HUT60505A - Process for producing 3'-(2')-amino or thiol-nucleosides, nucleotides and oligonucleotides connected with fluorescent colour and application thereof - Google Patents
Process for producing 3'-(2')-amino or thiol-nucleosides, nucleotides and oligonucleotides connected with fluorescent colour and application thereof Download PDFInfo
- Publication number
- HUT60505A HUT60505A HU913885A HU388591A HUT60505A HU T60505 A HUT60505 A HU T60505A HU 913885 A HU913885 A HU 913885A HU 388591 A HU388591 A HU 388591A HU T60505 A HUT60505 A HU T60505A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- amino
- thiol
- group
- synthesis
- compound
- Prior art date
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 31
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 28
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 25
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 27
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 26
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims abstract description 14
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims abstract description 13
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims abstract description 12
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 claims abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 25
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 22
- -1 fluoromethylene Chemical group 0.000 claims description 16
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 claims description 12
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims description 10
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 8
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 7
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 7
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 6
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical group O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 5
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 claims description 5
- 238000007344 nucleophilic reaction Methods 0.000 claims description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 4
- 150000007944 thiolates Chemical class 0.000 claims description 4
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 3
- GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 3-(1h-benzimidazol-2-yl)-7-(diethylamino)chromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2NC(C3=CC4=CC=C(C=C4OC3=O)N(CC)CC)=NC2=C1 GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 claims description 2
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 claims description 2
- 125000001028 difluoromethyl group Chemical group [H]C(F)(F)* 0.000 claims description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 2
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 claims description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- SJYNFBVQFBRSIB-UHFFFAOYSA-N norbornadiene Chemical compound C1=CC2C=CC1C2 SJYNFBVQFBRSIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 claims 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 8
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 abstract description 8
- 238000002372 labelling Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 abstract 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 33
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphine Chemical compound C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical class [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 10
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 8
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 8
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical class CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 6
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 6
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 4
- AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N hydrogen carbonate;triethylazanium Chemical compound OC(O)=O.CCN(CC)CC AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GUWHRJQTTVADPB-UHFFFAOYSA-N lithium azide Chemical compound [Li+].[N-]=[N+]=[N-] GUWHRJQTTVADPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- JTHUJOZLDHAGIH-UHFFFAOYSA-M sodium;thiobenzate Chemical compound [Na+].[O-]C(=S)C1=CC=CC=C1 JTHUJOZLDHAGIH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- WJKHJLXJJJATHN-UHFFFAOYSA-N triflic anhydride Chemical compound FC(F)(F)S(=O)(=O)OS(=O)(=O)C(F)(F)F WJKHJLXJJJATHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CFNMUZCFSDMZPQ-GHXNOFRVSA-N 7-[(z)-3-methyl-4-(4-methyl-5-oxo-2h-furan-2-yl)but-2-enoxy]chromen-2-one Chemical compound C=1C=C2C=CC(=O)OC2=CC=1OC/C=C(/C)CC1OC(=O)C(C)=C1 CFNMUZCFSDMZPQ-GHXNOFRVSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 3
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 3
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 3
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- IIZWAPABBWJGDY-HNPMAXIBSA-N CC(C(N1)=O)=CN([C@@H](C2)O[C@H](CO)[C@H]2O)C1=O.N=C=O Chemical compound CC(C(N1)=O)=CN([C@@H](C2)O[C@H](CO)[C@H]2O)C1=O.N=C=O IIZWAPABBWJGDY-HNPMAXIBSA-N 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- UIJGNTRUPZPVNG-UHFFFAOYSA-N benzenecarbothioic s-acid Chemical compound SC(=O)C1=CC=CC=C1 UIJGNTRUPZPVNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- HJUGFYREWKUQJT-UHFFFAOYSA-N tetrabromomethane Chemical compound BrC(Br)(Br)Br HJUGFYREWKUQJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DQWPFSLDHJDLRL-UHFFFAOYSA-N triethyl phosphate Chemical compound CCOP(=O)(OCC)OCC DQWPFSLDHJDLRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 2
- LORRLQMLLQLPSJ-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-trithiane Chemical compound C1SCSCS1 LORRLQMLLQLPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MRUKYOQQKHNMFI-XVFCMESISA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3-azido-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound [N-]=[N+]=N[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MRUKYOQQKHNMFI-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- UJQBOUAGWGVOTI-XSSZXYGBSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-azido-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@](O)(N=[N+]=[N-])C1 UJQBOUAGWGVOTI-XSSZXYGBSA-N 0.000 description 1
- RVVIWKLSTHKWIL-UPRLRBBYSA-N 1-[(2r,4s,5s)-4-amino-5-[[bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethoxy]methyl]oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OC)=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)OC[C@@H]1[C@@H](N)C[C@H](N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)O1 RVVIWKLSTHKWIL-UPRLRBBYSA-N 0.000 description 1
- LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro(diphenyl)methyl]-2,3-dimethoxybenzene Chemical compound COC1=CC=CC(C(Cl)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1OC LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMIKSILQWKITOH-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazole;phosphono dihydrogen phosphate Chemical compound C1=CNC=N1.OP(O)(=O)OP(O)(O)=O SMIKSILQWKITOH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(4-bromopyrazol-1-yl)ethyl]isoindole-1,3-dione Chemical compound C1=C(Br)C=NN1CCN1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWWNDRWADPRAGO-UHFFFAOYSA-N 4-fluoro-7-nitro-1-benzofuran Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(F)C2=C1OC=C2 QWWNDRWADPRAGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical group OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Natural products C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 238000006751 Mitsunobu reaction Methods 0.000 description 1
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N Phosphine Natural products P XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003800 Staudinger reaction Methods 0.000 description 1
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- INUFEIRTCLFJBN-IPMKNSEASA-N [(2r,3s,5r)-5-(6-benzamidopurin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methyl benzoate Chemical compound C([C@H]1O[C@H](C[C@@H]1O)N1C2=NC=NC(NC(=O)C=3C=CC=CC=3)=C2N=C1)OC(=O)C1=CC=CC=C1 INUFEIRTCLFJBN-IPMKNSEASA-N 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- CBHOOMGKXCMKIR-UHFFFAOYSA-N azane;methanol Chemical compound N.OC CBHOOMGKXCMKIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 1
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 1
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- MKYNHKOAYQRSBD-UHFFFAOYSA-N dioxouranium;nitric acid Chemical compound O=[U]=O.O[N+]([O-])=O.O[N+]([O-])=O MKYNHKOAYQRSBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ROORDVPLFPIABK-UHFFFAOYSA-N diphenyl carbonate Chemical compound C=1C=CC=CC=1OC(=O)OC1=CC=CC=C1 ROORDVPLFPIABK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YWEUIGNSBFLMFL-UHFFFAOYSA-N diphosphonate Chemical compound O=P(=O)OP(=O)=O YWEUIGNSBFLMFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- GUVUOGQBMYCBQP-UHFFFAOYSA-N dmpu Chemical compound CN1CCCN(C)C1=O GUVUOGQBMYCBQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006872 enzymatic polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001307 laser spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RLOWWWKZYUNIDI-UHFFFAOYSA-N phosphinic chloride Chemical compound ClP=O RLOWWWKZYUNIDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical group OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000073 phosphorus hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N phosphorus pentoxide Inorganic materials O1P(O2)(=O)OP3(=O)OP1(=O)OP2(=O)O3 DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006068 polycondensation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000005451 thionucleotide Substances 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-M triflate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/16—Purine radicals
- C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
A találmány szerint úgy járnak el, hogy egy nukleozid, nukleotid vagy oligonukleotid 3'- és/vagy 2'-helyzetű hidroxilcsoportját amino- vagy tiolcsoporttá alakítják, majd fluoreszcens színezékkel kapcsolják. A találmány szerint előállított vegyületet DNS- és RNS-nukleozidok, nukleotidok és oligonukleotidok szintézisénél; in vivő és in vitro fluoreszcenciás mikroszkópos és makroszkópos detektálásnál, templát szál jelenlétében ellenszál szintézisénél és oligonukleotidok szintézisénél alkalmazzák.
KÉPVISELŐ:
DANUBIA SZABADALMI ÉS
VÉDJEGY IRODA KFT
KÖZZÉTÉTELI / PÉLDÁNY >
BUDAPEST
c- O 9// //Z-O . / X X ú'X./óX
C& Xz V' < 0 /:72_ /
/ .< -fluoreszkáló színezékkel kapcsolt 31 -(21)-amino- vagy tiolΓ ‘ ί
-nukleozidok, nukleotidok és oligonukleotidok előállításúk-·.
ésalkalmazásuk
HOECHST AG, Frankfurt am Main, Német Szövetségi Köztársaság
Feltalálók:
Prof. Dr. ENGELS, Joachim,
HERRLEIN, Mathias,
KONRAD, Renate
MAG, Matthias
Kronberg/Taunus
Frankfurt am Main
Sulzbach/Taunus
Oberursel
Német Szövetségi Köztársaság
A bejelentés napja: 1991. 12. 10.
Elsőbbsége:
1990. 12. 11. (P 40 39 488.3)
Német Szövetségi Köztársaság
73824-1023-GÁ/KmO • ·
- 2 A találmány tárgya fluoreszkáló színezékkel kapcsolt 3'-(2·)-amino- vagy -tiol-nukleozidok, nukleotidok és oligonukleotidok, előállításuk és alkalmazásuk.
A jelzett oligonukleotidoknak a géntechnológiában rendkívül sok felhasználási területük van, mivel kezelésük egyszerűbb, mint a hibridizációs mintaként szokásosan alkalmazott, natív génanyagból restrikciós emésztéssel előállított DNS-mintáké.
Az úgynevezet antiszensz-DNS-oligonukleotidok formájában alkalmazott jelzett oligonukleotidok a sejtek folyamataiba szabályozó módon tudnak bekapcsolódni, és ezáltal egyre nagyobb jelentőséget nyernek például a proteinek kifejeződésének in vivő vizsgálatában. Ennek mechanizmusa mai ismereteink szerint DNS-DNS , DNS-RNS és RNS-RNS váltakozó hatások révén folyik le, részleteiben azonban még nem tisztázott.
A jelzett oligonukleotidok in vitro például egy génbank génfragmenseinek azonosítására szolgálnak, a jelzett oligonukleotidok segítségével a génbank blott módszerrel kezelt génmintáit vizsgálják és azonosítják.
Annak érdekében, hogy az ilyen vizsgálatok in vitro vagy in vivő véghezvihetők legyenek, az előzőekben említett oligonukleotidokat jelzéssel kell ellátni. A megfelelő izotóppal történő radioaktív jelzés mellett nem-radioaktív jelzésként alkalmazhatók származékká alakított fluoreszcens színezékek, amelyek könnyebb és kevésbé veszélyes kezelési lehetőséget kínálnak.
DNS szekvenálására korábban eredményesen használtak már egy ilyen nem-radioaktív eljárást. Ebben az eljárásban lényegében Sanger [F. Sanger, S. Nicklen és S. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74., 5463 (1977)] eljárása alapján jártak el. A fluoreszcens jelzőanyagot vagy az oligonukleotidok 5'-végére [L.E. Hood, L. M. Smith és C. Heiner, Natúré, 321, 674 (1986)] vagy a nukleotid bázisra [M. Prober, G.L. Trainor és R.J. Dam, Science 238, 336 (1987)] vitték fel [G.L. Trainor, Anal. Chem.
62, 418 (1990)]. Az utóbbiként említett eljárás hátránya abban áll, hogy a fluoreszcens színezék a szintézis során, azaz a polimerizálás során, az adott eljárásban konkrétan az enzimes polimerizálás során kerül felvitelre. Ennek az eljárási lépésnek az a következménye, hogy a szintézisben csak néhány polimeráz alkalmazható, hogy a polimeráz trifoszfát-tűrése csökken, és hogy erős szubsztrát-felesleg szükséges.
A fluoreszcens jelzés bevitele azonban nem korlátozódik kizárólag a Sanger-szekvenálásra. Ismeretes a Maxam-Gilbertféle kémiai szekvenálás fluoreszcens jelöléssel végrehajtott formája is [H. Voss, C. Schwager, U. Wirkner, B. Sproat, J. Zimmermann, A. Rosenthal, H. Erfle, J. Stegemann és W. Ansorge, Nucl. Acids. Rés. 17, 2517 (1989)].
Ezzel analóg módon a restrikciós fragmentek fluoreszcens detektorokkal való feltérképezése is leírt [A.V. Carrano, J. Lamerdin, L.K. Ashworth, B. Watkins, E. Branscomb, T. Slezak, M. Raff, P.J. de Jong, D. Keith, L. McBride, S. Meister, M. Kronick, Genomics 4, 129 (1989) és S. Brenner és K.J. Livak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 8902 (1989)].
Azt találtuk, hogy egy fluoreszcens színezék hozzákapcsol4 ható egy nukleozid, nukleotid vagy oligonukleotid 3'-(2’)helyzetű (a- vagy B-helyzetű) amino- vagy tiolcsoportjához, és ezek a vegyületek előnyösen alkalmazhatók templát szálak vagy oligonukleotidok jelenlétében másolati szálak szintéziséhez, valamint genetikai anyag in vivő és in vitro kimutatásához.
A találmány tárgya a fentieknek megfelelően eljárás az (I) általános képletű vegyületek előállítására - a képletben R1 jelentése egy purin- vagy pirimidinbázis, az R2 és R3 csoportok közül legalább az egyik egy aminovagy tiolcsoporton keresztül a- vagy β-helyzetben kötődő fluoreszcens színezék, és a két csoport közül a másik adott esetben hidrogénatom, hidroxilcsoport, védett hidroxilcsoport vagy metoxicsoport, amelyek a- vagy B-helyzetűek, n egy szám, amelynek értéke > 0,
R4 jelentése 51-védőcsoport vagy foszfát-, pirofoszfátvagy trifoszfát-csoport,
R5 jelentése oxigénatom, fluor-metilén-, difluor-metilénvagy metiléncsoport,
R6 jelentése hidroxilcsoport, metoxicsoport vagy hidrogénatom, amelyek a- vagy B-helyzetűek,
R1, R5 és R6 azonos vagy különböző jelentésűek lehetnek,
Y és X jelentése oxigénatom, kénatom, -NH- vagy metiléncsoport,
X és Y jelentése azonos vagy különböző -, a találmány szerint úgy járunk el, hogy a nukleozidok, nukleotidok vagy oligonukleotidok 3'- és/vagy 2'-helyzetű hidroxilcsoportját amino- vagy tiolcsoporttá alakítjuk, és ehhez egy fluoreszcens színezéket kapcsolunk.
A találmány tárgyát képezi még az (I) általános képletű vegyületek alkalmazása
a) egy templát-szál jelenlétében, másolati szál szintézisére,
b) meghatározott oligonukleotidok szintézisére,
c) ezek in vivő és in vitro kimutatására, és
d) nukleinsavak in vivő és in vitro történő kimutatására.
A következőkben a találmányt részletesen ismertetjük, különösen annak előnyös kiviteli formáit írjuk le.
Az (I) általános képletű vegyületeket lényegében az irodalomban ismertetett eljárásokkal [M. Gait, Oligonucleotide Synthesis, JRL-Press, Oxford 1984] állítjuk elő.
A színezéknek a 3'- és/vagy 2'-helyzetben való kapcsolásához kiindulási anyagul egy (II) általános képletű vegyületet, előnyösen egy nukleozidot alkalmazunk.
A (II) általános képletű vegyületben R1 - R6, X, Y és n jelentése az előzőekben megadott, a helyettesítők azonosak vagy különbözőek lehetnek, és a színezék kapcsolását az R^ vagy R& csoportokhoz végezzük, amely csoportok jelentése hidrogénatom, hidroxilcsopot, védőcsoporttal ellátott hidroxilcsoport vagy metoxicsoport. A színezék kapcsolása a 3'- és/vagy 2'-helyzetű hidroxilcsoporton történik egy amin vagy tiol bevitelével.
Az azidok bevitelére a 3'-(2')-helyzetbe egy kilépőcsoportot viszünk be. Kilépőcsoportként előnyösen triflátót, mezilátot vagy tozilátot alkalmazunk. Az azid bevitele az azid, előnyösen lítium-azid nukleofil reakciójával történik. Egy tiolát vagy S védett tiolát nukleofil reakciójával a tiolt vagy védett tiolt nyerjük. A nukleozid cukor-részének kívánt térbeli szerkezete legjobban Sjj2-szubsztitúció révén érhető el.
Az aminocsoportot egyszerűen nyerhetjük az azidon át az ezt követő aminná való redukálással [W.S. Mungall és R.L.
Letsinger, J. Org. Chem., 40, (11) 1659 (1975)]. Ebben a lépésben előnyös a Staudinger-reakció trifenil-foszfin és víz alkalmazásával [M. May és J.W. Engels, Nucl. Acids. Rés. 17, (15) 5973 (1989)].
Minden vegyületet szerkezete és konfigurációja szempontjából megvizsgálunk, ehhez NMR, UV, IR analízist és elemanalízist alkalmazunk.
A polikondenzációs reakció befejezése után a DNS 3'-végén lévő cukorrész szabad 3'-(2')-amino- vagy -tiolcsoportja egy reakcióképes fluoreszcens színezékkel a szakirodalomban leírt eljárással reagáltatható [Hunkapiller, Nucl. Acids. Rés. 13, 2399 (1985); Hodges R.R.. és mtsai., Biochemistry, 28, 261 (1989)] .
Alternatív módon nyerhető az aminocsoport Mitsunobureakcióval [Synthesis, 1, 1 (1981)], és a Yamamoto és mtsai. [J. Chem. Soc. Perk. Trans. I, 1, 306, 1980] által leírt reakciónak megfelelően.
A fluoreszcens színezéknek a tiolcsoporton át való kapcsolása analóg módon történik. Ebben az esetben az azid helyett egy adott esetben védett tiolcsoportot viszünk be.
A fluoreszcens színezéknek a nukleozid, nukleotid vagy oligonukleotid szabad amino vagy tiol funkciós csoportján való • ·
- 7 kapcsolása alternatív módon történhet a vegyület felhasználását követően is. Lehetséges például, hogy a fluoreszcens színezékkel való reagáltatást azt követően hajtjuk végre, hogy a DNS vagy RNS szekvenálási reakció terminációs lépését elvégeztük, ebben az esetben a teljes anyagkeveréket jelöljük a fluoreszcens színezékkel.
Fluoreszcens színezékként lényegében minden, a kereskedelmi forgalomban kapható olyan színezéket alkalmazhatunk, amely egy amino- vagy tiolcsoporttal reagál, előnyösen fluoreszceint, rodamint, texaszvöröst (Texasrot), NBD-t (4-fluor-7-nitro-benzofurán, Sigma), kumarint, fluoreszcamint, szukcinil-fluoreszcint vagy dansylt alkalmazunk.
A származékká alakított reakcióelegyet gélelektroforézissel választhatjuk el, és fotometriás vagy lézerspektroszkópiás eljárással detektálhatjuk [H. Swerdlow és R. Gesterland, Nucl. Acids Rés. 18, 1415 (1990)]. Jól bevált a kapillárelektroforézis is [A. S. Cohen és mtsai., P.N.A.S. US. 85, 9660 (1988)], például akrilamid-géllel töltött kapillárison. A detektálást ebben az esetben előnyösen a kapillárisból való kilépéskor végezzük [H. Swerdlow, S.Wu, H. Harke, N. Dovichi, Chromatography 516, 61 (1990)].
Egy olyan (I) általános képletű vegyület alkalmazásával, amely az 5'-helyzetben egy trifoszfáttal bír, egy tetszés szerint printerrel és egy templátszállal egy polimeráz segítségével, azaz egy olyan enzimmel, amely megfelelő szubsztrát jelenlétében a szekvencia egy hű komplementer másolatát szintetizálja, a négy nukleozid-trifoszfát jelenlétében elvégezhetjük • * ♦ · · · ♦ · · • · · « β « · ·*·· ···· ·4·· «· «·
- 8 a DNS-kettősszál szintézisét, előnyösen T7- vagy Taq-polimerázt, DNS-polimeráz I-t vagy reverz transzkriptázt alkalmazunk. 5'-védőcsoportként megfelelőek a tritilcsoport, és a metoxi- vagy dimetoxi-tritil-csoportok [Gait, Oligonucleotide Synthesis, JRL-Press, Oxford (1984)].
A szintézis befejezése mindig jellemzően meghatározható egy (I) általános képletű 3'-(21)-amino-módosított A,C,G,T-nukleotid alkalmazásával. Ez különös jelentőséggel bír DNS-ellenszálak templátszálak jelenlétében való szintézise esetén, és ezzel DNS-szálak szekvenálása esetén is, mivel egy módosított nukleotid bevitele a reakciónak egy erősen bázis-fajlagos megszakítását teszi lehetővé.
A RNS-nukleozidok, nukleotidok és oligonukleotidok szintézise analóg módon történik.
Ennek folytán lehetséges a származékká alakítható oligonukleotidok szintézise egy olyan kiindulási nukleotid alkalmazásával, amelynek 3'-(2')-vége amino- vagy tio-formára módosított, és amely egy polimer hordozóhoz rögzített.
Oligonukleotidon minden szokásos módon előállított DNS- és RNS-nukleotidok értünk, előnyösen azonban 2 - 100, különösen előnyösen 12 - 50 nukleotid hosszúságú (kémiai szintézis esetén), illetve mintegy 3000 nukleotidig terjedő hosszúságú (enzimes szintézis esetén) nukleotidot, az alkalmazott polimeráz hatékonyságától függően.
Az oligonukleotidok szintézise szokásos módon a kiindulási nukleotid - hordozó komplexből kiindulva történik, azaz 3'- és 5'-irányba, és lehetővé teszi egy oligonukleotid meghatározott • · • · • ·· · Μ» • ·ν szekvencia szerinti szintézisét.
A kiindulási nukleozid kereskedelmi forgalomban kapható hordozóhoz való kötése egy olyan vegyületen (spacer) keresztül történő kapcsolással valósítható meg, amely a szintézist követően lehasítható, például az irodalmi forrásokból ismert borostyánkősavas kapcsolással vagy egy uretánnal történő kapcsolással [Efimov és mtsai., Nucl. Acids. Rés. 11. 8369 (1983)] .
Az eredményes szintézist követően az oligonukleotidot a hordozóról megfelelő reagensekkel le kell hasítani. A megfelelő fluoreszcens színezékkel való származékképzés közvetlenül ezután történik.
Az így szintetizált, és a 3'-(2')-végen módosított oligonukleotidok ezután például komplementer oligonukleotidok kimutatására használhatók.
A találmány szerinti alkalmazás két előnnyel jár:
1) θ9Υ jelzett ellenszál előállításánál egyidejűleg bekövetkezik a lánc végén álló 3'-(2')-amino- vagy tiol-módosított nukleotid révén a szál megszakadása. A szál 3'-(2')-helyzetben fluoreszcens színezékkel való jelzett volta folytán ennek veszélytelen kimutatása lehetséges.
2) Pontosan definiált oligonukleotidok előállítása esetén a hordozóhoz kapcsolt és a 3'-(2')-amino- vagy tiol-módosított kiindulási nukleotid jelzése révén pontos oligonukleotidszintézis érhető el a fluoreszcens jelölés lehetőségével egyidejűleg, és ezzel lehetséges a kimutatás.
Az alábbiakban a találmányt példákban mutatjuk be közelebb• 4 * · » · ·
- · Λ ·« -.
• · 4 « · · · «··« ·'·* ·««· ««
- 10 ről.
1. 3'- vagy 2’-amino- vagy azido-nukleoltid-5’-trifoszfát anomerek
1. Példa
5'-Trifoszfát-3'-amino-3'-dezoxiribozid-timidin szintézise (1. reakcióvázlat)
5'-Monofoszfát-3'-azido-3' -dezoxiribozid-timidin előállítása
160 mg, 0,6 mmól 3'-azidotimidint (Sigma) keverés mellett ml trietil-foszfátban oldunk. Az oldathoz 4 °C hőmérsékleten csepegtetőtölcsérrel 6 ml trietil-foszfátban oldott 0,2 ml POCI3-t adunk. 24 óra múlva az elegyet 50 ml telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal semlegesítjük, majd 2 x 60 ml toluollal és 100 ml éterrel kirázzuk. A vizes fázist desztillált vízzel 500 ml-re hígítjuk, anioncserélő oszlopra (SephadexR A-25; 50 x 2,5 cm) visszük, amelyet előzetesen 200 ml 0,2 mól/1es TBK-puffer (trietil-ammónium-hidrogén-karbonát puffer, amelynek pH-ja önmagától 7,5-re beáll) átengedésével HCC>3_ formára hozunk. Ezután az oszlopot 300 ml desztillált víz átengedésével tisztítjuk, majd eluensként először 200 ml 0,1 mól/literes TBK-puffert, majd 0,1 és 0,2 mól/liter közötti lineáris gradiensű TBK-puffert (összesen 1350 ml-t) alkalmazunk. A kromatogramban egy csúcs mutatkozik, amely a terméknek felel meg. A termék 0,12 és 0,15 mól/liter TBK puffer koncentráció mellett eluálódik. A vékonyrétegkromatográfiás vizsgálattal pozitívnek bizonyuló 20 ml-es frakciókat egyesítjük, és fagyasztva-szárítással töményítjük. A trietil-ammónium-hidrogén-karbonátot a termékből többszöri etanol adagolással távolítjuk el. A terméket így fehér, kristályos trietil-ammónium-só formájában nyerjük.
Hozam: 220 mg (56,2 %); M: 651,81; Rf (ammónia:izopropanol:víz 10:70:20):0,40; 300 MHz-ÍH-NMR (D2O) : 1,36 (t, 3H, CH3) ; 1,90 (s, 3H, CH3); 2,50 (m, 4H, 2' ,2-H); 3,18-3,30 (dd, 2H, CH2);
4,10 (m, 1H, 4'-H); 4,3 (m, 1H, 3'-H); 6,31 (t, 1H, l'-H); 7,7 (s, 1H, 6-H); 11,50 (s, 1H, NH), 300 MHz-31P-NMR (85 %-OS H3PO4 extern, D20): 1,23 (s, IP).
5’-Trifoszfát-31-azido-3'-dezoxiribozid-timidin előállítása
130 mg, 0,2 mmól 51-monofoszfát-3’-azido-3',2'-dezoxiribozid-timint trietil-ammóniumsó formájában 6 ml abszolút dimetil-formamidban oldunk, és az oldathoz 25 °C hőmérsékleten keverés közben hozzáadjuk 162,15 mg, 1 mmól N',N'-karbonil-diimidazol 3 ml abszolút dimetil-formamidban készült oldatát. 2 óra reagáltatás után az elegyhez 1 ml abszolút metanolt adunk, az elegyet további 15 percig keverjük, majd a metanolt ledesztilláljuk róla. A visszamaradó anyaghoz 5 ml 0,2 mól/literes dimetil-formamidos tri(n-butil-ammónium)-pirofoszfátot adunk, és az elegyet éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután az elegyből az imidazol-pirofoszfát csapadékot kiszűrjük, 20 ml dimetil-f ormamiddal mossuk, és a szűrletet rotációs bepárlón bepároljuk. A visszamaradó anyagot 250 ml, 0,1 mól/literes TBKpufferben oldjuk, és HCO3~ formájú Sephadex A-25 anioncserélő oszlopra visszük. A terméket 200 ml desztillált víz átengedésével tisztítjuk, majd 0 és 0,5 mól/1 közötti lineáris gradiensű TBK puffer (2000 ml) alkalmazásával eluáljuk. A kromatogramban két csúcs jelentkezik, amelyek közül az első a monofoszfát, a második a termék. A termék 0,30 - 0,35 mól/1 TBK puffer koncentrációnál eluálódik. A pozitív 20 ml-es frakciókat egyesítjük, és fagyasztva-szárítással töményítjük be. A trietil-ammónium-hidrogén-karbonátot etanol többszöri adagolásával távolítjuk el. A terméket fehér, kristályos trietil-ammóniumsó formájában nyerjük.
Hozam: 92 mg (50,4 %); M: 911,95; Rf (ammónia:izopropanol:víz 10:70:20): 0,14; 300 MHz-31P-NMR (85 %-os H3PO4 extern, D2O): 10,74 (d, 2Jpp = 22,1 Hz, IP, α-Ρ-atom); -11,45 (d, 2Jpp = 21,9 Hz, IP, gamma-P-atom); -22,99 (t, 3JPP = 20,3 Hz, IP, β-Ρ-atom).
5'-Trifoszfát-3'-amino-31-dezoxiribozid-timidin előállítása mg, 0,075 mmól 5'-trifoszfát-3'-azido-32'-dezoxiribozid-timint 5 ml 2:1 arányú dioxán:desztillált víz elegyben oldunk, és szobahőmérsékleten, keverés közben hozzáadunk 200 mg, 0,75 mmól trifenil-foszfint. A reakcióelegyet 25 °C hőmérsékleten 30 órán át keverjük, majd lepároljuk róla az oldószert. A visszamaradó anyagot 30 ml desztillált vízben oldjuk, 3 x 30 ml éterrel extraháljuk, majd a vizes fázist 150 ml-re hígítjuk, és az oldatot HCO3- formájú Sephadex A-25 anioncserélő oszlopra visszük. A terméket 200 ml desztillált víz átengedésével tisztítjuk, majd 0 és 0,5 mól/1 közötti lineáris gradiensu TBK-pufferral (2000 ml térfogat) eluáljuk. A kromatogram három csúcsot mutat, amelyek között az első a 6 monofoszfát-vegyület, a második a termékcsúcs, a harmadik a 7 adduktumcsúcs. A termék 0,40 - 0,42 mól/1 TBK puffer koncentrációnál eluálódik. A pozitív 25 ml-es frakciókat egyesítjük, és fagyasztva-szárítással töményítjük be. A trietil-ammónium-hidrogén-karbonátot etanol hozzáadásával távolítjuk el. A terméket fehér, amorf trietil-ammónium-só formájában nyerjük.
Hozam: 57 mg (85,7 %); M: 885,90; Rf (ammónia:izopropanol:víz 10:70:20): 0,08; 300 MHz-1H-NMR (D20): 1,30 (t, 3H, CH3); 1,92 (s, 3H, CH3); 2,64 (m, 4H, 2',2-H); 3,19-3,21 (dd, 2H, CH2); 4,26 (m, 1H, 4'-H); 4,41 (m, 1H, 3'-H); 6,34 (t, 3JHH = 6,74 Hz,
IH, l'-H); 7,69 (s, 1H, 6-H); 11,50 (s, 1H, NH).
300 MHz-31P-NMR (85 %-os H3PO4 extern, D2O): -10,75 (d, 2Jpp = 22 Hz, IP; α-Ρ-atom); -11,45 (d, 2Jpp = 21,9 Hz, IP, /-P-atom); -22,05 (t, 3Jpp = 20,4 Hz, IP, β-Ρ-atom).
2. Példa
1-(3'-Amino-2',3'-didezoxi-5'-trifoszfát-B-D-treopentofuranozil)-timin előállítása (2. reakcióvázlat)
1-(3'-Azido-2',3'-didezoxi-5'-o-dimetoxi-tritil-B-D-treopentofuranozil)-timin előállítása
5,98 g, 11 mmól 51-dimetoxi-tritil-timidin [előállítását lásd azM. Gait, Oligonucleotide synthesis, IRL Press 1984, 27. oldal szakirodalmi helyen], 3,076 g, 11,73 mmól trifenil-foszfin és 3,1 g, 55 mmól lítium-azid 37 ml száraz dimetil-formamidban készült oldatához keverés közben hozzáadunk 4,10 g,
II, 91 mmól szén-tetrabromidot. Az elegyet 56 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd 15 ml metanolt adunk hozzá. Ezután az elegyből a terméket 800 ml jéghideg víz hozzáadásával csapjuk ki. A csapadékot kloroformban vesszük fel, és flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk (eluensként etil-acetát és n-hexán 3:1 arányú elegyét alkalmazzuk). Rf kloroform és metanol 9:1 elegyében 0,52. IR (cm-1): 2100 azid. 80 %-os hozammal 4,95 g terméket nyerünk.
1- (31-Amino-2',31-didezoxi-5' -O-dimetoxi-tritil-B-D-treopentofuranozil)-timin előállítása
0,5 g, 0,8 mmól 1-(3'-azido-2’,31-didezoxi-5'-0-dimetoxi-tritil-B-D-treopentofuranozil)-timin oldatához keverés közben hozzáadunk 1,3 g, 4,94 mmól trifenil-foszfint, és az elegyet 4 órán át hagyjuk reagálni. Ezután az elegyhez a foszfin-imidek hidrolizálására 3 ml desztillált vizet adunk, és az elegyet további 3 órán át keverjük. Ezután az elegyről az oldószert rotációs bepárlóban lepároljuk, a visszamaradó olajat flashkromatográfiás eljárással tisztítjuk (eluensként kloroform és metanol 99:1 arányú elegyét alkalmazzuk, amely 1 % trietil-amint is tartalmaz). Rf a fenti oldószerelegyben 0,27. Az amin vékonyrétegkromatogramon ninhidrinnel ibolyára szineződik. 87,5 %-os hozammal 0,42 g terméket nyerünk, amely a megfelelő 3H-NMR spektrumot mutatja.
1-(3 *-Amino-2',3'-didezoxi-5 ’ -trifoszfát-B-D-treopentofuranozil)-timin előállítása
Az 51-trifoszfát további reagáltatásához a dimetoxi-tritil-csoportot az M. Gait, Oligonucleotide synthesis, IRL Press, 1984, 49. szakirodalmi helyen leírttal analóg módon lehasítjuk, és a trifoszfátot az 5'-helyzetben az 1. példában leírt módon kapcsoljuk.
3. Példa
2·-Amino-2’-dezoxi-5·-trifoszfát-uridin előállítása (3. reakcióvázlat) (2,2'-Anhidro-l-B-arabinofuranozil)-uracil előállítása g, 77,8 mmól uridin és 22,2 g, 103,6 mmól difenil-karbonát 75 ml abszolút dimetil-formamidban készült oldatához 0,5 g, 5,93 mmól nátrium-hidrogén-karbonátot adunk. A teljes oldódás bekövetkezése után a tiszta, színtelen folyadékot 30 percig 150 °C hőmérsékleten tartjuk. Ezután az oldatot lehűtjük, és a hideg oldatot abszolút éterbe öntjük. A kapott csapadékról az étert dekantáljuk, és a nyersterméket 1650 ml metanolból kristályosítjuk. Szárítás után fehér, kristályos port nyerünk. A termék olvadáspontja 239 °C; M = 227; Rf = 0,31 (metilén-klorid és metanol 8:2 arányú elegyével). 52,3 %-os hozammal 9,22 g terméket nyerünk. A ^-H-NMR 60 MHz-nél az irodalmi adatoknak megfelelő.
2'-Azido-2’-dezoxi-uridin előállítása
1,16 g, 10 mmól (2,2'-anhidro-l-B-arabinofuranozil)-uracilt és 3,5 g, 71,7 mmól lítium-azidot keverés mellett 25 ml abszolút DMPU-ban (1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2-(1-H)-pirimidinol) szuszpendálunk. A szuszpenziót 120 °C hőmérsékletre melegítjük, ekkor a reakcióoldat gyengén elszíneződik. 3 nap múlva a fekete oldatot 80 ml vízzel hígítjuk, majd 2 x 100 ml metilén-kloriddal extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat még négyszer mossuk vízzel, majd a szerves fázist rotációs bepárlón bepároljuk. A szilárd, kátrányszerű maradékot oszlopkromatográfiás eljárással kiezelgélen tisztítjuk, eluensként metilén-klorid és metanol 8:2 arányú elegyet alkalmazzuk. A fekete, olajos maradék rotációs bepárlón való bepárlása után még kétszer tisztítjuk az anyagot kiezelgélen, eluensként aceton és metanol 8:3 és aceton és etil-acetát 1:1 arányú elegyét alkalmazva. így vékonyrétegkromatográfiásan egységes anyagot kapunk (Rf = 0,61 metilén-klorid:metanol = 8:1 elegyben). 30 %-os hozammal 2,035 g terméket nyerünk színtelen üveg formájában. IR (kloroform-film):
2120 cm-1. M (FAB): 270. A termék a várt 1H-NMR spektrummal bír.
A 21-amino-2'-dezoxi-5'-trifoszfát-uridin előállítását a hidroxil funkciós csoport szelektív 3'-acilezésével végezzük. Ezt követően az 5'-trifoszfát-csoportot az 1. példában leírttal analóg módon visszük a vegyületre. A 3'-helyzetű azid dezacilezését követően az azidot a 2. példában leírt módon trifenil-foszfinnal való reagáltatással aminná redukáljuk.
4. Példa
3'-Amino-2',3·-didezoxi-5'-trifoszfát-adenozin előállítása (4. reakcióvázlat)
N6-benzoi1-9- (5-0-benzoil-2-dezoxi-B-D-treo-pentofuranozil)-adenin előállítása
920 mg, 2 mmól N6,5'-O-dibenzoil-2'-dezoxiadenozin (amelyet a Nishino és mtsai., Nucleosides & Nucleotides 5, 159 (1986) szakirodalmi helyen leírt módon állítunk elő) 2 ml piridint tartalmazó 30 ml abszolút diklór-metánban készült szuszpenzióját -30 °C hőmérsékletre hűtjük, és lassan hozzácsepegtetünk 5 ml 10 térfogat%-os diklór-metános trifluor-metánszulfonsavanhidrid-oldatot. A hűtőfürdő eltávolítása után az oldatot hagyjuk felmelegedni, és 1 ml vizet adunk hozzá. 3 óra elteltével további 5 ml vizet adunk az elegyhez, és a szerves fázist mossuk. Az oldószer eltávolítása után a visszamaradó anyagot 50 ml metanolban oldjuk, majd 100 mg nátrium-hidrogén-karbonátot adunk hozzá, és az elegyet 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután az elegyet 10 %-os ecetsavval semlegesítjük, az oldószert lepároljuk róla, és a visszamaradó anyagot kiezelgélen flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk (eluensként kloroform és metanol 97:3 arányú elegyét alkalmazzuk). így 75 %-os hozammal 710 mg, 1,48 mmól terméket nyerünk. Rf = 0,49 (kloroform:metanol = 97:3). M = 459.
*-Azidő-2',3'-didezoxiadenozin előállítása
920 mg, 2 mmól N6-benzoil-9-(5-0-benzoil-2-dezoxi-B-D-treopentofuranozil)-adenin 20 ml abszolút diklór-metánban és 2 ml piridinben készült oldatát -30 °C hőmérsékletre hűtjük. Ezután hozzácsepegtetjük 5 ml, 3 mmól trifluor-metánszulfonsavanhidrid abszolút diklór-metános oldatát. A hűtőfürdőt eltávolítjuk, az elegyet további 20 percig keverjük, majd hozzáadjuk 980 mg, 20 mmól lítium-azid 20 ml dimetil-formamidban készült oldatát. Az elegyet további 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd 50 ml vizet és 150 ml kloroformot adunk hozzá, a szerves fázist elkülönítjük, és desztillált vízzel mossuk. A szerves fázisból az oldószert RotavaporR bepárló alkalmazásával eltávolítjuk, és a védőcsoportok eltávolítására éjszakán át ammóniás metanol oldattal reagáltatjuk. Az oldószer ismételt eltávolítása után az anyagot flash-kromatográfiás eljárással kiezelgélen tisztítjuk, eluensként kloroform és metanol 95:5 arányú elegyét alkalmazzuk. így 79 %-os hozammal 430 mg, 1,6 mmól fehér, kristályos port nyerünk. IR: 2100 cm-1, azidocsoport.
3'-Amino-2·,3'-didezoxi-5' -trifoszfát-adenozin előállítása
Az 5'-trifoszfát előállítását az 1. példában leírttal analóg módon végezzük. Ezt követően az azidot a 2. példában leírt módon aminná redukáljuk.
5. Példa
3·-Amino-21,3'-didezoxi-5'-trifoszfát-guanozin előállítása (5. reakcióvázlat)
A 3'-amino-2',3'-didezoxi-5'-trifoszfát-guanozin előállítását N2-izobutiril-5 ' -0-benzoil-2 ' -dezoxi-guanozin kiindulási anyag alkalmazásával végezzük [a kiindulási anyagot Nishino és munkatársai, Nucleosides & Nucleotides 5, 159 (1986) szakirodalmi helyen leírt eljárásával állítjuk elő]. A nukleozidot 3'-aziddá a 4. példában leírttal analóg módon alakítjuk. Ügyelni kell itt arra, hogy az ammóniás metanololdattal való kezelés itt elmarad, mivel az izobutiril-védőcsoportot csak a tiofoszfát-csoport bevitele után, az azidnak aminná való redukálása előtt kell eltávolítani. A trifoszfáttá való alakítást a guanozin vegyület esetén is az 1. példában leírt módon végezzük. Az aminná való redukálás a 2. példában leírt módon történik.
2. A 3'-Amino-oligomerek szintézise és az ezt követő 3'-
-fluoreszcens-jelölés
6. Példa
A 20 nukleotidból álló 3'-H2N-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-5' oligomert 5 '-dimetoxi-tritil-védett 3 '-amino-3 1-dezoxitimidin kiindulási anyag alkalmazásával állítjuk elő. A vegyület előállítását az 1. példában leírt módon végezzük. 5'-dimetoxi
-tritil-védett AZT-ből (azido-31-dezoxiribozid-timidin) indulunk ki, amelyet AZT-ből és dimetoxi-tritil-kloridból állítunk elő M. Gait eljárása szerint [Oligonucleotide Synthesis, IRL Press 1984. 27].
Ezt követően a vegyületet az 1. példában leírt módon trifenil-foszfinnal redukáljuk. A következő lépés a hordozóanyag előállítása. Ehhez 200 mg 5'-O-(4,4'-dimetoxi-tritil)-3'-amino-3'-dezoxi-timidint 700 μΐ abszolút piridinben oldunk. Az oldathoz hozzáadunk 45 mg dimetil-amino-piridint, majd 40 mg borostyánkősavat. Az elegyet éjszakán át állni hagyjuk, majd a maradék borostyánkősavat 10 μΐ víz hozzáadásával hidrolizáljuk. Az elegyet toluollal együtt háromszor bepároljuk, majd a visszamaradó anyagot 12 ml metilén-kloridban felvesszük, 4 ml hideg, 10 %-os citromsavval, majd 2 x 4 ml vízzel mossuk. A szerves fázist nátrium-szulfáton szárítjuk, az oldószert lepároljuk, és a visszamaradó anyagot 1 ml metilén-kloridban oldjuk. Ezt az oldatot lassan, keverés mellett 30 ml n-hexánba csepegtetjük. A kiváló csapadékot leszivatjuk, és 40 °C hőmérsékleten olaj vákuumszivattyúval létesített vákuumban szárítjuk. A CPG-alapú hordozóanyag előállításának további lépéseit standard eljárással végezzük, és a 12 nukleotidból álló oligomert foszforamidit eljárással, ABI 380 A DNS-szintetizátoron standard ciklussal [ABI 380A User Bulletin, Issue No. 36, 1986 július] állítjuk elő. A védőcsoport eltávolítása és a 3'-amino-oligonukleotidnak a hordozóról való lehasítása után az anyagot standard eljárással tisztítjuk és jellemezzük. Jobb eredmények érhetők el, ha a hordozóhoz való kapcsolásra lúg-labilis kapcsolási eljárást alkalmazunk. Előnyös, ha a lehasítandó savamidot egy uretán funkciós csoporttal helyettesítjük, amint azt Efimov [Nucleic Acid Rés. 11. . 8369 (1983)] leírja.
7. Példa
A 23 nukleotidból álló, 3'-amino-végződésű 3'-H2NACACCCAATTCTGAAAATGGAT-5' oligomert az 1. példa szerint állítjuk elő. A vegyület tisztítása és jellemzése ismert módon történik.
8. Példa
A 3’-amino-végződésű oligomerekből fluoreszcein-izotiocianát alkalmazásával képzünk származékot. 50 nmól 3'-aminooligonukleotidot Eppendorf-csőben 25 μΐ 500 mmól/l-es nátrium-hidrogén-karbonát-oldatban oldunk. Az oldathoz 20 μΐ 300 mmól/l-es dimetil-szulfoxidos fluoreszcein-izotiocianát-oldatot (Sigma) adunk. Az elegyet 6 órán át szobahőmérsékleten reagáltatjuk, majd 20 mmól/l-es ammónium-acetát-oldattal Sephadex G-25 oszlopra visszük, azon tisztítjuk. A 3'-fluoreszcein-izotiocianát-oligomert analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiás kezelés során fluoreszcein-detektálással, valamint UV-detektálással vizsgáljuk. A nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással kapott eredményeket kapillár-elektroforézisen (Dionex cég) végzett elemzéssel is igazoljuk. A fluoreszcein-izotiocianát az (1) képletnek felel meg.
9. Példa
Az 1. és 2. példa szerint előállított 3'-amino-oligomereket a 3. példában leírt módon rodaminnal [(2) képletű vegyület] és tetrametil-rodamin-izotiocianáttal [(3) képletű vegyület] reá gáltatjuk. A 3'-fluoreszcens jelölésű oligomereket analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárásnak tesszük ki, és azonnal fluoreszcens detektálással, valamint UV detektálással vizsgáljuk. A nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással kapott eredményeket kapillárgélelektroforézissel (Dionex cég) is igazoljuk.
10. Példa
Az 1. és 2. példa szerint kapott 3'-amino-oligomereket a 3. példában leírt módon a (4) képletű kumarinszármazékkal reagáltatjuk. A 3’-fluoreszcens jelölésű oligomert analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiás kezelésnek tesszük ki, és azonnal fluoreszcens detektálást, valamint UV detektálást végzünk. A nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással kapott eredményeket kapillárgélelektroforézissel (Dionex cég) is megerősítjük.
3. A módosított nukleotid beépítése DNS-polimerázzal, és a szekvenálási vizsgálatok
Az amino-trifoszfátnak a szokásos szekvenáló enzimekkel való összeférhetőségének vizsgálatára elkészítettük a megfelelő terminációs oldatokat, és kipróbáltuk a polimerázokat [Klenow, Boehringer; Taq, Amersham; T7, Pharmacia; Seguenase, USB]. Ennek során mind klasszikus módon, mind a fluoreszcens színezékkel való jelzés révén vizsgáltuk a beépülési sebességet és a terminációs tulajdonságokat.
11. Példa
Az 1. példa szerinti módon előállított 5'-trifoszfát-3 ’ -amino-3'-dezoxiribozid-timidint 21,3'-didezoxi-5'-trifoszfát
-timidinre cseréljük. Ezt elvégezzük a terminációs oldatokkal minden, az előzőekben megadott polimeráz esetén. Minden esetben ekvimoláris, 10-szer nagyobb és tized dNTP/terminátor arányt is kipróbálunk. A szekvenálást standard eljárás szerint végezzük. Ezeknél a vizsgálatoknál az a-35S-dATP beépülését autoradiográfiásan detektáljuk. Azt tapasztaljuk, hogy a) a 3'-amino-nukleotid termináló hatást fejt ki az alkalmazott enzimre, b) a beépülési sebességek T7, Taq és Sequenase esetén azonosak a szokásos didezoxi-terminátorok esetén kapottal, és c) az amino-nukleotiddal problémamentes szekvenálás vihető végbe.
12. Példa
5'-trifoszfát-3'-amino-3'-dezoxiribozid-timidin reagáltatása fluoreszcein-izocianáttal 5'-trifoszfát-31-amino-3'-dezoxiribozid-3'-N-fluoreszcein-izocianát-timidinné
2,5 mg, 2,8 μιηόΐ 5'-trifoszfát-3'-amino-3',2'-dezoxiribozid-timint Eppendorf csőben 200 μΐ desztillált vízben oldunk, és 200 μΐ 1 mól/l-es pH = 9-es Na2CO3/NaHCO3~puffért adunk hozzá. A csövet alumíniumfóliával vesszük körül, hogy a fénytől óvjuk, és egy 100 μΐ-es pipettával 80 μΐ fluoreszcein-izotiocianát-oldatot (10 mg 1 ml dimetil-formamidban) adunk hozzá. Az elegyet szobahőmérsékleten 10 percig reagáltatjuk, ez idő alatt vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat szerint a reakció kvantitatíve végbemegy. A terméket gélszűréssel tisztítjuk. Az erre alkalmazott Sephadex G-10 oszlopot alumínium-fóliával burkoljuk be, hogy a fénytől óvjuk, a teljes reakcióelegyet az oszlopra visszük, és az oszlopot 1 ml/perc sebességgel vízzel mossuk. A kromatogram két csúcsot mutat. Az első a termék, a második a reagálatlan színezék. 5 ml-es frakciókat szedünk, összesen 24 frakciót gyűjtünk. A kromatogram szerint a negyedik frakció bizonyul pozitívnak. Ezt vékonyrétegkromatográfiás vizsgálattal igazoljuk. Az oldószert a frakcióról liofilezéssel eltávolítjuk, és az anyagot -80 °C hőmérsékleten tároljuk. 93 %-os hozammal 3,32 mg anyagot nyerünk. M = 1274,32. Rf = 0,62 (ammónia:izopropanol:víz = 10:70:60). Fluoreszcenciás emissziós spektrum: a besugárzott fény hullámhossza 420 nm. A vegyület emissziós maximuma 514,8 nm. Egy 2,5 mmól/l-es, desztillált vizes oldatot mérünk. A származékká nem alakított színezék 2,5 mmól/l-es desztillált vizes oldatának emissziós maximum hullámhossza 519,4 nm.
Az előállított 5'-trifoszfát-3'-amino-3'-dezoxiribozid-3'-N-fluoreszcein-izotiocianát-timidint 2',3'-didezoxi-5'-trifoszfát-timidinre cseréljük. Ezt elvégezzük minden, az előzőekben megadott polimerázt tartalmazó terminációs oldattal. Minden esetben ekvimoláris, tízszeres és tized dNTP/terminátor arányt vizsgálunk meg. A szekvenálást standard eljárással végezzük. Ezekben a vizsgálatokban az a-35S-dATP beépülését autoradiográfiásan detektáljuk. Azt tapasztaljuk, hogy a) a 3'-fluoreszcens jelölésű nukleotid az alkalmazott enzimre termináló hatással bír, a beépülési sebességek T7, Taq és Sequenase esetén a térigényes színezékrész folytán a tízszeres koncentrációnál azonosak a szokásos didezoxi-terminátorokkal, és c) a 31-fluoreszcens-jelölésű terminátor alkalmazásával problémamentes szekvenálás végezhető.
13. Példa
Az előállított 5’-trifoszfát-3'-amino-3'-dezoxiribozid-3'N-fluoreszcein-izocianát-timidint 2',3'-didezoxi-5'-trifoszfát-timidinre cseréljük. Ezt a T7 és Taq polimerázokat tartalmazó terminációs oldatok mindegyikénél elvégezzük. Tízszeres dNTP/terminátor arányt veszünk alapul. A szekvenálást standard eljárással végezzük. Ezekben a vizsgálatokban az a-35S-dATP beépülés vizsgálatát elhagyjuk, a szekvencia analízist 3’-fluoreszcens jelölésű terminátorral, kereskedelmi forgalomban kapható DNS-szekvenálóban eredményesen végezzük.
14. Példa
5’-Trifoszfát-3'-tio-3'-dezoxiribozid-timidin előállítása (6. reakcióvázlat)
5'-O-dimetoxi-tritil-3’-S-benzoil-tiotimidin előállítása
A kén bevitelét a 3'-helyzetbe egy kilépőcsoportnak (mezilát) nátrium-tiobenzoáttal való helyettesítésével valósítjuk meg.
A nátrium-tiobenzoátot úgy állítjuk elő, hogy 10 g tiobenzoesav 15 ml vízben készült jégbehűtött oldatához 10 mól/l-es nátrium-hidroxidot adagolunk, amíg az oldat éppen lúgossá válik. Ezt követően a pH-t 7-re állítjuk be vizes tiobenzoesavval, az elegyet -5 °C hőmérsékletre hűtjük, és az oldatot a szilárd maradékok eltávolítására szűrjük. A vizet rotációs bepárlón etanol alkalmazásával eltávolítjuk, majd a kapott sárga sót vákuumban foszfor-pentoxid fölött szárítjuk.
8,45 mmól 51-O-dimetoxi-tritil-3'-O-metánszulfonil-2'-dezoxi-xilo-timidin [a mezilát szintézisét lásd a Miller, Fox,
J. Org. Chem. 29, 1772 (1964) szakirodalmi helyen] és 33 mmól nátrium-tiobenzoát 30 ml dimetil-formamidban készült oldatát 4 órán át 100 °C hőmérsékleten keverjük. Az elegyet diklór-metánnal kirázzuk, a szerves fázist telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és telített nátrium-klorid-oldattal mossuk. A szerves fázist nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük, majd toluollal együtt kétszer bepároljuk, és a kapott olajos nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk (kiezelgél 60 H, kloroform/metanol 0 - 10 %) .
A terméket 60 %-os hozammal nyerjük, a termék 1-H-NMR spektruma a vártnak megfelelő.
Az 5'-dimetoxi-tritil-védőcsoportot a foszfitcsoportnak az 5‘-helyzetbe való beviteléhez az irodalomban ismert eljárással [M. Gait, Oligonucleotide Synthesis, JRL-Press, Oxford, 1984] lehasítjuk. Ezt követően az 5'-trifoszfátot Eckstein és Ludwig eljárásával [J. Org. Chem. 54., (3) 631 (1989)] szalicil-foszforkloridit (Aldrich) alkalmazásával és pirofoszfáttal való reagáltatással állítjuk elő. A tiolt 10 mól/l-es, argonnal telített etanolos nátrium-hidroxiddal való reagáltatással [R. Cosstick, Nucleic Acids Research 18, 4, 829] tesszük szabaddá.
A 3'-tio-5'-trifoszfát-timidint a 8. példában leírt eljárás szerint jód-acetamid-fluoreszceinnel kapcsoljuk, ebben a lépésben a fluoreszcens színezékkel jelölt tionukleotidot 80 %os hozammal nyerjük.
15. Példa
1-(3'-tio-2',3'-didezoxi-5' -trifoszfát-B-D-treopentofuranozil)-timin előállítása (7. reakcióvázlat)
5'-DMTr-0-3'-O-mezil-timidinből kiindulva a 14. példában leírt módon nátrium-tiobenzoátos helyettesítést végzünk. Ezt követően az 5'-védőcsoportot lehasítjuk, az 5'-trifoszfátot a vegyületbe bevisszük, majd a tiolt szabaddá tesszük, és jód-acetamid-fluoreszceint kapcsolunk a vegyülethez a 14. példában leírttal analóg módon.
16. Példa
A 10 nukleotidból álló 3'-B-H2N-TTT TTT TTT T-5' oligomer előállítása
A 3'-β-Η2Ν-ΤΤΤ TTT TTT T-5' oligomert 1-(3'-amino-2',3'-didezoxi-51-DMTr-B-D-treopentofuranozil)-timinből állítjuk elő a hordozóanyagra a 6. példában leírt foszforamidit-eljárás szerint. A 3'-β-amino-oligonukleotidnak fluoreszcein-izotiocianáttal való fluoreszcens jelölését ezt követően a 8. példában leírt módon végezzük.
Claims (6)
1. Eljárás az (I) általános képletű vegyületek előállítására - a képletben
R1 jelentése egy purin- vagy pirimidinbázis, az R2 és R3 csoportok közül legalább az egyik egy aminovagy tiolcsoporton át kapcsolt fluoreszcens színezék, amely avagy β-helyzetű, és a másik helyettesítő adott esetben hidrogénatom, hidroxilcsoport, védett hidroxilcsoport vagy metoxicsoport, amelyek a- vagy β-helyzetűek, és n egy szám, amelynek értéke > 0,
R4 jelentése 5'-védőcsoport vagy foszfát-, pirofoszfátvagy trifoszfát-csoport,
R5 jelentése oxigénatom, fluor-metilén-, difluor-metilénvagy metiléncsoport,
R6 jelentése hidroxilcsoport, metoxicsoport vagy hidrogénatom, amelyek a- vagy β-helyzetűek,
R1, r5 és azonos vagy különböző jelentésűek lehetnek,
Y és X jelentése oxigénatom, kénatom, -NH- vagy metiléncsoport, ahol X és Y jelentése azonos vagy különböző -, azzal jellemezve, hogy egy nukleozid, nukleotid vagy oligonukleotid 3'- és/vagy 2'-helyzetű hidroxilcsoportját amino- vagy tiolcsoporttá alakítjuk, majd ezt egy fluoreszcens színezékkel kapcsoljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás az (I) általános képletű vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy egy nukleozid, nukleotid vagy oligonukleotid 3'- és/vagy 2'-helyzetű « · «
- 28 hidroxilcsoportját kilépőcsoporttá alakítjuk, majd egy aziddal való nukleofil reakció révén aziddá, illetve egy tioláttal vagy
S-védett tioláttal való nukleofil reakció révén tiollá vagy S-védett tiollá alakítjuk, majd a nukleinsav 3'-végén lévő cukorrész szabad 3'-(2')-amino- vagy -tiolcsoportját egy reakcióképes fluoreszcens színezékkel reagáltatjuk.
3. Eljárás az (I) általános képletű vegyületek előállítására - a képletben a helyettesítők jelentése az 1. igénypontban megadott - azzal jellemezve, hogy egy (II) általános képletű vegyületbe - a képletben R1 - R6, X, Y és n jelentése az 1. igénypontban megadott, ahol R1, R5 és R6 azonos vagy különböző jelentésű, és R7 és R8 jelentése hidrogénatom, hidroxilcsoport, védett hidroxilcsoport vagy metoxicsoport -,
a) a 3'- és/vagy 2'-helyzetbe nukleofil reakció révén egy védett vagy védetlen azid vagy tiol csoportot viszünk be, és az azidocsoportot aminná redukáljuk, majd
b) a fluoreszcens színezéket az amino- vagy tiolcsoport révén a vegyülethez kapcsoljuk.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fluoreszcens színezékként fluoreszceint, rodamint, texaszvöröst, NBD-t, kumarint, fluoreszcamint, szukcinil-fluoreszcint vagy dansylt alkalmazunk.
5. Az 1. igénypont szerint előállított vegyület alkalmazása
a) DNS- és RNS-nukleozidok, nukleotidok és oligonukleotidok szintézisénél,
b) in vivő és in vitro fluoreszcenciás mikroszkópos és makroszkópos detektálásnál.
• · ο ·« «· < · · • « « »· ·« • · · · · · · ··«· «··· ··»' «· ··
6. Az 1. igénypont szerint előállított vegyület alkalmazása
a) egy templátszál jelenlétében ellenszál szintézisére,
b) oligonukleotidok szintézisére.
f ..
danubia 1
Szabadalmi és Védjegy Iroda rgl . 7’
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4039488 | 1990-12-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU913885D0 HU913885D0 (en) | 1992-02-28 |
| HUT60505A true HUT60505A (en) | 1992-09-28 |
Family
ID=6420050
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU913885A HUT60505A (en) | 1990-12-11 | 1991-12-10 | Process for producing 3'-(2')-amino or thiol-nucleosides, nucleotides and oligonucleotides connected with fluorescent colour and application thereof |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5679785A (hu) |
| EP (1) | EP0490281B1 (hu) |
| JP (1) | JP3140127B2 (hu) |
| KR (1) | KR920012107A (hu) |
| AT (1) | ATE142222T1 (hu) |
| AU (1) | AU643856B2 (hu) |
| BG (1) | BG61484B1 (hu) |
| BR (1) | BR9105335A (hu) |
| CA (1) | CA2057475A1 (hu) |
| CS (1) | CS374391A3 (hu) |
| DE (1) | DE59108143D1 (hu) |
| DK (1) | DK0490281T3 (hu) |
| ES (1) | ES2093671T3 (hu) |
| FI (1) | FI915779A (hu) |
| GR (1) | GR3021041T3 (hu) |
| HU (1) | HUT60505A (hu) |
| IE (1) | IE75726B1 (hu) |
| IL (1) | IL100298A (hu) |
| MX (1) | MX9102468A (hu) |
| NO (1) | NO914859L (hu) |
| NZ (1) | NZ240900A (hu) |
| PL (1) | PL168874B1 (hu) |
| PT (1) | PT99747A (hu) |
| RO (1) | RO111575B1 (hu) |
| RU (1) | RU2073682C1 (hu) |
| TR (1) | TR27715A (hu) |
| YU (1) | YU187991A (hu) |
Families Citing this family (55)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5476925A (en) * | 1993-02-01 | 1995-12-19 | Northwestern University | Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups |
| US5726297A (en) * | 1994-03-18 | 1998-03-10 | Lynx Therapeutics, Inc. | Oligodeoxyribonucleotide N3' P5' phosphoramidates |
| US5599922A (en) * | 1994-03-18 | 1997-02-04 | Lynx Therapeutics, Inc. | Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties |
| JP3482209B2 (ja) * | 1994-03-18 | 2003-12-22 | ジェロン・コーポレーション | オリゴヌクレオチドｎ３’→ｐ５’ホスホルアミデート：合成および化合物；ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ耐性特性 |
| DE4418691A1 (de) * | 1994-05-28 | 1996-02-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | 3'-(4'-) nicht-radioaktiv markierte Nukleoside und Nukleotide mit Aminocarbonsäure-, Peptid- oder Carbonsäure-Spacer |
| US5962271A (en) * | 1996-01-03 | 1999-10-05 | Cloutech Laboratories, Inc. | Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end |
| US5859233A (en) * | 1996-02-21 | 1999-01-12 | Lynx Therapeutics, Inc. | Synthons for synthesis of oligonucleotide N3-P5 phosphoramidates |
| US5684143A (en) * | 1996-02-21 | 1997-11-04 | Lynx Therapeutics, Inc. | Oligo-2'-fluoronucleotide N3'->P5' phosphoramidates |
| US6017702A (en) * | 1996-12-05 | 2000-01-25 | The Perkin-Elmer Corporation | Chain-termination type nucleic acid sequencing method including 2'-deoxyuridine-5'-triphosphate |
| DE19741084A1 (de) * | 1997-09-18 | 1999-03-25 | Knoell Hans Forschung Ev | Hochaffine Nukleinsäuremoleküle mit funktionellen Gruppen zur spezifischen Erkennung von Zielmolekülen, ihre Herstellung und Verwendung |
| US6289229B1 (en) | 1998-01-20 | 2001-09-11 | Scimed Life Systems, Inc. | Readable probe array for in vivo use |
| US6184347B1 (en) | 1998-11-19 | 2001-02-06 | Agilent Technologies Inc. | Minimization of blooming in high-density arrays by using reactive wash reagents |
| US6761877B2 (en) * | 2000-02-18 | 2004-07-13 | Biocrystal, Ltd. | Functionalized encapsulated fluorescent nanocrystals |
| CA2423806C (en) * | 2000-09-29 | 2009-12-22 | Molecular Probes, Inc. | Modified carbocyanine dyes and their conjugates |
| US7563618B2 (en) | 2001-03-23 | 2009-07-21 | Geron Corporation | Oligonucleotide conjugates |
| KR100762261B1 (ko) | 2001-04-27 | 2007-10-04 | (주)바이오니아 | 전장 상보 디옥시리보핵산 제조 방법과 이에 사용되는앵커와 프라이머 |
| US7205048B2 (en) * | 2001-09-17 | 2007-04-17 | Invitrogen Corporation | Functionalized fluorescent nanocrystal compositions and methods of making |
| EP1456022B1 (en) * | 2001-09-17 | 2009-11-11 | Life Technologies Corporation | Nanocrystals |
| US7214428B2 (en) * | 2001-09-17 | 2007-05-08 | Invitrogen Corporation | Highly luminescent functionalized semiconductor nanocrystals for biological and physical applications |
| AU2003297859A1 (en) * | 2002-12-13 | 2004-07-09 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Biomolecular coupling methods using 1,3-dipolar cycloaddition chemistry |
| JP4177123B2 (ja) * | 2003-01-10 | 2008-11-05 | 富士通株式会社 | 配線図形検証方法、プログラム及び装置 |
| KR100890885B1 (ko) | 2003-03-31 | 2009-03-31 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 일본 뇌염 바이러스 혈청군의 구성원을 포함하는, 특정플라비바이러스 검출용 조성물 및 방법 |
| US20050131224A1 (en) * | 2003-12-15 | 2005-06-16 | Cti Pet Systems, Inc. | Method for preparing radiolabeled thymidine |
| US7160537B2 (en) * | 2003-12-15 | 2007-01-09 | Siemens Medical Solutions Usa, Inc. | Method for preparing radiolabeled thymidine having low chromophoric byproducts |
| US7939251B2 (en) | 2004-05-06 | 2011-05-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | SENP1 as a marker for cancer |
| WO2006033732A1 (en) * | 2004-08-17 | 2006-03-30 | Invitrogen Corporation | Synthesis of highly luminescent colloidal particles |
| JP2008519108A (ja) * | 2004-10-29 | 2008-06-05 | モレキュラー プローブス， インコーポレイテッド | 官能化蛍光性ナノ結晶、並びにそれらの調製及び使用方法 |
| US20090118132A1 (en) * | 2004-11-04 | 2009-05-07 | Roche Molecular Systems, Inc. | Classification of Acute Myeloid Leukemia |
| US7541144B2 (en) * | 2005-01-31 | 2009-06-02 | Agilent Technologies, Inc. | RNA labeling method |
| JP2008528040A (ja) | 2005-02-01 | 2008-07-31 | アジェンコート バイオサイエンス コーポレイション | ビーズベースの配列決定のための試薬、方法およびライブラリー |
| US7544471B2 (en) * | 2005-07-30 | 2009-06-09 | Agilent Technologies, Inc. | Preparing RNA from a wax-embedded tissue specimen |
| US7700289B2 (en) * | 2006-04-03 | 2010-04-20 | Agilent Technologies, Inc. | Method for labeling RNA |
| JP2009538123A (ja) * | 2006-04-19 | 2009-11-05 | アプライド バイオシステムズ， エルエルシー | ゲル非含有ビーズベースの配列決定のための試薬、方法およびライブラリー |
| US7572585B2 (en) * | 2006-07-31 | 2009-08-11 | Agilent Technologies, Inc. | Enzymatic labeling of RNA |
| KR101504640B1 (ko) * | 2006-12-05 | 2015-03-20 | 레이저젠, 인코퍼레이티드 | 광절단가능 표지된 뉴클레오티드와 뉴클레오시드, 표지된 뉴클레오티드와 뉴클레오시드, 그리고 ｄｎａ 염기서열분석에서 이들의 이용 방법 |
| EP2700723B1 (en) | 2007-08-06 | 2015-07-15 | Orion Genomics, LLC | Novel single nucleotide polymorphisms and combinations of novel and known polymorphisms for determining the allele-specific expression of the IGF2 gene |
| CA2639416C (en) | 2007-09-11 | 2019-12-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Diagnostic test for susceptibility to b-raf kinase inhibitors |
| EP2212434A1 (en) * | 2007-10-01 | 2010-08-04 | Applied Biosystems Inc. | Chase ligation sequencing |
| US20100086914A1 (en) * | 2008-10-03 | 2010-04-08 | Roche Molecular Systems, Inc. | High resolution, high throughput hla genotyping by clonal sequencing |
| CA2751758A1 (en) | 2009-02-11 | 2010-08-19 | Orion Genomics Llc | Combinations of polymorphisms for determining allele-specific expression of igf2 |
| US8431416B2 (en) | 2009-04-01 | 2013-04-30 | Becton, Dickinson And Company | Reactive heterocycle-substituted 7-hydroxycoumarins and their conjugates |
| US8309059B2 (en) * | 2009-08-31 | 2012-11-13 | Promega Corporation | Reactive cyanine compounds |
| WO2011128096A1 (en) | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Roche Diagnostics Gmbh | Polymorphism markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment |
| PL2576837T3 (pl) | 2010-06-04 | 2018-04-30 | Chronix Biomedical | Krążeniowe biomarkery typu kwasu nukleinowego związane z rakiem prostaty |
| US8623324B2 (en) | 2010-07-21 | 2014-01-07 | Aat Bioquest Inc. | Luminescent dyes with a water-soluble intramolecular bridge and their biological conjugates |
| US20140303008A1 (en) | 2011-10-21 | 2014-10-09 | Chronix Biomedical | Colorectal cancer associated circulating nucleic acid biomarkers |
| ES2413566B1 (es) | 2011-12-14 | 2014-05-20 | Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud | Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y pronóstico de la hipoacusia neurosensorial. |
| CN104619894B (zh) | 2012-06-18 | 2017-06-06 | 纽亘技术公司 | 用于非期望核酸序列的阴性选择的组合物和方法 |
| WO2014093825A1 (en) | 2012-12-14 | 2014-06-19 | Chronix Biomedical | Personalized biomarkers for cancer |
| ES2704682T5 (es) | 2013-05-29 | 2023-11-10 | Chronix Biomedical | Detección y cuantificación de ADN extracelular del donante en la circulación de receptores de trasplantes de órganos |
| ES2791328T3 (es) | 2014-10-01 | 2020-11-03 | Chronix Biomedical | Métodos de cuantificación de ADN acelular |
| KR20180136436A (ko) | 2016-03-28 | 2018-12-24 | 에이에이티 바이오퀘스트, 인코포레이티드 | 폴리플루오레노[4,5-cde]옥세핀 접합체 및 피분석물 검출 방법에서의 이의 용도 |
| US11220628B2 (en) | 2019-02-20 | 2022-01-11 | Aat Bioquest, Inc. | Condensed polycyclic conjugated polymers and their use for biological detection |
| WO2021154933A1 (en) | 2020-01-30 | 2021-08-05 | Aat Bioquest, Inc. | Uv excitable polyfluorene based conjugates and their use in methods of analyte detection |
| WO2023147355A2 (en) * | 2022-01-25 | 2023-08-03 | Oregon Health & Science University | Methods and systems for increasing capture potential of a spatial array |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5015733A (en) * | 1983-12-20 | 1991-05-14 | California Institute Of Technology | Nucleosides possessing blocked aliphatic amino groups |
| US4849513A (en) * | 1983-12-20 | 1989-07-18 | California Institute Of Technology | Deoxyribonucleoside phosphoramidites in which an aliphatic amino group is attached to the sugar ring and their use for the preparation of oligonucleotides containing aliphatic amino groups |
| EP0267996A1 (en) * | 1986-11-20 | 1988-05-25 | Tamir Biotechnology Ltd. | New nucleotide derivatives |
| GB2236852B (en) * | 1989-09-25 | 1994-04-06 | Scotgen Ltd | DNA probe based assays and intermediates useful in the synthesis of cleavable nucleic acids for use in such assays |
| US5227487A (en) * | 1990-04-16 | 1993-07-13 | Molecular Probes, Inc. | Certain tricyclic and pentacyclic-hetero nitrogen rhodol dyes |
| US5541307A (en) * | 1990-07-27 | 1996-07-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof |
-
1991
- 1991-12-02 YU YU187991A patent/YU187991A/sh unknown
- 1991-12-04 BG BG95575A patent/BG61484B1/bg unknown
- 1991-12-06 DE DE59108143T patent/DE59108143D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-12-06 ES ES91120935T patent/ES2093671T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-06 DK DK91120935.1T patent/DK0490281T3/da active
- 1991-12-06 EP EP91120935A patent/EP0490281B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-06 AT AT91120935T patent/ATE142222T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-12-09 TR TR01195/91A patent/TR27715A/xx unknown
- 1991-12-09 RO RO148926A patent/RO111575B1/ro unknown
- 1991-12-09 IL IL100298A patent/IL100298A/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-12-09 FI FI915779A patent/FI915779A/fi unknown
- 1991-12-09 NZ NZ24090091A patent/NZ240900A/en unknown
- 1991-12-10 NO NO91914859A patent/NO914859L/no unknown
- 1991-12-10 HU HU913885A patent/HUT60505A/hu unknown
- 1991-12-10 CA CA002057475A patent/CA2057475A1/en not_active Abandoned
- 1991-12-10 IE IE430191A patent/IE75726B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-12-10 AU AU88927/91A patent/AU643856B2/en not_active Ceased
- 1991-12-10 PT PT99747A patent/PT99747A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-12-10 PL PL91292701A patent/PL168874B1/pl unknown
- 1991-12-10 RU SU915010267A patent/RU2073682C1/ru active
- 1991-12-10 MX MX9102468A patent/MX9102468A/es unknown
- 1991-12-10 CS CS913743A patent/CS374391A3/cs unknown
- 1991-12-11 KR KR1019910022614A patent/KR920012107A/ko not_active Application Discontinuation
- 1991-12-11 BR BR919105335A patent/BR9105335A/pt unknown
- 1991-12-11 JP JP03350821A patent/JP3140127B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-01-18 US US08/184,759 patent/US5679785A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-06-01 US US08/457,377 patent/US5659025A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-01 US US08/456,734 patent/US5668269A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-09-13 GR GR960402400T patent/GR3021041T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT60505A (en) | Process for producing 3'-(2')-amino or thiol-nucleosides, nucleotides and oligonucleotides connected with fluorescent colour and application thereof | |
| KR0156042B1 (ko) | 적외선 염료로 표지화된 누클레오티드 및 그의 핵산 검출에 있어서의 사용방법 | |
| Stawinski et al. | Arylsulfonyltetrazoles, new coupling reagents and further improvements in the triester method for the synthesis of deoxyribooligonucleotides1 | |
| US5091519A (en) | Nucleotide compositions with linking groups | |
| EP2125856B1 (en) | Photocleavable labeled nucleotides and nucleosides and labeled nucleotides and nucleosides and methods for their use in dna sequencing | |
| JPH06500107A (ja) | オリゴ（α―アラビノフラノシル・ヌクレオチド）およびそれらのα―アラビノフラノシル前駆体 | |
| WO2008037568A2 (en) | Reversible terminators for efficient sequencing by synthesis | |
| JPH08507926A (ja) | エキソヌクレアーゼ分解を介した質量分析法によるｄｎａ配列決定 | |
| EP0466773A1 (en) | KUMARIN DERIVATIVES FOR USE AS NUCLEOTIDE CROSSLINKING REAGENTS. | |
| JP2562862B2 (ja) | 鋳型依存性酵素的核酸合成用プライマーとしてのオリゴヌクレオチド同時合成および直接標識化のための機能性担体 | |
| FR2632955A1 (fr) | Derives de nucleosides utilisables pour la synthese d'oligonucleotides marques, oligonucleotides obtenus a partir de ces derives et leur synthese | |
| KR20050122196A (ko) | 뉴클레오티드 유도체와 ｄｎａ 마이크로어레이 | |
| JPS63130599A (ja) | 修飾ヌクレオチド | |
| Stolze et al. | Synthesis of 3′‐Sugar‐and Base‐Modified Nucleotides and Their Application as Potent Chain Terminators in DNA Sequencing | |
| Ohkubo et al. | DNA synthesis without base protection using the phosphoramidite approach | |
| CN114174509A (zh) | 引物和使用了该引物的双链dna的制造装置以及双链dna的制造方法 | |
| JPS6299392A (ja) | 新規リボヌクレオシド誘導体およびその用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |