KR20050122196A

KR20050122196A - 뉴클레오티드 유도체와 ｄｎａ 마이크로어레이

Info

Publication number: KR20050122196A
Application number: KR1020057011850A
Authority: KR
Inventors: 이사오 사이토; 아키미츠 오카모토; 야스코 요시다
Original assignee: 니뽄 가이시 가부시키가이샤; 이사오 사이토
Priority date: 2002-12-26
Filing date: 2003-12-24
Publication date: 2005-12-28
Also published as: WO2004058793A1; CA2511620A1; EP1577318A4; EP1577318A1; AU2003296087A1

Abstract

본 발명은 하이브리드화한 상대 쇄가 서로 대응하는 염기종에 따라서 형광 시그널 강도가 변화하는 신규한 뉴클레오티드 유도체에 관한 것으로, 본 발명의 신규한 뉴크레오티드 유도체는 단일쇄 뉴클레오티드 서열의 멤버로서 존재하고, 이 단일쇄 뉴클레오티드 서열이 하이브리드화한 상대 쇄의 서로 대응하는 염기가 (1) 아데닌인 경우에 형광 색소가 가장 강하게 발광하는 티민/우라실 유도체; (2) 구아닌인 경우에 형광 색소가 가장 강하게 발광하는 시토신 유도체; (3) 시토신인 경우에 형광 색소가 가장 강하게 발광하는 아데닌 유도체; 또는 (4) 시토신 또는 티민/우라실인 경우에 형광 색소가 가장 강하게 발광하는 구아닌 유도체이다.

Description

뉴클레오티드 유도체와 ＤＮＡ 마이크로어레이{NUCLEOTIDE DERIVATIVES AND DNA MICROARRAY}

본 발명은 뉴클레오티드 서열 중 특정 염기종을 결정하기 위한 뉴클레오티드 유도체와, 이 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 캡쳐 프로브(capture probe)를 구비한 DNA 마이크로어레이에 관한 것이다.

포스트 게놈의 시대를 맞이하여, 뉴클레오티드 서열 중 염기종을 정확하게, 효율적으로, 나아가서는 저비용으로 검출하기 위한 새로운 기술이 요구되고 있다. 예를 들어, SNP(Single Nucleotide Polymorphism: 1염기다형)는 인간 게놈에 약 0.1%(약 1000 염기에 1염기)의 비율로 존재하는 가장 빈도가 높은 다형이며, 그 유무가 다양한 질병에도 관련된다는 것이 명백해지고 있으며(예를 들어, 폐암에 관한 p53 유전자 SNP: 비특허 문헌 1), 진단 및 유전적 치료법 등을 목적으로 하여 SNP의 유무를 정확히 판정하는 것(SNP 타이핑)의 중요성이 높아지고 있다.

SNP 타이핑의 방법으로서는 「하이브리드화 효율을 이용한 방법」,「효소 인식 효율을 이용한 방법」, 「전기적 수법을 이용한 방법」 등이 알려져 있지만, 특히 하이브리드화 효율을 이용한 방법은 DNA 마이크로어레이(예를 들어, 특허 문헌 1-4, 비특허 문헌 2, 3 참조)로의 적용이 다양하게 검토되어 있으며, 예를 들어, 비특허 문헌 4에는 DNA 마이크로어레이(마이크로어레이)를 이용한 BRCAl 유전자 SNP의 검출예가 보고되어 있다.

그러나, 종래의 DNA 마이크로어레이는 SNP의 검출에 한정된 것은 아닌지, 통상은 표적 뉴클레오티드 서열을 형광 등으로 표지하고, 마이크로어레이의 캡쳐 프로브와 하이브리드화한 표적 뉴클레오티드 서열을 형광 시그널을 지표로 하여 검출한다. 이 때문에, 예를 들어 표적 뉴클레오티드 서열의 제조에는 표시 dNTP를 이용한 PCR 증폭 등의 수단이 이용되고 있지만, 이것에는 많은 노동력과 시간, 비용을 필요로 한다. 또한, SNP 등의 검출에서는 프로브와 표지 뉴클레오티드 서열과의 하이브리드화에 있어서의 융해 온도를 지표로 하는 방법이 일반적으로 채용되고 있지만, 이 경우에는 하이브리드화의 엄격성(stringency) 조건을 개개의 표적 뉴클레오티드 서열마다 엄밀히 설정할 필요가 있으며, 또한 그와 같은 조건 설정에 의해서도 미스 하이브리드화 등에 의한 측정 오차를 피할 수 없다는 문제점도 존재하였다.

한편, 천연 핵산 염기에 형광 분자를 결합시킨 형광 수식 핵산 염기가 알려져 있으며, 예를 들어, 비특허 문헌 5에는 하이브리드화한 상대 쇄의 환경에 의해 형광 시그널 강도를 변화시키는 형광 프로브의 이용이 제안되어 있다.

[특허 문헌 1]

미국 특허 제5,474,796호 명세서

[특허 문헌 2]

미국 특허 제5,605,662호 명세서

[특허 문헌 3]

국제 공개 제95/251116호 팜플렛

[특허 문헌 4]

국제 공개 제95/35505호 팜플렛

[비특허 문헌 1]

Biros et al. Neoplasma 48(5): 407-11, 2001

[비특허 문헌 2]

Schena, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 10614-10619, 1996

[비특허 문헌 3]

Heller, R. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155, 1997

[비특허 문헌 4]

Hacia JG et al. Nat. Genet. 14:441-447, 1996

[비특허 문헌 5]

Nucleic Acids Res. 30:e97, 2002

도 1은 제3 위치에 미지 염기종 X를 포함하는 표적 뉴클레오티드 서열에 대하여, 각각 제3 위치에 뉴클레오티드 유도체를 보유하는 프로브 서열을 하이브리드화시켜 염기종 X를 결정한 예를 도시한다. T 유도체를 보유하는 프로브 서열이 가장 강한 형광 시그널을 발생시키기 때문에 표적 뉴클레오티드 서열의 미지 염기종 X는 아데닌으로 결정할 수 있다.

도 2는 제3 위치에 미지 염기종 X를 포함하는 표적 뉴클레오티드 서열에 대하여, 각각 제3 위치에 A 유도체 및 G 유도체를 보유하는 프로브 서열을 하이브리드화시켜 염기종 X를 결정한 예를 도시한다. 상단에서는 A 유도체 및 G 유도체를 보유하는 프로브 서열이 가장 강한 형광 시그널을 발생시키기 때문에 표적 뉴클레오티드 서열의 미지 염기종 X는 시토신이라고 결정할 수 있다. 하단에서는 G 유도체를 보유하는 프로브 서열이 가장 강한 형광 시그널을 발생시키기 때문에 표적 뉴클레오티드 서열의 미지 염기종 X는 티민이라고 결정할 수 있다.

도 3은 제4 위치에 G/A 다형을 포함하는 표적 이중쇄 뉴클레오티드 서열에 대하여, 각각 제4 위치에 뉴클레오티드 유도체를 보유하는 프로브 서열을 하이브리드화시켜 G/A 다형을 결정한 예를 도시한다. 상단에 도시한 G/G 호모 접합의 경우에는 상기 위치에 C 유도체를 포함하는 프로브가 강한 형광 시그널을 발생시키고, 중단에 도시한 G/A 헤테로 접합의 경우에는 C 유도체를 포함하는 프로브와 T 유도체를 포함하는 프로브가 강한 시그널을 발생시킨다. 또한, 하단에 도시한 A/A 호모 접합체의 경우에는 T 유도체를 포함하는 캡쳐 프로브로부터 강한 시그널를 얻을 수 있다.

도 4는 서열 미지인 6량체 올리고 뉴클레오티드(NNNNNN)의 염기 서열을 결정한 예를 도시한다. 제1 위치의 X에 대하여 상기 위치에 T 유도체를 포함하는 캡쳐 프로브로부터 강한 시그널를 얻을 수 있었기 때문에, 이 올리고 뉴클레오티드의 제1 위치 X는 티민(T)과 상보 결합하는 아데닌(A)으로 결정된다. 마찬가지로 하여 제2∼6 위치까지를 조사함으로써, 이 6량체 올리고 뉴클레오티드는 AGGCGA로 이루어지는 서열로 결정된다.

도 5는 표적 뉴클레오티드 서열이 원하는 기지 서열 영역에 대하여 일부가 불일치한 경우에 그 불일치 염기를 결정한 예를 도시한다. 제3 위치에 T 유도체를 보유하는 프로브와 제6 위치에 C 유도체를 보유하는 프로브가 각각 강한 시그널을 발생시킴으로써, 표적 뉴클레오티드 서열의 제3 위치가 A로 치환되고, 제6 위치가 G로 치환되고 있는 것이 판명된다.

도 6은 본 발명의 뉴클레오티드 유도체의 일례(PyU(5), PyC(5))의 합성 공정이다. Py는 1-피레닐, DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸이다.

도 7은 본 발명의 뉴클레오티드 유도체의 일례(PyA(7))의 합성 공정이다. Py는 1-피레닐, DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸이다.

도 8은 본 발명의 뉴클레오티드 유도체의 일례(PyG(8))의 합성 공정이다.

도 9는 형광 스펙트럼이며, 뉴클레오티드 유도체 PyC(5) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 상보 쇄상의 PyC(5)와 대응하여 결합하는 뉴클레오티드가 데옥시구아닐산(G)인 경우에는 강한 발광 시그널을 발생시키는 것을 도시한다.

도 10은 별도의 형광 스펙트럼이며, 뉴클레오티드 유도체 PyC(5) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 상보 쇄상의 PyC(5)와 서로 대응하는 뉴클레오티드가 데옥시구아닐산(G)인 경우에는 강한 발광 시그널을 발생시키는 것을 도시한다.

도 11은 형광 스펙트럼이며, 뉴클레오티드 유도체 PyU(5) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 상보 쇄상의 PyU(5)와 대응하여 결합하는 뉴클레오티드가 데옥시구아닐산(A)인 경우에는 강한 발광 시그널을 발생시키는 것을 도시한다.

도 12는 도 11에 도시한 결과의 형광 사진이다.

도 13은 형광 스펙트럼이며, 뉴클레오티드 유도체 PyU(5) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 상보 쇄상의 PyU(5)와 대응하여 결합하는 뉴클레오티드가 데옥시구아닐산(A)인 경우에는 강한 발광 시그널을 발생시키는 것을 도시한다.

도 14는 형광 스펙트럼이며, 뉴클레오티드 유도체 PyA(7) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 상보 쇄상의 PyA(7)와 대응하여 결합하는 뉴클레오티드가 데옥시시티딜산(C)인 경우에는 강한 발광 시그널을 발생시키는 것을 도시한다.

도 15는 형광 스펙트럼이며, 뉴클레오티드 유도체 PyG(8) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드 상보 쇄상의 PyG(8)와 대응하여 결합하는 뉴클레오티드가 데옥시시티딜산(C)인 경우와, 데옥시티미딜산(T)인 경우에는 강한 발광 시그널을 발생시키는 것을 도시한다.

발명 실시를 위한 최적 양태

제1 발명은 피리미딘 염기 또는 퓨린 염기에 링커를 통해 형광 색소 층간삽입체가 결합되어 있는 뉴클레오티드 유도체로서, 단일쇄 뉴클레오티드 서열의 멤버로서 존재하고, 이 단일쇄 뉴클레오티드 서열이 하이브리드화한 상대 쇄가 서로 대응하는 특정 염기종을 인식하고, 다른 염기종과 비교하여 상대적으로 강한 형광 시그널을 발생시키는 것을 특징으로 한다. 구체적으로는,

(1) 아데닌(A)을 인식하는 티민(T) 유도체;

(2) 구아닌(G)을 인식하는 시토신(C) 유도체;

(3) 시토신(C)을 인식하는 아데닌(A) 유도체; 및

(4) 시토신(C) 또는 티민(T)을 인식하는 구아닌(G) 유도체이다.

「형광 색소 층간삽입체」는 이중쇄 뉴클레오티드 서열 중 인접한 뉴클레오티드 쌍 사이에 삽입할 수 있는 물질이면서 형광을 발생시키는 물질이다. 이러한 물질로서는 형광 시그널을 발생시키면서, 삽입이 가능한 피레닐(1-pyrenyl) 등을 사용할 수 있다. 혹은 또한, 공지한 층간삽입체로 마찬가지로 공지한 형광 물질을 결합시킨 것을 사용할 수도 있다. 층간삽입체로서는 예를 들어, 아크리딘오렌지, 프로플라빈, 브롬화에티듐, 액티노마이신(D) 등의 방향족 색소 분자를 사용할 수 있다. 또한 형광 물질로서는 예를 들어 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC), 로다민 유도체 (예를 들어 로다민B이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민이소티오시아네이트(RITC), 테트라메틸로다민이소티오시아네이트아이소머-R) 등을 사용할 수 있다. 또 층간삽입체와 형광 물질과의 결합은 티올기와 말레이미드기의 반응, 피리딜디술피드기와 티올기의 반응, 아미노기와 알데히드기의 반응 등을 이용하여 행할 수 있으며, 공지한 방법 혹은 상기 분야의 당업자가 용이하게 할 수 있는 방법, 나아가서는 이들을 수식한 방법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다.

피리미딘 염기 또는 퓨린 염기에 층간삽입체를 연결하기 위한 「링커」는 예를 들어, 탄소쇄나 폴리머 등을 사용할 수 있다. 또한, 링커를 통해 층간삽입체를 연결하는 피리미딘 염기 또는 퓨린 염기의 위치는 각각의 비치환 탄소 위치로부터 임의로 선택하여 사용할 수 있다. 즉, 피리미딘 염기의 경우에는 제4 위치 또는 제5 위치이며, 퓨린 염기의 경우에는 제7 위치 또는 제8 위치이다.

이러한 뉴클레오티드 유도체는 보다 구체적으로는 각각 상기한 화학식 1∼4로 각각 도시할 수 있다. 즉, 화학식 1은 피리미딘 염기 제5 위치 치환의 T 유도체, 화학식 2는 피리미딘 염기 제5 위치 치환의 C 유도체, 화학식 3은 퓨린 염기 제7 위치 치환의 A 유도체, 화학식 4는 퓨린 염기 제8 위치 치환의 G 유도체이다. 이하의 기재에 있어서, 형광 색소 층간삽입체로서 피렌(Ry)을 사용한 경우, 이들 뉴클레오티드 유도체는 각각, PyU(5), PyC(5), PyA(7), PyG(8)로 기재하는 경우가 있다.

이들 뉴클레오티드 유도체는 피리미딘 염기 또는 퓨린 염기, 링커 및 적절한 형광 색소 층간삽입체를 사용하여, 예를 들어 후술하는 실시예에 기재한 방법에 의해 합성할 수 있다. 또한 상기한 화학식 1∼4에 도시한 뉴클레오티드 유도체의 경우에는 상기한 화학식 5∼8에서 각각 나타내는 뉴클레오시드 유도체를 전구체로 함으로써, 용이하게 작성할 수 있다.

또, 화학식 1∼8에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉는 동일 하거나 또는 상이하게 수소 원자 또는 치환기를 도시하고, R₁₀은 수소 원자 또는 수산기이며, X는 이미노(NH), 옥시(O), 티오(S), 메틸렌(CH₂) 및 알킬아미노기로부터 선택되는 연결기이며, 알킬렌 쇄 길이를 나타내는 정수 n은 X가 메틸렌 또는 알킬아미노기인 경우에는 0∼5이며, X가 이미노, 옥시 또는 티오인 경우에는 1∼5이다. 이 중 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉의 치환기는 할로겐 원자, 산소 함유기, 질소 함유기, 황 함유기 및 이들의 원자 및 치환기를 가져도 좋은 탄소수소기 혹은 복소환기 등이다. 더욱 자세히는 치환기는 할로겐 원자, 알콕시기, 에스테르기, 아미노기, 치환 아미노기, 니트로기, 아미도기, 시아노기, 카르바메이트기, 우레이도기, 티올기, 티오에테르기, 티오에스테르기 등이다. 또한, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇ 및 R₈이 동시에 수소 원자는 아니며 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉의 인접하는 것들이 결합하여 치환기를 가져도 좋은 페닐기를 형성하여도 좋다.

제3 발명의 단일쇄 뉴클레오티드 서열은 상기한 뉴클레오티드 유도체를 1개 또는 복수개 보유하는 3∼200개, 바람직하게는 10∼100개인 뉴클레오티드의 서열(올리고뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 단편)이다. 이러한 단일쇄 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, Carruthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; 미국 특허 제4,458,066호에 기재되어 있는 바와 같은 주지의 화학 합성 기술에 의해, 시험관 내에서 합성할 수 있다. 또한, DNA 합성 장치를 이용하여 자동적으로 합성할 수도 있다.

이상의 단일쇄 뉴클레오티드 서열을 이용함으로써, 본원의 제4 발명의 염기종 결정 방법을 실시할 수 있다.

이 제4 발명의 방법은 미지 염기종 X를 포함하는 표적 뉴클레오티드 서열과, 염기종 X의 동일한 위치에 뉴클레오티드 유도체를 보유하는 제3 발명의 단일쇄 뉴클레오티드 서열(이하 「프로브 서열」이라고 기재하는 경우가 있음)을 하이브리드화시키고, 뉴클레오티드 유도체 (1)∼(4) 각각의 형광 색소가 가장 강하게 형광 시그널을 발생시킨 경우, 염기종 X를 이하와 같이 결정한다.

(ⅰ) T 유도체의 형광 색소가 가장 강하게 발광한 경우는 아데닌;

(ⅱ) C 유도체의 형광 색소가 가장 강하게 발광한 경우는 구아닌;

(ⅲ) A 유도체의 형광 색소가 가장 강하게 발광한 경우는 시토신;

(ⅳ) G 유도체의 형광 색소가 가장 강하게 발광한 경우는 시토신 또는 티민.

이 경우 「가장 강하게 발광한다」는 것은 예를 들어, PyU(5)의 경우에는 다른 뉴클레오티드와 비교하여 약 3배 이상, PyC(5)의 경우에는 1.5배 이상, PyA(7)의 경우에는 2.5배 이상, PyG(8)의 경우에는 2배 이상의 발광 시그널이 관찰된 경우에 각각이 대응하여 결합한 염기종을 상기한 바와 같이 결정할 수 있다.

구체적으로는, 예를 들어 도 1에 도시한 예에서는 제3 위치에 미지 염기종 X를 포함하는 표적 뉴클레오티드 서열에 대하여, 각각 제3 위치에 A 유도체, T 유도체, G 유도체, C 유도체를 보유하는 프로브 서열을 준비하고, 각각의 프로브 서열을 표적 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화시키면, T 유도체를 보유하는 프로브 서열이 가장 강한 형광 시그널을 발생시키기 때문에 표적 뉴클레오티드 서열의 미지 염기종 X는 아데닌으로 결정할 수 있다.

단, 상기 제4 발명의 방법에서는 A 유도체와 G 유도체는 함께 시토신을 인식하고, G 유도체는 시토신과 티민을 각각 인식해버린다. 이 때문에, 제4 발명의 방법은 예를 들어 도 2에 도시한 바와 같이, A 유도체와 G 유도체의 각각을 동일 위치에 보유하는 2개의 단일쇄 뉴클레오티드 서열을 각각 동일한 상대 쇄에 하이브리드화시키고, 각각의 형광 시그널 강도의 조합에 의해 이하와 같은 염기종 X를 결정한다.

(ⅴ) A 유도체와 G 유도체 양쪽의 형광 색소가 가장 강하게 발광한 경우는 시토신.

(ⅳ) G 유도체의 형광 색소만이 가장 강하게 발광한 경우는 티민.

이상의 방법에 의해, 표적 뉴클레오티드 서열 중 SNP의 검출, 미지 서열의 서열 결정, 기지 서열 영역과 상동인 영역의 존부 혹은 기지 서열 영역내 미지 서열의 서열 결정 등이 가능해진다. 이들은 상기한 프로브 서열을 이용한 일반적인 하이브리드화 어세이로서 실시할 수도 있지만, 특히 상기한 프로브 서열을 캡쳐 프로브로 하는 DNA 마이크로어레이에 있어서 실시할 수 있다.

제5 발명의 DNA 마이크로어레이는 상기 제3 발명의 단일쇄 뉴클레오티드 서열을 캡쳐 프로브로 하는 것을 제외하고, 통상의 DNA 마이크로어레이와 동일하게 하여 제작할 수 있다. DNA 마이크로어레이의 제작 방법으로서는 고상담체 표면에서 직접 캡쳐 프로브를 합성하는 방법(온·칩법)과, 미리 제조한 캡쳐 프로브를 고상담체 표면에 고정하는 방법이 알려져 있지만, 본 발명의 DNA 마이크로어레이는 후자의 방법으로 제작하는 것이 바람직하다. 미리 제조한 캡쳐 프로브를 고상담체 표면에 고정하는 경우에는 관능기를 도입한 캡쳐 프로브를 합성하고, 표면 처리한 고상담체 표면에 캡쳐 프로브를 점착하여 공유 결합시킨다(예를 들어, Lamture, J. B. et al. Nucl. Acids Res. 22:2121-2125, 1994; Guo, Z. et al. Nucl. Acids Res. 22:5456-5465, 1994). 캡쳐 프로브는 일반적으로 표면 처리한 고상담체에 스페이서 및 크로스 링커를 통해 공유 결합시킨다. 유리 표면에 폴리아크릴아미드겔의 미소 부재를 정렬시키고, 거기에 캡쳐 프로브를 공유 결합시키는 방법도 알려져 있다 (Yershov, G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4913, 1996). 또한, 실리카마이크로어레이상에 미소 전극의 어레이를 제작하고, 전극상에는 스트렙타비딘을 포함하는 아가로스의 침투층을 마련하여 반응 부위로 하고, 이 부위를 플러스로 하전시킴으로써 비오틴화 캡쳐 프로브를 고정하고, 부위의 하전을 제어함으로써, 고속이며 엄밀한 하이브리드화를 가능하게 하는 방법도 알려져 있다(Sosnowski, R. G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1119-1123, 1997). 본 발명의 DNA 마이크로어레이는 상기한 어느 방법에 의해서도 제작할 수 있다.

또, 이 DNA 마이크로어레이와 표적 뉴클레오티드 서열과의 하이브리드화도 통상의 DNA 마이크로어레이와 동일하게 행할 수 있다. 즉, 표적 뉴클레오티드 서열을 DNA 마이크로어레이에 접촉시키고, DNA 마이크로어레이의 캡쳐 프로브에 하이브리드화시킨다. 하이브리드화는 96웰 혹은 384웰 플라스틱 플레이트에 분사하여 표지 cDNA 수성액을 마이크로어레이상에 점착함으로써 실시할 수 있다. 점착량은 1∼100 nl 정도로 할 수 있다. 하이브리드화는 실온∼70℃의 온도 범위에서 6∼20 시간의 범위로 실시하는 것이 바람직하다. 하이브리드화 종료 후, 계면 활성제와 완충액과의 혼합 용액을 이용하여 세정하고, 미반응 표지 cDNA를 제거한다. 계면 활성제로서는 도데실 황산나트륨(SDS)을 이용하는 것이 바람직하다. 완충액으로서는 시트르산 완충액, 인산 완충액, 붕산 완충액, 트리스 완충액, 굿 완충액 등을 이용할 수 있지만, 시트르산 완충액을 이용하는 것이 바람직하다.

단, 본 발명의 DNA 마이크로어레이의 경우에는 표적 뉴클레오티드 서열을 하이브리드화한 캡쳐 프로브가 형광 시그널을 발생시키기 때문에 통상의 DNA 마이크로어레이와 같은 표적 뉴클레오티드 서열에 표지 라벨 등을 부가할 필요는 없다.

이 제5 발명의 DNA 마이크로어레이 중 하나의 형태는 표적 뉴클레오티드 서열의 1염기다형(SNP)을 검출하기 위한 DNA 마이크로어레이이다. 즉, 이 DNA 마이크로어레이의 캡쳐 프로브 세트는 표적 뉴클레오티드 서열 중 적어도 SNP 뉴클레오티드를 포함하는 영역과 상보적이지만, 개개의 캡쳐 프로브는 표적 뉴클레오티드 서열의 SNP 뉴클레오티드와 대응하는 위치의 뉴클레오티드가 각각 다른 뉴클레오티드 유도체이다. 따라서, 캡쳐 프로브 중 뉴클레오티드 유도체가 발생시키는 형광 시그널 강도를 지표로 하여 표적 올리고뉴클레오티드 서열의 SNP를 검출할 수 있다. 예를 들어, 도 3에 도시한 바와 같은 G/A 다형의 경우에는, G/G 호모 접합의 경우에는 상기 위치에 C 유도체를 포함하는 캡쳐 프로브가 강한 형광 시그널을 발생시키고, G/A 헤테로 접합의 경우에는 C 유도체를 포함하는 캡쳐 프로브와 T 유도체를 포함하는 캡쳐 프로브가 강한 시그널을 발생시킨다. 또한 A/A 호모 접합체의 경우에는 T 유도체를 포함하는 캡쳐 프로브로부터 강한 시그널를 얻을 수 있다.

본 발명의 DNA 마이크로어레이에 있어서의 별도의 형태는 서열이 미지인 n(n=3∼100)개의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위한 DNA 마이크로어레이이다. 즉, 이 DNA 마이크로어레이에 있어서, 캡쳐 프로브는 뉴클레오티드 서열이 모두 다른 적어도 4ⁿ개의 세트이며, 개개의 캡쳐 프로브는 제1 위치에서 제n 위치까지가 순차적으로 다른 뉴클레오티드 유도체인 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 도 4에 예시한 바와 같은 서열 미지의 6량체 올리고뉴클레오티드(NNNNNN)의 경우, 제1 위치의 X에 대하여 상기 위치에 T 유도체를 포함하는 캡쳐 프로브로부터 강한 시그널를 얻을 수 있었던 경우, 이 올리고뉴클레오티드의 제1 위치 X는 티민(T)과 상보 결합하는 아데닌(A)이다. 마찬가지로 하여 제2∼6 위치까지를 조사함으로써, 이 6량체 올리고뉴클레오티드 NNNNNN은 AGGCGA로 이루어지는 서열이라고 결정할 수 있다. 또, 도 2에 도시한 바와 같은 A 유도체와 G 유도체와의 형광의 비교에 의해 티민(T)를 포함하는 미지 서열을 결정할 수도 있다. 또한, 통상의 서열결정기에서는 단쇄(3∼100)의 올리고뉴클레오티드의 서열 결정은 불가능하지만, 본 발명의 DNA 마이크로어레이를 이용함으로써, 단쇄 올리고뉴클레오티드의 서열을 간편하면서 정확히 결정하는 것이 가능해진다.

본 발명의 DNA 마이크로어레이의 또 다른 형태는 표적 뉴클레오티드 서열 중에 n(n=3∼100)개의 뉴클레오티드로 이루어지는 기지 서열 영역(도메인 및 모티프)과 상동인 영역이 존재하는지 여부를 검출하기 위한 DNA 마이크로어레이이다. 즉, 이 DNA 마이크로어레이에 있어서의 캡쳐 프로브 세트는 기지 서열 영역과 상보적이지만, 개개의 캡쳐 프로브는 제1 위치에서 제n 위치까지가 순차적으로 다른 뉴클레오티드 유도체인 것을 특징으로 한다. 따라서, 예를 들어, 표적 뉴클레오티드 서열이 원하는 기지 서열 영역과 완전 상동인 서열을 보유하는 경우, 기지 서열이 각각 대응하는 위치에 소정의 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 모든 캡처 프로브로부터 강한 시그널를 얻을 수 있다. 한편, 도 5에 예시한 바와 같이, 제3 위치가 A로 치환되고, 제6 위치가 G로 치환되어 있는 서열의 경우에는 제3 위치에 T 유도체를 포함하는 캡쳐 프로브와, 제6 위치에 C 유도체를 보유하는 캡쳐 프로브가 각각 강한 시그널을 발생시킨다. 이것에 의해 기지 서열 영역과 완전히 일치하는 서열의 존재뿐만 아니라, 일부가 불일치한 상동서열의 존재를 간편하면서 용이하게 검출하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 DNA 마이크로어레이의 다른 형태는 n(n=3∼100)개의 뉴클레오티드로 이루어지는 미지 서열 영역과 기지 서열 영역을 보유하는 표적 뉴클레오티드 서열의 미지 서열 영역의 서열을 결정하는 것을 목적으로 하는 DNA 마이크로어레이이다. 즉, 이 DNA 마이크로어레이에 있어서, 캡쳐 프로브의 세트는 표적 뉴클레오티드 서열 중 기지 서열 영역에 대한 상보 서열과, 뉴클레오티드 서열이 모두 다른 프로브 서열 영역을 보유하는 적어도 4ⁿ개의 세트이며, 각 프로브 서열 영역의 제1 위치에서 제n 위치까지 중 적어도 하나가 뉴클레오티드 유도체이다. 이 경우, 표적 뉴클레오티드 서열과 캡쳐 프로브와는 그 기지 서열 영역의 상보성에 의해 하이브리드화되고, 상기와 같은 미지 서열 결정용 캡쳐 프로브로부터의 형광 시그널에 의해 그 서열이 결정된다.

상기한 바와 같이, SNP 검출 등에 있어서 염기종의 결정을 위해서는 특히, DNA 마이크로어레이로의 적용을 고려한 경우, 표적 뉴클레오티드 서열의 형광 등에 의한 표지화 조작을 필요로 하지 않으며, 게다가 융해 온도 측정 등의 간접적인 지표에 의지할 필요 없는 새로운 방법이 요구되고 있다. 그와 같은 관점에서 형광수식 핵산 염기를 이용한 프로브(예를 들어 비특허 문헌 5)는 프로브측 형광 시그널의 변화를 지표로 하여 직접적으로 염기종을 특정 가능하다는 점에서 유효한 방법이다. 단, 이 비특허 문헌 5의 방법의 경우에는 형광 수식 핵산 염기와 대응하여 결합하는 염기종의 주변 환경(특정한 염기 서열 등)에 따른 형광 시그널을 지표로 하는 것이며, 1염기의 종류에 따라 형광 시그널이 변화하는 것은 아니다.

본 발명은 이상과 같은 사정을 감안하여 이루어진 것이며, 하이브리드화한 상대 쇄가 서로 대응하는 염기종에 따라서 형광 시그널 강도가 변화하는 새로운 뉴클레오티드 유도체를 제공하는 것을 과제로 하고 있다.

또한 본 발명은 상기한 뉴클레오티드 유도체를 이용한 염기종의 결정방법과, 이 방법을 측정 원리로 하는 DNA 마이크로어레이를 제공하는 것을 과제로 하고 있다.

본원의 제1 발명은 피리미딘 염기 또는 퓨린 염기에 링커를 통해 형광 색소 층간삽입체(intercalator)가 결합되어 있는 뉴클레오티드 유도체로서, 단일쇄 뉴클레오티드 서열의 멤버로서 존재하고, 이 단일쇄 뉴클레오티드 서열이 하이브리드화한 상대 쇄의 서로 대응하는 염기가,

(1) 아데닌인 경우에 형광 색소가 가장 강하게 발광하는 티민/우라실 유도체;

(2) 구아닌인 경우에 형광 색소가 가장 강하게 발광하는 시토신 유도체;

(3) 시토신인 경우에 형광 색소가 가장 강하게 발광하는 아데닌 유도체; 또는

(4) 시토신 또는 티민/우라실인 경우에 형광 색소가 가장 강하게 발광하는 구아닌 유도체이다.

이 제1 발명에 있어서, 「뉴클레오티드 유도체」란, 퓨린 또는 피리미딘이 당에 β-N-글리코시드 결합한 뉴클레오시드의 인산 에스테르인 뉴클레오티드(ATP, GTP, CTP, UTP; 또는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP)의 임의 위치에 알킬렌 쇄를 통해 형광 색소 층간삽입체를 결합한 화합물이다. 또한, 이 뉴클레오티드 유도체가 「단일쇄 뉴클레오티드 서열의 멤버로서 존재한다」는 것은 3 뉴클레오티드 이상의 뉴클레오티드 서열 중 단부가 아닌 위치에 뉴클레오티드 유도체가 그 좌우의 뉴클레오티드와 포스포디에스테르 결합한 상태를 말한다. 또한, 「형광 색소가 가장 강하게 발광한다」는 것은 예를 들어 형광 분광 광도계로 측정한 경우, 예를 들어 티민/우라실 유도체의 경우에는 대응하는 염기종이 구아닌, 시토신 및 티민/우라실인 경우에 비하여, 아데닌인 경우에 가장 강한 형광 시그널 강도를 얻을 수 있다는 것을 의미한다.

또한, 이하의 설명에 있어서 「티민/우라실」은 간단히 「우라실(U)」 또는「티민(T)」으로 기재하는 경우가 있다.

이 제1 발명의 구체예는 하기 화학식 1로 나타내는 티민 유도체:

하기 화학식 2로 나타내는 시토신 유도체:

하기 화학식 3으로 나타내는 아데닌 유도체:

및 하기 화학식 4로 나타내는 구아닌 유도체:

이다.

또한, 본원의 제2 발명은 상기 각 뉴클레오티드 유도체의 전구 물질의 구체예로서, 각각 이하의 뉴클레오시드 유도체이다.

티민/우라실 유도체의 전구 물질로서, 하기 화학식 5로 나타내는 뉴클레오시드 유도체:

시토신 유도체의 전구 물질로서, 하기 화학식 6으로 나타내는 뉴클레오시드 유도체:

아데닌 유도체의 전구 물질로서, 하기 화학식 7로 나타내는 뉴클레오시드 유도체:

구아닌 유도체의 전구 물질으로서, 하기 화학식 8로 나타내는 뉴클레오시드 유도체:

를 들 수 있다.

또한, 상기 화학식 1∼8에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉는 동일하거나 또는 상이하게 수소 원자 또는 치환기를 나타내고, R₁₀은 수소 원자 또는 수산기이며, X는 이미노(NH), 옥시(O), 티오(S), 메틸렌(CH₂) 및 알킬아미노기로부터 선택되는 연결기이며, 알킬렌 쇄 길이를 나타내는 정수 n은 X가 메틸렌 또는 알킬아미노기인 경우에는 0∼5이며, X가 이미노, 옥시 또는 티오인 경우에는 1∼5이다.

본원의 제3 발명은 상기 제1 발명의 뉴클레오티드 유도체 (1)∼(4) 중 1 이상을 멤버로서 보유하는 단일쇄 뉴클레오티드 서열이다.

상기 제3 발명의 단일쇄 뉴클레오티드 서열에 있어서는, 어느 하나에 뉴클레오티드 유도체가 복수개 존재하여도 좋고, 또는 2종 이상의 뉴클레오티드 유도체가 1개씩, 혹은 각각 복수개 존재하여도 좋다. 또한, 상기한 바와 같이, 이 단일쇄 뉴클레오티드 서열에서는 뉴클레오티드 유도체는 서열의 단부에는 존재하지 않는다.

본원의 제4 발명은 상기 제3 발명의 단일쇄 뉴클레오티드 서열이 하이브리드화한 상대 쇄의 1염기종 X를 결정하는 방법으로서, 단일쇄 뉴클레오티드 서열 중,

(ⅰ) 티민 유도체 (1)의 형광 색소가 가장 강하게 발광한 경우의 염기종 X는 아데닌;

(ⅱ) 시토신 유도체 (2)의 형광 색소가 가장 강하게 발광한 경우의 염기종 X는 구아닌;

(ⅲ) 아데닌 유도체 (3)의 형광 색소가 가장 강하게 발광한 경우의 염기종 X는 시토신;

(ⅳ) 구아닌 유도체 (4)의 형광 색소가 가장 강하게 발광한 경우의 염기종 X는 시토신 또는 티민

으로 결정하는 염기종 결정 방법이다.

상기 제4 발명의 방법은 또한, 아데닌 유도체 (3)와 구아닌 유도체 (4) 각각을 동일 위치에 보유하는 2개의 단일쇄 뉴클레오티드 서열을 각각 동일한 상대 쇄에 하이브리드화시키고,

(ⅴ) 아데닌 유도체 (3)와 구아닌 유도체 (4)의 양쪽 형광 색소가 가장 강하게 발광한 경우의 상대 쇄의 염기종 X는 시토신;

(ⅵ) 구아닌 유도체 (4)의 형광 색소만이 가장 강하게 발광한 경우의 상대 쇄의 염기종 X는 티민

으로 결정하는 것을 바람직한 형태로 하고 있다.

제4 발명의 상기 형태에 있어서, 「2개의 단일쇄 뉴클레오티드 서열」이란, 뉴클레오티드 유도체 (3)과 (4) 이외는 완전 동일한 염기 서열로 이루어지는 2개의 단일쇄 뉴클레오티드 서열을 말한다.

본원의 제5 발명은 상기 제2 발명의 단일쇄 뉴클레오티드 서열을 캡쳐 프로브로 하는 DNA 마이크로어레이이다.

상기 제5 발명의 DNA 마이크로어레이는 표적 뉴클레오티드 서열의 1염기다형(SNP)을 검출하는 DNA 마이크로어레이로서, 캡쳐 프로브의 세트는 표적 뉴클레오티드 서열 중 적어도 SNP 뉴클레오티드를 포함하는 영역과 상보적이지만, 개개의 캡쳐 프로브는 표적 뉴클레오티드 서열의 SNP 뉴클레오티드와 대응하는 위치에 뉴클레오티드가 각각 뉴클레오티드 유도체 (1)∼(4)인 것을 하나의 형태로 하고 있다.

상기 제5 발명의 DNA 마이크로어레이는 또한, 서열이 미지인 n(n=3∼100)개의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 DNA 마이크로어레이로서, 캡쳐 프로브는 뉴클레오티드 서열이 모두 다른 적어도 4ⁿ개의 세트이며, 개개의 캡쳐 프로브는 제1 위치에서 제n 위치까지 중 적어도 하나가 뉴클레오티드 유도체 (1)∼(4)인 것을 다른 형태로 하고 있다.

상기 제5 발명의 DNA 마이크로어레이는 또한, 표적 뉴클레오티드 서열 중에 n(n=3∼100)개의 뉴클레오티드로 이루어지는 기지(旣知) 서열 영역과 상동인 영역이 존재하는지 여부를 검출하는 DNA 마이크로어레이로서, 캡쳐 프로브 세트는 표적 뉴클레오티드 서열 중의 기지 서열 영역과 상보적이지만, 개개의 캡쳐 프로브는 제1 위치에서 제n 위치까지 중 적어도 하나가 뉴클레오티드 유도체 (1)∼(4)인 것을 또 다른 형태로 하고 있다.

상기 제5 발명의 DNA 마이크로어레이는 또한, 추가로 n(n=3∼100)개의 뉴클레오티드로 이루어지는 미지(未知) 서열 영역과 기지 서열 영역을 보유하는 표적 뉴클레오티드 서열의 미지 서열 영역의 서열을 결정하는 DNA 마이크로어레이로서, 캡쳐 프로브 세트는 표적 뉴클레오티드 서열 중 기지 서열 영역에 대한 상보 서열과, 뉴클레오티드 서열이 모두 다른 프로브 서열 영역을 보유하는 적어도 4ⁿ개의 세트이며, 각 프로브 서열 영역의 제1 위치에서 제n 위치까지 중 적어도 하나가 뉴클레오티드 유도체 (1)∼(4)인 것을 더욱 다른 형태로 하고 있다.

본원의 각 발명에 있어서의 구체적 구성, 용어 및 개념은 발명의 실시 형태의 설명 및 실시예에서 상세히 규정한다. 또한, 본 발명을 실시하기 위해 사용하는 다양한 기술은 특히, 그 출처를 명시한 기술을 제외하고는 공지된 문헌 등에 기초하여 당업자이면 용이하면서 확실하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 유전 공학 및 분자생물학적 기술은 문헌[참조: Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Mo1ecular Biology, John Wi1ey & Sons, New York, N. Y, 1995] 등에 기재되어 있다.

발명의 효과

상기한 제1 발명에 의하면, 하이브리드화한 상대 쇄가 서로 대응하는 염기종에 따라 형광 시그널 강도가 변화하는 새로운 뉴클레오티드 유도체가 제공된다. 표적 뉴클레오티드 서열의 표지화 조작을 필요로 하지 않으며, 게다가 융해 온도 측정 등의 간접적인 지표에 의지하지 않고, 캡쳐 프로브가 발생시키는 형광 강도를 직접 측정함으로써 표적 뉴클레오티드 서열의 소정 염기종을 판정하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명의 뉴클레오티드 유도체는 염기종의 주변 환경(특정한 염기 서열 등)에 따른 형광 시그널을 지표로 하는 것이 아니라, 대응하여 결합하는 염기의 종류에 따라서만 형광 시그널이 변화하기 때문에, 표적 서열이 어떠한 서열이라도 적응할 수 있다.

상기한 제2 발명에 의하면, 상기 제1 발명의 뉴클레오티드 유도체의 전구체 인 뉴클레오시드 유도체가 제공된다. 이 뉴클레오시드 유도체를 이용함으로써 상기 제1 발명의 뉴클레오티드 유도체를 용이하게 작성할 수 있다.

상기한 제3 발명에 의하면, 상기 제1 발명의 뉴클레오티드 유도체를 보유하는 단일쇄 뉴클레오티드 서열이 제공되고, 이 뉴클레오티드 서열을 프로브로 함으로써 표적 뉴클레오티드 서열 중 미지 염기의 염기종을 결정하는 것 등이 가능해진다.

상기한 제4 발명에 의하면, 상기 제3 발명의 단일쇄 뉴클레오티드 서열을 프로브로서 사용함으로써, 표적 뉴클레오티드 서열 중 미지 염기의 염기종을 결정하는 방법이 제공된다. 이 방법은 프로브의 형광 강도를 지표로 하여 간편하면서 확실하게 미지 염기종을 결정하는 것을 가능하게 한다.

상기한 제5 발명에 의하면, 상기 제3 발명의 단일쇄 뉴클레오티드 서열을 캡쳐 프로브로 하는 DNA 마이크로어레이가 제공된다. 이것에 의해, 표적 뉴클레오티드 서열의 1염기다형(SNP), 서열 미지의 뉴클레오티드 서열의 서열 결정, 표적 뉴클레오티드 서열 중 기지 서열 영역과 상동인 영역의 존재 등을 캡쳐 프로브의 형광 강도를 지표로 하여 간편하면서 확실하게 행하는 것이 가능해진다.

이하, 본 발명의 뉴클레오티드 유도체에 대해서 실시예를 제공하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

뉴클레오티드 유도체 (PyU(5), PyC(5), PyA(7))의 합성

뉴클레오티드 유도체 (PyU(5), PyC(5), PyA(7))를 도 6 및 7에 따라 다음과 같이 합성하였다. 또한, 화합물의 번호는 도 6 및 7의 번호에 대응한다.

스킴(scheme)ⅰ(화합물 2 합성)

프로파르길 아민(1, 和光純藥社)과 1-피렌카르복실산(2, 알드리치사)(1:1)을 축합제 PyBOP(1 당량, NOVA Biochem) 존재하에, N,N-디메틸포름아미드 중에서 실온으로 2.5시간 교반하여 추출, 컬럼크로마토그래피로 정제 후, 생성물 2(91%)를 얻었다.

스킴 ⅱ(화합물 4: PyU(5)의 뉴클레오시드 유도체의 합성)

3(5-요오드-2'-디옥시우리딘(시그마)을 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(東京化成社)와 피리딘 중에서 교반함으로써 얻어짐)와 화합물 2(1:1)를(테트라키스트리페닐포스핀)팔라듐(0.15 당량, 和光純藥社), 요오드화구리(0.3 당량, 和光純藥社), 트리에틸아민(1 당량, 和光純藥社) 존재하에, N,N-디메틸포름아미드 중에서 실온으로 10시간 교반하여 추출, 컬럼크로마토그래피로 정제 후, 생성물 4(82%)를 얻었다.

스킴 ⅲ(화합물 5의 합성)

화합물 4를 3% 트리클로로초산-디클로로메탄 용액(그레인리서치사) 중에서 실온으로 5분 교반하여 추출, 컬럼크로마토그래피로 정제 후, 생성물 5(27%)를 얻었다.

스킴 ⅳ(화합물 6: PyU(5)의 합성)

화합물 4와 2-시아노에틸테트라이소프로필포스포로디아미데이트(알드리치사)(1:1)를테트라졸(1 당량, 同仁化學社) 존재하에, 아세토니트릴 중에서 실온으로 2시간 교반하고, 그대로 DNA 합성기에 이용하였다.

스킴 ⅴ(화합물 8의 합성)

5-요오드-2-디옥시시티딘(7, 生化學工業)을 N,N-디메틸포름아미드디에틸아세탈(1 당량, 東京化成社) 존재하에, N,N-디메틸포름아미드 중에서 55℃로 2시간 교반하여 농축하였다. 조생성물 8은 다음 반응에 제공하였다.

스킴 ⅵ(화합물 9의 합성)

화합물 8과 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(東京化成社)(1:1)를 피리딘 중에서 실온으로 1시간 교반하여 추출, 컬럼크로마토그래피로 정제 후, 생성물 9(2 단계에서 50%)를 얻었다.

스킴 ⅶ(화합물 10: PyC(5)의 뉴클레오시드 유도체의 합성)

화합물 9와 화합물 2(1:1)를(테트라키스트리페닐포스핀)팔라듐(0.15 당량, 和光純藥社), 요오드화구리(0.3 당량, 和光純藥社), 트리에틸아민(1 당량, 和光純藥社) 존재하에, N,N-디메틸포름아미드 중에서 실온으로 12시간 교반하여 추출, 컬럼크로마토그래피로 정제 후, 생성물 10(47%)을 얻었다.

스킴 ⅷ(화합물 11: PyC(5)의 합성)

화합물 4와 2-시아노에틸테트라이소프로필포스포로디아미데이트(알드리치사)(1:1)를 테트라졸(1 당량, 同仁化學社) 존재하에, 아세토니트릴 중에서 실온으로 2시간 교반하여 그대로 DNA 합성기에 이용하였다.

스킴 ⅸ(화합물 13의 합성)

화합물 12[참조: Ramzaeva 및 Seela, Helv. Chim. Acta78, 1083-1090(1995)]와 화합물 2(1:2)를 (테트라키스트리페닐포스핀)팔라듐(0.1 당량, 和光純藥社), 요오드화구리(0.1 당량, 和光純藥社), 트리에틸아민(2 당량, 和光純藥社) 존재하에, N,N-디메틸포름아미드 중에서 실온으로 6시간 교반하여 추출, 컬럼크로마토그래피로 정제 후, 생성물 13(88%)을 얻었다.

스킴 ⅹ(화합물 14의 합성)

화합물 13을 N,N-디메틸포름아미드디에틸아세탈(1 당량, 東京化成社) 존재하에, N,N-디메틸포름아미드 중에서 50℃로 3시간 교반하여 농축하였다. 조생성물은 다음 반응에 제공하였다.

스킴 xi(화합물 15: PyA(7)의 뉴클레오시드 유도체의 합성)

화합물 14와 4,4-디메톡시트리틸클로라이드(東京化成社)(1:1)를 N,N-디메틸아미노피리딘 촉매량 존재하 피리딘 중에서 실온으로 1시간 교반하여 추출, 컬럼크로마토그래피로 정제 후, 생성물 15(2 단계에서 73%)를 얻었다.

스킴 xii(화합물 16: PyA(7)의 합성)

실시예 2

뉴클레오티드 유도체 (PyG(8))의 합성

뉴클레오티드 유도체 (PyG(8))를 도 8에 따라 이하와 같이 합성하였다. 또한, 화합물의 번호는 도 8의 번호에 대응한다.

스킴 1(화합물 2의 합성)

출발 재료로서 1-브로모피렌을 이용하여, 트리메틸실릴아세틸렌과 소노가시라형(sonogashira-type) 커플링함으로써 화합물 1을 얻었다. 계속해서, 메탄올 중에서 나트륨메톡사이드에 의해 보호기인 트리메틸실릴기를 제거하여 화합물 2(피렌 유닛)를 얻었다(수율 70%).

스킴 2(화합물 6: PyG(8)의 뉴클레오시드 유도체의 합성)

2'-데옥시구아노신에 N-브로모숙신이미드를 첨가하여, 물중에서 반응시킴으로써 화합물 3을 얻었다(수율 60%). 계속해서, 화합물 3의 당 3' 위치와 5' 위치의 수산기를 tert-부틸디메틸실릴클로라이드와 이미다졸로 tert-부틸디메틸실릴기에 의해 보호한 후, 화합물 2와 소노가시라형 커플링을 행하여 화합물 5를 얻었다(수율 61%). TBAF에 의해 화합물 5의 수산기 보호기인 tert-부틸디메틸실릴기를 제거한 단량체로서의 화합물 6을 얻었다(수율 60%).

스킴 3(화합물 10: PyG(8)의 합성)

화합물 3을 DMF 중에서 DMF 디에틸아세탈과 반응시켜 화합물 7을 얻었다. 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드에 의해 화합물 7의 5' 위치 수산기에 4,4'-디메톡시트리틸기를 도입하여 화합물 8을 얻었다(수율 22%). 소노가시라형 커플링에 의해 이 화합물 8의 8위치에 화합물 2를 도입하여 화합물 9를 얻었다(수율 58%). 마지막으로 아세토니트릴과 디클로로메탄 중에서 N,N,N',N'-테트라이소프로필시아노에틸포스포로디아미데이트와 테트라졸을 산성 활성화제로서 반응시켜 아미데이트 유닛인 화합물 10을 합성하였다. 이것을 0.1 M 아세토니트릴 용액으로서 DNA 합성기에 제공하였다.

실시예 3

올리고데옥시리보뉴클레오티드의 합성

실시예 1에서 제조한 뉴클레오티드 유도체 (PyU(5), PyC(5), PyA(7)) 및 실시예 2에서 제조한 뉴클레오티드 유도체 (PyG(8))를 이용하여, 뉴클레오티드 유도체가 함유된 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 합성하였다. 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 어플라이드바이오시스템즈사의 392DNA/RNA 합성기로 통상의 포스포로아미데이트법에 따라 합성하였다. 고상담체로부터의 추출 및 탈보호는 25% 암모니아 중에서 몇 번, 몇 시간 항온처리하여 수행하고, 그 후 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

실시예 4

PyC(5) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드(1)의 형광 분석

실시예 3에 의해 얻어진 PyC(5) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드(5'-CGCAACPyCCAAGCG-3': 서열 번호 1)를 2.5 μM이 되도록 0.1 M 염화나트륨을 함유하는 50 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 용해시킨 용액을 제조하였다. 이 용액의 형광 스펙트럼을 형광 분광 광도계를 이용하여 약 25℃로 측정한 바, 여기 파장 329 nm, 발광 파장 400 nm이며, 400 nm에서의 형광 강도는 7.0이었다.

상기 용액에 PyC(5) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드와 PyC(5) 이외의 부분이 상보적인, 별도 합성한 올리고데옥시리보뉴클레오티드:

(A'); 5'-GCGTTGAGTTGCG-3'(서열 번호 2),

(T'); 5'-GCGTTGTGTTGCG-3'(서열 번호 3),

(G'); 5'-GCGTTGGGTTGCG-3'(서열 번호 4),

(C'); 5'-GCGTTGCGTTGCG-3'(서열 번호 5)

를 각각 2.5 μM이 되도록 첨가하여, 볼텍스 믹서로 혼합하였다.

이들 용액의 형광 스펙트럼을 형광 분광 광도계를 이용하여 측정한 바, 올리고데옥시리보뉴클레오티드(A')를 첨가한 경우에는 400 nm에서의 형광 강도가 4.1이었다. 올리고데옥시리보뉴클레오티드(T')를 첨가한 경우에는 400 nm에서의 형광 강도는 2.6이며, 올리고데옥시리보뉴클레오티드(G')를 첨가한 경우에는 400 nm에서의 형광 강도는 18.3이며, 올리고데옥시리보뉴클레오티드(C')를 첨가한 경우에는 400 nm에서의 형광 강도는 1.4였다.

이와 같이, PyC(5) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 상보 쇄상의 PyC(5)와 대응하여 결합하는 뉴클레오티드가 데옥시구아닐산인 경우에는 강한 발광이 관측된 것에 비하여 데옥시아데닐산인 경우에는 형광이 78% 소광하고, 데옥시티미딜산인 경우에는 형광이 86% 소광하며, 데옥시시티딜산인 경우에는 형광이 92% 소광하였다. 형광 스펙트럼을 도 9에 도시한다.

실시예 5

PyC(5) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드(2)의 형광 분석

실시예 3에 의해 얻어진 PyC(5) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드(5'-CGCAATPyCTAAGCG-3': 서열 번호 6)를 2.5 μM이 되도록 0.1 M 염화나트륨을 함유하는 50 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 용해시킨 용액을 제조하였다. 이 용액의 형광 스펙트럼을 형광 분광 광도계를 이용하여 약 25℃로 측정한 바, 여기 파장 327 nm, 발광 파장 405 nm이며, 405 nm에서의 형광 강도는 9.2였다.

상기 용액에 PyC(5) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드와 PyC(5) 이외의 부분이 상보적인 별도 합성된 올리고데옥시리보뉴클레오티드:

(A'); 5'-GCGTTAAATTGCG-3'(서열 번호 7),

(T'); 5'-GCGTTATATTGCG-3'(서열 번호 8),

(G'); 5'-GCGTTAGATTGCG-3'(서열 번호 9),

(C'); 5'-GCGTTACATTGCG-3'(서열 번호 10)

이들 용액의 형광 스펙트럼을 형광 분광 광도계를 이용하여 측정한 바, 올리고데옥시리보뉴클레오티드(A')를 첨가한 경우에는 405 nm에서의 형광 강도는 10.9였다. 올리고데옥시리보뉴클레오티드(T')를 첨가한 경우에는 400 nm에서의 형광 강도는 8.8이며, 올리고데옥시리보뉴클레오티드(G')를 첨가한 경우에는 400 nm에서의 형광 강도는 18.2이며, 올리고데옥시리보뉴클레오티드(C')를 첨가한 경우에는 400 nm에서의 형광 강도는 11.9였다.

이와 같이, PyC(5) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 상보 쇄상의 PyC(5)와 대응하여 결합하는 뉴클레오티드가 데옥시구아닐산인 경우에는 강한 발광이 관측된 것에 비하여, 데옥시아데닐산인 경우에는 형광이 40% 소광하고, 데옥시티미딜산인 경우에는 형광이 52% 소광하며 데옥시시티딜산인 경우에는 형광이 35% 소광하였다. 형광 스펙트럼을 도 10에 도시한다.

또한, 이 실시예 5와 상기 실시예 4의 결과를 비교하면, 뉴클레오티드 유도체 PyC(5)가 그 대응하여 결합하는 염기종 전후의 염기종에 관계없이 특정 염기종 (G)에 대하여 강한 형광 시그널을 발생시키는 것이 확인되었다.

실시예 6

PyU(5) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드(1)의 형광 분석

실시예 3에 의해 얻어진 PyU(5) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드(5'-30 CGCAACPyUCAAGCG-3': 서열 번호 11)를 2.5 μM이 되도록 0.1 M 염화나트륨을 함유하는 50 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 용해시킨 용액을 제조하였다. 이 용액의 형광 스펙트럼을 형광 분광 광도계를 이용하여 약 25℃로 측정한 바, 여기 파장 344 nm, 발광 파장 398 nm이며, 398 nm에서의 형광 강도는 7.4였다.

상기 용액에 PyU(5) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드와 PyU(5) 이외의 부분이 상보적인 별도 합성한 올리고데옥시리보뉴클레오티드:

(A'): 5'-GCGTTGAGTTGCG-3'(서열 번호 2),

(T'); 5'-GCGTTGTGTTGCG-3'(서열 번호 3),

(G'); 5'-GCGTTGGGTTGCG-3'(서열 번호 4),

(C'); 5'-GCGTTGCGTTGCG-3'(서열 번호 5),

을 각각 2.5 μM이 되도록 첨가하여 볼텍스 믹서로 혼합하였다.

이들 용액의 형광 스펙트럼을 형광 분광 광도계를 이용하여 측정한 바, 올리고데옥시리보뉴클레오티드(A')를 첨가한 경우에는 398 nm에서의 형광 강도는 29.8이었다. 올리고데옥시리보뉴클레오티드(T')를 첨가한 경우에는 398 nm에서의 형광강도는 4.5이며, 올리고데옥시리보뉴클레오티드(G')를 첨가한 경우에는 398 nm에서의 형광 강도는 3.7이며, 올리고데옥시리보뉴클레오티드(C')를 첨가한 경우에는 398 nm에서의 형광 강도는 3.3이었다.

이와 같이, PyU(5) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 상보 쇄상의 Pyu(5)와 대응하여 결합하는 뉴클레오티드가 데옥시아데닐산인 경우에는 강한 발광이 관측된 것에 비해서, 데옥시티미딜산인 경우에는 형광이 85% 소광하고, 데옥시구아닐산인 경우에는 형광이 88% 소광하며, 데옥시시티딜산인 경우에는 형광이 89% 소광하였다. 형광 스펙트럼을 도 11에 도시한다. 또한, 형광 사진을 도 12에 도시한다.

실시예 7

PyU(5) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드(2)의 형광 분석

실시예 3에 의해 얻어진 PyU(5) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드(5'-CGCAATPyUTAAGCG-3': 서열 번호 12)를 2.5 μM이 되도록 0.1 M 염화나트륨을 함유하는 50 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 용해시킨 용액을 제조하였다. 이 용액의 형광 스펙트럼을 형광 분광 광도계를 이용하여 약 25℃에서 측정한 바, 여기 파장 327 nm, 발광 파장 398 nm이며 398 nm에서의 형광 강도는 6.3이었다.

(A'); 5'-GCGTTAAATTGCG-3'(서열 번호 7),

(T'); 5'-GCGTTATATTGCG-3'(서열 번호 8),

(G'); 5'-GCGTTAGATTGCG-3'(서열 번호 9),

(C'); 5'-GCGTTACATTGCG-3'(서열 번호 10)

를 각각 2.5 μM이 되도록 첨가하여 볼텍스 믹서로 혼합하였다.

이들 용액의 형광 스펙트럼을 형광 분광 광도계를 이용하여 측정한 바, 올리고데옥시리보뉴클레오티드(A')를 첨가한 경우에는 398 nm에서의 형광 강도는 26.0이었다. 올리고데옥시리보뉴클레오티드(T')를 첨가한 경우에는 398 nm에서의 형광강도는 2.7이며, 올리고데옥시리보뉴클레오티드(G')를 첨가한 경우에는 398 nm에서의 형광 강도는 4.8이며, 올리고데옥시리보뉴클레오티드(C')를 첨가한 경우에는 398 nm에서의 형광 강도는 10.6이었다.

이와 같이, PyU(5) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 상보 쇄상의 PyU(5)와 대응하여 결합하는 뉴클레오티드가 데옥시아데닐산인 경우에는 강한 발광이 관측된 것에 비해서, 데옥시티미딜산인 경우에는 형광이 90% 소광하고, 데옥시구아닐산인 경우에는 형광이 82% 소광하며, 데옥시시티딜산인 경우에는 형광이 59% 소광하였다. 형광 스펙트럼을 도 13에 도시한다.

또한, 이 실시예 7과 상기 실시예 6의 결과를 비교하면, 뉴클레오티드 유도체 PyU(5)가 그 서로 대응하는 염기종 전후의 염기종에 관계없이 특정 염기종 (A)에 대하여 강한 형광 시그널을 발생시키는 것이 확인되었다.

실시예 8

PyA(7) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 형광 분석

실시예 3에 의해 얻어진 PyA(7) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드(5'-CGCAACPyACAAGCG-3': 서열 번호 13)를 2.5 μM이 되도록, 0.1 M 염화나트륨을 함유하는 50 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 용해시킨 용액을 제조하였다. 이 용액의 형광 스팩트럼을 형광 분광 광도계를 이용하여 약 25℃로 측정한 바, 여기 파장 353 nm, 발광 파장 395 nm이며, 395 nm에서의 형광 강도는 4.3이었다.

상기 용액에 PyA(7) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드와 PyA(7) 이외의 부분이 상보적인 별도 합성한 올리고데옥시리보뉴클레오티드:

(A'); 5'-GCGTTGAGTTGCG-3'(서열 번호 2),

(T'); 5'-GCGTTGTGTTGCG-3'(서열 번호 3),

(G'); 5'-GCGTTGGGTTGCG-3'(서열 번호 4),

(C'); 5'-GCGTTGCGTTGCG-3'(서열 번호 5),

이들 용액의 형광 스펙트럼을 형광 분광 광도계를 이용하여 측정한 바, 올리고데옥시리보뉴클레오티드(A')를 첨가한 경우에는 395 nm에서의 형광 강도는 2.5였다. 올리고데옥시리보뉴클레오티드(T')를 첨가한 경우에는 395 nm에서의 형광 강도는 1.8이며, 올리고데옥시리보뉴클레오티드(G')를 첨가한 경우에는 395 nm에서의 형광 강도는 7.4이며, 올리고데옥시리보뉴클레오티드(C')를 첨가한 경우에는 395 nm에서의 형광 강도는 18.2였다.

이와 같이, PyA(7) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 상보 쇄상의 PyA(7)와 대응하여 결합하는 뉴클레오티드가 데옥시시티딜산인 경우에는 강한 발광이 관측된 것에 비해서, 데옥시티미딜산인 경우에는 형광이 90% 소광하고, 데옥시아데닐산인 경우에는 형광이 86% 소광하며, 데옥시구아닐산인 경우에는 형광이 59% 소광하였다. 형광 스펙트럼을 도 14에 도시한다.

실시예 9

PyG(8) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 형광 분석

실시예 3에 의해 얻어진 PyG(8) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드(5'-CGCAATPyGTAAGCG-3': 서열 번호 14)를 2.5 μM이 되도록 0.1 M 염화나트륨을 함유하는 50 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 용해시킨 용액을 제조하였다. 이 용액의 형광 스팩트럼을 형광 분광 광도계를 이용하여 약 25℃로 측정한 바, 여기 파장 420 nm, 발광 파장 430 nm 및 460 nm이며, 430 nm에서의 형광 강도는 16.0이고, 460 nm에서의 형광 강도는 15.3이었다.

상기 용액에 PyG(8) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드와 PyG(8) 이외의 부분이 상보적인 별도 합성한 올리고데옥시리보뉴클레오티드:

(A'); 5'-GCGTTAAATTGCG-3'(서열 번호 7),

(T'); 5'-GCGTTATATTGCG-3'(서열 번호 8),

(G'); 5'-GCGTTAGATTGCG-3'(서열 번호 9),

(C'); 5'-GCGTTACATTGCG-3'(서열 번호 10),

이들 용액의 형광 스펙트럼을 형광 분광 광도계를 이용하여 측정한 바, 올리고데옥시리보뉴클레오티드(A')를 첨가한 경우에는 430 nm에서의 형광 강도는 65.0이었다. 올리고데옥시리보뉴클레오티드(T')를 첨가한 경우에는 430 nm에서의 형광강도는 144.0이며, 올리고데옥시리보뉴클레오티드(G')를 첨가한 경우에는 430 nm에서의 형광 강도는 65.0이며, 올리고데옥시리보뉴클레오티드(C')를 첨가한 경우에는 430 nm에서의 형광 강도는 136.0이었다.

이와 같이, PyG(8) 함유 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 상보 쇄상의 PyG(8)와 대응하여 결합하는 뉴클레오티드가 데옥시티미딜산 및 데옥시시티딜산인 경우에는 강한 발광이 관측된 것에 비해서, 데옥시구아닐산 및 데옥시아데닐산인 경우에는 형광이 각각 55% 소광하였다. 상대적인 형광 스펙트럼을 도 15에 도시한다.

실시예 10

서열 번호 15의 올리고데옥시리보뉴클레오티드(샘플 DNA 단편)의 제8-11 위치의 미지 서열을 DNA 마이크로어레이를 이용하여 결정하였다. DNA 마이크로어레이의 캡쳐 프로브로서는 서열 번호 16-31의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편(프로브 DNA 단편)을 사용하였다(표 1 참조). 또한, 샘플 DNA 단편은 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전체 길이 50b, 프로브 DNA 단편 1-16은 각각 서열 번호 16-31의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전체 길이 68-70b이다.

1. 프로브 DNA 단편의 제조

서열 번호 16-31의 뉴클레오티드 서열을 각각 포함하는 프로브 DNA 단편 1-16을 어플라이드바이오시스템사의 392DNA/RNA 합성 장치를 이용하여, 통상의 포스포로아미데이트법에 따라 합성하였다. 고상 담체로부터의 추출 및 탈보호는 25% 암모니아 중에서 항온처리하여 수행하고, 그 후, 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

또한, 서열 번호 16-31 각각의 제8 위치(T, G, C, A)는 각각 뉴클레오티드 유도체 (PyU(5), PyC(5), PyA(7), PyG(8))이다. 마찬가지로, 서열 번호 20-23의 제9 위치, 서열 번호 24-27의 제10 위치, 서열 번호 28-31의 제11 위치의 T, G, C, A는 각각 PyU(5), PyC(5), PyA(7), PyG(8)이다(표 1 참조).

2. 고정용 기판의 제조

10% NaOH-60% 에탄올 수용액에 2시간 침지하고, 순수한 물로 10회 세정한 76×26×1 mm 사이즈의 유리 슬라이드(松波硝子工業社 제조)를 10% 폴리-L-리딘 수용액에 1시간 침지하였다. 순수한 물로 10회 세정 후, 800 rpm으로, 5분간 원심분리하고, 수분을 제거하여 실온에서 건조하여 고정용 기판을 제조하였다.

3. DNA 마이크로어레이의 제조

상기 1에서 제조한 프로브 DNA 단편의 각각을 최종 농도가 50 pmol/㎕가 되도록 조정하고 상기 2에서 제조한 기판에 200 pl를 각각 스폿(10 nmol)하였다. 그 후, 80℃에서 1시간 건조 처리하고 각 스폿에 물을 첨가하여 기판 상에 DNA 단편을 고정하였다. 이 기판을 1% BSA 블로킹 용액(50 mg/㎖) 5 ㎖, 10% SDS 1.25 ㎖로 45분간(42 ℃) 진탕하였다. 그 후, 95℃의 순수한 물로 1분간, 95% 에탄올로 1분간 각각 침지시키고, 원심분리(800 rpm, 1분간)하여 목적으로 하는 DNA 마이크로어레이를 제조하였다.

4. 샘플 DNA 단편의 제조

서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전체 길이 50b의 올리고데옥시리보뉴클레오티드로 이루어지는 샘플 DNA 단편(15 fmol/10.5 ㎕)을 포함하는 샘플 튜브에 20×SSC(3.75 ㎕) 및 10% SDS(0.75 ㎕)를 첨가하였다. 95℃ 히트 블록으로 2분간 가열한 후, 실온에서 5분간 방치하고, 원심분리하여 샘플액을 제조하였다(최종 농도: 1 nM).

5. 하이브리드화

상기 3에서 제조한 DNA 마이크로어레이 상에 상기 2에서 제조한 샘플액을 12 ㎕씩 한 방울 스폿하고, 커버 유리로 덮어 하이브리드화 반응을 수행하였다(65℃, 16시간). 반응 종료 후, 2×SSC-0.1% SDS 용액에 5분간, 20분간 침지하고, 0.2×SSC-0.1% SDS 용액에 20분간 침지, 55℃에서 추가로 20분간씩 2회 침지시켰다. 같은 용액으로 세정한 후, 추가로 0.05×SSC 용액으로 세정하였다. 900 rpm에서 1분간 원심분리하고, 방치하여 건조시켰다.

6. 측정

형광 현미경 BX-50(올림푸스사 제조)을 사용하여, 각 DNA 스폿의 형광 강도를 계측하여 화상 파일을 입력한 후, 시그널을 수치화하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.

DNA 단편	서열번호	염기서열	형광강도
샘플	15	3'-TCAGTAANNNNCGCCTAATG-5'	형광강도
프로브 1프로브 2프로브 3프로브 4	16171819	5'-AGTCATTTTGCCGCCTAATG-3'5'-AGTCATTGTGCCGCCTAATG-3'5'-AGTCATTCTGCCGCCTAATG-3'5'-AGTCATTATGCCGCCTAATG-3'	21012000180240
프로브 5프로브 6프로브 7프로브 8	20212223	5'-AGTCATTATGCCGCCTAATG-3'5'-AGTCATTAGGCCGCCTAATG-3'5'-AGTCATTACGCCGCCTAATG-3'5'-AGTCATTAAGCCGCCTAATG-3'	30000250300260
프로브 9프로브 10프로브 11프로브 12	24252627	5'-AGTCATTATTCCGCCTAATG-3'5'-AGTCATTATGCCGCCTAATG-3'5'-AGTCATTATCCCGCCTAATG-3'5'-AGTCATTATACCGCCTAATG-3'	2001800023013000
프로브 13프로브 14프로브 15프로브 16	28293031	5'-AGTCATTATGTCGCCTAATG-3'5'-AGTCATTATGGCGCCTAATG-3'5'-AGTCATTATGCCGCCTAATG-3'5'-AGTCATTATGACGCCTAATG-3'	13012020300180

표 1에 나타낸 형광 강도의 결과로부터, 샘플 DNA 단편에 있어서의 서열 번호 15 제8-11 위치의 미지 뉴클레오티드는 이하와 같은 것이 확인되었다.

(1) 프로브 DNA 단편 1-4의 제8 위치에 위치하는 각 뉴클레오티드 유도체의 형광 강도가 프로브 DNA 단편 2의 PyG(8)에서 높고, 프로브 DNA 단편 4의 PyA(7)에서는 명백히 낮기 때문에 샘플 DNA 단편의 제8 위치는 티민(T)으로 결정되었다.

(2) 프로브 DNA 단편 5-8의 제9 위치에 위치하는 각 뉴클레오티드 유도체의 형광 강도가 프로브 DNA 단편 5의 PyU(5)에서 가장 높기 때문에 샘플 DNA 단편의 제9 위치는 아데닌(A)으로 결정되었다.

(3) 프로브 DNA 단편 9-12의 제10 위치에 위치하는 각 뉴클레오티드 유도체의 형광 강도가 프로브 DNA 단편 10의 PyG(8) 및 프로브 DNA 단편 12의 PyA(7)에서 가장 높기 때문에 샘플 DNA 단편의 제10 위치는 시토신(C)으로 결정되었다.

(4) 프로브 DNA 단편 13-16의 제11 위치에 위치하는 각 뉴클레오티드 유도체의 형광 강도가 프로브 DNA 단편 15의 PyC(5)에서 가장 높기 때문에 샘플 DNA 단편의 제11 위치는 구아닌(G)으로 결정되었다.

또한 이 결과로부터, 본 발명의 뉴클레오티드 유도체가 대응하여 결합하는 염기종 전후의 염기종에 관계없이, 특정 염기종에 대하여 강한 형광 시그널을 발생시키는 것이 확인되었다.

이상 자세히 설명한 바와 같이, 본원의 발명은 DNA 프로브 및 DNA 마이크로어레이를 이용한 SNP 판정 및 서열 결정 등에 있어서의 시료 제조 및 측정 순서를 대폭 간편화하는 것을 가능하게 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Isao Saito and NGK Insulators, Ltd. <120> Nucleotide Derivatives and DNA Microarray <130> <160> 31 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> citosine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 1 cgcaacccaa gcg 13 <210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 gcgttgagtt gcg 13 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 gcgttgtgtt gcg 13 <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 gcgttgggtt gcg 13 <210> 5 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 gcgttgcgtt gcg 13 <210> 6 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> citosine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 6 cgcaatctaa gcg 13 <210> 7 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 7 gcgttaaatt gcg 13 <210> 8 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 8 gcgttatatt gcg 13 <210> 9 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 9 gcgttagatt gcg 13 <210> 10 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 gcgttacatt gcg 13 <210> 11 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> thymine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 11 cgcaactcaa gcg 13 <210> 12 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> thymine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 12 cgcaatttaa gcg 13 <210> 13 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> adenine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 13 cgcaacacaa gcg 13 <210> 14 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> guanine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 14 cgcaatgtaa gcg 13 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10)..(13) <223> n: a, t, g or c <400> 15 gtaatccgcn nnnaatgact 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> thymine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 16 agtcattttg ccgcctaatg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> guanine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 17 agtcattgtg ccgcctaatg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> cytosine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 18 agtcattctg ccgcctaatg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> adenine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 19 agtcattatg ccgcctaatg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> thymine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 20 agtcattatg ccgcctaatg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> guanine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 21 agtcattagg ccgcctaatg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> cytosine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 22 agtcattacg ccgcctaatg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> adenine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 23 agtcattaag ccgcctaatg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> thymine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 24 agtcattatt ccgcctaatg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> guanine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 25 agtcattatg ccgcctaatg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> cytosine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 26 agtcattatc ccgcctaatg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> adenine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 27 agtcattata ccgcctaatg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> thymine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 28 agtcattatg tcgcctaatg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> guanine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 29 agtcattatg gcgcctaatg 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> cytosine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 30 agtcattatg ccgcctaatg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> adenine derivative modified with 1-pyrenyl <400> 31 agtcattatg acgcctaatg 20

Claims

피리미딘 염기 또는 퓨린 염기에 링커를 통해 형광 색소 층간삽입체(intercalator)가 결합되어 있는 뉴클레오티드 유도체로서, 단일쇄 뉴클레오티드 서열의 멤버로서 존재하고, 이 단일쇄 뉴클레오티드 서열이 하이브리드화한 상대 쇄의 서로 대응하는 염기가

(1) 아데닌인 경우에 형광 색소가 가장 강하게 발광하는 티민/우라실 유도체;

(2) 구아닌인 경우에 형광 색소가 가장 강하게 발광하는 시토신 유도체;

(3) 시토신인 경우에 형광 색소가 가장 강하게 발광하는 아데닌 유도체; 또는

(4) 시토신 또는 티민/우라실인 경우에 형광 색소가 가장 강하게 발광하는 구아닌 유도체.
제1항에 있어서, 티민/우라실 유도체가 하기 화학식 1로 나타내는 것인 뉴클레오티드 유도체:

화학식 1

상기 식에서, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉는 동일하거나 또는 상이하게 수소 원자 또는 치환기를 나타내고, R₁₀은 수소 원자 또는 수산기이며, X는 이미노(NH), 옥시(O), 티오(S), 메틸렌(CH₂) 및 알킬아미노기로부터 선택되는 연결기이며, 알킬렌 쇄 길이를 나타내는 정수 n은 X가 메틸렌 또는 알킬아미노기인 경우에는 0∼5이며, X가 이미노, 옥시 또는 티오인 경우에는 1∼5이다.
제1항에 있어서, 시토신 유도체가 하기 화학식 2로 나타내는 것인 뉴클레오티드 유도체:

화학식 2

상기 식에서, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉는 동일하거나 또는 상이하게 수소 원자 또는 치환기를 나타내고, R₁₀은 수소 원자 또는 수산기이며, X는 이미노(NH), 옥시(O), 티오(S), 메틸렌(CH₂) 및 알킬아미노기로부터 선택되는 연결기이며, 알킬렌 쇄 길이를 나타내는 정수 n은 X가 메틸렌 또는 알킬아미노기인 경우에는 0∼5이며, X가 이미노, 옥시 또는 티오인 경우에는 1∼5이다.
제1항에 있어서, 아데닌 유도체가 하기 화학식 3으로 나타내는 것인 뉴클레오티드 유도체:

화학식 3

상기 식에서, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉는 동일하거나 또는 상이하게 수소 원자 또는 치환기를 나타내고, R₁₀은 수소 원자 또는 수산기이며, X는 이미노(NH), 옥시(O), 티오(S), 메틸렌(CH₂) 및 알킬아미노기로부터 선택되는 연결기이며, 알킬렌 쇄 길이를 나타내는 정수 n은 X가 메틸렌 또는 알킬아미노기인 경우에는 0∼5이며, X가 이미노, 옥시 또는 티오인 경우에는 1∼5이다.
제1항에 있어서, 구아닌 유도체가 하기 화학식 4로 나타내는 것인 뉴클레오티드 유도체:

화학식 4

상기 식에서, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉는 동일하거나 또는 상이하게 수소 원자 또는 치환기를 나타내고, R₁₀은 수소 원자 또는 수산기이며, X는 이미노(NH), 옥시(O), 티오(S), 메틸렌(CH₂) 및 알킬아미노기로부터 선택되는 연결기이며, 알킬렌 쇄 길이를 나타내는 정수 n은 X가 메틸렌 또는 알킬아미노기인 경우에는 0∼5이며, X가 이미노, 옥시 또는 티오인 경우에는 1∼5이다.
티민/우라실 유도체의 전구 물질로서, 하기 화학식 5로 나타내는 뉴클레오시드 유도체:

화학식 5

상기 식에서, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉는 동일하거나 또는 상이하게 수소 원자 또는 치환기를 나타내고, R₁₀은 수소 원자 또는 수산기이며, X는 이미노(NH), 옥시(O), 티오(S), 메틸렌(CH₂) 및 알킬아미노기로부터 선택되는 연결기이며, 알킬렌 쇄 길이를 나타내는 정수 n은 X가 메틸렌 또는 알킬아미노기인 경우에는 0∼5이며, X가 이미노, 옥시 또는 티오인 경우에는 1∼5이다.
시토신 유도체의 전구 물질로서, 이하의 화학식 6으로 나타내는 뉴클레오티드 유도체:

화학식 6

상기 식에서, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉는 동일하거나 또는 상이하게 수소 원자 또는 치환기를 나타내고, R₁₀은 수소 원자 또는 수산기이며, X는 이미노(NH), 옥시(O), 티오(S), 메틸렌(CH₂) 및 알킬아미노기로부터 선택되는 연결기이며, 알킬렌 쇄 길이를 나타내는 정수 n은 X가 메틸렌 또는 알킬아미노기인 경우에는 0∼5이며, X가 이미노, 옥시 또는 티오인 경우에는 1∼5이다.
아데닌 유도체의 전구 물질로서, 하기 화학식 7로 나타내는 뉴클레오티드 유도체:

화학식 7

상기 식에서, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉는 동일하거나 또는 상이하게 수소 원자 또는 치환기를 나타내고, R₁₀은 수소 원자 또는 수산기이며, X는 이미노(NH), 옥시(O), 티오(S), 메틸렌(CH₂) 및 알킬아미노기로부터 선택되는 연결기이며, 알킬렌 쇄 길이를 나타내는 정수 n은 X가 메틸렌 또는 알킬아미노기인 경우에는 0∼5이며, X가 이미노, 옥시 또는 티오인 경우에는 1∼5이다.
구아닌 유도체의 전구 물질로서, 하기 화학식 8로 나타내는 뉴클레오티드 유도체.

화학식 8

상기 식에서, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉는 동일하거나 또는 상이하게 수소 원자 또는 치환기를 나타내고, R₁₀은 수소 원자 또는 수산기이며, X는 이미노(NH), 옥시(O), 티오(S), 메틸렌(CH₂) 및 알킬아미노기로부터 선택되는 연결기이며, 알킬렌 쇄 길이를 나타내는 정수 n은 X가 메틸렌 또는 알킬아미노기인 경우에는 0∼5이며, X가 이미노, 옥시 또는 티오인 경우에는 1∼5이다.
제1항에 기재된 뉴클레오티드 유도체 (1)∼(4) 중 1 이상을 멤버로서 보유하는 단일쇄 뉴클레오티드 서열.
제10항에 기재된 단일쇄 뉴클레오티드 서열이 하이브리드화한 상대 쇄의 1염기종 X를 결정하는 방법으로서, 단일쇄 뉴클레오티드 서열 중

(ⅰ) 티민/우라실 유도체 (1)의 형광 색소가 가장 강하게 발광한 경우의 염기종 X는 아데닌;

(ⅱ) 시토신 유도체 (2)의 형광 색소가 가장 강하게 발광한 경우의 염기종 X는 구아닌;

(ⅲ) 아데닌 유도체 (3)의 형광 색소가 가장 강하게 발광한 경우의 염기종 X는 시토신;

(ⅳ) 구아닌 유도체 (4)의 형광 색소가 가장 강하게 발광한 경우의 염기종 X는 시토신 또는 티민/우라실

로 결정하는 염기종 결정 방법.
제11항에 있어서, 아데닌 유도체 (3)와 구아닌 유도체 (4)를 동일 위치에 보유하는 2개의 단일쇄 뉴클레오티드 서열을 각각 동일한 상대 쇄에 하이브리드화시키고,

(ⅴ) 아데닌 유도체 (3)와 구아닌 유도체 (4) 양방의 형광 색소가 가장 강하게 발광한 경우의 상대 쇄의 염기종 X는 시토신;

(ⅵ) 구아닌 유도체 (4)의 형광 색소만이 가장 강하게 발광한 경우의 상대 쇄의 염기종 X는 티민/우라실

로 결정하는 것인 염기종 결정 방법.
제6항에 기재된 단일쇄 뉴클레오티드 서열을 캡쳐 프로브(capture probe)로하는 DNA 마이크로어레이.
제13항에 있어서, 표적 뉴클레오티드 서열의 1염기다형(SNP)을 검출하는 DNA 마이크로어레이로서, 캡쳐 프로브의 세트는 표적 뉴클레오티드 서열 중 적어도 SNP 뉴클레오티드를 포함하는 영역과 상보적이지만, 개개의 캡쳐 프로브는 표적 뉴클레오티드 서열의 SNP 뉴클레오티드와 대응하는 위치의 뉴클레오티드가 각각 뉴클레오티드 유도체 (1)∼(4)인 DNA 마이크로어레이.
제13항에 있어서, 서열이 미지인 n(n=3∼100)개의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 DNA 마이크로어레이로서, 캡쳐 프로브는 뉴클레오티드 서열이 모두 다른 적어도 4ⁿ개의 세트이며, 개개의 캡쳐 프로브는 제1 위치에서 제n 위치까지 적어도 하나가 뉴클레오티드 유도체 (1)∼(4)인 DNA 마이크로어레이.
제13항에 있어서, 표적 뉴클레오티드 서열 중에 n(n=3∼100)개의 뉴클레오티드로 이루어지는 기지 서열 영역과 상동인 영역이 존재하는지 여부를 검출하는 DNA 마이크로어레이로서, 캡쳐 프로브의 세트는 표적 뉴클레오티드 서열 중 기지 서열 영역과 상보적이지만, 개개의 캡쳐 프로브는 제1 위치에서 제n 위치까지 적어도 하나가 뉴클레오티드 유도체 (1)∼(4)인 DNA 마이크로어레이.
제13항에 있어서, n(n=3∼100)개의 뉴클레오티드로 이루어지는 미지 서열 영역과 기지 서열 영역을 보유하는 표적 뉴클레오티드 서열의 미지 서열 영역의 서열을 결정하는 DNA 마이크로어레이로서, 캡쳐 프로브의 세트는 표적 뉴클레오티드 서열 중 기지 서열 영역에 대한 상보 서열과, 뉴클레오티드 서열이 모두 다른 프로브 서열 영역을 보유하는 적어도 4ⁿ개의 세트이며, 각 프로브 서열 영역의 제1 위치에서 제n 위치까지 적어도 하나가 뉴클레오티드 유도체 (1)∼(4)인 DNA 마이크로어레이.