CN1938328A - 核苷酸衍生物和dna微阵列 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了荧光强度根据杂交互补链的相应碱基种类而变化的新的核苷酸衍生物，作为单链核苷酸序列的成员存在，当该单链核苷酸序列的杂交互补链的相应碱基是，腺嘌呤时，其为荧光色素的发光最强的胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物(1)；鸟嘌呤时，其为荧光色素的发光最强的胞嘧啶衍生物(2)；胞嘧啶时，其为荧光色素的发光最强的腺嘌呤衍生物(3)；胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶时，其为荧光色素的发光最强的鸟嘌呤衍生物(4)；或胸腺嘧啶/尿嘧啶时，其为荧光色素的发光最强的腺嘌呤衍生物(5)。

Description

核苷酸衍生物和DNA微阵列
技术领域
本发明涉及用于确定核苷酸序列中的特定碱基种类的核苷酸衍生物，以及具备含有该核苷酸衍生物的捕获探针的DNA微阵列。
背景技术
随着迎来后基因组时代，对正确、高效，进而以低成本检测核苷酸序列中的碱基种类的新技术提出了要求。例如，SNP(Single NucleotidePolymorphism：单核苷酸多态性)是以约0.1％(约1000个碱基中的1个)的比例存在于人类基因组的频率最高的多态性，它的有无与各种疾病有关这一事实逐渐变得明了化(例如与肺癌有关的p53基因的SNP：非专利文献1)，从而以诊断或遗传治疗方法等为目的，正确判定SNP的有无的技术(SNP分型)也就变得越来越重要。
作为SNP分型方法，已知有“利用杂交效率的方法”、“利用酶识别效率的方法”、“利用电技术的方法”等，特别是利用杂交效率的方法，对其在DNA微阵列(例如参考专利文献1～4，非专利文献2、3)方面的应用进行了各种研究，例如非专利文献4中报道了使用了DNA微阵列(微阵列)的BRCAl基因SNP的检测例。
但是，以前的DNA微阵列仅限于SNP的检测，通常利用荧光等标记目标核苷酸序列，以荧光信号作为指标，检测与微阵列的捕获探针杂交的目标核苷酸序列。因此，例如目标核苷酸序列的制备中，利用使用了标记dNTP的PCR扩增等手段，但是这需要很多的劳动力、时间和费用。另外，SNP等的检测中，一般采用以探针与目标核苷酸序列杂交的解链温度作为指标的方法，这种情况下，需要严密设定每个目标核苷酸的杂交的严格度(stringency)条件，另外，即使通过设定这样的条件也存在着无法避免错误杂交等引起的测定误差的不良情况。
另一方面，已知使荧光分子结合在天然的核酸碱基上的荧光修饰核酸碱基，例如非专利文献5中，提出了使荧光信号强度根据杂交互补链的环境而变化的荧光探针的利用。
专利文献1：美国专利第5,474,796号说明书
专利文献2：美国专利第5,605,662号说明书
专利文献3：国际公开第95/25116号小册子
专利文献4：国际公开第95/35505号小册子
非专利文献1：Biros et al.Neoplasma 48(5)：407-11，2001
非专利文献2：Schena，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93：10614-10619，1996
非专利文献3：Heller，R.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94：2150-2155，1997
非专利文献4：Hacia JG et al.Nat.Genet.14：441-447，1996
非专利文献5：Yamane，A.，Nucleic Acids Res.30(19)：e97，2002
发明内容
如上所述，为了确定SNP检测等中的碱基种类，特别是考虑到在DNA微阵列中的适用的情况，寻求一种不需要利用荧光等标记目标核苷酸序列的操作，而且不依赖于解链温度测定等间接性指标的新方法。从这样的观点考虑，使用了荧光修饰核酸碱基的探针(例如非专利文献5)，在能够以探针侧荧光信号的变化作为指标直接确定碱基种类的方面上，是有效的方法。但是，该非专利文献5的方法是，以与荧光修饰核酸碱基配对的碱基种类的周边的环境(特定的碱基序列等)相应的荧光信号作为指标，而不是荧光信号根据单个碱基的种类而发生变化。
本申请的发明是鉴于如上所述的情况而进行的，目的是提供荧光信号强度根据杂交互补链的相应碱基种类而变化的新的核苷酸衍生物。
本申请的发明还提供使用了上述核苷酸衍生物的确定碱基种类的方法，和以该方法作为测定原理的DNA微阵列。
本申请的第1发明为，一种核苷酸衍生物，其为在嘧啶碱基或嘌呤碱基上经由连接臂(linker)结合了荧光色素嵌入剂的核苷酸衍生物，作为单链核苷酸序列的成员存在，当该单链核苷酸序列的杂交互补链的相应碱基是
腺嘌呤时，其为荧光色素的发光最强的胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物(1)；
鸟嘌呤时，其为荧光色素的发光最强的胞嘧啶衍生物(2)；
胞嘧啶时，其为荧光色素的发光最强的腺嘌呤衍生物(3)；
胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶时，其为荧光色素的发光最强的鸟嘌呤衍生物(4)；或
胸腺嘧啶/尿嘧啶时，其为荧光色素的发光最强的腺嘌呤衍生物(5)。
在该第1发明中，所说的“核苷酸衍生物”是，在嘌呤或嘧啶以β-N-糖苷键与糖结合的核苷的磷酸酯即核苷酸(ATP、GTP、CTP、UTP；或dATP、dGTP、dCTP、dTTP)的任意位置上，经由亚烷基链结合荧光色素嵌入剂而成的化合物。另外，该核苷酸衍生物“作为单链核苷酸序列的成员存在”是指，在3个核苷酸以上的核苷酸序列中的非端部位置上，核苷酸衍生物与其左右的核苷酸形成磷酸二酯键的状态。进一步，所说的“荧光色素发光最强”的意思是，例如用荧光分光光度计测定时，例如胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物的情况，与相应的碱基种类是鸟嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶/尿嘧啶的情况相比，腺嘌呤的情况可以得到最强的荧光信号强度。
这里，在以下的说明中有时将“胸腺嘧啶/尿嘧啶”简单地记为“尿嘧啶(U)”或“胸腺嘧啶(T)”。
该第1发明的具体例子为，以下的通式(1)表示的胸腺嘧啶衍生物(1)：
Figure A20058000743600141
    (1)
以下的通式(2)表示的胞嘧啶衍生物(2)：
Figure A20058000743600151
    (2)
以下的通式(3)表示的腺嘌呤衍生物(3)：
Figure A20058000743600152
    (3)
以下的通式(4)表示的鸟嘌呤衍生物(4)：
Figure A20058000743600161
    (4)
以及，以下的通式(5)表示的腺嘌呤衍生物(5)。
    (5)
另外，本申请的第2发明为，上述各核苷酸衍生物的前体物质的具体例子，各自为以下的核苷衍生物。
胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物(1)的前体物质，以下的通式(6)表示的核苷衍生物。
    (6)
胞嘧啶衍生物(2)的前体物质，以下的通式(7)表示的核苷衍生物。
    (7)
腺嘌呤衍生物(3)的前体物质，以下的通式(8)表示的核苷衍生物。
    (8)
鸟嘌呤衍生物(4)的前体物质，以下的通式(9)表示的核苷衍生物。
Figure A20058000743600182
    (9)
腺嘌呤衍生物(5)的前体物质，以下的通式(10)表示的核苷衍生物。
    (10)
这里，在以上的通式(1)～(10)中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9表示氢原子或取代基，它们可以相同或不同；R10为氢原子或羟基；X为从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷氨基中选择的连结基团；整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷氨基时为0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时为1～5。
本申请的第3发明为，具有从上述第1发明的核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(4)组成的群中选出的一个以上的核苷酸衍生物作为成员的单链核苷酸序列。
该第3发明的单链核苷酸序列中，可以是任一种核苷酸衍生物存在多个，或者也可以是两种以上的核苷酸衍生物各自存在一个，或各自存在多个。其中，如上所述，该单链核苷酸序列中，核苷酸衍生物不存在于序列的端部。
本申请的第4发明为碱基种类确定方法，其为确定所述第3发明的单链核苷酸序列杂交互补链上的单个碱基种类X的方法，当单链核苷酸序列中的
(i)胸腺嘧啶衍生物(1)的荧光色素发光最强时，确定碱基种类X为腺嘌呤；
(ii)胞嘧啶衍生物(2)的荧光色素发光最强时，确定碱基种类X为鸟嘌呤；
(iii)腺嘌呤衍生物(3)的荧光色素发光最强时，确定碱基种类X为胞嘧啶；
(iv)鸟嘌呤衍生物(4)的荧光色素发光最强时，确定碱基种类X为胞嘧啶或胸腺嘧啶。
另外，该第4发明的方法的优选方式为，把在同一位置上各自具有腺嘌呤衍生物(3)和鸟嘌呤衍生物(4)的两条单链核苷酸序列各自杂交到相同的互补链上，当
(v)腺嘌呤衍生物(3)和鸟嘌呤衍生物(4)双方的荧光色素发光最强时，确定互补链上的碱基种类X为胞嘧啶；
(vi)只有鸟嘌呤衍生物(4)的荧光色素发光最强时，确定互补链上的碱基种类X为胸腺嘧啶。
第4发明的所述方式中，所说的“两条单链核苷酸序列”是指，由除核苷酸衍生物(3)(4)外全部相同的碱基序列构成的两条单链核苷酸序列。
本申请的第5发明为，具有从上述第1发明的核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(5)组成的群中选出的一个以上的核苷酸衍生物作为成员的单链核苷酸序列。
本申请的第6发明为碱基种类确定方法，其为确定所述第5发明的单链核苷酸序列杂交互补链上的单个碱基种类X的方法，当单链核苷酸序列中的
(i)胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物(1)的荧光色素发光最强时，确定碱基种类X为腺嘌呤；
(ii)胞嘧啶衍生物(2)的荧光色素发光最强时，确定碱基种类X为鸟嘌呤；
(iii)腺嘌呤衍生物(3)的荧光色素发光最强时，确定碱基种类X为胞嘧啶；
(iv)腺嘌呤衍生物(5)的荧光色素发光最强时，确定碱基种类X为胸腺嘧啶/尿嘧啶。
本申请的第7发明为，以所述第3发明的单链核苷酸序列作为捕获探针的DNA微阵列。
所述第7发明的DNA微阵列的一个实施方式为，检测目标核苷酸序列的单核苷酸多态性(SNP)的DNA微阵列，其中，捕获探针的组为，与目标核苷酸序列的至少含有SNP核苷酸的区段互补，但每个捕获探针的与目标核苷酸序列的SNP核苷酸对应位置的核苷酸各自为核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(4)。
所述第7发明的DNA微阵列另一个实施方式为，确定序列未知的n(n＝3～100)个核苷酸序列的DNA微阵列，其中，捕获探针为核苷酸序列完全不同的至少4n个的组，每个捕获探针为第1位至第n位的至少一个是核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(4)。
所述第7发明的DNA微阵列的再一个实施方式为，检测目标核苷酸序列中是否存在与由n(n＝3～100)个核苷酸构成的已知序列区段相同的区段的DNA微阵列，其中，捕获探针的组为与目标核苷酸序列中的已知序列区段互补，但每个捕获探针为第1位至第n位的至少一个是核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(4)。
所述第7发明的DNA微阵列的又一个实施方式为，确定具有由n(n＝3～100)个核苷酸构成的未知序列区段和已知序列区段的目标核苷酸序列中的未知序列区段的序列的DNA微阵列，其中，捕获探针的组为具有针对目标核苷酸序列中已知序列区段的互补序列和、核苷酸序列完全不同的探针序列区段的至少4n个的组，各探针序列区段的第1位至第n位的至少一个是核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(4)。
本申请的第8发明为，以所述第5发明的单链核苷酸序列作为捕获探针的DNA微阵列。该第8发明的DNA微阵列也具有与上述第7发明的DNA微阵列同样的具体实施方式。
本申请的第9发明为目标核苷酸序列的定量方法，其包括将所述第3发明或第5发明的单链核苷酸序列与序列已知的目标核苷酸序列杂交后，测定单链核苷酸序列的核苷酸衍生物的荧光强度的步骤。
本申请的各发明的具体构成、用语或概念，在发明的实施方式的说明或实施例中详细规定。另外，为了实施本发明而使用的各种技术，除了特别明示其出处的技术外，只要是本领域的技术人员都可以基于公知的文献等容易且确切地实施。例如，基因工程学及分子生物学方面的技术记载于Sambrookand Maniatis，in Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，1989；Ausubel，F.M.et al，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，New York，N.Y，1995等中。
发明的有益效果
根据上述的第1发明，提供了荧光信号强度根据杂交互补链的相应碱基种类而变化的新的核苷酸衍生物。不需要目标核苷酸序列的标记操作，而且不依赖于解链温度测定等的间接性指标，通过直接测定捕获探针发出的荧光强度，就可以判定目标核苷酸序列的规定的碱基种类。另外，由于本发明的核苷酸衍生物，不是以与碱基种类的周边环境(特定的碱基序列等)相应的荧光信号作为指标，而是荧光信号只根据配对的碱基种类发生相应变化，因此无论目标序列是何种序列都是适宜的。
根据所述的第2发明，提供了作为所述第1发明的核苷酸衍生物前体的核苷衍生物。通过使用该核苷衍生物，可以容易地制成上述第1发明的核苷酸衍生物。
根据所述的第3发明及第4发明，提供了具有所述第1发明的核苷酸衍生物的单链核苷酸序列，通过以该核苷酸序列作为探针，可以确定目标核苷酸序列中的未知碱基的碱基种类。
根据所述的第5发明及第6发明，通过使用所述第3发明及第5发明的的单链核苷酸序列作为探针，提供了确定目标核苷酸序列中的未知碱基的碱基种类的方法。该方法以探针的荧光强度作为指标，可以简便且确切地确定未知碱基种类。
根据所述第7发明及第8发明，提供了以所述第3发明及第5发明的单链核苷酸序列作为捕获探针的DNA微阵列。借助于此，以捕获探针的荧光强度作为指标，可以简便且确切地进行目标核苷酸序列的单核苷酸多态性(SNP)、序列未知的核苷酸序列的测序、与目标核苷酸序列中的已知序列区段相同的区段的存在等。
根据所述第9发明，以探针核苷酸序列的荧光强度作为指标，可以简便且确切地对于样品中含有的目标核苷酸序列的量进行定量。
附图说明
图1表示的是，对于第3位上含有未知的碱基种类X的目标核苷酸序列，使其分别与第3位上含有核苷酸衍生物的探针序列杂交，确定碱基种类X的例子。由于含有T衍生物的探针序列发出最强的荧光信号，因此可以确定目标核苷酸序列的未知碱基种类X为腺嘌呤。
图2表示的是，对于第3位上含有未知的碱基种类X的目标核苷酸序列，使其分别与第3位上含有A衍生物及G衍生物的探针序列杂交，确定碱基种类X的例子。由于在上排含有A衍生物及G衍生物的探针序列发出最强的荧光信号，因此可以确定目标核苷酸序列的未知碱基种类X为胞嘧啶。由于在下排含有G衍生物的探针序列发出最强的荧光信号，因此可以确定目标核苷酸序列的未知碱基种类X为胸腺嘧啶。
图3表示的是，对于第4位上含有G/A多态性的双链核苷酸序列，使其分别与第4位上含有核苷酸衍生物的探针序列杂交，确定G/A多态性的例子。上排显示的G/G纯合体的情况下，该位置上含有C衍生物的探针发出最强的荧光信号，中排显示的G/A杂合体的情况下，含有C衍生物的探针和含有T衍生物的探针发出强荧光信号。另外，下排显示的A/A纯合体的情况下，从含有T衍生物的捕获探针得到强的信号。
图4表示的是，确定序列未知的6mer寡核苷酸(NNNNNN)的碱基序列的例子。对于第1位的X从在该位置上含有T衍生物的捕获探针得到强信号，由此，确定该寡核苷酸的第1位X为与胸腺嘧啶(T)互补接合的腺嘌呤(A)。同样地，通过检测第2～6位，确定该6mer寡核苷酸为由AGGCGA构成的序列。
图5表示的是，对于目的的已知序列区段，当目标核苷酸序列有一部分不一致时，确定其不一致的碱基的例子。因为第3位上含有T衍生物的探针和第6位上含有C衍生物的探针各自发出强信号，所以可以确认目标核苷酸序列的第3位被A取代，第6位被G取代。
图6表示的是，本发明的核苷酸衍生物的一个例子(PyU(5)、PyC(5))的合成工艺。Py为1-芘基，DMTr为4，4′-二甲氧基三苯甲基。
图7表示的是，本发明的核苷酸衍生物的一个例子(PyA(7))的合成工艺)。Py为1-芘基，DMTr为4，4′-二甲氧基三苯甲基。
图8表示的是，本发明的核苷酸衍生物的一个例子(PyG(8))的合成工艺。
图9表示的是荧光光谱，含有核苷酸衍生物PyC(5)的低聚脱氧核糖核苷酸(序列标识符1)，当互补链(序列标识符50)上与PyC(5)配对的核苷酸是脱氧鸟苷酸(G)时发出强发光信号。
图10表示的是其他的荧光光谱，含有核苷酸衍生物PyC(5)的低聚脱氧核糖核苷酸(序列标识符6)，当互补链(序列标识符51)上与PyC(5)配对的核苷酸是脱氧鸟苷酸(G)时发出强发光信号。
图11表示的是荧光光谱，含有核苷酸衍生物PyU(5)的低聚脱氧核糖核苷酸(序列标识符11)，当互补链(序列标识符50)上与PyU(5)配对的核苷酸是脱氧鸟苷酸(A)时发出强发光信号。
图12为图11显示的结果的荧光图象照片。
图13表示的是荧光光谱，含有核苷酸衍生物PyU(5)的低聚脱氧核糖核苷酸(序列标识符12)，当互补链(序列标识符51)上与PyU(5)配对的核苷酸是脱氧鸟苷酸(A)时，发出强发光信号。
图14表示的是荧光光谱，含有核苷酸衍生物PyA(7)的低聚脱氧核糖核苷酸(序列标识符13)，当互补链(序列标识符50)上与PyA(7)配对的核苷酸是脱氧胞苷酸(C)时，发出强发光信号。
图15表示的是荧光光谱，含有核苷酸衍生物PyG(8)的低聚脱氧核糖核苷酸(序列标识符11)，当互补链上与PyG(8)配对的核苷酸是脱氧胞苷酸(C)和脱氧胸苷酸(T)时，发出强发光信号。
图16表示的是本发明的核苷酸衍生物的一个例子(PyA(8))的合成工艺。DMTr为4，4′-二甲氧基三苯甲基。
图17表示的是荧光光谱，含有核苷酸衍生物PyA(8)的低聚脱氧核糖核苷酸(序列标识符32)，当互补链(序列标识符51)上与PyA(8)配对的核苷酸是脱氧胸苷酸(T)时，发出强发光信号。
图18表示的是，与含有本发明的核苷酸衍生物的探针DNA杂交的样品的浓度和荧光强度关系的图表。
具体实施方式
第1发明为，在嘧啶碱基或嘌呤碱基上经由连接臂结合了荧光色素嵌入剂的核苷酸衍生物，其特征为，作为单链核苷序列的成员存在，可识别该单链核苷酸序列的杂交互补链上的相应特定碱基种类，与其他的碱基种类比较能够发出相对强的荧光信号。具体为
可识别腺嘌呤(A)的胸腺嘧啶(T)衍生物(1)；
可识别鸟嘌呤(G)的胞嘧啶(C)衍生物(2)；
可识别胞嘧啶(C)的腺嘌呤(A)衍生物(3)；
可识别胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)的鸟嘌呤(G)衍生物(4)；及
可识别胸腺嘧啶(T)的腺嘌呤(A)衍生物(5)。
“荧光色素嵌入剂”为，可插入到双链核苷酸序列的邻接的核苷酸对间，且发出荧光的物质。作为这样的物质，可以使用产生荧光信号，且产生嵌入作用的芘(1-芘基)、蒽、萘等。或者，可以使用将公知的荧光物质结合在同样公知的嵌入剂上的物质。作为嵌入剂，例如可以使用吖啶橙、原黄素、溴化乙锭、放线菌素D等芳香族色素分子。另外，作为荧光物质，例如可以使用异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明衍生物(例如异硫氰酸罗丹明B、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明异构体R)等。另外，嵌入剂与荧光物质的结合可以利用，巯基与马来酰亚胺基的反应、二硫化吡啶基与巯基的反应、氨基与醛基的反应等进行，从公知的方法或本领域技术人员能够容易使用的方法、进而它们的改进方法中适当选择使用。
将嵌入剂连结于嘧啶碱基或嘌呤碱基的“连接臂”(linker)，例如可以使用碳链或聚合物等。进一步，经由连接臂连结嵌入剂的嘧啶碱基或嘌呤碱基的位置，可以从各自的非取代碳位置任意选择使用。即，嘧啶碱基时为第4位或第5位，嘌呤碱基时为第7位或第8位。
这样的核苷酸衍生物，更具体的，分别可以是所述的通式(1)～(5)各自表示的。即，式(1)为嘧啶碱基第5位取代的T衍生物，式(2)为嘧啶碱基第5位取代的C衍生物，式(3)为嘌呤碱基第7位取代的A衍生物，式(4)为嘌呤碱基第8位取代的G衍生物，式(5)为嘌呤碱基第8位取代的A衍生物。其中，式(1)～(4)的核苷酸衍生物为，连接臂部分为三键，与其相对，式(5)的核苷酸衍生物的连接臂部分为直链状。在以下的记载中，使用芘(Py)作为荧光色素嵌入剂时，有时将式(1)～(5)的核苷酸衍生物各自记载为PyU(5)、PyC(5)、PyA(7)、PyG(8)、PyA(8)。
另外，与所述通式(1)～(5)所示的核苷酸衍生物不同，作为只选择性识别胸腺嘧啶(T)的核苷酸衍生物，可以例示出能够用以下的通式(18)表示的鸟嘌呤(G)衍生物。该式(18)的G衍生物具有与所述式(4)的G衍生物相同的基本结构，与式(4)的G衍生物连接臂部分为三键相对，式(18)的G衍生物连接臂部分为与式(5)的A衍生物相同的直链状。所以，式(18)的G衍生物既是式(4)的G衍生物的变形，也是式(5)的A衍生物的变形。
Figure A20058000743600261
    (18)
这些核苷酸衍生物，使用了嘧啶碱基或嘌呤碱基、连接臂、及适宜的荧光色素嵌入剂，例如可以利用后述实施例中记载的方法合成。另外，所述的通式(1)～(5)所示的核苷酸衍生物的情况下，通过以所述的通式(6)～(10)各自表示的核苷衍生物作为前体，可以容易地制成。另外，式(18)的G衍生物的情况下，也可以用下述式(19)的核苷衍生物作为前体。
    (19)
其中，通式(1)～(1)、(18)、(19)中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9表示氢原子或取代基，它们可以相同或不同；R10为氢原子或羟基；X为从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷氨基中选择的连结基团；整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷氨基时为0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时为1～5。其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9的取代基为，卤原子、含氧基、含氮基、含硫基及也可以含有这些原子或取代基的烃基或杂环基等。进一步详细地是，取代基为卤原子、烷氧基、酯基、氨基、取代氨基、硝基、酰胺基、氰基、氨基甲酸酯基、脲基、巯基、硫醚基、硫酯基等。另外，也可以是R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7及R8并非同时为氢原子，而是R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9的相邻的取代基结合而形成可以含有取代基的苯基。
进一步，关于所述式(1)～(10)的X，具体的可以例示出以下的式(11)～(17)的连结基团。另外，也可以不存在该X表示的连结基团，而是以嘧啶碱基或嘌呤碱基与荧光色素嵌入剂经由连接臂直接连接。
第3发明的单链核苷酸序列为，具有一个或多个从所述核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(4)组成的群中选出的一个以上的核苷酸衍生物的3～200个，优选10～100个的核苷酸序列(寡核苷酸或核苷酸片段)。另外，第5发明的单链核苷酸序列为，具有一个或多个从所述的核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(5)组成的群中选出的一个以上的核苷酸衍生物的3～200个，优选10～100个的核苷酸序列。这些单链核苷酸序列，例如可以根据如Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47：411-418；Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105：661；Belousov(1997)Nucleic AcidRes.25：3440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19：373-380；Blommers(1994)Biochemistry33：7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.68：90；Brown(1979)Meth.Enzymol.68：109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.22：1895；美国专利第4,458,066号中记载的众所周知的化学合成技术，在体外(in vitro)合成。另外，也可以使用DNA合成装置自动合成。
通过利用以上的单链核苷酸序列，可以实施本申请的第4发明及第6发明的碱基种类确定方法。
该第4发明的方法为，使含有未知碱基种类X的目标核苷酸序列与在碱基种类X的同样位置上具有核苷酸衍生物的第3发明的单链核苷酸序列(以下有时记为“探针序列”)杂交，当核苷酸衍生物(1)～(4)各自的荧光色素发出最强荧光信号时，如下确定碱基种类X。
(i)T衍生物(1)的荧光色素发光最强时为腺嘌呤；
(ii)C衍生物(2)的荧光色素发光最强时为鸟嘌呤；
(iii)A衍生物(3)的荧光色素发光最强时为胞嘧啶；
(iv)G衍生物(4)的荧光色素发光最强时为胞嘧啶或胸腺嘧啶。
这时所说的“发光最强”是指，例如在观察到，与其他的核苷酸比较，当PyU(5)时为约3倍以上，PyC(5)时为1.5倍以上，PyA(7)时为2.5倍以上，PyG(8)时为2倍以上的发光信号的情况下，可如上所述地确定各自配对的碱基种类。
具体讲，例如在图1所示的例子中，对于第3位上含有未知的碱基种类X的目标核苷酸序列，准备第3位上各自含有A衍生物(3)、T衍生物(1)、G衍生物(3)、C衍生物(2)的探针序列，使各探针序列与目标核苷酸序列杂交时，由于含有T衍生物(1)的探针序列发出最强的荧光信号，因此可以确定目标核苷酸序列的未知碱基种类X为腺嘌呤。
但是，所述第4发明的方法中，A衍生物(3)和G衍生物(4)同时识别胞嘧啶，G衍生物(4)各自识别出胞嘧啶和胸腺嘧啶。因此，第4发明的方法为，例如如图2所示的，使在同样位置上各自含有A衍生物(3)和G衍生物(4)的两条单链核苷酸序列各自与相同的互补链杂交，根据各自的荧光信号强度的组合，如下确定碱基种类X。
(v)A衍生物(3)和G衍生物(4)双方的荧光色素发光最强时为胞嘧啶；
(vi)只有G衍生物(4)的荧光色素发光最强时为胸腺嘧啶。
另一方面，第6发明的方法为，使用含有核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(4)的第5发明的单链核苷酸序列的方法，可以如下一一对应地确定目标核苷酸序列的未知碱基种类X。
(i)T衍生物(1)的荧光色素发光最强时为腺嘌呤；
(ii)C衍生物(2)的荧光色素发光最强时为鸟嘌呤；
(iii)A衍生物(3)的荧光色素发光最强时为胞嘧啶；
(iv)A衍生物(5)的荧光色素发光最强时为胸腺嘧啶。
根据以上的方法，可以检测目标核苷酸序列中的SNP，确定未知序列的序列，确定是否存在与已知序列区段相同的区段，或确定已知序列区段内的未知序列的序列等。它们可以作为使用了所述探针序列的普通杂交分析来实施，特别是可以在以所述探针序列作为捕获探针的DNA微阵列中实施。
进一步，也可以使用G衍生物(18)来代替所述A衍生物(5)，判定胸腺嘧啶。
第7发明及第8发明的DNA微阵列为，除以所述第3发明及第5发明的单链核苷酸序列作为捕获探针外，可用与通常的DNA微阵列同样方法进行制作。作为DNA微阵列的制作方法，已知在固相载体表面直接合成捕获探针的方法(原位合成法)、将预先制作的捕获探针固定在固相载体表面的方法，本发明的DNA微阵列优选使用后者的方法进行制作。将预先制作的捕获探针固定在固相载体表面时，合成引入了官能基的捕获探针，将捕获探针点样在进行了表面处理的固相载体表面上，使其共价结合(例如，Lamture，J.B.et al.Nucl.Acids Res.22：2121-2125，1994；Guo，Z.et al.Nucl.Acids Res.22：5456-5465，1994)。一般地，捕获探针是经由间隔基或交联剂共价结合在进行了表面处理的固相载体上。已知将聚丙烯酰胺凝胶微片整齐排列在玻璃表面，使捕获探针共价结合于此的方法(Yershov，G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4913，1996)。另外，已知在二氧化硅微阵列上制作微小电极的阵列，在电极上设置含有链抗生物素蛋白的琼脂糖浸透层作为反应部位，通过使该部位成正电荷而固定生物素化捕获电极，控制该部位的荷电，以高速严格地进行杂交的方法(Sosnowski，R.G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：1119-1123，1997)。本发明的DNA微阵列，可以利用以上的任一种方法制作。
另外，该DNA微阵列与目标核苷酸序列的杂交，也可以是与通常的DNA微阵列同样进行的。即，使目标核苷酸序列与DNA微阵列接触，使其与DNA微阵列的捕获探针杂交。杂交为，可以通过向96孔或384孔塑料盘中分注，将标记cDNA水溶液点样在微阵列上进行实施。点样的量可以是1～100nl左右。杂交优选在室温～70℃的温度范围内，6～20小时的范围内实施。杂交结束后，用表面活性剂和缓冲液的混合溶液进行清洗，除去未反应的标记cDNA。作为表面活性剂，优选使用十二烷基硫酸钠(SDS)。作为缓冲液，可以使用柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、tris缓冲液、两性离子缓冲液等，优选使用柠檬酸缓冲液。
但是，本发明的DNA微阵列的情况下，由于与目标核苷酸序列杂交的的捕获探针发出荧光信号，因此不需要像通常的DNA微阵列那样在目标核苷酸序列上附加标记示踪物(label)。
该第7发明及第8发明的DNA微阵列的一个实施方式为，检测目标核苷酸序列的单核苷酸多态性(SNP)的DNA微阵列。即，该DNA微阵列的捕获探针的组为，与目标核苷酸序列的至少含有SNP核苷酸的区段是互补的，但每个捕获探针为，与目标核苷酸序列的SNP核苷酸对应的位置上的核苷酸是各自不同的核苷酸衍生物。所以，可以以捕获探针中的核苷酸衍生物发出的荧光信号强度作为指标，检测目标寡核苷酸序列的SNP。例如，如图3所示的G/A多态性的情况下，G/G纯合体的情况下该位置上含有C衍生物的捕获探针发出强荧光信号，G/A杂合体的情况下，含有C衍生物的捕获探针和含有T衍生物的捕获探针发出强荧光信号。另外，A/A纯合体的情况下，从含有T衍生物的捕获探针得到强信号。
本发明的DNA微阵列的其他的实施方式为，确定序列未知的n(n＝3～100)个的核苷酸序列的DNA微阵列。即，该DNA微阵列中，捕获探针为，核苷酸序列完全不同的至少4n个的组，其特征为，每个捕获探针为第1位至第n位的顺次不同的核苷酸衍生物。例如，如图4例示的序列未知的6mer寡核苷酸(NNNNNN)的情况，当从对应于第1位的X在该位置含有T衍生物的捕获探针得到强信号时，该寡核苷酸的第1位X为与胸腺嘧啶(T)互补的腺嘌呤(A)。同样地，通过检查第2～6位，可以确定该6mer寡核苷酸NNNNNN为由AGGCGA构成的序列。另外，通过比较如图2所示的A衍生物(3)和G衍生物(4)的荧光，可以确定含有胸腺嘧啶(T)的未知序列。另外，通过使用A衍生物(3)和A衍生物(5)，可以直接区别胞嘧啶和胸腺嘧啶。其中，用通常的测序仪不能确定短链(3～100)的寡核苷酸序列，但是通过使用本发明的DNA微阵列，能够简便正确地确定短链寡核苷酸的序列。
本发明的DNA微阵列的进一步的其他实施方式为，检测目标核苷酸序列中，是否存在与由n(n＝3～100)个核苷酸构成的已知序列区段(区域(domain)或模体(motif))相同的区段的DNA微阵列。即，该DNA微阵列的捕获探针的组是与已知序列区段互补的，其特征为，每个捕获探针为第1位至第n位的顺次不同的核苷酸衍生物。所以，例如目标核苷酸序列具有与目的的已知序列区段完全相同的序列时，从与已知序列各自对应的位置上含有规定核苷酸衍生物的全部捕获探针得到强信号。另一方面，如图5所示，第3位被A取代，第6位被G取代的序列的情况下，第3位上含有T衍生物(1)的捕获探针、及第6位上含有C衍生物(2)的捕获探针各自发出强信号。这样，不仅可以检测出与已知序列区段完全一致的序列的存在，而且可以简便容易地检测出一部分不一致的相同序列的存在。
进一步，本发明的DNA微阵列的其他的实施方式为，用来确定具有由n(n＝3～100)个核苷酸构成的未知序列区段和已知序列区段的目标核苷酸序列中的未知序列区段的序列的DNA微阵列。即，在DNA微阵列中，捕获探针的组为，具有对于目标核苷酸序列中已知序列区段的互补序列、及核苷酸序列完全不同的探针序列区段的至少4n个的组，各探针序列区段的第1位至第n位的至少一个为核苷酸衍生物。这时，目标核苷酸序列和捕获探针通过已知序列区段的互补性进行杂交，与上述相同地借助由确定未知序列用的捕获探针发出的荧光信号，确定其序列。
第9发明的方法的特征为，使所述第3发明或第5发明的单链核苷酸序列(探针核苷酸序列)与序列已知的目标核苷酸序列杂交，测定探针核苷酸序列所含的核苷酸衍生物的荧光强度，以该荧光强度作为指标，对目标核甘酸序列进行定量。即，如后述的实施例13所示，使含有本发明的核苷酸衍生物的探针与目标核苷酸序列杂交时，荧光强度依赖于目标核苷酸序列的量，有所升高。所以，例如，只要作出使作为定量对象的目标核苷酸序列与特定探针杂交时的目标核苷酸序列量和荧光强度相关的标准曲线，通过测定被测样品与探针接触时的荧光强度，可以正确地确定样品中的目标核苷酸序列的量。其中，该第9发明的方法可以在如后述的实施例13的固相体系(使用DNA微阵列等的体系)中，或者在液相体系中进行。
实施例
以下，关于本发明的核苷酸衍生物列举实施例，但本发明不被以下的例子限定。
实施例1
核苷酸衍生物(PyU(5)、PyC(5)、PyA(7))的合成
按照图6及7，如下合成核苷酸衍生物(PyU(5)、PyC(5)、PyA(7))。其中，化合物的编号与图6及7的编号对应。
方案i(化合物2的合成)
将炔丙胺(1，和光纯药)和1-芘基羧酸(2，Aldrich公司)(1∶1)在缩合剂PyBOP(1当量，NOVA Biochem)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中于室温下搅拌2.5小时，萃取，用柱色谱纯化后，得到生成物2(91％)。
方案ii(化合物4：PyU(5)的核苷酸衍生物的合成)
将3(5-碘-2′-脱氧尿苷(西格玛)在4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(东京化成)和吡啶中搅拌得到)和2(1∶1)在(四三苯基磷)钯(0.15当量，和光纯药)、碘化铜(0.3当量，和光纯药)、三乙胺(1当量，和光纯药)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中于室温下搅拌10小时，萃取，用柱色谱纯化后，得到生成物4(82％)。
方案iii(化合物5的合成)
将4在3％三氯乙酸-二氯甲烷溶液(Glen Research公司)中于室温下搅拌5分钟，萃取，柱色谱纯化后，得到生成物5(27％)。
方案iv(化合物6：PyU(5)的合成)
将4和2-氰乙基四异丙基亚磷酰二胺(Aldrich公司)(1∶1)在四唑(1当量，同仁化学)存在下，在乙腈中于室温下搅拌2小时，以此状态用于DNA合成仪。
方案v(化合物8的合成)
把5-碘-2-脱氧胞嘧啶核苷(7，生化学工业)在N，N-二甲基甲酰胺二乙基缩醛(1当量，东京化成)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中于55度搅拌2小时，浓缩。粗产物8供下面的反应使用。
方案vi(化合物9的合成)
将化合物8和4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(东京化成)(1∶1)，在吡啶中于室温下搅拌1小时，萃取，用柱色谱纯化，得到生成物9(2步共50％)。
方案vii(化合物10：PyC(5)的核苷衍生物的合成)
将化合物9和2(1∶1)在(四三苯基磷)钯(0.15当量，和光纯药)、碘化铜(0.3当量，和光纯药)、三乙胺(1当量，和光纯药)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中于室温下搅拌12小时，萃取，用柱色谱纯化后，得到生成物10(47％)。
方案viii(化合物11：PyC(5)的合成)
将化合物4和2-氰乙基四异丙基亚磷酰二胺(Aldrich公司)(1∶1)在四唑(1当量，同仁化学)存在下，在乙腈中于室温下搅拌2小时，以此状态用于DNA合成仪。
方案ix(化合物13的合成)
将化合物12(Ramzaeva and Seela，Helv.Chim.Acta78，1083-1090(1995))和化合物2(1∶2)在(四三苯基磷)钯(0.1当量，和光纯药)、碘化铜(0.1当量，和光纯药)、三乙胺(2当量，和光纯药)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中于室温下搅拌6小时，萃取，用柱色谱纯化后，得到生成物13(88％)。
方案x(化合物14的合成)
将化合物13在N，N-二甲基甲酰胺二乙基缩醛(1当量，东京化成)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中于50度搅拌3小时，浓缩。粗产物供下面的反应使用。
方案xi(化合物15：PyA(7)的核苷衍生物的合成)
将化合物14和4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(东京化成)(1∶1)在N，N-二甲氨基吡啶催化剂量存在下，在吡啶中于室温下搅拌1小时，萃取，用柱色谱纯化，得到生成物15(2步共73％)。
方案xii(化合物16：PyA(7)的合成)
将化合物4和2-氰乙基四异丙基亚磷酰二胺(Aldrich公司)(1∶1)，在四唑(1当量，同仁化学)存在下，在乙腈中于室温下搅拌2小时，以此状态用于DNA合成仪。
实施例2
核苷酸衍生物(PyG(8)的合成)
按照图8，如下合成核苷酸衍生物(PyG(8))。其中，化合物的编号与图8的编号对应。
方案1(化合物2的合成)
使用1-溴芘作为初始原料，通过与三甲基甲硅烷基乙炔进行芳卤与末端炔偶联反应(Sonogashira coupling)得到化合物1。接着，在甲醇中利用甲醇钠除去作为保护基的三甲基甲硅烷基，得到化合物2(芘单元)(收率70％)。
方案2(化合物6：PyG(8)的核苷衍生物的合成)
向2′-脱氧鸟苷中加入N-溴琥珀酰亚胺，通过使其在水中反应得到化合物3(收率60％)。接着，利用叔丁基二甲基甲硅烷基氯和咪唑通过叔丁基二甲基甲硅烷基氯保护化合物3的糖的3′位和5′位的羟基后，与化合物2进行芳卤与末端炔偶联反应得到化合物5(收率61％)。利用TBAF除去作为化合物5的羟基保护基的叔丁基二甲基甲硅烷基，得到作为单体的化合物6(收率60％)。
方案3(化合物10：PyG(8)的合成)
使化合物3在DMF中与DMF二乙基缩醛反应，得到化合物7。利用4，4′-二甲氧基三苯甲基氯向化合物7的5′位羟基引入4，4′-二甲氧基三苯甲基，得到化合物8(收率22％)。通过芳卤与末端炔偶联反应向化合物8的8位引入化合物2，得到化合物9(收率58％)。最后，在乙腈和二氯甲烷中，以四唑作为酸性活化剂，使其与N，N，N′，N′-四异丙基氰乙基亚磷酰二胺进行反应，合成作为Amidite单元的化合物10。将其作为0.1M的乙腈溶液供给DNA合成仪。
实施例3
寡脱氧核糖核苷酸的合成
使用实施例1中制成的核苷酸衍生物(PyU(5)、PyC(5)、PyA(7))，及实施例2中制成的核苷酸衍生物(PyG(8))，合成含有核苷酸衍生物的寡脱氧核糖核苷酸。寡脱氧核糖核苷酸是，使用日本应用生物系统公司(アプライドバイオシステムズ社)的392NDA/RNA合成仪按照通常的亚磷酰胺法合成的。从固相载体上的切取及脱保护是，通过在25％的氨中进行若干小时的孵育进行的，然后使用高效液相色谱仪纯化。
实施例4
含有PyC(5)的寡脱氧核糖核苷酸(1)的荧光分析
将根据实施例3得到的含有PyC(5)的寡脱氧核糖核苷酸(5′-CGCAAC PyCCAACGC-3′：序列标识符1)溶解在含有0.1M氯化钠的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，制成2.5μM的溶液。使用荧光分光光度计，在约25℃下测定该溶液的荧光光谱，结果激发波长为329nm、发光波长为400nm，在400nm的荧光强度为7.0。
在上述溶液中分别添加与含有PyC(5)的寡脱氧核糖核苷酸的除PyC(5)以外的部分互补的，另行合成的寡脱氧核糖核苷酸：
(A′)：5′-GCGTTGAGTTGCG-3′(序列标识符2)
(T′)：5′-GCGTTGTGTTGCG-3′(序列标识符3)
(G′)：5′-GCGTTGGGTTGCG-3′(序列标识符4)
(C′)：5′-GCGTTGCGTTGCG-3′(序列标识符5)
使其各自成为2.5μM，于漩涡式混合机中混合。
使用荧光分光光度计测定这些溶液的荧光光谱，加入寡脱氧核糖核苷酸(A′)时在400nm的荧光强度为4.1。加入寡脱氧核糖核苷酸(T′)时在400nm的荧光强度为2.6，加入寡脱氧核糖核苷酸(G′)时在400nm的荧光强度为18.3，加入寡脱氧核糖核苷酸(C′)时在400nm的荧光强度为1.4。
这样，含有PyC(5)的寡脱氧核糖核苷酸，当互补链上的与PyC(5)配对的核苷酸是脱氧鸟苷酸时观测到了强发光，与此相比，当为脱氧腺苷酸时荧光消光78％，为脱氧胸苷酸时荧光消光86％，为脱氧胞苷酸时荧光消光92％。荧光光谱如图9所示。
实施例5
含有PyC(5)的寡脱氧核糖核苷酸(2)的荧光分析
将根据实施例3得到的含有PyC(5)的寡脱氧核糖核苷酸(5′-CGCAAT PyCTAACGC-3′：序列标识符6)溶解在含有0.1M氯化钠的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，制成2.5μM的溶液。使用荧光分光光度计，在约25℃下测定该溶液的荧光光谱，结果激发波长为327nm、发光波长为405nm，在405nm的荧光强度为9.2。
在上述溶液中分别添加与含有PyC(5)的寡脱氧核糖核苷酸的除PyC(5)以外的部分互补的，另行合成的寡脱氧核糖核苷酸：
(A′)：5′-GCGTTAAATTGCG-3′(序列标识符7)
(T′)：5′-GCGTTATATTGCG-3′(序列标识符8)
(G′)：5′-GCGTTAGATTGCG-3′(序列标识符9)
(C′)：5′-GCGTTACATTGCG-3′(序列标识符10)
使其各自成为2.5μM，于漩涡式混合机中混合。
使用荧光分光光度计测定这些溶液的荧光光谱，其结果加入寡脱氧核糖核苷酸(A′)时在405nm的荧光强度为10.9。加入寡脱氧核糖核苷酸(T′)时在400nm的荧光强度为8.8，加入寡脱氧核糖核苷酸(G′)时在400nm的荧光强度为18.2，加入寡脱氧核糖核苷酸(C′)时在400nm的荧光强度为11.9。
这样，含有PyC(5)的寡脱氧核糖核苷酸，当互补链上的与PyC(5)配对的核苷酸为脱氧鸟苷酸时观测到了强发光，与此相比，当为脱氧腺苷酸时荧光消光40％，为脱氧胸苷酸时荧光消光52％，为脱氧胞苷酸时荧光消光35％。荧光光谱如图10所示。
其中，比较该实施例5与所述实施例4时可以确认，核苷酸衍生物PyC(5)对于特定的碱基种类(G)发出强荧光信号，而与与其配对的碱基种类的前后的碱基种类无关。
实施例6
含有PyU(5)的寡脱氧核糖核苷酸(1)的荧光分析
将根据实施例3得到的含有PyU(5)的寡脱氧核糖核苷酸(5′-CGCAAC PyUCAACGC-3′：序列标识符11)溶解在含有0.1M氯化钠的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，制成2.5μM的溶液。使用荧光分光光度计，在约25℃下测定该溶液的荧光光谱，其结果激发波长为344nm、发光波长为398nm，在398nm的荧光强度为7.4。
在上述溶液中分别添加与含有PyU(5)的寡脱氧核糖核苷酸的除PyU(5)以外的部分互补的，另行合成的寡脱氧核糖核苷酸：
(A′)：5′-GCGTTGAGTTGCG-3′(序列标识符2)
(T′)：5′-GCGTTGTGTTGCG-3′(序列标识符3)
(G′)：5′-GCGTTGGGTTGCG-3′(序列标识符4)
(C′)：5′-GCGTTGCGTTGCG-3′(序列标识符5)
使其各自成为2.5μM，于漩涡式混合机中混合。
使用荧光分光光度计测定这些溶液的荧光光谱，其结果加入寡脱氧核糖核苷酸(A′)时在398nm的荧光强度为29.8。加入寡脱氧核糖核苷酸(T′)时在398nm的荧光强度为4.5，加入寡脱氧核糖核苷酸(G′)时在398nm的荧光强度为3.7，加入寡脱氧核糖核苷酸(C′)时在398nm的荧光强度为3.3。
这样，含有PyU(5)的寡脱氧核糖核苷酸，当互补链上的与PyU(5)配对的核苷酸为脱氧腺苷酸时观测到了强发光，与此相比，当为脱氧胸苷酸时荧光消光85％，为脱氧鸟苷酸时荧光消光88％，为脱氧胞苷酸时荧光消光89％。荧光光谱如图11所示。另外，荧光照片图象如图12所示。
实施例7
含有PyU(5)的寡脱氧核糖核苷酸(2)的荧光分析
将根据实施例3得到的含有PyU(5)的寡脱氧核糖核苷酸(5′-CGCAAT PyUTAACGC-3′：序列标识符12)溶解在含有0.1M氯化钠的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，制成2.5μM的溶液。使用荧光分光光度计，在约25℃下测定该溶液的荧光光谱，其结果激发波长为327nm、发光波长为398nm，在398nm的荧光强度为6.3。
在上述溶液中分别添加与含有PyU(5)的寡脱氧核糖核苷酸的除PyU(5)以外的部分互补的，另行合成的寡脱氧核糖核苷酸：
(A′)：5′-GCGTTAAATTGCG-3′(序列标识符7)
(T′)：5′-GCGTTATATTGCG-3′(序列标识符8)
(G′)：5′-GCGTTAGATTGCG-3′(序列标识符9)
(C′)：5′-GCGTTACATTGCG-3′(序列标识符10)使其各自成为2.5μM，于漩涡式混合机中混合。
使用荧光分光光度计测定这些溶液的荧光光谱，其结果加入寡脱氧核糖核苷酸(A′)时在398nm的荧光强度为26.0。加入寡脱氧核糖核苷酸(T′)时在398nm的荧光强度为2.7，加入寡脱氧核糖核苷酸(G′)时在398nm的荧光强度为4.8，加入寡脱氧核糖核苷酸(C′)时在398nm的荧光强度为10.6。
这样，含有PyU(5)的寡脱氧核糖核苷酸，当互补链上的与PyU(5)配对的核苷酸为脱氧腺苷酸时观测到了强发光，与此相比，为脱氧胸苷酸时荧光消光90％，为脱氧鸟苷酸时荧光消光82％，为脱氧胞苷酸时荧光消光59％。荧光光谱如图13所示。
其中，比较该实施例7与所述实施例6时可以确认，核苷酸衍生物PyU(5)对于特定的碱基种类(A)发出强荧光信号，而与与其配对的碱基种类的前后的碱基种类无关。
实施例8
含有PyA(7)的寡脱氧核糖核苷酸的荧光分析
将根据实施例3得到的含有PyA(7)的寡脱氧核糖核苷酸(5′-CGCAAC PyACAACGC-3′：序列标识符13)溶解在含有0.1M氯化钠的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，制成制成2.5μM的溶液。使用荧光分光光度计，在约25℃下测定该溶液的荧光光谱，其结果激发波长为353nm、发光波长为395nm，在395nm的荧光强度为4.3。
在上述溶液中分别添加与含有PyA(7)的寡脱氧核糖核苷酸的除PyA(7)以外的部分互补的，另行合成的寡脱氧核糖核苷酸：
(A′)：5′-GCGTTGAGTTGCG-3′(序列标识符2)
(T′)：5′-GCGTTGTGTTGCG-3′(序列标识符3)
(G′)：5′-GCGTTGGGTTGCG-3′(序列标识符4)
(C′)：5′-GCGTTGCGTTGCG-3′(序列标识符5)
使其各自成为2.5μM，于漩涡式混合机中混合。
使用荧光分光光度计测定这些溶液的荧光光谱，其结果加入寡脱氧核糖核苷酸(A′)时在395nm的荧光强度为2.5。加入寡脱氧核糖核苷酸(T′)时在395nm的荧光强度为1.8，加入寡脱氧核糖核苷酸(G′)时在395nm的荧光强度为7.4，加入寡脱氧核糖核苷酸(C′)时在395nm的荧光强度为18.2。
这样，含有PyA(7)的寡脱氧核糖核苷酸，当互补链上的与PyU(5)配对的核苷酸为脱氧胞苷酸时观测到了强发光，与此相比，为脱氧胸苷酸时荧光消光90％，为脱氧腺苷酸时荧光消光86％，为脱氧胞苷酸时荧光消光59％。荧光光谱如图14所示。
实施例9
含有PyG(8)的寡脱氧核糖核苷酸的荧光分析
将根据实施例3得到的含有PyG(8)的寡脱氧核糖核苷酸(5′-CGCAAT PyGTAACGC-3′：序列标识符14)溶解在含有0.1M氯化钠的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，制成2.5μM的溶液。使用荧光分光光度计，在约25℃下测定该溶液的荧光光谱，其结果激发波长为420nm、发光波长为430nm及460nm，在430nm的荧光强度为16.0，在460nm的荧光强度为15.3。
在上述溶液中分别添加与含有PyG(8)的寡脱氧核糖核苷酸的除PyG(8)以外的部分互补的，另行合成的寡脱氧核糖核苷酸：
(A′)：5′-GCGTTAAATTGCG-3′(序列标识符7)
(T′)：5′-GCGTTATATTGCG-3′(序列标识符8)
(G′)：5′-GCGTTAGATTGCG-3′(序列标识符9)
(C′)：5′-GCGTTACATTGCG-3′(序列标识符10)
使其各自成为2.5μM，于漩涡式混合机中混合。
使用荧光分光光度计测定这些溶液的荧光光谱，其结果加入寡脱氧核糖核苷酸(A′)时在430nm的荧光强度为65.0。加入寡脱氧核糖核苷酸(T′)时在430nm的荧光强度为144.0，加入寡脱氧核糖核苷酸(G′)时在430nm的荧光强度为65.0，加入寡脱氧核糖核苷酸(C′)时在430nm的荧光强度为136.0。
这样，含有PyG(8)的寡脱氧核糖核苷酸，当互补链上的与PyG(8)配对的核苷酸为脱氧胸苷酸及脱氧胞苷酸时观测到了强发光，与此相比，为脱氧鸟苷酸及脱氧腺苷酸时荧光各自消光55％。相对的荧光光谱如图15所示。
实施例10
使用DNA微阵列确定了序列标识符15的寡脱氧核苷酸(样品DNA片段)的第8-11位的未知序列。作为DNA微阵列的捕获探针，使用的是含有序列标识符16-31的核苷酸序列的DNA片段(探针DNA片段)(参考表1)。其中，样品DNA片段含有序列标识符15的核苷酸序列，全长50b，样品DNA片段1-16各自含有序列标识符16-31的核苷酸序列，全长68-70b。
1.探针DNA片段的制备
使用日本应用生物系统公司的392DNA/RNA合成仪，按照通常的亚磷酰胺法合成各自含有序列标识符16-31核苷酸序列的探针DNA片段1-16。从固相载体上的切取及脱保护是在25％的氨中进行孵育来进行的，然后使用高效液相色谱仪纯化。
其中，序列标识符16-31的各自的第8位(T、G、C、A)为各核苷酸衍生物(PyU(5)、PyC(5)、PyA(7)、PyG(8))。同样地，序列标识符20-23的第9位、序列标识符24-27的第10位、序列标识符28-31的第11位的T、G、C、A各自为PyU(5)、PyC(5)、PyA(7)、PyG(8)(参考表1)。
2.固定用基板的制备
将在10％NaOH-60％乙醇水溶液中浸渍2小时，用纯水清洗10次的76×26×1mm大小的载玻片(松波硝子工业社制)，在10％聚-L-赖氨酸水溶液中浸渍1小时。用纯水清洗10次后，以800rpm离心5分钟，除去水分，室温干燥，制成固定用基板。
3.DNA微阵列的制备
将所述1中制备的各个探针DNA片段调整为最终浓度50pmol/μl，在所述2中制备的基板上各自点样200pl(10nmol)。然后，在80℃下进行1小时的干燥处理，向各点样中添加水，将DNA片段固定在基板上。将该基板在1％BSA封闭液(50mg/ml)5ml、10％SDS 1.25ml中振荡45分钟(42℃)。然后，用95℃纯水、95％乙醇分别浸渍1分钟，离心(800rpm，1分钟)，制成作为目的物的DNA微阵列。
4.样品DNA片段的制备
在含有由含有序列标识符15的核苷酸序列全长50b的寡脱氧核糖核苷酸构成的样品DNA片段(15fmol/10.5μl)的样品管中，添加20×SSC(3.75μl)及10％SDS(0.75μl)。用95℃加热模块(heat block)加热2分钟后，于室温放置5分钟，离心，制成样品液(最终浓度：1nM)。
5.杂交
向所述3中制备的DNA微阵列上，将所述2中制备的样品液以每点12μl进行点样，盖上盖玻片进行杂交反应(65℃，16小时)。反应结束后，在2×SSC-0.1％SDS溶液中浸渍5分钟、20分钟，0.2×SSC-0.1％SDS溶液中浸渍20分钟，55℃下进一步浸渍2次，每次20分钟。以相同的溶液冲洗后，进一步用0.05×SSC溶液冲洗。900rpm离心1分钟，放置使其干燥。
6.测定
使用荧光显微镜BX-50(奥林帕斯公司制)，计测各DNA点样的荧光强度，取得图像文件后，进行信号的数值化处理。结果如表1所示。
表1
DNA片段 序列标识符 碱基序列 荧光强度
 样品     15   3′-TCAGTAANNNNCGCCTAATG-5′
样品1样品2样品3样品4     16171819   5′-AGTCATTTTGCCGCCTAATG-3′5′-AGTCATTGTGCCGCCTAATG-3′5′-AGTCATTCTGCCGCCTAATG-3′5′-AGTCATTATGCCGCCTAATG-3′   21012000180240
样品5样品6样品7样品8     20212223   5′-AGTCATTATGCCGCCTAATG-3′5′-AGTCATTAGGCCGCCTAATG-3′5′-AGTCATTACGCCGCCTAATG-3′5′-AGTCATTAAGCCGCCTAATG-3′   30000250300260
样品9样品10样品11样品12     24252627   5′-AGTCATTATTCCGCCTAATG-3′5′-AGTCATTATGCCGCCTAATG-3′5′-AGTCATTATCCCGCCTAATG-3′5′-AGTCATTATACCGCCTAATG-3′   2001800023013000
样品13样品14样品15样品16     28293031   5′-AGTCATTATGTCGCCTAATG-3′5′-AGTCATTATGGCGCCTAATG-3′5′-AGTCATTATGCCGCCTAATG-3′5′-AGTCATTATGACGCCTAATG-3′   13012020300180
从表1显示的荧光强度的结果可以确认，样品DNA片段的序列标识符15的第8-11位的未知核苷酸如下。
(1)位于探针DNA片段1-4的第8位上的各核苷酸衍生物的荧光强度为，探针DNA片段2的PyG(8)高，探针DNA片段4的PyA(7)明显低，因此确定样品DNA片段的第8位是胸腺嘧啶(T)。
(2)位于探针DNA片段5-8的第9位上的各核苷酸衍生物的荧光强度为，探针DNA片段5的PyU(5)最高，因此确定样品DNA片段的第9位是腺嘌呤(A)。
(3)位于探针DNA片段9-12的第10位上的各核苷酸衍生物的荧光强度为，探针DNA片段10的PyG(8)及探针DNA片段12的PyA(7)最高，因此确定样品DNA片段的第10位是胞嘧啶(C)。
(4)位于探针DNA片段13-16的第11位上的各核苷酸衍生物的荧光强度为，探针DNA片段15的PyC(5)最高，因此确定样品DNA片段的第11位是鸟嘌呤(G)。
另外，从这个结果可以确认，本发明的核苷酸衍生物对于特定的碱基种类发出强荧光，与与其配对的碱基种类的前后的碱基种类无关。
实施例11
核苷酸衍生物(PyA(8))的合成
按照图16，如下合成核苷酸衍生物(PyA(8))。其中，化合物的编号与图16的编号对应。
方案1(化合物2的合成)
将化合物1(2′-脱氧腺苷一水合物：2.0g)和N-溴琥珀酰亚胺(1.57g)(1.2当量)，在甲醇中于50℃下搅拌16小时，得到化合物2(收率80％)。
方案2(化合物3的合成)
将化合物2(299mg)、N-(2-丙炔基)-1-芘基羧酰胺(257mg)(1.5当量)、四(三苯基磷)钯(70mg)(0.1当量)、碘化铜(I)(21mg)(0.2当量)、三乙胺(0.8mL)，在二甲基甲酰胺中于室温搅拌5小时，得到化合物3(收率89％)。
方案3(化合物4的合成)
将化合物3(250mg)、钯-碳(50mg)，在甲醇中，氢气环境下，于室温搅拌16小时，得到化合物4(收率67％)。
方案4(化合物5的合成)
将化合物4(120mg)、二甲基甲酰胺二甲基缩醛(1.8mL)，在二甲基甲酰胺中，于50℃下搅拌2小时，得到化合物5(收率82％)。
方案5(化合物6的合成)
将化合物5(109mg)、二甲氧基三苯甲基氯(69mg)(1.1当量)、二甲基氨基吡啶(6.2mg)(0.25当量)，在吡啶中于室温搅拌16小时，得到化合物6(收率47％)。
方案6(化合物7：PyA(8)的合成)
将化合物6(30mg)、四唑(2.8mg)、四二异丙基氰乙基亚磷酰二胺(12mg)，在乙腈-二氯甲烷(1∶3)中于室温搅拌1小时，得到化合物7：PyA(8)。利用薄层色谱确认进行的是定量反应后，供给DNA合成仪。
实施例12
寡脱氧核糖核苷酸的合成
使用实施例11中制成的核苷酸衍生物(PyA(8))，合成含有核苷酸衍生物的寡脱氧核糖核苷酸。寡脱氧核糖核苷酸为，使用日本应用生物系统公司的392DNA/RNA合成仪，按照通常的亚磷酰胺法合成的。从固相载体上的切取及脱保护是，通过在25％的氨中进行若干小时的孵育来进行的，然后使用高效液相色谱仪纯化。
实施例13
含有PyA(8)的寡脱氧核糖核苷酸的荧光分析
将根据实施例11得到的含有PyA(8)的寡脱氧核糖核苷酸(5′-CGCAAT PyATAACGC-3′：序列标识符32)溶解在含有0.1M氯化钠的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，制成2.5μM的溶液。使用荧光分光光度计，在约25℃下测定该溶液的荧光光谱，其结果激发波长为349nm、发光波长为400nm，在400nm的荧光强度为19。
在上述溶液中分别添加与含有PyA(8)的寡脱氧核糖核苷酸的除PyA(8)以外的部分互补的，另行合成的寡脱氧核糖核苷酸：
(A′)：5′-GCGTTAAATTGCG-3′(序列标识符7)
(T′)：5′-GCGTTATATTGCG-3′(序列标识符8)
(G′)：5′-GCGTTAGATTGCG-3′(序列标识符9)
(C′)：5′-GCGTTACATTGCG-3′(序列标识符10)
使其各自成为2.5μM，于漩涡式混合机中混合。
使用荧光分光光度计测定这些溶液的荧光光谱，其结果加入寡脱氧核糖核苷酸(A′)时在400nm的荧光强度为28。加入寡脱氧核糖核苷酸(T′)时在400nm的荧光强度为49，加入寡脱氧核糖核苷酸(G′)时在400nm的荧光强度为4，加入寡脱氧核糖核苷酸(C′)时在400nm的荧光强度为27。
这样，含有PyA(8)的寡脱氧核糖核苷酸，当互补链上的与PyA(8)配对的核苷酸为脱氧胸苷酸时观测到了强发光，与此相比，为脱氧腺苷酸时荧光消光43％，为脱氧鸟苷酸时荧光消光92％，为脱氧胞苷酸时荧光消光45％。荧光光谱如图17所示。
实施例14
使用DNA微阵列，确定序列标识符33的寡脱氧核糖核苷酸(样品DNA片段)的第13-16位的未知序列。作为DNA微阵列的捕获探针，使用的是含有序列标识符34-49的核苷酸序列的DNA片段(探针DNA片段)(参看表2)。其中，样品DNA片段为含有序列标识符33的核苷酸序列，全长50b，探针DNA片段1-16各自为，含有序列标识符34-49的核苷酸序列，全长68-70b。
1.探针DNA片段的制备
使用日本应用生物系统公司的392DNA/RNA合成仪，按照通常的亚磷酰胺法，合成各自含有序列标识符34-49的核苷酸序列的探针DNA片段1-16。从固相载体上的切取及脱保护是，通过在25％的氨中进行孵育来进行的，然后使用高效液相色谱仪纯化。
其中，序列标识符34-37的各自的第13位(U、A、C、A)为，各核苷酸衍生物(PyU(5)、PyA(7)、PyC(5)、PyA(8))。同样地，序列标识符38-41的第14位、序列标识符42-45的第15位、序列标识符46-49的第16位的U、A、C、A各自为PyU(5)、PyA(7)、PyC(5)、PyA(8)(参考表2)。
2.固定用基板的制备
将在10％NaOH-60％乙醇水溶液中浸渍2小时，用纯水清洗10次的76×26×1mm大小的载玻片(松波硝子工业社制)，在10％聚-L-赖氨酸水溶液中浸渍1小时。用纯水清洗10次后，以800rpm离心5分钟，除去水分，室温干燥，制成固定用基板。
3.DNA微阵列的制备
将所述1中制备的各个探针DNA片段调整为最终浓度为50pmol/μl，各自200pl点样(10nmol)于所述2中制备的基板上。然后，在80℃下进行1小时的干燥处理，向各点样中添加水，将DNA片段固定在基板上。将该基板在1％BSA封闭液(50mg/ml)5ml、10％SDS 1.25ml中振荡45分钟(42℃)。然后，分别用95℃纯水浸渍1分钟，95％乙醇浸渍1分钟，离心(800rpm，1分钟)，制成目的物的DNA微阵列。
4.样品DNA片段的制备
在含有由含有序列标识符33的核苷酸序列的全长50b的寡脱氧核糖核苷酸构成的样品DNA片段(15fmol/10.5μl)的样品管中，添加20×SSC(3.75μl)及10％SDS(0.75μl)。用95℃加热模块加热2分钟后，于室温放置5分钟，离心，制成样品液(最终浓度：1nM)。
5.杂交
向所述3中制备的DNA微阵列上，以每点12μl，点样所述2中制备的样品液，盖上盖玻片进行杂交反应(65℃，16小时)。反应结束后，在2×SSC-0.1％SDS溶液中浸渍5分钟、20分钟，0.2×SSC-0.1％SDS溶液中浸渍20分钟，55℃下进一步浸渍2次，每次20分钟。以相同的溶液冲洗后，进一步以0.05×SSC溶液冲洗。900rpm离心1分钟，放置使其干燥。
6.测定
使用生物芯片读取机(Applied Precision公司制)，取得各DNA点的图像文件后，将荧光强度数值化。结果如表2所示。
表2
  DNA片段     序列标识符     碱基序列   荧光强度
样品     33  3′？GACACTTCTCAGNNNNACCGTTGGA？5′
探针1探针2探针3探针4     34353637  5′？CTGYGAAGAGTCUTGCTGGCAACCT？3′5′？CTGYGAAGAGTCATGCTGGCAACCT？3′5′？CTGYGAAGAGTCCTGCTGGCAACCT？3′5′？CTGYGAAGAGTCATGCTGGCAACCT？3′   3208250290350
探针5探针6探针7探针8     38394041  5′？CTGYGAAGAGTCAUGCTGGCAACCT？3′5′？CTGYGAAGAGTCAAGCTGGCAACCT？3′5′？CTGYGAAGAGTCACGCTGGCAACCT？3′5′？CTGYGAAGAGTCAAGCTGGCAACCT？3′   28600180250320
探针9探针10探针11探针12     42434445  5′？CTGYGAAGAGTCATUCTGGCAACCT？3′5′？CTGYGAAGAGTCATACTGGCAACCT？3′5′？CTGYGAAGAGTCATCCTGGCAACCT？3′5′？CTGYGAAGAGTCATACTGGCAACCT？3′   2202503506140
探针13探针14探针15探针16     46474849  5′？CTGYGAAGAGTCATGUTGGCAACCT？3′5′？CTGYGAAGAGTCATGATGGCAACCT？3′5′？CTGYGAAGAGTCATGCTGGCAACCT？3′5′？CTGYGAAGAGTCATGATGGCAACCT？3′   19021020500250
从表2显示的荧光强度的结果可以确认，样品DNA片段的序列标识符33的第13-16位的未知核苷酸如下。
(1)位于探针DNA片段1-4的第13位上的各核苷酸衍生物的荧光强度为，探针DNA片段2的PyA(7)最高，因此确定样品DNA片段的第13位是胞嘧啶(C)。
(2)位于探针DNA片段5-8的第14位上的各核苷酸衍生物的荧光强度为，探针DNA片段5的PyU(5)最高，因此确定样品DNA片段的第14位是腺嘌呤(A)。
(3)位于探针DNA片段9-12的第15位上的各核苷酸衍生物的荧光强度为，探针DNA片段12的PyA(8)最高，因此确定样品DNA片段的第15位是胸腺嘧啶(T)。
(4)位于探针DNA片段13-16的第16位上的各核苷酸衍生物的荧光强度为，探针DNA片段15的PyC(5)最高，因此确定样品DNA片段的第16位是鸟嘌呤(G)。
另外，从这个结果可以确认，本发明的核苷酸衍生物对于特定的碱基种类发出强荧光信号。
实施例15
使用实施例14中显示强荧光强度的探针2、5、12、15，检验样品DNA浓度与荧光强度的关系。
结果如图18所示。样品DNA浓度与荧光强度具有比例关系，荧光强度随着样品DNA浓度而升高。从这个结果可以知道，通过使用本发明的含有核苷酸衍生物的探针DNA进行杂交，测定荧光强度，可以确定样品中的目标DNA的量。
工业上应用的可能性
如上述详细说明，本申请的发明可以大幅简化采用了DNA探针或DNA微阵列的SNPs判定和测序、表达基因分析等中的样品制备和测定过程。
现存方式中利用标记试剂对样品DNA标记化的方法为，由于其标记化效率变化大，所以无论使用重现性多么好的DNA芯片，其通过杂交的表达分析的重现性都很低，几乎无法达到临床检测市场要求的水平。本申请的发明中，因为样品DNA不需要标记，所以重现性大大提高，进而有望进行灵敏度非常好的正确的测定。
                             序列表
<110>斋藤烈和日本碍子株式会社(Isao Saito and NGK Insulators，Ltd.)
<120>核苷酸衍生物和DNA微阵列
<130>02-F-072CIPCT
<140>US 10/795,436
<141>2004-03-09
<150>US 10/746,157
<151>2003-12-24
<150>US 60/523,318
<151>2003-11-20
<150>US 60/500,645
<151>2003-09-08
<150>US 60/435,995
<151>2002-12-26
<160>51
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)
<223>用1-芘基改性的胞嘧啶衍生物
<400>1
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<210>2
<211>13
<212>DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<222>(7)
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<220>
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<220>
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<222>(9)
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<220>
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<400>24
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<212>DNA
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<222>(10)
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<400>27
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<212>DNA
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<220>
<221>misc_feature
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<400>28
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)
<223>用1-芘基改性的鸟嘌呤衍生物
<400>29
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)
<223>用1-芘基改性的胞嘧啶衍生物
<400>30
agtcattatg ccgcctaatg                                                     20
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
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<222>(11)
<223>用1-芘基改性的腺嘌呤衍生物
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<211>13
<212>DNA
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<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)
<223>用1-芘基改性的腺嘌呤衍生物
<400>32
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<210>33
<211>25
<212>DNA
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<220>
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<220>
<221>misc_feature
<222>(13)...(16)
<223>n：a，t，g或c
<400>33
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<211>25
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<220>
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<220>
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<222>(13)
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<400>34
ctgygaagag tcutgctggc aacct                                        25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)
<223>用1-芘基改性的腺嘌呤衍生物
<400>35
ctgygaagag tcatgctggc aacct                                        25
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<211>25
<212>DNA
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<220>
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<222>(13)
<223>用1-芘基改性的胞嘧啶衍生物
<400>36
ctgygaagag tcctgctggc aacct                                        25
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<212>DNA
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<220>
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<222>(13)
<223>用1-芘基改性的腺嘌呤衍生物
<400>37
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<211>25
<212>DNA
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<220>
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<222>(14)
<223>用1-芘基改性的尿嘧啶衍生物
<400>38
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<211>25
<212>DNA
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<223>合成的寡核苷酸
<220>
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<222>(14)
<223>用1-芘基改性的腺嘌呤衍生物
<400>39
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<211>25
<212>DNA
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<223>合成的寡核苷酸
<220>
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<222>(14)
<223>用1-芘基改性的胞嘧啶衍生物
<400>40
ctgygaagag tcacgctggc aacct                                        25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
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<222>(14)
<223>用1-芘基改性的腺嘌呤衍生物
<400>41
ctgygaagag tcaagctggc aacct                                        25
<210>42
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)
<223>用1-芘基改性的尿嘧啶衍生物
<400>42
ctgygaagag tcatuctggc aacct                                        25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
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<222>(15)
<223>用1-芘基改性的腺嘌呤衍生物
<400>43
ctgygaagag tcatactggc aacct                                        25
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<211>25
<212>DNA
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<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)
<223>用1-芘基改性的胞嘧啶衍生物
<400>44
ctgygaagag tcatcctggc aacct                                        25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>合成的寡核苷酸
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<222>(15)
<223>用1-芘基改性的腺嘌呤衍生物
<400>45
ctgygaagag tcatactggc aacct                                        25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>合成的寡核苷酸
<220>
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<222>(16)
<223>用1-芘基改性的尿嘧啶衍生物
<400>46
ctgygaagag tcatgutggc aacct                                        25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>合成的寡核苷酸
<220>
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<222>(16)
<223>用1-芘基改性的腺嘌呤衍生物
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ctgygaagag tcatgatggc aacct                                        25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)
<223>用1-芘基改性的胞嘧啶衍生物
<400>48
ctgygaagag tcatgctggc aacct                                        25
<210>49
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)
<223>用1-芘基改性的腺嘌呤衍生物
<400>49
ctgygaagag tcatgatggc aacct                                        25
<210>50
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)
<223>n：a，t，g或c
<400>50
gcgttgngtt gcg                                                     13
<210>51
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)
<223>n：a，t，g或c
<400>51
gcgttanatt gcg                                                     13

Claims (27)

1.核苷酸衍生物，其为在嘧啶碱基或嘌呤碱基上经由连接臂结合了荧光色素嵌入剂的核苷酸衍生物，作为单链核苷酸序列的成员存在，当该单链核苷酸序列的杂交互补链的相应碱基是
腺嘌呤时，其为荧光色素的发光最强的胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物(1)；
鸟嘌呤时，其为荧光色素的发光最强的胞嘧啶衍生物(2)；
胞嘧啶时，其为荧光色素的发光最强的腺嘌呤衍生物(3)；
胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶时，其为荧光色素的发光最强的鸟嘌呤衍生物(4)；或
胸腺嘧啶/尿嘧啶时，其为荧光色素的发光最强的腺嘌呤衍生物(5)。
2.根据权利要求1所述的核苷酸衍生物，其中，胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物(1)是由以下的通式(1)表示：
Figure A2005800074360002C1
式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9表示氢原子或取代基，它们可以相同或不同；R10为氢原子或羟基；X为从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷氨基中选择的连结基团；整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷氨基时为0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时为1～5。
3.根据权利要求1所述的核苷酸衍生物，其中，胞嘧啶衍生物(2)是由以下的通式(2)表示：
Figure A2005800074360003C1
式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9表示氢原子或取代基，它们可以相同或不同；R10为氢原子或羟基；X为从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷氨基中选择的连结基团；整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷氨基时为0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时为1～5。
4.根据权利要求1所述的核苷酸衍生物，其中，腺嘌呤衍生物(3)是由以下的通式(3)表示：
式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9表示氢原子或取代基，它们可以相同或不同；R10为氢原子或羟基；X为从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷氨基中选择的连结基团；整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷氨基时为0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时为1～5。
5.根据权利要求1所述的核苷酸衍生物，其中，鸟嘌呤衍生物(4)是由以下的通式(4)表示：
Figure A2005800074360004C1
式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9表示氢原子或取代基，它们可以相同或不同；R10为氢原子或羟基；X为从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷氨基中选择的连结基团；整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷氨基时为0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时为1～5。
6.根据权利要求1所述的核苷酸衍生物，其中，腺嘌呤衍生物(5)是由以下的通式(5)表示：
式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9表示氢原子或取代基，它们可以相同或不同；R10为氢原子或羟基；X为从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷氨基中选择的连结基团；整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷氨基时为0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时为1～5。
7.核苷衍生物，其为权利要求2的胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物(1)的前体物质，由以下通式(6)表示：
Figure A2005800074360005C2
式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9表示氢原子或取代基，它们可以相同或不同；R10为氢原子或羟基；X为从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷氨基中选择的连结基团；整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷氨基时为0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时为1～5。
8.核苷衍生物，其为权利要求3的胞嘧啶衍生物(2)的前体物质，由以下通式(7)表示：
Figure A2005800074360006C1
式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9表示氢原子或取代基，它们可以相同或不同；R10为氢原子或羟基；X为从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷氨基中选择的连结基团；整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷氨基时为0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时为1～5。
9.核苷衍生物，其为权利要求4的腺嘌呤衍生物(3)的前体物质，由以下通式(8)表示：
Figure A2005800074360007C1
式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9表示氢原子或取代基，它们可以相同或不同；R10为氢原子或羟基；X为从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷氨基中选择的连结基团；整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷氨基时为0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时为1～5。
10.核苷衍生物，其为权利要求5的鸟嘌呤衍生物(4)的前体物质，由以下通式(9)表示：
式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9表示氢原子或取代基，它们可以相同或不同；R10为氢原子或羟基；X为从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷氨基中选择的连结基团；整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷氨基时为0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时为1～5。
11.核苷衍生物，其为权利要求6的腺嘌呤衍生物(5)的前体物质，由以下通式(10)表示：
式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9表示氢原子或取代基，它们可以相同或不同；R10为氢原子或羟基；X为从亚氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亚甲基(CH2)及烷氨基中选择的连结基团；整数n表示亚烷基链长度，当X为亚甲基或烷氨基时为0～5，当X为亚氨基、氧基或硫基时为1～5。
12.单链核苷酸序列，其特征为，具有从权利要求1所述的核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(4)组成的群中选出的一个以上的核苷酸衍生物作为成员。
13.碱基种类确定方法，其为确定权利要求12所述的单链核苷酸序列的杂交互补链上的单个碱基种类X的方法，当单链核苷酸序列中的
(i)胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物(1)的荧光色素发光最强时，确定碱基种类X为腺嘌呤；
(ii)胞嘧啶衍生物(2)的荧光色素发光最强时，确定碱基种类X为鸟嘌呤；
(iii)腺嘌呤衍生物(3)的荧光色素发光最强时，确定碱基种类X为胞嘧啶；
(iv)鸟嘌呤衍生物(4)的荧光色素发光最强时，确定碱基种类X为胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶。
14.根据权利要求13所述的碱基种类确定方法，其特征为，把在同一位置具有腺嘌呤衍生物(3)和鸟嘌呤衍生物(4)的两条单链核苷酸序列各自杂交到相同的互补链上，当
(v)腺嘌呤衍生物(3)和鸟嘌呤衍生物(4)双方的荧光色素发光最强时，确定互补链上的碱基种类X为胞嘧啶；
(vi)只有鸟嘌呤衍生物(4)的荧光色素发光最强时，确定互补链上的碱基种类X为胸腺嘧啶/尿嘧啶。
15.单链核苷酸序列，其特征为，具有从权利要求1所述的核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(5)组成的群中选出的一个以上的核苷酸衍生物作为成员。
16.碱基种类确定方法，其为确定权利要求15的单链核苷酸序列的杂交互补链上的单个碱基种类X的方法，当单链核苷酸序列中的
(i)胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物(1)的荧光色素发光最强时，确定碱基种类X为腺嘌呤；
(ii)胞嘧啶衍生物(2)的荧光色素发光最强时，确定碱基种类X为鸟嘌呤；
(iii)腺嘌呤衍生物(3)的荧光色素发光最强时，确定碱基种类X为胞嘧啶；
(iv)腺嘌呤衍生物(5)的荧光色素发光最强时，确定碱基种类X为胸腺嘧啶/尿嘧啶。
17.以权利要求12所述的单链核苷酸序列作为捕获探针的DNA微阵列。
18.根据权利要求17所述的DNA微阵列，其为检测目标核苷酸序列的单核苷酸多态性(SNP)的DNA微阵列，其中，捕获探针的组为，与目标核苷酸序列的至少含有SNP核苷酸的区段互补，但每个捕获探针的与目标核苷酸序列的SNP核苷酸对应位置的核苷酸各自为核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(4)。
19.根据权利要求17所述的DNA微阵列，其为确定序列未知的n(n＝3～100)个核苷酸序列的DNA微阵列，其中，捕获探针为核苷酸序列完全不同的至少4n个的组，每个捕获探针为第1位至第n位的至少一个是核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(4)。
20.根据权利要求17所述的DNA微阵列，其为检测目标核苷酸序列中是否存在与由n(n＝3～100)个核苷酸构成的已知序列区段相同的区段的DNA微阵列，其中，捕获探针的组为与目标核苷酸序列中的已知序列区段互补，但每个捕获探针为第1位至第n位的至少一个是核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(4)。
21.根据权利要求17所述的DNA微阵列，其为确定具有由n(n＝3～100)个核苷酸构成的未知序列区段和已知序列区段的目标核苷酸序列中的未知序列区段的序列的DNA微阵列，其中，捕获探针的组为具有针对目标核苷酸序列中已知序列区段的互补序列和、核苷酸序列完全不同的探针序列区段的至少4n个的组，各探针序列区段的第1位至第n位的至少一个是核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(4)。
22.以权利要求15所述的单链核苷酸序列作为捕获探针的DNA微阵列。
23.根据权利要求22所述的DNA微阵列，其为检测目标核苷酸序列的单核苷酸多态性(SNP)的DNA微阵列，其中，捕获探针的组为，与目标核苷酸序列的至少含有SNP核苷酸的区段互补，但每个捕获探针的与目标核苷酸序列的SNP核苷酸对应位置的核苷酸各自为核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(5)。
24.根据权利要求22所述的DNA微阵列，其为确定序列未知的n(n＝3～100)个核苷酸序列的DNA微阵列，其中，捕获探针为核苷酸序列完全不同的至少4n个的组，每个捕获探针为第1位至第n位的至少一个是核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(5)。
25.根据权利要求22所述的DNA微阵列，其为检测目标核苷酸序列中是否存在与由n(n＝3～100)个核苷酸构成的已知序列区段相同的区段的DNA微阵列，其中，捕获探针的组为与目标核苷酸序列中的已知序列区段互补，但每个捕获探针为第1位至第n位的至少一个是核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(5)。
26.根据权利要求22所述的DNA微阵列，其为确定具有由n(n＝3～100)个核苷酸构成的未知序列区段和已知序列区段的目标核苷酸序列中的未知序列区段的序列的DNA微阵列，其中，捕获探针的组为具有针对目标核苷酸序列中已知序列区段的互补序列和、核苷酸序列完全不同的探针序列区段的至少4n个的组，各探针序列区段的第1位至第n位的至少一个是核苷酸衍生物(1)、(2)、(3)及(5)。
27.目标核苷酸序列的定量方法，其特征为，包括将权利要求12或15所述的单链核苷酸序列与序列已知的目标核苷酸序列杂交后，测定单链核苷酸序列的核苷酸衍生物的荧光强度的步骤。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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