CN114941018A - cap1帽类似物的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种cap1帽类似物的合成方法，其步骤包括：通过多步化学反应合成二核苷酸pNpN；二核苷酸pNpN与GDP或者3'‑OMe‑GDP缩合反应生成G‑cap结构；G(5')ppp(5')NpN或者（3'‑OMe）G(5')ppp(5')NpN在加帽酶的催化下生成cap0结构；m7G(5')ppp(5')NpN或者3'‑OMe‑m7G(5')ppp(5')NpN在2‑O甲基转移酶的催化下生成cap1帽类似物，即m7G(5')ppp(5')(2'‑OMeN)pN或者(3'‑OMe‑m7G)(5')ppp(5')(2'‑OMeN)pN。本发明采用化学合成加酶促合成的方法合成cap1帽类似物，简化了传统上的纯化学合成方法。起始原料来源更广泛，更便宜，合成步骤更简单，合成得率更高。

Description

cap1帽类似物的合成方法
技术领域
本申请涉及一种cap1帽类似物的合成方法，属于生物化学技术领域。
背景技术
mRNA疫苗是近几年兴起一种疫苗形式，尤其是新冠期间表现突出。mRNA疫苗具有快速响应、便于大规模制备的优点，同时又没有DNA疫苗的遗传变异的风险。非常适合应对突发性的、流传性、季节性的疾病威胁。mRNA除了在疫苗领域应用，还可以应用于癌症治疗、遗传性疾病治疗等领域。mRNA作为活性药物组分，其核心结构有5’端的帽子结构，5’-UTR，基因翻译去、3’-UTR和3’-polyA尾巴。mRNA的帽子结构可以通过转录后使用加帽酶和2-O-甲基转移酶的酶法加帽修饰完成，也可以通过帽类似物共转录加帽方式完成。
Cap1结构的帽类似物是目前常用的形式，其生产方式是复杂的化学合成。核苷酸上有多个活性基团，因此合成过程中需要到多次的保护和脱保护反应，所以合成产率很低。
发明内容
本发明的目的是提供一种cap1帽类似物的合成方法，采用化学合成加酶促反应的方法，简化了传统上的纯化学合成方法。
本发明采用的技术手段为：
一种cap1帽类似物的合成方法，其步骤包括：
通过多步化学反应合成二核苷酸pNpN；
二核苷酸pNpN与GDP或者3'-OMe-GDP缩合反应生成G-cap结构，即G(5')ppp(5')NpN或者（3'-OMe）G(5')ppp(5')NpN；
G(5')ppp(5')NpN或者（3'-OMe）G(5')ppp(5')NpN在加帽酶的催化下生成cap0结构，即m7G(5')ppp(5')NpN或者3'-OMe-m7G(5')ppp(5')NpN；
m7G(5')ppp(5')NpN或者3'-OMe-m7G(5')ppp(5')NpN在2-O甲基转移酶的催化下生成cap1帽类似物，即m7G(5')ppp(5')(2'-OMeN)pN或者(3'-OMe-m7G)(5')ppp(5')(2'-OMeN)pN。
优选的，步骤（1）具体为：
化合物1、化合物2与吡啶三氟乙酸盐溶于乙腈中搅拌反应，旋蒸旋掉乙腈，加入二氯甲烷，水洗，饱和氯化钠溶液洗涤，柱层析得到产品1；
产品1溶解于THF：pyridine：H2O溶剂中，控温至0度，缓慢加入碘单质，室温反应，旋干，加入二氯甲烷，水洗，饱和氯化钠溶液洗涤，旋干，柱层析得到产品2；
产品2溶解于CHCl3中，控温至0度，缓慢加入三氟乙酸，室温反应，旋干，加入二氯甲烷，水洗，碳酸氢钠溶液洗涤，旋干，柱层析得到化合物3；
化合物3 溶解于乙腈中，加入双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺，及吡啶三氟乙酸盐，室温搅拌过夜，反应完全后加入二氯甲烷及水，分出有机相，碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，柱层析得到产品3；
产品3溶解于THF：pyridine：H2O溶剂中，控温至0度，缓慢加入碘单质，室温反应，旋干，加入二氯甲烷，水洗，饱和氯化钠溶液洗涤，旋干，柱层析得到产品4；
产品4溶解于THF中，加入浓氨水，室温搅拌过夜，反应完全后旋干得到粗品，柱层析得到二核苷酸pNpN；
其中化合物1的结构为
Figure DEST_PATH_IMAGE001
，或者化合物1的碱基为尿嘧啶；
化合物2的结构为
Figure 867092DEST_PATH_IMAGE002
。
优选的，步骤（2）具体为将二核苷酸pNpN溶解于DMF中，加入CDI，加热至50℃反应一段时间，再加入GDP 或者3'-OMe-GDP，室温搅拌，反应完后经过离子交换树脂纯化，得到G(5')ppp(5')NpN或者（3'-OMe）G(5')ppp(5')NpN。
优选的，步骤（3）和（4）同时进行，即G(5')ppp(5')NpN或者（3'-OMe）G(5')ppp(5')NpN在加帽酶和2-O-甲基转移酶的同时作用下，生成m7G(5')ppp(5')(2'-OMeN)pN或者(3'-OMe-m7G)(5')ppp(5')(2'-OMeN)pN。
优选的，所述加帽酶为牛痘病毒加帽酶，或者加帽酶的甲基转移酶的活性亚基。
优选的，所述2-O-甲基转移酶是牛痘病毒来源、黄病毒来源或者冠状病毒来源的2-O-甲基转移酶。
本发明采用化学合成加酶促合成的方法合成cap1帽类似物，简化了传统上的纯化学合成方法。起始原料来源更广泛，更便宜，合成步骤更简单，合成得率更高。
附图说明
图1：化合物5 G(5’)ppp(5’)ApG的合成路线图。
图2：由化合物5 G(5’)ppp(5’)ApG合成m7G(5')ppp(5')(2'-OMeN)pG的合成路线图。
图3：m7G(5')ppp(5')(2'-OMeN)pG的结构式。
图4：(3'-OMe-m7G)(5')ppp(5')(2'-OMeA)pG的结构式。
具体实施方式
实施例1，化学合成G-Cap，G(5’)ppp(5’)ApG
1、化合物3的合成
如图1所示，步骤a， 57.5g化合物1加入1.2L 乙腈，溶清后加入85.8g化合物2，57g吡啶三氟乙酸盐，室温搅拌反应过夜，反应完全，旋蒸旋掉乙腈，加入1L 二氯甲烷，水洗一次，饱和食盐水洗涤一次，柱层析得到100g产品1。
步骤b，上述100g产品1溶解于1L的THF：pyridine：H2O（4:2:4）溶剂中，控温至0度，缓慢加入3eq的碘单质，室温反应3小时，旋干，加入1000ml二氯甲烷，水洗，饱和氯化钠洗涤，旋干，柱层析得到90g产品2。
步骤c，上述90g产品2溶解于1L的CHCl3中，控温至0度，缓慢加入3eq的三氟乙酸，室温反应过夜，旋干，加入1000ml二氯甲烷，水洗，5%碳酸氢钠洗涤，旋干，柱层析得到65g化合物3。
2、化合物4的合成
步骤d，54g 化合物3 溶解于600ml 乙腈中，加入 15g 双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺，及15g吡啶三氟乙酸盐，室温搅拌过夜，反应完全后加入600ml二氯甲烷及600ml水，分出有机相，5%碳酸氢钠洗涤，饱和氯化钠洗涤，柱层析得到50g产品3。
步骤e，上述50g产品3溶解于1L的THF：pyridine：H2O（4:2:4）溶剂中，控温至0度，缓慢加入3eq的碘单质，室温反应3小时，旋干，加入600ml二氯甲烷，水洗，饱和氯化钠洗涤，旋干，柱层析得到40g产品4。
步骤f，上述40g产品4溶解于300ml的THF中，加入200ml浓氨水，室温搅拌过夜，反应完全后旋干得到粗品，柱层析得到10g化合物4。
3、化合物5的合成
步骤g，10g 化合物4溶解于100ml DMF中，加入2g CDI，加热至50度反应2小时，再加入5g GDP，室温搅拌过夜。反应完后经过DEAE-Sephadex离子交换树脂纯化，得到5g 化合物5（G(5’)ppp(5’)ApG）。
实施例2，化学合成G-Cap，（3'-OMe）G(5')ppp(5')ApG
同实施例1相同的合成路线，区别在于3'-OMe-GDP替代GDP，得到（3'-OMe）G(5')ppp(5')ApG。
实施例3，酶促合成cap0，m7GpppApG
在实施例1中合成的G-Cap，G(5’)ppp(5’)ApG，取10g，按照下表配置反应体系：
原料 添加量
G(5’)ppp(5’)ApG 10g
氯化镁 3.8g
二硫苏糖醇 3g
S-腺苷蛋氨酸 32g
三羟甲基氨基甲烷 2.4g
牛痘病毒加帽酶 0.1g
超纯水 至1L
在2L反应釜中，控制反应温度为37℃，控制pH为8.0。反应12h后，加入8g EDTA终止反应。HPLC检测反应完成率为85%。高效液相纯化后纯度为96%，旋转蒸发后，冻干，得到7.5g目标产物m7GpppApG。
实施例4，酶促合成cap1，m7GpppAmpG
在实施例3中合成的Cap0，m7G(5’)ppp(5’)ApG，取5g，按照下表配置反应体系：
原料 添加量
M7G(5’)ppp(5’)ApG 5g
氯化镁 2g
二硫苏糖醇 1.5g
S-腺苷蛋氨酸 10g
三羟甲基氨基甲烷 1.2g
牛痘病毒2-O-甲基转移酶 0.05g
超纯水 至0.5L
在1L反应釜中，控制反应温度为37℃，控制pH为8.0。反应12h后，加入8g EDTA终止反应。HPLC检测反应完成率为92%。高效液相纯化后纯度为98%，旋转蒸发后，冻干，得到4.1g目标产物m7GpppAmpG。
实施例5，一步酶促合成cap1, (3'-OMe-m7G)(5')ppp(5')(2'-OMeA)pG
在实施例2中合成的G-Cap，（3'-OMe）G(5’)ppp(5’)ApG，取10g，按照下表配置反应体系：
原料 添加量
（3'-OMe）G(5’)ppp(5’)ApG 10g
氯化镁 3.8g
二硫苏糖醇 3g
S-腺苷蛋氨酸 40g
三羟甲基氨基甲烷 2.4g
非洲猪瘟病毒加帽酶 0.1g
黄病毒2-O-甲基转移酶 0.1g
超纯水 至1L
在2L反应釜中，控制反应温度为37℃，控制pH为8.0。反应12h后，加入8g EDTA终止反应。HPLC检测反应完成率为79%。高效液相纯化后纯度为92%，旋转蒸发后，冻干，得到6.3g目标产物(3'-OMe-m7G)(5')ppp(5')(2'-OMeA)pG。
实施例6，合成cap1, m7G(5’)ppp(5’)(2’-OMeA)pU
同实施例1和2一样的合成路线合成G-cap，G(5’)ppp(5’)ApU。取10g，按照下表配置反应体系：
原料 添加量
G(5’)ppp(5’)ApU 10g
氯化镁 3.8g
二硫苏糖醇 3g
S-腺苷蛋氨酸 40g
三羟甲基氨基甲烷 2.4g
牛痘病毒加帽酶鸟苷转移酶亚基 0.05g
牛痘病毒2-O-甲基转移酶 0.1g
超纯水 至1L
在2L反应釜中，控制反应温度为37℃，控制pH为8.0。反应12h后，加热80℃，30分钟终止反应。HPLC检测反应完成率为82%。高效液相纯化后纯度为93%，旋转蒸发后，冻干，得到6.7g目标产物m7G(5')ppp(5')(2'-OMeA)pU。

Claims (6)

1.一种cap1帽类似物的合成方法，其特征在于其步骤包括：
（1）通过多步化学反应合成二核苷酸pNpN；
（2）二核苷酸pNpN与GDP或者3'-OMe-GDP缩合反应生成G(5')ppp(5')NpN或者（3'-OMe）G(5')ppp(5')NpN；
（3）G(5')ppp(5')NpN或者（3'-OMe）G(5')ppp(5')NpN在加帽酶的催化下生成m7G(5')ppp(5')NpN或者3'-OMe-m7G(5')ppp(5')NpN；
（4）m7G(5')ppp(5')NpN或者3'-OMe-m7G(5')ppp(5')NpN在2-O甲基转移酶的催化下生成cap1帽类似物m7G(5')ppp(5')(2'-OMeN)pN或者(3'-OMe-m7G)(5')ppp(5')(2'-OMeN)pN。
2.根据权利要求1所述的cap1帽类似物的合成方法，其特征在于步骤（1）具体为：
A、化合物1、化合物2与吡啶三氟乙酸盐溶于乙腈中搅拌反应，旋蒸旋掉乙腈，加入二氯甲烷，水洗，饱和氯化钠溶液洗涤，柱层析得到产品1；
B、产品1溶解于THF：pyridine：H2O溶剂中，控温至0度，缓慢加入碘单质，室温反应，旋干，加入二氯甲烷，水洗，饱和氯化钠溶液洗涤，旋干，柱层析得到产品2；
C、产品2溶解于CHCl3中，控温至0度，缓慢加入三氟乙酸，室温反应，旋干，加入二氯甲烷，水洗，碳酸氢钠溶液洗涤，旋干，柱层析得到化合物3；
D、化合物3 溶解于乙腈中，加入双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺，及吡啶三氟乙酸盐，室温搅拌过夜，反应完全后加入二氯甲烷及水，分出有机相，碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，柱层析得到产品3；
E、产品3溶解于THF：pyridine：H2O溶剂中，控温至0度，缓慢加入碘单质，室温反应，旋干，加入二氯甲烷，水洗，饱和氯化钠溶液洗涤，旋干，柱层析得到产品4；
F、产品4溶解于THF中，加入浓氨水，室温搅拌过夜，反应完全后旋干得到粗品，柱层析得到二核苷酸pNpN；
其中化合物1的结构为
Figure 109108DEST_PATH_IMAGE001
，或者化合物1的碱基为尿嘧啶；
化合物2的结构为
Figure 826528DEST_PATH_IMAGE002
。
3.根据权利要求2所述的cap1帽类似物的合成方法，其特征在于步骤（2）具体为将二核苷酸pNpN溶解于DMF中，加入CDI，加热至50℃反应一段时间，再加入GDP 或者3'-OMe-GDP，室温搅拌，反应完后经过离子交换树脂纯化，得到G(5')ppp(5')NpN或者（3'-OMe）G(5')ppp(5')NpN。
4.根据权利要求2所述的cap1帽类似物的合成方法，其特征在于：步骤（3）和（4）同时进行，即G(5')ppp(5')NpN或者（3'-OMe）G(5')ppp(5')NpN在加帽酶和2-O-甲基转移酶的同时作用下，生成m7G(5')ppp(5')(2'-OMeN)pN或者(3'-OMe-m7G)(5')ppp(5')(2'-OMeN)pN。
5.根据权利要求1或4所述的cap1帽类似物的合成方法，其特征在于：所述加帽酶为牛痘病毒加帽酶，或者加帽酶的甲基转移酶的活性亚基。
6.根据权利要求1或4所述的cap1帽类似物的合成方法，其特征在于：所述2-O-甲基转移酶是牛痘病毒来源、黄病毒来源或者冠状病毒来源的2-O-甲基转移酶。
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WO2024051696A1 (zh) * 2022-09-05 2024-03-14 广州市恒诺康医药科技有限公司 用于rna加帽的化合物及其应用

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