CN107922968B - 用于单分子电子snp测定的聚合物标记的核苷酸 - Google Patents
用于单分子电子snp测定的聚合物标记的核苷酸 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107922968B CN107922968B CN201680030064.3A CN201680030064A CN107922968B CN 107922968 B CN107922968 B CN 107922968B CN 201680030064 A CN201680030064 A CN 201680030064A CN 107922968 B CN107922968 B CN 107922968B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- npp
- nucleic acid
- label
- nanopore
- analogue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 157
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 118
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title claims description 37
- 238000003556 assay Methods 0.000 title description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 160
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 107
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 claims abstract description 40
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 claims abstract description 40
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 claims abstract description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims abstract description 18
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 106
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 106
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 97
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 58
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 57
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 54
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 42
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 41
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 41
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 39
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 30
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 23
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 23
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 claims description 22
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 19
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 15
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 15
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 claims description 15
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 14
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 14
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 14
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 13
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 13
- PEHVGBZKEYRQSX-UHFFFAOYSA-N 7-deaza-adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1C=CN2 PEHVGBZKEYRQSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 11
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 8
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 7
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 7
- LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 7-deazaguanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1CC=N2 LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 6
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 5
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 claims description 5
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 claims description 5
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 claims description 5
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 3
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 claims description 3
- 238000009482 thermal adhesion granulation Methods 0.000 claims 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 32
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 133
- 239000000047 product Substances 0.000 description 72
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 62
- -1 6-methoxycoumarin N-hydroxysuccinimide Chemical compound 0.000 description 40
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 37
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 34
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 30
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 29
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 28
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 22
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 20
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 19
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 15
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 14
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 14
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 12
- IZKZIDXHCDIZKY-UHFFFAOYSA-N heptane-1,1-diamine Chemical compound CCCCCCC(N)N IZKZIDXHCDIZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 11
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 11
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 10
- 229940021013 electrolyte solution Drugs 0.000 description 10
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 9
- PFYXSUNOLOJMDX-UHFFFAOYSA-N bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) carbonate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)ON1C(=O)CCC1=O PFYXSUNOLOJMDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 8
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 8
- URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N ddTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 8
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 8
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 8
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 7
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 7
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YDHWWBZFRZWVHO-UHFFFAOYSA-H [oxido-[oxido(phosphonatooxy)phosphoryl]oxyphosphoryl] phosphate Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O YDHWWBZFRZWVHO-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 6
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 6
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 6
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 6
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 6
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 5
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 5
- HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N [[(2s,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1CC[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- HLUIWGCMLRIUNQ-UHFFFAOYSA-N tributylazanium;phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O.CCCC[NH+](CCCC)CCCC.CCCC[NH+](CCCC)CCCC.CCCC[NH+](CCCC)CCCC HLUIWGCMLRIUNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 4
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- YYULROINNKAMIB-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-azidobutanoate Chemical compound [N-]=[N+]=NCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YYULROINNKAMIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical class C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 3
- OTXOHOIOFJSIFX-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical class O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O)CC[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 OTXOHOIOFJSIFX-POYBYMJQSA-N 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-M hexanoate Chemical compound CCCCCC([O-])=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical group C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- QTMDXZNDVAMKGV-UHFFFAOYSA-L copper(ii) bromide Chemical compound [Cu+2].[Br-].[Br-] QTMDXZNDVAMKGV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- YMBCJWGVCUEGHA-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CC[N+](CC)(CC)CC YMBCJWGVCUEGHA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- PKOHVHWNGUHYRE-ZFWWWQNUSA-N (2s)-1-[2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound O=C([C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O PKOHVHWNGUHYRE-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- 125000006527 (C1-C5) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006729 (C2-C5) alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006730 (C2-C5) alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- UKDDQGWMHWQMBI-UHFFFAOYSA-O 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)CC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C UKDDQGWMHWQMBI-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- WKGZJBVXZWCZQC-UHFFFAOYSA-N 1-(1-benzyltriazol-4-yl)-n,n-bis[(1-benzyltriazol-4-yl)methyl]methanamine Chemical compound C=1N(CC=2C=CC=CC=2)N=NC=1CN(CC=1N=NN(CC=2C=CC=CC=2)C=1)CC(N=N1)=CN1CC1=CC=CC=C1 WKGZJBVXZWCZQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RQDKNFDEXBVLPV-UHFFFAOYSA-N 2-azidobutanoic acid Chemical compound CCC(C(O)=O)N=[N+]=[N-] RQDKNFDEXBVLPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical group OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- XQGIRPGAVLFKBJ-CIUDSAMLSA-N Ala-Asn-Lys Chemical compound N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O XQGIRPGAVLFKBJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FVSOUJZKYWEFOB-KBIXCLLPSA-N Ala-Gln-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)N FVSOUJZKYWEFOB-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- WEZNQZHACPSMEF-QEJZJMRPSA-N Ala-Phe-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 WEZNQZHACPSMEF-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- YVTHEZNOKSAWRW-DCAQKATOSA-N Arg-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YVTHEZNOKSAWRW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NMTANZXPDAHUKU-ULQDDVLXSA-N Arg-Tyr-Lys Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NMTANZXPDAHUKU-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- DXZNJWFECGJCQR-FXQIFTODSA-N Asn-Asn-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N DXZNJWFECGJCQR-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- AYKKKGFJXIDYLX-ACZMJKKPSA-N Asn-Gln-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AYKKKGFJXIDYLX-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- DXVMJJNAOVECBA-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DXVMJJNAOVECBA-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- OWUCNXMFJRFOFI-BQBZGAKWSA-N Asn-Gly-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O OWUCNXMFJRFOFI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ACKNRKFVYUVWAC-ZPFDUUQYSA-N Asn-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N ACKNRKFVYUVWAC-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- RCFGLXMZDYNRSC-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RCFGLXMZDYNRSC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VHQSGALUSWIYOD-QXEWZRGKSA-N Asn-Pro-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VHQSGALUSWIYOD-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- NPZJLGMWMDNQDD-GHCJXIJMSA-N Asn-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O NPZJLGMWMDNQDD-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- ZELQAFZSJOBEQS-ACZMJKKPSA-N Asp-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZELQAFZSJOBEQS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- AKPLMZMNJGNUKT-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asp-Cys Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O AKPLMZMNJGNUKT-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- ZXRQJQCXPSMNMR-XIRDDKMYSA-N Asp-Lys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N ZXRQJQCXPSMNMR-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- GYWQGGUCMDCUJE-DLOVCJGASA-N Asp-Phe-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GYWQGGUCMDCUJE-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- OZBXOELNJBSJOA-UBHSHLNASA-N Asp-Ser-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N OZBXOELNJBSJOA-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- JJQGZGOEDSSHTE-FOHZUACHSA-N Asp-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O JJQGZGOEDSSHTE-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- NAAAPCLFJPURAM-HJGDQZAQSA-N Asp-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O NAAAPCLFJPURAM-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- UXRVDHVARNBOIO-QSFUFRPTSA-N Asp-Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N UXRVDHVARNBOIO-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- 101710150820 Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229910021590 Copper(II) bromide Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010000543 Cytochrome P-450 CYP2C9 Proteins 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 102000003849 Cytochrome P450 Human genes 0.000 description 1
- 102100038742 Cytochrome P450 2A13 Human genes 0.000 description 1
- 102100029358 Cytochrome P450 2C9 Human genes 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- ZBKUIQNCRIYVGH-SDDRHHMPSA-N Gln-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N ZBKUIQNCRIYVGH-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- DOQUICBEISTQHE-CIUDSAMLSA-N Gln-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DOQUICBEISTQHE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- GTBXHETZPUURJE-KKUMJFAQSA-N Gln-Tyr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GTBXHETZPUURJE-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- SBYVDRJAXWSXQL-AVGNSLFASA-N Glu-Asn-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O SBYVDRJAXWSXQL-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- SJPMNHCEWPTRBR-BQBZGAKWSA-N Glu-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O SJPMNHCEWPTRBR-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- BRFJMRSRMOMIMU-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BRFJMRSRMOMIMU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- WJZLEENECIOOSA-WDSKDSINSA-N Gly-Asn-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)O WJZLEENECIOOSA-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- LRQXRHGQEVWGPV-NHCYSSNCSA-N Gly-Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN LRQXRHGQEVWGPV-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- YABRDIBSPZONIY-BQBZGAKWSA-N Gly-Ser-Met Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O YABRDIBSPZONIY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- LKJCZEPXHOIAIW-HOTGVXAUSA-N Gly-Trp-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)CN LKJCZEPXHOIAIW-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 208000033981 Hereditary haemochromatosis Diseases 0.000 description 1
- LYSVCKOXIDKEEL-SRVKXCTJSA-N His-Asn-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 LYSVCKOXIDKEEL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- UMBKDWGQESDCTO-KKUMJFAQSA-N His-Lys-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O UMBKDWGQESDCTO-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- CCUSLCQWVMWTIS-IXOXFDKPSA-N His-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CCUSLCQWVMWTIS-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- YERBCFWVWITTEJ-NAZCDGGXSA-N His-Trp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)N)O YERBCFWVWITTEJ-NAZCDGGXSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000957389 Homo sapiens Cytochrome P450 2A13 Proteins 0.000 description 1
- REJKOQYVFDEZHA-SLBDDTMCSA-N Ile-Asp-Trp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N REJKOQYVFDEZHA-SLBDDTMCSA-N 0.000 description 1
- HUORUFRRJHELPD-MNXVOIDGSA-N Ile-Leu-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N HUORUFRRJHELPD-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- MMEDVBWCMGRKKC-GARJFASQSA-N Leu-Asp-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N MMEDVBWCMGRKKC-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- WXDRGWBQZIMJDE-ULQDDVLXSA-N Leu-Phe-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O WXDRGWBQZIMJDE-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- QESXLSQLQHHTIX-RHYQMDGZSA-N Leu-Val-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QESXLSQLQHHTIX-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- FZIJIFCXUCZHOL-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN FZIJIFCXUCZHOL-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MRWXLRGAFDOILG-DCAQKATOSA-N Lys-Gln-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O MRWXLRGAFDOILG-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PBIPLDMFHAICIP-DCAQKATOSA-N Lys-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PBIPLDMFHAICIP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UETQMSASAVBGJY-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-His Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 UETQMSASAVBGJY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- IVFUVMSKSFSFBT-NHCYSSNCSA-N Lys-Ile-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN IVFUVMSKSFSFBT-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- QQPSCXKFDSORFT-IHRRRGAJSA-N Lys-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QQPSCXKFDSORFT-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N Lys-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- VVURYEVJJTXWNE-ULQDDVLXSA-N Lys-Tyr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VVURYEVJJTXWNE-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHGIWFGJIHTASW-FXQIFTODSA-N Met-Ala-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VHGIWFGJIHTASW-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- RIIFMEBFDDXGCV-VEVYYDQMSA-N Met-Thr-Asn Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O RIIFMEBFDDXGCV-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- WXOMTJVVIMOXJL-BOBFKVMVSA-A O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)OS(=O)(=O)OC[C@H]1O[C@@H](O[C@]2(COS(=O)(=O)O[Al](O)O)O[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H]2OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H]1OS(=O)(=O)O[Al](O)O Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)OS(=O)(=O)OC[C@H]1O[C@@H](O[C@]2(COS(=O)(=O)O[Al](O)O)O[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H]2OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H]1OS(=O)(=O)O[Al](O)O WXOMTJVVIMOXJL-BOBFKVMVSA-A 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- XZQYIJALMGEUJD-OEAJRASXSA-N Phe-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XZQYIJALMGEUJD-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- QSWKNJAPHQDAAS-MELADBBJSA-N Phe-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)O QSWKNJAPHQDAAS-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 1
- 102000017033 Porins Human genes 0.000 description 1
- QUBVFEANYYWBTM-VEVYYDQMSA-N Pro-Thr-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QUBVFEANYYWBTM-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 1
- 241000109329 Rosa xanthina Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- UGJRQLURDVGULT-LKXGYXEUSA-N Ser-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O UGJRQLURDVGULT-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- QPFJSHSJFIYDJZ-GHCJXIJMSA-N Ser-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO QPFJSHSJFIYDJZ-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- HEQPKICPPDOSIN-SRVKXCTJSA-N Ser-Asp-Tyr Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 HEQPKICPPDOSIN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N Ser-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- KZPRPBLHYMZIMH-MXAVVETBSA-N Ser-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KZPRPBLHYMZIMH-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- GYDFRTRSSXOZCR-ACZMJKKPSA-N Ser-Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O GYDFRTRSSXOZCR-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N Ser-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 1
- CTONFVDJYCAMQM-IUKAMOBKSA-N Thr-Asn-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N CTONFVDJYCAMQM-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- PQLXHSACXPGWPD-GSSVUCPTSA-N Thr-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PQLXHSACXPGWPD-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 1
- VXMHQKHDKCATDV-VEVYYDQMSA-N Thr-Asp-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O VXMHQKHDKCATDV-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- GKMYGVQDGVYCPC-IUKAMOBKSA-N Thr-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N GKMYGVQDGVYCPC-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- NIEWSKWFURSECR-FOHZUACHSA-N Thr-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NIEWSKWFURSECR-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- KBBRNEDOYWMIJP-KYNKHSRBSA-N Thr-Gly-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N)O KBBRNEDOYWMIJP-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 1
- XOWKUMFHEZLKLT-CIQUZCHMSA-N Thr-Ile-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XOWKUMFHEZLKLT-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 1
- VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N Thr-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- JLNMFGCJODTXDH-WEDXCCLWSA-N Thr-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O JLNMFGCJODTXDH-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- YJVJPJPHHFOVMG-VEVYYDQMSA-N Thr-Met-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O YJVJPJPHHFOVMG-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- ILUOMMDDGREELW-OSUNSFLBSA-N Thr-Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O ILUOMMDDGREELW-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- PWONLXBUSVIZPH-RHYQMDGZSA-N Thr-Val-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O PWONLXBUSVIZPH-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- YTYHAYZPOARHAP-HOCLYGCPSA-N Trp-Lys-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)O)N YTYHAYZPOARHAP-HOCLYGCPSA-N 0.000 description 1
- OJKVFAWXPGCJMF-BPUTZDHNSA-N Trp-Pro-Ser Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O OJKVFAWXPGCJMF-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- BARBHMSSVWPKPZ-IHRRRGAJSA-N Tyr-Asp-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O BARBHMSSVWPKPZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- JFDGVHXRCKEBAU-KKUMJFAQSA-N Tyr-Asp-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O JFDGVHXRCKEBAU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- TWAVEIJGFCBWCG-JYJNAYRXSA-N Tyr-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N TWAVEIJGFCBWCG-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- XQYHLZNPOTXRMQ-KKUMJFAQSA-N Tyr-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O XQYHLZNPOTXRMQ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- NOOMDULIORCDNF-IRXDYDNUSA-N Tyr-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O NOOMDULIORCDNF-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- OGPKMBOPMDTEDM-IHRRRGAJSA-N Tyr-Met-Ser Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N OGPKMBOPMDTEDM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- AUZADXNWQMBZOO-JYJNAYRXSA-N Tyr-Pro-Arg Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AUZADXNWQMBZOO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- NMANTMWGQZASQN-QXEWZRGKSA-N Val-Arg-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N NMANTMWGQZASQN-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- VFOHXOLPLACADK-GVXVVHGQSA-N Val-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VFOHXOLPLACADK-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- KDKLLPMFFGYQJD-CYDGBPFRSA-N Val-Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N KDKLLPMFFGYQJD-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- APEBUJBRGCMMHP-HJWJTTGWSA-N Val-Ile-Phe Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 APEBUJBRGCMMHP-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- AIWLHFZYOUUJGB-UFYCRDLUSA-N Val-Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 AIWLHFZYOUUJGB-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- PGQUDQYHWICSAB-NAKRPEOUSA-N Val-Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C(C)C)N PGQUDQYHWICSAB-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- YQYFYUSYEDNLSD-YEPSODPASA-N Val-Thr-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O YQYFYUSYEDNLSD-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- IECQJCJNPJVUSB-IHRRRGAJSA-N Val-Tyr-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O IECQJCJNPJVUSB-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010640 amide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 125000002029 aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 125000004369 butenyl group Chemical group C(=CCC)* 0.000 description 1
- 125000000480 butynyl group Chemical group [*]C#CC([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- HFNQLYDPNAZRCH-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O.OC(O)=O HFNQLYDPNAZRCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012650 click reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 125000000332 coumarinyl group Chemical group O1C(=O)C(=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 108010079547 glutamylmethionine Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010026364 glycyl-glycyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 208000020673 hypertrichosis-acromegaloid facial appearance syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical class NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000001499 laser induced fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108010047926 leucyl-lysyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010025153 lysyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920000137 polyphosphoric acid Polymers 0.000 description 1
- 108010079317 prolyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 125000004368 propenyl group Chemical group C(=CC)* 0.000 description 1
- 125000002568 propynyl group Chemical group [*]C#CC([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical group 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical group 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 102200071191 rs1799945 Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004557 single molecule detection Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010031491 threonyl-lysyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 108010071635 tyrosyl-prolyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 108010027345 wheylin-1 peptide Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
- G01N33/48721—Investigating individual macromolecules, e.g. by translocation through nanopores
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
- C12Q2565/631—Detection means characterised by use of a special device being a biochannel or pore
Abstract
本发明提供了具有单分子敏感性的、使用标记的核苷多磷酸类似物并利用纳米孔检测来检测核酸序列中某些位置处的核苷酸的身份或存在的方法，用于这种方法的核苷酸和引物缀合的纳米孔蛋白以及用于产生这种核苷酸和引物缀合的纳米孔蛋白的方法。
Description
本申请要求于2015年3月23日提交的第62/137,014号美国临时申请的权益，其通过引用整体并入本文。
在整个申请中，引用了各种出版物和专利。对于这些参考文献的完整引用可以在说明书的最后找到。这些出版物和专利的公开内容全部通过引用结合到本申请中，以更全面地描述本发明所属领域的状态。
本申请通过引用包含在名为“160322_0575_87413-A_Sequence_Listing_RBR.txt”的文件中存在的核苷酸和氨基酸序列，其大小为2千字节，于2016年3月21日以IBM-PC机格式创建，具有MS-Windows的操作系统可计算性，该文件作为本申请的一部分包含在2016年3月22日提交的文本文件中。
背景技术
单核苷酸多态性(SNP)是活的生物体的基因组中的单个碱基变异。SNP可发生在基因的编码序列和基因的非编码区域，包括调控区域。基因组编码序列中的SNP分为两类：同义和非同义。由于遗传密码的简并性，同义SNP不改变蛋白序列，而非同义SNP改变所编码的蛋白的氨基酸序列。非同义SNP进一步分为两类：错义和无义。错义突变是产生与野生型相比编码不同氨基酸的密码子的单核苷酸点突变，而无义突变是产生过早终止密码子的点突变。不在蛋白质编码区的SNP可以通过改变剪接序列和转录因子的结合活性以及基因表达来影响基因的功能。在所有的遗传变异中，SNP是人之间最常见的遗传差异。在第二代人类单体型图(Frazer等人，2007)中已经从人类基因组中表征了超过310万个SNP。因此，SNP是研究疾病发生机制的分子基础的重要生物标志物，为精密医学奠定基础。
人类基因组计划和全面的人类基因组序列图谱的构建(Lander等人，2001；Venter等人，2001和Wheeler等人，2008)为研究遗传变异提供了有价值的资源。这些遗传差异包括SNP、基因拷贝数变异、插入和缺失。已经将SNP确立为用于发现和表征疾病基因的独特生物标志物(Kwok 2000和Roses 2000)。这些研究工作需要使用具有高成本效益、高产量和高精度的技术来表征大量的SNP。以下DNA测序平台被广泛用于表征遗传变异：(1)4色荧光Sanger法(Smith等人，1986；Ju等人，1995；Ju等人，1996；Salas-Solano等人，1998和Kheterpal等人，1996)，(2)使用可切割荧光核苷酸可逆终止子合成测序(SBS)(Ju等人，2006和Bentley等人，2008)，(3)在聚合酶反应期间焦磷酸释放之后检测由一系列酶促反应引起的化学发光信号的SBS(焦磷酸测序)(Margulies等人，2005)，(4)在聚合酶反应期间电子检测释放质子的SBS(离子流式测序)(Rothberg等人，2011)和(5)单分子荧光SBS方法(Harris等人，2008，和Eid等人，2009)。然而，这些测序技术并不是为精确检测SNP而设计的，而且对于进行大规模SNP研究而言仍然过于昂贵。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和荧光发射是用于SNP分析的两种主要检测方法。以下回顾使用上述两种检测方法的SNP测定方法。
通过MALDI-TOF MS检测进行的SNP分析
MALDI-TOF MS测量目标分子的质量，以数字格式给出高度准确的结果。通过单碱基延伸(SBE)(Haff等人，1997；Tang等人，1999；Ross等人，1998；Fei等人，1998；和Griffin等人，2000)、杂交(Stoerker等人，2000；和Ross等人，1997)和侵入性切割(Griffin等人，1999和Lyamichev等人，1999)将其用于SNP检测。在通过聚合酶进行单碱基延伸的背景下，MALDI-TOF MS也已被用于基因表达分析和单拷贝DNA单体型分析(Ding et al.,PNAS 100:3059-3064,2003和Ding et al.,PNAS 100:7449-74532003)。
大多数多重SNP分析利用由聚合酶催化的SBE反应的特异性。被广泛使用的SNP表征方法之一使用SBE和MALDI-TOF MS检测。在这种方法中，基于目标基因的遗传变异来设计和合成寡核苷酸引物。引物的3'端紧挨着DNA模板的SNP位点退火。然后通过DNA聚合酶将与SNP位点互补的单个双脱氧核苷酸掺入到引物中。SNP的身份由从MALDI-TOF MS光谱获得的所产生的引物延伸产物的质量确定。
通过荧光检测进行SNP分析
已经使用荧光标记和检测开发了许多SNP基因分型方法，包括微阵列(Hartmann等人，2009)，PCR-RFLP分析(Chowdhury等人，2007)和TaqMan实时基因分型(Bai等人，2004)。使用荧光标记和检测有几个优点，其中包括各种强大的化学偶联方法来标记目标分子、对几个光物理参数(荧光寿命、发射和极化)的高检测灵敏度和多路复用的能力。已经开发了用于SNP检测的分子反转探针(MIP)方法(Hardenbol等人，2003)。在该方法中，基因座特异性DNA探针的连续延伸和连接在靶基因的多态性位点处产生环状。然后线性探针被选择性地降解，而含有等位基因信息的环状DNA探针被放大并利用荧光检测使用微阵列进行分析。使用这种方法，Hardenbol等人(2003)每次测定对超过1,000个SNP进行基因分型。MIP方法的优点是非常高的多路复用水平。然而，MIP需要许多酶促反应步骤和复杂的探针设计。
现有的多重SNP分析主要使用质谱检测或荧光标签和光学检测。先前的这些方法都不能提供单分子检测的灵敏度，而且都需要笨重的仪器。没有方法使用纳米孔来鉴定对应于目的核苷酸或SNP的分子或聚合物标签，从而鉴定目的核苷酸或SNP。
发明内容
本发明涉及一种用于鉴定核酸中一段连续核苷酸残基内的一个位置上的目的单核苷酸残基的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在施加的电压的条件下将核酸与下列物质一起孵育：
(1)纳米孔，
(2)寡核苷酸引物，其与纳米孔缀合并与核酸中3’方向上紧邻目的单核苷酸残基的多个核苷酸杂交，
(3)至少一种标记的终止核苷多磷酸(NPP)类似物，其中标记与NPP类似物的碱基或末端磷酸连接，和
(4)核酸聚合酶，
使得如果NPP类似物与目的单核苷酸残基互补，则NPP类似物被掺入引物中，并且连接至被掺入的NPP类似物的标记被拉入纳米孔；以及
b)通过纳米孔检测掺入引物中的NPP类似物的标记的信号，以鉴定掺入的NPP类似物；
从而鉴定目的单核苷酸残基。
本发明还涉及一种用于鉴定核酸中一段连续核苷酸残基内的一个位置上的目的单核苷酸残基的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在施加的电压的条件下将核酸与下列物质一起孵育:
(1)纳米孔，
(2)寡核苷酸引物，其与纳米孔缀合并与核酸中3’方向上紧邻目的单核苷酸的多个核苷酸杂交，
(3)至少一种标记的核苷多磷酸(NPP)类似物，其中标记与NPP类似物的碱基或末端磷酸连接，
(4)核酸聚合酶，和
(5)非催化型化合物，其使得互补的NPP类似物与核酸聚合酶和带有引物的模板(primed-template)瞬时结合但抑制结合的NPP类似物的掺入，
使得如果NPP类似物与目的单核苷酸互补，则NPP类似物瞬时结合至核酸聚合酶和带有引物的模板，并且连接至被瞬时结合的NPP类似物的标记被拉入纳米孔；以及
b)通过纳米孔检测瞬时结合至聚合酶和带有引物的模板的NPP类似物的标记的信号，以鉴定NPP类似物；
从而鉴定目的单核苷酸残基。
本发明还提供了用于实施本发明的任何方法的测定法。
本发明还提供了双脱氧核苷多磷酸(ddNPP)类似物，其包含与其末端磷酸连接的标记，其中多磷酸基团包含3-10个磷酸单元。
本发明还提供了包含与其末端磷酸连接的标记的脱氧核苷多磷酸(dNPP)类似物，其中多磷酸基团包含3-10个磷酸单元。
本发明还提供了包含与其末端磷酸连接的标记的核糖核苷多磷酸(rNPP)类似物，其中多磷酸基团包含3-10个磷酸单元。
本发明还提供了包含连接于其末端磷酸的香豆素-聚乙二醇(PEG)-氨基炔丙基标记的双脱氧核苷四磷酸(ddN4P)类似物。
本发明还提供了包含本发明的4种ddN4P类似物的组合物，其中每种ddN4P包含不同的碱基和由聚合物形成的不同的标记，每种具有不同数目(n)的单体。
本发明还提供了生产本发明的ddN4P类似物的方法，其包括：
a)在使得二氨基庚烷能够与末端磷酸连接的条件下，使ddN4P与二氨基庚烷在碳二亚胺(EDAC)和咪唑缓冲液中接触；
b)在使得能够产生香豆素-PEGn-酸化合物的条件下，使6-甲氧基香豆素N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)与氨基-PEGn-酸部分在二甲基甲酰胺中接触，其中n是PEG中乙二醇单体的数目；
c)在使得能够产生香豆素-PEGn-NHS化合物的条件下，使步骤b)的产物与N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯在二甲基甲酰胺中反应；和
d)使步骤a)和步骤c)的产物反应以产生香豆素-PEGn-ddN4P类似物。
本发明还提供了生产本发明的ddG4P类似物的方法，其包括：
a)在使得二氨基庚烷能够与末端磷酸连接的条件下，使ddG4P与二氨基庚烷在碳二亚胺(EDAC)和咪唑缓冲液中接触；
b)在使得能够产生香豆素-PEGn-酸化合物的条件下，使6-甲氧基香豆素N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)与氨基-PEGn-酸部分在二甲基甲酰胺中接触，其中n是PEG中乙二醇单体的数目；
c)在使得能够产生香豆素-PEGn-NHS化合物的条件下，使步骤b)的产物与N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯在二甲基甲酰胺中反应；和
d)使步骤a)和步骤c)的产物反应以产生香豆素-PEGn-ddG4P类似物。
本发明还提供了双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)类似物，其包含与其碱基连接的香豆素-聚乙二醇(PEG)-氨基炔丙基标记。
本发明还提供了包含本发明的4种ddNTP类似物的组合物，其中每种ddNTP包含不同的碱基和由聚合物形成的不同标记，每种具有不同数量(n)的单体。
本发明还提供了双脱氧核苷多磷酸(ddNPP)类似物，其包含与其碱基连接的标记，其中多磷酸基团包含3-10个磷酸单元。
本发明还提供了脱氧核苷多磷酸(dNPP)类似物，其包含与其碱基连接的标记，其中多磷酸基团包含3-10个磷酸单元。
本发明还提供了一种核糖核苷多磷酸(rNPP)类似物，其包含与其碱基连接的标记，其中多磷酸基团包含3-10个磷酸酯单元。
本发明还提供了生产本发明的ddNTP类似物的方法，其包括：
a)在使得能够产生香豆素-PEGn-酸化合物的条件下，使6-甲氧基香豆素N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)与氨基-PEGn-酸部分在二甲基甲酰胺中接触，其中n是PEG中乙二醇单体的数目；
b)在使得能够产生香豆素-PEGn-NHS化合物的条件下，使步骤a)的产物与N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯在二甲基甲酰胺中反应；以及
c)使步骤b)的产物与氨基炔丙基-ddNTP在二甲基甲酰胺中反应以产生香豆素-PEGn-氨基炔丙基-ddNTP，其中在氨基炔丙基-ddNTP中，氨基炔丙基部分连接至碱基。
本发明还提供了生产聚合物标记的ddNTP类似物的方法，其包括：
a)使5(7)-炔丙基氨基-ddNTP与氨基保护的己酸NHS酯接触；
b)使步骤a)的产物与氢氧化铵反应以产生5(7)-炔丙基酰胺基氨基己酰基-ddNTP；
c)使步骤b)的产物与叠氮丁酸NHS酯反应；以及
d)使步骤c)的产物与5'-炔基-寡核苷酸标签反应以产生寡核苷酸标记的ddNTP。
在一些情况下，连接至核苷多磷酸的碱基部分的标记或标签可以是寡核苷酸或肽。寡核苷酸可以具有10-100个单体单元之间的任何长度，单体单元具有胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或其衍生物；非碱基单元(脱氧核糖单元)和不形成氢键的经修饰的碱基单元。
寡核苷酸可以由两个单体单元之间的磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、硼酸-磷酸酯键和甲基膦酸酯键组成。在早期公开的专利申请“Chemical methods for producing taggednucleotides”US2015/0368710中公开了寡核苷酸标签的实例，该文献通过引用并入本文。
核苷酸与标签的连接还可以通过下列方式实现：形成二硫化物、形成酰胺、形成酯或烷基化(例如使用取代的碘乙酰胺试剂)或使用醛和胺或肼形成加合物、叠氮化物-炔偶联(azide-alkyn coupling)或四嗪-二烯偶联。许多缀合化学反应可以在GregT.Hermanson的Bioconjugate Techniques(2008)中找到，该文献通过引用整体并入本文。
表1中提供了核苷酸或寡核苷酸标签上的反应性基团和可以与之反应的基团的具体实例。这些可以与其反应的反应性基团可以存在于接头上或标签上。
表1
本发明还提供了具有与其缀合的引物的α溶血素蛋白。
本发明还提供了生产本发明的引物缀合的α-溶血素的方法，其包括：
a)在允许末端氨基与氨基反应性NHS酯反应的条件下，使在相反末端包含氨基反应性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯和硫醇反应性马来酰亚胺基团的磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(sSMCC)异双功能交联剂与包含末端氨基的引物接触；以及
b)从溶液中去除残留的游离sSMCC；以及
c)在允许硫醇反应性马来酰亚胺基团与位置46处的半胱氨酸残基反应的条件下，使步骤a)产生的产物与α-溶血素接触，其中α-溶血素包含C46位上的半胱氨酸突变；
从而将引物缀合到α-溶血素上。
本发明还提供了一种电导测量系统，其包括：
a)电阻屏障，其分隔至少第一电解质溶液和第二电解质溶液；
所述电阻屏障包括至少一个孔，所述至少一个孔具有纳米级直径；
所述至少一个孔被构造成允许离子电流被所施加的电压驱动穿过所述第一电解质溶液和第二电解质溶液；
b)在所述第一电解质溶液和第二电解质溶液中的至少一个中的至少一种标记的终止核苷多磷酸(NPP)类似物，其中在标记的终止核苷多磷酸(NPP)类似物中，标记连接至NPP类似物的碱基或末端磷酸；和
c)测量离子电流的装置和将其时间过程记录为时间序列的装置，时间序列包括至少所述一个孔不被标记阻塞的时间段以及标记引起电导减小的脉冲的时间段。
附图说明
图1.在引物-缀合的纳米孔阵列中使用聚合物标记的ddNTP(在该实施例中，标签连接到ddNTP的碱基)的单分子电子SNP基因分型的示例性方案。制备与SNP引物缀合的纳米孔(即，与DNA中在3'方向与目的单核苷酸紧邻的多个核苷酸基本上完全互补的引物，被认定为问询核苷酸(queried necleotide))。通过添加4种不同标记的ddNTP、DNA聚合酶和DNA模板进行单碱基延伸通过聚合酶用标记的ddNTP延伸具有与添加的模板互补的序列的引物。在施加的电压的条件下，标签被拉入孔中，读取来自孔的电流信号，揭示模板的特定基因型。
图2.在非催化金属离子如Sr2+的存在下，在引物-缀合的纳米孔阵列中使用4种标记的核苷酸的单分子电子SNP基因分型的示例性方案(在该实例中，标签可以连接到dNTP或ddNTP的碱基或末端磷酸)。制备与SNP引物缀合的纳米孔。形成DNA聚合酶、匹配的模板-引物对和与模板中问询位点互补的标记核苷酸的封闭三元复合物，在非催化Sr2+离子的存在下使该复合物暂时停顿。在此冷冻期间，三元复合物中引入的核苷酸上的标签在施加的电压的条件下被拉入孔中，读取来自孔的电流信号，揭示模板的特定基因型。
图3.单分子电子SNP基因分型方案和使用4种标记的核苷酸的预期电流信号。将4种标记的核苷酸添加到在含有非催化Sr2+离子和聚合酶的溶液中连接至纳米孔的引物-模板部分，使得与模板上的下一个碱基互补的一个标签-核苷酸形成三元复合物，但没有被掺入，多次记录电流阻断信号用于SNP检测。
图4.四种香豆素-PEGn-双脱氧鸟苷-5'-四磷酸的设计和合成。所示的具体合成法是针对ddG4P的，但是可以使用相同的方法在细节上做必要的修改以产生其他的ddN4P。
图5.香豆素-PEGn-氨基炔丙基-ddNTP的设计和合成。
图6.寡核苷酸标记的氨基炔丙基-ddNTP的设计和合成。
图7.寡核苷酸标记的氨基炔丙基-ddTTP(ddTTP-Cy3-T4-dSp3-T23-C3)和-ddCTP(ddCTP-Cy3-T2-dSp8-T20-C3)的MALDI-TOF MS测量结果和结构。
图8.凝胶电泳表征的、使用寡核苷酸标记的氨基炔丙基-ddTTP和氨基炔丙基-ddCTP进行的单碱基聚合酶延伸反应。延伸反应在标记的ddCTP(顶部凝胶)和包括Klenow、测序酶和热测序酶在内的不同酶的存在下进行。使用10皮摩尔(pmol)自启动环模板(self-primed looped template)(5'-GATAGCGCCGCGCCTTGGCGCGGCGC-3')(SEQ ID No:1)，200pmol标记的ddNTP和5单位的各种酶，在37℃孵育1小时进行反应。在底部凝胶中，第1-4泳道是使用热测序酶用标记的ddTTP进行的延伸反应，第5-8泳道是使用热测序酶用标记的ddCTP进行的反应。第9泳道是没有酶的阴性对照延伸反应。第10和第12泳道分别为标记的ddCTP和引物模板对照。
图9.通过用标记的ddNTP延伸生物素化的引物来表征不同标签的电流信号的方案。将具有连接至3'-核苷酸碱基的单个生物素分子的引物和互补模板DNA与热测序酶、Mg2+和标记的ddNTP一起孵育。DNA聚合酶使用与模板DNA中的下一个碱基互补的单个标记的ddNTP延伸引物。孵育后，将对生物素具有强亲和力的链霉亲和素分子加入至延伸反应中，未延伸和延伸的引物都被链霉亲和素捕获。然后将反应混合物施加到纳米孔电子检测系统。虽然链霉亲和素本身由于其大得多的尺寸而不能穿过孔，但它将引物延伸产物保持在标签能够进入孔的位置，从而产生每个核苷酸上的标签所特有的独特电流信号。通过这种方式，可以确认不同标签的电流信号。
图10.通过掺入标记的ddCTP(ddCTP-Cy3-T2-dSp8-T20-C3)和标记的ddTTP(ddTTP-Cy3-T4-dSp3-T23-C3)所获得的引物延伸产物上的标签所产生的纳米孔电流阻断水平。掺入标记的ddCTP的引物延伸产物上的标签显示出为开孔电流水平的约26-30％的电流阻断，掺入标记的ddTTP的引物延伸产物上的标签产生46-50％的阻断。
图11.引物缀合的αHL的合成。使具有末端氨基的引物与在相反末端含有氨基反应性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS酯)和硫醇反应性马来酰亚胺基团的磺基琥珀酰亚胺基-4-{N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(sSMCC)异双功能交联剂缀合。然后使连接有交联剂的引物与在位置46处具有半胱氨酸残基的αHL突变体反应，以使交联剂中的马来酰亚胺基团与半胱氨酸残基中的巯基反应。重组溶血素突变体46C的一级结构：
MADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDC NHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAAENFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWTDRSSERYKIDWEKEEMTNKGHHHHHH(SEQ ID No:2)。
图12.延伸反应后的两种可能情况。左图显示纯合基因型的实例，其中SNP引物全部由相同的核苷酸延伸，这表示两个相同等位基因。右图表示杂合基因型的情况，其中每个引物被两个各携带有独特标签的不同核苷酸中的一个延伸，这表示两个不同的等位基因。
具体实施方式
虽然本文已经示出和描述了本发明的各种实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，这样的实施方案仅作为示例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应该理解，可以使用这里描述的本发明的实施方案的各种替代方案。
术语
除非另有说明，否则本文中使用的以下术语中的每一个应具有以下阐述的定义。
A-腺嘌呤；
C-胞嘧啶；
DNA-脱氧核糖核酸；
G-鸟嘌呤；
RNA-核糖核酸；
T-胸腺嘧啶；和
U-尿嘧啶。
冠词“一个/一种”(“a”、“an”)和“所述”(“the”)是非限制性的。例如，“所述方法”包括对该短语的含义的最宽泛的定义，其可以是多于一种的方法。
孔中化合物的“信号”应当包括例如当化合物通过、驻留或以其他方式与孔相互作用时产生的信号或变化。其中一种这样的变化可以是电子信号。
核酸或其他分子(例如通过施加电场由孔捕获的或穿过孔的标记和聚合物标签)的“电子信号”应包括例如核苷酸或分子的捕获持续时间或其穿过孔的持续时间以及在通过过程中所观察到的电流振幅。电子信号可以通过例如电流(例如pA)对时间的曲线被可视化。DNA的电子信号也是可以被可视化，其可以是例如通过施加电场被孔捕获或穿过孔的DNA的电流(例如pA)对时间的曲线。
“纳米孔”包括例如一种结构，该结构包括(a)被物理屏障隔开的第一隔室和第二隔室，该屏障具有至少一个直径为例如约1-10nm的孔，和b)横跨屏障施加电场的装置，使得带电分子例如DNA、核苷酸、核苷酸类似物或标签可以被孔捕获或从第一隔室通过孔到达第二隔室。理想地，纳米孔进一步包括用于测量由孔捕获的或穿过其屏障的分子的电子信号的装置。纳米孔屏障可以是合成的或天然存在的，或者两者都是部分的。例如，屏障可以是生物性的，包括天然存在的化合物或衍生自这些化合物的材料。这包括例如在其中具有α-溶血素的脂双层，诸如孔蛋白的寡聚蛋白通道以及合成肽等。屏障也可以是例如固态纳米孔，包括例如具有合适尺寸的一个或多个孔的无机板。这里“纳米孔”、“纳米孔屏障”和纳米孔屏障中的“孔”有时等同使用。
“经由纳米孔检测”或“由纳米孔检测”包括例如检测通过纳米孔的离子电流的变化，该变化由被孔捕获的分子或者进入纳米孔的分子、移位通过纳米孔的分子或者以其他方式与纳米孔相互作用的分子引起。例如，在水性离子盐(如KCl)溶液中，当跨膜施加适当的电压时，由α-溶血素通道形成的孔传导足够强且稳定的离子电流。然后带电荷的分子可以被所施加的电场驱动通过孔，从而阻断或减少本来不受阻碍的离子电流。这个过程产生一个电子信号。当被孔捕获或进入并穿过纳米孔时，特定分子产生特征信号将其与其他分子区分开。阻断的持续时间和信号强度与该分子的空间性质、电性质和其他物理和化学性质有关。由此得到一个特定的事件图，其为移位时间对阻断电流的图，该图用于通过单通道记录技术基于图中的特征参数(如移位电流、移位持续时间以及它们相应的散布)来识别分子。
“核酸”应意指任何核酸分子，包括但不限于DNA、RNA及其杂交体，以及它们的类似物。形成核酸分子的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U以及它们的衍生物。这些碱基的衍生物在本领域中是众所周知的，在PCR Systems，Reagents and Consumables(Perkin ElmerCatalogue1996-1997,Roche Molecular Systems,Inc.,Branchburg,New Jersey,USA)中有例证。
“杂交”应意指基于公知的序列互补性原理将一条单链核酸(例如引物)退火至另一条核酸。在一个实施方案中，所述另一条核酸是单链核酸。核酸之间杂交的倾向性取决于它们环境(miliu)的温度和离子强度、核酸的长度和互补程度。这些参数对杂交的影响描述于例如Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.,Molecular cloning:a laboratorymanual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1989)中。如本文所用，通过与可形成磷酸二酯键的可用核苷酸或核苷酸类似物形成磷酸二酯键，引物或DNA延伸产物的杂交是可延伸的。
本文使用的“引物”(引物序列)是短的、通常化学合成的寡核苷酸，其具有足以与靶DNA(例如单链DNA)杂交的适当长度(例如约10-30个碱基)，允许在本领域公知的合适的条件下向其添加核苷酸残基或由其合成寡核苷酸或多核苷酸。在一个实施方案中，引物是DNA引物，即由脱氧核糖核苷酸残基或其类似物组成或基本上由脱氧核糖核苷酸残基或其类似物组成的引物。引物被设计成具有与模板/靶DNA的引物杂交区域互补的序列。通过形成磷酸二酯键将核苷酸残基添加到引物的3'末端生成DNA延伸产物。通过形成磷酸二酯键将核苷酸残基添加到DNA延伸产物的3'末端产生进一步的DNA延伸产物。
本文使用的“核苷酸”是指核苷-5'-多磷酸化合物或其结构类似物，其可以通过核酸聚合酶掺入从而延伸正在生长的核酸链(例如引物)。核苷酸可以包含碱基如A、C、G、T、U或其类似物，磷酸基团中可以包含3、4、5、6、7、8或更多个磷酸基团。在一个或多个碱基、糖或磷酸基处对核苷酸进行修饰。核苷酸可以具有连接的标记或标签(“标记的核苷酸”)。
“终止核苷酸”是指任何经修饰或未经修饰的核苷酸，其在掺入核苷酸链中时阻止或严重妨碍核苷酸链的进一步延伸。一个实例是双脱氧核苷酸。“终止核苷酸”还包括在非催化金属离子的存在下与带引物的模板和DNA聚合酶形成三元复合物以防止核苷酸掺入的任何核苷酸(Vander Horn等人，2014)。终止核苷酸可以具有连接的标记或标签。
本文使用的“聚合物”是指由多个重复单元组成的任何分子或部分。这包括均聚物，即由相同重复单元组成的聚合物(例如聚乙二醇)，和杂聚物，即由相似但不同的重复单元组成的聚合物，例如某些寡核苷酸。
本文中使用的“聚合酶”是指任何天然或非天然的酶或其他催化剂，其能够催化聚合反应，例如催化核苷酸单体的聚合以形成核酸聚合物。可用于本发明的组合物和方法中的示例性聚合酶包括核酸聚合酶，例如DNA聚合酶、DNA依赖性RNA聚合酶或RNA依赖性RNA聚合酶和逆转录酶。
本文中使用的“基本上相同的”或“基本上完全互补的”序列各自与核苷酸序列具有至少约80％的序列同一性或互补性。基本上相同的序列或基本上完全互补的序列可以各自具有至少约85％、90％、95％或100％的序列同一性或互补性。
单分子电子SNP分析的原理
本文公开的发明涉及具有单分子敏感性的、使用标记的核苷多磷酸类似物并利用纳米孔检测来检测DNA(或RNA，细节上作必要的改变)中的某些位置处的核苷酸的身份或存在的方法、用于这种方法的核苷酸和引物缀合的纳米孔蛋白以及用于产生这种核苷酸和引物缀合的纳米孔蛋白的方法。
用不同长度的PEG分子或其他聚合物标签标记4种ddNTP，使得在核苷酸被掺入引物中之后检测纳米孔系统中的标签从而很好地区分每种核苷酸以确定模板的互补核苷酸的基因型。例如，首先选择四种不同的具有16、20、24和36个乙二醇单元的PEG作为标签来标记ddNTP，已证明这些PEG显示不同的纳米孔阻断信号用于潜在的DNA合成测序(Kumar等人，2012)。为了避免干扰DNA聚合酶的活性位点，测试了ddNTP中两个位置的标签连接：每个核苷酸的末端磷酸或碱基的特定位置。其次，为了进行分析，通过将引物缀合到α溶血素(αHL)的帽子(cap)上来制备均质的SNP基因分型平台。第三，使用这些独特的试剂、标记的ddNTP和引物缀合的纳米孔，在纳米孔系统中进行单分子电子SNP基因分型。具体而言，引物缀合的纳米孔在脂质双层中重建。在确认指示孔的插入的电流之后，通过向孔添加具有与引物互补的序列的特定环化模板、DNA聚合酶和四种不同标记的ddNTP来进行单碱基延伸(SBE)。在施加的电压的条件下，来自每个延伸的引物的标签被捕获在孔中，分析来自每个孔的不同电流信号，解码掺入至延伸的引物中的核苷酸。这反过来揭示了模板的基因型(图1)。
或者，可以通过加入高浓度的非催化Sr2+离子使DNA聚合酶暂时停滞在闭合的三元复合物中，所述非催化Sr2+离子允许互补核苷酸和带有引物的模板与DNA聚合酶瞬时结合，但抑制结合的核苷酸的掺入，如Vander Horn等人(2014)所述。因此，Sr2+的加入暂时停止了DNA聚合酶复合物，并延长了DNA聚合酶闭合形式中核苷酸结合的时间跨度，而没有掺入步骤。这个延长的时间使得标签被捕获并在孔中被多次读取，产生断断续续的电流阻断信号。此外，可以使用标记的双脱氧核苷酸和脱氧核苷酸来识别问询的SNP位点，并预期产生相同的结果，因为该方法中的核苷酸实际上并不掺入引物中，而是在Sr2+的存在下与三元复合物中的聚合酶复合。图2和图3中提供了使用Sr2+离子的替代测定方案。总体而言，这些配置的证实为开发用于单分子电子SNP基因分型测定的完整系统奠定了基础。
本发明的实施方案
本发明涉及用于鉴定核酸中一段连续核苷酸残基内的一个位置上的目的单核苷酸残基的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在施加的电压的条件下将核酸与下列物质一起孵育：
(1)纳米孔，
(2)寡核苷酸引物，其与纳米孔缀合并与核酸中3’方向上紧邻目的单核苷酸残基的多个核苷酸杂交，
(3)至少一种标记的终止核苷多磷酸(NPP)类似物，其中标记与NPP类似物的碱基或末端磷酸连接，和
(4)核酸聚合酶，
使得如果NPP类似物与目的单核苷酸残基互补，则所述NPP类似物被掺入引物中，并且连接至被掺入的NPP类似物的标记被拉入纳米孔；以及
b)通过纳米孔检测掺入引物中的NPP类似物的标记的信号，以鉴定掺入的NPP类似物；
从而鉴定目的单核苷酸残基。
在本发明的一个实施方案中，在步骤(a)中，将核酸与至少两种NPP类似物一起孵育。在另一个实施方案中，将核酸与至少四种NPP类似物一起孵育。在另一个实施方案中，将核酸与正好四种NPP类似物一起孵育。
在本发明的一个实施方案中，在步骤(a)中，将核酸与一种NPP类似物一起孵育，并且如果NPP类似物未被掺入，则反复地重复与不同NPP类似物的孵育，直至NPP类似物被掺入。
本发明还涉及一种用于鉴定核酸中一段连续核苷酸残基内的一个位置上的目的单核苷酸残基的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在施加的电压的条件下将核酸与下列物质一起孵育:
(1)纳米孔，
(2)寡核苷酸引物，其与纳米孔缀合并与核酸中3’方向上紧邻目的单核苷酸的多个核苷酸杂交，
(3)至少一种标记的核苷多磷酸(NPP)类似物，其中标记与NPP类似物的碱基或末端磷酸连接，
(4)核酸聚合酶，和
(5)非催化型化合物，其使得互补的标记的NPP类似物与核酸聚合酶和带有引物的模板瞬时结合但抑制结合的NPP类似物的掺入，
使得如果NPP类似物与目的单核苷酸互补，则NPP类似物瞬时结合至核酸聚合酶和带有引物的模板，并且连接至被瞬时结合的NPP类似物的标记被拉入纳米孔；以及
b)通过纳米孔检测瞬时结合至聚合物酶和带有引物的模板的NPP类似物的标记的信号，以鉴定NPP类似物；
从而鉴定目的单核苷酸残基。
在本发明的一个实施方案中，在步骤(a)中，将核酸与至少两种NPP类似物一起孵育。在另一个实施方案中，将核酸与至少四种NPP类似物一起孵育。在另一个实施方案中，将核酸与正好四种NPP类似物一起孵育。
在本发明的一个实施方案中，在步骤(a)中，将核酸与一种NPP类似物一起孵育，并且如果所述NPP类似物不与核酸聚合酶瞬时结合，则反复地重复与不同NPP类似物的孵育，直至NPP类似物被瞬时结合。
在本发明的一个实施方案中，非催化型化合物是Sr2+。
在本发明的一个实施方案中，每种NPP是脱氧核糖核苷多磷酸(dNPP)或其类似物。
在本发明的另一个实施方案中，每种NPP是双脱氧核糖核苷多磷酸(ddNPP)或其类似物。
在本发明的一个实施方案中，每种ddNPP或其类似物包含具有香豆素-PEG部分的标记。
在本发明的一个实施方案中，每种ddNPP或其类似物包含具有基于寡核苷酸的标签的标记，所述标签在约10-50个单体单元之间变化。
在本发明的一个实施方案中，每种NPP是核糖核苷多磷酸(rNPP)或其类似物。
在本发明的一个实施方案中，核酸是单链DNA。在另一个实施方案中，核酸是双链DNA。在另一个实施方案中，核酸是单链RNA。在另一个实施方案中，核酸是双链RNA。
在本发明的一个实施方案中，核酸是单链DNA或双链DNA，核酸聚合酶是DNA聚合酶。在另一个实施方案中，核酸是RNA，核酸聚合酶是逆转录酶。
在本发明的一个实施方案中，核酸聚合酶是RNA聚合酶。
在本发明的一个实施例中，标记被连接到碱基。在另一个实施方案中，标记被连接到末端磷酸。
在本发明的一个实施方案中，标记包含乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、寡核苷酸、脂族酸、芳香酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或它们的组合中的一种或多种。
在本发明的一个实施方案中，标记是聚合物标记。在另一个实施方案中，标记是聚乙二醇(PEG)标记。在另一个实施方案中，PEG标记各自具有彼此不同的长度。在另一个实施方案中，标记是寡核苷酸标记(Fuller等人，2015)。
在本发明的一个实施方案中，信号是电子信号。在进一步的实施方案中，电子信号是电流阻断信号。在另一个实施方案中，电流阻断信号是断断续续的电流阻断信号。
在本发明的一个实施方案中，纳米孔是固态纳米孔。在另一个实施方案中，纳米孔位于固态膜中。在另一个实施方案中，纳米孔是生物孔。在另一个实施方案中，纳米孔是蛋白。在另一个实施方案中，纳米孔包含α溶血素。在另一个实施方案中，每个纳米孔包含七个α溶血素单体，任一个或全部α溶血素单体缀合至相同的引物。在另一个实施方案中，纳米孔包含MspA(Manrao等人，2012)。在另一个实施方案中，每个纳米孔包含八个αMspA单体，任一个或全部αMspA单体与相同的引物缀合。在另一个实施方案中，纳米孔包含CsgG(Goyal等人，2014)。在另一个实施方案中，每个纳米孔包含九个αCSGG单体，任一个或全部αCSGG单体与相同的引物缀合。
在本发明的一个实施方案中，将核酸与四种香豆素-PEG-ddNPP一起孵育，每种香豆素-PEG-ddNPP包含不同的碱基，并且各自包含不同长度的香豆素-PEG-标记。在另一个实施方案中，四种香豆素-PEG标记是香豆素-PEG16、香豆素-PEG20、香豆素-PEG24和香豆素-PEG36。在一个实施方案中，每个香豆素-PEG标记连接到ddNPP的末端磷酸。在另一个实施方案中，如果ddNPP是ddCPP、ddUPP或ddTPP，则每个香豆素-PEG标记是香豆素-PEG-氨基炔丙基标记并且连接到碱基的5-位；如果ddNPP是ddAPP或ddGPP，则每个香豆素-PEG标记是香豆素-PEG-氨基炔丙基标记并且连接到碱基的7-位。
在本发明的一个实施方案中，将核酸与四种寡核苷酸标记的ddNPP一起孵育，每种ddNPP包含不同的碱基，并且各自包含具有不同长度和组成的寡核苷酸标签。在另一个实施方案中，四种寡核苷酸标签如在Fuller等人(2015)的文献中所描述的。在一个实施方案中，每个寡核苷酸标签连接到ddNPP的末端磷酸。在另一个实施方案中，如果ddNPP是ddCPP、ddUPP或ddTPP，则每个寡核苷酸标签连接到碱基的5-位；如果ddNPP是ddAPP或ddGPP，则每个寡核苷酸标签连接到碱基的7-位。
在本发明的一个实施方案中，引物的序列长度为10-40个核苷酸。在另一个实施方案中，引物的序列长度为18-24个核苷酸。
本发明还提供了用于实施本发明的任何方法的测定法。
本发明还提供了双脱氧核苷四磷酸(ddN4P)类似物，其包含连接至其末端磷酸的香豆素-聚乙二醇(PEG)-氨基炔丙基标记。
在本发明的一个实施方案中，ddN4P类似物具有以下结构：
其中n是16、20、24或36，并且其中B是选自腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶的碱基。
在一个实施方案中，碱基是鸟嘌呤。
本发明还提供了包含四种本发明的ddN4P类似物的组合物，其中每种ddN4P包含不同的碱基和独特的聚合物标签，并且每种标签具有不同的组成和不同数量的单体。
在本发明的一个实施方案中，其中四种ddN4P类似物是ddA4P类似物、ddG4P类似物、ddC4P类似物，以及ddT4P类似物或ddU4P类似物。
本发明还提供了生产本发明的ddN4P类似物的方法，其包括：
a)在使得二氨基庚烷能够连接至末端磷酸的条件下，使ddN4P与二氨基庚烷在碳二亚胺(EDAC)和咪唑缓冲液中接触；
b)在使得能够产生香豆素-PEGn-酸化合物的条件下，使6-甲氧基香豆素N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)与氨基-PEGn-酸部分在二甲基甲酰胺中接触，其中n是PEG中乙二醇单体的数目；
c)在使得能够产生香豆素-PEGn-NHS化合物的条件下，使步骤b)的产物与N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯在二甲基甲酰胺中反应；和
d)使步骤a)和步骤c)的产物反应以产生香豆素-PEGn-ddN4P类似物。
在一个实施方案中，所述方法还包括在步骤a)之前使ddNTP与磷酸三丁基铵反应以获得ddN4P。
本发明还提供了生产本发明的ddG4P类似物的方法，其包括：
a)在使得二氨基庚烷能够与末端磷酸连接的条件下，使ddG4P与二氨基庚烷在碳二亚胺(EDAC)和咪唑缓冲液中接触；
b)在使得能够产生香豆素-PEGn-酸化合物的条件下，使6-甲氧基香豆素N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)与氨基-PEGn-酸部分在二甲基甲酰胺中接触，其中n是PEG中乙二醇单体的数目；
c)在使得能够产生香豆素-PEGn-NHS化合物的条件下，使步骤b)的产物与N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯在二甲基甲酰胺中反应；和
d)使步骤a)和步骤c)的产物反应以产生香豆素-PEGn-ddG4P类似物。
在一个实施方案中，所述方法还包括在步骤a)之前使ddGTP与磷酸三丁基铵反应以获得ddG4P。
本发明还提供了包含连接至其碱基的香豆素-聚乙二醇(PEG)-氨基炔丙基标签的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)类似物。
在一个实施方案中，ddNTP类似物具有以下结构：
其中B是选自腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶或它们的类似物的碱基；n是16、20、24或36。
本发明还提供了包含四种本发明的ddNTP类似物的组合物，其中每种ddNTP包含不同的碱基和独特的聚合物标签，并且每种标签具有不同的组成和不同数量的单体。
在另一个实施方案中，四种ddNTP类似物是ddATP类似物、ddGTP类似物、ddCTP类似物，以及ddTTP类似物或ddUTP类似物。
本发明还提供了生产本发明的ddNTP类似物的方法，其包括：
a)在使得能够产生香豆素-PEGn-酸化合物的条件下，使6-甲氧基香豆素N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)与氨基-PEGn-酸部分在二甲基甲酰胺中接触，其中n是PEG中乙二醇单体的数目；
b)在使得能够产生香豆素-PEGn-NHS化合物的条件下，使步骤a)的产物与N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯在二甲基甲酰胺中反应；以及
c)使步骤b)的产物与氨基炔丙基-ddNTP在二甲基甲酰胺中反应以产生香豆素-PEGn-氨基炔丙基-ddNTP，其中在氨基炔丙基-ddNTP中，氨基炔丙基部分连接至碱基。
在一个实施方案中，如果ddNTP包含胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶碱基，则步骤c)中的氨基炔丙基-ddNTP是5-氨基炔丙基-ddNTP；如果ddNTP包含腺嘌呤或鸟嘌呤碱基，则步骤c)中的氨基炔丙基-ddNTP是7-氨基炔丙基-ddNTP。
在本发明的一个实施方案中，n是16、20、24或36。
在另一个实施方案中，标记的终止NPP类似物是选自以下的核苷酸类似物：
其中BASE选自腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤和7-脱氮鸟嘌呤或它们的类似物；
R和R'可独立地为H、OH、O-烷基、F、Cl、Br、N3、NH2、O-NH2、O-烯丙基、O-CH2N3、2',3'-异丙叉基或仅允许DNA聚合酶掺入单核苷酸的基团；
TAG可以是能够被纳米孔检测的任何聚合物分子，可以选自寡核苷酸、肽、碳水化合物和不同长度的PEG。
本发明还提供了生产聚合物标记的ddNTP类似物的方法，其包括：
a)使5(7)-炔丙基氨基-ddNTP与氨基保护的己酸NHS酯接触；
b)使步骤a)的产物与氢氧化铵反应以产生5(7)-炔丙基酰胺基氨基己酰基-ddNTP；
c)使步骤b)的产物与叠氮丁酸NHS酯反应；以及
d)使步骤c)的产物与5'-炔基-寡核苷酸标签反应以产生寡核苷酸标记的ddNTP。
本发明还提供了双脱氧核苷四磷酸(ddN4P)类似物，其包含连接到其末端磷酸的香豆素-聚乙二醇(PEG)-氨基炔丙基标记。
在本发明的一个实施方案中，ddN4P类似物具有以下结构
其中n是16、20、24或36，并且其中B是选自腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶的碱基。
在一个实施方案中，碱基是鸟嘌呤。
本发明还提供了包含四种本发明的ddN4P类似物的组合物，其中每种ddN4P包含不同的碱基和独特的聚合物标签，并且每种标签具有不同的组成和不同数量的单体。
在本发明的一个实施方案中，其中四种ddN4P类似物是ddA4P类似物、ddG4P类似物、ddC4P类似物，以及ddT4P类似物或ddU4P类似物。
本发明还提供了生产本发明的ddN4P类似物的方法，其包括：
a)在使得二氨基庚烷能够与末端磷酸连接的条件下，使ddN4P与二氨基庚烷在碳二亚胺(EDAC)和咪唑缓冲液中接触；
b)在使得能够产生香豆素-PEGn-酸化合物的条件下，使6-甲氧基香豆素N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)与氨基-PEGn-酸部分在二甲基甲酰胺中接触，其中n是PEG中乙二醇单体的数目；
c)在使得能够产生香豆素-PEGn-NHS化合物的条件下，使步骤b)的产物与N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯在二甲基甲酰胺中反应；和
d)使步骤a)和步骤c)的产物反应以产生香豆素-PEGn-ddN4P类似物。
在一个实施方案中，所述方法还包括在步骤a)之前使ddNTP与磷酸三丁基铵反应以获得ddN4P。
本发明还提供了生产本发明的ddG4P类似物的方法，其包括：
a)在使得二氨基庚烷能够与末端磷酸连接的条件下，使ddG4P与二氨基庚烷在碳二亚胺(EDAC)和咪唑缓冲液中接触；
b)在使得能够产生香豆素-PEGn-酸化合物的条件下，使6-甲氧基香豆素N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)与氨基-PEGn-酸部分在二甲基甲酰胺中接触，其中n是PEG中乙二醇单体的数目；
c)在使得能够产生香豆素-PEGn-NHS化合物的条件下，使步骤b)的产物与N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯在二甲基甲酰胺中反应；和
d)使步骤a)和步骤c)的产物反应以产生香豆素-PEGn-ddG4P类似物。
在一个实施方案中，所述方法还包括在步骤a)之前使ddGTP与磷酸三丁基铵反应以获得ddG4P。
本发明还提供了双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)类似物，其包含连接至其碱基的香豆素-聚乙二醇(PEG)-氨基炔丙基标记。
在一个实施方案中，ddNTP类似物具有以下结构：
其中B是选自腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶或它们的衍生物的碱基；n是16、20、24或36。
本发明还提供了包含四种本发明的ddNTP类似物的组合物，其中每种ddNTP包含不同的碱基和独特的聚合物标签，并且每种标签具有不同的组成和不同数量的单体。
在另一个实施方案中，四种ddNTP类似物是ddATP类似物、ddGTP类似物、ddCTP类似物，以及ddTTP类似物或ddUTP类似物。
本发明还提供了生产本发明的ddNTP类似物的方法，其包括：
a)在使得能够产生香豆素-PEGn-酸化合物的条件下，使6-甲氧基香豆素N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)与氨基-PEGn-酸部分在二甲基甲酰胺中接触，其中n是PEG中乙二醇单体的数目；
b)在使得能够产生香豆素-PEGn-NHS化合物的条件下，使步骤a)的产物与N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯在二甲基甲酰胺中反应；以及
c)使步骤b)的产物与氨基炔丙基-ddNTP在二甲基甲酰胺中反应以产生香豆素-PEGn-氨基炔丙基-ddNTP，其中在氨基炔丙基-ddNTP中，氨基炔丙基部分连接至碱基。
在一个实施方案中，如果ddNTP包含胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶碱基，则步骤c)中的氨基炔丙基-ddNTP是5-氨基炔丙基-ddNTP，并且如果ddNTP包含腺嘌呤或鸟嘌呤碱基，则步骤c)中的氨基炔丙基-ddNTP是7-氨基炔丙基-ddNTP。
在本发明的一个实施方案中，n是16、20、24或36。
在另一个实施方案中，标记的终止NPP类似物是选自以下的核苷酸类似物：
其中BASE选自腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤和7-脱氮鸟嘌呤或它们的类似物；
R和R'可独立地为H、OH、O-烷基、F、Cl、Br、N3、NH2、O-NH2、O-烯丙基、O-CH2N3、2',3'-异丙叉基或仅允许DNA聚合酶掺入单核苷酸的基团；
TAG可以是能够被纳米孔检测的任何聚合物分子，可以选自寡核苷酸、肽、碳水化合物和不同长度的PEG。
本发明还提供了生产聚合物标记的ddNTP类似物的方法，其包括：
a)使5(7)-炔丙基氨基-ddNTP与氨基保护的己酸NHS酯接触；
b)使步骤a)的产物与氢氧化铵反应以产生5(7)-炔丙基酰胺基氨基己酰基-ddNTP；
c)使步骤b)的产物与叠氮丁酸NHS酯反应；以及
d)使步骤c)的产物与5'-炔基-寡核苷酸标签反应以产生寡核苷酸标记的ddNTP。
本发明还提供了用于生产具有与其碱基连接的标签的dNTP类似物的方法，其包括：
a)使5(7)-炔丙基氨基-dNTP与氨基保护的己酸NHS酯接触；
b)使步骤a)的产物与氢氧化铵反应以产生5(7)-炔丙基酰胺基氨基己酰基-dNTP；
c)使步骤b)的产物与叠氮丁酸NHS酯反应；以及
d)使步骤c)的产物与5'-炔基-寡核苷酸标签反应以产生寡核苷酸标记的dNTP。
本发明还提供了使用dNTP类似物通过上述方法进行SNP检测的方法，所述dNTP类似物具有不同的与末端磷酸连接的标签(Fuller等，2015)。
本发明还提供了α溶血素蛋白，其具有与其缀合的引物。
在一个实施方案中，α溶血素包含C46突变，并且引物与第46位上的半胱氨酸残基缀合。
本发明还提供了生产本发明的引物缀合的α-溶血素的方法，其包括：
a)在允许末端氨基与氨基反应性NHS酯反应的条件下，使在相反末端包含氨基反应性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯和硫醇反应性马来酰亚胺基团的磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(sSMCC)异双功能交联剂与包含末端氨基的引物接触；以及
b)从溶液中去除残留的游离sSMCC；以及
c)在允许硫醇反应性马来酰亚胺基团与位置46处的半胱氨酸残基反应的条件下，使步骤a)产生的产物与α-溶血素接触，其中α-溶血素包含在位置46上的半胱氨酸突变；
从而将引物缀合到α-溶血素上。
在一个实施方案中，步骤b)中未反应的游离sSMCC的去除通过凝胶过滤纯化进行。
本发明还提供了一种电导测量系统，其包括：
a)电阻(electrically resistive)屏障，其分隔至少第一电解质溶液和第二电解质溶液；
所述电阻屏障包括至少一个孔，所述至少一个孔具有纳米级直径；
所述至少一个孔被构造成允许离子电流被所施加的电压驱动穿过所述第一电解质溶液和第二电解质溶液；
b)在所述第一电解质溶液和第二电解质溶液中至少一个中的至少一种标记的终止核苷多磷酸(NPP)类似物，其中在标记的终止核苷多磷酸(NPP)类似物中，标记连接至NPP类似物的碱基或末端磷酸；和
c)测量离子电流的装置和将其时间过程记录为时间序列的装置，时间序列包括所述至少一个孔不被标记阻塞的时间段以及标记引起电导减小的脉冲的时间段。
在另一个实施方案中，标记的终止NPP类似物是选自以下的ddNPP类似物：
其中B(BASE)是选自腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶或它们的衍生物的碱基；n是16、20、24或36。
TAG可以是能够被纳米孔检测的任何聚合物分子，并且可以选自寡核苷酸、肽、碳水化合物和不同长度的PEG。
在一个实施方案中，该系统包含四种具有以下结构的ddNPP类似物
其中每种ddNTP包括不同的碱基，并且每种具有不同的n值。
在一个实施方案中，该系统包含四种具有以下结构的ddNPP类似物：
其中每种ddNTP包括不同的碱基，并且每种具有不同的n值。在一个实施方案中，该系统包含四种ddNTP类似物，这四种ddNTP类似物是ddATP类似物、ddGTP类似物、ddCTP类似物以及ddTTP类似物或ddUTP类似物。
本文种使用的“烷基”包括具有指定碳原子数的支链和直链饱和脂族烃基，并且可以是未取代的或取代的。因此，“C1-Cn烷基”中的C1-Cn被定义为包括具有以直链或支链形式排列的1、2、……n-1或n个碳的基团。例如，“C1-C5烷基”被定义为包括具有以直链或支链形式排列的1、2、3、4或5个碳的基团，具体包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基和戊基。
本文中使用的“烯基”是指含有至少1个碳-碳双键的直链或支链的非芳族烃基，可以存在多达最大可能数量的非芳族碳-碳双键，并且其可以是未取代的或取代的。例如，“C2-C5烯基”是指分别具有2、3、4或5个碳原子和至多1、2、3或4个碳-碳双键的烯基。烯基包括乙烯基、丙烯基和丁烯基。
术语“炔基”是指含有至少1个碳-碳三键的直链或支链烃基，可以存在多达最大可能数量的非芳族碳-碳三键，并且其可以是未取代的或取代的。因此，“C2-C5炔基”是指具有2或3个碳原子和1个碳-碳三键、或具有4或5个碳原子和至多2个碳-碳三键的炔基。炔基包括乙炔基、丙炔基和丁炔基。
术语“取代的”是指如上所述的官能团(例如烷基或烃基)中所含的与氢原子连接的至少一个键被与非氢原子或非碳原子连接的键代替，条件是维持正常的化合价并且(一个或多个)取代产生稳定的化合物。取代的基团还包括这样的基团：其中与碳原子或氢原子连接的一个或多个键被与杂原子连接的一个或多个键(包括双键或三键)替换。取代基的非限制性实例包括上述官能团以及例如N以形成-CN。
示例性标记
标记(在本文中也被称为标签)可以是能够在纳米孔中被检测到的任何化学基团或分子。在一个实施方案中，标记通过阻断或阻碍穿过纳米孔的离子电流来提供电子信号。
在一些情况下，标记包含乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、寡核苷酸(修饰的或未修饰的)、脂族酸、芳香酸、醇、巯基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或它们的组合中的一种或多种。
在一些情况下，标记是聚合物。聚乙二醇(PEG)是聚合物的一个实例，其具有以下结构：
可以使用任何数量的乙二醇单元(W)。在一些情况下，每种标记都是包含不同数量的乙二醇单元的PEG标记。
标记的纳米孔检测
之前Kasianowicz等人(1996)发现具有1.5nm直径限制孔的α-溶血素(αHL)蛋白纳米孔(Song等人，1996；Bezrukov等人，1996；Krasilnikov，2002；和Kasianowicz等人，1995)可用于在单分子水平电子检测核酸。因此，aHL纳米孔已被广泛研究用于单分子电子DNA测序技术的研制(Kasianowicz等人，1996；Kasianowicz等人，2002；Kasianowicz等人，1998；和Clarke等人，2009)。这些研究工作大部分涉及由纳米孔进行链DNA测序，其目的在于通过使DNA穿过纳米孔并检测来自4个核苷酸(A、C、G、T)的电流阻断来对DNA进行测序(Cherf等人，2012；Manrao等人，2012)。
天然αHL纳米孔具有用于以高分辨率分辨分子和离子的固有性质，其使得能够区分水合H+和D+离子(Kasianowicz等人，1995)。Robertson等人(2007)已经证明，αHL纳米孔可以在单个单体水平上容易地分离超过20种不同的PEG聚合物。该研究表明PEG聚合物在孔中的平均停留时间随着其尺寸的增加而增加(Reiner等人，2010)。最近，Kumar等人(2012)已经报道了使用4种不同尺寸的PEG来标记核苷酸的末端磷酸从而通过纳米孔检测进行单分子电子DNA合成测序。基于这些先前的研究，本文所述的单分子电子多重SNP测定将能够通过使用不同尺寸的PEG对核苷酸进行标记来同时检测多个遗传变异。
通过参考下面的实验细节可以更好地理解本发明，但是本领域技术人员将容易地认识到，具体实验仅仅是对在权利要求书中更充分描述的本发明的说明。在本申请中描述的每个实施方案和特征应该被理解为是可互换的并且可以与包含在其中的每个实施方案组合。
实验细节和讨论
对通过MALDI-TOF MS进行的SNP分析的综述
因为引物及其延伸产物都被加载到MS分析仪，所以使用MALDI-TOF MS进行多重SNP分析的早期SBE方法检测引物及其延伸产物。这需要明确地同时检测多重引物及其延伸产物。但是，对于较长的生物聚合物(如DNA)，MALDI-TOF MS分析仪在分辨率和灵敏度方面受到限制。因此，MALDI-TOF MS不能分辨较大的DNA分子。为了解决这个问题，Kim等人开发了多重SNP测定(SPC-SBE)，其在SBE中使用固相可捕获(SPC)的生物素化双脱氧核苷酸终止子(生物素-ddNTP)，通过MALDI-TOF MS进行检测(Kim等人，2002和Kim等人，2003)。
在SPC-SBE方法中，对应于多个SNP位点的寡核苷酸引物文库被设计成具有不同的分子量。然后将这些引物退火到靶基因的SNP位点，并通过DNA聚合酶使用特定的生物素-ddNTP对引物进行延伸，产生3'-生物素化的DNA产物。用链霉亲和素包被的磁珠处理聚合酶反应混合物导致捕获在3'端携带生物素部分的DNA产物。反应中过量的引物、DNA聚合酶和盐被洗掉。随后通过在95℃使用甲酰胺使生物素-链霉亲和素的相互作用变性而从磁珠上释放纯DNA延伸产物，并用MALDI-TOF MS进行表征以确定SNP。在SPC-SBE方法中，因为只有分离的引物延伸产物被加载到MALDI-TOF MS分析仪中，所以SNP分析中多重检测的准确性和范围显著增加。因此，所得质谱中没有未延伸的引物的峰及其相关二聚体，这些物质不携带生物素部分并在SPC期间被去除。SPC还有利于所捕获的DNA产物的脱盐，因此提高了用于SNP分析的MS数据的准确性和整体质量。
总之，在使用MALDI-TOF MS的SPC-SBE多重SNP测定(Kim等人，2002)中，产生多重PCR产物作为来自基因组DNA的模板，以使用具有不同质量的SNP特异性引物进行SBE反应。只有由特定生物素-ddNTP延伸的DNA延伸产物被捕获，而反应的其他组分被去除。然后将捕获的DNA产物释放并加载到MALDI-TOF MS分析仪上以鉴定核苷酸变异。已经表明，未延伸的引物占据质谱中的有效质量范围，这降低了多重检测的能力。过量的引物可以形成二聚体，在质谱中产生假峰(Roskey等人，1996)。所有上述问题都被SPC-SBE彻底解决掉。由于四种生物素-ddNTP存在大的分子量差异，明确地检测到了由这些双脱氧核苷酸形成的聚合酶延伸产物，分子量被很好地分辨。引物延伸产物的分子量与相应引物的质量相比揭示了多态性位点上每个核苷酸的身份。SPC-SBE方法在确定杂合基因型方面特别有利。在这种情况下，两个峰(一个峰对应一个等位基因)在所得质谱中清晰可辨。
当用于表征SNP时，MALDI-TOF MS可以在一定范围内同时测量DNA分子的质量。为了更好地利用这一特性来分析单个质谱图中的多个SNP，如果不去除过量的引物，所有引物及其延伸产物之间的质量差异必须足够大才能产生可以在质谱中可被完全分辨的峰。例如，Ross等人(1998)通过调整所有引物及其延伸产物的质量使得它们位于4.5kDa至7.6kDa的范围内而没有重叠来进行多个SNP的同时检测。相反，通过消除在质谱中占据有价值质量范围的未延伸的引物，SPC-SBE方法显著增加了用SNP进行的表征中多重检测的范围。通过SPC-SBE成功而准确地表征了人类遗传性血色素沉着症基因的遗传变异(C282Y和H63D)(Kim等人，2002)。来自Wilms瘤、头颈部鳞状细胞癌以及结肠直肠癌的肿瘤抑制基因p53的外显子5、7和8中的30个多态性位点(其在人类癌症中最常发生突变)(Hollstein等人，1991和Bardelli等人，2003)，也用SPC-SBE方法进行了精确确定(Kim等人，2004)。Misra等人使用SPC-SBE方法对细胞色素P450(CYP450)基因中CYP2C9的40个SNP和CYP2A13的50个SNP同时进行了分析(Misra等人，2007)。
利用小分子、生物素和蛋白链霉亲和素在固体表面如磁珠上的强相互作用的DNA纯化被广泛用于生物技术。然而，生物素和链霉亲和素之间的亲和力是已知最强的非共价键之一。生物素-链霉亲和素相互作用的变性需要在95℃下用甲酰胺进行处理，反应产率通常较低。为了进一步优化SPC的条件和从链霉亲和素包被的磁珠释放DNA延伸产物，Qiu等人(Anal.Biochem,427:193-201,2012)研制了一组可化学切割的生物素化的双脱氧核苷酸，即ddNTP-N3-生物素(ddATP-N3-生物素、ddGTP-N3-生物素、ddCTP-N3-生物素和ddUTP-N3-生物素)，其用于DNA测序和通过MALDI-TOF MS进行的SNP分析。已成功将这些可切割的生物素化的双脱氧核苷酸用于SPC-SBE中以表征线粒体SNP(Qiu et al.,Anal.Biochem,427:202-210,2012)。
已经开发了多种使用质谱分析的多重SNP分析的替代方法。例如，来自SequenomInc.的市售MASSARRAYTM(Rodi等人,2002)被广泛用于表征遗传变异，包括用于种群研究的线粒体SNP(Cerezo等人，2009)和异质性检测(Xiu-Cheng et al.2008)。MASSARRAYTM测定是自动化的，并且具有高通量。在这种方法的一种形式中，在三种双脱氧核苷酸和一种对应于两个等位基因之一的脱氧核苷酸的存在下，利用DNA聚合酶延伸引物。在反应结束时，将单核苷酸引物延伸产物和延伸有两个或多个核苷酸的引物以及未延伸的引物全部加载到MALDI-TOF MS分析仪上并检测其质谱。由于不需要标记任何反应组分，因此MASSARRAYTM测定操作简单。然而，由于所有的反应产物和所有未扩增的引物都被加载到MS分析仪中，该方法在进行高水平多重SNP分析方面受到限制。
对通过荧光检测进行SNP分析的综述
荧光偏振-模板引导的染料终止子掺入(FP-TDI)SNP测定(Chen等人，1999)使用单核苷酸聚合酶延伸，其采用等位基因特异性荧光标记的双脱氧核苷酸终止子。通过监测荧光偏振的独特变化来表征延伸产物的基因型。FP-TDI方法提供了一种简单的SNP检测方法，但是多重检测范围有限。
已经开发了BEAMing(bead(珠)、emulsion(乳液)、amplification(扩增)和magnetics(磁性))方法(Dressman等人，2003)用于以高灵敏度和高通量检测遗传变异。在该方法中，通过在水-油乳剂中固定在磁珠上的大量寡核苷酸引物离散地扩增每个单独的DNA模板，靶SNP通过独特的荧光染料标记的探针进行区分，并使用流式细胞术进行表征。BEAMing方法不仅可以识别等位基因变异，还可以量化这些变异。另外，可以从流式细胞仪中回收DNA样本用于进一步的分析。BEAMing方法的缺点是需要多个操作步骤，这会导致难以准确表征等位基因频率。
Tong等人已经开发了使用SBE和组合荧光能量转移(CFET)标签的多重荧光SNP测定法(Tong等人，2002)。通过利用荧光能量转移和组合概念，使用少量具有不同发射物的荧光团构建了具有独特荧光信号的更多数量的CFET标签。所有CFET标签都可以在488nm的单一波长下被激发，并通过简单的光学系统检测和区分。该方法的原理概述如下。设计和合成CFET标记的寡核苷酸引物文库，使得3'端的核苷酸与模板中特定的SNP互补。在单管反应中，使用CFET标记的寡核苷酸引物和生物素-ddNTP在含有SNP的DNA模板上进行SBE。与DNA模板完美匹配的CFET标记的引物通过DNA聚合酶使用生物素-ddNTP延伸。通过用链霉亲和素包被的磁珠捕获来分离3'生物素化的DNA产物，而未反应的引物和反应中的其它组分未被捕获并通过洗涤被去除。使用多色激光诱导荧光电泳仪来分析生物素化的荧光DNA产物。由电泳图中每种DNA延伸产物的不同荧光信号和电泳迁移率确定SNP。通过使用寡核苷酸连接，Tong等人(2001)已采用CFET标签来同时检测视网膜母细胞瘤肿瘤抑制基因的多重核苷酸变异。以上所述的基于质谱或荧光的方法均未提供具有单分子敏感性的SNP检测。
实验1
设计和合成PEG标记的ddNTP类似物用于DNA聚合酶延伸
在本文描述的单分子单碱基延伸电子SNP基因分型方案的一个实施方案中，通过捕获连接至核苷酸的PEG分子产生纳米孔中的电流阻断信号。因此，需要设计和合成PEG-标记的ddNTP并将这些分子作为DNA聚合酶的底物进行测试。有必要在ddNTP中找到独特的位置来连接标签，而不会在核苷酸掺入期间干扰DNA聚合酶的活性位点和天然DNA的结构。为了达到这个目的，测试ddNTP中的两个可能的位置的标签连接：即每个核苷酸的末端磷酸或碱基上的特定位置。
首先，考虑到在聚合酶反应过程中从酶复合物释放焦磷酸，我们推断四种核苷酸中的每一种的末端磷酸均可用于连接较长的聚合物标签。的确，Kumar等人(2012)已经将不同长度的PEG分子连接到脱氧鸟苷的末端磷酸位置，并证明这些修饰的核苷酸以100％的效率掺入到引物中用于DNA测序。具体地，他们在脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)中加入了额外的磷酸基作为dGTP的γ-磷酸与标签之间的接头，防止标签在掺入过程中干扰DNA聚合酶的活性位点。然后，连接四种不同的PEG标签，产生PEG标记的脱氧鸟苷四磷酸(PEG-dG4P)。他们证明这些PEG-dG4P核苷酸是DNA聚合酶延伸的有效底物(Kumar等人，2012)。该结果表明，DNA聚合酶可以耐受在脱氧核苷三磷酸(dNTP)的末端磷酸位置处的相当大的修饰，包括额外的磷酸基和PEG标签，并且利用这种核苷酸类似物作为通过聚合酶进行引物延伸的有效底物。早期的一项研究表明，DNA聚合酶识别四聚磷酸基或更长的多磷酸基的效率比识别相应的三磷酸基的效率高(高达50倍)(Kumar等人，2005)。
因此，利用上述策略，作为示例，本方法包括连接到每种ddNTP的末端磷酸位置的不同长度的PEG分子。合成过程如下。首先，通过用磷酸三丁基铵处理双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)将其转化为双脱氧核苷四磷酸(ddN4P)。然后，将二氨基庚烷接头添加到四磷酸基的末端磷酸中以产生用于连接不同长度PEG标签的ddN4P-庚基-NH2(产物A)。在另一组反应中，使6-甲氧基香豆素N-羟基琥珀酰亚胺酯与四种氨基-PEGn-COOH(其中n对应于16、20、24或36个乙二醇单元)分子中的一种进行反应，产生香豆素-PEGn-COOH分子，随后将其转化为相应的NHS-酯(产物B)。香豆素部分用于追踪中间体和最终核苷酸类似物的纯化。最后，将ddN4P-庚基-NH2(产物A)与香豆素-PEGn-NHS酯(产物B)偶联产生最终的标记的核苷酸类似物。具有16、20、24或36个乙二醇单元的PEG分子分别与A、C、G或T连接。图4中提供了所提出的香豆素-PEGn-ddG4P分子的合成方案的实例。按照相同的方案，合成一组完整的ddN4P(A、C、G、T)，每种标记有独特的PEG聚合物。
其次，已证明某些修饰的DNA聚合酶可以耐受具有在嘧啶(C和U)的5-位和嘌呤(A和G)的7-位含有大体积基团的大量修饰的核苷酸(Rosenblum等人，1997)。实际上，已构建了在嘧啶的5-位或嘌呤的7-位上用荧光染料标记的几个核苷酸并将其用于包括DNA标记和测序在内的各种基因组应用(Ju等人，2006)。基于这些以前的研究，将不同长度的PEG标签连接到C/U的5位和A/G的7位作为替代设计。为了合成这些分子，使6-甲氧基香豆素-NHS酯与四种氨基-PEGn-COOH分子(具有16、20、24或36个乙二醇单元)之一反应产生香豆素-PEGn-COOH分子，随后将其转化成相应的NHS-酯。然后，将得到的香豆素-PEGn-NHS-酯与5-氨基炔丙基-ddNTP(针对C/U)偶联或与7-氨基炔丙基-ddNTP进行偶联(针对A/G)。图5中提供了香豆素-PEGn-氨基炔丙基-ddNTP的一般合成方案。另外，可以合成不同类型的标签，如寡糖、核苷酸或寡肽的聚合物，并测试其是否提高纳米孔信号分辨率。
在合成这些分子之后，使用自身作为引物的环模板DNA检查它们作为底物用于DNA聚合酶延伸反应的能力。如果每种化合物都能被DNA聚合酶识别并掺入到引物中，那么在5'磷酸标记的情况下引物的分子量将会增加所预期的核苷单磷酸的大小，或者在碱基标记的分子中增加标记的核苷单磷酸的大小，这可以通过MALDI-TOF质谱来检测。
寡核苷酸标记的核苷多磷酸的合成
图6中给出了一般的总合成方案。寡核苷酸标记的核苷酸的合成包括5(7)-炔基氨基-2',3'-双脱氧核苷-5'-三磷酸-叠氮(ddNTP-N3)与5'-己炔基寡核苷酸的偶联。
5-炔丙基酰胺基氨基己酰基-ddNTP或7-炔丙基酰胺基氨基己酰基-ddNTP(5-8)的
合成
按照Hobbs和Cocuzza(1991)描述的方法制备5(7)-炔丙基氨基-双脱氧核苷酸(1-4)，根据Duthie等人(2002)所述制备更长的接头臂双脱氧核苷酸(5-8)并通过反相HPLC进行纯化。
向5-炔丙基酰胺基氨基己酰基-ddNTP或7-炔丙基酰胺基氨基己酰基-ddNTP(9-
12)中加入叠氮基
将延伸的ddNTP-NH2核苷酸(5-8,5μmol)各自溶于0.1M碳酸氢盐-碳酸盐缓冲液(200μl,pH8.7)中，加入100μl DMF中的叠氮丁酸-NHS(15μmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，并通过使用0.1M TEAC缓冲液(pH7.5)和乙腈梯度的HPLC进行纯化，得到产物9-12。MALDI TOF MS数据：ddATP-N3:750(计算值751)；ddUTP-N3:726(计算值729)；ddGTP-N3:765(计算值767)；ddCTP-N3:725(计算值728)。
进行ddNTP-N3核苷酸(9-12)与5'-己炔基寡核苷酸标签之间的点击反应以产生聚
合物标记的ddNTP核苷酸
向每种5'-己炔基-寡核苷酸标签(由TriLink定制合成，500nmol，在200μl H2O中)添加相应ddNTP-N3核苷酸(750nmol)的溶液，然后加入溴化铜(50μL，在3:1DMSO/叔丁醇中的0.1M溶液)和三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)(100μL，在3:1DMSO/叔丁醇中的0.1M溶液)。将反应混合物在40℃下搅拌16小时，随后使用0.1M TEAC缓冲液(pH7.5)和乙腈梯度进行HPLC纯化。通过MALDI-TOF质谱和单碱基聚合酶延伸反应表征标记的核苷酸。图7中显示了两个标记的核苷酸的MALDI-TOF质谱数据：ddCTP-Cy3-dT2-dSp8-dT20-C3,9601(计算值9605)；ddTTP-Cy3-dT4-dSp3-dT23-C3,10226(计算值10225)。
用寡核苷酸标记的ddCTP和寡核苷酸标记的ddTTP进行的单碱基延伸反应
使用模板环引物进行延伸反应，其中模板上的下一个互补碱基是A或G(允许通过单个互补核苷酸进行延伸)。将10pmol的自启动环模板、200pmole标记的ddNTP和5单位的每种酶(Klenow、测序酶和热测序酶)在37℃孵育1小时进行反应。如图8所示，通过凝胶电泳表征DNA延伸产物。
使用链霉亲和素-生物素捕获的SNP检测方法
图9中显示了通过用标记的ddNTP延伸生物素化的引物来表征不同标签的电流信号的方案。将具有连接至3'-核苷酸碱基的单个生物素分子的引物和互补模板DNA与热测序酶、Mg2+和标记的ddNTP一起孵育。DNA聚合酶使用与模板DNA中的下一个碱基互补的单个标记的ddNTP延伸引物。孵育后，将对生物素具有强亲和力的链霉亲和素分子加入至延伸反应中并且未延伸和延伸的引物都被链霉亲和素捕获。然后将反应混合物施加到纳米孔电子检测系统。虽然链霉亲和素本身由于其大得多的尺寸不能穿过孔，但它将引物延伸产物保持在标签能够进入孔的位置，从而在每个核苷酸上产生对于标签有特异性的独特电流信号。通过这种方式，可以确认不同标签的电流信号。
标记的核苷酸的纳米孔电流阻断水平
图10显示通过掺入标记的ddCTP(ddCTP-Cy3-T2-dSp8-T20-C3)和标记的ddTTP(ddTTP-Cy3-T4-dSp3-T23-C3)获得的引物延伸产物上的标签所产生的纳米孔电流阻断水平。掺入标记的ddCTP的引物延伸产物上的标签显示为开孔电流水平的约26-30％的电流阻断，掺入标记的ddTTP的引物延伸产物上的标签产生46-50％的阻断。
实验2
引物与αHL单体缀合
通过将引物与单体αHL缀合，可以在相同的环境中进行等位基因鉴别和等位基因检测。为了将引物与αHL缀合，将工程化的αHL构建体(其中赖氨酸残基突变为46位的半胱氨酸(C46突变)用于蛋白质的位点特异性标记，并将六聚组氨酸标签添加至C末端)用于引物连接。使用该重组DNA构建体，首先，在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达C46单体，并通过镍亲和层析纯化。在单独的反应中，使具有末端氨基的引物与在相反末端含有氨基反应性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS酯)和硫醇反应性马来酰亚胺基团的磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(sSMCC)异双功能交联剂缀合。然后，通过交联葡聚糖G50将sSMCC交联剂缀合的引物从溶液中剩余的未反应的交联剂中纯化。最后，C46单体通过巯基与接头连接的引物反应。这通过突变体单体中半胱氨酸残基中的巯基与交联剂中的马来酰亚胺基团之间的反应产生了单引物缀合的C46单体。该方案如图11所示。
实验3
确认电子信号
如上所述，已证明四种不同PEGn标记(N＝16、20、24、36)在αHL通道中以用于DNA测序的单分子水平产生四种不同的离子电流阻断模式(Kumar等人，2012)。首先，为了确认上述结果并为每个PEG标记建立对照电子信号，对预期释放的标记(香豆素-PEGn-NH2)的合成形式进行分析以获得其在纳米孔中的纳米孔电流阻断效应。最初，将1M KC1引入系统。然后，加入1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱以形成脂双层。一旦膜密封孔口，立即将野生型αHL单体在紧邻膜的位置注入到溶液，并向系统施加电压。监测离子电流，直到电流幅度突然增加，这表明在膜中形成单个通道。在确认单个七聚体通道插入的正确信号之后，将香豆素-PEGn-NH2分子加入孔中并记录离子电流。从这个实验中，分析了每个PEGn分子在宽范围的跨膜电压下的阻断深度和停留时间分布，并且为了获得最高信号强度和最低背景噪声对诸如盐浓度或温度-电压分布(profile)等的条件进行了优化。这为不同重复单元的PEG分子产生了参考电流信号。已证明被基于修饰的寡核苷酸的标签标记的核苷酸在纳米孔中显示不同的电子信号(Fuller等人，2015)。
实验4
以引物-缀合的纳米孔形式进行单分子电子SNP基因分型
在为每种标签确立参考电流信号之后，进行上述的单分子电子SNP基因分型测定。在加入约0.2M KCl并于该系统中形成脂质双分子层后，将上述纯化的引物缀合的突变体C46αHL引入脂质双分子层。一旦一个单体结合到膜上，它就会与溶液中的相邻单体结合，形成均聚的七聚物跨膜孔。由于上文所述的单体被工程化从而具有单一引物，因此形成了具有7个相同引物的孔。为了确认这种孔的形成，跨越纳米孔芯片系统中的每个单独的脂质双层施加电压(Fuller等人，2015)。一旦确认了指示孔的插入的电流信号，通过向孔中添加含有特定SNP基因座的DNA模板、4种不同长度的PEG标记的ddNPP(标记连接至每种ddNTP的碱基)和DNA聚合酶进行SBE。如果所添加的模板与孔中的连接的引物具有互补性，则引物用4种PEG标记的ddNTP中的一种延伸一个碱基。
由于在单个孔上具有多个相同的引物，标签从单个孔被读取多次，这提高了事件检测的可靠性效率。此外，如果测试的模板是杂合的，则应该从单个孔中检测到两个不同的电流信号；如果模板是纯合的，则只有一个电流信号出现在系统中(图12)。为了测试这一点，设计了除SNP位点之外具有相同序列的两个不同模板，将其混合在一起，并在系统中进行测试。如果两种不同的模板与单个孔上的引物结合，则引物通过连接有不同标签的ddNPP得到延伸。结果，从单个孔中检测到两个不同的电流信号。
实验5
用末端磷酸标记的核苷酸以引物-缀合纳米孔形式进行单分子电子SNP基因分型
在选择在其末端磷酸位置连接有聚合物标签的ddNPP或dNPP作为DNA聚合酶的底物进行延伸反应的情况下，预期随着核苷酸被掺入引物，标签将与多聚磷酸一起释放。尽管在以前的研究中成功地检测并证实了单个聚合物分子通过纳米孔(Kumar等人，2012)，但是由于快速移位，仍然很难在单分子水平从每个释放的聚合物标签分子获得可靠的电流信号。为了克服这个潜在的问题并确保标签在纳米孔系统中有充足的停留时间，添加高浓度的非催化金属离子(Vander Horn等人，2014)，例如Sr2+或Ca2+，其允许互补核苷酸与DNA聚合酶瞬时结合但抑制结合的核苷酸的掺入。与催化ddNPP或dNPP完全掺入引物的镁(Mg2+)竞争，Sr2+或Ca2+的加入延长了在聚合酶闭合的三元复合物中核苷酸的结合与多磷酸释放之间的时间。这个延长的时间使得聚合物标签被捕获并在孔中保持更长的时间，同时核苷酸仍然与闭合形式的DNA聚合酶相互作用，但尚未被完全掺入。而且，可将DNA聚合酶体外掺入核苷酸的速率调节到每添加一个碱基约100毫秒，而聚合物标签通过纳米孔的移位发生在几微秒内。因此，在孔中捕获核苷酸的聚合物标签的时间足够长从而产生信号，这使得该基因分型检测与通过使释放的聚合物标签穿过孔而进行的基因分型检测相比更加准确、可靠。
在选择具有连接到碱基位置的聚合物标签的核苷酸作为用于延伸的底物的情况下，因为聚合物标签被永久性地掺入与孔缀合的引物中，所以不需要添加Sr2+。因此，在SBE步骤之后，在每个孔中稳定地从延伸的引物捕获长聚合物标签。
参考文献
Bai,R.K.&Wong,L.J.Detection and quantification of heteroplasmicmutant mitochondrial DNA by real-time amplification refractory mutationsystem quantitative PCR analysis:a single-step approach.Clin.Chem.50,996–1001(2004).
Bardelli,A.et al.Mutational analysis of the tyrosine kinome incolorectal cancers.Science 300,949(2003).
Bentley,D.R.et al.Accurate whole human genome sequencing usingreversible terminator chemistry.Nature 456,53-59(2008).
Bezrukov,S.M.et al.Dynamics and free energy of polymers partitioninginto a nanoscale pore.Macromolecules 29,8517–22(1996).
Cerezo,M.et al.Applications of MALDI–TOF MS to large-scale humanmtDNA population-based studies.Electrophoresis 30,3665–3673(2009).
Chen,X.et al.Fluorescence polarization in homogeneous nucleic acidanalysis.Genome Res.9:492-498(1999).
Cherf,G.M.et al.Automated forward and reverse ratcheting of DNA in ananopore at 
precision.Nat.Biotechnol.30,344-348(2012).
Chowdhury,J.et al.Microfluidic Platform for Single NucleotidePolymorphism Genotyping of the Thiopurine S-Methyltransferase Gene toEvaluate Risk for Adverse Drug Events.J.Mol.Diagn.9,521–529(2007).
Clarke,J.et al.Continuous base identification for single-moleculenanopore DNA sequencing.Nat.Nanotechnol.4,265–70(2009).
Ding,C.&Cantor,C.R.A high-throughput gene expression analysistechnique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorptionionization time-of-flight MS Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100,3059-3064(2003).
Ding,C.&Cantor,C.R.Direct molecular haplotyping of long-range genomicDNA with M1-PCR.MS Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100,7449-7453(2003).
Dressman,D.et al.Transforming single DNA molecules into fluorescentmagnetic particles for detection and enumeration of geneticvariation.Proc.Natl.Acad.USA100,8817-8822(2003).
Duthie R.S.et al.Novel Cyanine Dye-Labeled DideoxynucleosideTriphosphates for DNA Sequencing.Bioconjugate Chemistry 13,699-706(2002).
Eid,J.et al.Real-Time DNA Sequencing from Single PolymeraseMolecules.Science 323,133-138(2009).
Fei,Z.et al.MALDI-TOF mass spectrometric typing of single nucleotidepolymorphisms with mass-tagged ddNTPs.Nucleic Acids Res.,26,2827-2828(1998).
Frazer,K.A.et al.A second generation human haplotype map of over3.1million SNPs.Nature 449,851–861(2007).
Fuller,C.W.et al.,Chemical methods for producing taggednucleotides.U.S Patent Application 20150368710(2015).
Goyal,P et al.,Structural and mechanistic insights into the bacterialamyloid secretion channel CsgG.Nature 516,250–253(2014).
Griffin,T.J.et al.Direct genetic analysis by matrix-assisted laserdesorption/ionization mass spectrometry.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96,6301-6306(1999).
Griffin,T.J.&Smith,L.M.Single-nucleotide polymorphism analysis byMALDI-TOF mass spectrometry.Trends.Biotechnol.18,77-84(2000).
Haff,L.A.&Smirnov,I.P.Multiplex genotyping of PCR products with masstag-labeled primers.Nucleic Acids Res.,25,3749-3750(1997).
Hardenbol,P.et al.Multiplexed genotyping with sequence-taggedmolecular inversion probes.Nat.Biotechnol.21:673-678(2003).
Harris,T.D.et al.Single-Molecule DNA Sequencing of a ViralGenome.Science 320,106-109(2008).
Hartmann,A.et al.Validation of microarray-based resequencing of93worldwide mitochondrial genomes.Hum.Mutat.30,115–122(2009).
Hermanson G.T.Bioconjugate Techniques,ISBN-13:978-0123705013(2008).
Hobbs,F.W.&Cocuzza,A.J.,Alkynylamino-nucleotides.U.S Patent5047519(1991).
Hollstein,M.et al.p53 mutations in human cancers.Science.253,49-53(1991).
Ju,J.et al.Energy transfer fluorescent dye-labeled primers for DNAsequencing and analysis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,4347-4351(1995).
Ju,J.et al.Cassette labeling for facile construction of energytransfer fluorescent primers.Nucleic Acids Res.24,1144-1148(1996).
Ju,J.et al.Four-Color DNA Sequencing by Synthesis Using CleavableFluorescent Nucleotide Reversible Terminators.Proc.Natl.Acad.Sci.USA103,19635-19640(2006).
Kasianowicz,J.J.&Bezrukov,S.M.Protonation dynamics of the alpha-toxinion channel from spectral analysis of pH-dependent currentfluctuations.Biophys.J.69,94–105(1995).
Kasianowicz,J.J.et al.Characterization of individual polynucleotidemolecules using a membrane channel.Proc Natl Acad Sci USA 93,13770–13773(1996).
Kasianowicz,J.J.et al.Physics of DNA threading through a nanometerpore and applications to simultaneous multianalyte sensing.In Structure andDynamics of Confined Polymers,ed.Kasianowicz,J.J.,Kellemayer,M.S.Z.&Deamer,D.W.,NATO Science Series,Kluwer Academic Publishers,The Netherlands 87,141–164(2002).
Kasianowicz,J.J.et al.Nanoscopic porous sensors.Annu Rev Anal Chem 1,737–766(2008).
Kheterpal,I.et al.DNA Sequencing Using a Four-Color ConfocalFluorescence Capillary Array Scanner.Electrophoresis 17,1852-1859(1996).
Kim,S.et al.Solid phase capturable dideoxynucleotides for multiplexgenotyping using mass spectrometry.Nucleic Acids Res.30,e85(p1-6)(2002).
Kim,S.et al.Multiplex Genotyping of the Humanβ2-Adrenergic ReceptorGene Using Solid Phase Capturable Dideoxynucleotides and MassSpectrometry.Analytical Biochemistry 316,251-258(2003).
Kim,S.et al.Thirtyfold multiplex genotyping of the p53 gene usingsolid phase capturable dideoxynucleotides and mass spectrometry.Genomics83,924-931(2004).
Krasilnikov,O.V.Sizing channels with neutral polymers.In Structureand Dynamics of Confined Polymers,ed.Kasianowicz,J.J.,Kellemayer,M.S.Z.&Deamer,D.W.NATO Science Series,Kluwer Academic Publishers,The Netherlands 87,97–116(2002).
Kumar,S.et al.PEG-labeled nucleotides and nanopore detection forsingle molecule DNA sequencing by synthesis.Sci Rep.2,684,1-8(2012).
Kwok,P.Y.High-throughput genotyping assay approaches.Pharmacogenomics1,95-100(2000).
Lander,E.S.et al.Initial sequencing and analysis of the humangenome.Nature 409,860-921(2001).
Lyamichev,V.et al.Polymorphism identification and quantitativedetection of genomic DNA by invasive cleavage of oligonucleotideprobes.Nat.Biotechnol.17,292-296(1999).
Manrao,E.A.et al.Reading DNA at single-nucleotide resolution with amutant MspA nanopore and phi29 DNA polymerase.Nat.Biotechnol.30,349–353(2012).
Margulies,M.et al.Genome sequencing in microfabricated high-densitypicolitre reactors.Nature 437,376-380(2005).
Misra,A.et al.Multiplex genotyping of cytochrome p450single-nucleotide polymorphisms by use of MALDI-TOF mass spectrometry.Clin.Chem.53,933-939(2007).
Qiu,C.et al.Design and synthesis of cleavable biotinylateddideoxynucleotides for DNA sequencing by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.Anal.Biochem.427,193-201(2012).
Qiu,C.et al.Mitochondrial single nucleotide polymorphism genotypingby matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight massspectrometry using cleavable biotinylated dideoxynucleotides.Anal.Biochem.427,202-210(2012).
Reiner,J.E.et al.Theory for polymer analysis using nanopore-basedsingle-molecule mass spectrometry.Proc Natl Acad Sci USA 107,12080–12085(2010).
Robertson,J.W.et al.Single-molecule mass spectrometry in solutionusing a solitary nanopore.Proc Natl Acad Sci USA 104,8207–11(2007).
Rodi,C.P.et al.A strategy for the rapid discovery of disease markersusing the MassARRAYTM system.Biotechniques Suppl.32,S62-S69(2002).
Roses,A.Pharmacogenetics and the practice of medicine.Nature 405,857-865(2000).
Roskey,M.T.et al.DNA sequencing by delayed extraction-matrix-assistedlaser desorption/ionization time of flight mass spectrometry.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93,4724-4729(1996).
Ross,P.L.et al.Discrimination of single-nucleotide polymorphisms inhuman DNA using peptide nucleic acid probes detected by MALDI-TOF massspectrometry.Anal.Chem.,69,4197-4202(1997).
Ross,P.et al.High level multiplex genotyping by MALDI-TOF massspectrometry.Nat.Biotechnol.16,1347-1351(1998).
Rothberg,J.M.et al.An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing.Nature 475,348-352(2011).
Salas-Solano,O.et al.Routine DNA sequencing of 1000 bases in lessthan one hour by capillary electrophoresis with replaceable linearpolyacrylamide solutions.Anal Chem.70,3996-4003(1998).
Smith,L.M.et al.Fluorescence detection in automated DNA sequencinganalysis.Nature,321,674-679(1986).
Song,L.et al.Structure of Staphylococcal alpha-hemolysin,a heptamerictransmembrane pore.Science 274,1859–1866(1996).
Stoerker,J.et al.Rapid genotyping by MALDI-monitored nucleaseselection from probe libraries.Nat.Biotechnol.18,1213-1216(2000).
Tang,K.et al.Chip-based genotyping by mass spectrometry.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96,10016-10020(1999).
Tong,A.K.et al.Combinatorial Fluorescence Energy Transfer Tags forMultiplex Biological Assays.Nat.Biotechnol.19,756-759(2001).
Tong,A.K.&Ju,J.Single-nucleotide Polymorphism Detection byCombinatorial Fluorescence Energy Transfer Tags and BiotinylatedDideoxynucleotides.Nucleic Acids Research 30,e19(p1-7)(2002).
Vander Horn et al.,“Nucleotide Transient Binding For SequencingMethods”U.S.Patent No.8,632,975,issued January 21,2014.
Venter,J.C.et al.The sequence of the human genome.Science 291,1304-1351(2001).
Wheeler,D.A.et al.The complete genome of an individual by massivelyparallel DNA sequencing.Nature 452,872-876(2008).
Xiu-Cheng,F.A.et al.A rapid and accurate approach to identify singlenucleotide polymorphisms of mitochondrial DNA using MALDI–TOF mass spectrometry.Clin.Chem.Lab.Med.46,299–305(2008).
序列表
<110> 哥伦比亚大学董事会(The Trustees of Columbia University in theCity of New York)
<120> 用于单分子电子SNP测定的聚合物标记的核苷酸
<130> KHP172111351.2
<140> PCT/US2016/023,607
<141> 2016-03-22
<150> US 62/137,014
<151> 2015-03-23
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 模板
<400> 1
gatagcgccg cgccttggcg cggcgc 26
<210> 2
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 溶血素变体
<400> 2
Met Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly
1 5 10 15
Ser Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu
20 25 30
Asn Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Cys Asn
35 40 45
His Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Arg Val Tyr Ser Glu Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala
65 70 75 80
Trp Pro Ser Ala Phe Lys Val Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn Glu Val
85 90 95
Ala Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr Lys Glu
100 105 110
Tyr Met Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr Gly Asp
115 120 125
Asp Thr Gly Lys Ile Gly Gly Leu Ile Gly Ala Asn Val Ser Ile Gly
130 135 140
His Thr Leu Lys Tyr Val Gln Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Ser
145 150 155 160
Pro Thr Asp Lys Lys Val Gly Trp Lys Val Ile Phe Asn Asn Met Val
165 170 175
Asn Gln Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro Val Tyr
180 185 190
Gly Asn Gln Leu Phe Met Lys Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys Ala Ala
195 200 205
Glu Asn Phe Leu Asp Pro Asn Lys Ala Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly
210 215 220
Phe Ser Pro Asp Phe Ala Thr Val Ile Thr Met Asp Arg Lys Ala Ser
225 230 235 240
Lys Gln Gln Thr Asn Ile Asp Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg Asp Asp
245 250 255
Tyr Gln Leu His Trp Thr Ser Thr Asn Trp Lys Gly Thr Asn Thr Lys
260 265 270
Asp Lys Trp Thr Asp Arg Ser Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp Trp Glu
275 280 285
Lys Glu Glu Met Thr Asn Lys Gly His His His His His His
290 295 300
Claims (83)
1.用于鉴定核酸中一段连续核苷酸残基内的一个位置上的目的单核苷酸残基的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在施加的电压下，将核酸与下列物质一起孵育：
(1)纳米孔，
(2)寡核苷酸引物，其与纳米孔缀合并与核酸中在3’方向上紧邻目的单核苷酸残基的多个核苷酸杂交，
(3)至少一种标记的终止核苷多磷酸(NPP)类似物，
其中所述至少一种NPP类似物具有以下结构：
其中B为选自以下的碱基：腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤和7-脱氮鸟嘌呤和它们的类似物，
R和R'各自独立地为H、OH、O-烷基、F、Cl、Br、N3、NH2、O-NH2、O-烯丙基、O-CH2N3、2',3'-异丙叉基或仅允许单个核苷酸通过DNA聚合酶掺入的基团，
TAG包括能够被纳米孔检测的任何聚合物分子，以及
(4)核酸聚合酶，
使得如果NPP类似物与目的单核苷酸残基互补，则NPP类似物被掺入引物中，并且连接至被掺入的NPP类似物的标记被拉入纳米孔；以及
b)通过纳米孔检测掺入引物中的NPP类似物的标记的信号，以鉴定掺入的NPP类似物；
从而鉴定目的单核苷酸残基；
其中在步骤(a)中，将所述核酸与一种NPP类似物一起孵育，如果所述NPP类似物未被掺入，则反复地重复与不同NPP类似物的孵育，直至NPP类似物被掺入且其标记被纳米孔检测到。
2.用于鉴定核酸中一段连续核苷酸残基内的一个位置上的目的单核苷酸残基的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在施加的电压下，将核酸与下列物质一起孵育：
(1)纳米孔，
(2)寡核苷酸引物，其与纳米孔缀合并与核酸中在3’方向上紧邻目的单核苷酸残基的多个核苷酸杂交，
(3)至少一种标记的终止核苷多磷酸(NPP)类似物，
其中所述至少一种NPP类似物具有以下结构：
其中B为选自以下的碱基：腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤和7-脱氮鸟嘌呤和它们的类似物，
R和R'各自独立地为H、OH、O-烷基、F、Cl、Br、N3、NH2、O-NH2、O-烯丙基、O-CH2N3、2',3'-异丙叉基或仅允许单个核苷酸通过DNA聚合酶掺入的基团，
TAG包括能够被纳米孔检测的任何聚合物分子，以及
(4)核酸聚合酶，
使得如果NPP类似物与目的单核苷酸残基互补，则NPP类似物被掺入引物中，并且连接至被掺入的NPP类似物的标记被拉入纳米孔；以及
b)通过纳米孔检测掺入引物中的NPP类似物的标记的信号，以鉴定掺入的NPP类似物；
从而鉴定目的单核苷酸残基；
其中在步骤(a)中，将所述核酸与至少两种NPP类似物一起孵育，所述NPP类似物各自包含不同的碱基或碱基类似物以及不同的标记。
3.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(a)中，将所述核酸与至少四种NPP类似物一起孵育，所述NPP类似物各自包含不同的碱基或碱基类似物以及不同的标记。
4.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤(a)中，将所述核酸与正好四种NPP类似物一起孵育，所述NPP类似物各自包含不同的碱基或碱基类似物以及不同的标记。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中每种NPP是脱氧核糖核苷多磷酸(dNPP)。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中每种NPP是双脱氧核糖核苷多磷酸(ddNPP)。
7.根据权利要求6所述的方法，其中每种ddNPP包含具有香豆素-PEG部分的标记。
8.根据权利要求6所述的方法，其中每种ddNPP包含具有基于寡核苷酸的标签的标记。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中每种NPP是核糖核苷多磷酸(rNPP)。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述核酸是单链DNA。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述核酸是双链DNA。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述核酸是单链RNA。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述核酸是双链RNA。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述核酸是单链DNA或双链DNA，所述核酸聚合酶是DNA聚合酶。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述核酸是RNA，所述核酸聚合酶是逆转录酶。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述核酸聚合酶是RNA聚合酶。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述标记连接至碱基。
18.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述标记包含氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、寡核苷酸、脂族酸、芳族酸、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或它们的组合中的一种或多种。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述碳水化合物是醇。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述标记包含乙二醇、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸或它们的组合中的一种或多种。
21.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述标记是聚合物标记。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述标记是聚乙二醇(PEG)标记。
23.根据权利要求22所述的方法，其中PEG标记各自具有彼此不同的长度。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述标记是寡核苷酸标记。
25.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述信号是电子信号。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述电子信号是电流阻断信号。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述电流阻断信号是断断续续的电流阻断信号。
28.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述纳米孔是固态纳米孔。
29.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述纳米孔位于固态膜中。
30.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述纳米孔是生物孔。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述纳米孔是蛋白。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述纳米孔包含α溶血素。
33.根据权利要求32所述的方法，其中每个纳米孔包含7个α溶血素单体，其中任一个或全部α溶血素单体与相同的引物缀合。
34.根据权利要求1或2所述的方法，其中每个纳米孔包含8个MspA单体，其中任一个或全部MspA单体与相同的引物缀合。
35.根据权利要求1或2所述的方法，其中每个纳米孔包含9个CsgG单体，其中任一个或全部CsgG单体与相同的引物缀合。
36.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸与4种香豆素-PEG-ddNPP一起孵育，每种香豆素-PEG-ddNPP包含不同的碱基，并且每种香豆素-PEG-ddNPP包含不同长度的香豆素-PEG-标记。
37.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸与4种寡核苷酸标记的ddNPP一起孵育，每种寡核苷酸标记的ddNPP包含不同的碱基，并且每种寡核苷酸标记的ddNPP包含不同长度和/或组成的寡核苷酸。
38.根据权利要求36所述的方法，其中4种香豆素-PEG标记是香豆素-PEG16、香豆素-PEG20、香豆素-PEG24和香豆素-PEG36。
39.根据权利要求38所述的方法，其中每种香豆素-PEG标记是香豆素-PEG-氨基炔丙基标记，如果ddNPP是ddCPP、ddUPP或ddTPP，则每种香豆素-PEG标记连接到碱基的5-位，如果ddNPP是ddAPP或ddGPP，则连接到碱基的7-位。
40.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述引物的序列长度为10-40个核苷酸。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述引物的序列长度为18-24个核苷酸。
42.用于鉴定核酸中一段连续核苷酸残基内的一个位置上的目的单核苷酸残基的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在施加的电压下将核酸与下列物质一起孵育:
(1)纳米孔，
(2)寡核苷酸引物，其与纳米孔缀合并与核酸中在3’方向上紧邻目的单核苷酸残基的多个核苷酸杂交，
(3)至少一种标记的终止核苷多磷酸(NPP)类似物，
其中所述至少一种NPP类似物具有以下结构：
其中B为选自以下的碱基：腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤和7-脱氮鸟嘌呤和它们的类似物，
R和R'各自独立地为H、OH、O-烷基、F、Cl、Br、N3、NH2、O-NH2、O-烯丙基、O-CH2N3、2',3'-异丙叉基或仅允许单个核苷酸通过DNA聚合酶掺入的基团，
TAG包括能够被纳米孔检测的任何聚合物分子，
(4)核酸聚合酶，和
(5)非催化离子，其使得互补的标记的NPP类似物与核酸聚合酶瞬时结合但抑制结合的NPP类似物的掺入，
使得如果NPP类似物与目的单核苷酸互补，则NPP类似物瞬时结合至核酸聚合酶，并且连接至被瞬时结合的NPP类似物的标记被拉入纳米孔；以及
b)通过纳米孔检测由聚合酶瞬时结合至带引物的模板的NPP类似物的标记的信号，以鉴定NPP类似物；
从而鉴定目的单核苷酸残基；
其中在步骤(a)中，将所述核酸与一种NPP类似物一起孵育，并且如果所述NPP类似物不与所述核酸聚合酶瞬时结合，则反复地重复与不同NPP类似物的孵育，直至NPP类似物被瞬时结合并且其标记被纳米孔检测到。
43.用于鉴定核酸中一段连续核苷酸残基内的一个位置上的目的单核苷酸残基的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在施加的电压下将核酸与下列物质一起孵育:
(1)纳米孔，
(2)寡核苷酸引物，其与纳米孔缀合并与核酸中在3’方向上紧邻目的单核苷酸残基的多个核苷酸杂交，
(3)至少一种标记的终止核苷多磷酸(NPP)类似物，
其中所述至少一种NPP类似物具有以下结构：
其中B为选自以下的碱基：腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤和7-脱氮鸟嘌呤和它们的类似物，
R和R'各自独立地为H、OH、O-烷基、F、Cl、Br、N3、NH2、O-NH2、O-烯丙基、O-CH2N3、2',3'-异丙叉基或仅允许单个核苷酸通过DNA聚合酶掺入的基团，
TAG包括能够被纳米孔检测的任何聚合物分子，
(4)核酸聚合酶，和
(5)非催化离子，其使得互补的标记的NPP类似物与核酸聚合酶瞬时结合但抑制结合的NPP类似物的掺入，
使得如果NPP类似物与目的单核苷酸互补，则NPP类似物瞬时结合至核酸聚合酶，并且连接至被瞬时结合的NPP类似物的标记被拉入纳米孔；以及
b)通过纳米孔检测由聚合酶瞬时结合至带引物的模板的NPP类似物的标记的信号，以鉴定NPP类似物；
从而鉴定目的单核苷酸残基；
其中在步骤(a)中，将所述核酸与至少两种NPP类似物一起孵育，所述NPP类似物各自包含不同的碱基或碱基类似物以及不同的标记。
44.根据权利要求43所述的方法，其中在步骤(a)中，将所述核酸与至少四种NPP类似物一起孵育，所述NPP类似物各自包含不同的碱基或碱基类似物以及不同的标记。
45.根据权利要求44所述的方法，其中在步骤(a)中，将所述核酸与正好四种NPP类似物一起孵育，所述NPP类似物各自包含不同的碱基或碱基类似物和不同的标记。
46.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中非催化金属离子是Sr2+或Ca2+。
47.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中每种NPP是脱氧核糖核苷多磷酸(dNPP)。
48.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中每种NPP是双脱氧核糖核苷多磷酸(ddNPP)。
49.根据权利要求48所述的方法，其中每种ddNPP包含具有香豆素-PEG部分的标记。
50.根据权利要求48所述的方法，其中每种ddNPP包含具有基于寡核苷酸的标签的标记。
51.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中每种NPP是核糖核苷多磷酸(rNPP)。
52.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述核酸是单链DNA。
53.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述核酸是双链DNA。
54.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述核酸是单链RNA。
55.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述核酸是双链RNA。
56.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述核酸是单链DNA或双链DNA，所述核酸聚合酶是DNA聚合酶。
57.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述核酸是RNA，所述核酸聚合酶是逆转录酶。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述核酸聚合酶是RNA聚合酶。
59.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述标记连接至碱基。
60.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述标记包含氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、寡核苷酸、脂族酸、芳族酸、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或它们的组合中的一种或多种。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述碳水化合物是醇。
62.根据权利要求60所述的方法，其中所述标记包含乙二醇、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸或它们的组合中的一种或多种。
63.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述标记是聚合物标记。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述标记是聚乙二醇(PEG)标记。
65.根据权利要求64所述的方法，其中PEG标记各自具有彼此不同的长度。
66.根据权利要求60所述的方法，其中所述标记是寡核苷酸标记。
67.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述信号是电子信号。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述电子信号是电流阻断信号。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述电流阻断信号是断断续续的电流阻断信号。
70.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述纳米孔是固态纳米孔。
71.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述纳米孔位于固态膜中。
72.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述纳米孔是生物孔。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述纳米孔是蛋白。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述纳米孔包含α溶血素。
75.根据权利要求74所述的方法，其中每个纳米孔包含7个α溶血素单体，其中任一个或全部α溶血素单体与相同的引物缀合。
76.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中每个纳米孔包含8个MspA单体，其中任一个或全部MspA单体与相同的引物缀合。
77.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中每个纳米孔包含9个CsgG单体，其中任一个或全部CsgG单体与相同的引物缀合。
78.根据权利要求43所述的方法，其中所述核酸与4种香豆素-PEG-ddNPP一起孵育，每种香豆素-PEG-ddNPP包含不同的碱基，并且每种香豆素-PEG-ddNPP包含不同长度的香豆素-PEG-标记。
79.根据权利要求43所述的方法，其中所述核酸与4种寡核苷酸标记的ddNPP一起孵育，每种寡核苷酸标记的ddNPP包含不同的碱基，并且每种寡核苷酸标记的ddNPP包含不同长度和/或组成的寡核苷酸。
80.根据权利要求78所述的方法，其中4种香豆素-PEG标记是香豆素-PEG16、香豆素-PEG20、香豆素-PEG24和香豆素-PEG36。
81.根据权利要求80所述的方法，其中每种香豆素-PEG标记是香豆素-PEG-氨基炔丙基标记，如果ddNPP是ddCPP、ddUPP或ddTPP，则每种香豆素-PEG标记连接到碱基的5-位，如果ddNPP是ddAPP或ddGPP，则连接到碱基的7-位。
82.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述引物的序列长度为10-40个核苷酸。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述引物的序列长度为18-24个核苷酸。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562137014P | 2015-03-23 | 2015-03-23 | |
| US62/137,014 | 2015-03-23 | ||
| PCT/US2016/023607 WO2016154215A1 (en) | 2015-03-23 | 2016-03-22 | Polymer tagged nucleotides for single molecule electronic snp assay |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107922968A CN107922968A (zh) | 2018-04-17 |
| CN107922968B true CN107922968B (zh) | 2022-05-17 |
Family
ID=56978693
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201680030064.3A Active CN107922968B (zh) | 2015-03-23 | 2016-03-22 | 用于单分子电子snp测定的聚合物标记的核苷酸 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10662463B2 (zh) |
| EP (1) | EP3274471B1 (zh) |
| CN (1) | CN107922968B (zh) |
| WO (1) | WO2016154215A1 (zh) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2641871T3 (es) | 2010-12-17 | 2017-11-14 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Secuenciación de ADN mediante síntesis usando nucleótidos modificados y detección con nanoporos |
| US9624539B2 (en) | 2011-05-23 | 2017-04-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | DNA sequencing by synthesis using Raman and infrared spectroscopy detection |
| EP2836604B1 (en) | 2012-04-09 | 2021-09-15 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Method of preparation of nanopore and uses thereof |
| EP2864502B1 (en) | 2012-06-20 | 2019-10-23 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Nucleic acid sequencing by nanopore detection of tag molecules |
| US9605309B2 (en) | 2012-11-09 | 2017-03-28 | Genia Technologies, Inc. | Nucleic acid sequencing using tags |
| WO2015148402A1 (en) | 2014-03-24 | 2015-10-01 | The Trustees Of Columbia Univeristy In The City Of New York | Chemical methods for producing tagged nucleotides |
| WO2016144973A1 (en) | 2015-03-09 | 2016-09-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Pore-forming protein conjugate compositions and methods |
| CN114989235A (zh) | 2015-09-28 | 2022-09-02 | 哥伦比亚大学董事会 | 用作dna合成测序的可逆终止物的基于新的二硫键接头的核苷酸的设计与合成 |
| WO2017087724A1 (en) * | 2015-11-17 | 2017-05-26 | Omniome, Inc. | Methods for determining sequence profiles |
| WO2017205336A1 (en) | 2016-05-23 | 2017-11-30 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Nucleotide derivatives and methods of use thereof |
| US11591647B2 (en) | 2017-03-06 | 2023-02-28 | Singular Genomics Systems, Inc. | Nucleic acid sequencing-by-synthesis (SBS) methods that combine SBS cycle steps |
| WO2019166457A1 (en) * | 2018-02-28 | 2019-09-06 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Tagged nucleoside compounds useful for nanopore detection |
| EP3826960A4 (en) * | 2018-07-23 | 2022-04-27 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | ELECTRONIC SINGLE MOLECULE MULTIPLEX NANOPORES IMMUNOASSAYS FOR THE DETECTION OF BIOMARKERS |
| EP3870593A4 (en) | 2018-10-25 | 2022-11-16 | Singular Genomics Systems, Inc. | NUCLEOTIDE ANALOGUES |
| WO2020097607A1 (en) * | 2018-11-09 | 2020-05-14 | Mgi Tech Co., Ltd. | Massively parallel sequencing using unlabeled nucleotides |
| AU2019403077B2 (en) | 2018-12-19 | 2022-09-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | 3' protected nucleotides |
| US10822653B1 (en) | 2019-01-08 | 2020-11-03 | Singular Genomics Systems, Inc. | Nucleotide cleavable linkers and uses thereof |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1932039A (zh) * | 2006-09-21 | 2007-03-21 | 上海交通大学 | 外切酶－纳米孔的单分子核酸测序方法 |
| CN103282518A (zh) * | 2010-12-17 | 2013-09-04 | 纽约哥伦比亚大学理事会 | 使用经修饰的核苷酸和纳米孔检测的dna边合成边测序 |
| WO2013154999A2 (en) * | 2012-04-09 | 2013-10-17 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method of preparation of nanopore and uses thereof |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2425663C (en) | 2000-10-11 | 2009-12-29 | Applera Corporation | Fluorescent nucleobase conjugates having anionic linkers |
| EP1725572B1 (de) * | 2003-11-05 | 2017-05-31 | AGCT GmbH | Makromolekulare nukleotidverbindungen und methoden zu deren anwendung |
| WO2006097320A2 (de) * | 2005-03-17 | 2006-09-21 | Genovoxx Gmbh | Makromolekulare nukleotidverbindungen und methoden zu deren anwendung |
| US8133672B2 (en) | 2008-03-31 | 2012-03-13 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Two slow-step polymerase enzyme systems and methods |
| US8632975B2 (en) * | 2009-06-05 | 2014-01-21 | Life Technologies Corporation | Nucleotide transient binding for sequencing methods |
| EP2864502B1 (en) * | 2012-06-20 | 2019-10-23 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Nucleic acid sequencing by nanopore detection of tag molecules |
-
2016
- 2016-03-22 WO PCT/US2016/023607 patent/WO2016154215A1/en unknown
- 2016-03-22 EP EP16769553.5A patent/EP3274471B1/en active Active
- 2016-03-22 CN CN201680030064.3A patent/CN107922968B/zh active Active
- 2016-03-22 US US15/560,820 patent/US10662463B2/en active Active
-
2020
- 2020-05-22 US US16/882,353 patent/US20200283833A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1932039A (zh) * | 2006-09-21 | 2007-03-21 | 上海交通大学 | 外切酶－纳米孔的单分子核酸测序方法 |
| CN103282518A (zh) * | 2010-12-17 | 2013-09-04 | 纽约哥伦比亚大学理事会 | 使用经修饰的核苷酸和纳米孔检测的dna边合成边测序 |
| WO2013154999A2 (en) * | 2012-04-09 | 2013-10-17 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method of preparation of nanopore and uses thereof |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Detecting SNPs using a synthetic nanopore;Q Zhao等;《Nano Lett》;20070630;第7卷(第6期);第1680-1685页 * |
| Evidence for a Non-Catalytic Ion-Binding Site in Multiple RNA-Dependent RNA Polymerases;Heli A M Mönttinen等;《PLoS One》;20121231;第7卷(第7期);第1-11页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20200283833A1 (en) | 2020-09-10 |
| US10662463B2 (en) | 2020-05-26 |
| EP3274471A1 (en) | 2018-01-31 |
| EP3274471A4 (en) | 2018-12-05 |
| US20180112257A1 (en) | 2018-04-26 |
| EP3274471B1 (en) | 2020-05-06 |
| WO2016154215A1 (en) | 2016-09-29 |
| CN107922968A (zh) | 2018-04-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107922968B (zh) | 用于单分子电子snp测定的聚合物标记的核苷酸 | |
| US10718011B2 (en) | Single molecule electronic multiplex SNP assay and PCR analysis | |
| US10273473B2 (en) | Method of normalizing biological samples | |
| US10590479B2 (en) | Polymerase idling method for single molecule DNA sequencing | |
| EP3108010B1 (en) | Sample preparation method | |
| US10364464B2 (en) | Compositions and methods for co-amplifying subsequences of a nucleic acid fragment sequence | |
| EP3146075B1 (en) | Ion sensor dna and rna sequencing by synthesis using nucleotide reversible terminators | |
| US20030134290A1 (en) | Method for identifying polymorphisms | |
| Fei et al. | Analysis of single nucleotide polymorphisms by primer extension and matrix‐assisted laser desorption/ionization time‐of‐flight mass spectrometry | |
| WO2013057495A2 (en) | Enzyme method | |
| US20220267848A1 (en) | Detection and quantification of rare variants with low-depth sequencing via selective allele enrichment or depletion | |
| JP2002525129A (ja) | ポリヌクレオチドを分析するための方法 | |
| US20200040390A1 (en) | Methods for Sequencing Repetitive Genomic Regions | |
| Qiu | Novel molecular engineering approaches for genotyping and DNA sequencing | |
| JP4920201B2 (ja) | 核酸中の特定塩基を測定する方法 | |
| US20170137457A1 (en) | Labeled Nucleic Acids: A Surrogate for Nanopore-based Nucleic Acid Sequencing | |
| JP2005530508A (ja) | プライマー伸長反応および多型検出反応をモニターするための方法および組成物 | |
| KR102286025B1 (ko) | 유전자 변이 특이성이 증가된 dna 중합효소를 이용한 질량분석법 | |
| Cho | Development of Single Molecule Electronic SNP Assays using Polymer Tagged Nucleotides and Nanopore Detection | |
| WO2023125898A1 (zh) | 核酸检测方法与系统 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |