CN100372863C - 核苷酸衍生物和dna微阵列 - Google Patents
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Abstract
对应于杂交的对方链的相应碱基种类而变化荧光信号强度的新的核苷酸衍生物，其特征在于，作为单链核苷酸序列的成员存在，与该单链核苷酸序列杂交的对方链的相应碱基为，(1)腺嘌呤时，是荧光色素发光最强的胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物；(2)鸟嘌呤时，是荧光色素发光最强的胞嘧啶衍生物；(3)胞嘧啶时，是荧光色素发光最强的腺嘌呤衍生物；或者(4)胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶时，是荧光色素发光最强的鸟嘌呤衍生物。
Description
技术领域
本申请发明涉及用于确定核苷酸序列中的特定碱基种类的核苷酸衍生物，以及具有含有该核苷酸衍生物的捕获探针的DNA微阵列。
背景技术
随着迎来后基因组时代，要求能够正确、有效、进而以低成本检测核苷酸序列中的碱基种类的新技术。例如，SNP(Single Nucleotide Polymorphism：单核苷酸多态性)是在人类基因组中以约0.1％(约1000碱基单核苷酸)的比例存在的频率最高的多态性，已越来越明确，其有无状态还会影响各种疾病(如与肺癌有关的p53基因的SNP：非专利文献1)，从而以诊断和遗传治疗法等为目的，正确判断SNP的有无的技术(SNP分型)也就变得越来越重要。
作为SNP分型方法，已知有“利用杂交效率的方法”、“利用酶识别效率的方法”、“利用电气性技术的方法”等，尤其是利用杂交效率的方法，正在被多方面研究应用于DNA微阵列(如参照专利文献1～4、非专利文献2、3)，如在非专利文献4中报道了使用DNA微阵列(微阵列)的BRCAI基因SNP的检测例。
但是，以往DNA微阵列不仅只限于检测SNP，而且通常是由荧光等标记目标核苷酸序列，用荧光信号作为指标来检测与微阵列的捕获探针杂交的目标核苷酸序列。因此，如调制目标核苷酸序列时，使用采用了标记dNTP的PCR扩增等方法，但这会需要过多的劳力、时间和费用。另外，检测SNP等时，一般采用把杂交探针和目标核苷酸序列时的熔解温度作为指标的方法，但此时，需要把杂交的严格度(stringency)条件对应每个单个目标核苷酸序列进行严格地设定，并且即使是如此设定条件，也会存在无法避免错误杂交等引起的测定误差的不良情况。
另一方面，已知有在天然的核酸碱基上连接荧光分子而得的荧光修饰核酸碱基，如在非专利文献5中提出了利用根据所杂交的对链的情况而变化荧光信号强度的荧光探针的方法。
专利文献1：美国专利第5,474,796号说明书
专利文献2：美国专利第5,605,662号说明书
专利文献3：国际公开第95/251116号小册子
专利文献4：国际公开第95/35505号小册子
非专利文献1：Biros et al.Neoplasma48(5)：407-11，2001
非专利文献2：Schena，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93：10614-10619，1996
非专利文献3：Heller，R.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：2155，1997
非专利文献4：Hacia JG et al.Nat.Genet.14：441-447，1996
非专利文献5：Nucleic Acids Res.30：e97，2002
发明内容
如上所述，为了确定SNP检测等中的碱基种类，尤其是考虑应用DNA微阵列时，需要一种不需要用荧光等标记目标核苷酸序列，并且不依赖于熔解温度测定等间接性指标的新的方法。从这种观点来看，使用荧光修饰核酸碱基的探针(如非专利文献5)，可以把探针侧的荧光信号变化作为指标而直接确定碱基种类，从这方面来说是有效的方法。其中，该非专利文献5的情况下，把与荧光修饰核酸碱基配对的碱基种类的周边环境(特定的碱基序列等)所对应的荧光信号作为指标，并非根据单碱基的种类而变化荧光信号。
本申请发明就是鉴于如上所述的问题而进行的，其课题为提供能够根据杂交的对方链的相应碱基种类而变化荧光信号强度的新的核苷酸衍生物。
另外，本申请发明的课题为提供使用所述核苷酸衍生物的碱基种类的确定方法、及以该方法为测定原理的DNA微阵列。
本申请的第一个发明是，在嘧啶碱基或嘌呤碱基上经接头(linker)连接了荧光色素嵌入剂而成的核苷酸衍生物，其特征为，作为单链核苷酸序列的成员存在，当该单链核苷酸序列的杂交对方链的相应碱基为，
(1)腺嘌呤时，是荧光色素发光最强的胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物；
(2)鸟嘌呤时，是荧光色素发光最强的胞嘧啶衍生物；
(3)胞嘧啶时，是荧光色素发光最强的腺嘌呤衍生物；或者
(4)胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶时，是荧光色素发光最强的鸟嘌呤衍生物。
该第一个发明中，“核苷酸衍生物”是，在核苷酸，即嘌呤或嘧啶与糖进行β-N-糖苷结合而得的核苷的磷酸酯(ATP、GTP、CTP、UTP；或dATP、dGTP、dCTP、dTTP)的任意位置，经亚烷基链连接荧光色素嵌入剂而成的化合物。另外，该核苷酸衍生物“作为单链核苷酸序列的成员存在”是指，在3个核苷酸或其以上的核苷酸序列中的非端部位置，核苷酸衍生物与其左右的核苷酸形成磷酸二酯键的状态。进而，“荧光色素发光最强”是指，例如用荧光分光光度计测定时，如胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物时，与对应的碱基种类为鸟嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶/尿嘧啶时相比，对应的碱基种类为腺嘌呤时可以得到更强的荧光信号强度。
另外，在以下说明中有时只用“尿嘧啶(U)”或“胸腺嘧啶(T)”来记载“胸腺嘧啶/尿嘧啶”。
该第一个发明的具体例是由以下通式(1)表示的胸腺嘧啶衍生物：
由以下通式(2)表示的胞嘧啶衍生物：
由以下通式(3)表示的腺嘌呤衍生物：
以及，由以下通式(4)表示的鸟嘌呤衍生物：
并且，本申请的第二个发明是所述各核苷酸衍生物的前体物质的具体例，分别为如下的核苷衍生物。
是胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物的前体物质，且由以下通式(5)表示的核苷衍生物。
是胞嘧啶衍生物的前体物质，且由以下通式(6)表示的核苷衍生物。
是腺嘌呤衍生物的前体物质，且由以下通式(7)表示的核苷衍生物。
是鸟嘌呤衍生物的前体物质，且由以下通式(8)表示的核苷衍生物。
上述通式(1)～(8)中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同，表示氢原子或取代基，R10是氢原子或羟基，X是从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷基氨基中选出的连接基团，整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷基氨基时，是0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时，是1～5。
本申请的第三个发明是，将所述第一个发明的核苷酸衍生物(1)～(4)中的一个或其以上作为成员而具有的单链核苷酸序列。
该第三个发明的单链核苷酸序列中，可以是任一种核苷酸衍生物存在多个，也可以是两种或其以上的核苷酸衍生物各自存在一个，或者各自存在多个。其中，如上所述，该单链核苷酸序列中，核苷酸衍生物不存在于序列的端部。
本申请的第四个发明是，确定所述第三个发明的单链核苷酸序列的杂交对方链的单碱基X的方法，是确定下述情况中的碱基种类的方法：
(i)单链核苷序列中的胸腺嘧啶衍生物(1)的荧光色素发光最强时，则确定碱基X为腺嘌呤；
(ii)单链核苷序列中的胞嘧啶衍生物(2)的荧光色素发光最强时，则确定碱基X为鸟嘌呤；
(iii)单链核苷序列中的腺嘌呤衍生物(3)的荧光色素发光最强时，则确定碱基X为胞嘧啶；
(iv)单链核苷序列中的鸟嘌呤衍生物(4)的荧光色素发光最强时，则确定碱基X为胞嘧啶或胸腺嘧啶。
该第四个发明的方法的优选方案为，把在同一位置分别具有腺嘌呤衍生物(3)和鸟嘌呤衍生物(4)的两条单链核苷酸序列分别与相同互补链杂交，进行如下确定：
(v)腺嘌呤衍生物(3)和鸟嘌呤衍生物(4)双方的荧光色素发光最强时，则确定互补链的碱基X为胞嘧啶；
(vi)只是鸟嘌呤衍生物(4)的荧光色素发光最强时，则确定互补链的碱基种类X为胸腺嘧啶。
第四个发明的所述方案中，“两条单链核苷酸序列”是指除了核苷酸衍生物(3)(4)以外由完全相同的碱基序列构成的两条单链核苷酸序列。
本申请的第五个发明是把所述第二个发明的单链核苷酸序列作为捕获探针的DNA微阵列。
所述第五个发明的DNA微阵列的一个方案如下：其是检测目标核苷酸序列的单核苷酸多态性(SNP)的DNA微阵列，捕获探针的组与目标核苷酸序列的至少含有SNP核苷酸的区段互补，各个捕获探针是，其对应于目标核苷酸序列的SNP核苷酸的部位的核苷酸各自为核苷酸衍生物(1)～(4)。
所述第五个发明的DNA微阵列的另一个方案如下：其是确定序列未知的n(n＝3～100)个核苷酸序列的DNA微阵列，捕获探针是核苷酸序列完全不同的至少4n个探针的组，各捕获探针从第1位到第n位的至少一个为核苷酸衍生物(1)～(4)。
所述第五个发明的DNA微阵列的再一个方案如下：其是检测目标核苷酸序列中是否存在与由n(n＝3～100)个核苷酸构成的已知序列区段相同区段的DNA微阵列，捕获探针组与目标核苷酸序列中的已知序列区段互补，各个捕获探针从第1位到第n位的至少一个为核苷酸衍生物(1)～(4)。
所述第五个发明的DNA微阵列的又一个方案如下：其是确定具有由n(n＝3～100)个核苷酸构成的未知序列区段和已知序列区段的目标核苷酸序列的未知序列区段的序列的DNA微阵列，捕获探针组是具有对应于目标核苷酸序列中的已知序列区段的互补序列和核苷酸序列完全不同的探针序列区段的至少4n个探针的组，各探针序列区段从第1位到第n位的至少一个为核苷酸衍生物(1)～(4)。
本申请各发明中的具体构成、用语和概念将在发明的实施方式的说明和实施例中进行详细的规定。另外，为了实施该发明而使用的各种技术，除了特别指出其出处的技术以外，都是基于公知的文献等，只要是本行业熟练人员都可以容易且确实地实施。例如，基因工学和分子生物学技术在Sambrookand Maniatis，in Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，1989；Ausubel，F.M.et al.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，New York，N.Y，1995等中有记载。
发明效果
根据所述的第一个发明，提供对应于杂交的对方链的相应碱基种类而变化荧光信号强度的新的核苷酸衍生物。不需要目标核苷酸序列的标记操作，并且不用依赖于熔解温度测定等间接性指标，通过直接测定捕获探针发出的荧光强度就可以测定目标核苷酸序列的特定碱基种类。并且，本发明的核苷酸衍生物不是以基于于碱基的周边环境(特定的碱基序列等)的荧光信号为指标，而只是基于配对的碱基种类而变化荧光信号，因此不管目标序列为何种序列都可以应用。
根据所述的第二个发明，提供所述第一个发明的核苷酸衍生物的前体即核苷衍生物。通过使用该核苷衍生物，可以容易地制成所述第一个发明的核苷酸衍生物。
根据所述的第三个发明，提供具有所述第一个发明的核苷酸衍生物的单链核苷酸序列，通过把该核苷酸序列作为探针，可以确定目标核苷酸序列中的未知碱基的碱基。
根据所述的第四个发明，提供通过把所述第三个发明的单链核苷酸序列用作探针，确定目标核苷酸序列中的未知碱基的碱基种类的方法。该方法可以把探针的荧光强度作为指标而简便确实地确定未知碱基种类。
根据所述的第五个发明，提供把所述第三个发明的单链核苷酸序列作为捕获探针的DNA微阵列。由此，可以把捕获探针的荧光强度作为指标而简便确实地确定目标核苷酸序列的单核苷酸多态性(SNP)、序列未知的核苷酸序列的序列、目标核苷酸序列中是否存在与已知序列区段相同的区段等。
附图说明
图1表示分别使在第3位具有核苷酸衍生物的探针序列与在第3位含有未知碱基X的目标核苷酸序列杂交来确定碱基X的例子。由于具有T衍生物的探针序列发出最强的荧光信号，所以可以确定目标核苷酸序列的未知碱基X是腺嘌呤。
图2表示，分别使在第3位具有A衍生物及G衍生物的探针序列与在第3位含有未知碱基X的目标核苷酸序列杂交，来确定碱基X的例子。由于在上部是具有A衍生物及G衍生物的探针序列发出最强的荧光信号，所以可以确定目标核苷酸序列的未知碱基X是胞嘧啶。由于在下部是具有G衍生物的探针序列发出最强的荧光信号，所以可以确定目标核苷酸序列的未知碱基X是胸腺嘧啶。
图3表示，分别使在第4位具有核苷酸衍生物的探针序列与在第4位含有G/A多态性的双链核苷酸序列杂交，来确定G/A多态性的例子。在上部表示的G/G纯合时，在该位置含有C衍生物的探针发出最强的荧光信号，在中部表示的G/A杂合时，则含有C衍生物的探针和含有T衍生物的探针发出最强的荧光信号，在下部表示的A/A纯合时，从含有T衍生物的捕获探针得到强信号。
图4表示确定序列未知的6-mer寡核苷酸(NNNNNN)的碱基序列的例子。对于第1位的X，从在该位置含有T衍生物的捕获探针得到强信号，由此可以确定该寡核苷酸的第1位X是与胸腺嘧啶(T)互补结合的腺嘌呤(A)。同样地通过研究第2～6位，从而确定该6-mer寡核苷酸是由AGGCGA构成的序列。
图5表示目标核苷酸序列对于目的已知序列区段有一部分不一致时，确定其不一致碱基的例子。在第3位具有T衍生物的探针和在第6位具有C衍生物的探针各自发出强信号，从而可以知道目标核苷酸序列的第3位被A取代，第6位被G取代。
图6是本发明的核苷酸衍生物的一例(PyU(5)、PyC(5))的合成工序。Py是1-芘基、DMTr是4，4’-二甲氧基三苯甲基。
图7是本发明的核苷酸衍生物的一例(PyA(7))的合成工序。Py是1-芘基、DMTr是4，4’-二甲氧基三苯甲基。
图8是本发明的核苷酸衍生物的一例(PyG(8))的合成工序。
图9表示荧光光谱，含有核苷酸衍生物PyC(5)的寡脱氧核糖核苷酸，当互补链上与PyC(5)配对的核苷酸为脱氧鸟苷酸(G)时发出强发光信号。
图10表示另一荧光光谱，含有核苷酸衍生物PyC(5)的寡脱氧核糖核苷酸，当互补链上与PyC(5)配对的核苷酸为脱氧鸟苷酸(G)时发出强发光信号。
图11表示荧光光谱，含有核苷酸衍生物PyU(5)的寡脱氧核糖核苷酸，当互补链上与PyU(5)配对的核苷酸为脱氧鸟苷酸(A)时发出强发光信号。
图12是图11所表示结果的荧光照片图像。
图13表示荧光光谱，含有核苷酸衍生物PyU(5)的寡脱氧核糖核苷酸，当互补链上与PyU(5)配对的核苷酸为脱氧鸟苷酸(A)时发出强发光信号。
图14表示荧光光谱，含有核苷酸衍生物PyA(7)的寡脱氧核糖核苷酸，当互补链上与PyA(7)配对的核苷酸为脱氧胞苷酸(C)时发出强发光信号。
图15表示荧光光谱，含有核苷酸衍生物PyG(8)的寡脱氧核糖核苷酸，当互补链上与PyG(8)配对的核苷酸为脱氧胞苷酸(C)时和脱氧胸腺酸(T)时发出强发光信号。
具体实施方式
第一个发明是，在嘧啶碱基或嘌呤碱基上经接头连接了荧光色素嵌入剂而成的核苷酸衍生物，其特征为，作为单链核苷酸序列的成员存在，可以识别该单链核苷酸序列杂交的对方链的相应特定碱基，发出比其他碱基种类相对较强的荧光信号。具体讲是，
(1)识别腺嘌呤(A)的胸腺嘧啶(T)衍生物；
(2)识别鸟嘌呤(G)的胞嘧啶(C)衍生物；
(3)识别胞嘧啶(C)的腺嘌呤(A)衍生物；以及
(4)识别胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)的鸟嘌呤(G)衍生物。
“荧光色素嵌入剂”是能够插入到双链核苷酸序列的相邻核苷酸对之间的物质，同时也是发出荧光的物质。作为这种物质，可以使用发出荧光信号、且产生嵌入作用的芘(1-芘基)等。或者也可以使用在公知的嵌入剂上结合同样公知的荧光物质而成的物质。作为嵌入剂，可以使用如吖啶橙、普鲁黄素、溴化乙锭、放线菌素D等芳香族色素分子。另外，作为荧光物质，可以使用如荧光素异硫氰酸酯(FITC)、罗丹明衍生物(如罗丹明B异硫氰酸酯、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(RITC)、四甲基罗丹明异硫氰酸酯异构体R)等。另外，嵌入剂和荧光物质的结合是，可以利用硫醇基和马来酰亚胺基的反应、吡啶二硫化物和硫醇基的反应、氨基和醛基的反应等，可以从公知的方法或本领域技术人员容易实施的方法、进而它们经修饰后的方法中适当选择应用。
用于在嘧啶碱基或嘌呤碱基上连接嵌入剂的“接头”可以使用如碳链或聚合物等。进而，经过接头连接嵌入剂的嘧啶碱基或嘌呤碱基的位置，可以从各自的非取代碳位置任意选择使用。即，嘧啶碱基时，为第4位或第5位，嘌呤碱基时，为第7位或第8位。
这种核苷酸衍生物，更具体地讲，可以各自用前述通式(1)～(4)各自表示。即，式(1)是嘧啶碱基第5位取代的T衍生物、式(2)是嘧啶碱基第5位取代的C衍生物、式(3)是嘌呤碱基第7位取代的A衍生物、式(4)是嘌呤碱基第8位取代的G衍生物。在以下叙述中，用芘(Py)作为荧光色素嵌入剂时，这些核苷酸衍生物有时会各自被记载为PyU(5)、PyC(5)、PyA(7)、PyG(8)。
这些核苷酸衍生物可以使用嘧啶碱基或嘌呤碱基、接头、及适宜的荧光色素嵌入剂，由例如后述实施例中记载的方法合成。另外，所述通式(1)～(4)中表示的核苷酸衍生物的情况下，可以通过前述通式(5)～(8)表示的核苷衍生物作为前体，来容易地制作。
另外，通式(1)～(8)中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同，表示氢原子或取代基，R10是氢原子或羟基，X是从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷基氨基中选出的连接基团，表示亚烷基链长度的整数n，当X为亚甲基或烷基氨基时，是0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时，是1～5。其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9的取代基是卤原子、含氧基、含氮基、含硫基、及含有这些原子或取代基的烃基或杂环基等。更详细地说，取代基是卤原子、烷氧基、酯基、氨基、取代氨基、硝基、酰胺基、氰基、氨基甲酸酯基、脲基、硫醇基、硫醚基、硫酯基等。另外，也可以是R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7及R8并非同时为氢原子，可以是R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9中彼此相邻基团结合而形成苯基，该苯基可以具有取代基。
第3个发明的单链核苷酸序列是具有一个或多个前述核苷酸衍生物的3～200个、优选是10～100个核苷酸的序列(寡核苷酸、或者核苷酸片段)。这种单链核苷酸序列可以采用如Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47：411-418；Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105：661；Belousov(1997)Nucleic Acid Res.25：3440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19：373-380；Blommers(1994)Biochemistry33：7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.68：90；Brown(1979)Meth.Enzymol.68：109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.22：1859；美国专利第4,458,066号中记载的众所周知的化学合成技术，在在试管中合成。另外，也可以使用DNA合成装置自动合成。
通过利用以上的单链核苷酸序列，可以实施本申请的第四个发明的碱基种类确定方法。
该第四个发明是，使含有未知碱基X的目标核苷酸序列和、在与碱基X相同的位置具有核苷酸衍生物的第三个发明的单链核苷酸序列(以下有时也记载为“探针序列”)进行杂交，当核苷酸衍生物(1)～(4)的各自荧光色素发出最强荧光信号时，如下确定碱基X：
(i)T衍生物的荧光色素发光最强时，为腺嘌呤；
(ii)C衍生物的荧光色素发光最强时，为鸟嘌呤；
(iii)A衍生物的荧光色素发光最强时，为胞嘧啶；
(iv)G衍生物的荧光色素发光最强时，为胞嘧啶或胸腺嘧啶。
此时的“发光最强”是指，例如在观察到，PyU(5)时与其他核苷酸相比为约大于等于3倍、PyC(5)时为大于等于1.5倍、PyA(7)时为大于等于2.5倍、PyG(8)时为大于等于2倍的发光信号的情况下，可以如上所述确定各自配对的碱基种类。
具体讲，例如图1所示的例子中，对于在第3位含有未知碱基X的目标核苷酸序列，准备各自在第3位具有A衍生物、T衍生物、G衍生物、C衍生物的探针序列，把各个探针序列杂交到目标核苷酸序列上，则由于具有T衍生物的探针序列发出最强的荧光信号，所以可以确认目标核苷酸序列的未知碱基X为腺嘌呤。
只是，所述第四个发明的方法中，A衍生物和G衍生物一同识别胞嘧啶，G衍生物分别识别胞嘧啶和胸腺嘧啶。因此，第四个发明的方法为，如在图2所示，把在相同位置分别具有A衍生物和G衍生物的两条单链核苷酸序列杂交到各自相同的对方链上，通过组合各自的荧光信号强度，如下确定碱基X。
(v)A衍生物和G衍生物双方的荧光色素发光最强时，为胞嘧啶；
(vi)只是G衍生物的荧光色素发光最强时，为胸腺嘧啶。
根据如上所述方法，可以检测目标核苷酸序列的SNP、确定未知序列的序列、是否存在与已知序列区段相同的区段、或者确定已知序列区段内的未知序列等。这些可以作为使用所述探针序列的常规杂交分析来实施，尤其可以在把所述探针序列作为捕获探针的DNA微阵列中实施。
第五个发明的DNA微阵列，除了把所述第三个发明的单链核苷酸序列作为捕获探针以外，可以与通常的DNA微阵列同样地制作。作为DNA微阵列的制作方法，已知有在固相载体表面直接合成捕获探针的方法(在片法)、把预先制备的捕获探针固定在固相载体表面的方法，但本发明的DNA微阵列优选采用后一方法制作。就把预先制备的捕获探针固定在固相载体表面的情况而言，合成引入了官能团的捕获探针，在进行了表面处理的固相载体表面点印捕获探针，进行共价结合(例如，Lamture，J.B.et al.Nucl.Acids Res.22：2121-2125，1994；Guo，Z.et al.Nucl.Acids Res.22：5456-5465，1994)。捕获探针一般是在进行了表面处理的固相载体上经间隔子(spacer)或交联剂进行共价结合。也已知有在玻璃表面排列聚丙烯酰胺凝胶的微小片，使其与捕获探针进行共价结合的方法(Yershov，G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4913，1996)。另外，也已知有在硅微阵列上制作微小电极阵列，在电极上设置含有链霉亲和素的琼脂糖的渗透层作为反应部位，通过使该部位呈正电荷，固定生物素化捕获探针，控制部位的电荷，以进行高速而严格的杂交的方法(Sosnowski，R.G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：1119-1123，1997)。本发明的DNA微阵列可以用以上的任意方法制作。
另外，该DNA微阵列和目标核苷酸序列的杂交也可以与通常的DNA微阵列同样地进行。即，使目标核苷酸序列与DNA微阵列接触，杂交到DNA微阵列的捕获探针上。杂交可以通过分注到96孔或384孔塑料板上，把标记cDNA水性液点印在微阵列上来实施。点印量可以是1～100nl左右。杂交优选在室温～70℃的温度范围、6～20小时的范围实施。杂交结束后，使用表面活性剂和缓冲液的混合溶液进行清洗，去除未反应的标记cDNA。作为表面活性剂，优选使用十二烷基硫酸钠(SDS)。作为缓冲液，可以使用柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、tris缓冲液、Good′s缓冲液等，但优选使用柠檬素缓冲液。
其中，本发明的DNA微阵列时，由于杂交了目标核苷酸序列的捕获探针发出荧光信号，所以并不需要象通常的DNA微阵列那样对目标核苷酸序列附加标记标签等。
本第五个发明的DNA微阵列的一个方式，是用于检测目标核苷酸序列的单核苷酸多态性(SNP)的DNA微阵列。即，该DNA微阵列的捕获探针组，与目标核苷酸序列的至少含有SNP核苷酸的区段互补，各捕获探针的与目标核苷酸序列的SNP核苷酸对应的位置的核苷酸是各自不同的核苷酸衍生物。从而，以捕获探针中的核苷酸衍生物发出的荧光信号强度作为指标，可以检测目标寡核苷酸序列的SNP。例如，图3所示G/A多态性的情况，G/G纯合时是在该位置含有C衍生物的捕获探针发出强荧光信号，而G/A杂合时则是含有C衍生物的捕获探针和含有T衍生物的捕获探针发出强荧光信号。另外，A/A纯合体时是从含有T衍生物的捕获探针得到强荧光信号。
本发明DNA微阵列的另一方案为，用于确定序列未知的n(n＝3～100)个核苷酸序列的DNA微阵列。即，该DNA微阵列中，捕获探针是核苷酸序列完全不同的至少4n个探针的组，其特征在于，各捕获探针从第1位到第n位是顺次不同的核苷酸衍生物。例如，如图4表示的序列未知的6-mer寡核苷酸(NNNNNN)时，对于第1位的X，从在该位置含有T衍生物的捕获探针得到强信号时，该寡核苷酸的第1位X是与胸腺嘧啶(T)互补结合的腺嘌呤(A)。同样地研究第2～6位，就可以确定该6-mer寡核苷酸是由AGGCGA构成的序列。另外，通过比较如图2所示的A衍生物和G衍生物的荧光，还可以确定含有胸腺嘧啶(T)的未知序列。并且，用通常的测序仪无法确定短链(3～100)的寡核苷酸的序列，但使用本发明的DNA微阵列，就可以简便且正确地确定短链寡核苷酸的序列。
本发明的DNA微阵列的再一个方案是，用于检测目标核苷酸序列中是否存在与由n(n＝3～100)个核苷酸构成的已知序列区段(区域(domain)或模体(motif))相同区段的DNA微阵列。即，其特征在于，该DNA微阵列中的捕获探针组与已知序列区段互补，各捕获探针从第1位到第n位是顺次不同的核苷酸衍生物。从而，如当目标核苷酸序列具有与目的的已知序列区段完全相同的序列时，可以从在对应于已知序列的各位置含有给定核苷酸衍生物的所有捕获探针得到强信号。另一方面，如图5所示，当第3位被A取代、第6位被G取代时，在第3位含有T衍生物的捕获探针和在第6位含有C衍生物的捕获探针各自发出强信号。由此，不仅可以检测是否存在与已知序列区段完全一致的序列，还可以简便且容易地检测是否存在一部分不一致的相同序列。
进而，本发明的DNA微阵列的再另一个方案是，确定具有由n(n＝3～100)个核苷酸构成的未知序列区段和已知序列区段的目标核苷酸序列的未知序列区段的序列的DNA微阵列。即，该DNA微阵列中，捕获探针组是具有与目标核苷酸序列中的已知序列区段互补的序列和核苷酸序列完全不同的探针序列区段的至少4n个探针的组，各探针序列区段从第1位到第n位的至少一个为核苷酸衍生物。此时，目标核苷酸序列和捕获探针是根据其已知序列区段的互补性而杂交，并根据与前述相同的用于确定未知序列的捕获探针发出的荧光信号来确定其序列。
实施例
下面，对于本发明的核苷酸衍生物表示实施例，但本发明并不受以下例子的限定。
实施例1
核苷酸衍生物(PyU(5)、PyC(5)、PyA(7))的合成
按照图6和7，如下合成核苷酸衍生物(PyU(5)、PyC(5)、PyA(7))。其中，化合物的序号对应于图6和7的序号。
方案i(化合物2的合成)
把丙炔胺(1，和光纯药)和1-芘基羧酸(2，Aldrich(アルドリツチ))(1∶1)，在缩合剂PyBOP(1当量，NOVA Biochem)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中，在室温搅拌2.5小时，萃取，用柱色谱精制后，得到产物2(91％)。
方案ii(化合物4：PyU(5)的核苷衍生物的合成)
把3(把5-碘-2’-脱氧尿苷(西格玛)在4，4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(东京化成)和吡啶中搅拌而得到)和2(1∶1)在(四三苯膦)钯(0.15当量，和光纯药)、碘化铜(0.3当量，和光纯药)、三乙胺(1当量，和光纯药)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中，在室温搅拌10小时，萃取，用柱色谱精制后，得到产物4(82％)。
方案iii(化合物5的合成)
把4在3％三氯醋酸-二氯甲烷溶液(Glen Research公司)中，在室温搅拌5分钟，萃取，用柱色谱精制后，得到产物5(27％)。
方案iv(化合物6：PyU(5)的合成)
把4和2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(aldrich公司)(1∶1)，在四唑(1当量，同仁化学)存在下，在乙腈中，在室温搅拌2小时，直接用于DNA合成仪。
方案v(化合物8的合成)
把5-碘-2’-脱氧胞苷(7，生化学工业)，在N，N-二甲基甲酰胺二乙缩醛(1当量，东京化成)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中，在55度搅拌2小时，并浓缩。粗产物8供于下一反应。
方案vi(化合物9的合成)
把化合物8和4，4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(东京化成)(1∶1)，在吡啶中，在室温搅拌1小时，萃取，用柱色谱精制后，得到产物9(50％在两个步骤)。
方案vii(化合物10：PyC(5)的核苷衍生物的合成)
把化合物9和2(1∶1)在(四三苯膦)钯(0.15当量，和光纯药)、碘化铜(0.3当量，和光纯药)、三乙胺(1当量，和光纯药)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中，在室温搅拌12小时，萃取，用柱色谱精制后，得到产物10(47％)。
方案viii(化合物11：PyC(5)的合成)
把化合物4和2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(aldrich公司)(1∶1)，在四唑(1当量，同仁化学)存在下，在乙腈中，在室温搅拌2小时，直接用于DNA合成仪。
方案ix(化合物13的合成)
把化合物12(Ramzaeva and Seela，Helv.Chim.Acta78，1083-1090(1995))和2(1∶2)在(四三苯膦)钯(0.1当量，和光纯药)、碘化铜(0.1当量，和光纯药)、三乙胺(2当量，和光纯药)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中，在室温搅拌6小时，萃取，用柱色谱精制后，得到产物13(88％)。
方案x(化合物14的合成)
把化合物13，在N，N-二甲基甲酰胺二乙缩醛(1当量，东京化成)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中，在50度搅拌3小时，并浓缩。粗产物供于下一反应。
方案xi(化合物15：PyA(7)的核苷衍生物的合成)
把化合物14和4，4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(东京化成)(1∶1)，在N，N-二甲基氨基吡啶催化剂量存在下，在吡啶中，在室温搅拌1小时，萃取，用柱色谱精制后，得到产物15(73％在两个步骤)。
方案xii(化合物16：PyA(7)的合成)
把化合物4和2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(aldrich公司)(1∶1)，在四唑(1当量，同仁化学)存在下，在乙腈中，在室温搅拌2小时，直接用于DNA合成仪。
实施例2
核苷酸衍生物(PyG(8))的合成
按照图8，如下合成核苷酸衍生物(PyG(8))。其中，化合物的序号对应于图8的序号。
方案1(化合物2的合成)
使用1-溴化芘作为起始原料，通过与三甲基甲硅烷基乙酸甘油酯发生Sonogashira偶合反应，得到化合物1。接着，在甲醇中由甲醇钠去除保护基三甲基甲硅烷基，得到化合物2(芘单元)(生成率70％)。
方案2(化合物6：PyG(8)的核苷衍生物的合成)
在2’-脱氧鸟苷中加入N-溴化琥珀酰亚胺，通过在水中反应而得到化合物3(生成率60％)。接着，用叔丁基二甲基氯硅烷和咪唑，由叔丁基二甲基甲硅烷基来保护化合物3的糖的3’位和5’位的羟基，然后与化合物2进行Sonogashira偶合反应而得到化合物5(生成率61％)。由TBAF去除化合物5的羟基保护基即叔丁基二甲基甲硅烷基而得到单体化合物6(生成率60％)。
方案3(化合物10：PyG(8)的合成)
使化合物3在DMF中与DMF二乙缩醛反应而得到化合物7。由4，4’-二甲氧基三苯甲基氯化物在化合物7的5’位的羟基导入4，4’-二甲氧基三苯甲基，得到化合物8(生成率22％)。通过Sonogashira偶合反应在该化合物8的8位导入化合物2，得到化合物9(生成率58％)。最后，在乙腈和二氯甲烷中与N，N，N’，N’-四异丙基氰乙基亚磷二酰胺，以四唑为酸性活化剂进行反应，合成作为amidite单元的化合物10。把它作为0.1M乙腈溶液供于DNA合成仪。
实施例3
寡脱氧核糖核苷酸的合成
使用在实施例1制成的核苷酸衍生物(PyU(5)、PyC(5)、PyA(7))、及在实施例2制成的核苷酸衍生物(PyG(8))，合成含有核苷酸衍生物的寡脱氧核糖核苷酸。寡脱氧核糖核苷酸是用美国应用生物系统公司的392DNA/RNA合成仪按照通常的亚磷酰胺法合成。从固相载体切取及脱保护是，通过在25％的氨水中，孵育一定温度和一定时间来进行，然后利用高效液相色谱精制。
实施例4
含有PyC(5)的寡脱氧核糖核苷酸(1)的荧光分析
把在实施例3得到的含有PyC(5)的寡脱氧核糖核苷酸(5’-CGCAACPyCCAACGC-3；：序列号1)溶解到含有0.1M氯化钠的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中配制成2.5μM的溶液。使用荧光分光光度计在约25℃测定该溶液的荧光光谱的结果，激发波长为329nm、发射波长为400nm，在400nm的荧光强度为7.0。
在上述溶液中分别添加与含有PyC(5)的寡脱氧核糖核苷酸的除PyC(5)以外的部分互补的下述另行合成的寡脱氧核糖核苷酸，使其成为2.5μM，用涡流混合器混合：
(A’)：5’-GCGTTGAGTTGCG-3’(序列号2)；
(T’)：5’-GCGTTGTGTTGCG-3’(序列号3)；
(G’)：5’-GCGTTGGGTTGCG-3’(序列号4)；
(C’)：5’-GCGTTGCGTTGCG-3’(序列号5)。
用荧光分光光度计测定这些溶液的荧光光谱的结果是，添加寡脱氧核糖核苷酸(A’)时，在400nm的荧光强度为4.1。添加寡脱氧核糖核苷酸(T’)时，在400nm的荧光强度为2.6；添加寡脱氧核糖核苷酸(G’)时，在400nm的荧光强度为18.3；添加寡脱氧核糖核苷酸(C’)时，在400nm的荧光强度为1.4。
这样，对于含有PyC(5)的寡脱氧核糖核苷酸，当互补链上的与PyC(5)配对的核苷酸为脱氧鸟苷酸时，可以观察得到强发光，与此相比，当为脱氧腺苷酸时，荧光就消光78％；当为脱氧胸苷酸时，荧光就消光86％；当为脱氧胞苷酸时荧光就消光92％。在图9表示荧光光谱。
实施例5
含有PyC(5)的寡脱氧核糖核苷酸(2)的荧光分析
把在实施例3得到的含有PyC(5)的寡脱氧核糖核苷酸(5’CGCAATPyCTAACGC-3；：序列号6)溶解到含有0.1M氯化钠的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中配制成2.5μM的溶液。使用荧光分光光度计在约25℃测定该溶液的荧光光谱的结果，激发波长为327nm、发射波长为405nm，在405nm的荧光强度为9.2。
在上述溶液中分别添加与含有PyC(5)的寡脱氧核糖核苷酸的除PyC(5)以外的部分互补的下述另行合成的寡脱氧核糖核苷酸，使其成为2.5μM，用涡流混合器混合：
(A’)：5’-GCGTTAAATTGCG-3’(序列号7)；
(T’)：5’-GCGTTATATTGCG-3’(序列号8)；
(G’)：5’-GCGTTAGATTGCG-3’(序列号9)；
(C’)：5’-GCGTTACATTGCG-3’(序列号10)。
用荧光分光光度计测定这些溶液的荧光光谱的结果，添加寡脱氧核糖核苷酸(A’)时，在405nm的荧光强度为10.9。添加寡脱氧核糖核苷酸(T’)时，在400nm的荧光强度为8.8；添加寡脱氧核糖核苷酸(G’)时，在400nm的荧光强度为18.2；添加寡脱氧核糖核苷酸(C’)时，在400nm的荧光强度为11.9。
这样，对于含有PyC(5)的寡脱氧核糖核苷酸，当互补链上的与PyC(5)配对的核苷酸为脱氧鸟苷酸时，可以观察得到强发光，与此相比，当为脱氧腺苷酸时，荧光就消光40％；当为脱氧胸苷酸时，荧光就消光52％；当脱氧胞苷酸时，荧光就消光35％。在图10表示荧光光谱。
比较该实施例5和所述实施例4的结果，可以确认核苷酸衍生物PyC(5)与其配对的碱基的前后碱基种类无关，对应于特定的碱基种类(G)而发出强荧光信号。
实施例6
含有PyU(5)的寡脱氧核糖核苷酸(1)的荧光分析
把在实施例3得到的含有PyU(5)的寡脱氧核糖核苷酸(5’-CGCAACPyUCAACGC-3；：序列号11)溶解到含有0.1M氯化钠的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中配制成2.5μM的溶液。使用荧光分光光度计在约25℃测定该溶液的荧光光谱的结果，激发波长为344nm、发射波长为398nm，在398nm的荧光强度为7.4。
在上述溶液中分别添加与含有PyU(5)的寡脱氧核糖核苷酸的除PyU(5)以外的部分互补的下述另行合成的寡脱氧核糖核苷酸，使其成为2.5μM，用涡流混合器混合：
(A’)：5’-GCGTTGAGTTGCG-3’(序列号2)；
(T’)：5’-GCGTTGTGTTGCG-3’(序列号3)；
(G’)：5’-GCGTTGGGTTGCG-3’(序列号4)；
(C’)：5’-GCGTTGCGTTGCG-3’(序列号5)。
用荧光分光光度计测定这些溶液的荧光光谱的结果是，当添加寡脱氧核糖核苷酸(A’)时，在398nm的荧光强度为29.8；添加寡脱氧核糖核苷酸(T’)时，在398nm的荧光强度为4.5；添加寡脱氧核糖核苷酸(G’)时，在398nm的荧光强度为3.7；添加寡脱氧核糖核苷酸(C’)时，在398nm的荧光强度为3.3。
这样，对于含有PyU(5)的寡脱氧核糖核苷酸，当互补链上的与PyU(5)配对的核苷酸为脱氧腺苷酸时，可以观察得到强发光，与此相比，当脱氧胸苷酸时荧光就消光85％；脱氧鸟苷酸时荧光就消光88％；脱氧胞苷酸时荧光就消光89％。在图11表示荧光光谱。另外，在图12表示荧光照片图像。
实施例7
含有PyU(5)的寡脱氧核糖核苷酸(2)的荧光分析
把在实施例3得到的含有PyU(5)的寡脱氧核糖核苷酸(5’-CGCAATPyUTAACGC-3；：序列号12)溶解到含有0.1M氯化钠的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中配制成2.5μM的溶液。使用荧光分光光度计在约25℃测定该溶液的荧光光谱的结果，激发波长为327nm、发射波长为398nm，在398nm的荧光强度为6.3。
在上述溶液中分别添加与含有PyU(5)的寡脱氧核糖核苷酸的除PyU(5)以外的部分为互补的下述另行合成的寡脱氧核糖核苷酸，使其成为2.5μM，用涡流混合器混合：
(A’)：5’-GCGTTAAATTGCG-3’(序列号7)；
(T’)：5’-GCGTTATATTGCG-3’(序列号8)；
(G’)：5’-GCGTTAGATTGCG-3’(序列号9)；
(C’)：5’-GCGTTACATTGCG-3’(序列号10)。
用荧光分光光度计测定这些溶液的荧光光谱的结果，添加寡脱氧核糖核苷酸(A’)时，在398nm的荧光强度为26.0；添加寡脱氧核糖核苷酸(T’)时，在398nm的荧光强度为2.7；添加寡脱氧核糖核苷酸(G’)时，在398nm的荧光强度为4.8；添加寡脱氧核糖核苷酸(C’)时，在398nm的荧光强度为10.6。
这样，对于含有PyU(5)的寡脱氧核糖核苷酸，当互补链上的与PyU(5)配对的核苷酸为脱氧腺苷酸时，可以观察得到强发光，与此相比，当为脱氧胸苷酸时，荧光就消光90％；当为脱氧鸟苷酸时，荧光就消光82％；当为脱氧胞苷酸时，荧光就消光59％。在图13表示荧光光谱。
比较该实施例7和所述实施例6的结果，可以确认核苷酸衍生物PyU(5)与其配对的碱基的前后碱基种类无关，对特定的碱基种类(A)发出强荧光信号。
实施例8
含有PyA(7)的寡脱氧核糖核苷酸的荧光分析
把在实施例3得到的含有PyA(7)的寡脱氧核糖核苷酸(5’CGCAACPyACAACGC-3；：序列号13)溶解到含有0.1M氯化钠的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中配制成2.5μM的溶液。使用荧光分光光度计在约25℃测定该溶液的荧光光谱的结果，激发波长为353nm、发射波长为395nm，在395nm的荧光强度为4.3。
在上述溶液中分别添加与含有PyA(7)的寡脱氧核糖核苷酸的除PyA(7)以外的部分为互补的下述另行合成的寡脱氧核糖核苷酸，使其成为2.5μM，用涡流混合器混合：
(A’)：5’-GCGTTGAGTTGCG-3’(序列号2)；
(T’)：5’-GCGTTGTGTTGCG-3’(序列号3)；
(G’)：5’-GCGTTGGGTTGCG-3’(序列号4)；
(C’)：5’-GCGTTGCGTTGCG-3’(序列号5)。
用荧光分光光度计测定这些溶液的荧光光谱的结果，添加寡脱氧核糖核苷酸(A’)时，在395nm的荧光强度为2.5；添加寡脱氧核糖核苷酸(T’)时，在395nm的荧光强度为1.8；添加寡脱氧核糖核苷酸(G’)时，在395nm的荧光强度为7.4；添加寡脱氧核糖核苷酸(C’)时，在395nm的荧光强度为18.2。
这样，对于含有PyA(7)的寡脱氧核糖核苷酸，当互补链上的与PyA(7)配对的核苷酸为脱氧胞苷酸时，可以观察得到强发光，与此相比，当为脱氧胸苷酸时，荧光就消光90％；当为脱氧腺苷酸时，荧光就消光86％；当为脱氧鸟苷酸时，荧光就消光59％。在图14表示荧光光谱。
实施例9
含有PyG(8)的寡脱氧核糖核苷酸(2)的荧光分析
把在实施例3得到的含有PyG(8)的寡脱氧核糖核苷酸(5’-CGCAATPyGTAACGC-3；：序列号14)溶解到含有0.1M氯化钠的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中配制成2.5μM的溶液。使用荧光分光光度计在约25℃测定该溶液的荧光光谱的结果，激发波长为420nm、发射波长为430nm和460nm，在430nm的荧光强度为16.0，而在460nm的荧光强度为15.3。
在上述溶液中分别添加与含有PyG(8)的寡脱氧核糖核苷酸的除PyG(8)以外的部分为互补的下述另行合成的寡脱氧核糖核苷酸，使其成为2.5μM，用涡流混合器混合：
(A’)：5’-GCGTTAAATTGCG-3’(序列号7)；
(T’)：5’-GCGTTATATTGCG-3’(序列号8)；
(G’)：5’-GCGTTAGATTGCG-3’(序列号9)；
(C’)：5’-GCGTTACATTGCG-3’(序列号10)。
用荧光分光光度计测定这些溶液的荧光光谱的结果，添加寡脱氧核糖核苷酸(A’)时，在430nm的荧光强度为65.0；添加寡脱氧核糖核苷酸(T’)时，在430nm的荧光强度为144.0；添加寡脱氧核糖核苷酸(G’)时，在430nm的荧光强度为65.0；添加寡脱氧核糖核苷酸(C’)时，在430nm的荧光强度为136.0。
这样，对于含有PyG(8)的寡脱氧核糖核苷酸，当互补链上的与PyG(8)配对的核苷酸为脱氧胸苷酸和脱氧胞苷酸时，可以观察得到强发光，与此相比，当为脱氧鸟苷酸和脱氧腺苷酸时，荧光各自消光55％。在图15表示相对荧光光谱。
实施例10
使用DNA微阵列确定序列号15的寡脱氧核糖核苷酸(样品DNA片段)的第8～11位的未知序列。作为DNA微阵列的捕获探针，使用含有序列号16～31的核苷酸序列的DNA片段(探针DNA片段)(参照表1)。其中，样品DNA片段含有序列号15的核苷酸序列，全长50b；探针DNA片段1～16各自含有序列号16～31的核苷酸序列，全长68～70b。
1.探针DNA片段的制备
各自含有序列号16～31的核苷酸序列的探针DNA片段1～16，使用美国应用生物系统公司的392DNA/RNA合成装置，按照通常的亚磷酰胺法合成。从固相载体切取及脱保护是，通过在25％的氨水中孵育来进行，然后利用高效液相色谱精制。
序列号16～31的各自第8位(T、G、C、A)为各核苷酸衍生物(PyU(5)、PyC(5)、PyA(7)、PyG(8))。同样，序列号20～23的第9位、序列号24～27的第10位、序列号28～31的第11位的T、G、C、A各自为PyU(5)、PyC(5)、PyA(7)、PyG(8)(参照表1)。
2.固定用基板的制备
把在10％NaOH-60％乙醇水溶液中浸渍2小时且用纯水清洗10次的76×26×1mm大小的玻璃制载片(slide)(松波硝子工业公司制)，在10％聚L-赖氨酸水溶液中浸渍1小时。用纯水清洗10次后，以800rpm、离心5分钟，去除水分，在室温干燥，制备固定用基板。
3.DNA微阵列的制备
把在上述1中制备的各个探针DNA片段，调整成最终浓度50pmol/μl，在上述2制备的基板上分别点印200pl(10nmol)。然后，在80℃干燥处理1小时，在各点上添加水，将DNA片段固定在基板上。把该基板用1％BSA封闭液(50mg/ml)5ml、10％SDS1.25ml)振荡45分钟(42℃)。然后，分别用95℃纯水浸渍1分钟、用95％乙醇浸渍1分钟，离心(800rpm、1分钟)，来制备目的DNA微阵列。
4.样品DNA片段的制备
在含有由含有序列号15的核苷酸序列的全长50b的寡脱氧核糖核苷酸构成的样品DNA片段(15fmol/10.5μl)的样品管中，添加20×SSC(3.75μl)和10％SDS(0.75μl)。用95℃加热模块(heatblock)进行2分钟加热后，在室温放置5分钟，离心，来制备样品液(最终浓度：1nM)。
5.杂交
在上述3制备的DNA微阵列上，把在上述2制备的样品液点印在1点，12μl/点，用盖玻片覆盖，进行杂交反应(65℃、16小时)。反应终止后，在2×SSC-0.1％SDS溶液中浸渍5分钟、20分钟，在0.2×SSC-0.1％SDS溶液中浸渍20分钟，然后在55℃进一步浸渍2次，每次20分钟。用同溶液冲洗后，进而用0.05×SSC溶液冲洗。用900rpm离心1分钟，放置，干燥。
6.测定
使用荧光显微镜BX-50(奥林帕斯公司制)，测量各DNA点的荧光强度，得到图像文件后，进行信号的数值化处理。结果示于表1。
表1
| DNA片段 | 序列号 | 碱基序列 | 荧光强度 |
| 样品 | 15 | 3’-TCAGTAANNNNCGCCTAATG-5’ | |
| 探针1探针2探针3探针4 | 16171819 | 5’-AGTCATTTTGCCGCCTAATG-3’5’-AGTCATTGTGCCGCCTAATG-3’5’-AGTCATTCTGCCGCCTAATG-3’5’-AGTCATTATGCCGCCTAATG-3’ | 21012000180240 |
| 探针5探针6探针7探针8 | 20212223 | 5’-AGTCATTATGCCGCCTAATG-3’5’-AGTCATTAGGCCGCCTAATG-3’5’-AGTCATTACGCCGCCTAATG-3’5’-AGTCATTAAGCCGCCTAATG-3’ | 30000250300260 |
| 探针9探针10探针11探针12 | 24252627 | 5’-AGTCATTATTCCGCCTAATG-3’5’-AGTCATTATGCCGCCTAATG-3’5’-AGTCATTATCCCGCCTAATG-3’5’-AGTCATTATACCGCCTAATG-3’ | 2001800023013000 |
| 探针13探针14探针15探针16 | 28293031 | 5’-AGTCATTATGTCGCCTAATG-3’5’-AGTCATTATGGCGCCTAATG-3’5’-AGTCATTATGCCGCCTAATG-3’5’-AGTCATTATGACGCCTAATG-3’ | 13012020300180 |
从表1所示的荧光强度的结果可以确定样品DNA片段的序列号15的第8～11位的未知核苷酸如下。
(1)位于探针DNA片段1～4的第8位的各核苷酸衍生物的荧光强度为，探针DNA片段2的PyG(8)最高，探针DNA片段4的PyA(7)则明显要低，因此样品DNA片段的第8位确定为胸腺嘧啶(T)。
(2)位于探针DNA片段5～8的第9位的各核苷酸衍生物的荧光强度为，探针DNA片段5的PyU(5)最高，因此样品DNA片段的第9位确定为腺嘌呤(A)。
(3)位于探针DNA片段9～12的第10位的各核苷酸衍生物的荧光强度为，探针DNA片段10的PyG(8)和探针DNA片段12的PyA(7)最高，因此样品DNA片段的第10位确定为胞嘧啶(C)。
(4)位于探针DNA片段13～16的第11位的各核苷酸衍生物的荧光强度为，探针DNA片段15的PyC(5)最高，因此样品DNA片段的第11位确定为鸟嘌呤(G)。
并且，从该结果可以确认，本发明的核苷酸衍生物为，与配对的碱基的前后碱基种类无关，对特定的碱基种类发出强荧光信号。
产业上的利用可能性
如在上面详细说明，本申请的发明可以大幅度简化使用DNA探针或DNA微阵列的SNP判定或序列确认等中的试样制备和测定过程。
序列表
<110>斋藤烈和日本碍子株式会社(Isao Saito and NGK Insulators，Ltd.)
<120>核苷酸衍生物和DNA微阵列
<130>
<160>31
<170>PatentIn version3.1
<210>1
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
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<222>(7)
<223>用1-芘基改性的胞嘧啶衍生物
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<222>(9)
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<222>(11)
<223>用1-芘基改性的腺嘌呤衍生物
<400>31
agtcattatg acgcctaatg 20
Claims (17)
1.一种核苷酸衍生物，其是荧光色素嵌入剂经由接头连接于嘧啶碱基或嘌呤碱基而成，其特征在于，作为单链核苷酸序列的成员存在，当与该单链核苷酸序列杂交的对方链的相应碱基为
(1)腺嘌呤时，是荧光色素发光最强的胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物；
(2)鸟嘌呤时，是荧光色素发光最强的胞嘧啶衍生物；
(3)胞嘧啶时，是荧光色素发光最强的腺嘌呤衍生物；或者
(4)胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶时，是荧光色素发光最强的鸟嘌呤衍生物。
2.根据权利要求1所述的核苷酸衍生物，其特征在于，胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物是由以下通式(1)表示：
式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氢原子或取代基，R10是氢原子或羟基，X是从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷基氨基中选出的连接基团，整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷基氨基时，是0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时，是1～5。
3.根据权利要求1所述的核苷酸衍生物，其特征在于，胞嘧啶衍生物是由以下通式(2)表示：
式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氢原子或取代基，R10是氢原子或羟基，X是从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷基氨基中选出的连接基团，整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷基氨基时，是0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时，是1～5。
4.根据权利要求1所述的核苷酸衍生物，其特征在于，腺嘌呤是由以下通式(3)表示：
式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氢原子或取代基，R10是氢原子或羟基，X是从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷基氨基中选出的连接基团，整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷基氨基时，是0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时，是1～5。
5.根据权利要求1所述的核苷酸衍生物，其特征在于，鸟嘌呤衍生物是由以下通式(4)表示：
式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氢原子或取代基，R10是氢原子或羟基，X是从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷基氨基中选出的连接基团，整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷基氨基时是0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时，是1～5。
6.胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物的前体物质，其是由以下通式(5)表示的核苷衍生物：
式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氢原子或取代基，R10是氢原子或羟基，X是从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷基氨基中选出的连接基团，整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷基氨基时，是0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时，是1～5。
7.胞嘧啶衍生物的前体物质，其是由以下通式(6)表示的核苷衍生物：
式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氢原子或取代基，R10是氢原子或羟基，X是从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷基氨基中选出的连接基团，整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷基氨基时，是0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时，是1～5。
8.腺嘌呤衍生物的前体物质，其是由以下通式(7)表示的核苷衍生物：
式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氢原子或取代基，R10是氢原子或羟基，X是从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷基氨基中选出的连接基团，整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷基氨基时，是0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时，是1～5。
9.鸟嘌呤衍生物的前体物质，其是由以下通式(8)表示的核苷衍生物：
式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氢原子或取代基，R10是氢原子或羟基，X是从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷基氨基中选出的连接基团，整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷基氨基时，是0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时，是1～5。
10.将权利要求1的核苷酸衍生物(1)～(4)中的一个或其以上作为成员而具有的单链核苷酸序列。
11.确定与权利要求10的单链核苷酸序列杂交的对方链的单碱基X的方法，其中，
(i)当单链核苷酸序列中的胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物(1)的荧光色素发光最强时，确定碱基X为腺嘌呤；
(ii)当单链核苷酸序列中的胞嘧啶衍生物(2)的荧光色素发光最强时，确定碱基X为鸟嘌呤；
(iii)当单链核苷酸序列中的腺嘌呤衍生物(3)的荧光色素发光最强时，确定碱基X为胞嘧啶；
(iv)当单链核苷酸序列中的鸟嘌呤衍生物(4)的荧光色素发光最强时，确定碱基X为胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶。
12.根据权利要求11所述的碱基种类确定方法，其特征在于，把在同一位置具有腺嘌呤衍生物(3)和鸟嘌呤衍生物(4)的两条单链核苷酸序列各自杂交到同一对方链，
(v)当腺嘌呤衍生物(3)和鸟嘌呤衍生物(4)双方的荧光色素发光最强时，确定对方链的碱基X为胞嘧啶；
(vi)只是鸟嘌呤衍生物(4)的荧光色素发光最强时，确定对方链的碱基X为胸腺嘧啶/尿嘧啶。
13.把权利要求10的单链核苷酸序列作为捕获探针的DNA微阵列。
14.根据权利要求13所述的DNA微阵列，其是检测目标核苷酸序列的单核苷酸多态性(SNP)的DNA微阵列，其特征在于，捕获探针的组与目标核苷酸序列的至少含有SNP核苷酸的区段互补，各个捕获探针的与目标核苷酸序列的SNP核苷酸对应的位置的核苷酸各自为核苷酸衍生物(1)～(4)。
15.根据权利要求13所述的DNA微阵列，其是确定序列未知的n(n＝3～100)个核苷酸序列的DNA微阵列，其特征在于，捕获探针是核苷酸序列完全不同的至少4n个的组，各捕获探针从第1位到第n位的至少一个为核苷酸衍生物(1)～(4)。
16.根据权利要求13所述的DNA微阵列，其是检测目标核苷酸序列中是否存在与由n(n＝3～100)个核苷酸构成的已知序列区段相同的区段的DNA微阵列，其特征在于，捕获探针组与目标核苷酸序列中的已知序列区段互补，各捕获探针从第1位到第n位的至少一个为核苷酸衍生物(1)～(4)。
17.根据权利要求13所述的DNA微阵列，其是确定目标核苷酸序列的未知序列区段的序列的DNA微阵列，所述目标核苷酸序列具有由n(n＝3～100)个核苷酸构成的未知序列区段和已知序列区段，其特征在于，捕获探针组是具有与目标核苷酸序列中的已知序列区段互补的序列和核苷酸序列完全不同的探针序列区段的至少4n个的组，各探针序列区段从第1位到第n位的至少一个为核苷酸衍生物(1)～(4)。
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