CN107473972B - 一种核苷类保护基及其制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型核苷类保护基及其制备。具体而言，本发明提供下式1所示结构的化合物，其中，R1选自C1‑C6烷基或C6‑C14芳基，优选为C1‑C4烷基或苯基，例如甲基、乙基或苯基；R2选自C1‑C6烷基或C6‑C14芳基取代的C1‑C6烷基，优选为C1‑C4烷基或苯基取代的C1‑C4烷基，例如甲基、乙基、苄基或苯乙基；X是卤素，优选为氯。在酸性条件下本发明化合物比传统的4,4'‑双甲氧基三苯甲基核苷保护基更易脱保护。

Description

一种核苷类保护基及其制备
技术领域
本发明属于核苷化合物合成领域，更具体地，本发明涉及新型核苷类保护基及其制备。
背景技术
反义技术(Antisense Technology)是根据碱基互补原理，用人工合成或生物体合成的特定DNA或RNA片段抑制或封闭基因表达的技术，是一种新的药物开发方法。利用反义技术研制的药物成为反义核酸药物(简称反义药物)，包括反义寡核苷酸(又包括反义DNA和反应RNA)、核酶、反义RNA及RNA干扰。根据核酸杂交原理，反义药物能与特定基因杂交，在基因水平干扰致病蛋白的产生过程。蛋白质是生物体结构和功能的主要物质，在人体代谢中扮演非常重要的角色，几乎所有的人类疾病都是由蛋白质的异常引起的，无论是宿主疾病(肿瘤等)还是感染疾病(肝炎等)。传统药物主要是直接作用于致病蛋白本身，反义药物则作用于编码致病蛋白的基因，因此可以应用于多种疾病的治疗。
反义寡核苷酸的研究包括以硫代修饰为代表的第一代反义核酸，对核糖的2′位羟基进行修饰为代表的第二代反义核酸，以及对磷酸骨架和核糖进行修饰为代表的第三代反义核酸。近年来，反义寡核苷酸的合成和研究更是已进入了一个新的阶段，有望在抗病毒、抗肿瘤、炎症性疾病方面成为新的药物，并且是研究基因功能的一个有用工具。
在反义寡核苷酸的合成和研究中，经典的方法往往首先会在核苷的5’位羟基引入一个保护基，从而保证随后单体偶联中核苷3’位羟基的单一选择性。常见5’位羟基保护基有4,4'-双甲氧基三苯甲基(DMT)，4-甲氧基三苯甲基(MMT)等。为了进一步丰富5’位羟基保护基，满足各种不同寡核苷酸衍生物的合成和研发需求，进一步开发出新型的5’位羟基保护基就显得尤为必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种核苷类保护基的制备方法，以丰富核苷5'-羟基保护基的选择。
本发明所述的新型核苷类保护基化合物为4-烷氧基-4'-酰氧基三苯甲基卤，其具有式1所示结构：
Figure GDA0002463472880000021
式1中，
R1选自C1-C6烷基或C6-C14芳基；
R2选自C1-C6烷基或C6-C14芳基取代的C1-C6烷基；
X是卤素。
在一个或多个实施方案中，式1中，R1为甲基，乙基或苯基。
在一个或多个实施方案中，R1为甲基。
在一个或多个实施方案中，式1中，R2为甲基，乙基或苄基。
在一个或多个实施方案中，R2为甲基。
在一个或多个实施方案中，X为氯。
在一个或多个实施方案中，所述化合物选自以下化合物D-1到D-4：
Figure GDA0002463472880000031
本发明还提供下式C所示的化合物：
Figure GDA0002463472880000032
其中，
R1选自C1-C6烷基或C6-C14芳基；
R2选自C1-C6烷基或C6-C14芳基取代的C1-C6烷基；
X是卤素，优选为氯。
在一个或多个实施方案中，式C中，R1为甲基，乙基或苯基。
在一个或多个实施方案中，式C中，R1为甲基。
在一个或多个实施方案中，式C中，R2为甲基，乙基或苄基。
在一个或多个实施方案中，式C中，R2为甲基。
在一个或多个实施方案中，式C中，X为氯。
在一个或多个实施方案中，式C化合物选自：
Figure GDA0002463472880000041
本发明还提供一种制备式1化合物的方法：
Figure GDA0002463472880000042
式1中，
R1选自C1-C6烷基或C6-C14芳基；
R2选自C1-C6烷基或C6-C14芳基取代的C1-C6烷基；
X是卤素；
其中，所述方法包括将式C化合物与酰卤反应，进行卤化从而制备得到式1化合物的步骤：
Figure GDA0002463472880000051
式C中，R1和R2的定义与式1中的定义相同。
在一个或多个实施方案中，卤化式C化合物的步骤包括使式C化合物与酰卤反应。
在一个或多个实施方案中，酰卤具有以下结构：R-C(O)-X，其中，X为卤素，R为C1-C6烷基或C6-C14芳基。
在一个或多个实施方案中，酰卤选自酰氟、酰氯、酰溴和酰碘。
在一个或多个实施方案中，酰卤选自乙酰氯、乙酰溴、乙酰碘、乙酰氟和苯甲酰氯。
在一个或多个实施方案中，式C化合物与酰卤的摩尔比为1：6～10，如1：7～9。
在一个或多个实施方案中，卤化反应包括在80～90℃回流2～5小时。
在一个或多个实施方案中，卤化反应在有机溶剂中进行。
在一个或多个实施方案中，有机溶剂选自甲苯或苯。
在一个或多个实施方案中，卤化反应结束后，还包括纯化步骤。
在一个或多个实施方案中，纯化包括浓缩，重结晶，将析出的固体抽滤，以及将洗涤滤饼的步骤。
在一个或多个实施方案中，洗涤包括使用体积比为5～8：1的正庚烷：甲苯进行洗涤。
在一个或多个实施方案中，式C化合物由下式B化合物与酰卤进行反应，并进行水解而制备得到：
Figure GDA0002463472880000061
式B中，R2的定义与式1的定义相同。
在一个或多个实施方案中，酰卤具有以下结构：R1-C(O)-X，其中，X为卤素，R1的定义与式1的定义相同。
在一个或多个实施方案中，酰卤选自甲酰氟、乙酰氯和苯甲酰氯。
在一个或多个实施方案中，式B化合物与酰卤的摩尔比为1：6～10，如1：7～9。
在一个或多个实施方案中，反应包括在80～90℃回流2～5小时。
在一个或多个实施方案中，反应在有机溶剂中进行。
在一个或多个实施方案中，有机溶剂选自甲苯或苯。
在一个或多个实施方案中，反应结束后，将反应液减压浓缩至干燥，向干燥的产品中加入乙腈和水溶解，进行水解反应。
在一个或多个实施方案中，乙腈和水的体积比为1：3～3：1。
在一个或多个实施方案中，水解结束后，还包括纯化步骤。
在一个或多个实施方案中，纯化包括减压浓缩，萃取，干燥以及柱层析的步骤。
在一个或多个实施方案中，用乙酸乙酯和水溶解萃取减压浓缩获得的产品，获得有机相。
在一个或多个实施方案中，通过将下式A所示的化合物选择性脱苯环上一个烷基保护后再水解而得到式B化合物：
Figure GDA0002463472880000071
式A中，R2和X的定义与式1的定义相同。
在一个或多个实施方案中，使式A化合物与BBr3反应，从而选择性脱除一个苯环上的R2。
在一个或多个实施方案中，式A化合物与BBr3的摩尔比为1：1～3，如1：1～2。
在一个或多个实施方案中，反应在有机溶剂中进行。
在一个或多个实施方案中，有机溶剂选自：二氯甲烷或二氯乙烷。
在一个或多个实施方案中，反应在20±5℃下搅拌至化合物A不再转化。
在一个或多个实施方案中，HPLC监控反应，若原料<7％则停止反应；否则继续反应，每50-60分钟取样HPLC分析直至原料<7％。
在一个或多个实施方案中，反应结束后，将反应液减压浓缩至干燥，向干燥的产品中加入乙腈和水溶解，进行水解反应。
在一个或多个实施方案中，乙腈和水的体积比为1：3～3：1。
在一个或多个实施方案中，水解结束后，还包括纯化步骤。
在一个或多个实施方案中，纯化包括减压浓缩，萃取，干燥以及柱层析的步骤。
在一个或多个实施方案中，用乙酸乙酯和水溶解萃取减压浓缩获得的产品，获得有机相。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括：
(1)以式A化合物为原料，选择性脱苯环上一个烷基保护后再水解得到式B化合物；
(2)将式B化合物与酰卤反应，对苯环上的羟基进行酰基保护，再水解得到式C化合物；和
(3)将式C化合物与酰卤反应，进行卤化得到式1化合物。
本发明还提供一种制备受式1化合物保护的核苷的方法，其特征在于，所述方法包括使式1化合物与待保护的核苷在有机溶剂中进行反应的步骤。
本发明还提供受本发明式1化合物保护的核苷，以及采用本发明所述方法制备得到的核苷。
在一个或多个实施方案中，所述受保护的核苷选自：
Figure GDA0002463472880000081
本发明还提供含本发明受式1化合物保护的核苷的核苷酸序列。
本发明还包括式1化合物在制备受保护的核苷或核苷酸序列如反义寡核苷酸中的用途。
具体实施方式
本申请提供一种新型的核苷类保护基化合物，其具有式1所示结构：
Figure GDA0002463472880000082
式1中，
R1选自C1-C6烷基或C6-C14芳基；
R2选自C1-C6烷基或C6-C14芳基取代的C1-C6烷基；
X是卤素。
本文中，烷基包括直链和支链烷基，其碳原子数通常为1～6个，例如1～4个、1～3个或1～2个。典型的烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、仲丁基等。
本文中，芳基指含有6到14个碳原子，优选6到10个碳原子的单环、双环或三环芳族基团。典型的芳基包括苯基、萘基、菲基、蒽基、茚基、薁基、联苯基、亚联苯基和茀基。
本文中，卤素包括氟、氯、溴和碘。
在优选的实施方案中，式1的R1为C1-C4烷基或苯基，例如甲基，乙基或苯基。在优选的实施方案中，式1的R2为C1-C4烷基或苯基取代的C1-C4烷基，例如甲基，乙基，苄基或苯乙基。在优选的实施方案中，X为氯。
因此，在某些优选的实施方案中，式1化合物中，R1为C1-C4烷基或苯基，例如甲基，乙基或苯基；R2为C1-C4烷基或苯基取代的C1-C4烷基，例如甲基，乙基或苄基；X为氯。
在某些实施方案中，式1化合物中，R1为C1-C4烷基，例如甲基或乙基；R2为苯基取代的C1-C4烷基，例如苄基或苯乙基；X为氯。
本发明提供式1化合物的制备方法，所述方法包括将式C化合物卤化，从而制备得到式1化合物的步骤：
Figure GDA0002463472880000091
式C中，R1和R2的定义与式1中的定义相同。
可通过使式C化合物与酰卤发生反应而实现式C化合物的卤化。通常，可采用本领域常用的酰卤进行卤化反应。酰卤通常具有以下结构：R-C(O)-X，其中，X为卤素，R为C1-C6烷基或C6-C14芳基。酰卤可以是酰氟、酰氯、酰溴和酰碘。在某些实施方案中，酰卤选自乙酰氯、乙酰溴、乙酰碘、乙酰氟和苯甲酰氯。
卤化反应可在有机溶剂中进行。合适的有机溶剂包括苯、甲苯或其任意混合物。卤化反应通常在80～90℃进行，回流2～5小时，例如2～4小时。式C化合物与酰卤的摩尔比为1：6～10，如1：7～9。
反应结束后，可采用常规的方法进行纯化，以获得式1化合物。纯化包括浓缩，例如减压浓缩；重结晶；将析出的固体抽滤；以及将洗涤滤饼等的步骤。重结晶可包括将浓缩所得固体溶解在苯、甲苯或其任意混合物中，然后加入适量的正庚烷，在0℃左右搅拌，使产物结晶。在一些实施方案中，洗涤包括使用体积比为5～8：1的正庚烷：甲苯(或苯)进行洗涤。
因此，在某些实施方案中，所述方法包括：
(i)在有机溶剂的存在下，使式C化合物与酰卤的混合物在80～90℃回流2～5小时；其中，式C化合物与酰卤的摩尔比为1：6～10；
(ii)减压浓缩步骤(i)制备得到的产物，获得固体；
(iii)将步骤(ii)获得的固体溶解在有机溶剂中，加入正庚烷进行重结晶；和
(iv)抽滤步骤(iii)析出的固体，使用体积比为5～8：1的正庚烷：甲苯(或苯)洗涤。
在某些实施方案中，式C化合物由下式B化合物与酰卤进行反应，并进行水解而制备得到：
Figure GDA0002463472880000101
式B中，R2的定义与式1的定义相同。
适用于此反应的酰卤可具有如下结构：R1-C(O)-X，其中，X为卤素，R1的定义与式1的定义相同。在某些实施方案中，酰卤选自甲酰氟、乙酰氯和苯甲酰氯。
式B化合物与酰卤的反应可在有机溶剂中进行。有机溶剂可以是例如苯、甲苯或其任意化合物。反应可在80～90℃进行，回流2～5小时。通常，式B化合物与酰卤的摩尔比为1：6～10，如1：7～9。
反应结束后，可将反应液减压浓缩至干燥，向干燥的产品中加入乙腈和水溶解，进行水解反应。通常，乙腈和水的体积比为1：3～3：1。水解反应的时间可根据具体制备情况确定，例如可在10分钟到1小时左右。
水解结束后，还包括纯化。纯化包括减压浓缩，萃取，干燥以及柱层析等步骤。在某些实施方案中，用乙酸乙酯和水溶解萃取减压浓缩获得的产品，获得有机相，然后干燥，并进行柱层析分离。
因此，在某些实施方案中，式C化合物的制备包括：
(a)在有机溶剂的存在下，使式B化合物与酰卤R1-C(O)-X的混合物在80～90℃回流2～5小时；其中，式B化合物与酰卤的摩尔比为1：6～10；
(b)浓缩干燥步骤(a)的产物，加入体积比为1：3～3：1的乙腈和水，进行水解反应；和
(c)纯化步骤(b)所得产物。
在某些实施方案中，通过将下式A所示的化合物选择性脱苯环上一个烷基保护后再水解而得到式B化合物：
Figure GDA0002463472880000111
式A中，R2和X的定义与式1的定义相同。
在某些实施方案中，使式A化合物与BBr3反应，从而选择性脱除一个苯环上的R2。通常，式A化合物与BBr3的摩尔比为1：1～3，如1：1～2。上述脱烷基保护的反应可在有机溶剂中进行。合适的有机溶剂为二氯甲烷、二氯乙烷或其任意化合物。
通常，脱烷基保护的反应可在20±5℃下进行，搅拌至化合物A不再转化为止。可通过HPLC监控反应。通常，若原料<7％，则停止反应；否则继续反应，每50-60分钟取样HPLC分析直至原料<7％。
反应结束后，将反应液减压浓缩至干燥，向干燥的产品中加入乙腈和水溶解，进行水解反应。乙腈和水的体积比可为1：3～3：1。水解结束后，还包括纯化步骤。纯化包括减压浓缩，萃取，干燥以及柱层析等步骤。在某些实施方案中，用乙酸乙酯和水溶解萃取减压浓缩获得的产品，获得有机相。
因此，式B化合物的制备可包括：
(A)在有机溶剂存在下，在20±5℃搅拌式A化合物与BBr3，其中，式A化合物与BBr3的摩尔比为1：1～3；
(B)浓缩干燥步骤(A)的产物，加入体积比为1：3～3：1的乙腈和水，进行水解反应；和
(C)纯化步骤(B)所得产物。
因此，在某些实施方案中，本发明制备4-烷氧基-4'-酰氧基三苯甲基卤的方法以4,4'-双烷氧基三苯甲基卤为原料，依次经历“选择性脱烷基保护”、“水解”、“酰基保护”、“水解”、“卤化”后得到，其合成路线如下所示：
Figure GDA0002463472880000121
其中：X是氯，溴，碘或氟，R1和R2的含义与前文所述相同。
具体地，本发明的方法可包括如下步骤：
(1)以4,4'-双烷氧基三苯甲基卤A为原料，选择性脱苯环上一个烷基保护后再水解得到B；
(2)将步骤(1)脱保护产物B与酰卤反应对苯环上的羟基进行酰基保护，再水解得到C；
(3)将步骤(2)中酰基保护后水解产物C与酰卤反应，进行卤化得到产物D。
本发明设计并制备的4-烷氧基-4'-酰氧基三苯甲基卤可用于寡核苷酸合成中的核苷5'-羟基保护，从而丰富核苷5'-羟基保护基的选择。
因此，本发明还提供一种制备受本发明式1化合物保护的核苷的方法，所述方法包括使本发明式1化合物与待保护的核苷在有机溶剂中反应的步骤。核苷可以是本领域常规使用的各种核苷，包括核糖核苷和脱氧核糖核苷，如腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷，以及脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧胸腺苷。反应可在本领域常规的核苷进行保护的反应条件下进行。例如，有机溶剂可以是常规的有机溶剂，如吡啶；反应可在室温下进行；反应时间可根据反应物的种类和量进行适当调整，可在例如6～30小时的范围内。反应结束后，可加入例如甲醇淬灭反应，然后采用常规的方法纯化受保护的核苷。
与传统的4,4'-双甲氧基三苯甲基核苷保护基相比，在酸性条件下，本发明式1化合物更易脱保护。
下面结合具体实施例，进一步详细地描述本发明。应理解为，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围；本领域的普通技术员可以理解为，在本发明的基础上，无需任何创造性劳动，即可对本发明进行适当的改进或改变，因而所有这些改进或改变仍在本发明的保护范围内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
本发明下述实施例中的HPLC(高效液相色谱)条件：
柱：Luna C18，4.6*150mm；
流速：1.0ml/min，柱温：25℃；
检测波长：260nm；
流动相：梯度条件：
时间 A液 B液
0 65 35
3 65 35
15 5 95
20 5 95
25 65 35
30 65 35
A液：TEAA缓冲液(0.1摩尔/升的乙酸水溶液用三乙胺调至PH＝7.0)。
B液：色谱级乙腈。
分析过程中A液，B液在线脱气，氦气流速50ml/min。
实施例1：4-甲氧基-4'-乙酰氧基三苯甲基氯(D-1)的合成
Figure GDA0002463472880000141
合成化合物B-1：在干燥的三颈瓶中称取100g的4,4'-双甲氧基三苯甲基氯A-1(295.8mmol)，加入400ml的DCM溶解后，用氩气鼓泡赶掉体系中的空气。用冰水浴将反应液温度降至0℃后，向上体系中逐渐滴加444ml的1M的BBr3(443.7mmol)二氯甲烷溶液，滴加时间约60min。滴加完毕于20±5℃下搅拌反应约12小时至原料不在转化。HPLC监控反应，若原料<7％则停止反应；否则继续反应，每50-60分钟取样HPLC分析直至原料<7％。反应完毕后将反应液在37℃下减压浓缩至干。向干样中加入500ml乙腈和500ml水溶解搅拌30min。将反应液在40℃下减压浓缩至干，加入500ml的乙酸乙酯和500ml的水溶解萃取。随后静置分层，分出有机相，水相用乙酸乙酯再次萃取两次(200ml*2)。合并有机相，用40g无水硫酸钠干燥后浓缩至干得到粗品B-1约100g。该粗品不经纯化直接用于下一步反应。
合成化合物C-1：在干燥的三口中，将上一步约100g粗品化合物B(295.8mmol)用500ml的甲苯溶解后，用氩气鼓泡赶掉体系中的空气。向上体系中加入170ml的乙酰氯(2.4mol)。加料完毕，将反应加热至80～90℃回流约3小时。TLC和HPLC检测反应，TLC：展开剂正庚烷：乙酸乙酯＝6:1爬板；HPLC可监测反应产物的生成。反应完毕，将反应液在40℃下减压浓缩至干。向干样中加入500ml乙腈和500ml水溶解搅拌30min。将反应液在40℃下减压浓缩至干，加入500ml的乙酸乙酯和500ml的水溶解萃取。有机相用40g无水硫酸钠干燥浓缩至干。快速硅胶柱层析得产品C-1 55.5g，两步总分离收率53.9％(mol)，55.5％(w)，纯度99.35％。
合成化合物D-1：在干燥的三颈瓶中称取55.5g的化合物C-1(0.136mol)，加入450ml的甲苯溶解后，用氩气鼓泡赶掉体系中的空气。向上体系中加入80.5ml的乙酰氯(1.116mol)。加料完毕，将反应加热至80～90℃回流3小时反应完毕。反应结束后，将反应液在40℃下减压浓缩至干，得到白色固体粗品。加入50ml的甲苯溶解后再加入350ml正庚烷，在0℃下搅拌结晶。将析出的固体在氩气氛围下抽滤。滤饼用正庚烷/甲苯(7/1，v/v)洗涤两次(120ml*2)后，真空干燥得到43g产品D-1，HPLC纯度99.42％，收率：73.6％(mol)，77.5％(w)。质谱:MS(ESI)m/z 367.3(M+H+,100)。
实施例2：4-苄氧基-4'-苯甲酰氧基三苯甲基氯(D-2)的合成
Figure GDA0002463472880000151
合成化合物B-2：在干燥的三颈瓶中称取145g的4,4'-双苄氧基三苯甲基氯A-2(295.8mmol)，加入400ml的DCM溶解后，用氩气鼓泡赶掉体系中的空气。用冰水浴将反应液温度降至0℃后，向上体系中逐渐滴加444ml的1M的BBr3(443.7mmol)二氯甲烷溶液，滴加时间约60min。滴加完毕于20±5℃下搅拌反应约12小时至原料不在转化。HPLC监控反应，若原料<7％则停止反应；否则继续反应，每50-60分钟取样HPLC分析直至原料<7％。反应完毕后将反应液在37℃下减压浓缩至干。向干样中加入500ml乙腈和500ml水溶解搅拌30min。将反应液在40℃下减压浓缩至干，加入500ml的乙酸乙酯和500ml的水溶解萃取。随后静置分层，分出有机相，水相用乙酸乙酯再次萃取两次(200ml*2)。合并有机相，用40g无水硫酸钠干燥后浓缩至干得到粗品B-2约140g。该粗品不经纯化直接用于下一步反应。
合成化合物C-2：在干燥的三口中，将上一步约140g粗品化合物B-2(295.8mmol)用500ml的甲苯溶解后，用氩气鼓泡赶掉体系中的空气。向上体系中加入277ml的苯甲酰氯(2.4mol)。加料完毕，将反应加热回流约3小时。TLC和HPLC检测反应，TLC：展开剂正庚烷：乙酸乙酯＝6:1爬板；HPLC可监测反应产物的生成。反应完毕，将反应液在40℃下减压浓缩至干。向干样中加入500ml乙腈和500ml水溶解搅拌30min。将反应液在40℃下减压浓缩至干，加入500ml的乙酸乙酯和500ml的水溶解萃取。有机相用40g无水硫酸钠干燥浓缩至干。快速硅胶柱层析得产品C-2 71.9g，两步总分离收率50.1％(mol)，51.4％(w)，纯度99.12％。
合成化合物D-2：在干燥的三颈瓶中称取71.9g的化合物C-2(0.148mol)，加入450ml的甲苯溶解后，用氩气鼓泡赶掉体系中的空气。向上体系中加入80.5ml的乙酰氯(1.116mol)。加料完毕，将反应加热至80～90℃回流3小时反应完毕。反应结束后，将反应液在40℃下减压浓缩至干，得到白色固体粗品。加入80ml的甲苯溶解后再加入350ml正庚烷，在0℃下搅拌结晶。将析出的固体在氩气氛围下抽滤。滤饼用正庚烷/甲苯(7/1，v/v)洗涤两次(120ml*2)后，真空干燥得到51.0g产品D-2，HPLC纯度99.01％，收率：68.6％(mol)，70.9％(w)。质谱:MS(ESI)m/z 505.5(M+H+,100)
实施例3：4-甲氧基-4'-苯甲酰氧基三苯甲基氯(D-3)的合成
Figure GDA0002463472880000171
合成化合物B-3：在干燥的三颈瓶中称取100g的4,4'-双甲氧基三苯甲基氯A-1(295.8mmol)，加入400ml的DCM溶解后，用氩气鼓泡赶掉体系中的空气。用冰水浴将反应液温度降至0℃后，向上体系中逐渐滴加444ml的1M的BBr3(443.7mmol)二氯甲烷溶液，滴加时间约60min。滴加完毕于20±5℃下搅拌反应约12小时至原料不在转化。HPLC监控反应，若原料<7％则停止反应；否则继续反应，每50-60分钟取样HPLC分析直至原料<7％。反应完毕后将反应液在37℃下减压浓缩至干。向干样中加入500ml乙腈和500ml水溶解搅拌30min。将反应液在40℃下减压浓缩至干，加入500ml的乙酸乙酯和500ml的水溶解萃取。随后静置分层，分出有机相，水相用乙酸乙酯再次萃取两次(200ml*2)。合并有机相，用40g无水硫酸钠干燥后浓缩至干得到粗品B-3约120g。该粗品不经纯化直接用于下一步反应。
合成化合物C-3：在干燥的三口中，将上一步约120g粗品化合物B-3(295.8mmol)用500ml的甲苯溶解后，用氩气鼓泡赶掉体系中的空气。向上体系中加入277ml的苯甲酰氯(2.4mol)。加料完毕，将反应加热回流约3小时。TLC和HPLC检测反应，TLC：展开剂正庚烷：乙酸乙酯＝6:1爬板；HPLC可监测反应产物的生成。反应完毕，将反应液在40℃下减压浓缩至干。向干样中加入500ml乙腈和500ml水溶解搅拌30min。将反应液在40℃下减压浓缩至干，加入500ml的乙酸乙酯和500ml的水溶解萃取。有机相用40g无水硫酸钠干燥浓缩至干。快速硅胶柱层析得66.7g的产品C-3，两步总分离收率55％(mol)，66.7％(w)，纯度99.34％。
合成化合物D-3：在干燥的三颈瓶中称取66.7g的化合物C-3(0.163mol)，加入450ml的甲苯溶解后，用氩气鼓泡赶掉体系中的空气。向上体系中加入151.4ml的苯甲酰氯(1.304mol)。加料完毕，将反应加热至80～90℃回流3小时反应完毕。反应结束后，将反应液在40℃下减压浓缩至干，得到白色固体粗品。加入100ml的甲苯溶解后再加入350ml正庚烷，在0℃下搅拌结晶。将析出的固体在氩气氛围下抽滤。滤饼用正庚烷/甲苯(7/1，v/v)洗涤两次(120ml*2)后，真空干燥得到45.0g产品D-3，HPLC纯度99.11％，收率：65.0％(mol)，67.5％(w)。质谱:MS(ESI)m/z 429.5(M+H+,100)
实施例4：4-苄氧基-4'-乙酰氧基三苯甲基氯(D-4)的合成
Figure GDA0002463472880000181
合成化合物B-2：在干燥的三颈瓶中称取145g的4,4'-双苄氧基三苯甲基氯A-2(295.8mmol)，加入400ml的DCM溶解后，用氩气鼓泡赶掉体系中的空气。用冰水浴将反应液温度降至0℃后，向上体系中逐渐滴加444ml的1M的BBr3(443.7mmol)二氯甲烷溶液，滴加时间约60min。滴加完毕于20±5℃下搅拌反应约12小时至原料不在转化。HPLC监控反应，若原料<7％则停止反应；否则继续反应，每50-60分钟取样HPLC分析直至原料<7％。反应完毕后将反应液在37℃下减压浓缩至干。向干样中加入500ml乙腈和500ml水溶解搅拌30min。将反应液在40℃下减压浓缩至干，加入500ml的乙酸乙酯和500ml的水溶解萃取。随后静置分层，分出有机相，水相用乙酸乙酯再次萃取两次(200ml*2)。合并有机相，用40g无水硫酸钠干燥后浓缩至干得到粗品B-2约140g。该粗品不经纯化直接用于下一步反应。
合成化合物C-4：在干燥的三口中，将上一步约140g粗品化合物B-2(295.8mmol)用500ml的甲苯溶解后，用氩气鼓泡赶掉体系中的空气。向上体系中加入208ml的乙酰氯(2.4mol)。加料完毕，将反应加热回流约3小时。TLC和HPLC检测反应，TLC：展开剂正庚烷：乙酸乙酯＝6:1爬板；HPLC可监测反应产物的生成。反应完毕，将反应液在40℃下减压浓缩至干。向干样中加入500ml乙腈和500ml水溶解搅拌30min。将反应液在40℃下减压浓缩至干，加入500ml的乙酸乙酯和500ml的水溶解萃取。有机相用40g无水硫酸钠干燥浓缩至干。快速硅胶柱层析得产品C-4 61.5g，两步总分离收率49.1％(mol)，42.4％(w)，纯度98.99％。
合成化合物D-4：在干燥的三颈瓶中称取61.5g的化合物C-4(0.139mol)，加入450ml的甲苯溶解后，用氩气鼓泡赶掉体系中的空气。向上体系中加入80.5ml的乙酰氯(1.116mol)。加料完毕，将反应加热至80～90℃回流3小时反应完毕。反应结束后，将反应液在40℃下减压浓缩至干，得到白色固体粗品。加入50ml的甲苯溶解后再加入350ml正庚烷，在0℃下搅拌结晶。将析出的固体在氩气氛围下抽滤。滤饼用正庚烷/甲苯(7/1，v/v)洗涤两次(120ml*2)后，真空干燥得到44.2g产品D-4，HPLC纯度99.00％，收率：72.1％(mol)，71.9％(w)。质谱:MS(ESI)m/z 443.3(M+H+,100)。
实施例5：4-甲氧基-4'-乙酰氧基三苯甲基保护胞苷的合成
Figure GDA0002463472880000191
在200ml的三口瓶中称取20g 2’-脱氧胞苷(87.7mmol)和33.7g化合物D-1(92.1mmol)用180ml干燥的吡啶搅拌溶解。反应室温搅拌12h后，TLC(CH2Cl2:MeOH＝95:5,v/v)以及HPLC监控反应至原料基本消失(转化率93％)，停止反应。向体系中加入6ml甲醇淬灭，浓缩除去所有溶剂得淡黄色固体粗品。粗品用600ml二氯甲烷稀释，600ml水洗，分出有机相用10g无水硫酸钠干燥后得粗品76g。快速硅胶柱层析得产品41.1g，分离收率80％(mol)，122％(w)，纯度99.0％。质谱:MS(ESI)m/z 559.4(M+H+,100)。
实施例6：4-苄氧基-4'-乙酰氧基三苯甲基保护尿苷的合成
Figure GDA0002463472880000201
在200ml的三口瓶中称取20g 2’-脱氧尿苷(87.7mmol)和41g化合物D-4(92.1mmol)用180ml干燥的吡啶搅拌溶解。反应室温搅拌12h后，TLC(CH2Cl2:MeOH＝95:5,v/v)以及HPLC监控反应至原料基本消失(转化率90％)，停止反应。向体系中加入6ml甲醇淬灭，浓缩除去所有溶剂得淡黄色固体粗品。粗品用600ml二氯甲烷稀释，600ml水洗，分出有机相用10g无水硫酸钠干燥后得粗品76g。快速硅胶柱层析得产品47.1g，分离收率76％(mol)，115％(w)，纯度98.8％。质谱:MS(ESI)m/z 635.4(M+H+,100)。
实施例7：4-甲氧基-4'-乙酰氧基三苯甲基保护基的离去优越性考察
分别以5’-(4-甲氧基-4'-乙酰氧基三苯甲基)-脱氧胞苷和5’-(4,4'-双甲氧基三苯甲基)-脱氧胞苷为底物，考察其分别在六氟异丙醇(HFIP)中脱保护的速率，发现在相同条件下4-甲氧基-4'-乙酰氧基三苯甲基的脱保护速率明显优于4,4'-双甲氧基三苯甲基。具体实验如下：
(a)在100ml的三口瓶中称取5克5’-(4,4'-双甲氧基三苯甲基)-脱氧胞苷用50ml的六氟异丙醇(HFIP)在室温(25℃)下搅拌溶解。
Figure GDA0002463472880000202
HPLC监控转化率。反应1h后发现反应的HPLC转化率50％，2小时后的转化率为70％，3小时后的转化率为91％，反应基本结束。结果如下表1所示。
表1
Figure GDA0002463472880000211
(b)在100ml的三口瓶中称取5克5’-(4-甲氧基-4'-乙酰氧基三苯甲基)-脱氧胞苷用50ml的六氟异丙醇(HFIP)在室温(25℃)下搅拌溶解。
Figure GDA0002463472880000212
HPLC监控转化率。反应1h后发现反应的HPLC转化率为73％，2小时后的转化率为93％，反应基本结束。结果如下表2所示。
表2
Figure GDA0002463472880000213
实施例8：5'-(4-苄氧基-4'-乙酰氧基三苯甲基)-脱氧尿苷的脱保护
Figure GDA0002463472880000221
在100ml的三口瓶中称取5g由实例5制备得到的E-2:5'-(4-苄氧基-4'-乙酰氧基三苯甲基)-脱氧尿苷，用50ml的六氟异丙醇(HFIP)在室温(25℃)下搅拌溶解。
HPLC监控转化率。反应1h后发现反应的HPLC转化率为65％，2小时后的转化率为96％，反应基本结束。

Claims (27)

1.一种制备受式1所示结构的化合物保护的核苷的方法，其特征在于，所述方法包括使式1所示结构的化合物与待保护的核苷在有机溶剂中进行反应的步骤；
Figure FDA0002637337900000011
其中，
R1选自C1-C4烷基；
R2选自C1-C4烷基或苄基；
X是卤素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，R1选自甲基或乙基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，R2选自甲基、乙基或苄基。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，X为氯。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述式1所示结构的化合物选自以下化合物D-1和D-4：
Figure FDA0002637337900000021
6.一种受式1所示结构的化合物保护的核苷，或采用权利要求1-5任一项所述方法制备得到的核苷；
Figure FDA0002637337900000022
其中，
R1选自C1-C4烷基；
R2选自C1-C4烷基或苄基；
X是卤素。
7.如权利要求6所述的核苷，其特征在于，R1选自甲基或乙基。
8.如权利要求6所述的核苷，其特征在于，R2选自甲基、乙基或苄基。
9.如权利要求6所述的核苷，其特征在于，X为氯。
10.如权利要求6所述的核苷，其特征在于，所述式1所示结构的化合物选自以下化合物D-1和D-4：
Figure FDA0002637337900000031
11.如权利要求6-10任一项所述的核苷，其特征在于，式1化合物通过将式C化合物与酰卤反应，进行卤化而制备得到：
Figure FDA0002637337900000032
式C中，R1和R2的定义与式1中的定义相同；
所述酰卤具有以下结构：R-C(O)-X，式中，X为卤素；
式C化合物与酰卤的摩尔比为1：6～10；
卤化反应包括在80～90℃回流2～5小时；和/或
卤化反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为甲苯或苯。
12.如权利要求11所述的核苷，其特征在于，所述酰卤选自酰氟、酰氯、酰溴或酰碘。
13.如权利要求11所述的核苷，其特征在于，所述酰卤选自乙酰氯、乙酰溴、乙酰碘、乙酰氟或苯甲酰氯。
14.如权利要求11所述的核苷，其特征在于，式C化合物与酰卤的摩尔比为1：7～9。
15.如权利要求11所述的核苷，其特征在于，所述式C化合物由下式B化合物与酰卤进行反应，并进行水解而制备得到：
Figure FDA0002637337900000041
式B中，R2的定义与式1的定义相同；
所述酰卤具有以下结构：R1-C(O)-X，其中，X为卤素，R1的定义与式1的定义相同；
式B化合物与酰卤的摩尔比为1：6～10；
反应包括在80～90℃回流2～5小时；
与酰卤的反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为甲苯或苯；和/或
与酰卤的反应结束后，将反应液减压浓缩至干燥，向干燥的产品中加入乙腈和水溶解，进行水解反应。
16.如权利要求15所述的核苷，其特征在于，所述酰卤选自甲酰氟、乙酰氯或苯甲酰氯。
17.如权利要求15所述的核苷，其特征在于，式B化合物与酰卤的摩尔比为1：7～9。
18.如权利要求15所述的核苷，其特征在于，乙腈和水的体积比为1：3～3：1。
19.如权利要求15所述的核苷，其特征在于，通过将下式A所示的化合物选择性脱苯环上一个烷基保护后再水解而得到所述式B化合物：
Figure FDA0002637337900000051
式A中，R2和X的定义与式1的定义相同；
在20±5℃下搅拌式A化合物与BBr3的混合物，从而选择性脱除一个苯环上的R2；
反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为二氯甲烷或二氯乙烷；和/或
反应结束后，将反应液减压浓缩至干燥，向干燥的产品中加入乙腈和水溶解，进行水解反应。
20.如权利要求19所述的核苷，其特征在于，式A化合物与BBr3的摩尔比为1：1～3。
21.如权利要求19所述的核苷，其特征在于，式A化合物与BBr3的摩尔比为1：1～2。
22.如权利要求19所述的核苷，其特征在于，乙腈和水的体积比为1：3～3：1。
23.式1所示结构的化合物在制备受保护的核苷中的用途；
Figure FDA0002637337900000061
其中，
R1选自C1-C4烷基；
R2选自C1-C4烷基或苄基；
X是卤素。
24.如权利要求23所述的用途，其特征在于，R1选自甲基或乙基。
25.如权利要求23所述的用途，其特征在于，R2选自甲基、乙基或苄基。
26.如权利要求23所述的用途，其特征在于，X为氯。
27.如权利要求23所述的用途，其特征在于，所述式1所示结构的化合物选自以下化合物D-1和D-4：
Figure FDA0002637337900000062
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