WO2020010560A1 - 一种亚磷酰胺类化合物、其制备方法及应用 - Google Patents

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WO2020010560A1 PCT/CN2018/095362 CN2018095362W WO2020010560A1 WO 2020010560 A1 WO2020010560 A1 WO 2020010560A1 CN 2018095362 W CN2018095362 W CN 2018095362W WO 2020010560 A1 WO2020010560 A1 WO 2020010560A1
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刘二凯
陈奥
章文蔚
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Abstract

本发明公开了一种亚磷酰胺类化合物、其制备方法及应用。本发明提供了一种如式1所示的亚磷酰胺类化合物，其中，R为（I）或（II）；X为氢或（III）。使用该化合物的DNA固相合成方法的脱保护条件温和，不会损伤DNA，提高DNA合成的质量。

Description

一种亚磷酰胺类化合物、其制备方法及应用 技术领域
本发明提供了一种亚磷酰胺类化合物、其制备方法及应用。
背景技术
DNA固相合成技术所使用的单体从20世纪80年代以来结构改变较小，其结构以胸腺嘧啶为例，在合成DNA过程中其3端的亚磷酰胺被固相DNA的5端羟基进攻，失去二异丙基胺，T单体连接到DNA上，之后的脱保护过程中，5端的二甲氧基三苯甲基(DMT)在三氯乙酸的作用下离去，形成5端的羟基，这一过程在过去30多年的发展中，未有较大的变化，其中DMT保护基团被改变成2-(2-硝基苯)丙基碳酸酯(2-(2-nitrophenyl)propoxycarbonyl；NPPOC)或类似物(JOC.1995,60,6270-6),其脱保护方式也改变成了使用365nm波长激光进行光照，切断保护基团。在之后的基于芯片的DNA高通量合成技术所使用的合成原料和普通DNA固相合成一样，仅仅是三氯乙酸换成了通过电解的方式产生酸性氢离子，使DMT基团脱保护，本质上没有变化。
Figure PCTCN2018095362-appb-000001
现有技术中所使用的两种DNA合成单体如上，其在DNA合成中的使用方法为领域中的人员所非常熟知，首先在接有合成linker的可控多孔玻璃(controlled pore glass；CPG)上已经接入了第一个碱基(或其他非碱基类含有DMT保护的羟基类物质)，在三氯乙酸溶液作用下DMT基团离去，形成 了羟基基团，之后加入一种亚磷酰胺单体溶液，在四唑的作用下，羟基进攻亚磷酰胺单体的磷原子，二异丙基胺离去，羟基与磷原子成键，之后未反应的羟基在乙酸酐的作用下形成乙酸酯，被封闭上而不能继续反应。加入了一个单体的DNA链则在碘单质的氧化下，形成五价磷，之后DNA可进行下一个循环的脱保护或者在氨水的作用下从CPG上被切除下去。使用NPPOC保护的DNA单体，则在脱保护过程中不使用化学试剂，使用365nm波长激光照射30秒，其他均与上述过程相同。
在最近的研究进展中Caruthers课题组使用苯基碳酸酯进行保护，而脱保护的方法使用氢氧化锂和双氧水的氧化体系，由于其使用碱性氧化条件，每一步的反应效率仅为99％，且氧化条件有氧化G碱基的副反应(J.Am.Chem.Soc.,2003,125,pp 13427-13441)。
不管是使用三氯乙酸，氢氧化锂加双氧水还是使用365nm的激光，不可避免存在对碱基的伤害，其中三氯乙酸的较强酸性条件可使DNA发生脱嘌呤的现象，导致AG碱基的碱基离去，而在后续氨解过程中DNA链断裂，双氧水的氧化同样能导致G碱基被氧化，而失去碱基，在后续氨解中导致DNA断裂，激光这会使碱基直接发生2+2反应，使两个T碱基或者2个C碱基直接成键，而使合成的DNA无使用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有的DNA固相合成方法的脱保护步骤中经常会损伤DNA，故而，本发明提供了一种亚磷酰胺类化合物、其制备方法及应用，使用该化合物的DNA固相合成方法的脱保护条件温和，不会损伤DNA，提高DNA合成的质量。
本发明提供了一种如式1所示的亚磷酰胺类化合物；
Figure PCTCN2018095362-appb-000002
其中，R为
Figure PCTCN2018095362-appb-000003
X为氢或
Figure PCTCN2018095362-appb-000004
(例如三甲基硅基氧基、三乙基硅基氧基、三异丙基硅基氧基、二甲基异丙基硅基氧基、二乙基异丙基硅基氧基、或、叔丁基二甲基硅基氧基，又例如三甲基硅基氧基)，R 1、R 2和R 3独立地为C 1～C 4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基)；
当X为氢时，B为
Figure PCTCN2018095362-appb-000005
Figure PCTCN2018095362-appb-000006
当X为
Figure PCTCN2018095362-appb-000007
时，B为
Figure PCTCN2018095362-appb-000008
Figure PCTCN2018095362-appb-000009
在某一方案中，亚磷酰胺类化合物1中的某些定义如下所述(未定义的基团如前任一方案所述)：
R为
Figure PCTCN2018095362-appb-000010
在某一方案中，亚磷酰胺类化合物1中的某些定义如下所述(未定义的基团如前任一方案所述)：
X为氢。
在某一方案中，亚磷酰胺类化合物1中的某些定义如下所述(未定义的基团如前任一方案所述)：
X为
Figure PCTCN2018095362-appb-000011
在某一方案中，亚磷酰胺类化合物1中的某些定义如下所述(未定义的基团如前任一方案所述)：
R为
Figure PCTCN2018095362-appb-000012
X为氢。
在某一方案中，亚磷酰胺类化合物1中的某些定义如下所述(未定义的基团如前任一方案所述)：
R为
Figure PCTCN2018095362-appb-000013
X为
Figure PCTCN2018095362-appb-000014
在某一方案中，亚磷酰胺类化合物1中的某些定义如下所述(未定义的基团如前任一方案所述)：
R为
Figure PCTCN2018095362-appb-000015
X为三甲基硅基氧基。
在某一方案中，所述的亚磷酰胺类化合物1为下述任一结构：
Figure PCTCN2018095362-appb-000016
Figure PCTCN2018095362-appb-000017
Figure PCTCN2018095362-appb-000018
其中，TMS为三甲基硅基。
本发明还提供了一种亚磷酰胺类化合物1的制备方法，其包括下述步骤：在溶剂中，在四氮唑的存在下，将化合物3与化合物2进行缩合反应，得到化合物1即可。
Figure PCTCN2018095362-appb-000019
其中，R、X和B的定义均如上所述。
在所述的缩合反应中，所述的溶剂可为本领域该类反应常规的溶剂，例如卤代烃类溶剂，又例如二氯甲烷。
在所述的缩合反应中，所述的溶剂的用量可为本领域该类反应常规的用量，例如所述的溶剂与所述的化合物2的体积摩尔比为5L/mol～15L/mol，又例如所述的溶剂与所述的化合物2的体积摩尔比为10L/mol～15L/mol。
在所述的缩合反应中，所述的四氮唑与所述的化合物2的摩尔比值可为本领域该类反应常规的摩尔比值，例如1～5，又例如2～3。
在所述的缩合反应中，所述的化合物3与所述的化合物2的摩尔比值可为本领域该类反应常规的摩尔比值，例如1.00～1.10，又例如1.05～1.10。
所述的缩合反应的反应温度可为本领域该类反应常规的反应温度，例如20℃～30℃。
所述的缩合反应至所述的化合物2不再反应为止。所述的缩合反应的反应时间例如3h。
所述的亚磷酰胺类化合物1的制备方法，还可进一步包括下述步骤：在溶剂中，将化合物5与化合物4进行取代反应，得到所述的化合物2即可。
Figure PCTCN2018095362-appb-000020
其中，LG 1为离去基团。
在所述的取代反应中，所述的溶剂可为本领域该类反应常规的溶剂，例如吡啶。
在所述的取代反应中，所述的溶剂的用量可为本领域该类反应常规的用量，例如所述的溶剂与所述的化合物5的体积摩尔比为5L/mol～15L/mol，又例如所述的溶剂与所述的化合物5的体积摩尔比为10L/mol～15L/mol。
在所述的取代反应中，所述的LG 1里，所述的离去基团可为本领域常规的离去基团，例如卤素，又例如氯。
在所述的取代反应中，所述的化合物4与所述的化合物5的摩尔比值可为本领域该类反应常规的摩尔比值，例如1.00～1.10，又例如1.04～1.10。
所述的取代反应的反应温度可为本领域该类反应常规的反应温度，例如20℃～30℃。
所述的取代反应至所述的化合物5不再反应为止。所述的取代反应的反 应时间例如10h。
所述的亚磷酰胺类化合物1的制备方法，还可进一步包括下述步骤：在溶剂中，将化合物7与化合物6进行酯化反应，得到所述的化合物4即可。
Figure PCTCN2018095362-appb-000021
其中，LG 2为离去基团。
在所述的酯化反应中，所述的溶剂可为本领域该类反应常规的溶剂，例如醚类溶剂和/或芳烃类溶剂。所述的醚类溶剂本领域常规的醚类溶剂，例如1,4-二氧六环。所述的芳烃类溶剂本领域常规的芳烃类溶剂，例如甲苯。当所述的溶剂为醚类溶剂和芳烃类溶剂时，所述的醚类溶剂与所述的芳烃类溶剂的体积比值可为0.6～1.0。
在所述的酯化反应中，所述的溶剂的用量可为本领域该类反应常规的用量，例如所述的溶剂与所述的化合物6的体积摩尔比为1.0L/mol～2.0L/mol，又例如所述的溶剂与所述的化合物6的体积摩尔比为1.6L/mol～2.0L/mol。
在所述的酯化反应中，所述的LG 2里，所述的离去基团可为本领域常规的离去基团，例如卤素，又例如氯。
在所述的酯化反应中，所述的化合物7与所述的化合物6的摩尔比值可为本领域该类反应常规的摩尔比值，例如1.0～4.0，又例如2.0～3.0。
所述的酯化反应的反应温度可为本领域该类反应常规的反应温度，例如(-25℃)～(-15℃)，又例如(-25℃)～(-20℃)。
所述的酯化反应至所述的化合物6不再反应为止。所述的酯化反应的反应时间例如20h。
本发明还提供了一种如式2所示的核糖类化合物；
Figure PCTCN2018095362-appb-000022
其中，R、X和B的定义均如上所述。
所述的核糖类化合物2可为如下任一结构：
Figure PCTCN2018095362-appb-000023
Figure PCTCN2018095362-appb-000024
其中，TMS为三甲基硅基。
本发明还提供了一种核糖类化合物2的制备方法，其包括下述步骤：在溶剂中，将化合物5与化合物4进行取代反应，得到化合物2即可。
Figure PCTCN2018095362-appb-000025
其中，R、X、B和LG 1的定义均如上所述。
所述的取代反应的反应条件参数和化合物4的制备方法可如上所述。
所述的酯化反应的反应条件参数可如上所述。
本发明还提供了一种如式4所示的酯类化合物；
Figure PCTCN2018095362-appb-000026
其中，R和LG 1的定义均如上所述。
所述的酯类化合物4可为
Figure PCTCN2018095362-appb-000027
又可为
Figure PCTCN2018095362-appb-000028
本发明还提供了一种酯类化合物4的制备方法，其包括下述步骤：在溶剂中，将化合物7与化合物6进行酯化反应，得到所述的化合物4即可。
Figure PCTCN2018095362-appb-000029
其中，R、LG 1和LG 2的定义均如上所述。
本发明还提供了一种上述的亚磷酰胺类化合物1在制备DNA中的应用。
在所述的应用中，所述的亚磷酰胺类化合物1可作为核苷酸单体。
本发明还提供了一种上述的亚磷酰胺类化合物1作为DNA合成单体的应用。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：使用该化合物的DNA固相合成方法的脱保护条件温和，不会损伤DNA，提高DNA合成的质量。
附图说明
图1为应用实施例1粗产物HPLC图。
图2为应用实施例2粗产物HPLC图。
具体实施方式
实施例1 核苷酸亚磷酰胺单体的合成
第一步：
Figure PCTCN2018095362-appb-000030
在溶有0.63g的(E)-Cyclooct-2-enol(2-羟基-反式环辛烯烃)的3ml的1，4-二氧六环中加入含有20％的光气的甲苯溶液(5.1ml,10mmol)，-20℃搅拌反应20小时，之后去除所有的挥发性溶剂和试剂，得到的粗产物在不做任何进一步纯化之后，立即用于下一步反应。
第二步：
Figure PCTCN2018095362-appb-000031
在干燥的吡啶溶液25ml中加入2.5mmol,605mg脱氧胸腺嘧啶核苷，溶解后冷却溶液在零度的冰水混合物中，加入上述制备的2.6mmol的反式环辛烯烃氯甲酸酯，移除冰水冷却装置，搅拌至所有固体溶解，并继续室温搅拌10个小时，之后加入水1ml停止反应，使用50ml×2的二氯甲烷萃取反应，使用5％碳酸氢钠溶液30ml洗二氯甲烷溶液，硫酸镁干燥，之后去除溶剂，在硅胶柱上使用三氯甲烷/甲苯(9：1)的流动相分离纯化产物得到，产率74％。TLC Rf(A，三氯甲烷/甲苯＝9：1)0.32。HRMS分子式C 19H 27N 2O 7(M+H)计算值395.1813，实测值395.1826。
第三步：
Figure PCTCN2018095362-appb-000032
在10ml二氯甲烷中加入干燥的上述产物1mmole(394mg)和1.05mmole2-氰基乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺，缓慢加入溶有3mmole的四氮唑的10ml二氯甲烷，用时30分钟。反应继续室温搅拌3小时，之后加入0.2ml三乙胺中和反应，去除溶剂，粗产物通过硅胶柱和含有0.1％三乙胺的甲苯/乙酸乙酯(4：1)分离纯化得到，产率76％。磷31核磁(CDCl 3)δ149.44。HRMS分子式C 28H 44N 4O 8P(M+H)计算值595.2891，实测值595.2841。
实施例2 核苷酸亚磷酰胺单体的合成
Figure PCTCN2018095362-appb-000033
使用与实施例1相同的反应条件(仅将2-羟基-反式环辛烯烃替换为2-羟基环丙烯)合成环丙稀碳酸酯保护的胸腺嘧啶核苷酸单体，产率61％。磷31核磁(CDCl 3)δ149.43。HRMS分子式C 23H 34N 4O 8P(M+H)计算值525.2109，实测值525.2117。
应用实施例1 DNA固相合成方法
使用实施例1合成的DNA固相合成单体在ABI 394DNA合成仪上合成20个循环的T20序列，使用200nmole的固相柱，使用实施例1合成的DNA固相合成单体取代合成仪上四种常规单体的接口，实施例1合成的DNA固相合成单体溶解在乙腈中，形成0.1M乙腈溶液，常规脱保护的溶液更换为含有0.1M的3,6-二-2-吡啶基-1,2,4,5-四嗪的N,N-二甲基-甲酰胺溶液，反应时间增加至3分钟，其他加帽和氧化反应条件均不变，在合成之后进行DNA切除和氨解整体脱保护反应，DNA在浓氢氧化铵2个小时室温作用下被从固相切除，收集后转移到密封的瓶子中，55度加热继续脱掉氰乙基基团，反应15个小时。反应之后了去除所有溶剂，得DNA粗产物。取少量粗产物进行HPLC分析(YMC，Hydrosphere C18色谱柱，5μm，120A，250*10.0mm)，流动相为0-20％乙腈/水+50mM乙酸三乙铵盐，UV检测，HPLC谱图如图1 所示。
图1中，在30分钟流程的全长T20峰的积分面积占比93.2％，计算得到每一步反应的效率为99.65％。
剩余DNA溶解在少量水溶液中，利用C18反相柱的高效液相色谱进行纯化，流动相为0-20％乙腈/水+50mM乙酸三乙铵盐(40分钟内匀速递增乙腈含量，由100％水到“80％水+20％乙腈”，流动相始终含有乙酸三乙胺盐)，40分钟。产物(T)20的峰收集冻干。(T)20计算分子量6078.81，MALDI检测冻干产物得，(M-H)-；6077.5,(M+H)+；6079.9。
应用实施例2 DNA固相合成方法
使用与应用实施例1相同的反应条件(仅将实施例1合成的DNA固相合成单体替换为实施例2合成的DNA固相合成单体)合成20个循环的T20序列。取少量粗产物进行HPLC分析(YMC，Hydrosphere C18色谱柱，5μm，120A，250*10.0mm)，流动相为0-20％乙腈/水+50mM乙酸三乙铵盐，UV检测，HPLC谱图如图2所示。
图2中，在30分钟流程的全长T20峰的积分面积占比80.7％，计算单步反应效率98.93％。
剩余DNA溶解在少量水溶液中，利用C18反相柱的高效液相色谱进行纯化，流动相为0-20％乙腈/水+50mM乙酸三乙铵盐(40分钟内匀速递增乙腈含量，由100％水到“80％水+20％乙腈”，流动相始终含有乙酸三乙胺盐)，40分钟。产物(T)20的峰收集冻干。(T)20计算分子量6078.81，MALDI检测冻干产物得，(M-H)-；6077.5,(M+H)+；6079.9。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此，本发明的保护范围由所附权利要求 书限定。

Claims (15)

  1. 一种如式1所示的亚磷酰胺类化合物；
    Figure PCTCN2018095362-appb-100001
    其中，R为
    Figure PCTCN2018095362-appb-100002
    X为氢或
    Figure PCTCN2018095362-appb-100003
    R 1、R 2和R 3独立地为C 1～C 4烷基；
    当X为氢时，B为
    Figure PCTCN2018095362-appb-100004
    Figure PCTCN2018095362-appb-100005
    当X为
    Figure PCTCN2018095362-appb-100006
    时，B为
    Figure PCTCN2018095362-appb-100007
    Figure PCTCN2018095362-appb-100008
  2. 如权利要求1所述的亚磷酰胺类化合物1，其特征在于，所述的R 1为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基；
    和/或，所述的R 2为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基；
    和/或，所述的R 3为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。
  3. 如权利要求1所述的亚磷酰胺类化合物1，其特征在于，所述的
    Figure PCTCN2018095362-appb-100009
    为三甲基硅基氧基、三乙基硅基氧基、三异丙基硅基氧基、二甲基异丙基硅基氧基、二乙基异丙基硅基氧基、或、叔丁基二甲基硅基氧基。
  4. 如权利要求1所述的亚磷酰胺类化合物1，其特征在于，R为
    Figure PCTCN2018095362-appb-100010
    和/或，X为氢。
  5. 如权利要求1所述的亚磷酰胺类化合物1，其特征在于，R为
    Figure PCTCN2018095362-appb-100011
    和/或，X为
    Figure PCTCN2018095362-appb-100012
  6. 如权利要求1所述的亚磷酰胺类化合物1，其特征在于，其为下述任一结构：
    Figure PCTCN2018095362-appb-100013
    Figure PCTCN2018095362-appb-100014
    Figure PCTCN2018095362-appb-100015
    其中，TMS为三甲基硅基。
  7. 一种亚磷酰胺类化合物1的制备方法，其包括下述步骤：在溶剂中，在四氮唑的存在下，将化合物3与化合物2进行缩合反应，得到化合物1即可；
    Figure PCTCN2018095362-appb-100016
    其中，R的定义如权利要求1～6中任一项所述，X的定义如权利要求1～6中任一项所述，B的定义如权利要求1～6中任一项所述。
  8. 一种如式2所示的核糖类化合物；
    Figure PCTCN2018095362-appb-100017
    其中，R的定义如权利要求1～6中任一项所述，X的定义如权利要求1～6中任一项所述，B的定义如权利要求1～6中任一项所述。
  9. 如权利要求8所述的核糖类化合物2，其特征在于，其为如下任一结构：
    Figure PCTCN2018095362-appb-100018
    Figure PCTCN2018095362-appb-100019
    其中，TMS为三甲基硅基。
  10. 一种核糖类化合物2的制备方法，其包括下述步骤：在溶剂中，将化合物5与化合物4进行取代反应，得到化合物2即可；
    Figure PCTCN2018095362-appb-100020
    其中，R的定义如权利要求1～6中任一项所述，X的定义如权利要求1～6中任一项所述，B的定义如权利要求1～6中任一项所述，LG 1为离去基团。
  11. 一种如式4所示的酯类化合物；
    Figure PCTCN2018095362-appb-100021
    其中，R的定义如权利要求1～6中任一项所述，LG 1为离去基团。
  12. 如权利要求11所述的酯类化合物，其特征在于，其为
    Figure PCTCN2018095362-appb-100022
    Figure PCTCN2018095362-appb-100023
  13. 一种酯类化合物4的制备方法，其包括下述步骤：在溶剂中，将化合物7与化合物6进行酯化反应，得到所述的化合物4即可；
    Figure PCTCN2018095362-appb-100024
    其中，R的定义如权利要求1～6中任一项所述，LG 1为离去基团，LG 2为离去基团。
  14. 一种如权利要求1～6中任一项所述的亚磷酰胺类化合物1在制备DNA中的应用。
  15. 一种如权利要求1～6中任一项所述的亚磷酰胺类化合物1作为DNA合成单体的应用。
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