JP2022516244A - 3’保護ヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年4月4日に出願された米国特許仮出願第62/781,638号の利益を主張するものであり、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
本開示は、概して、配列決定での使用に適した3’保護ヌクレオチドに関する。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは0または1~5の範囲の整数である。)であり;
R1は、結合、-CH2-、-C(O)-O-、-C(O)-NRa-、または-C(O)-Rx-であり;
R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和のC1~C6アルキル基、C5~C6アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q-(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
R4は、結合、置換または非置換の5-~7-員のアリール基、-CH=CH-、置換または非置換の5-または6-員のヘテロシクロアルキル基、または-O-C(O)-アリール-であり;
R5は、-(C(Ra)(Rb))n-N3、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-(C(Ra)(Rb))n-CN、互いに1、3の位置にある2つの硫黄原子を含む5-~8-員のシクロアルキル基、または構造:
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)である。)を有する基であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
ReおよびRfは、独立してH、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-員または6-員のアリール基であり;
Rxは、置換または非置換の5-員または6-員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり;
nは、0または1~3の範囲の整数であり;
pおよびqは、それぞれ独立して、1~3の範囲の整数であり;
ただし、R1およびR4がいずれも結合であり、かつ、R2およびR3がいずれもHである場合、R5は、アジドではない(例えば、R5はN3ではない。)である。〕、
のヌクレオチドまたはその塩である。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは0または1~5の範囲の整数である。)であり;
「保護基」は、構造:
Z1およびZ2は、独立して、H、C1~C4アルキル基、または任意選択的に1つまたは複数のヒドロキシル基で置換された5-~6-員のアリール基である。)であり;
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)である。)を有し;および
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-員または6-員のアリール基である。〕、
のヌクレオチドまたはその塩である。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは0または1~5の範囲の整数である。)であり;
R1は、結合、-CH2-、-C(O)-O-、-C(O)-NRa-、または-C(O)-Rx-であり;
R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和C1~C6アルキル基、C5~C6アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q--(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
R5は、-(C(Ra)(Rb))n-N3、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-(C(Ra)(Rb))n-CN、互いに1、3の位置にある2つの硫黄原子を含む5-~8-員のシクロアルキル基、または、構造:
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)である。)を有する基であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-員または6-員のアリール基であり;
Rxは、置換または非置換の5-員または6-員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり;
nは、0または1~3の範囲の整数であり;および
pおよびqは、それぞれ独立して、1~3の範囲の整数であり;
ただし、R1が結合であり、R2およびR3がいずれもHである場合、R5はアジドではない(例えば、R5はN3ではない。)である。〕、
のヌクレオチドまたはその塩である。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
R1は、結合、-CH2-、-C(O)-O-、-C(O)-NRa-、または-C(O)-Rx-であり;
R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和C1~C6アルキル基、C5~C6アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q--(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
R4は、結合、置換または非置換の5-~7-員のアリール基、-CH=CH-、置換または非置換の5-または6-員のヘテロシクロアルキル基、または-O-C(O)-アリール-であり;
Z1およびZ2は、独立して、H、C1~C4アルキル基、または任意選択的に1つまたは複数のヒドロキシル基で置換された5-~6-員のアリール基である。)であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
Rxは、置換または非置換の5-員または6-員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり;および
pおよびqは、それぞれ独立して、1~3の範囲の整数である。〕。
を有する、ヌクレオチドまたはその塩である。
Z1およびZ2は、独立して、H、C1~C4アルキル基、または任意選択的に1つまたは複数のヒドロキシル基で置換された5-~6-員のアリール基である。)であり;
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)であり;
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-員または6-員のアリール基である。〕、
を有する部分を含むブロック基を含む、重合反応を実行することと;
(b)ナノポアを使用して、成長中のポリヌクレオチド鎖への3’保護ヌクレオチドまたはその副生成物の組み込みを検出することと;(c)3’保護ヌクレオチドまたはその副生成物の組み込みを検出するステップと同時に、またはその後に、3’保護ヌクレオチドを脱保護して3’脱保護ヌクレオチドを提供することと、を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも4つの異なる3’保護ヌクレオチドはそれぞれが異なる検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、検出するステップは、少なくとも4つの異なる3’保護ヌクレオチドのそれぞれに関連する異なる検出可能な部分を検出することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも4つの異なる3’保護ヌクレオチドのそれぞれに関連する検出された標識をヌクレオチドのタイプと相関させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、重合中に検出された標識の評価に基づいて、核酸分子の核酸配列を生成することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、脱保護は、3’保護ヌクレオチドを酸化剤(例えば、過酸化水素)と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、3’保護ヌクレオチドの脱保護の副生成物を検出することをさらに含む。
Z1およびZ2は、独立して、H、C1~C4アルキル基、または任意選択的に1つまたは複数のヒドロキシル基で置換された5-~6-員のアリール基である。)であり;
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)であり;
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-員または6-員のアリール基である。〕、
を有する部分を含む保護基を含む、重合反応を実行することと;
(b)ナノポアを使用して、成長中のポリヌクレオチド鎖への3’保護ヌクレオチドの取り込みを検出することと;(c)3’保護基を脱保護し、3’保護ヌクレオチドから標識を切断して3’-OH基を提供する(すなわち、脱保護ヌクレオチドを提供する)ために、酸化剤を導入することと、を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも4つの異なる3’保護ヌクレオチドはそれぞれが異なる標識を含む。いくつかの実施形態において、検出するステップは、少なくとも4つの異なる3’保護ヌクレオチドのそれぞれに関連する異なる標識を検出することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも4つの異なる3’保護ヌクレオチドのそれぞれに関連する検出された標識をヌクレオチドのタイプと相関させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、重合中に検出された標識の評価に基づいて、核酸分子の核酸配列を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、脱保護は、3’保護ヌクレオチドを酸化剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、酸化剤は、過酸化水素、過ヨウ素酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、ペルオキシ硝酸塩、または他の適切な酸化剤からなる群から選択される。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
R1は、結合、-CH2-、-C(O)-O-、-C(O)-NRa-、または-C(O)-Rx-であり;
R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和のC1~C6アルキル基、C5~C6アール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q--(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
R4は、結合、置換または非置換の5-~7-員のアリール基、-CH=CH-、置換または非置換の5-または6-員のヘテロシクロアルキル基、または-O-C(O)-アリール-であり;
R5は、-(C(Ra)(Rb))n-N3、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-(C(Ra)(Rb))n-CN、互いに1、3の位置にある2つの硫黄原子を含む5-~8-員のシクロアルキル基、または、構造:
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)である。)を有する基であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-員または6-員のアリール基であり;
Rxは、置換または非置換の5-員または6-員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり;
nは、0または1~3の範囲の整数であり;
pおよびqは、それぞれ独立して、1~3の範囲の整数であり;
ただし、R1およびR4がいずれも結合であり、かつ、R2およびR3がいずれもHである場合、R5は、アジドではない(例えば、R5はN3ではない。)である。〕、
によって具体化される、取得することと;
(b)ナノポアに隣接または近接して核酸分子を方向付けることと;(c)核酸分子の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチド鎖を生成するために、酵素を使用して、核酸分子に沿って3’保護ヌクレオチドを重合することと;(d)3’保護ヌクレオチドをポリヌクレオチド鎖に組み込んだ後、3’保護ヌクレオチドの3’保護基を脱保護することと;(e)電極を使用して、3’保護ヌクレオチドから放出された標識を検出することであって、放出された標識は、ナノポアを通過するか、ナノポアに近接して流れる、検出することと、を含む。いくつかの実施形態において、標識は、3’保護ヌクレオチドの3’保護基の脱保護の前に放出される。いくつかの実施形態において、標識は、3’保護ヌクレオチドの脱保護と同時に放出される。いくつかの実施形態において、標識は、保護基の放出の前に脱保護される。いくつかの実施形態において、3’保護ヌクレオチドの脱保護のステップは、3’保護ヌクレオチドを酸化剤、例えば、過酸化水素と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、同じ反応条件および/または試薬が、3’保護基の脱保護および標識の放出に使用される。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;および
Z1およびZ2は、独立して、HまたはC1~C4アルキル基である。〕、
からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、Z1およびZ2は、独立して、H、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態において、Z1またはZ2の少なくとも一方はHである。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドまたはその塩は、エチレングリコールまたはエチレングリコールに由来するポリマー、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素(フルオロフォアを含む)、化学発光化合物、mass標識、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、脂肪族酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、およびそれらの任意の組み合わせのうちの1つまたは複数からなる群から選択される標識を含む。いくつかの実施形態において、核酸塩基またはその塩は、PEGベースの標識を含む。いくつかの実施形態において、標識化核酸塩基は、切断可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、酸化剤(例えば、過酸化水素)で切断される。
本開示は、糖、例えば、3’の除去可能な保護基を有するリボースまたはデオキシリボースなどを含むヌクレオチドおよび/またはヌクレオシド(またはその任意の塩)に関する。いくつかの実施形態において、本開示のヌクレオチドおよび/またはヌクレオシドは、標識化核酸塩基、例えば、検出可能な部分を含む塩基を含む。いくつかの実施形態において、3’除去可能保護基は、以下のような少なくとも1つの基準、例えば、(i)3’除去可能な保護基を有するヌクレオチドまたはヌクレオシドを成長中のオリゴヌクレオチドに正確かつ効率的に組み込む酵素(例えば、ポリメラーゼ)の能力;(ii)迅速かつ定量的な脱保護のための穏やかな条件の利用可能性、および(iii)脱保護ステップに続いてオリゴマー合成を再開する酵素の能力である。いくつかの実施形態において、3’保護基は、非還元条件下で(例えば、過酸化水素または別の酸化剤を使用して)除去される。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
「保護基」は、構造:
Z1およびZ2は、独立して、H、C1~C4アルキル基、または任意選択的に1つまたは複数のヒドロキシル基で置換された5-~6-員のアリール基であり;
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)であり;および
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-員または6-員のアリール基である。)を有する。〕。
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
「スペーサー」は、1個と16個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に1つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基もしく芳香族基であり;
「ブロッキング部分」は、1個と20個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に1つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基もしく芳香族基であり、ただし、「ブロッキング部分」は、アジド基、イソニトリル基、シアノ基、O、N、S、またはSeから選択される少なくとも一つのヘテロ原子を有する5-~8員のヘテロシクロアルキル基、置換または非置換の1,4-エポキシ-1,4-ジヒドロナフタレン、または構造:
Z1およびZ2は、独立して、H、C1~C4アルキル基、または任意選択的に1つまたは複数のヒドロキシル基で置換された5-~6-員のアリール基であり;
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)である。)を有する基であり;および
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-員または6-員のアリール基であり;
ただし、「ブロッキング部分」が-N3である場合、「スペーサー」は-CH2-ではない。〕。
いくつかの実施形態において、「スペーサー」は、1個と12個との間の炭素原子を有し、任意選択的に、カルボニル基を含む、直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族基である。他の実施形態において、「スペーサー」は、1個と10個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的にケトン、エステルまたはアミドを含む脂肪族基であり;さらに他の実施形態において、「スペーサー」は、1個と6個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、カルボニル基、例えばケトン、エステル、炭酸塩、カルバメート、ウレタン、またはアミドを含む脂肪族基である。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
R1は、結合、-CH2-、-C(O)-O-、-C(O)-NRa-、または-C(O)-Rx-であり;
R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和C1~C6アルキル基、C5~C6アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q--(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
R4は、結合、置換または非置換の5-~7-員のアリール基、-CH=CH-、置換または非置換の5-または6-員のヘテロシクロアルキル基、または-O-C(O)-アリール-であり;
R5は、-(C(Ra)(Rb))n-N3、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-(C(Ra)(Rb))n-CN、互いに1、3の位置にある2つの硫黄原子を含む5-~8-員のシクロアルキル基、または、構造:
Z1およびZ2は、独立して、H、C1~C4アルキル基、または任意選択的に1つまたは複数のヒドロキシル基で置換された5-~6-員のアリール基であり;
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)である。)を有する基であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-員または6-員のアリール基であり;
Rxは、置換または非置換の5-員または6-員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり;
nは、0または1~3の範囲の整数であり;および
pおよびqは、それぞれ独立して、1~3の範囲の整数であり;
ただし、R1およびR4がいずれも結合であり、かつ、R2およびR3がいずれもHである場合、R5は、アジドではない。〕。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;および
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは0または1~5の範囲の整数である。)である。〕。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和のC1~C6アルキル基、C5~C6アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q--(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
R4は、結合、置換または非置換の5-~7-員のアリール基、-CH=CH-、置換または非置換の5-または6-員のヘテロシクロアルキル基、または-O-C(O)-アリール-であり;
R5は、-(C(Ra)(Rb))n-N3、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-(C(Ra)(Rb))n-CN、互いに1、3の位置にある2つの硫黄原子を含む5-~8-員のシクロアルキル基、または、構造:
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)である。)を有する基であり;
R7はOまたはNRaであり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-員または6-員のアリール基であり;
nは、0または1~3の範囲の整数であり;および
pおよびqは、それぞれ独立して、1~3の範囲の整数である。)を有する。〕。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
R8はO、NRa、またはSであり;
R9はH、ハロゲン、C1~C4アルキル基、-C(O)-Ra、-N(Ra)(Rb)、または-NO2である。
R11およびR12は、それぞれ独立して、Hまたは直鎖状または分岐状のC1~C4アルキル基であり;
R13は結合、-CH2-または-CH2-CH2-であり;
R14は-N3、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-(C(Ra)(Rb))n-CN、または-B(OZ1)(OZ2)(式中、Z1およびZ2は、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、またはtertブチルから選択される。)であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
Reは、HまたはC1~C4アルキルであり;および
nは0または1~3の範囲の整数であり;
いくつかの実施形態において、複素環は2,3位または2,5位で置換されており、例えば、-C(R11)(R12)-R13-R14は、複素環の3位または5位に存在する。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和のC1~C6アルキル基、C5~C6アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q--(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
R4は、結合、置換または非置換の5-~7-員のアリール基、-CH=CH-、置換または非置換の5-または6-員のヘテロシクロアルキル基、または-O-C(O)-アリール-であり;および
R5は、-(C(Ra)(Rb))n-N3、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-(C(Ra)(Rb))n-CN、互いに1、3の位置にある2つの硫黄原子を含む5-~8-員のシクロアルキル基、または、構造:
Z1およびZ2は、独立して、H、C1~C4アルキル基、または任意選択的に1つまたは複数のヒドロキシル基で置換された5-~6-員のアリール基であり;
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)である。)を有する基であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-または6-員のアリール基であり;
nは、0または1~3の範囲の整数であり;および
pおよびqは、それぞれ独立して、1~3の範囲の整数であり;
ただし、R2およびR3がHであり、R4が結合である場合、R5はアジドではない。)有する基である。〕。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
R1は、結合、-CH2-、-C(O)-O-、-C(O)-NRa-、または-C(O)-Rx-であり;
R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和のC1~C6アルキル基、C5~C6アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q--(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
R5は、-(C(Ra)(Rb))n-N3、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-(C(Ra)(Rb))n-CN、互いに1、3の位置にある2つの硫黄原子を含む5-~8-員のシクロアルキル基、または、構造:
Z1およびZ2は、独立して、H、C1~C4アルキル基、または任意選択的に1つまたは複数のヒドロキシル基で置換された5-~6-員のアリール基であり;
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)である。)を有する基であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-または6-員のアリール基であり;
Rxは、置換または非置換の5-員または6-員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり;
nは、0または1~3の範囲の整数であり;および
pおよびqは、それぞれ独立して、1~3の範囲の整数であり;
ただし、R1が結合であり、R2およびR3がいずれもHである場合、R5はアジドではないである。〕。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
R1は、結合、-CH2-、-C(O)-O-、-C(O)-NRa-、または-C(O)-Rx-であり;
R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和のC1~C6アルキル基、C5~C6アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q--(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
R4は、結合、置換または非置換の5-~7-員のアリール基、-CH=CH-、置換または非置換の5-または6-員のヘテロシクロアルキル基、または-O-C(O)-アリール-であり;
Z1およびZ2は、独立して、H、C1~C4アルキル基、または任意選択的に1つまたは複数のヒドロキシル基で置換された5-~6-員のアリール基であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
Rxは、置換または非置換の5-員または6-員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり;
nは、0または1~3の範囲の整数であり;および
pおよびqは、それぞれ独立して、1~3の範囲の整数である。〕。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;および
Z1およびZ2は、独立して、H、C1~C4アルキル基、または任意選択的に1つまたは複数のヒドロキシル基で置換された5-~6-員のアリール基であり;
いくつかの実施形態において、Z1およびZ2は、独立して、H、メチルまたはエチルから選択される。いくつかの実施形態において、Z1およびZ2は両方Hである。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;および
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは0または1~5の範囲の整数である。)である。〕。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
R1は、結合、-CH2-、-C(O)-O-、-C(O)-NRa-、または-C(O)-Rx-であり;
R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和のC1~C6アルキル基、C5~C6アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q--(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
R4は結合、置換または非置換の5-員または6-員のアリール基、-CH=CH-、または置換または非置換の5-員または6-員のヘテロシクロアルキル基であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
Rxは、置換または非置換の5-員または6-員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり;
nは、0または1~3の範囲の整数であり;および
pおよびqは、それぞれ独立して、1~3の範囲の整数である。〕。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
R1は、結合、-CH2-、-C(O)-O-、-C(O)-NRa-、または-C(O)-Rx-であり;
R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和のC1~C6アルキル基、C5~C6アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q--(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
Rxは、置換または非置換の5-員または6-員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり;
nは、0または1~3の範囲の整数であり;および
pおよびqは、それぞれ独立して、1~3の範囲の整数である。〕。
いくつかの実施形態において、R1は結合であり、R2またはR3の少なくとも一方はHである。
いくつかの実施形態において、R1は-CH2-である。いくつかの実施形態において、R1は-CH2-であり、R2またはR3の少なくとも一方はHである。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
R1は、結合、-CH2-、-C(O)-O-、-C(O)-NRa-、または-C(O)-Rx-であり;
R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和のC1~C6アルキル基、C5~C6アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q--(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
R4は、結合、置換または非置換の5-~7-員のアリール基、-CH=CH-、置換または非置換の5-または6-員のヘテロシクロアルキル基、または-O-C(O)-アリール-であり;
Z1およびZ2は、独立して、H、C1~C4アルキル基、または任意選択的に1つまたは複数のヒドロキシル基で置換された5-~6-員のアリール基であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
Rxは、置換または非置換の5-員または6-員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり;
nは、0または1~3の範囲の整数であり;および
pおよびqは、それぞれ独立して、1~3の範囲の整数である。〕。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
R1は、結合、-CH2-、-C(O)-O-、-C(O)-NRa-、または-C(O)-Rx-であり;
R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和のC1~C6アルキル基、C5~C6アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q--(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
R4は、結合、置換または非置換のフェニル基、-CH=CH-、または置換または非置換の5-または6-員のヘテロシクロアルキル基、または-O-C(O)-アリール-であり;
R10はOH、-(C(Ra)(Rb))u-OH、-(C(Ra)(Rb))u-C(O)H、または相互に1,3の位置にある2つの-S(O)-基を含む5-~8-員のシクロアルキル基であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
Rxは、置換または非置換の5-員または6-員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり;
nは、0または1~3の範囲の整数であり;
pおよびqは、それぞれ独立して、1~3の範囲の整数であり;および
uは、1~3の範囲の整数である。〕。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
R1は、結合、-CH2-、-C(O)-O-、-C(O)-NRa-、または-C(O)-Rx-であり;
R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和のC1~C6アルキル基、C5~C6アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q--(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
R8はO、NRa、またはSである。
R9はH、ハロゲン、C1~C4アルキル基、-C(O)-Ra、-N(Ra)(Rb)、または-NO2である;
R11およびR12は、それぞれ独立して、Hまたは直鎖状または分岐状のC1~C4アルキル基であり;
R13は結合、-CH2-、または-CH2-CH2-であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
Reは、HまたはC1~C4アルキル基であり;
Rxは、置換または非置換の5-員または6-員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり;
nは、0または1~3の範囲の整数であり;
pおよびqは、それぞれ独立して、1~3の範囲の整数であり;
uは、1~3の範囲の整数である。〕。
ここに記載されるように、本開示のヌクレオチドまたはヌクレオシドは、核酸塩基またはタグ付き核酸塩基を含み得る。「核酸塩基」とは、天然に存在する塩基および合成塩基を含む、オリゴヌクレオチド(例えば、RNAまたはDNA分子)内に含めるのに適した任意の窒素塩基を意味する。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルまたはそれらの誘導体または類似体から選択される。他の実施形態において、核酸塩基は、7-デアザグアニン、7-デアザアデニンまたは5-メチルシトシンである。
R15は核酸塩基であり;
「リンカー」は、1個と50個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に1つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基もしく芳香族基であり;
「標識」は、検出可能な種を含む。
R15は、核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
「保護基」は、構造:
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-である。)を有する基であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)であり;
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-員または6-員のアリール基である。)を有する基であり;
「リンカー」は、1個と50個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に1つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基もしく芳香族基であり;および
「標識」は、ここに記載されている種のいずれかを含む、検出可能な種である。〕。
R15は、核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
「スペーサー」は、1個と16個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に1つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基もしく芳香族基であり;
「ブロッキング部分」は、1個と20個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に1つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基もしく芳香族基であり、ただし、「Blocking Moiety」は、アジド基、イソニトリル、シアノ基、O、N、S、またはSeから選択される少なくとも一つのヘテロ原子を有する5-~8員のヘテロシクロアルキル基、置換または非置換の1,4-エポキシ-1,4-ジヒドロナフタレン、または構造:
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)であり;
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-または6-員のアリール基である。)を有する基であり;
「リンカー」は、1個と50個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に1つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基もしく芳香族基であり;および
「標識」は、ここに記載されている種のいずれかを含む、検出可能な種であり、
ただし、「ブロッキング部分」が-N3である場合、「スペーサー」は-CH2-ではない。〕。
本開示はまた、ここに記載の保護されたヌクレオチドのいずれかを脱保護する方法を提供する。ここに記載のように成長中のオリゴヌクレオチドに保護ヌクレオチドを組み込んだ後、保護ヌクレオチドを脱保護して、脱保護ヌクレオチドを生成することができる。ヌクレオチドが標識またはラベルを含み、脱保護が標識またはラベルの除去の前または後に起こり得る実施形態において。他の実施形態では、脱保護は、存在する場合、標識またはラベルの除去と同時に起こり得る。
本開示はまた、ナノポア配列決定方法を提供し、それにより、この方法は、式(I)、(II)、(IIIA)、(IIIB)、(IIIC)、(IIID)、(IV)、(VA)、(VB)、(VC)、(VD)、(VIIIA)、(VIIIB)、(VIIIC)、(VIIID)、(VIIIE)、および(VIIIF)のヌクレオチド(またはその塩)のいずれかを含む、ここに記載のヌクレオチドまたは標識化ヌクレオチドのいずれかを利用する。
例えばDNAまたはRNAなどのポリヌクレオチドのナノポア配列決定は、ポリヌクレオチド配列の鎖配列決定および/またはエキソ配列決定によって達成することができる。いくつかの実施形態において、鎖配列決定は、ポリヌクレオチドテンプレートのヌクレオチドがナノポアを通るときに、サンプルポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド塩基が直接決定される方法を含む。いくつかの実施形態において、ナノポアベースのヌクレオチド酸配列決定は、酵素によって成長中の鎖に組み込むことができる4つのヌクレオチド類似体の混合物を使用する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、それを膜の微細な細孔に通すことによって配列決定され得る。いくつかの実施形態において、塩基は、それらが膜の一方の側から他方の側に細孔を通って流れるイオンに影響を与える方法によって識別され得る。いくつかの実施形態において、1つのタンパク質分子は、DNAヘリックスを2つの鎖に「解凍(unzip)」することができる。2番目のタンパク質は、膜に細孔を作り、「アダプター」分子を保持することができる。細孔を通るイオンの流れは電流を生成することでき、それによって各塩基はイオンの流れを異なる程度に遮断し、電流を変化させることができる。アダプター分子は、塩基を電子的に識別するのに十分な時間、塩基を所定の位置に保つことができる(PCT公開番号、国際公開第2018/034745号パンフレット、および米国特許出願公開番号第2018/0044725号および同第2018/0201992号を参照されたい。これらの開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。)。
本開示は、ナノポア配列決定に使用されるオリゴヌクレオチドなどのオリゴマーを合成する方法を提供し、オリゴマーは、ここに開示される保護ヌクレオチドまたは保護標識化ヌクレオチドに由来する。
本開示はまた、合成による配列決定の方法(SBS)を提供し、それにより、この方法は、式(I)、(II)、(IIIA)、(IIIB)、(IIIC)、(IIID)、(IV)、(VA)、(VB)、(VC)、(VD)、(VIIIA)、(VIIIB)、(VIIIC)、(VIIID)、(VIIIE)、および(VIIIF)のヌクレオチド(またはその塩)のいずれかを含む、ここに記載のヌクレオチドまたは標識化ヌクレオチドのいずれかを利用する。SBS技術は一般に、テンプレート鎖に対するヌクレオチドの反復的付加による新生核酸鎖の酵素的伸長を伴う。各ヌクレオチドの追加は、テンプレート鎖の1つまたは数塩基を照会する。SBSの1つの例示的なタイプでは、サイクル配列決定は、例えば、切断可能または光退色性の染料ラベルを含む可逆的ターミネーターヌクレオチドの段階的添加によって達成される(例えば、PCT出願公開番号、国際公開第91/06678号パンフレットを参照。その開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。)。いくつかの実施形態において、1つまたは複数の保護標識化ヌクレオチドは、5’~3’方向に伸長するポリヌクレオチド鎖に連続的に付加されて、配列決定されるテンプレート核酸に相補的な伸長ポリヌクレオチドを形成する。付加された保護標識化ヌクレオチドの1つまたは複数に存在する塩基の同一性は、各ヌクレオチドの取り込み後などの検出または画像化ステップで決定することができる。
上記の30mgのボロネート-カーボネート-DMT-dT生成物を、3mLのアセトニトリルに溶解して、10mg/mL(約12.5mM)の溶液を作った。次に、以下の反応を調製した:
10μLの10mg/mLボロネート-カーボネート-DMT-dTを、90μLの20mM重炭酸ナトリウム緩衝液pH~8.5に添加した。ボロネート-カーボネート-DMT-dTの水への溶解度が低いため、溶液は濁った。2μLの1%aqH2O2を加え、反応物を1分間ボルテックスした。溶液は再び透明になった。10μLを1mLの水に希釈し、LC-MS(ネガティブモード)で分析した。543の主要な質量ピークは、化合物のマスキング解除の、DMT-dTに戻るまでを示している。出発物質は観察されなかった。
10μLの10mg/mLボロネート-カーボネート-DMT-dTを、90μLの20mM重炭酸ナトリウム緩衝液pH~8.5に添加した。溶液が濁った。2μLの水を加え、反応液を10分間ボルテックスした。溶液は依然として濁っていたが、程度は低かった。10μLを1mLの水に希釈し、LC-MS(ネガティブモード)で分析した。2つの主要な質量ピークが観察された:出発物質からの803およびピナコールエステルの加水分解からの721。
10mmolのビス(ヒドロキシメチル)化合物1を8mLの乾燥ピリジンに溶解する。2mLの乾燥ピリジンに溶解した9mmolのtert-ブチルジメチルシリルクロリドをゆっくりと加え、反応物を3日間撹拌する。混合物を真空下で蒸発乾固し、50mLのCH2Cl2に溶解する。それを50mLの水で洗浄し、水溶液を50mLのCH2Cl2で抽出する。すべての有機画分を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮する。生成物2を、溶媒としてヘキサン/酢酸エチルを使用するシリカゲルクロマトグラフィーによってさらに精製する。この例では、Rは-CNまたは-C(O)O-Etであり得る。
5’-O-DMT-N3-アニソイル-チミジン9(648mg、1.00mmol)を、アルゴン雰囲気下、活性化モレキュラーシーブ(4A)の存在下で乾燥MeCN(20mL)に溶解した。K2CO3(415mg、3.00mmol)を加え、懸濁液を室温で30分間撹拌した。2-(クロロメチル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン(351μL、442mg、2.00mmol)を加え、反応混合物を60℃で撹拌した。24時間後、追加のK2CO3(138mg、1.00mmol)およびアルキルクロリド(176μl、222mg、1.00mmol)を加えた。60℃での撹拌をさらに16時間続けた。混合物を室温に冷却し、ろ過し、真空中で濃縮した。粗生成物をn-ヘキサン/酢酸エチル(1/2→1/4)およびジクロロメタン/メタノール(2/1)を移動相として使用するシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーで生成した。RP-HPLCによる最終精製により、凍結乾燥後、所望の3’-O-メチルボロン酸-5’-O-DMT-N3-アニソイル-チミジン10(167mg、0.23mmol、23%)を白色固体として得た。
30mMのHEPES、pH7.5中のdATPブロック(アジドメチル)安息香酸エステル17の1mM溶液を、15mMのTCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン)で処理し、室温でインキュベートした。LCMS分析では、水中の反応混合物の10倍希釈液を、100mMの酢酸トリエチルアンモニウム勾配中のアセトニトリルを使用して分析し、260nMでネガティブモードESI-MSで検出する。切断前に、ブロックdATPは、分子量649.03(ネガティブモード)のLC勾配で4分で溶出する。アジドが還元され、分子内の環化と脱保護が行われると、放出されたdATPは、分子量489.99(ネガティブモード)のLCMS勾配において1.8分で溶出する。
ポリメラーゼによる三リン酸7の組み込みの効率は、挿入部位に相補的塩基を含む15-merのプライマーと25-merのテンプレートを使用した単一ヌクレオチド挿入実験で調べることができる。挿入の成功は、LC-MS分析メソッドを使用して分析される。
単一塩基の挿入実験混合物は、不特定の量のエステラーゼに約1分と約30分との間供される。完全なマスキング解除の成功は、LC-MS分析法によって検証された。
本開示の別の態様では、式(IIIA)のヌクレオチドまたはその塩である:
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは0または1~5の範囲の整数である。)である。
R1は、結合であり;
・ R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和のC1~C6アルキル基、C5~C6アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q--(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
R4は、結合、置換または非置換の5-~7-員のアリール基、-CH=CH-、置換または非置換の5-または6-員のヘテロシクロアルキル基、または-O-C(O)-アリール-であり;
R5は、-(C(Ra)(Rb))n-N3、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-(C(Ra)(Rb))n-CN、互いに1、3の位置にある2つの硫黄原子を含む5-~8-員のシクロアルキル基、または、構造:
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)である。)を有する基であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-または6-員のアリール基であり;
Rxは、置換または非置換の5-員または6-員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり;
nは、0または1~3の範囲の整数であり、
pおよびqは、それぞれ独立して、1~3の範囲の整数であり;。
ただし、R1およびR4がいずれも結合であり、かつ、R2およびR3がいずれもHである場合、R5は、アジドではない。〕。
いくつかの実施形態において、R4は、結合である。いくつかの実施形態において、R4は結合であり、R2またはR3はHである。
いくつかの実施形態において、R4は6員のアリール基である。いくつかの実施形態において、R4は6員のアリール基であり、R2またはR3の少なくとも一方はHである。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは0または1~5の範囲の整数である。)である。
R1は-C(O)-O-であり;
R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和のC1~C6アルキル基、C5~C6アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q--(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
R4は、結合、置換または非置換の5-~7-員のアリール基、-CH=CH-、置換または非置換の5-または6-員のヘテロシクロアルキル基、または-O-C(O)-アリール-であり;
R5は、-(C(Ra)(Rb))n-N3、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-(C(Ra)(Rb))n-CN、互いに1、3の位置にある2つの硫黄原子を含む5-~8-員のシクロアルキル基、または、構造:
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)である。)を有する基であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-または6-員のアリール基であり;
Rxは、置換または非置換の5-員または6-員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり;
nは、0または1~3の範囲の整数であり;および
pおよびqは、それぞれ独立して、1~3の範囲の整数であり;
ただし、R1およびR4がいずれも結合であり、かつ、R2およびR3がいずれもHである場合、R5は、アジドではない。〕。
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは0または1~5の範囲の整数である。)である。
R1は-C(O)-Rx-であり;
R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和のC1~C6アルキル基、C5~C6アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q--(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
R4は、結合、置換または非置換の5-~7-員のアリール基、-CH=CH-、置換または非置換の5-または6-員のヘテロシクロアルキル基、または-O-C(O)-アリール-であり;
R5は、-(C(Ra)(Rb))n-N3、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-(C(Ra)(Rb))n-CN、互いに1、3の位置にある2つの硫黄原子を含む5-~8-員のシクロアルキル基、または、構造:
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)である。)を有する基であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-または6-員のアリール基であり;
Rxは、置換または非置換の5-員または6-員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり;
nは、0または1~3の範囲の整数であり;および
pおよびqは、それぞれ独立して、1~3の範囲の整数であり;
ただし、R1およびR4がいずれも結合であり、かつ、R2およびR3がいずれもHである場合、R5は、アジドではない。〕。
Claims (84)
- 式(IIIA):
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは0または1~5の範囲の整数である。)であり;
R1は、結合、-CH2-、-C(O)-O-、-C(O)-NRa-、または-C(O)-Rx-であり;
R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和のC1~C6アルキル基、C5~C6アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q-(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
R4は、結合、置換または非置換の5-~7-員のアリール基、-CH=CH-、置換または非置換の5-または6-員のヘテロシクロアルキル基、または-O-C(O)-アリール-であり;
R5は、-(C(Ra)(Rb))n-N3、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-(C(Ra)(Rb))n-CN、互いに1、3の位置にある2つの硫黄原子を含む5-~8-員のシクロアルキル基、または、構造:
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)である。)を有する基であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-員または6-員のアリール基であり;
Rxは、置換または非置換の5-員または6-員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり;
nは、0または1~3の範囲の整数であり;
pおよびqは、それぞれ独立して、ゼロまたは1~3の範囲の整数であり;
ただし、R1およびR4がいずれも結合であり、かつ、R2およびR3がいずれもHである場合、R5は、アジドではない。〕の、ヌクレオチドまたはその塩。 - Z1またはZ2の少なくとも一方が、Hである、請求項2に記載のヌクレオチド。
- 両方のZ1およびZ2がHである、請求項2に記載のヌクレオチド。
- R1が、結合である、請求項1から4のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
- R4が、結合である、請求項5に記載のヌクレオチド。
- R2またはR3の少なくとも一方がHである、請求項6に記載のヌクレオチド。
- R4が、6-員のアリール基である、請求項5に記載のヌクレオチド。
- R2またはR3の少なくとも一方がHである、請求項8に記載のヌクレオチド。
- R1が、-C(O)-O-である、請求項1から4のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
- R4が、6-員のアリール基である、請求項10に記載のヌクレオチド。
- 6-員のアリール基が、少なくとも一つの置換基を含み、該少なくとも一つの置換基は、メチルおよびエチルからなる群から選択される、請求項11に記載のヌクレオチド。
- R2またはR3の少なくとも一方がHである、請求項11に記載のヌクレオチド。
- R4が、-CH=CH-である、請求項5に記載のヌクレオチド。
- R1が、結合である、請求項1から4のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
- R5が、-(C(Ra)(Rb))n-CNまたは-(C(Ra)(Rb))n-N+C-である、請求項15に記載のヌクレオチド。
- R2が、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q-(Ra)または-C(O)-ORa-(式中、少なくとも一つのRaは、C1~C6アルキル基である。)である、請求項15に記載のヌクレオチド。
- R1が、-C(O)-Rx-である、請求項1から4のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
- R5が、-(C(Ra)(Rb))n-N3である、請求項19に記載のヌクレオチド。
- R5が、置換または非置換の1,4-エポキシ-1,4-ジヒドロナフタレンから誘導される、請求項1から4のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
- R1が、-CH2-であり、R5が、-B(OZ1)(OZ2)である、請求項1から4のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
- 式(I):
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
「保護基」は、構造:
Z1およびZ2は、独立して、H、C1~C4アルキル基、または任意選択的に1つまたは複数のヒドロキシル基で置換された5-~6-員のアリール基である。)であり;
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)であり;および
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-員または6-員のアリール基である。)を有する。〕の、ヌクレオチドまたはその塩。 - 「保護基」が、-B(OZ1)(OZ2)である、請求項23に記載のヌクレオチド。
- Z1およびZ2が、独立して、H、メチルおよびエチルからなる群から選択される、請求項24に記載のヌクレオチド。
- 「保護基」が、-B(OZ1)(OH)である、請求項23に記載のヌクレオチド。
- Z1が、H、メチルおよびエチルからなる群から選択される、請求項26に記載のヌクレオチド。
- 「保護基」が、-B(OH)2である、請求項23に記載のヌクレオチド。
- 式(VA):
Xは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
R1は、結合、-CH2-、-C(O)-O-、-C(O)-NRa-、または-C(O)-Rx-であり;
R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和のC1~C6アルキル基、C5~C6アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q-(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
R4は、結合、置換または非置換の5-~7-員のアリール基、-CH=CH-、置換または非置換の5-または6-員のヘテロシクロアルキル基、または-O-C(O)-アリール-であり;
式中、Z1およびZ2は、独立して、HまたはC1~C4アルキル基であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
Rxは、置換または非置換の5-員または6-員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり;
nは、0または1~3の範囲の整数であり;および
pおよびqは、それぞれ独立して、ゼロまたは1~3の範囲の整数である。〕。 - Z1またはZ2のうちの少なくとも一方がHである、請求項29に記載のヌクレオチド。
- 両方のZ1およびZ2がHである、請求項29に記載のヌクレオチド。
- R1が、結合である、請求項29から31のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
- R4が、結合である、請求項32に記載のヌクレオチド。
- R2またはR3の少なくとも一方がHである、請求項33に記載のヌクレオチド。
- R4が、6-員のアリール基である、請求項34に記載のヌクレオチド。
- R2またはR3の少なくとも一方がHである、請求項35に記載のヌクレオチド。
- R1が、-C(O)-O-である、請求項29から31のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
- R4が、6-員のアリール基である、請求項37に記載のヌクレオチド。
- 6-員のアリール基が、少なくとも一つの置換基を含み、該少なくとも一つの置換基は、メチルおよびエチルからなる群から選択される、請求項38に記載のヌクレオチド。
- R1が-CH2-であり、両方のZ1およびZ2がHである、請求項29に記載のヌクレオチド。
- ナノポアを使用して核酸サンプルを配列決定する方法であって:
(a)ナノポアに結合した単一のポリメラーゼを用いて重合反応を実行することであって、重合反応は、核酸サンプルに由来する一本鎖核酸分子に相補的な成長中のポリヌクレオチド鎖に少なくとも4つの異なる3’保護ヌクレオチドの1つを組み込み、少なくとも4つの異なる3’保護ヌクレオチドの個々の3’保護ヌクレオチドは、構造:
Z1およびZ2は、独立して、H、C1~C4アルキル基、任意選択的に1つまたは複数のヒドロキシル基で置換された5-~6-員のアリール基であり;
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)であり;および
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-員または6-員のアリール基である。)、
重合反応を実行することと;
(b)ナノポアを使用して、成長中のポリヌクレオチド鎖への3’保護ヌクレオチドまたはその副生成物の組み込みを検出することと;
(c)3’保護ヌクレオチドまたはその副生成物の組み込みを検出するステップと同時に、または、その後のいずれかで、3’保護ヌクレオチドを脱保護して、3’脱保護ヌクレオチドを提供することと、
を含む、方法。 - 少なくとも4つの異なる3’保護ヌクレオチドそれぞれが、異なる標識を含む、請求項41に記載の方法。
- 検出するステップが、少なくとも4つの異なる3’保護ヌクレオチドのそれぞれに関連する異なる標識を検出することを含む、請求項41から42のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも4つの異なる3’保護ヌクレオチドのそれぞれに関連する検出された標識をヌクレオチドのタイプと相関させることをさらに含む、請求項43に記載の方法。
- 重合中に検出された標識の評価に基づいて、核酸分子の核酸配列を生成することをさらに含む、請求項44に記載の方法。
- 脱保護が、3’保護ヌクレオチドを酸化剤と接触させることを含む、請求項41から45のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸分子を配列決定するための方法であって:
(a)複数の個別にアドレス指定可能なナノポアを含むチップを取得することであって、複数の個別にアドレス指定可能なナノポアのうちの各個別にアドレス指定可能なナノポアは、電極に隣接して配置された膜内のナノポアを含み、ナノポアは酵素に連結されており、各個別にアドレス指定可能なナノポアは、3’保護ヌクレオチドから放出される標識を検出するように適合されており、3’保護ヌクレオチドは、式(IIIA):
Xは、標識化核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
R1は、結合、-CH2-、-C(O)-O-、-C(O)-NRa-、または-C(O)-Rx-であり;
R2およびR3は、それぞれ独立して、H、飽和または不飽和のC1~C6アルキル基、C5~C6アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、-[(C(Ra)(Rb))p-O]q-(Ra)、-C(O)-ORa、-C(O)-N(Ra)(Rb)、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-CN、または-NO2であり;
R4は、結合、置換または非置換の5-~7-員のアリール基、-CH=CH-、置換または非置換の5-または6-員のヘテロシクロアルキル基、または-O-C(O)-アリール-であり;
R5は、-(C(Ra)(Rb))n-N3、-(C(Ra)(Rb))n-N+C-、-(C(Ra)(Rb))n-CN、互いに1、3の位置にある2つの硫黄原子を含む5-~8-員のシクロアルキル基、または、構造:
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)である。)を有する基であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して、Hまたは飽和C1~C6アルキル基であり;
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-員または6-員のアリール基であり;
Rxは、置換または非置換の5-員または6-員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり;
nは、0または1~3の範囲の整数であり;
pおよびqは、それぞれ独立して、ゼロまたは1~3の範囲の整数であり;
ただし、R1およびR4がいずれも結合であり、かつ、R2およびR3がいずれもHである場合、R5は、アジド基ではない。〕によって具体化される、取得することと;
(b)ナノポアに隣接または近接して核酸分子を方向付けることと;
(c)酵素を使用して、核酸分子の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチド鎖を生成するために、核酸分子に沿って3’保護ヌクレオチドを重合することと;
(d)ポリヌクレオチド鎖に3’保護ヌクレオチドを組み込んだ後、3’保護ヌクレオチドを脱保護することと;
(e)電極を使用して3’保護ヌクレオチドから放出された標識を検出することであって、放出された標識はナノポアを通ってまたはナノポアに近接して流れる、検出することと、
を含み、
ステップ(d)および(e)は、任意の順序で実行することができる、方法。 - ナノポアを使用して核酸サンプルを配列決定する方法であって:(a)ナノポアに結合した単一のポリメラーゼを用いて重合反応を実行することであって、重合反応は、請求項1から40のいずれか一項に記載の保護ヌクレオチドの少なくとも一つを、核酸サンプルに由来する一本鎖核酸分子に相補的な成長中のポリヌクレオチド鎖に組み込む、実行することと、ナノポアを使用して、成長中のポリヌクレオチド鎖への、少なくとも一つの保護ヌクレオチドまたはその副生成物の組み込みを検出することと、保護ヌクレオチドまたはその副生成物の組み込みを検出するステップと同時に、またはその後に、保護ヌクレオチドを脱保護して、3’脱保護ヌクレオチドを提供することと、を含む、方法。
- (a)
(i)少なくとも約250ウェル/mm2の密度で複数のウェルを有する半導体基板;および
(ii)複数のウェルのそれぞれに配置された電極、を含むバイオチップと;
(b)請求項1から40のいずれか一項に記載のヌクレオチドの少なくとも一つと、
を含む、キット。 - ヌクレオチドの少なくとも一つが、ホウ酸、ボロン酸、またはそれらの誘導体または類似体に由来する部分を含む、請求項49に記載のキット。
- (a)請求項29から40のいずれか一項に記載のヌクレオチドの少なくとも一つと、(b)酸化剤とを含む、キット。
- 塩基をさらに含む、請求項51に記載のキット。
- 請求項29から40のいずれか一項に記載のヌクレオチドの少なくとも一つが、第1の容器に提供され;酸化剤が、第2の容器に提供される、請求項51に記載のキット。
- (a)請求項1から40のいずれか一項に記載のヌクレオチドの少なくとも一つを含むリザーバと;
(b)(iii)少なくとも約250ウェル/mm2の密度で複数のウェルを有する半導体基板;および
(iv)複数のウェルのそれぞれに配置された電極、
を含むバイオチップと;
(c)リザーバのバイオチップに面する表面上に配置された対電極と、
を含む、アッセンブリ。 - ヌクレオチドの少なくとも一つが、ボロン酸、またはそれらの誘導体または類似体に由来する部分を含む、請求項54に記載のアッセンブリ。
- リザーバが、ヌクレオチドの脱保護に由来する副生成物をさらに含む、請求項54から55のいずれか一項に記載のアッセンブリ。
- 副生成物がホウ酸である、請求項56に記載のアッセンブリ。
- Z1およびZ2が、独立して、H、メチル、またはエチルである、請求項58に記載のヌクレオチド。
- Z1またはZ2の少なくとも一方がHである、請求項58に記載のヌクレオチド。
- 標識化核酸塩基が、PEGベースの標識、オリゴヌクレオチド標識、ポリペプチド標識、または蛍光標識を含む、請求項58から60のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
- 標識化核酸塩基が、切断可能なリンカーを含む、請求項58から61のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
- 標識化核酸塩基が、PEGベースの標識、オリゴヌクレオチド標識、ポリペプチド標識、または蛍光標識を含む、請求項63に記載のヌクレオチド。
- 標識化核酸塩基が、切断可能なリンカーを含む、請求項63から64のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
- 請求項58から66のいずれか一項に記載の少なくとも2つの異なるヌクレオチドを含み、該少なくとも2つの異なるヌクレオチドはそれぞれ、異なる標識化核酸塩基を含む、キット。
- 請求項58から66のいずれか一項に記載の少なくとも3つの異なるヌクレオチドを含み、該少なくとも3つの異なるヌクレオチドはそれぞれ、異なる標識化核酸塩基を含む、請求項67に記載のキット。
- 請求項58から66のいずれか一項に記載の、少なくとも4つの異なるヌクレオチドを含み、該少なくとも4つの異なるヌクレオチドはそれぞれ、異なる標識化核酸塩基を含む、請求項67に記載のキット。
- それぞれ異なる標識化核酸塩基が、異なるPEGベースの標識を含む、請求項68に記載のキット。
- それぞれ異なるPEGベースの標識が、異なる数のPEG繰り返し基を有する、請求項69に記載のキット。
- 複数のウェルを有する半導体基板を含むバイオチップ;および複数のウェルのそれぞれに配置された電極をさらに含む、請求項67から71のいずれか一項に記載のキット。
- 酸化剤または塩基のうちの少なくとも一つをさらに含む、請求項67から72のいずれか一項に記載のキット。
- 式(VIIIA)または(VIIID):
〔式中、
R15は、核酸塩基であり;
Yは、-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-OHまたは-O-P(O)(OH)-[O-P(O)(OH)]z-O-オリゴヌクレオチド(式中、zは、0または1~5の範囲の整数である。)であり;
「保護基」は、次の構造を有し:
「標識」は、ここに記載されている種のいずれかを含む、検出可能な種であり、
「スペーサー」は、1個と16個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に1つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基もしく芳香族基であり;
「ブロッキング部分」は、1個と20個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に1つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基もしく芳香族基であり、ただし、「ブロッキング部分」は、アジド基、イソニトリル基、シアノ基、O、N、S、またはSeから選択される少なくとも一つのヘテロ原子を有する5-~8員のヘテロシクロアルキル基、置換または非置換の1,4-エポキシ-1,4-ジヒドロナフタレン、または構造:
Q1およびQ3は、それぞれ独立して、結合、-C(Re)(Rf)-、または-C(O)-であり;
Q2は、結合、o-フェニレン、または-[C(Re)(Rf)]w-(式中、wは、1または2である。)である。)を有する基であり;および
ReおよびRfは、独立して、H、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の5-または6-員のアリール基であり;
ただし、「ブロッキング部分」が-N3である場合、「スペーサー」は-CH2-ではない。〕のいずれか一つを有する、ヌクレオチドまたはその塩。 - 「リンカー」が、切断可能な基を含む、請求項74に記載のヌクレオチド。
- 切断可能な基が、ジスルフィド部分、ジアゾベンゼン基、エステル基、1,2-ジオール基、ボロン酸基、またはp-アルコキシベンジル基を含む、請求項75に記載のヌクレオチド。
- 「標識」が、PEGベースのポリマー、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、または蛍光部分を含む、請求項74に記載のヌクレオチド。
- 「ブロッキング部分」が、-B(OZ1)(OZ2)を含む、請求項74から77のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
- Z1およびZ2が、独立して、H、メチルおよびエチルからなる群から選択される、請求項78に記載のヌクレオチド。
- 「ブロッキング部分」が、-B(OZ1)(OH)を含む、請求項74から77のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
- Z1が、H、メチルおよびエチルからなる群から選択される、請求項80に記載のヌクレオチド。
- 「ブロッキング部分」が、-B(OH)2または-B(OH)3 -を含む、請求項74に記載のヌクレオチド。
- 合成による配列決定を使用して標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法であって:(a)請求項1から40、58から66、および74から82のいずれか一項に記載の保護標識化ヌクレオチドを提供することと;(b)保護標識化ヌクレオチドを標的一本鎖ポリヌクレオチドの補体に組み込むことと;(c)ステップ(b)の保護標識化ヌクレオチドの標識を検出し、それによって組み込まれたヌクレオチドのタイプを決定する、標識を検出することと;(d)組み込まれた保護標識化ヌクレオチドを脱保護し、ステップ(b)の保護標識化ヌクレオチドの標識を除去することと;(e)任意選択的に、ステップ(b)~(d)を1回または複数回繰り返すこととを含み、それにより、標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する、方法。
- 請求項1から40、58から66、および74から82のいずれか一項に記載のヌクレオチドの、核酸分子の配列決定における使用。
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