囲の端点を含むことができる。「実質的に」、「実質的にない」、「実質的に～でない」、「実質的に含まない」、及び「およそ」という用語は、記載されている値が、合理的な期待値の範囲内であり得ることを示す、大きさ、位置、又は両方を説明するときに使用することができる。例えば、ある数値は、述べられている値（又は値の範囲）の±０．１％、述べられている値（又は値の範囲）の±１％、述べられている値（又は値の範囲）の±２％、述べられている値（又は値の範囲）の±５％、述べられている値（又は値の範囲）の±１０％等であり得る値を有していてもよい。本明細書に引用される任意の数値範囲は、その中に属する全ての部分範囲を含むことを意図し得る。

本明細書で「Ａ及び／又はＢ」等の語句で使用される「及び／又は」という用語は、Ａ及びＢの両方、Ａ又はＢ、Ａ（単独）、並びにＢ（単独）を含むことを意図し得る。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」等の語句で使用される「及び／又は」という用語は、以下の実施形態の各々を包含することを意図し得る。Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）。

本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、組成物及び方法が列挙される要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することを意図し得る。組成物及び方法を定義するために使用される場合、「～から本質的になる」とは、意図された使用のための組み合わせに対する任意の本質的な重要性を有する他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書に定義される要素から本質的になる組成物は、単離及び精製方法からの微量汚染物質、並びに薬学的に許容される担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、保存剤等を除外しない。「～からなる」とは、他の成分の微量元素、及び本開示の組成物を投与するための実質的な方法ステップより多くを除外することを意味するものとする。これらの移行語の各々によって定義される実施形態は、本開示の範囲内であり得る。

「有効量」又は「治療有効量」という用語は、有益な結果又は所望の結果をもたらすのに十分であり得る薬剤の量を指し得る。治療有効量は、治療される対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与様式等のうちの１つ以上に応じて変動してもよく、これらは当業者によって容易に決定することができる。有効量の活性薬剤は、単回用量又は複数回用量で投与され得る。構成要素は、本明細書に記載されるいずれか等の特定の目標又は目的と関連するもの等の少なくとも有効量、又は少なくとも有効な量を有するものとして本明細書に記載され得る。「有効量」という用語はまた、適切なイメージング法によって検出するための画像を提供する用量にも適用される。特定の用量は、選択される特定の薬剤、従うべき投薬レジメン、他の化合物と組み合わされて投与され得るかどうか、投与のタイミング、イメージングされる組織、及びそれが運ばれ得る物理的送達系のうちの１つ以上に応じて変化し得る。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために相互に置き換え可能に使用され得る。ポリマーは、直鎖状又は分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。また、この用語は、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、又は標識構成要素とのコンジュゲーション等の任意の他の操作で修飾されたアミノ酸重合体も包含する。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン及びＤ若しくはＬの両方の光学異性体、並びにアミノ酸類似体及びペプチド模倣物を含む、天然及び／又は非天然又は合成アミノ酸のいずれかを指し得る。

「対象」、「宿主」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書において動物、典型的には哺乳動物を指すために相互に置き換え可能に使用され得る。任意の好適な哺乳動物は、本明細書に記載される方法、細胞又は組成物によって治療され得る。哺乳動物は、本明細書に記載されるように、ベクター、操作されたガイドＲＮＡ、前駆体ガイドＲＮＡ、核酸、ポリヌクレオチド、操作されたポリヌクレオチド、又は薬学的組成物を投与され得る。哺乳動物の非限定的な例としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカク等）、家畜動物（例えば、イヌ及びネコ）、農場動物（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、並びに実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）が挙げられる。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトであり得る。哺乳動物は、任意の年齢、又は任意の発達段階（例えば、成人、十代、子供、乳児、又は子宮内の哺乳動物）であり得る。哺乳動物は、雄又は雌であり得る。哺乳動物は、妊娠中の雌であり得る。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトであり得る。いくつかの実施形態において、対象は、神経変性疾患等の疾患を有するか、又は有することが疑われ得る。いくつかの実施形態において、対象は、がん、又は新生物性障害を有するか、又は有することが疑われ得る。他の実施形態において、対象は、異常なタンパク質発現と関連する疾患又は障害を有するか、又は有することが疑われ得る。いくつかの場合において、ヒトは、約１日齢～約１０ヶ月齢、約９ヶ月齢～約２４ヶ月齢、約１歳～約８歳、約５歳～約２５歳、約２０歳～約５０歳、約１歳～約１３０歳、又は約３０歳～約１００歳より上であってもよい。ヒトは、約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、又は１２０歳より上であってもよい。ヒトは、約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、又は１３０歳より下であってもよい。

本明細書で使用される「試料」という用語は、一般に、対象の任意の試料（例えば、血液試料又は組織試料）を指し得る。試料又はその一部分は、幹細胞等の細胞を含み得る。試料の一部分は、幹細胞について濃縮されてもよい。幹細胞を試料から単離してもよい。試料は、組織、細胞、血清、血漿、エクソソーム、体液、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。体液は、尿、血液、血清、血漿、唾液、粘液、脊髄液、涙液、精液、胆汁、羊水、脳脊髄液、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。試料又はその一部分は、対象から得られた細胞外液を含み得る。試料又はその一部分は、細胞を含まない核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。試料又はその一部分は、存在若しくは不在、又は１つ以上の変異について分析され得る。ゲノムデータは、試料又はその一部分から得られ得る。試料は、ある疾患又は状態を有することが疑われるか、又は有することが確認され得る。試料は、非侵襲的技術、最小限の侵襲的技術、又は侵襲的技術を介して対象から除去された試料であり得る。試料又はその一部分は、組織ブラッシング、拭い取り、組織生検、切除された組織、細針吸引、組織洗浄、細胞診標本、外科的切除、又はこれらの任意の組み合わせによって得られ得る。試料又はその一部分は、組織型からの組織又は細胞を含み得る。例えば、試料は、鼻組織、気管組織、肺組織、咽頭組織、喉頭組織、気管支組織、胸膜組織、肺胞組織、乳房組織、膀胱組織、腎臓組織、肝臓組織、結腸組織、甲状腺組織、頸部組織、前立腺組織、心臓組織、筋組織、膵臓組織、肛門組織、胆管組織、骨組織、脳組織、脊髄組織、腎臓組織、子宮組織、卵巣組織、子宮内膜組織、膣組織、外陰部組織、子宮組織、胃組織、眼組織、洞組織、陰茎組織、唾液腺組織、腸組織、胆嚢組織、胃腸組織、膀胱組織、脳組織、脊髄組織、血液、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。

「真核細胞」は、モネラを除く全ての生物界を含む。真核細胞は、膜に結合した核によって容易に区別することができる。動物、植物、真菌、及び原生生物は、細胞が内部膜及び細胞骨格によって複雑な構造に組織化され得る真核生物又は生物であり得る。最も特徴的な膜に結合した構造は、核であり得る。具体的に列挙されない限り、「宿主」という用語は、例えば、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞を含む、真核宿主を含む。真核細胞又は宿主の非限定的な例としては、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、鳥類、爬虫類、及びヒトが挙げられる。

「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」という用語は、相互に置き換え可能に使用されてもよく、それらの最も広い意味で使用され、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、又はペプチド模倣物の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結され得る。別の実施形態において、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテル等によって連結され得る。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列又はペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限は課されない。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン及びＤ及びＬの両方の光学異性体、アミノ酸類似体及びペプチド模倣物を含む、天然及び／又は非天然又は合成アミノ酸のいずれかを指し得る。本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、１つより多い天然に存在するか、又は組換えで産生されたタンパク質由来のドメインで構成されるタンパク質を指してもよく、各ドメインは、一般に、異なる機能を果たす。この点に関して、「リンカー」という用語は、これらのドメインを一緒に連結するために使用され得るタンパク質断片を指してもよく、任意選択的に、融合タンパク質ドメインの立体配座を保存し、及び／又は融合タンパク質ドメイン間のそれぞれの機能を損なう可能性のある好ましくない相互作用を防止するために使用されるタンパク質断片を指し得る。

「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、２つのペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性を指し得る。相同性は、比較の目的のためにアラインメントすることができる各配列における位置を比較することによって決定することができる。比較される配列中の位置が、同じ塩基又はアミノ酸によって占有され得る場合、その分子は、その位置で相同性であり得る。配列間の相同性の程度は、複数の配列によって共有されるマッチする位置又は相同性の位置の数の関数であり得る。「無関係」又は「非相同性の」配列は、本開示の配列のうちの１つと４０％未満の同一性、又は代替的に２５％未満の同一性を共有する。配列相同性は、参照配列に対する配列の同一性％を指し得る。実用的な問題として、任意の特定の配列が、本明細書に記載の任意の配列（本明細書に記載の特定の核酸配列と対応し得る）に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり得るかどうかにかかわらず、このような特定のポリペプチド配列は、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）等の既知のコンピュータプログラムを使用して、簡便に決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔ又は任意の他の配列アラインメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、参照配列に対して９５％同一であるかどうかを決定する場合、同一性パーセントを参照配列の全長にわたって計算することができるように、かつ全参照配列の最大５％の配列相同性中のギャップを許容することができるように、パラメータを設定することができる。

いくつかの場合において、参照配列（クエリ配列、すなわち、本開示の配列）と主題配列との間の同一性は、グローバル配列アラインメントとも称され、Ｂｒｕｔｌａｇ ｅｔ ａｌ．のアルゴリズムに基づき、ＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７－２４５（１９９０））。いくつかの実施形態において、同一性が狭義に解釈され得る特定の実施形態のパラメータは、ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントに使用され、Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｃｈｅｍｅ＝ＰＡＭ（許容される変異率）０、ｋ－ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝配列長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００又は主題配列の長さのいずれか短い方、を含み得る。この実施形態によれば、主題配列が、内部欠失のためではなく、Ｎ末端又はＣ末端の欠失に起因してクエリ配列より短い可能性がある場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、グローバル同一性パーセントを計算する場合に主題配列のＮ末端及びＣ末端の切断を考慮していないという事実を考慮するために、結果に対して手動の修正を行うことができる。クエリ配列と比較する、Ｎ末端及びＣ末端で切断された主題配列に関して、同一性パーセントは、対応する主題の残基とマッチ／アラインメントし得ない、主題配列のＮ末端及びＣ末端に対して横方向であり得るクエリ配列の残基の数を、クエリ配列の全塩基に対するパーセントとして計算することによって修正することができる。残基がマッチ／アラインメントされ得るかどうかの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定することができる。次いで、このパーセンテージを、同一性パーセントから引き算し、指定されたパラメータを使用してＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算し、最終的な同一性パーセントスコアに到達することができる。この最終的な同一性パーセントスコアを、この実施形態の目的のために使用することができる。いくつかの場合において、クエリ配列とマッチ／アラインメントし得ない、主題配列のＮ末端及びＣ末端に対する残基のみが、同一性パーセントスコアを手動で調節する目的のために考慮され得る。すなわち、主題配列の最も遠いＮ末端残基及びＣ末端残基の外側にあるクエリ残基位置のみが、この手動の修正のために考慮され得る。例えば、９０残基の主題配列を、１００残基のクエリ配列とアラインメントし、同一性パーセントを決定することができる。欠失は、主題配列のＮ末端で生じ、したがって、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、Ｎ末端における最初の１０個の残基のマッチング／アラインメントを示さない。この１０個の対形成していない残基は、配列の１０％（マッチしていないＮ末端及びＣ末端での残基の数／クエリ配列中の残基の総数）を表し、そのため、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントスコアから１０％を引き算することができる。残りの９０個の残基が完全にマッチした場合、最終的な同一性パーセントは、９０％であり得る。別の例において、９０残基の主題配列を、１００残基のクエリ配列と比較することができる。このとき、欠失は、内部欠失である可能性があり、そのため、クエリとマッチ／アラインメントし得ない残基は主題配列のＮ末端又はＣ末端に存在し得ない。この場合において、ＦＡＳＴＤＢによって計算された同一性パーセントを、手動で修正することはできない。繰り返しになるが、クエリ配列とマッチ／アラインメントし得ない、主題配列のＮ末端及びＣ末端の外側にある残基位置のみを、ＦＡＳＴＤＢアラインメントで示されるように、手動で修正することができる。

「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、相互に置き換え可能に使用されてもよく、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド又はそれらの類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドの高分子形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有していてもよく、既知又は未知の任意の機能を発揮してもよい。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例であり得る。遺伝子若しくは遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ若しくはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、遺伝子間ＤＮＡ（ヘテロクロマチンＤＮＡを含むが、これらに限定されない）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、配列の単離されたＤＮＡ、配列の単離されたＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、核酸プローブ、プライマー、ｓｎＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ由来の小さなＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又は小さなｒＤＮＡ由来のＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体等の修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドの組み立ての前又は後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識構成要素とのコンジュゲーション等により、重合後に更に修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子及び一本鎖分子の両方を指し得る。例えば、ホスホロチオエート骨格を有する核酸を含む核酸は、１つ以上の反応性部分を含み得る。本明細書で使用される場合、反応性部分という用語は、共有結合、非共有結合、又は他の相互作用を介して、別の分子、例えば核酸又はポリペプチドと反応可能な任意の基を含む。例として、核酸は、共有結合、非共有結合、又は他の相互作用を介して、タンパク質又はポリペプチド上のアミノ酸と反応するアミノ酸反応性部分を含み得る。別途指定されない限り、又は必要とされない限り、ポリヌクレオチドであり得る本開示の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが既知であるか、又は予測される２つの相補的な一本鎖形態の各々の両方を包含する。いくつかの実施形態は、ＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ配列は、類似のＲＮＡ配列と相互に置き換え可能であり得る。いくつかの実施形態は、ＲＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列は、類似のＤＮＡ配列と相互に置き換え可能であり得る。いくつかの実施形態において、Ｕ及びＴは、本明細書で提供される配列において相互に置き換え可能であり得る。

本開示の方法で有用なポリヌクレオチドは、天然核酸配列及びそのバリアント、人工核酸配列、又はこのような配列の組み合わせを含み得る。

ポリヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びポリヌクレオチドがＲＮＡであり得る場合にはチミンの代わりにウラシル（Ｕ）の４つのヌクレオチド塩基の特異的配列で構成され得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１つ以上の他のヌクレオチド塩基（例えば、イノシン（Ｉ））、ヒポキサンチンがβ－Ｎ９－グリコシド結合を介してリボフラノースに接続し得るときに形成されるヌクレオシドを含んでいてもよく、以下の化学構造が得られる。

イノシンは、翻訳機構によってグアニン（Ｇ）と読まれ得る。

「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表現であり得る。このアルファベット表現は、中央処理装置を有するコンピュータ中のデータベースに入力され、機能ゲノミクス及び相同性検索等のバイオインフォマティクス用途に使用することができる。

本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され得るプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡが、その後にペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質内で翻訳され得るプロセスを指してもよい。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来し得る場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

「等価物」又は「生物学的等価物」という用語は、特定の分子、生物学的材料、又は細胞材料を指す場合に相互に置き換え可能に使用されてもよく、所望の構造又は機能性を依然として維持しながら、最小限の相同性を有するものを意図する。

「コードする」という用語は、ポリヌクレオチドに適用され得るとき、ポリペプチドが、その天然状態で、又は当業者に周知の方法によって操作される場合、ポリペプチド及び／又はその断片のためのｍＲＮＡを産生するように転写及び／又は翻訳することができる場合、「コードする」と言われ得るポリヌクレオチドを指し得る。アンチセンス鎖は、そのような核酸の補体であってもよく、コード配列は、そこから推定することができる。

本明細書で使用される場合、「機能的」という用語は、具体的な特定の効果を達成することを意図する任意の分子、生物学的又は細胞材料を修飾するために使用され得る。

本明細書で使用される「変異」という用語は、タンパク質のコンセンサス配列と比較して、タンパク質をコードする核酸配列に対する変化を指してもよい。「ミスセンス」変異は、１つのコドンを別のコドンに置換する。「ナンセンス」変異は、コドンを特定のアミノ酸をコードするものから停止コドンに変化させる。ナンセンス変異は、タンパク質の切断翻訳をもたらすことが多い。「サイレント」変異は、結果として生じるタンパク質に影響を及ぼさないものであり得る。本明細書で使用される場合、「点変異」という用語は、遺伝子配列中の１つのヌクレオチドのみに影響を与える変異を指してもよい。「スプライス部位変異」は、（イントロンを除去するための処理の前に）プレｍＲＮＡに存在する変異であって、スプライス部位の誤った描写からのタンパク質の誤訳を引き起こし、多くは切断を引き起こす、変異であり得る。変異は、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）を含み得る。変異は、配列バリアント、配列変動、配列変化、又は対立遺伝子バリアントを含み得る。参照ＤＮＡ配列は、参照データベースから得ることができる。変異は、機能に影響を及ぼすことがある。変異は、機能に影響を及ぼさないことがある。変異は、１つ以上のヌクレオチド中のＤＮＡレベル、１つ以上のヌクレオチド中のリボ核酸（ＲＮＡ）レベル、１つ以上のアミノ酸中のタンパク質レベル、又はこれらの任意の組み合わせで生じ得る。参照配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＲｅｆＳｅｑ）データベース等のデータベースから得ることができる。変異を構成することができる特定の変化としては、１つ以上のヌクレオチド又は１つ以上のアミノ酸における置換、欠失、挿入、反転、又は変換が挙げられ得る。変異は、点変異であり得る。変異は、融合遺伝子であり得る。融合対又は融合遺伝子は、変異、例えば、転座、中間部欠失、染色体反転、又はそれらの任意の組み合わせから生じ得る。変異は、三重化、四重化等の反復配列の数の変動を構成し得る。例えば、変異は、所与の配列と関連付けられたコピー数の増加又は減少（例えば、コピー数変動、又はＣＮＶ）であり得る。変異は、異なる対立遺伝子における２つ以上の配列変化、又は１つの対立遺伝子における２つ以上の配列変化を含み得る。変異は、モザイク等の１つの対立遺伝子の１つの位置に２つの異なるヌクレオチドを含み得る。変異は、キメラ等の１つの対立遺伝子の１つの位置に２つの異なるヌクレオチドを含み得る。変異は、悪性組織中に存在し得る。変異の存在又は不在は、ある疾患又は状態を発症するリスクの増加を示し得る。変異の存在又は不在は、ある疾患又は状態の存在を示し得る。変異は、良性組織中に存在し得る。変異の不在は、組織又は試料が良性であり得ることを示す場合がある。代替として、変異の不在は、組織又は試料が良性であり得ることを示さない場合がある。本明細書に記載の方法は、試料において変異の存在を特定することを含み得る。

「メッセンジャーＲＮＡ」又は「ｍＲＮＡ」は、ＤＮＡから転写され、次いでイントロンとして知られる非コード切片を除去するように処理され得る核酸分子であり得る。得られたｍＲＮＡは、核（又はＤＮＡが存在し得る別の遺伝子座）から運び出され、タンパク質に翻訳され得る。「プレｍＲＮＡ」という用語は、非コード切片を除去する処理の前の鎖を指し得る。

「典型的なアミノ酸」は、以下の表に示される人体において天然に見出される２０個のアミノ酸を指し、各々が、表３に示されるように、それらの３文字の略語、１文字の略語、構造、及び対応するコドンを有する。

「非典型的なアミノ酸」という用語は、典型的には典型的なアミノ酸（例えば、アミノ酸類似体）の化学合成又は修飾によって生成される、この群の外側にある合成又は他の方法で修飾されたアミノ酸を指し得る。本開示は、本明細書に開示される方法及びベクターのいくつかにおいて、タンパク質を構成する非典型的なアミノ酸を用いる。非典型的なアミノ酸の非限定的な例は、ピロリジン（Ｐｙｌ又はＯ）であってもよく、化学構造は以下に提供される。

イノシン（Ｉ）は、別の例示的な非典型的なアミノ酸であってもよく、ｔＲＮＡ中に一般的に見出されてもよく、「ゆらぎ塩基対形成」に従った適切な翻訳に必須なものであり得る。イノシンの構造の非限定的な例は、上に提供される。

本明細書で使用される「ＡＤＡＲ」という用語は、ＲＮＡ配列中のアデノシン（Ａ）をイノシン（Ｉ）に変換することができる、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ）を指し得る。ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２は、インビボでのＲＮＡ編集に関与し得るＡＤＡＲの２つの例示的な種であり得る。ＡＤＡＲ１の非限定的な例示的な配列は、以下の参照番号：ＨＧＮＣ：２２５；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：１０３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ ０００００１６０７１０；ＯＭＩＭ：１４６９２０；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ５５２６５、及びＧｅｎｅＣａｒｄｓ：ＧＣ０１Ｍ１５４５５４、並びにこれらの生物学的等価物で見出され得る。ＡＤＡＲ２の非限定的な例示的な配列は、以下の参照番号：ＨＧＮＣ：２２６；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：１０４；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１９７３８１；ＯＭＩＭ：６０１２１８；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ７８５６３、及びＧｅｎｅＣａｒｄｓ：ＧＣ２１Ｐ０４５０７３、並びにこれらの生物学的等価物で見出され得る。ＡＤＡＲの生物学的に活性な断片も本明細書で提供されてもよく、ＡＤＡＲを指す場合に含まれ得る。

本明細書で使用される「欠乏症」という用語は、特定の薬剤の正常な（生理学的に許容される）レベルよりも低いレベルを指し得る。タンパク質の文脈では、欠乏症は、完全長タンパク質の正常レベルよりも低いレベルを指し得る。

「相補的」又は「相補性」という用語は、伝統的なワトソン－クリック又は他の非伝統的な種類のいずれかによって核酸が別の拡散配列と水素結合を形成する能力を指し得る。例えば、配列Ａ－Ｇ－Ｔは、配列Ｔ－Ｃ－Ａに相補的であり得る。相補性率は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン－クリック塩基対形成）を形成し得る核酸分子中の残基の割合を示す（例えば、１０のうちの５、６、７、８、９、１０は、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続した残基が、第２の核酸配列中の同じ数の連続した残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」、「部分的に相補的」、「少なくとも部分的に相補的」、又は本明細書で使用される場合は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又はそれより多くのヌクレオチドの領域にわたる、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％であり得る相補性の程度を指し得るか、又はストリンジェントな条件（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下でハイブリダイズする２つの核酸を指し得る。核酸は、非特異的な配列を含み得る。本明細書で使用される場合、「非特異的な配列」又は「特異的ではない」という用語は、任意の他の核酸配列に対して相補的であるように設計することができないか、又は任意の他の核酸配列に対して部分的にしか相補的にすることができない一連の残基を含有する核酸配列を指し得る。

本明細書で使用される場合、「ドメイン」という用語は、タンパク質又はポリペプチドの特定の領域を指していてもよく、特定の機能と関連付けられ得る。例えば、「ＲＮＡヘアピンモチーフと会合するドメイン」は、１つ以上のＲＮＡヘアピンに結合するタンパク質のドメインを指し得る。この結合は、任意選択的に、特定のヘアピンに特異的であってもよい。

本開示が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド又は抗体に関する場合、明示的に列挙することなく、また、別段の意図がない限り、その等価物又は生物学的等価物が本開示の範囲内で意図され得ると推測され得る。本明細書で使用される場合、「その生物学的等価物」という用語は、参照タンパク質、抗体、ポリペプチド、又は核酸を指すときに、「その等価物」と同義であることを意図されてもよく、所望の構造又は機能性を依然として維持しつつ、最小限の相同性を有するものを意図している。本明細書で具体的に列挙されない限り、本明細書で言及される任意のポリヌクレオチド、ポリペプチド又はタンパク質はまた、それらの等価物を含むことが企図され得る。例えば、等価物は、少なくとも約７０％の相同性若しくは同一性、少なくとも８０％の相同性若しくは同一性、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％の相同性率若しくは同一性率を有することができ、参照タンパク質、ポリペプチド、又は核酸に対して実質的に等価な生物学的活性を示す。代替的に、ポリヌクレオチドを指す場合、その等価物は、参照ポリヌクレオチド又はその補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり得る。

「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」、又は「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」という用語は、一般に静的に有意な量までの増加を意味するために本明細書で使用され得る。いくつかの態様において、「増加した」又は「増加する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、参照レベル、標準、又は対照と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は最大１００％、及び１００％の増加、又は１０～１００％の任意の増加を含むことを意味する。「増加する」の他の例としては、参照レベルと比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍以上の増加が挙げられる。

「減少した（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）」、「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ）」、又は「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」という用語は、一般に統計的に有意な量までの減少を意味するために本明細書で使用され得る。いくつかの態様において、「減少した」又は「減少する」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の低減、例えば、参照レベルと比較して、少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は最大１００％、及び１００％の減少（例えば、参照レベルと比較して、存在しないレベル、又は検出不可能なレベル）、又は１０～１００％の任意の減少を含むことを意味する。マーカー又は症状に関連して、これらの用語は、そのようなレベルの統計的に有意な減少を意味し得る。減少は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％以上であってもよく、所与の疾患を有しない個体について正常の範囲内として許容されるレベルまで低下し得ることが好ましい。

ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ペプチド様骨格がＤＮＡ又はＲＮＡの糖－リン酸骨格を置き換える合成ＤＮＡ／ＲＮＡ類似体であり得る。ＰＮＡオリゴマーは、相補的ＤＮＡへの結合において、より高い結合強度及びより高い特異性を示し、ＰＮＡ／ＤＮＡ塩基のミスマッチは、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖における同様のミスマッチよりも不安定である。この結合強度及び特異性は、ＰＮＡ／ＲＮＡ二本鎖にも適用される。ＰＮＡは、いくつかの場合において、ヌクレアーゼ又はプロテアーゼのいずれかによって容易に認識されない場合があり、酵素分解に耐性になる。ＰＮＡは、広範なｐＨ範囲にわたって安定であり得る。

ロックド核酸（ＬＮＡ）は、修飾されたＲＮＡヌクレオチドであってもよく、ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’炭素及び４’炭素を接続する更なる架橋で修飾され得る。架橋は、３’－ｅｎｄｏ（北側）立体配座にリボースを「ロック」し、多くはＡ型の二本鎖中に見出され得る。ＬＮＡヌクレオチドは、所望な場合はいつでも、オリゴヌクレオチド中のＤＮＡ又はＲＮＡ残基と混合し得る。そのようなオリゴマーは、化学的に合成することができ、市販され得る。ロックされたリボース立体配座は、塩基の積み重ね及び組織化前の骨格を増強する。

本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成的な目的のためであってもよく、いくつかの場合において、説明される主題を限定するものとして解釈され得ない。

本開示の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されているが、そのような実施形態が例としてのみ提供され得ることは、当業者には明白であろう。いくつかの場合において、本発明が、明細書内で提供される具体的な例によって制限されることを意図していない。本発明は、前述の明細書を参照しつつ説明されてきたが、本明細書の実施形態の説明及び例示は、必ずしも限定的な意味で解釈されることを意味しない。本開示から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換がここで当業者に想起されるであろう。更に、本発明の全ての態様は、様々な条件及び変数に依存する、本明細書に記載の特定の描写、構成又は相対的な割合に限定されないことを理解されたい。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替物が、本発明の実施に用いられ得ることを理解されたい。したがって、本発明は、任意のそのような代替物、改変、変形、又は等価物も網羅しなければならないことが意図され得る。いくつかの場合において、特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内の方法及び構造がそれによって網羅されることが意図される。

付番された実施形態
いくつかの組成物、及び方法が、本明細書で開示される。これらの組成物及び方法の具体的な例示的な実施形態を以下に開示する。以下の実施形態は、本明細書に開示される特徴の組み合わせの非限定的な順列を列挙する。特徴の組み合わせの他の順列も企図される。特に、これらの付番された実施形態の各々は、列挙されるようなそれらの順序とは無関係に、あらゆる前又は後続の付番された実施形態に依存するか、又は関連するものとして企図される。
実施形態１．操作されたガイドＲＮＡであって、
（ａ）少なくとも１個の化学修飾と、
（ｂ）標的化ドメインであって、標的化ドメインが、対象に投与されると標的ＲＮＡにハイブリダイズし、それによって対象の細胞中に存在するＲＮＡ編集エンティティを動員する複合体を形成する、標的化ドメインと、を含み、
ＲＮＡ編集エンティティは、操作されたガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡと会合すると、標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の標的編集を行う、操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態２．操作されたガイドＲＮＡが、一本鎖である、実施形態１の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態３．操作されたガイドＲＮＡが、標的ＲＮＡに対するミスマッチを含む、実施形態１又は実施形態２の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態４．ミスマッチが、標的ＲＮＡ分子中の塩基に対して対向しており、かつ対形成しない、操作されたガイドＲＮＡ中の塩基を含む、実施形態２の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態５．ミスマッチが、Ａ／Ｃミスマッチを含み、Ａが、標的ＲＮＡ分子中にあり、Ｃが、操作されたガイドＲＮＡ中にある、実施形態２の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態６．Ａ／Ｃミスマッチ中のＡが、ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された標的ＲＮＡ分子中のヌクレオチドの塩基を含む、実施形態５の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態７．操作されたガイドＲＮＡが、ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基と対向するＣを含む、実施形態６の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態８．標的ＲＮＡ分子が、ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基に隣接し、かつ５’のＧを含む、実施形態６の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態９．操作されたガイドが、ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された標的ＲＮＡ分子中のＡに対して対向しており、かつ対形成しないＣに隣接し、かつ５’のＧを更に含む、実施形態７の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態１０．操作されたガイドＲＮＡが、ミスマッチのいずれかの側に非修飾ヌクレオチドを含む、実施形態６～実施形態９のいずれかの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態１１．操作されたガイドＲＮＡが、ミスマッチの２個のヌクレオチド内に第２のミスマッチを含まない、実施形態６～実施形態１０のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態１２．少なくとも１個の化学修飾が、
（ａ）操作されたガイドＲＮＡの５’末端の近位、
（ｂ）操作されたガイドＲＮＡのある領域の５’末端の近位、又は
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方に配置される、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態１３．少なくとも１個の化学修飾が、
（ａ）操作されたガイドＲＮＡの３’末端の近位、
（ｂ）操作されたガイドＲＮＡのある領域の３’末端の近位、又は
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方に配置される、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態１４．少なくとも１個の化学修飾が、操作されたガイドＲＮＡの５’末端の近位、操作されたガイドＲＮＡのある領域の５’末端の近位、操作されたガイドＲＮＡの３’末端の近位、操作されたガイドＲＮＡのある領域の３’末端の近位、又はこれらの任意の組み合わせに配置される、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態１５．操作されたガイドＲＮＡが、水溶液中に存在し、かつ標的ＲＮＡに結合していない場合には、約１００ｎＭ未満の解離定数であり、ＲＮＡ編集エンティティに結合しない、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態１６．操作されたガイドＲＮＡが、水溶液中に存在し、かつ標的ＲＮＡに結合していない場合には、ヘアピン、バルジ、ポリヌクレオチドループ、又は構造化ドメイン、又はこれらの任意の組み合わせのうちの少なくとものうちの少なくとも１つを欠いている、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態１７．複合体が、バルジ、内部ループ、ヘアピン、ミスマッチ、ゆらぎ塩基対、又はこれらの任意の組み合わせを含む構造的特徴を含む、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態１８．前記構造的特徴が、バルジを含む、実施形態１７の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態１９．バルジが、非対称バルジである、実施形態１８の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態２０．バルジが、対称バルジである、実施形態１８の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態２１．構造的特徴が、内部ループを含む、実施形態１７の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態２２．内部ループが、非対称内部ループである、実施形態２１の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態２３．内部ループが、対称内部ループである、実施形態２１の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態２４．構造的特徴が、ヘアピンを含み、ヘアピンが、二本鎖ＲＮＡ非標的化ドメインを含む、実施形態１７の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態２５．少なくとも１個の化学修飾が、表２に提供される操作されたガイドＲＮＡのホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素原子の片方又は両方の置換を含む、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態２６．少なくとも１個の化学修飾が、表２に提供される操作されたガイドＲＮＡのホスホジエステル骨格連結中の連結リン酸酸素原子のうちの１つ以上の置換を含む、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態２７．少なくとも１個の化学修飾が、表２に提供される操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの糖に対する修飾を含む、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態２８．操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの糖に対する修飾が、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、実施形態２７の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態２９．操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの糖に対する修飾が、少なくとも１つのアンロックド核酸（ＵＮＡ）を含む、実施形態２７の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態３０．糖に対する修飾が、糖の構成要素の修飾を含み、糖が、リボース糖を含む、実施形態２７の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態３１．操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドのリボース糖の構成要素に対する修飾が、２’－Ｏ－メチル基を含む、実施形態３０の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態３２．少なくとも１個の化学修飾が、表２に提供されるデホスホリンカーによる、操作されたガイドＲＮＡのリン酸部分の置き換えを含む、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態３３．少なくとも１個の化学修飾が、表２に提供される操作されたガイドＲＮＡのリン酸骨格の修飾を含む、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態３４．操作されたガイドＲＮＡが、ホスホチオエート基を含む、実施形態３３の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態３５．少なくとも１個の化学修飾が、操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの塩基に対する修飾を含む、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態３６．少なくとも１個の化学修飾が、表２に提供されるヌクレオチドの非天然塩基を含む、実施形態３５の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態３７．少なくとも１個の化学修飾が、モルホリノ基、シクロブチル基、ピロリジン基、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代理物を含む、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態３８．少なくとも１個の化学修飾が、表２に提供される少なくとも立体化学的に純粋な核酸を含む、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態３９．操作されたガイドＲＮＡが、１～１００個の化学修飾を含み、その各々が独立して同じであってもよいか、又は異なっていてもよい、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態４０．少なくとも１個の化学修飾が、真核細胞中の核酸に対して天然に存在する化学修飾を含まない、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態４１．少なくとも１個の化学修飾が、少なくとも１個の化学修飾を含まない、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドの特異性と比較して、標的ＲＮＡに対する操作されたガイドＲＮＡの結合の特異性を増加させる、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態４２．少なくとも１個の化学修飾が、インビトロアッセイで測定される場合に、少なくとも１個の化学修飾を含まない、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド消化に対する抵抗性と比較して、操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチド消化に対する抵抗性を増加させる、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態４３．少なくとも１個の化学修飾が、インビトロアッセイで測定される場合に、少なくとも１個の化学修飾を含まない、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドの免疫原性と比較して、操作されたガイドＲＮＡの免疫原性を減少させる、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態４４．操作されたガイドＲＮＡが、ＤＮＡを含む、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態４５．標的ＲＮＡが、ＲＡＢ７Ａ、ＡＢＣＡ４、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＡＰＰ、Ｔａｕ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ Ｇ１２２６Ｒ、ＨＦＥ Ｃ２８２Ｙ、ＬＩＰＡ ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ、ＰＣＳＫ９開始部位、若しくはＳＣＮＮ１Ａ開始部位、これらのいずれかの断片、又はこれらの任意の組み合わせを含む、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態４６．標的ＲＮＡが、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋを含む、実施形態４５の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態４７．操作されたガイドＲＮＡが、配列番号１～２のうちのいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態４５の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態４８．標的ＲＮＡが、ＡＢＣＡ４をコードする、実施形態４５の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態４９．操作されたガイドＲＮＡが、配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態４５の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態５０．操作されたガイドＲＮＡが、配列番号２と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態４５の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態５１．操作されたガイドＲＮＡが、単離されるか、又は精製されるか、又はその両方である、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態５２．ＲＮＡ編集エンティティが、
（ａ）ＡＤＡＲ若しくはＡＰＯＢＥＣ、
（ｂ）（ａ）の触媒的に活性な断片、
（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）を含む融合ポリペプチド、又は
（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせである、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態５３．ＲＮＡ編集エンティティが、ＡＤＡＲを含み、ＡＤＡＲが、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、又はこれらの組み合わせを含む、実施形態５２の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態５４．ＲＮＡ編集エンティティが、対象の細胞に対して内因性である、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態５５．ＲＮＡ編集エンティティが、外因的に提供される、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態５６．構造的なループ安定化骨格を更に含む、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態５７．構造的なループ安定化骨格が、ステムループ、接合部、Ｔ接合部、クローバーリーフ、シュードノット、又はこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態５６の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態５８．構造的なループ安定化骨格が、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０個のステムループ構造を含む、実施形態５６又は実施形態５７の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態５９．構造的なループ安定化骨格が、ｔＲＮＡ骨格を含む、実施形態５６～実施形態５８のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態６０．ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを更に含む、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態６１．操作されたガイドＲＮＡが、標的化部分にコンジュゲート化される、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態６２．標的化部分が、神経細胞を標的化する、実施形態６１の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態６３．標的化部分が、肝臓細胞を標的化する、実施形態６１の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態６４．標的化部分が、黄斑細胞を標的化する、実施形態６１の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態６５．操作されたガイドＲＮＡが、粒子中に封入される、先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態６６．粒子が、ナノ粒子を含む、実施形態６５の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態６７．粒子が、リポソームを含む、実施形態６５の操作されたガイドＲＮＡ。
実施形態６８．先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡを含む、単離された細胞。
実施形態６９．単離された細胞が、免疫細胞を含む、実施形態６８の単離された細胞。
実施形態７０．免疫細胞が、Ｔ細胞を含む、実施形態６９の単離された細胞。
実施形態７１．先行実施形態のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡを含む、単離された複数の細胞。
実施形態７２．単離された複数の細胞が、免疫細胞を含む、実施形態７１の単離された複数の細胞。
実施形態７３．免疫細胞が、Ｔ細胞である、実施形態７２の単離された複数の細胞。
実施形態７４．単位用量形態の薬学的組成物であって、
（ａ）実施形態１～実施形態６７のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ、実施形態６８～実施形態７０のうちのいずれか１つの単離された細胞、又は実施形態７１～実施形態７３のうちのいずれか１つの単離された複数の細胞と、
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤と、を含む、薬学的組成物。
実施形態７５．キットであって、
（ａ）実施形態１～実施形態６７のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ、実施形態６８～実施形態７０のうちのいずれか１つの単離された細胞、又は実施形態７１～実施形態７３のうちのいずれか１つの単離された複数の細胞、又は実施形態７４の薬学的組成物と、
（ｂ）容器と、を含む、キット。
実施形態７６．実施形態１～実施形態６７のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ、又は実施形態７４の薬学的組成物を細胞に送達する方法であって、その方法が、操作されたガイドＲＮＡを細胞に直接的又は間接的に送達することを含む、方法。
実施形態７７．疾患又は状態を治療又は予防することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、その方法が、実施形態１～実施形態６７のうちのいずれか１つの操作されたガイドＲＮＡ、又は実施形態７４の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法。
実施形態７８．薬学的組成物が、対象に、髄腔内、眼内、硝子体内、網膜内、静脈内、筋肉内、脳室内、大脳内、小脳内、側脳室内、実質内、皮下、又はこれらの組み合わせにより投与される、実施形態７５の方法。
実施形態７９．投与することが、対象を治療するのに十分な治療有効量を含む、実施形態７８の方法。
実施形態８０．疾患又は状態が、神経性疾患又は状態を含む、実施形態７７又は実施形態７８の方法。
実施形態８１．神経性疾患若しくは状態、又は神経発達的疾患若しくは状態が、パーキンソン病、アルツハイマー病、又は認知症を含む、実施形態８０の方法。
実施形態８２．疾患又は状態が、肝臓疾患又は状態を含む、実施形態７７又は実施形態７８の方法。
実施形態８３．肝臓疾患又は状態が、肝硬変を含む、実施形態８２の方法。
実施形態８４．肝臓疾患又は状態が、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴ欠乏症）を含む、実施形態８２の方法。
実施形態８５．疾患又は状態が、黄斑変性を含む、実施形態７７又は実施形態７８の方法。
実施形態８６．黄斑変性が、スターガルト病を含む、実施形態８５の方法。

以下の例示的な実施例は、本明細書に記載の刺激、システム、及び方法の実施形態を表し、いかなる方式でも限定することを意味しない。

実施例１：ＲＮＡ編集による神経性疾患の治療
対象は、ＬＲＲＫ２遺伝子中のＧ２０１９Ｓ変異から生じるパーキンソン病を有すると診断される。この対象に、Ｇ２０１９Ｓ変異を含む標的ＬＲＲＫ２転写産物に核酸編集エンティティを動員するための本明細書に開示される化学修飾された操作されたガイドＲＮＡを含む薬学的組成物の投薬レジメンを処方する。化学修飾された操作されたガイドＲＮＡは、ＬＲＲＫ２転写産物（例えば、ＬＲＲＫ２プレｍＲＮＡ又はＬＲＲＫ２ ｍＲＮＡ）に結合すると、標的ＬＲＲＫ２転写産物と会合して構造的特徴を形成し、次いで少なくとも、核酸編集エンティティ（例えば、ＲＮＡ編集エンティティ）を動員して、ＬＲＲＫ２転写産物の変異を編集する。いくつかの場合において、化学修飾された操作されたガイドＲＮＡは、非修飾の操作されたガイドＲＮＡと比較して、ＲＮＡ編集エンティティを動員する効率を増加させる。いくつかの場合において、化学修飾された操作されたガイドＲＮＡは、ＬＲＲＫ２転写産物を編集するためのＲＮＡ編集エンティティの特異性を増加させる。いくつかの実施形態において、化学修飾された操作されたガイドＲＮＡは、操作されたガイドＲＮＡが対象に投与され得るときに、加水分解のヌクレアーゼ消化に対する抵抗性を増加させる。薬学的組成物は、パーキンソン病のために対象を治療するための有効量で実質注射によって対象に投与するために製剤化することができる。

実施例２：操作されたガイドＲＮＡによるＲＮＡ編集
非修飾ｇＲＮＡ又は化学修飾されたｇＲＮＡを含む操作されたガイドＲＮＡを、４０μＭの最終濃度で、ヌクレアーゼを含まない水に再懸濁させた。操作されたガイドＲＮＡの化学修飾は、操作されたガイドＲＮＡの任意の位置にあり得る。いくつかの場合において、化学修飾は、ステム領域内にあり得る。図１Ａ及び図２Ａは、ＲＡＢ７Ａを編集するための化学修飾されたｇＲＮＡを含む例示的な操作されたガイドＲＮＡを示す。

Ｋ５６２細胞を、１０％のＦＢＳ及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液を追加したＲＰＭＩ培地中、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。４０ｐｍｏｌのｇＲＮＡを、推奨プロトコルに従って、１６ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ Ｓｔｒｉｐｓ（Ｌｏｎｚａ）を使用した４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ Ｘ Ｋｉｔを使用して、２×１０＾５個の細胞にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、細胞を、５００ｍｌの予め加温しておいた培養培地にすぐに入れ、３時間（終点実験用）又は指定時間（一時的試験用）培養した。細胞を採取し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞ＲＮＡを単離した。６０ｎｇの全ＲＮＡを使用して、ランダム六量体プライマーアプローチ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキットを使用してｃＤＮＡを作製した。次いで、ｃＤＮＡをｓａｎｇｅｒ配列決定及び液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）の両方で使用して、編集効率を測定した。

Ｓａｎｇｅｒ配列決定アプローチのために、ＲＡＢ７Ａの標的領域を、以下のプライマーを用い、ＰＣＲによって増幅させた。
ＲＡＢ７Ａ＿ＦＰ：ＡＧＧＣＣＴＧＴＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＧ
ＲＡＢ７Ａ＿ＲＰ：ＴＧＡＡＡＴＡＡＣＧＧＣＡＡＴＴＴＡＴＣＣＡＴＴＧＣＡＣＡＴＡＣ

カラム精製したＰＣＲ産物を、ｓａｎｇｅｒ配列決定（Ｇｅｎｅｗｉｚ）を使用して配列決定し、編集をＥｄｉｔＲプログラムを使用して分析した。

液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）のために、２０μｌのｄｄＰＣＲ反応物を、９６ウェルＰＣＲプレート中、１０μｌのＢｉｏ－Ｒａｄ ｄｄＰＣＲ ２Ｘ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし）、１μｌの９μＭの順方向プライマー（ＦＰ）、１μｌの９μＭの逆方向プライマー（ＲＰ）、１μｌの５μＭの標的内部プローブ（ＦＡＭ）、１μｌの５μＭの参照内部プローブ（ＨＥＸ）、５μｌの０．５ｎｇ／μｌのｃＤＮＡ、及び１μｌのヌクレアーゼを含まない水を用いて調製した。２０μｌのＰＣＲ反応物を、製造業者の指示に従って、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ２００液滴生成器での液滴生成に使用した。次いで、液滴をＢｉｏ－Ｒａｄ ９６ウェルｄｄＰＣＲプレートに移し、１８０℃で５秒間、ホイルシールで熱密封した。以下の条件を使用して、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃ１０００サーマルサイクラーでサーマルサイクリングを行った。９５℃で１０分間、続いて、９４℃で３０秒間及び６０℃で１分間の４０サイクル、９８℃で１０分間、及び４℃で保持。温度上昇率は、２℃／秒に設定した。増幅後、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ２００ ｄｄＰＣＲシステムで液滴を読み取った。次いで、手動ゲーティングによって決定された野生型及びドロップオフ集団を用いて、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｑｕａｎｔａｓｏｆｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏソフトウェアを使用して液滴を分析してもよい。以下のプライマー及びプローブを使用した。
ＲＡＢ７Ａ＿ｄｄＰＣＲ＿ＦＰ：ＡＧＧＣＣＴＧＴＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＧ
ＲＡＢ７Ａ＿ｄｄＰＣＲ＿ＲＰ：ＡＡＴＴＴＡＴＣＣＡＴＴＧＣＡＣＡＴＡＣ
標的内部プローブ：／５６－ＦＡＭ／ＣＡＧＡＡＴＴＧＧＧＡＡＡＴＣＣＡＧＣＴＡＧ／３ＩＡＢｋＦＱ／
参照内部プローブ：／５ＨＥＸ／ＡＣＴＧＴＣＴＡＧＴＴＣＣＣＴＴＣＴＧＴＧ／３ＩＡＢｋＦＱ／

いくつかのｇＲＮＡ配列標的ＲＡｂ７Ａを、以下の表４にまとめている。

図１Ｂ～Ｄ及び図２Ｂ～Ｄからわかるように、本明細書に記載の少なくとも１個の化学修飾を含むｇＲＮＡを含む操作されたガイドＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡを用いた編集と比較して、増加した効率でＲＡＢ７Ａを修飾した。いくつかの場合において、化学修飾を含む操作されたガイドＲＮＡは、オフターゲット編集の減少を示した（図２Ｄ）。いくつかの実施形態において、ＲＡＢ７Ａの編集は、細胞に導入されたｇＲＮＡ（図３）を含む操作されたガイドＲＮＡの存在に対応する編集期間を示した。図３に示すように、操作されたガイドＲＮＡにＬＮＡを導入する化学修飾は、ＲＡＢ７Ａを編集するためのｇＲＮＡを含む操作されたガイドＲＮＡの半減期を、操作されたガイドＲＮＡを細胞に導入してから少なくとも４８時間まで延長した。

化学修飾されたガイドＲＮＡの長さを変化させ、Ｋ５６２細胞において試験した。細胞トランスフェクション及び配列決定のための上述の方法を、以下の表５に記載される化学修飾されたガイドを用いて実施した。

化学修飾されたｇＲＮＡはまた、ＡＲＰＥ－１９網膜上皮細胞におけるＲＡＢ７Ａのより高いレベルのＲＮＡ編集を示した。細胞を、６０ｐｍｏｌの非修飾ｇＲＮＡ及び化学修飾されたｇＲＮＡでトランスフェクトした。ＲＮＡを７時間目に単離し、ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、任意のＳａｎｇｅｒ配列決定をした。ＥｄｉｔＲソフトウェアを使用して、ＲＮＡ編集率を定量化した。図４からわかるように、化学修飾された操作されたｇＲＮＡ（図１ＡのｇＲＮＡ３）は、ＲＡＢ７Ａにおいて標的Ａのわずか１６％の編集が得られた非修飾ｇＲＮＡ（図１ＡのｇＲＮＡ１）と比較して、ＲＡＢ７Ａにおいて標的Ａの８７％の編集が得られた。標的Ａは、矢印によって示され得る。

実施例３：ＳＮＣＡの編集のための化学修飾された操作されたガイドＲＮＡ
この実施例は、ＳＮＣＡの３’ＵＴＲの編集のための化学修飾された操作されたガイドＲＮＡを記載する。トランスフェクション及び配列決定を実施例２に記載したように行った。ガイドの５’端及び３’端での３個のヌクレオチドにおけるＬＮＡ末端修飾を含む化学修飾された操作されたガイドＲＮＡは、同じ領域に対する非修飾ガイドＲＮＡ（約２０％の編集）と比較して、ＳＮＣＡ ３’ＵＴＲのより高い編集率（約３０～４０％の編集）が得られた。ガイドのいくつかの配列を以下の表６に示す。

実施例４．ＲＡＢ７Ａの編集のための化学修飾された操作されたガイドＲＮＡ
ＲＮＡ編集及び血清安定性に関するＬＮＡ及び２’ＯＭｅ化学修飾の程度も試験した。Ｋ５６２細胞（２×１０＾５個の細胞）を、４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ Ｘ Ｋｉｔ及び１６ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ Ｓｔｒｉｐｓ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、４０ｐｍｏｌのｇＲＮＡを用いてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、細胞を、５００ｍｌの予め加温しておいた培養培地にすぐに入れ、３時間培養した。細胞を採取し、ＲＮＡをＳａｎｇｅｒ配列決定のために単離した。安定性試験のために、ｇＲＮＡを、リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）又はウシ胎仔血清（「ＦＢＳ」、１０％ＦＢＳを有するＰＢＳ）に露出させた。１８時間のインキュベーションの後、血清安定性を評価するためのアガロースゲル。

図７は、試験した様々なｇＲＮＡの概略図（左上）、ＲＮＡ編集の結果（右上）、及びｇＲＮＡ安定性（下）を示す。図７に示すように、ＲＡＢ７ＡのＲＮＡ編集のレベルは、化学修飾の数の増加に伴って減少した。これも図７に示されるように、血清安定性は、化学修飾の数の増加に伴って増加した。アガロースゲルを非変性条件下で実施し、複数のバンドを観察した。このことは、様々なｇＲＮＡが異なる構造立体配座をとることを示し得る。

ｇＲＮＡ配列を以下の表７に示す。＋は、ＬＮＡを示し、イタリック体は２’ＯＭｅを示す。

図８は、１００及び５０の長さのガイドについてのＲＮＡアガロースゲル及びＲＮＡ編集のグラフを示す。示されるように、化学修飾の数の増加により、血清安定性が向上した。更に、様々なレベルの化学修飾で示された、より長いガイド（１００量体）は、約２０～６０％の高いＲＮＡ編集率を示した。

ｇＲＮＡ配列を以下の表８に示す。＋は、ＬＮＡを示し、イタリック体は２’ＯＭｅを示し、＊は、ホスフェート骨格に対するホスホロチオエート（ＰＳ）修飾を示す。

実施例５．ＡＣＴＢ、ＳＮＣＡ、及びＡＢＣＡ４の編集のための化学修飾された操作されたガイドＲＮＡ
３つの標的（ＡＣＴＢ、ＳＮＣＡ、及びＡＢＣＡ４）のＲＮＡ編集を、ｇＲＮＡが１００ヌクレオチド長である本開示の化学修飾されたガイドで評価した。全ての場合において、標的に対するｇＲＮＡを、ｇＲＮＡの５’末端及び３’末端に３つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含むように修飾した。

ＡＣＴＢについては、以下のように実験を行った。ＲＮＡ編集及び血清安定性に関するＬＮＡ及び２’ＯＭｅ化学修飾の程度も試験した。Ｋ５６２細胞又はＨｅｐＧ２細胞（２×１０＾５個の細胞）を、４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ Ｘ Ｋｉｔ及び１６ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ Ｓｔｒｉｐｓ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、４０ｐｍｏｌのｇＲＮＡを用いてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、細胞を、５００ｍｌの予め加温しておいた培養培地にすぐに入れ、７時間、２４時間、又は４８時間培養した。細胞を採取し、ＲＮＡをＳａｎｇｅｒ配列決定のために単離した。

ＳＮＣＡについては、以下のように実験を行った。ＲＮＡ編集及び血清安定性に関するＬＮＡ及び２’ＯＭｅ化学修飾の程度も試験した。ＨＥＫ２９３細胞（２×１０＾５個の細胞）を、４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ Ｘ Ｋｉｔ及び１６ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ Ｓｔｒｉｐｓ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、４０ｐｍｏｌのｇＲＮＡを用いてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、細胞を、５００ｍｌの予め加温しておいた培養培地にすぐに入れ、７時間培養した。細胞を採取し、ＲＮＡをＳａｎｇｅｒ配列決定のために単離した。

ＡＢＣＡ４については、以下のように実験を行った。ＲＮＡ編集及び血清安定性に関するＬＮＡ及び２’ＯＭｅ化学修飾の程度も試験した。ＡＢＣＡ４ １９６１Ｅ変異を有するＡＢＣＡ４ミニ遺伝子を保有するＨＥＫ２９３細胞（２×１０＾５個の細胞）を、４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ Ｘ Ｋｉｔ及び１６ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ Ｓｔｒｉｐｓ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、４０ｐｍｏｌのｇＲＮＡを用いてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、細胞を、５００ｍｌの予め加温しておいた培養培地にすぐに入れ、７時間培養した。細胞を採取し、ＲＮＡをＳａｎｇｅｒ配列決定のために単離した。

図９に示すように、化学修飾されたｇＲＮＡは、修飾を有しないＩＶＴガイドよりも高いレベルで、３つ全ての標的の編集を首尾良く媒介した。

ｇＲＮＡ配列を以下の表９に示す。＋は、ＬＮＡを示す。

前述の開示は、明確さ及び理解のためにある程度詳細に説明されているが、本開示の真の範囲から逸脱することなく形態及び詳細の様々な変更を行うことができることは、本開示を読めば、当業者には明白であろう。例えば、上述の全ての技術及び装置は、様々な組み合わせで使用され得る。本出願で引用される全ての刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文書は、各々の個々の刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文書が、あらゆる目的のために参照により組み込まれるように個別かつ別々に示されているのと同じ程度まで、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により組み込まれる。

本開示の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されているが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは、当業者には明白であろう。本開示から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換がここで当業者に想起されるであろう。本明細書に記載の本開示の実施形態に対する様々な代替物が、本開示の実施に用いられ得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内の方法及び構造がそれによって網羅されることが意図され得る。

Claims (63)

1. 操作されたガイドＲＮＡであって、
   （ａ）少なくとも１個の化学修飾と、
   （ｂ）標的化ドメインであって、前記標的化ドメインが、対象に投与されると標的ＲＮＡにハイブリダイズし、それによって前記対象の細胞中に存在するＲＮＡ編集エンティティを動員する複合体を形成する、標的化ドメインと、を含み、
   前記ＲＮＡ編集エンティティが、前記操作されたガイドＲＮＡ及び前記標的ＲＮＡと会合すると、前記標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の標的化編集を行う、操作されたガイドＲＮＡ。
2. 前記操作されたガイドＲＮＡが、前記標的ＲＮＡに対するミスマッチを含む、請求項１に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
3. 前記ミスマッチが、標的ＲＮＡ分子中の塩基に対向しており、かつ対形成しない、前記操作されたガイドＲＮＡ中の塩基を含む、請求項２に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
4. 前記ミスマッチが、Ａ／Ｃミスマッチを含み、前記Ａが、前記標的ＲＮＡ分子中にあり、前記Ｃが、前記操作されたガイドＲＮＡ中にある、請求項２に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
5. 前記Ａ／Ｃミスマッチ中の前記Ａが、前記ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された前記標的ＲＮＡ分子中のヌクレオチドの塩基を含む、請求項４に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
6. 前記操作されたガイドＲＮＡが、前記ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された前記標的ＲＮＡ中の前記ヌクレオチドの塩基と対向するＣを含む、請求項５に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
7. 前記標的ＲＮＡ分子が、前記ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された前記標的ＲＮＡ中の前記ヌクレオチドの塩基に隣接し、かつ５’のＧを含む、請求項５に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
8. 前記操作されたガイドが、前記ＲＮＡ編集エンティティによって化学修飾された前記標的ＲＮＡ分子中の前記Ａに対して対向しており、かつ対形成しない前記Ｃに隣接し、かつ５’のＧを更に含む、請求項６に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
9. 前記操作されたガイドＲＮＡが、前記ミスマッチのいずれかの側に非修飾ヌクレオチドを含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
10. 前記操作されたガイドＲＮＡが、前記ミスマッチの２個のヌクレオチド内に第２のミスマッチを含まない、請求項５～９のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
11. 前記少なくとも１個の化学修飾が、
    （ａ）前記操作されたガイドＲＮＡの５’末端の近位、
    （ｂ）前記操作されたガイドＲＮＡのある領域の５’末端の近位、又は
    （ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方に配置される、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
12. 前記少なくとも１個の化学修飾が、
    （ａ）前記操作されたガイドＲＮＡの３’末端の近位、
    （ｂ）前記操作されたガイドＲＮＡのある領域の３’末端の近位、又は
    （ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方に配置される、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
13. 前記少なくとも１個の化学修飾が、前記操作されたガイドＲＮＡの５’末端の近位、前記操作されたガイドＲＮＡのある領域の５’末端の近位、前記操作されたガイドＲＮＡの３’末端の近位、前記操作されたガイドＲＮＡのある領域の３’末端の近位、又はこれらの任意の組み合わせに配置される、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
14. 前記操作されたガイドＲＮＡが、水溶液中に存在し、かつ前記標的ＲＮＡに結合していない場合には、約１００ｎＭ未満の解離定数であり、前記ＲＮＡ編集エンティティに結合しない、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
15. 前記少なくとも１個の化学修飾が、表２に提供される前記操作されたガイドＲＮＡのホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素原子の片方又は両方の置換を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
16. 前記少なくとも１個の化学修飾が、表２に提供される前記操作されたガイドＲＮＡのホスホジエステル骨格連結中の連結リン酸酸素原子のうちの１つ以上の置換を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
17. 前記少なくとも１個の化学修飾が、表２に提供される前記操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの糖に対する修飾を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
18. 前記操作されたガイドＲＮＡの前記ヌクレオチドの前記糖に対する前記修飾が、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、請求項１７に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
19. 前記操作されたガイドＲＮＡの前記ヌクレオチドの前記糖に対する前記修飾が、少なくとも１つのアンロックド核酸（ＵＮＡ）を含む、請求項１７に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
20. 前記糖に対する前記修飾が、前記糖の構成要素の修飾を含み、前記糖が、リボース糖を含む、請求項１７に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
21. 前記操作されたガイドＲＮＡの前記ヌクレオチドの前記リボース糖の前記構成要素に対する前記修飾が、２’－Ｏ－メチル基を含む、請求項２０に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
22. 前記少なくとも１個の化学修飾が、表２に提供されるデホスホリンカーによる、前記操作されたガイドＲＮＡのリン酸部分の置き換えを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
23. 前記少なくとも１個の化学修飾が、表２に提供される前記操作されたガイドＲＮＡのリン酸骨格の修飾を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
24. 前記操作されたガイドＲＮＡが、ホスホチオエート基を含む、請求項２３に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
25. 前記少なくとも１個の化学修飾が、前記操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチドの塩基に対する修飾を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
26. 前記少なくとも１個の化学修飾が、表２に提供されるヌクレオチドの非天然塩基を含む、請求項２５に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
27. 前記少なくとも１個の化学修飾が、モルホリノ基、シクロブチル基、ピロリジン基、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代理物を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
28. 前記少なくとも１個の化学修飾が、表２に提供される少なくとも１個の立体化学的に純粋な核酸を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
29. 前記操作されたガイドＲＮＡが、１～１００個の化学修飾を含み、その各々が独立して同じであってもよいか、又は異なっていてもよい、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
30. 前記少なくとも１個の化学修飾が、真核細胞中の核酸に対して天然に存在する化学修飾を含まない、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
31. 前記少なくとも１個の化学修飾が、前記少なくとも１個の化学修飾を含まない、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドの特異性と比較して、前記標的ＲＮＡに対する前記操作されたガイドＲＮＡの結合の特異性を増加させる、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
32. 前記少なくとも１個の化学修飾が、インビトロアッセイで測定される場合に、前記少なくとも１個の化学修飾を含まない、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド消化に対する抵抗性と比較して、前記操作されたガイドＲＮＡのヌクレオチド消化に対する抵抗性を増加させる、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
33. 前記少なくとも１個の化学修飾が、インビトロアッセイで測定される場合に、前記少なくとも１個の化学修飾を含まない、それ以外は同一の参照ポリヌクレオチドの免疫原性と比較して、前記操作されたガイドＲＮＡの免疫原性を減少させる、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
34. 前記標的ＲＮＡが、ＲＡＢ７Ａ、ＡＢＣＡ４、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＡＰＰ、Ｔａｕ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ Ｇ１２２６Ｒ、ＨＦＥ Ｃ２８２Ｙ、ＬＩＰＡ ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ、ＰＣＳＫ９開始部位、若しくはＳＣＮＮ１Ａ開始部位、これらのいずれかの断片、又はこれらの任意の組み合わせを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
35. 前記標的ＲＮＡが、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋを含む、請求項３４に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
36. 前記操作されたガイドＲＮＡが、配列番号１～２のうちのいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項３４に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
37. 前記標的ＲＮＡが、ＡＢＣＡ４をコードする、請求項３４に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
38. 前記ＲＮＡ編集エンティティが、
    （ａ）ＡＤＡＲ若しくはＡＰＯＢＥＣ、
    （ｂ）（ａ）の触媒的に活性な断片、
    （ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）を含む融合ポリペプチド、又は
    （ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせである、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
39. 前記ＲＮＡ編集エンティティが、ＡＤＡＲを含み、前記ＡＤＡＲが、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、又はこれらの組み合わせを含む、請求項３８に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
40. 前記ＲＮＡ編集エンティティが、前記対象の細胞に対して内因性である、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
41. 前記ＲＮＡ編集エンティティが、外因的に提供される、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
42. 構造的なループ安定化骨格を更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
43. 前記構造的なループ安定化骨格が、ステムループ、接合部、Ｔ接合部、クローバーリーフ、シュードノット、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項４２に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
44. 前記構造的なループ安定化骨格が、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０個のステムループ構造を含む、請求項４２又は４３に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
45. 前記構造的なループ安定化骨格が、ｔＲＮＡ骨格を含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
46. ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
47. 前記操作されたガイドＲＮＡが、標的化部分にコンジュゲート化される、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
48. 前記標的化部分が、神経細胞を標的化する、請求項４７に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
49. 前記標的化部分が、肝臓細胞を標的化する、請求項４７に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
50. 前記標的化部分が、黄斑細胞を標的化する、請求項４７に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
51. 前記操作されたガイドＲＮＡが、粒子中に封入される、先行請求項のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
52. 前記粒子が、ナノ粒子を含む、請求項５１に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
53. 前記粒子が、リポソームを含む、請求項５１に記載の操作されたガイドＲＮＡ。
54. 単位用量形態の薬学的組成物であって、
    （ａ）請求項１～５３のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡと、
    （ｂ）薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤と、を含む、薬学的組成物。
55. 疾患又は状態を治療又は予防することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記方法が、請求項１～５３のいずれか一項に記載の操作されたガイドＲＮＡを前記対象に投与することを含む、方法。
56. 前記投与することが、髄腔内、眼内、硝子体内、網膜内、静脈内、筋肉内、脳室内、大脳内、小脳内、側脳室内、実質内、皮下、又はこれらの組み合わせである、請求項５５に記載の方法。
57. 前記疾患又は前記状態が、神経性疾患又は状態を含む、請求項５５又は５６に記載の方法。
58. 前記神経性疾患若しくは状態、又は神経発達的疾患若しくは状態が、パーキンソン病、アルツハイマー病、又は認知症を含む、請求項５７に記載の方法。
59. 前記疾患又は前記状態が、肝臓疾患又は状態を含む、請求項５５又は５６に記載の方法。
60. 前記肝臓疾患又は状態が、肝硬変を含む、請求項５９に記載の方法。
61. 前記肝臓疾患又は状態が、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴ欠乏症）を含む、請求項５９に記載の方法。
62. 前記疾患又は前記状態が、黄斑変性を含む、請求項５５又は５６に記載の方法。
63. 前記黄斑変性が、スターガルト病を含む、請求項６２に記載の方法。

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