PT99747A - Processo para a preparacao de nucleosidos ou oligonucleotidos modificados por 33'-(2')-amino ou tiol acoplados a corantes de fluorescencia - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de invenção de HOECHST ÃKÍIB^GESBLLBOHAFT, alemã, industrial e comercial com se de em D-62J0 Franfcfurt arn Main 80» República federal Alemã» (inventores; Prof. Dr. Joaehim Engela, Mathias Herrlein, Senate Konrad e uatthias Mag, residentes na República federal Alemã), para ^PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ITOOSEtfsiPOa, OLIGÕ^tlOLM-[glDQS» MODIFICADOS POR 2» WrrflQ OU H?IQL» ACOPLADOS A GORASSES DE FLU& SESOÊ^OIA*

DESORIOlO

Oligonucleátidos marcados encontraram aplicações extraordinariamente numerosas na tecnologia genética, pois a sua manipulação I aais fácil do que as amostras de ADU usadas tradicionalmente como amostras de hibridização, que são obtidas por meio de digestão de restrição de material gen£ tico natural.

Oligonucleátidos marcados, que são usados sob a forma de assim denominados oligonueleótidos de ADíí de "sentido inverso" ("antisense") podem intervir nas ocorrências celulares de maneira reguladora e, por isso, adqui rem cada vez maior importância, por exemplo, para as pesquisas "in vivo*1 da expressão de proteínas. De acordo com os conheci | mentos actuais o mecanismo desenvolve-se através de efeitos de m - 1 -

troca de ADU - ADIS* ADiS - &RM e àSM - AI$'j porém, isso ainda mão está esclarecido pormenorizadamente *

Os oligonucleotídos marcados, são usados "in vitro*, por exemplo, para a identificação de fragmentos de genes dentro de um banco de genes, sondando e identificando amostras de genes marcados com o auxílio de oligonucleoti-do marcado.

Para poder realizar esses ensaios *in vi-tro" ou "in vivo*, os oligonucleótidos tem de ser marcados, como Já foi mencionado* Juntamente com a marcação radioactiva por meio àe isotopos adequadas, são usados como forma de marcação não radioactiva corante de fluorescência, Já derlvatiza-dos, porque estes proporcionam a possibilidade de uma manipulação mais fáoil e menos perigosa*

Durante todo este tempo, uma tal técnica também Já foi usada com sucesso para o sequencia-iento de ADU não radioactiva* Reste caso realizaram-se preparações, que se baseiam essencialmente no processo de Sanger (P. Sanger, S. Ricklen e S* Coulson, Proo* Rabi, Acad* Sei* USA 74,5463 (1977)). 0 rótulo de fluorescência é adaptado ou na extremidade 5* do oligonucleótido (L*l. Hood, L. II. Smith e 0. Heiner, fature 521, 674 (1986)) ou na base do núcleo (J. £1. Prober, G. L. Irainor e R. J. Dam, Science 238, 336 (1987)) (G- I.· Trainor, Anal. Cbem. 62, 418 (1990)). Um inconveniente decisivo do processo citado em último lugar reside no facto de o rótulo de fluorescência ser introduzido durante a sintese, isto é, durante a polimerização e, neste caso, especialmente, durante a polimerização enzimática. Esta fase do processo tem como consequência, que somente se podem ainda usar para a síntese algumas polimerases, que a aceitação dos trifosfatos diminui devido às polimerases e que, alem disso, * é necessário um maior excesso de substrato* 2 —

A introdução do rótulo de fluorescência, não se limita ao sequenciamento de Sasger* O sequenoiamento químico de acordo com Maxam-Gilbert com rótulos de fluorescência também é conhecido (H* Yoss, 0* Gcliwager, U. 7/irkner, B. Sproat, J* Simmermann, A* Bosentbal, a* Erfle» d, Stegemann e W. Ansorge, Buel. Acids Ses* 1?, 251? (1989))·

Analogamente também se descreve já o ma-peamento de fragmestos.de restrição com detectores.de fluores cência (A.V. Garrano, J* Bamerdin, I». K. Ashwoetb, B* WatJcins, E* Branscomb, $* Slezak, iu Baff, P* J. de Jong, I). Keitb, L* McBride, S* Meister, M* Kronick, Genomies 4, 129 (1989) e S. Brenner e K. J. Livak, Proo, Bati* Acad* Sei* USA 86, 8902 (1989))* A. requerente descobriu agora que um cora» te. de fluorescência pode ser acoplado na posição 3*-(2#) (na posição alfa ou beta) de um nucleésido, nucleotidos ou oligo-nucleétido através de um grupo amino ou tiol e que este composto pode ser usado vantajosamente para a síntese de uma fita em presença de uma fita que serve como modelo (*template*) ou de oligonucleótldos bem como para a detecção de material genético *in vivo11 e *in vitro*. A invenção refere-sef portanto, as 1* Um processo para a preparação de um eomposto de fórmula ge ral (I) - 3 -

I n& qual representa ma base de purina ou de pirimidina ; pelo menos um do3 radicais R^ e R^ representa um corante de fluorescência ligado por intermédio de um grupo amino ou tiol, na posição alfa ou beta e o outro radical representa eventual-mente um átomo de hidrogénio, um grupo hidroxilo, ou um grupo hidroxilo ou metoxi protegidos» na posição alfa ou beta; n representa um número A D; R^ representa um grupo de protecção na posição 5* ou fosfato, pirofosfato» ou trifosfato; representa oxigénio, fluormetileno, difluoimetileno ou metileno; representa um grupo hidroxilo ou metoxi ou um átomo .de i e g hidrogénio na posição alfa ou beta, podendo r,B?eS , respectivamente» possuir significações iguais ou diferentes; T e Z representam oxigénio» enxofre, RH ou aetileno, podendo X e Y ser» respectivamente, iguais ou diferentes, caracterizado pelo facto de se derivatizar o grupo OH do núcleo sido, nucleétido ou oligonucleétido, que se encontra na posição 5' e/ou 2*, em um grupo amino ou tiol, e, em seguida» se acoplar um corante de flurescência· - 4 -

2* A utilização dos compostos caracterizados na alínea 1. na a) síntese de fitas inversas em presença de uma fita* que serve como modelo ("template *)5 O) síntese de oligonucleotídios definidos, c) sua detecção "In vivo1* e "in vitroM e d) detecção de ácidos nucleieos *in vivo*1 e *in vitro1*.

Em seguida* a invenção será descrito de maneira pormenorizada* especialmente* nas suas formas de realização preferidas* Além disso, a invenção ê determinado pelo teor das reivindicações.

Os compostos da fórmula geral I são sinte tizados substancialmente por processos conhecidos da literatura (M* Gait, Oligonucleotide Synthesis, JRL-Press * Oxford 1984).

Para o acoplamento do corante na posição 3* e/ou 2* parte-se de um composto da fórmula geral II, de preferência, de um nueleósido

3 -

Β% Η2, R^* R^, R^, R6, If ΐβ δ possuem as significações acima mencionadas* podendo os substitulntes ser iguais ou diferentes e R^ ou R® representam hidrogénio* um grupo hidroxi-la ou um grupo hiâroxiio ou netoxi protegido, é usado para o acoplamento» 0 acoplamento do corante realiza-se por intermédio do grupo hidroxilo que se encontra na posição 3* e/ou 2' por introdução de uma amina ou de tiol»

Para a introdução da azida* é inserido na posição 3*-(2*) um grupo de saída* Oomo grupo de saída emprega-se* de preferência, um grupo triílato ou mesilato ou tosila to* Por meio de um ataque nucleofílico com azida* de preferência * azida de litio* realiza-se a introdução da azida* 0 ataque nucleofílico de um tiolato ou de um tiolato com o átomo de 8 protegido fornece o tiol ou o tiol protegido. A estereoquímica do agrupamento de açúcar do nucleétido pretendida ê obtida da melhor maneira por substituições S^2* 0 grupo amino pode ser obtido facilmente através da azida e subsequente redução com obtenção amina (Idt.í W.S* Llungall e li. Xi* Iietsinger* <J, Org. Chem* Vol. 40* Bo. 11* 1659 (1975)* Sesta operação, prefere-se a reac-ção de Staidinger com trifenilfosfina e água (Lit.t M* May e J. W. Sngels* iTucl. Acids Res* 17* 15* 5973 (1989))·

Sodos os compostos foram ensaiados rela-tívamente â sua constituição e configuração por ressonância magnética nuclear* análise elementar, espectro de ultravioletas (DV)* espectro de infravermelhos (IR)* etc.

Depois de a policondensação terminar, o grupo 3* (2f)-amino ou tiol do agrupamento de açúcar na extremidade 3' do ADH pode reagir com um corante de fluorescência reactivo por processos conhecidos na literatura (Kunhapiller, Hucl. Acids * Res. 13» 2399» 19&5ϊ Hodges R.R et al· Bioche-mistry* Vol* 28, 261 (1989))*

Como alternativa» também pode obter-se o grupo amino por meio da reacção de Llitsunobu (Synthesis, Volume 1» 1981, página 1) e de acordo com a reacção descrita por Tamamoto et al* (J* Chem. Soc. Perlu Trans. I, 1, 306* 1980)* 0 acoplamentodo corante de fluorescência por intermédio do grupo tiol realiza-se de maneira análoga. Introduz-se» porém* em vez do grupo azida, um grupo tiol sob a forma protegisa ou não protegida. O acoplamento do corante de florescência ao grupo amino livre ou à função tiol do nucleósido > nucleá-tido ou oligonucleótido» alternativamente também se pode realizar somente após a sua utilização* Por exemplo» é possível realizar a reação com o corante de fluorescência depois de fase de acabamento da reacção de sequênciamento de ADE ou de ARh, marcando a mistura reaccional total com o corante de fluorescência.

Como corantes de fluorescência são adequados* em princípio» todos os corantes usuais existentes no comércio» que reagem com um grupo amino ou tiol* de preferência, fluoresceínas, rodaminas* vermelho do Sexas * 23&P (4-fláor -7-nitrobenzofurano de Sigma)* c&marinas, fluorescaminas, suc-cinilfluorescinas e dansilas· A mistura reaccional derivatizada pode ser separada por eletroforese em gel e detectada por fotometria ou espectroscôpia de laser (H* Swerdlow e R. Cesterland* Eucl. Acids Res. 18* pagina 1413 (199©))* Gomo adequada também se mostrou a eletroforese capilar (A.S.Cohen et al., P.R.A.S. US. 85» 9660 (1988)), por exemplo, capilares cheios com geles de - 7 -

acrilaaida* A àetecção realiza-se então de preferência na saída dos capilares (H* Swerdlow, S, Wu, H* Herke, 1T* Dovichi, Chromatograpiiy 5^6, 61 (1990)).

Partindo de um composto cb fórmula geral (I), que possui na posição 5* um trifosfato, pode proceder-—se à sitttese da fita dupla de ADH primário ("primer") qual que? e de uma fita que serve como modelo ("template") com o auxílio de uma polimerase, isto é, de uma enzima, que sintetiza em presença de substratos adequados uma cópia complementar fiel da sequência, em presença dos quatro trifosfatos de núcleos!-dio, de preferência, com o auxílio da $7-polimerase ou Eaq-polimerase, da ADR-polimerase I e da traascriptase inversa» Gomo grupos protectores 5* são usados os grupos tri-tilo» metoxítritilo ou dimetoxitritilo (Gait, Oligonueleotide Syntbesis, JBL-Press, Oxford 1984). 0 fim da síntese pode ser determinado res pectivamente de modo especifico, por utilização de um nucleó-tido A»0»G»E modificado com amino em 3'-(2') de fórmula geral (I), Isto tem importância especial para a síntese de fitas in versas de ADR em presença de uma fita que serve como modelo ( "template*) e desta maneira também para o sequenciamento de fitas de &DB, pois o uso de um nucleótido modificado garante uma interrupção da reacção muito específica da base. A síntese de nuclaósidos, nucleótidos e oligonucleótidos de ARK faz-se de maneira análoga.

Além disso, é possível a síntese de oligonucleótidos derivatizáveis, com o auxílio de um nucleótido de partida, que foi modificado com amino ou tio na extremidade 3*-(2’) e foi fixado em um suporte polimérico*

Gomo oligonucleótidos são considerados todos os nucleótidos de ADR e ARJèí, preparados no sentido tra-] dicional, de preferência, no entanto, com um comprimento de - «a Q —

2 a 100* de preferência especial* 12-50 nueleótidos (síntese química)* ou com um comprimento de atê cerca de 5*000 nucleó-tidos (síntese enzimátiea)* conforme a eficácia da polimerase usada. . A síntese de oligonucleátidos realiza-se * partindo do compexo de nucleótido de partida-suporte, no sentido tradicional, isto é* no sentido 5* e 5’ e possibilita a síntese de um oligonucleótido com sequência definida. A fixação do nucleótido de partida em suportes comerciais realiza-se através de um braço de ligação (”spacerM), que pode ser dissociado depois da sintese j por exemplo através da libação de ácido succínico conhecida da literatura out então* através de uma ligação com uretano (Efimov et al,, Huel. Acids. Res. 11, 8369* 1983))

Depois de realizada a síntese, o ollgo-nucleétido tem de ser dissociado do suporte com um reagente adequado. A modificação com um corante de fluorescência qualquer realiza-se iaediatamente em seguida. 0s oligonucleátidos assim sintetizados e modificados na extremidade 3#-(2f) podem ser usados, então, para a detecção de* por exemplo* oligonucleátidos complementares. A utilização do processo de acordo com a presente invenção combina duas vantagens entre si* 1) 2?a preparação de uma fita inversa marcada ocorre simulta neamente a interrupção da fita pelo nucleótido modificado na extremidade 3*-(2*) com aaino ou com tiol. Pela marcação do mesmo com o corante de fluorescência na posição 3*-(2*) ê possível* além disso* uma detecção isenta de perigo* 2)

ffa preparação de oligonucleótidos exaetamente definidos é possível, através da marcação do nucleotido de partida acoplado à um suporte e igualmente modificado em 3*-(2*) com amino ou tiol, efectuar uma síntese exacta áo oligonucleótiào ligada com a possibilidade de marcação de fluorescência e, desta forma, para a detecção*

Os exemplos citados a seguir servem para uma maior elucidação da invenção,

Exemplos 1, 3*- ou 2*-Amino- ou azido-nucle5sido-5*-trifosfatos ano-méricos

Exemplo 1 Síntese de 5 r-trifosfato-3 f-amino-3 *-de-soxi rribésido-timidina \

Esquema reaccional

5 * --io^of osfato-3 ,-azido-3,-desoxirribosido-timidina

Dissolve-sc 3 *-azidotimidina (Sigma) (160 mg, 0,6 amol) sob agitação em 10 ml de fosfato de trie-tilo* Com um funil de carga adicionam-se à solução a 4°C 0,2 ml de POCl^ em δ ml de fosfato de trietilo* Depois de 24 horas, neutraliza-se com 50 ml de solução saturada de HaHGQ,. e extrai-se, respectivamente, duas vezes com 60 ml de tolueno e 100 ml de éter* Dilui-se a fase aquosa com água destilada • até perfazer 500 ml e introduz-se em uma coluna permutadora - 10 -

de aniões ((R) Sephadex A-25i 50 x 2,5 ca), que foi permutada por meio de passagem de 200 ml de tampão 2HK O *2 LI (tampão de bicarbonato de trietilamónio; pH 7*5 foi auto-ajustado), com HOOj como contra-ião* Depois purifica-se por passagem de 300 ml de água destilada e elui-se primeiro com 200 ml de tam pão ΦΒΚ 0,1 IJ e depois com um gradiente linear de tampão 2BE 0,1-0,2 U (volume total de gradiente 1350 ml)· 1¾ cromatogra-ma aparece um pico, o máximo do produto* 0 produto foi eluído a uma concentração de tampão ΪΒΚ compreendida entre 0,12 até 0,15 £1# Reunem-se as fracções de 20 ml positivas de acordo com 0 cromatograma em camada fina e concentram-se por meio de secagem apés congelação, Elimina-se o bicarbonato de trie tilamonio por adição repetida de etanol. 0 produto apresenta -se como um sal de trietilamónio cristalino, branco*

Rendimento: 220 mg (56,2%); peso molecular 651 *61; Rf (amoníaco: iso-prop.: água 10 : ?0 : 20) 0,40 · 300 LUÍz-^H-Rí^ (Ι>20): 1,36 (t, 3H, CHj); 1,90 (s, 3H* CHj) j 2,50 (a, 4H, 2*,2"-H)? 3,18-3»50 (dd, 2H, OHg); 4,10 (m, 1H, 4*-H); 4,3 (m, 1H, 3’-H) } 6,31 (t, 1E, 1*-E) 5 7,7 (s, ΙΕ, 6-H); 11,50 (s, III, M)* 300 Míz-^p-RlM (HjPC^ a 85%, externo, B^O): 1,23 (s, IP) * 51-Srifosfato-3'-azido-3*-de soxirribósido-timidina

Dissolve-se 5 *-monofosf ato-3 *-azido-3 * ,2*--desoxirribósido-timina sob a forma de sal de trietilamónio (130 mg, 0,2 mmol) em 6 ml de 'Dal- (dimetilformamida) absoluta e adiciona-se â solução, a 25°C, IT* ,R*-carbonil-diimidazol (162,15 mg, 1 ramol) em 3 ml de DILu? absoluta sob agitação* Depois de 2 horas de tempo reaccional, adiciona-se 1 ml de me tanol absoluto, agita-se durante mais 15 minutos e separa-se o metanol por destilação, Adicionam-se ao resíduo 5 ml de uma solução 0,2 ϋ de pirofosfato de tri-n-butilamónio em DFM e agi ta-se durante a noite â temperatura ambiente* Separa-se o pre eipitado, que consiste em pirofosfato de imidazol, por filtração, lava-se com 20 ml de DMF e concentra-se o filtrado em evaporador de rotação. Dissolve-se o resíduo em 2β0 ml de tampão ΪΒΚ a 0,1 ±1 e introduz-se a solução em uma coluna per- 11 -

mutadora de aniões Sephadex A-25 carregada com HCO_~ * Purifi- 3 ca-se o produto por passagem de 200 ml de água destilada e elul -se com um gradiente linear de tampão SfBK a O até 0,5 II (volume total de gradiente 2.000 ml). Ho cromatograma aparecem doÍ3 máximos, o primeiro dos quais ê causado pelo monofosfato e o segundo pelo produto. 0 produto foi eluído a uma concentração de tampão IBS de 0,50 até 0,55 II· Heunem-se as fracções positivas de 20 ml e concentram-se por meio de liofilização· Eli-mina-se o bicarbonato áe trietilamónio por adição repetida de etanol* O produto apresenta-se como sal de trietilamónio crls talino, branco.

Rendimentoí 92 mg (50,4%): peso molecular: 911,95; Sf (amoníaco; isoprop.; água 10 ; 70 ; 20); 0,14; 500 MHz-^R-RiâN (Η?Ρ04 a 85% externo, D^O); -10,74 (d,2J * 22,1 Hz, IP, átomo alfa-P); -11,45 (d, J * 21,9 Hz, 1F, átomo de gaaa-P): -22,99 (t, 5Jpp * 20,5 Hz, IP, átomo de beta-P). 5 *—SDrlf osf ato-3 *-amino~3* -desoxirribosldo-tlmidina

Dissolve-se 5*-trifosfato-5*-azido-3 *,2*--desoxirribésido-timina (68 mg, 0,075 mmol) em 5 ml de dioxa-no-água destilada (2:1) e, sob agitação, à temperatura ambiente, adiciona-se ttófenilfosfina (200 mg, 0,75 mmol). ágita-—se a mistura reaccional a 25°0 durante 30 boras e depois elimina-se o solvente. Dissolve-se q resíduo em 30 ml de água destilada e extrai-se três vezes com respeetivamente 30 ml de éter. Dilui-se a fase aquosa até perfazer 150 ml e coloca-se a solução ea uma coluna de permuta de aniões Sepbadex A--25, carregada eom H00^*“. Purifica-se o produto por passagem de 200 ml de água destilada e elui-so com um gradiente linear de tampão PBK a 0 até 0,5 I (volume de gradiente 2*000 ml). 0 cromatograma apresenta três máximos, o primeiro dos quais representa o composto de monofosfato 6, o segundo o máximo de produto e o terceiro o máximo do eduto 7* 0 produto é eluído a uma concentração de tampão ΪΒΚ de 0,40 até 0,42 M. Beunem--se as fracções de 25 ml positivas e concentram-se por liofili zaçio. Elimina-se o bicarbonato de trietilamónio por adição de etanol. O produto apresenta-se como sal de trietilamónio amorfo, branco. - 12 -

Rendimento: 57 mg (a 35,7%) ; peso molecular 885*90; (amoníaco: isoprop*: água 10 ; 70 ; 20); 0*08; 300 IIHz-Íí-RlST (B20): 1,30 (t, 3H, OH^); 1,92 (s, 3H, GH^); 2,64- (m, 4H, 2», 2*-H): 3,19-3*21 (dd, 2H, 0H2); 4,26 (m, 1H, 4r-H); 4*41 (m, 1H, 3*-H); 6*34 (t, - 6.74 Hz, 1H, l'-H); 7*69 (s, 1H, 6-Ii); 11,50 (e, 1H, HH) * 300 MHz-53T-Rím (HjPG^ a 85 % externo, Do0); -10,75 (d, - 22 Hz, IP; átomo de alfa-P);

Ca PP -11,45 (d, ^<J * 21,9 Hz, IP, átomo de gama-P)*, -22,05 (t, x 93? ^Jpp * 20,4 Η*, IP, átomo de beta-P).

Exemplo 2 Síntese de l-(3 r-amino-21,3'-didesoxi-5’-trÍíosfatô-beta--2-treopentoiuranosil)-timina

Esquema reaccional

l-(3 f-Azido-2* ,3 ‘ -didesoxi-5 ’ -0-dimetoxi tr.it il-beta-D--treopentof uranosil)-timina A uma solução de 5 *-dimetoxitritiltimi-dina (Obtenção vide tí.Gait, Oligonucleotide synthesis, IRL Press (1984), página 27) (5*98 g, 11 mmol), trifenilfosfina (3,076 g, 11*73 mmol) e azida de lítio (3,1 g, 55 mmol) ea 37 ml de DÍ.ÍF isenta de água, adiciona-se, sob agitação, te-trabrometo de carbono (11,91 mmol, 4,10 g)„ Agita-se a preparação durante 56 horas â temperatura ambiente (*EA) e adicio-nam-se então 15 ml de metanol* Precipita-se o produto, em seguida, em 800 ml de água destilada gelada, Retoma-se o precipitado em clorofórmio e purifica-se por cromatografia de . Hflesh* (acetato de etilo; n-hexano * 3:1)* Valor de R^ cloro - 13 - formio metanol 9:1 * 0,52. II (cu”1): 2100 azida; rendimento 80%, 4,95 S« 1-(3*-Αΐβ1ηο-2* ,5*-didesoxi-5*-O-dimetaxitritil-beta-B--treopentof uranoxil)-timina

Adiciona-se a uma solução agitada de 1-(3 *-azido-2f,5*-didesoxi-5*-O-dimetoxitritil-beta-D-treopen-tofuranosil)-timira (0,5 &» 0*8 mmol) 0,15 S de trifènilfosfi-na (1,5 g, 4,94 mmol} e deixa-se reagir durante 4 horas. Para hi&rolisar a fosfinimina adicionau-se 3 ml de água destilada e continua-se a agitar durante mais 3 horas* Após a eliminação do solvente por meio de destilação com rotação, purifica--se o óleo residual por cromatografia de "flash1* (clorofórmio imetanol 99 íi + 1 % de trietilcmina). Valor no mesmo eluente * 0,27* A amima pode ser corada de violeta por tratamento com ninidrina no ensaio de cromatografia de fina camada (DO). S-endimento 87,5%* 0,42 g. 0 produto possui o espectro de correspondente*

Heacção para obtenção de l-(3 *-amino-2*, 3 *-diâesoxi-51-trifosfato-beta-D-treopentofuranosil)-tÍmina

Para a continuação da reacção para obtenção de 5‘“trifosfato elimina-se o grupo dimetoxitritilo analogamente ao processo descrito em M.Gait, Oligonucleotide synthesis, IBL Press página 49 (1984) e realiza-se o acoplamento do trifosfato na posição 5* como se descreveu no Exemplo 1.

Exemplo 3

Preparação de 2 *-amino-2 *-des oxi-5*-trifosfato-uriditta Esquema reaccional - 14 -

OH OH (2,2*-Anidro-l-beta—arabinofuranosil) -uracilo A uma solução de 19 S (77,8 mol) de uri-dina e 22,2 g (103*6 mol) dô carbonato de difenilo em 75 ml de dimetilformamida absoluta adicionam-se 0,5 S (5,93 mmol) de hidrogenocarbonato de sódio* Depois da dissolução completa, aquece-se o líquido límpido incolor a uma temperatura de 150°C durante 30 minutos. Depois de deixar arrefecer, despeja-se a

I solução fria eir. Iter absoluto. Separa-se o éter por decantação do precipitado formado e recristaliza-se o produto bruto em 1650 ml de metanol, Após a secagem, obtêm-se um pé cristalino branco ·

Ponto de fusão: 239°C| MS: 227* valor de ίϊ,,: 0,31 cm cloreto de metileno/metanol 8:2? rendimento: 9,22 g (52,3%): 60 AHz corresponde "aos dados da literatura. 2'-Azido-2*-desoxÍ-uridina

Colocam-se 1,16 g (10 mmoles) de (2,2*--anidro-l-beta-arabinofuranosil)-uracilo e 3*5 g (71*7 mmoles) de azida de lítio, sob agitação, em 25 ml de BMPH absoluto (1,3-dimetil-3,4,5,6-tetra-hidro-2-(l-H)-pirimidinol) previa-mente em um recipiente. Aquece-se a suspensão a 120°0, ficando a solução reaccional corada de preto. Depois de 3 dias, dilui-se a solução preta com 80 ml de água e extrai-se 2 vezes com 100 ml de cloreto de metileno. Lavam-se as fases orga nicas reunidas ainda quatro vezes com água e concentra-se em - 15 -

por cromatografia em coluna com gel de sílica (cloreto de me-tileno/metanol 8:2). Depois da concentração do resíduo oleoso preto por destilação exa evaporador rotativo purifica-se ainda duas vezes em base de gel de sílica (acetona: metanol 8 : 3 e aoetona; acetato de etilo (1:1)· Obtêm-se um vidro incolor, unitário por cromatografia em fina camada (valor de em cloreto de metileno/metanol 8:1 * 0,61). Rendimento 2,035 S (30%) \ 17 (película com clorofórmio): 2120 caT1. ES(FAB): 270. 0 produto possui o espectro de ^Η-Εΐ',Φ’ esperado. Λ obtenção da 2 *-amino-2'-desoxi-5 *--trifosfato-uridina realiza-se por 3*-acilação selectiva da função de bidroxilo» A introdução do grupo 5*-trifosfato realiza-se, em seguida, analogamente ao Exemplo 1. Depois da desacilação na posição 3'» a azida é reduzida com obtenção de amina por reacção com trifenilfosfina (como no Exemplo 2).

Exemplo 4 Síntese de 3*-amino-2*^‘-diaesoxi^-trifosfato-adenosina Esquema reaccional

E^-3enzoil-9-(5-0-benzoil-2-desoxi-bôta-D-treo-pencofuranosil2 -adesina

Arrefece-se a 30°0 uma suspensão de 920 mg (2 mraoi) de 1T® ,5 '-O-dibenzoil-^-desoxi-adenQsiiia (obtida pelo processo descrito em ITisbino et al., Hucleosiàes d Eucleo • tides 1986, 5, 159) ©& 30 ml de diclorometano absoluto (contêm - 16 -

am 2 »1 de pisidiaa) e adicionn^-ae 5 ml de uma solução da ani&ri-do de ácido trifluormetaaossulfénieo ea dicloromecano (10 volume)* lontamente, e 30ta a sota* Oepois da se afastar o ba mho de arrefecimento» deixa-se aquecer a solução e adiciona-se 1 ml de água» 3epels de 5 horas, adicionam-ae aats 5 al do água e lava-»· a fase orgânica, depois da eliminação 4o solvente» dissolve-se ô resíduo restante 00a 5u al de metanol e adicioBaa-se 133 mg 4e bicarbonato do aáâio. Agita-se durante sais 2 horas ã T!í* neutraliza-se òom. acido acético a 10&, sspara-se o solvente por destilação e purifica-se por croma-bograíia rápida (*£laoh") através de ge1 de sílica (clorofár-mio metanol 97:3) * Sendiauinto 710 mg <1,4& isoles) TpvU Yalor de em clorofórmio smetanol 97; 5 * 0»49« iil * #59* 3 *- 2ido-3* »3 #-dideaoxiadenosli»a 1 mrrefece-se a -33¾ uma solução âe 920 mg (2 mmol) de !í®-benzoi 1-9-( ^-O-bs^soil-S-desoxi-beta-B-treopen-bofurnnosil)-adenina ea 23 ml de âleloscaotano absoluto (a 2 m piridina)* g® aoguida, a€ieio»o3-ae 9 si (5 amoles) de uma solução de aniirido de ácido trifluormetanossulfénica em diclo roaetafia absoluto, dfasta-ae o banho de arrefecimento» agita--se durante nals 23 minutos e adicionam-se 983 mg (23 amoles) de acida de lífeio ea 23 nt de 31-7 â solução, 'Depois de mais 2 horas de agitação à 1*1, adicionam-se 50 ml de água e lf>0 ml de cloroférmie* eglua-se a fes© orgânica e lava-se com água destilada* ílimina-se o solvente ea ' ^ctcivapor e trata-se durante a noite com solução de metanol amoniacal cara a eliminação do grupo 4a base 4a protecção* Sepois de uma nova eliminação do solvente, purifica-se por cromatografia rlnida (*ílash*) (clorofórmio; metanol 95 ; 5) atrevéc de gel de sílica. Rendimento; 433 mg (1,6 mmol» 7¾ ) de nS cristalino» —1 branco. XV: 2.103 cm gruoo assldo* 5*‘ .mino-S* ,3 •-didesaxi^-trifosf&to-adenosina X obtenção do 5*-trifosfato realiza-se analogamente ao processo descrito no Sremplo 1. Snt seguida* reluz-se a azida ê com obtenção de ©mina como no Kxemolo 2* - 17 -

Exemplo 5 Síntese da J^amino-S* ,3*-didesoxi-5,-trif0s£atQ-guanQsina

Esquema reacciottal

A obtenção da 3*-amino-2*,3,-didesoxi-5,-

P -trifo s fat o-guanosina realiza-se a partir de Π -isobutiril--5*-0-ben3oil-2r-d3S0XÍguaTiosina* que pode ser obtida pelo processo de Hisbino et al* (líucleosldes & bucleotides 5, 159* 1986)« A reaoção do nucleósido com obtenção da 3’-azida rea-liza-se analogamente à obtenção do Exemplo 4* Deve ser observado neste caso* que nio se realiza o tratamento com solução de metanol amoniacal, pois a eliminação do grupo pxptector de isobutirilo somente se efectua depois da introdução do grupo de trifosfato e antes da redução da azida com obtenção de amina. A reacção com obtenção de trifosfato, na guanosina realiza-se igualmente pelo processo citado no Exemplo 1. A redução com obtenção da amina ê descrita no Exemplo 2« 2« Síntese de oligomeros de 3 '-amino e subsequente marcação d© 3*-fluorescência.

Exemplo 6 A síntese de um oligomero de 20 nucleó-tidos 3'* realiza-se partindo da 3 r*-amino-3 ’-desoxitimidina protegida com 5f-dimetoxitritilô. Λ obtenção deste composto realiza-se procedendo de acordo com a descrição do Exemplo 1. Parte-se, neste caso, da A3'I (azido -3t-desoxirribósido-timidina) protegida com J^-dimetoxitritilo, - 18 -

que pode ser obtida a partir de Α3Ϊ e de cloreto de dimetoxi-tritilo pelo processo de li «Gait (Gligonucleotide Synthesis, ISL Press 1994, página 27)·

Bm seguida* o composto ê reduzido com trifenilfosfina como se descreve no Exemplo 1, A operação seguinte ê a obtenção do material de suporte· Para esta finalidade, colocam-se 200 mg 31-Q~(4,4*-dimetoxitritil) -31 --amino-3 * -desoxitimicLina em 700 de piridina absoluta em um recipiente. A esta solução adicionam-se 45 mg de ΏίϊΑΡ (di-> metilaminopiridina) e, em seguida, 40 mg de anidrido de ácido succinico* Após repouso durante a noite, ki&rolisa-se o ani-drido de ácido succinico restante por adição de 10 ^tL de água, Ooevapora-se três vezes com tolueno e retoma-se o resíduo em 12 ml de cloreto de metileno, lava-se com 4 ml de ácido cítri- · co frio (a 10%) e duas vezes com 4 ml de água. Seca-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio, concentra-se o volume por vaporização, do solvente e dissolve-se a substância com 1 ml de cloreto de metileno, introduz-se esta solução, lentamerte, gota a gota, sob agitação, em 30 ml de n-hexano. 3epara-se o precipitado formado por filtração sob sucçãc e seca-se a 4G°G em báeuo de bomba de óleo. A continuação da obtenção do material de suporte â base de CPG· ê realiza-se procedendo de acordo com maneiras de proceder padrão e para a obtenção do oligomero de 12 nucleótidos procede-se com o ciclo padrão (ABI 3S0A User Bullstia., ITúaero 36, Julho de 1986) em. um sin-tetizador de kW ABI 3B0 Δ pelo processo de fosforamideto· Depois de desprotecçâo e dissociação do 3‘-amino-oligonucleó-tido do suporte, purifica-se e earacteriza-se de acordo com os métodos padrão. Heste caso, obter-se melhores resultados processos de acoplação mais 1abeis a bases para a ligação ao suporte, t vantajosa a substituição da ami&a de ácido a ser dissociada por uma função de uretano, como se descreve em Bfi-mov (Bucleic Acid Ees. 11, 8369, 1983).

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Realiza-se a síntese àe um. oligomero de 23 nucleõtidos com a extremidade de 3' -amino fornada por 3 * -H^-AOAOOO ΑΛΤΤΟΤΟΑΔAATGGAT-5 * procedendo de acordo com ft descrição do Exemplo 1, A purificação e a caracterização são realizadas por processos padrão·

Sxemplo 8 A subsequente derivatização dos oligomero 3 na extremidade de 3*-asino realiza-se com isotiocianato de fluoresceína· Dissolvera-se 50 mmoles do 3 * -anino-oligonucleo tídio em um balão de Eppendorf em 25 ^.1 de uma solução de h±-drogenocarbonato de sódio 500 i&I. Adicionam-se 20 de uma solução de EITO $00 al.I (Sigma) em.DMSO. Depois de 6 boras de tempo reaceional à temperatura ambiente, purifica-se a mistura reaoeiottãl pela passagem em uma solução de acetato de amónio 20 má através de uma coluna com Sephadex 0-25· 0 oligomero 3*-EITO foi analisado por meio dum ensaio de NPLO analítica tanto por detecção de fluorescência eomo também por deteeçâo àe ΤΠΓ· Os resultados do ensaio HPIiO foram também verificados por análises de eletroforese capilar (firma Dionex)* Fórmula do isotiocianato de fluoresceína

OH 20 -

Exemplo 9

Fazem-se reagir ambos os 3*-amino-oligó-neros dos Exemplos 1 e 2, de acordo com o processo descrito no Exemplo 3, com isocianato d© rodaaina e com isocianato de tetranetilro&amina* Os oligéaeros marcados com 31-xluoro.acenei a são analisados por meio de ua ensaio de HPLO analítica tan to por deteeção de fluorescência como também, por deteeção de W* Os resultados do ensaio de HPLO foram também verificados por meio de ensaios de eletroforese capilar (firma Dionex)« Fórmula cios corantes isotiociansto de rodamina ê isociarato de tetrametilrodamina

Exemplo 10

Fazem-se reagir ambos os 3 *-an&no-ollgomeroe dos Sxexaplos 1 e 2 de acordo com o processo descrito no Exemplo 3 com o derivado de cumarina cuja fórmula se representa* O oligomero marcado de 3'-flurescêrcia ê analisado por ua ensaio de HPLO analítica tanto por deteeção de fluorescência como também por deteeção de UF. Os resultados do ensaio de HPLO são também verificados por ensaios de electroforese capilar (Firma Lionex), 21 -

Fórmula da molécula do corante cumarina /

;S, Introdução de núcleo ti dos modificados por E3lí-polime rases e analítica dos ensaios de sequenciaMento«

Pará o exesas da aceitação dos aminotri-fosfatos pelas enzimas de sequencicmento comuns foram preparadas soluções de terminação correspondentes e ensaiaram-se as polimerasee (Elenow* Boehringer; a?aq»àaers3iam; 2?7» Hiarma-cia; Bequenase, USB). Seste casc foram analisadas as proporções de incorporação e as propriedades de terminação dos tri-fosfatos tanto de maneira clássica como também pela marcação com corantes de fluorescência.

Exemplo 11 À 5*-trifosfato-3*-amino-ã*-desoxirribo-siáio-timidina, obtida como se descreveu no Exemplo 1, foi substituída por 2* ,3*-di&esoxi~5*-tri£osfato«limi&ina. Isso realizou-se com as soluções de terminação de todas as polime-rases acima citadas. Foram experimentadas respectivamenle proporções de ΊΧΤϊρ/terminador equimolares % dez vezes superiores e dez vezes menores. Os sequenciamentos foram realizadas de acordo com os modos de proceder padrão. Hestes exames foi - 22 - deteetado autorradiograficamente introdução de alfa- S-dAlV. Verificou-se que» a) 0 3•-amiEo-nucleádido actua de maneira terminadora sobre as enzimas usadas, b) as proporções de inser ção de '17* faq e sequenase são idênticas aos dides oxii er mina -dorcs usuais e c) por fim pode realizar-se um sequeneiamento sem problemas com o aminc-nucleótido.

Exemplo 12 5t-trií'osfato I?ez-so reagir o composto -amino-3 *-desoxirribosido-tiaidina com isotroeianato de fluo-resceína para a obtenção de $t-trifosfato-3,-amino-3,-c.esoxir-ribosido-5 ‘-iT-fluoresceino-isotiocianato-timidina ·

Hum botão de Eppe»âor£ dissolve-se 3'-trifosfato-3r-aminc~31,2*-desoxirribósido-timina (2,3 mg, 2,8 ^imoles) em 200 jH de água destilada e adicionam-se 200 yal de tampão de EúsupO~ /haHOO(pH <)) · Protege—se a mistura rsaecioral da acção da luz do dia envolvendo o recipiente com folha de alumínio e com uma pipeta de 100 pl, adiciona-se 80 de uma solução de isotioeianato de fluores— ceína (10 mg em 1 nl de 3)Ι2Γ). Depois de 10 minutos de tempo reaocional â temperatura ambiente, o eduto está reagido quantitativamente como mostra o ensaio de cromatografia em camada fina· i purificação realiza-se por meio de filtração através de gel* Δ coluna de Sephadex G-lO ê protegida da acção da luz do dia por meio de envolvimento com folha de alumínio; en seguida introduz-se a mistura reaocional inteira no material âa coluna e elui-se com um caudal de 1 al/min ue água. 0 cromatograna apresenta dois máximos* o primeiro máximo é produzido pelo produto e o segunde pelo corante que não rea-guir* 0 volume de cada fracçãe corresponde a 5 ml; ao todo obtêa-se 24 fracções* De acordo com o croaatograma, a fracção 4 é positiva. Isto ê confirmado por cromatografla em camada fina. Concentra-se o solvente por meio de liofilização e armazena-se a substância a -80°C. Eendimento 3,32 ag (95/0» peso molecular; 1.274,32; Ef (amoníaco; isopropanol ; água 10; 70 s 60)¾ 0,62; espectro de emissão de fluorescência; o - 23 - 1

comprimento áe onda da lua irradiada corresponde a 420 nm. 0 máximo de emissão do composto fica a 514*8 nm, Utilizou-se uma solução 2,5 mí-ΐ em água destilada* 0 máximo de emissão de uaa solução 2,5 aM do corante não derivatizado em água destilada corresponde a um comprimento de onda de 519# nm. 51 «trlfosfato-3 *-amino-31 -desoxirribo-sido-p*-íT-isotiocianato de flucre sceína-timidina foi permutada por 2%3*-dià3Sôxi-5,-trifosi'ato-timiciina. Isto foi realizado nas soluções de terminação de todas as polixaerases acima citadas. Foram experimentadas, respectivamente. proporções equi-molares, dez vezes maiores e dez vozes menores de dlTIP/termi-«ador* Os sequenci amentos foram realizados de acordo com maneiras de proceder padrão, restes ensaios, detectou-se a incorporação de alfa-^S-d&fp autorradiograficamente, Verifica--se que a) o nucleSti&o marcado com ^'«fluoxeecSãoiã actua de maneira a terminar a cadeia sobre as enzimas usadas; b) as proporções de incorporação são idênticas com 17* laç e sequena se aos didesoxiterminadores usuais no caso de concentrações dez vezes maiores devido ao radical de corante estericamente estorvado; e c) pode realizae-se um se quenci amento sem problemas com o terminaâor marcado com 3*-fluorescência.

Exemplo 13 â, 5 *-trifosfato-3 *-amiro-3 * -desoxirribó-sido-3 *-IT-isotiocia^ato de fluoresçeína-timidina foi substituí da por 2^31-didesoxi-5f-trifosfato-timidina. Isso se com as soluções de terminação das polimerases I? e 1’aq, Foram usadas proporções de dlTSP/terminador dez vezes maiores. Os sequancia--mentos foram realizados pelas maneiras de proceder padrão. 2¾ tes exames desistiu-se da incorporação de alfa-^S-dAIP o a a-nãlise áe sequência com o terminador marcado de 3*-fluorescência realizou-se com sucesso em um sequeneiador de JLU17 comercial»

Exemplo 14 Síntese de 5'-trifosfato-3 *-ΐ1ο-3 ‘-desoxirribósido-timiclina Esouema reaccional

m

-> > O-Diaetoxitritil-ã^S-benzoil-tiotimidina A introdução do enxofre ou posição 3* realiza-se pela substituição de ua grupo de saída (mosilato) com tiobenzoato de sódio* A síntese de tiobenzoatc de sódio rea-lizou-se adicionando HaOH 10 d a uma solução arrefecida com C©lo de ácido tiobenzóico (10 g) em V? ml de água até a solução ficar preoisamente alcalina* Em seguida* ajusta-se o valor de pll para pH 7 oca ácido tiabenzóico aquoso* arrefece--se a -5°0 e filtra-se a solução, a fim de eliminar resíduos sólidos* Depois da eliminação da água em evaporador de rotação com etanol, seca-se o sal amarelo em vácuo sobro pentóxido de fósforo*

Agita-se uma solução de 5* -G-aiaiôtoxitri-t i 1 -3 ♦ -0-met an o s sulfonll-2 *-deoxtxilo-timidina (8*45 maoles) (síntese do mesilatoi ililler, Pox (1964) J. Qrg* Ghem. 29, - 25

1772) β tiobenzoato de sádio (33 amoles) em BMP (30 ml) durante 4 horas a 100°0. Extrai-se a mistura reaccional com àiclo-rometana e lava-se a fase orgânica com solução saturada de -KaHQO, e com solução saturada de uaOl* Depois da secagem da fase orgânica sobre sulfato de sodio, eoevapora-se duas vezes com tolueno e pur-ifica-se o produto bxuta oleoso por cromato-grafia tipo "flash" (gel de sílica 60H, elorofórmio/metarol 0-10%) *

Rendimento? 60% j o produto possui o espectro de ^H-IEiR esperado* 0 grupo protector 5‘-dimetoxitritilo ê eliminado para a fosfitilação na posição 5* de acordo com processos conhecidos na literatura (u*Gait, Gligorucleotide Gynthesis, JSL-Press, Oxford 1984)* Em seguida, é obtido o 9*-trifQsfato pelo processo de jSokstein e Ludwig (J*Grg*Ghem* 1939, ?ol* 54·» 3,631) com salicilfosforoclorideto (Alarich) e tratamento com pirofosfato · 0 táiol e libertado par reacção com NaOH 10 H em etanol saturado em atmosfera de árgon (E.0os-stick, ITõcleic Acide Research 18, 4, 829)* A 3 *-ti o-3 * -trifosf ato-timicLina foi acoplada de acordo con o processo descrito no Exemplo 8 com iodoacetamidofluoresceina (amostras moleculares) e, nesta fase obtêm-se tionucleótido, marcado com fluorescência, com um rendimento de 80%*

Exemplo 15 Síntese do i-Q*-tio~2* ,3‘-didesoxi-J ♦-trifosfato-beta-D--treopehtofuranosil)-timina

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Claims (1)

1. A partir de 5 * -Di,12r-0- *3 * -0-mesil-timi-dina substitui—se, como se descreveu no Exemplo 14f com tio-benzoato de sódio. Em seguida* realiza-se a dissociação do grupo de protecção em >N & introdução do 5 *~trifosfato * a libertação do tiol e a ligação de iodoacetamidoíluoresceína analogamente âs maneiras de proceder que se descreveram no Exemplo 14. Exemplo 16 Síntese de um oligómero de 10 nucleotidos 3 '-beta-H^-^·^ ¢5¾ 222 2-5' A síntese de um oligómero 3 '-beta-Ií^*--222 222 222 2-5* realiza-se a partir de l-(3 *-amino-2'-,3 f--didesoxi-6*-p;i22?-beta-B-treopento.furanosil)-tiai«a* que se faz reagir pelo processo descrito no Exemplo 6* com obtenção do material de suporte para o processo de fosforamidite. A subsequente margação com fluorescência do 3*—beta—amino— -oligonucleótido com isotiooianato da fluoresceina realiza~-£e de acordo com o Exemplo 8« sei?ihpioacões - 1ê - Processo para a preparação de nucleósi-dos, nucleotidos ou oligonucleotidos, modificados por 3 *-(2*,). -amino ou tiol* acoplados a corantes de fluorescência c.e fórmula gersil I - 27 -

   η α eual η Ε ê uma base de ourina ou de pirimidina» pelo menos um dos radicais e representa um corante de flussosôência ligado por intermédio de ua grupo aaino ou tiol, na posição alfa ou beta» e o outro radical representa eiren-taalaente ura átomo de hidrogénio» toa grupo kidroxilo, ou um grupo hidroxilo ou netos:! protegidos» na posição alfa ou beta» n é um námero > Q» ê um grupo de proteeção na posição 5* ou fosfato» pirofos-fato ou trifosfato, li? é oxigénio, fluormetileno, difliiormetileno ou metileno» <jT 2 $ ura grupo Mdroxilo ou aetoxi ou um átomo de hidrogénio na posição alfa ou beta, ea çue R1, e ifi pedem respectiva-sente ter significados iguais ou diferentes, e x e Z representam oxigénio, enxofre, EH ou netileno, podendo Z e Ί ser, respeotivamente» iguais ou diferentes» caracteriaado por se derivatisar o grupo OH de um nticleósido » nuoleótido ou cligonucleótido, que se encontra na posição 5* e/ou 2', ea um grupo amino ou tiol, e, em seguida» se acoplar um corante de fluorescência» 28 - 2Β Processo para a preparação do composto de fórmula geral X de acordo com a reivinai cação 1, aaraeteri· zadc por se derivatisar o grupo OH de uai nucleosido» imcleó-tido ou oligonueleátido, que se encontra Ra posição 3* e/ou 2*, em mi grupo amino ou tiol, para o que se introduz primei-raraettfce no grupo 5*-áidroxi e/ou 2M:ddroxilo um grupo de saída; esi seguida se efeetuar o ataque nucleofílieo da azida para a fonação áa azida ou o ataque necleofílico do tiolato ou do tiolato- S-protegido para a formação do tiol ou do. tiol ^-protegido; e em seguida, se fazer reagir o grupo 3*^(21)— -amino ou tiol do agrupamento de açúcar, na extremidade 3 * do ácido rucleico, com um corante de fluorescência reactivo« 33 Processo para a preparação do composto de fórmula I de acordo com a reivindicação 1, caracterisadp pelo facto de, no composto do fórmula geral II

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   na qual H^-K6* X* Y e n possuem as significações acima citados podendo os símbolos b\ iP e S° possuir respectivamente significações iguais ou diferentes» e ou R® representam hidrogénio, um grupo hidroxilo ou um grupo hidroxilo ou metoxi protegidos, a) se introduzir, na posição 5* e/ou 2*, uma função azida ou tiol, sob uma forma protegida ou não protegida, por meio de ataque meleafilieo e eventualmento, se reduzir a azida com obtenção de .mina o b) se acoplar o corante de fluorescência por intermédio do grupo amino ou por intermédio do grupo tiol, — iLP ^rocesso de acordo com as reivindicações 1 a 3» caracteriaado por, como corante de fluorescência, se empregarem fluorescaínas, rodasinas» vermelho do Sexas, 4--£ldor-9~nitroben3o£ura»ano (1ΤΒΪ)) , cumaninas, fluoressaminas, succinilxluorescinas e dansilos. Processo para a síntes de nueleósidos, rucleótidos e oligonuclaótidos de ,\sfS e de ΆΜ para a detecção de fluorescência microscópica e macroscópica **in vivo" e ,fin vitro11, car&cter-icado por se empregar um composto de fórmu!. geral (I) preparado de acordo cora qualquer das reivindicações 1 a 4. — sê Processo para a síntese de aligonucleóti-doe de contracordõee em ausência de usa cordão que serve como modelo (ntxiplate"), caracterisado por se empregar um composto . de fórmula geral (X) preparado de acordo coa qualquer das rei-' vlndicações 1 a 4* - 50 - * ϊ - φ A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente alemão, apresentado eia 11 de Dezembro de 1990, sob o Ufi. P 40 39 488.3* itieboa» 10 de dezembro de 1991»

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