JPWO2006075735A1 - アレイおよびハイブリダイズ方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、シグナル性プローブに適したハイブリダイズ方法を提供する。このため、本発明では、アレイであって、基板と、該基板に固定され、被験試料とハイブリダイズすることによりシグナル変化を生じる核酸プローブと、前記被験試料を含み前記被験試料と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応のための液体を充填可能な1又は2以上の空間と、を備える、アレイを提供する。こうした形態でのハイブリダイゼーションがシグナル性プローブを用いたハイブリダイゼーションの再現性や効率の向上に有効である。
Description
本発明は、特定塩基とのハイブリダイズをシグナル変化として検出できるプローブを保持するアレイ、改良されたプローブ及びこれらの利用に関する。
cDNAプローブやオリゴヌクレオチドプローブはガラス基板の表面に固定化されたDNAマイクロアレイなどの形態でヒトなどの遺伝子解析に用いられている。例えばヒトを対象とする遺伝子解析では、遺伝子多型、遺伝子変異、遺伝子発現量等などの各種の遺伝子に関連したシグナルを検出して遺伝子診断することを目的としている。
遺伝子関連シグナルを検出するには、いずれもプローブとサンプルDNA等の間のハイブリダイゼーションを用いている。すなわち、通常、予め蛍光物質等により標識してサンプルDNAを固相担体に固定化したプローブに供給し、ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズしなかったサンプルDNAを洗浄除去し、その後、プローブとハイブリダイズしたサンプルDNAの標識物質に基づく標識量(通常は蛍光強度)を検出することにより多型等の遺伝子関連シグナルを検出している。したがって、最終的に得られる標識量の変動要因は、標識ステップ、ハイブリダイゼーションステップ及び洗浄ステップに存在しうるといえる。
例えば、プローブに対して供給される標識されたサンプルDNA量は必ずしも一定ではないため、ハイブリダイズ産物の標識量は大きく変動してしまう。また、ハイブリダイゼーションは多種多様な要因に影響されるため、再現性よく実施することは困難であるとともに、プローブとサンプルDNA間のミスハイブリダイゼーションが生じ得ることから、ハイブリダイゼーションステップは標識量変動の要因となりうる。さらに、洗浄が不十分であれば、標識されたサンプルDNAが残留するため、ノイズや標識量の変動要因となっている。このため、従来、遺伝子解析には、通常、コントロールなどを用いたシグナル補正がなされるほかミスハイブリダイゼーションの影響を回避するためのプローブデザインや配置並びに解析処理も行われている。さらに、ハイブリダイゼーションステップの安定化のための種々の試みもなされている。
一方、特開2004−357570号公報に記載されるインターカレーターによる電気化学的手法や特開2004−168672号、特開2004−166522号等に記載の特定塩基とハイブリダイズすると蛍光を発する塩基識別型蛍光性核酸塩基(BDF)の開発が試みられている。塩基識別型蛍光性核酸塩基を用いたプローブは、検出しようとする配列中の特定塩基との対合により特異的なシグナル変化を自ら発することができる。
特定塩基とのハイブリダイズによりシグナルが変化するシグナル性プローブによれば、サンプルDNAの標識操作が不要となるため標識ステップに由来する誤差や特異性の向上からミスハイブリダイゼーションによる誤差を回避又は抑制できることが期待される。また、従来、ミスハイブリダイゼーションによる測定誤差を低減させるための多種類のプローブが必要であったが、こうしたプローブの作製や配置も不要となることが期待される。しかしながら、シグナル性プローブを用いることによる各種のメリットを享受するには、より安定的でかつ高いハイブリダイゼーション効率を確保することが求められる。また、アレイに供されるサンプル量が測定毎にまた遺伝子毎に変動することによるシグナル補正の手法もより確実なものにすることが必要である。
そこで、本発明は、この種のシグナル性プローブを用いた遺伝子解析に適した技術を提供することを目的とする。具体的には、この種のシグナル性プローブに適したハイブリダイズ方法を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、改良されたシグナル性プローブ、該プローブを固定化した固相担体を提供することを他の一つの目的とする。
本発明者らは、上記した課題を解決するために検討したところ、特定形態でのハイブリダイゼーションがシグナル性プローブを用いたハイブリダイゼーションの再現性や効率の向上に有効であることを見出した。また、本発明者らは、シグナル補正を同時に可能とする新たなデザインのシグナル性プローブを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成した。すなわち、本発明によれば以下の手段が提供される。
本発明によれば、アレイであって、基板と、該基板に固定され、被験試料とハイブリダイズすることによりシグナル変化を生じる核酸プローブと、前記被験試料を含み前記被験試料と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応のための液体を充填可能な1又は2以上の空間と、を備える、アレイが提供される。
前記アレイはカバー部材を備えていることが好ましく、前記空間は、前記基板に形成され前記核酸プローブの固定領域を含む凹部内に備えられることが好ましく、より好ましくは、凹部の底部が核酸プローブの固定領域である。さらに、前記空間は、前記核酸プローブの固定領域に対して所定高さを持って覆うカバー部材の中空部内に備えられることが好ましく、より好ましくは、カバー部材の中空部と前記固定領域とによって規定される空間として備えられる。前記カバー部材は、前記アレイを収納可能な容器の一部を構成していてもよい。さらに、前記カバー部材は、前記基板に対して脱着可能に備えられることが好ましい。さらにまた、前記カバー部材は、前記アレイに対して接着剤又は粘着剤によって固定されていてもよく、前記カバー部材は前記核酸プローブと前記被験試料とのハイブリダイズにより発生するシグナル変化を検出可能な透過性を備えていることが好ましい。また、前記カバー部材には、前記ハイブリダイズ反応のための液体を前記空間に充填するための注入口を備えることもできる。さらに、前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域の厚みは300μm以上とすることができる。さらにまた、前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域を形成する材料は、ガラス、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂ならびにこれらのフッ化物およびポリハロゲン化ビニルからなる群から選択される1種あるいは2種以上を含んでいてもよい。
また、前記空間の内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有していることができる。前記カバー部材の少なくとも一部に疎水性領域を有していてもよく、前記疎水性領域は、前記核酸プローブの固定領域に対向する領域に備えられていてもよい。また、前記疎水性領域は、水の接触角が30°以上、好ましくは60°以上である、より好ましくは70°以上である。
さらに、前記空間の高さ(前記固定領域とこれに対向する対向領域との距離)の変動係数が50%以下及び/又は前記空間の高さの平均値が15μm以上であることが好ましい。
また、前記核酸プローブは、ハイブリダイズにより、蛍光波長のシフト、蛍光強度の増大及び蛍光強度の減少のいずれかあるいは組み合わせからなる蛍光シグナルが変化するプローブとすることができ、好ましくは、前記核酸プローブは、塩基識別型蛍光性核酸塩基を含んでいる。また、被験試料は標識されていない核酸であることが好ましい。前記核酸プローブは20mer以上100mer以下であり、前記シグナルの検出精度がCV10%以下、好ましくは5%以下であることが好ましい。
本発明のアレイは、体質(1塩基多型など)診断用、疾患遺伝子(遺伝子キメラなどの各種遺伝子変異)診断用、治療予後診断用、薬剤反応性診断用及び薬剤耐性診断用のいずれかあるいは2種以上の用途を有することができる。
本発明によれば、核酸のハイブリダイズ方法であって、上記いずれかに記載のアレイの前記空間に被験試料を含む液体を充填してハイブリダイズを実施するハイブリダイズ工程を備える、方法が提供される。
前記ハイブリダイズ工程は、前記アレイを静置して又は一時的若しくは間欠的若しくは連続的に前記空間内の液体を強制攪拌してハイブリダイズを実施する工程とすることができる。また、標識されていない核酸を被験試料とすることが好ましい。
本ハイブリダイズ方法は、前記ハイブリダイズ工程後、前記核酸プローブに基づくシグナル変化を検出する検出工程を備えることができ、検出工程は、前記ハイブリダイズ工程後の前記被験試料を含む液体が前記空間に充填されたままの状態で前記シグナル変化を検出する工程とすることができ、検出工程は、前記ハイブリダイズ工程後に洗浄工程を経ることなく実施することもできる。
本発明によれば、核酸ハイブリダイズ用のプローブ保持体であって、固相担体と、該固相担体に識別可能に固定され、被験試料とハイブリダイズすることによりシグナル変化を生じるプローブと、を備える、プローブ保持体が提供される。
前記固相担体は、平板状あるいは粒子状とすることができ、前記固相担体は、液体透過性又は多孔質とすることもできる。さらに、例えば、粒子状等の前記固相担体に対して単一の種類のプローブが固定され、前記固相担体は色、蛍光、記号、数字、文字及び柄等から選択されるプローブ識別情報を有するようにしてもよい。
また、前記プローブは、ハイブリダイズにより、蛍光波長のシフト、蛍光強度の増大及び蛍光強度の減少のいずれかあるいは組み合わせからなる蛍光シグナルが変化するプローブとすることができ、好ましくは、塩基識別型蛍光性核酸塩基を含んでいる。さらに、前記被験試料は標識されていない核酸であってもよい。さらにまた、本発明のプローブ保持体は、前記被験試料を含む液体に浸漬又は懸濁された状態で使用するためのものであってもよい。
本発明によれば、核酸のハイブリダイズ方法であって、上記プローブ保持体を含む空間に被験試料を含有する液体を充填してハイブリダイズを実施するハイブリダイズ工程を備える方法が提供される。
このハイブリダイズ方法は、被験試料を含む液体の存在下で前記シグナル変化を検出する工程を有することができる。
本発明によれば、核酸ハイブリダイズ用のプローブであって、
以下の(a)及び(b);
(a)被験試料について検出しようとする塩基配列上の特徴を検出可能な領域
(b)前記(a)領域における塩基配列上の特徴の近傍に存在する被験試料について定常的な塩基配列((1)変異が未だ検出されていない領域、(2)変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが推測される領域、(3)変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが確認された領域などが挙げられる。)を検出可能な領域
を備えており、
前記(a)の領域及び前記(b)の領域におけるハイブリダイズによりそれぞれ異なるシグナル変化を生じる、プローブが提供される。
以下の(a)及び(b);
(a)被験試料について検出しようとする塩基配列上の特徴を検出可能な領域
(b)前記(a)領域における塩基配列上の特徴の近傍に存在する被験試料について定常的な塩基配列((1)変異が未だ検出されていない領域、(2)変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが推測される領域、(3)変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが確認された領域などが挙げられる。)を検出可能な領域
を備えており、
前記(a)の領域及び前記(b)の領域におけるハイブリダイズによりそれぞれ異なるシグナル変化を生じる、プローブが提供される。
前記(a)の領域及び前記(b)の領域におけるハイブリダイズによって生じる前記シグナル変化は、蛍光波長のシフト、蛍光強度の増大及び蛍光強度の減少のいずれかあるいは組み合わせからなる蛍光シグナルが変化するプローブであることが好ましく、より好ましくは前記プローブは、塩基識別型蛍光性核酸塩基を含んでいる。また、使用する被験試料は標識されていない核酸であることが好ましい。
本発明によれば、核酸ハイブリダイズ用のプローブ保持体であって、固相担体と、上記記載のいずれかのプローブと、を備える、プローブ保持体が提供される。
前記固相担体は、平板状あるいは粒子状とすることができ、また、前記固相担体は、液体透過性又は多孔質とすることもできる。さらに、例えば粒子状等の前記固相担体に対して単一の種類のプローブが固定され、前記固相担体は色、蛍光、記号、数字、文字及び柄等から選択されるプローブ識別情報を有していてもよい。さらにまた、前記プローブ保持体は、前記被験試料を含む液体に浸漬又は懸濁された状態で使用するためのものであってもよい。
前記プローブは20mer以上100mer以下とすることができるし、また、前記シグナルの検出精度がCV10%以下、好ましくは5%以下とすることができる。
本プローブ保持体は、体質(1塩基多型など)診断用、疾患遺伝子(遺伝子キメラなどの各種遺伝子変異)診断用、治療予後診断用、薬剤反応性診断用及び薬剤耐性診断用のいずれかあるいは2種以上の用途を有することができる。
本発明によれば、核酸ハイブリダイズ装置であって、前記(a)領域及び前記(b)領域を備えるプローブを備える上記いずれかに記載のプローブ保持体と、前記プローブ保持体における前記プローブとのハイブリダイズ反応のための液体を充填可能な1又は2以上の空間と、を備える、核酸ハイブリダイズ装置が提供される。
前記空間の内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有することができ、前記疎水性領域は、水の接触角が30°以上、好ましくは60°以上である、より好ましくは70°以上とすることができる。また、前記疎水性領域は、ガラス、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂ならびにこれらのフッ化物およびポリハロゲン化ビニルからなる群から選択される1種あるいは2種以上で構成されることが好ましい。また、本ハイブリダイズ装置は、前記空間の開口を覆うカバー部材を備えていることが好ましい。また、前記固相担体は基板であり、前記カバー部材を、前記基板に対して脱着可能に備えることが好ましい。また、前記カバー部材は前記プローブと前記被験試料とのハイブリダイズにより発生するシグナル変化を検出可能な透過性を備えることが好ましく、また、前記カバー部材の前記プローブの固定領域に対向する領域の厚みは300μm以上であることも好ましい。
さらに、前記カバー部材の少なくとも一部に疎水性領域を有することができ、前記疎水性領域は、プローブが固定化された基板上の領域に対向する領域に備えられることが好ましい。また、前記空間の高さ(前記基板上のプローブ固定領域とこれに対向する対向領域との距離)の変動係数が50%以下及び/又は前記空間の高さの平均値が15μm以上であることも好ましい。
本発明によれば、核酸のハイブリダイズ方法であって、前記(a)領域及び前記(b)領域を備えるプローブを備える上記いずれかに記載のプローブ保持体を含む空間に被験試料を含有する液体を充填してハイブリダイズを実施するハイブリダイズ工程を備える、方法が提供される。
前記ハイブリダイズ工程は、前記ハイブリダイズ装置を静置して又は一時的若しくは間欠的若しくは連続的に前記空間内の液体を強制攪拌してハイブリダイズを実施する工程とすることが好ましい。また、前記ハイブリダイズ工程後、前記プローブに基づくシグナル変化を検出する検出工程を備えることができ、前記検出工程は、前記ハイブリダイズ工程後の前記被験試料を含む液体の存在下で前記シグナル変化を検出する工程とすることが好ましく、前記検出工程は、前記ハイブリダイズ工程後に洗浄工程を経ることなく実施してもよい。
本発明によれば、核酸ハイブリダイズ用のプローブであって、
被験個体又は被験個体を含む群(家系、民族、人種等)において、定常的な塩基配列((1)変異が未だ検出されていない領域、(2)変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが推測される領域、(3)変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが確認された領域などが挙げられる。)を検出可能な領域を備えており、
当該領域におけるハイブリダイズによりシグナル変化を生じる、プローブが提供される。
被験個体又は被験個体を含む群(家系、民族、人種等)において、定常的な塩基配列((1)変異が未だ検出されていない領域、(2)変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが推測される領域、(3)変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが確認された領域などが挙げられる。)を検出可能な領域を備えており、
当該領域におけるハイブリダイズによりシグナル変化を生じる、プローブが提供される。
前記定常的塩基配列を検出可能な領域におけるハイブリダイズによって生じる前記シグナル変化は、蛍光波長のシフト、蛍光強度の増大及び蛍光強度の減少のいずれかあるいは組み合わせからなる蛍光シグナルが変化するプローブであることが好ましく、より好ましくは、塩基識別型蛍光性核酸塩基を備える。
本発明のアレイは、基板と、該基板に固定され、被験試料とハイブリダイズすることによりシグナル変化を生じる核酸プローブと、前記被験試料を含み前記被験試料と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応のための液体を充填可能な1又は2以上の空間と、を備えることを特徴としている。このアレイによれば、前記空間内で前記核酸プローブと前記被験試料とをハイブリダイズ反応させることができる。前記空間内のハイブリダイズ反応では、ハイブリダイゼーションが促進され、前記核酸プローブのシグナル変化量を高めることができるとともに、そのバラツキを低減することができる。また、前記核酸プローブはハイブリダイズによりシグナル変化を生じるためミスハイブリダイゼーションによってはシグナル変化を生じない。このためハイブリダイゼーションに由来するシグナル変化量のバラツキを抑制して、検出感度及び精度の高い遺伝子解析が可能となる。また、前記核酸プローブは被験試料とのハイブリダイズによりシグナル変化を生じるため、アレイに供給した被験試料を含む液体が維持された状態でシグナル変化量を検出することができる。本発明のアレイは、前記液体を充填可能な空間を有しているため、この空間に前記液体を容易に維持できる。このため、ハイブリダイゼーション後の状態に何ら変化させることなくそのままシグナルが検出されるため、洗浄等に起因するシグナル変化量のバラツキも回避又は抑制される。核酸プローブの固定領域全体で効率的なハイブリダイズ反応を実現でき、結果的にハイブリダイズ反応の再現性を向上させることができる。
また、本発明のプローブ保持体は、核酸ハイブリダイズ用のプローブ保持体であって、固相担体と、該固相担体に識別可能に固定され、被験試料とハイブリダイズすることによりシグナル変化を生じるプローブと、を備えることを特徴としている。このプローブ保持体によれば、被験試料とハイブリダイズすることによりシグナル変化を生じるプローブを備えているため、ミスハイブリダイゼーションによってはシグナル変化を生じない。したがって、厳密なハイブリダイゼーション条件によらないでも安定的に被験試料中の特定配列を検出できる。また、前記核酸プローブは被験試料とのハイブリダイズによりシグナル変化を生じるため、アレイに供給した被験試料を含む液体が維持された状態でシグナル変化量を検出することができる。
さらに、本発明のプローブは、核酸ハイブリダイズ用のプローブであって、
以下の(a)及び(b);
(a)被験試料について検出しようとする塩基配列上の特徴を検出可能な領域
(b)前記(a)領域における塩基配列上の特徴の近傍に存在する被験試料について定常的な塩基配列((1)変異が未だ検出されていない領域、(2)変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが推測される領域、(3)変異がないか若しくは高い確率で存在しないこと又は確認された領域などが挙げられる。)を検出可能な領域
を備えており、
前記(a)の領域及び前記(b)の領域におけるハイブリダイズによりそれぞれ異なるシグナル変化を生じることを特徴としている。
以下の(a)及び(b);
(a)被験試料について検出しようとする塩基配列上の特徴を検出可能な領域
(b)前記(a)領域における塩基配列上の特徴の近傍に存在する被験試料について定常的な塩基配列((1)変異が未だ検出されていない領域、(2)変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが推測される領域、(3)変異がないか若しくは高い確率で存在しないこと又は確認された領域などが挙げられる。)を検出可能な領域
を備えており、
前記(a)の領域及び前記(b)の領域におけるハイブリダイズによりそれぞれ異なるシグナル変化を生じることを特徴としている。
本発明のプローブによれば、被験試料の前記(a)領域におけるハイブリダイズによるシグナル変化と同時に前記(b)領域におけるハイブリダイズによるシグナル変化を生じるため、前記(b)領域において得られるシグナル変化をシグナル補正のために用いることができる。同一プローブにおいてこれら2種のシグナル変化を生じるため、余分なプローブ等シグナル補正のためのコントロールを要しない。また、このプローブによれば、多型、変異、キメラを相対的にも絶対的にも定量することが容易となる。
以下、本発明を実施するための最良の形態について、ハイブリダイズ方法、プローブ保持体、プローブ等について図面を適宜参照しながら説明する
(ハイブリダイズによりシグナル変化を生じる核酸プローブ)
本発明における核酸プローブは、ハイブリダイズによりシグナル変化を生じる。ここで、核酸とは、少なくとも一部に核酸の塩基対合によって他の核酸とハイブリダイズするものであればよい。したがって、核酸とは、天然あるいは合成のヌクレオチドのオリゴマーおよびポリマーの双方を含み、さらにゲノムDNA、cDNAなどのDNA、PCR産物、mRNAなどのRNA、ペプチド核酸を含む概念である。また、ハイブリダイズとは、核酸分子間における塩基の対合による相補鎖間の結合反応を意味している。
本発明における核酸プローブは、ハイブリダイズによりシグナル変化を生じる。ここで、核酸とは、少なくとも一部に核酸の塩基対合によって他の核酸とハイブリダイズするものであればよい。したがって、核酸とは、天然あるいは合成のヌクレオチドのオリゴマーおよびポリマーの双方を含み、さらにゲノムDNA、cDNAなどのDNA、PCR産物、mRNAなどのRNA、ペプチド核酸を含む概念である。また、ハイブリダイズとは、核酸分子間における塩基の対合による相補鎖間の結合反応を意味している。
シグナル変化とは、特に限定しないが、電気化学的信号であっても、色や光などの信号、放射性信号であってもよい。シグナル変化を生じるプローブとしては、例えば、特開2004−357570等のような電気化学的手法によりミスマッチを検出可能な酸化還元性ユニット、フラビン、ポルフィリン、キノン、メタロセン、フラビン等の公知の化合物から選択される核酸へのインターカレート性基を備えるインターカレート性蛍光ユニット、特開2004−166522号公報及び特開2004−168672号公報に記載されるヌクレオチド誘導体等からなるインターカレート性の特定塩基認識型蛍光性ユニット(塩基識別型蛍光性核酸塩基)や特開2002−281978号公報等に記載される相互に会合可能であって会合により消光する自己クエンチング性基を備える蛍光ユニットなどを備えるプローブが挙げられる。
プローブにおいてこうしたシグナル変化を生じるユニットとしては、蛍光に関する信号の変化を生じるプローブが好ましい。蛍光に関する信号変化としては、蛍光波長のシフト、蛍光強度の増大及び蛍光強度の減少のいずれかあるいはこれらのうち2種類以上の組み合わせが挙げられる。
蛍光シグナル変化を生じるユニットとしては、上記したインターカレート性蛍光ユニット及び特定塩基認識性蛍光ユニットが挙げられる。こうしたユニットは、ハイブリダイズする塩基により蛍光シグナルが変化する蛍光色素インターカレーターを含んでいる。例えば、蛍光色素インターカレーターとしては、ピレン、アントラセン、ナフタレン等を使用することができる。あるいは公知のインターカレーターに公知の蛍光物質を結合させたものであってもよい。この場合、インターカレーターとしては、アクリジンオレンジ、プロフラビン、臭化エチジウム、アクチノマイシンD等の芳香族色素分子を使用することができる。また、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン誘導体等を使用することができる。
ピリミジン塩基又はプリン塩基にインターカレーターを結合させるためのリンカーとしては、炭素鎖やポリマー鎖を利用することができる。さらに、インターカレーターが連結されるピリミジン塩基又はプリン塩基の位置は、それぞれの非置換炭素位置から任意に選択される。すなわち、ピリミジン塩基の場合には、第4位又は第5位であり、プリン塩基の場合には、第7位又は第8位である。
こうしたインターカレート性蛍光ユニット及び塩基識別型蛍光性ユニットは、前記核酸プローブにおける1又は2以上10以下の予め決められた塩基に対応するヌクレオチドを置換することができる。なお、特開2004−166522号公報、特開2004−168672号公報、特開2002−281978号公報、国際出願明細書PCT/JP2005/004703及びPCT/JP2004/016602は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
上記したうち、蛍光ユニットを備えるプローブは、いずれもこうした蛍光に関する信号変化を生じるが、なかでも、本発明においては、以下の式(1)〜(20)に示す塩基識別型蛍光性核酸塩基ユニット(ヌクレオチド誘導体及びヌクレオシド誘導体として表す。)を用いることが好ましい。こうした塩基識別型蛍光性核酸塩基ユニットを用いることで、標識誤差やバックグラウンドを低下させて測定誤差を低減し、マッチとミスマッチとを厳密に判別できるため、体質、薬剤反応性、薬剤感受性等に影響するSNPsなどの多型、疾患の診断、予後診断、発症予測などに影響する遺伝子変異(染色体転座等によるキメラ遺伝子を含む)を検出するのに有効である。なお、式(1)〜(4)は、アデニン識別型蛍光性核酸塩基ユニットであり、式(5)〜(8)は、チミン/ウラシル識別型蛍光性核酸塩基ユニットであり、式(9)〜(12)は、グアニン識別型蛍光性核酸塩基ユニットであり、式(13)〜(16)は、シトシン識別型蛍光性核酸塩基ユニットであり、式(17)〜(20)は、チミン/ウラシル又はシトシン識別型蛍光性核酸塩基ユニットである。
以上の式(1)〜(20)において、R1〜R9は、水素原子又は置換基を表し、R10は、水素原子又は水酸基であり、Xはイミノ(NH)、オキシ(O)、チオ(S)、メチレン(CH2)及びアルキルアミノ基から選択される連結基であり、アルキレン鎖長を表す整数nは、Xがメチレン又はアルキルアミノ基の場合には0〜5であり、Xがイミノ、オキシ又はチオの場合には1〜5である。このうち、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8及びR9の置換基は、ハロゲン原子、含酸素基、含窒素基、含硫黄基、及びこれらの原子や置換基を有していてもよい炭化水素基若しくは複素環基などである。さらに詳しくは、置換基は、ハロゲン原子、アルコキシ基、エステル基、アミノ基、置換アミノ基、ニトロ基、アミド基、シアノ基、カルバメール基、ウレイド基、チオール基、チオエーテル基、チオエステル基などである。また、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8及びR9が同時に水素原子であることはなく、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8及びR9の隣接するもの同士が結合して置換基を有していてもよいフェニル基を形成してもよい。
さらに、前記式(3)〜(8)、(11)、(12)、(15)、(16)、(19)及び(20)におけるXについては、以下の式(21)〜(27)の連結基を例示することができる。また、このXで表される連結基が存在せず、ピリミジン塩基又はプリン塩基と蛍光色素インタカレーターとがリンカーを介して直接に結合されていてもよい。
また、本発明において、プローブは、以下の(a)及び(b);
(a)被験試料について検出しようとする塩基配列上の特徴を検出可能な領域
(b)前記(a)領域における塩基配列上の特徴の近傍に存在する被験試料について定常的な塩基配列((1)変異が未だ検出されていない領域、(2)変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが推測される領域、(3)変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが確認された領域などが挙げられる。)を検出可能な領域
を備え、前記(a)の領域及び前記(b)の領域におけるハイブリダイズによりそれぞれ異なるシグナル変化を生じるものであってもよい。
(a)被験試料について検出しようとする塩基配列上の特徴を検出可能な領域
(b)前記(a)領域における塩基配列上の特徴の近傍に存在する被験試料について定常的な塩基配列((1)変異が未だ検出されていない領域、(2)変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが推測される領域、(3)変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが確認された領域などが挙げられる。)を検出可能な領域
を備え、前記(a)の領域及び前記(b)の領域におけるハイブリダイズによりそれぞれ異なるシグナル変化を生じるものであってもよい。
こうしたプローブによれば、一つのプローブにより、検査対象となる被験試料中の配列に対応したシグナルとともに、シグナル補正や定量に用いることができるコントロールとしてのシグナルを得ることができる。すなわち、前記(b)領域におけるハイブリダイズによるシグナル変化を、前記(a)領域におけるマッチ/ミスマッチに関わらず生じるようにすることで(例えば、ハイブリダイゼーション条件の設定により)、換言すれば、前記プローブに対するミスハイブリダイゼーションを利用することで、前記(b)領域に基づくシグナル変化は、前記プローブ又は前記プローブを固定化したアレイに供給される被験試料中のターゲット核酸の量を代表することができる。同一プローブにおいてこうしたコントロール(内部標準)等として用いるシグナルが得られるため、精度の高い測定が可能となる。
ここで、前記(a)領域が検出する被験試料の塩基配列上の特徴としては、変異、一塩基多型、染色体転座等によって生じるキメラ遺伝子のブレークポイントなどの特徴的キメラ部分などが挙げられ、前記(a)領域は、こうした特徴に含まれる1又は2以上の塩基を識別する塩基識別型蛍光性核酸塩基を備えることができる。また、前記(b)領域が検出する定常的な塩基配列としては、上記のとおり特に限定するものではないが、前記特徴近傍の定常的な1又は2以上の塩基とすることができ、前記(b)領域は、こうした定常的な1又は2以上の塩基に対応する塩基を識別する塩基識別型蛍光性核酸塩基を備えることができる。なお、定常的な塩基配列は、被験個体又は被験個体を含む群(家系、民族、人種等)を考慮して決定されることが好ましい。
なお、コントロールとするための定常的な塩基は、特徴的塩基のマッチ/ミスマッチに関わらず検出できればよいが、好ましくは特徴的塩基との間に少なくとも1塩基が介在されていることが好ましい。
例えば、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)2遺伝子においては、図1に示す配列中の第11位において一塩基多型(A/G)を有している。この場合多型を検出するために第11位のメジャー型塩基に対応して第1の塩基識別型蛍光性核酸塩基を有し、多型等が報告されていない第6位の塩基に対応して別の第2の塩基識別型蛍光性核酸塩基を有するプローブを設計することができる。
図2に示すように、それぞれ塩基識別型蛍光性核酸塩基を有する多型検出領域と定常的塩基検出領域を備えるプローブに対して、多型検出領域では不完全な対合状態であっても定常的塩基検出領域にハイブリダイズして蛍光を生じる条件で被験試料と接触させて最終的に得られる前記第2の塩基識別型蛍光性核酸塩基に由来する蛍光シグナルは、供給された被験試料(ALDH2遺伝子サンプル)の量を代表することができる。なお、このとき、多型検出領域では、第1の塩基識別型蛍光性核酸塩基が不対合であれば当該塩基に由来する蛍光は生じないし、当該塩基が検出すべき塩基と対合していれば当該塩基に由来する蛍光が生じる。このため、第2の塩基識別型蛍光性核酸塩基に由来する蛍光シグナルに対する第1の塩基識別型蛍光性塩基核酸に由来する蛍光シグナルの比を利用すれば、供給した被験試料量に関わらず被験試料中におけるメジャー配列量の比率を検出できるため、マイナー配列量を測定することなく多型の型を容易に特定できる。さらに、こうしたプローブを用いて、変異配列等を一定濃度で含む標準溶液について第2の塩基識別型蛍光性核酸塩基由来の蛍光シグナルに対する第1の塩基識別型蛍光性核酸塩基由来の蛍光シグナルの比を利用することで、容易に変異配列量を定量できる。標準溶液における蛍光シグナル比は、予め求めておいてもよいし、被験試料のアッセイ毎に行ってもよい。
なお、前記(a)領域を検出するためのシグナル変化と前記(b)領域を検出するためのシグナル変化は、互いに区別できるものであればよい。例えば、異なる蛍光波長を有することができる。
このように、本発明においては、塩基配列中の特定塩基とのハイブリダイズによりシグナル変化を生じるユニットを1又は2以上備えることができる。こうしたユニットは、全てが被験試料中の測定対象となる塩基配列の特定塩基とのハイブリダイズによりシグナル変化を生じるものであってもよい。例えば、染色体転座等によって生じるキメラ遺伝子のそれぞれの部位を検出するように蛍光ユニットを備えていてもよい。
また、本発明によれば、こうした被験試料の量を補正することができるように前記(b)領域のみを有するプローブも提供される。こうしたプローブと前記(a)領域のみを有するプローブとを、例えば、一つの固相担体に固定化することにより同時に用いることで、これらのシグナル変化量を測定し、比率を算出することで、先と同様の補正、解析等が可能となる。
(プローブ保持体)
プローブ保持体は、プローブを保持した固相担体である。固相担体が基板状の場合には、プローブ保持体はアレイを構成する。固相担体が後述するように粒子状の場合もある。予め合成されたプローブの固相担体への固定化は、特に限定されないで、各種の共有結合、静電的結合など結合手法を用いることができる。また、プローブは、固相担体表面においてその場でフォトリソグラフィ等の手法を利用して合成されるものであってもよい。
プローブ保持体は、プローブを保持した固相担体である。固相担体が基板状の場合には、プローブ保持体はアレイを構成する。固相担体が後述するように粒子状の場合もある。予め合成されたプローブの固相担体への固定化は、特に限定されないで、各種の共有結合、静電的結合など結合手法を用いることができる。また、プローブは、固相担体表面においてその場でフォトリソグラフィ等の手法を利用して合成されるものであってもよい。
(アレイ)
プローブ保持体の一形態であるアレイの一例を図3に示す。アレイ2はプローブを備えた、核酸のハイブリダイズ反応のための装置(ハイブリダイズ装置)でもある。
プローブ保持体の一形態であるアレイの一例を図3に示す。アレイ2はプローブを備えた、核酸のハイブリダイズ反応のための装置(ハイブリダイズ装置)でもある。
(基板)
本ハイブリダイズ装置2における基板4は、少なくとも核酸プローブが固定される核酸固定領域6を備えている。核酸固定領域6は、それぞれ核酸プローブが固定された微小な1以上の領域(スポットともいう。)が形成された、あるいは該微小領域が形成されるために準備された領域である。なお、本発明においては、基板4に対する核酸プローブの固定方法や固定形態については特に限定することなく本出願時における公知の全ての形態を包含するものである。基板4における核酸固定領域6は、微小な三次元形状を有している場合も含め実質的に平坦であることが好ましい。また、基板4は、基板4上に直接あるいは必要に応じて多孔質体などの介在物を介して核酸固定領域6を単数あるいは2以上有することができる。基板4に2以上の核酸固定領域6を有する場合には、これらは疎水性の離隔部によって互いに隔てられていてもよい。
本ハイブリダイズ装置2における基板4は、少なくとも核酸プローブが固定される核酸固定領域6を備えている。核酸固定領域6は、それぞれ核酸プローブが固定された微小な1以上の領域(スポットともいう。)が形成された、あるいは該微小領域が形成されるために準備された領域である。なお、本発明においては、基板4に対する核酸プローブの固定方法や固定形態については特に限定することなく本出願時における公知の全ての形態を包含するものである。基板4における核酸固定領域6は、微小な三次元形状を有している場合も含め実質的に平坦であることが好ましい。また、基板4は、基板4上に直接あるいは必要に応じて多孔質体などの介在物を介して核酸固定領域6を単数あるいは2以上有することができる。基板4に2以上の核酸固定領域6を有する場合には、これらは疎水性の離隔部によって互いに隔てられていてもよい。
また、基板4の形状は特に限定しない。例えば、平板のほか、基板4として機能する平坦な底部を有する凹状体が挙げられる。基板4を構成する材料は、従来この種の基板に用いられている各種の材料の他各種の材料を使用できる。例えば、ガラス、二酸化ケイ素、窒化ケイ素などのシリコン系セラミックスを含むセラミックス、シリコーン、ポリメチルメタクリレート、ポリ(メタ)アクリレートなどの樹脂、金、銀、銅等の金属などを用いることができる。所望の表面特性を付与するために適当なコートが施されていてもよい。なかでも、ガラス基板、シリコーン、アクリル樹脂を使用することができる。こうした基板4の最も典型例は、cDNAプローブ等が固定されたDNAチップ若しくはDNAマイクロアレイまたはcDNA等が固定されていない(固定されるべき)DNAマイクロアレイ用等の基板である。
(カバー部材)
本ハイブリダイズ装置2は、基板4に対して使用されるカバー部材10を備えている。カバー部材10は、基板4の核酸固定領域6を含んだハイブリダイズ反応のためのキャビティ12を構成する。カバー部材10は、基板4に対して装着されるものとすることもできるが、基板4を収容あるいは保持する基板保持体に対して装着された結果として、基板4との間でキャビティ12を構成するものであってもよい。前者の例としては、平板状あるいは平坦な底部を有する凹状の基板に対して装着される形態を挙げることができ、後者の例としては、平板状の基板を載置する平坦部あるいは凹状部を備える基板保持体に対して装着される形態を挙げることができる。
本ハイブリダイズ装置2は、基板4に対して使用されるカバー部材10を備えている。カバー部材10は、基板4の核酸固定領域6を含んだハイブリダイズ反応のためのキャビティ12を構成する。カバー部材10は、基板4に対して装着されるものとすることもできるが、基板4を収容あるいは保持する基板保持体に対して装着された結果として、基板4との間でキャビティ12を構成するものであってもよい。前者の例としては、平板状あるいは平坦な底部を有する凹状の基板に対して装着される形態を挙げることができ、後者の例としては、平板状の基板を載置する平坦部あるいは凹状部を備える基板保持体に対して装着される形態を挙げることができる。
キャビティ12は、核酸固定領域6を含んだ空間であって、前記ハイブリダイズ反応のための液体(以下、単にハイブリダイズ液という。)を貯留可能に形成される空間である。キャビティ12は、核酸固定領域6上において所定の空間高さ(あるいは空間の厚み)を有する空間を有していることが好ましい。すなわち、カバー部材10は、ハイブリダイズ液が貯留されない状態であっても基板4の核酸固定領域6に対向する領域(以下、単に対向領域という。)14を基板4からいくらかの距離離れて保持できる構成を有していることが好ましい。カバー部材10がこうした形態を有することで、基板4に対して特別な操作を施すことなく、カバー部材10を基板4等に対して装着するだけで、核酸固定領域6に所定の空間高さを有するキャビティ12を形成できる。
キャビティ12内には、少なくとも基板4の核酸固定領域6とカバー部材10の対向領域14とが露出されている他、これらの領域以外にキャビティ12を外部と遮断するために必要な追加の面が露出されている。追加の面は、基板4あるいはカバー部材10の一部であってもよいし、さらに別個の部材で構成されていてもよい。キャビティ12の平面形態は特に限定しないが、突状部や角部を有しないことが好ましい。このような個所には、ハイブリダイズ液が滞留しやすいからである。なお、後述するように外側に膨出する個所であっても、該個所が、十分に小さく全体として液体の滞留が抑制されるような曲線形態などを有する側壁部分近傍に形成されていれば、滞留が抑制される。好ましい平面形態としては、図3および図4に示すような長円や円などが挙げられる。また、キャビティ12の対向領域14は基板4から離れる方向に対して凸状としても凹状としてもよいが、平坦であることが好ましい。平坦であると、核酸固定領域6に対しておおよそ一定の空間高さを備えるキャビティ12を容易に構成できるからである。
このようなカバー部材10は、図4に示すように、基板4が平板である場合には、対向領域14を含む平板状体10aの周囲に所定高さのスペーサ8を有する形態とすることもできる。図3においては、カバー部材10は、基板4とほぼ同じ大きさで少なくとも基板4に対向する側にはほぼ平坦な表面を有する板状体10aと、その周縁に基板4との間に介在されるスペーサ8とを有している。他の形態としては、それ自体が核酸固定領域6を覆う所定形状のドームを有する形態とすることもできる。このような形態のカバー部材10は、高分子材料の成形体とすることができる。一方、基板4が凹状部の底部を核酸固定領域6とする凹状体であるとか核酸固定領域6の外周に所定高さの周縁部を有する場合、さらには基板4が基板保持体などの底部に収容される場合など、カバー部材10を装着するのにあたり核酸固定領域6が凹状部の底部に位置されるときには、これら凹状部の周縁の縦壁部分に装着される平板状体とすることもできる。
スペーサ8の材料としては、例えば、アクリル樹脂、熱可塑性エラストマー、天然あるいは合成ゴム、シリコーン、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、ハロゲン化ビニル、ポリカーボネートを用いることができる。
(疎水性領域)
本ハイブリダイズ装置2は、キャビティ12内に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域16を有していることが好ましい。疎水性とは、少なくとも撥水性を示す表面特性を意味し、好ましくは、親水処理など施されていない一般的なケイ酸ソーダガラスよりも高い撥水性を有していることを意味する。撥水性は、一般に平坦な表面における水の接触角で表現することができる。本発明における疎水性領域の水の接触角は、30°以上であることが好ましく、より好ましくは60°以上であり、さらに好ましくは70°以上である。最も好ましくは、90°以上である。なお、接触角とは、液滴を水平な固体板状に置いたときに液滴が固体と接している部分の角度をいうものとする。接触角は、静的接触角や臨界値としての前進接触角あるいは後退接触角、さらには動的接触角などをも用いることができるが、液滴法によって測定した静的接触角を用いることが好ましい。
本ハイブリダイズ装置2は、キャビティ12内に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域16を有していることが好ましい。疎水性とは、少なくとも撥水性を示す表面特性を意味し、好ましくは、親水処理など施されていない一般的なケイ酸ソーダガラスよりも高い撥水性を有していることを意味する。撥水性は、一般に平坦な表面における水の接触角で表現することができる。本発明における疎水性領域の水の接触角は、30°以上であることが好ましく、より好ましくは60°以上であり、さらに好ましくは70°以上である。最も好ましくは、90°以上である。なお、接触角とは、液滴を水平な固体板状に置いたときに液滴が固体と接している部分の角度をいうものとする。接触角は、静的接触角や臨界値としての前進接触角あるいは後退接触角、さらには動的接触角などをも用いることができるが、液滴法によって測定した静的接触角を用いることが好ましい。
なお、静的接触角を測定する液滴法は、(1)接線法、(2)θ/2法および(3)3点クリック法がある。(1)の接線法は、読み取り顕微鏡等を利用してカーソルを液滴の接線に合わせて接触角を直接求める方法であり、(2)のθ/2法は、液滴の片端と頂点とを結ぶ直線と固体面との角度を2倍して接触角として求める方法であり、(3)の3点クリック法は、液滴と固体面との接点2ヶ所と頂点をコンピュータ画像上等でクリックして画像処理により求める方法である。これらの液滴法においては、上記(2)および(3)の方法にて接触角を求めることが好ましい。
疎水性領域16は、キャビティ12内に露出される領域の少なくとも一部に備えられていればよいが、好ましくは、カバー部材10に備えられる。カバー部材10に疎水性領域16を備えることで、シグナル強度を効果的に向上させることができる。カバー部材10においては、対向領域14に疎水性領域16を有していることが好ましく、さらに好ましくは、核酸固定領域6のおおよそ全体に対応する対向領域14の全体に均一に疎水性領域16を備えることが好ましい。疎水性領域16は、対向領域14において複数個分散して備えられていてもよいが、好ましくは、対向領域14のおおよそ全体を被覆するような連続状に備えられている。さらに、カバー部材10のキャビティ12に露出される全領域が疎水性領域16であってもよい。
疎水性領域16は、例えば、カバー部材10自体の材質を疎水性材料を用いることで形成することもできるし、疎水性領域16を形成しようとする領域に対して疎水性材料および/または疎水性(撥水性)を呈する表面形態を付与することによっても形成することができる。疎水性領域16を構成する疎水性材料としては、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレフィン、ハロゲン化ビニル、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂およびこれらの樹脂のフッ化又は塩化物を挙げることができる。また、撥水性を呈する表面形態としては、例えば、各種材料表面に化学的な修飾や機械的処理により接触角が90°以上になるように粗面化された形態を挙げることができる。
キャビティ12における核酸固定領域6とこれに対向する対向領域14との距離、すなわち、核酸固定領域6におけるキャビティ12の空間高さの変動係数(標準偏差/平均値×100(%))が50%以下であることが好ましい。核酸固定領域6において空間高さの変動係数が50%以下であると、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキを抑制することができる。シグナル強度のバラツキが抑制されることは、精度の高い検出が可能となるとともに、再現性の高いハイブリダイズ反応が実現できることを意味する。例えば、空間高さの変動係数が50%以下であるとシグナル強度の変動係数を20%以下程度に容易に抑制することができる。空間高さの変動係数はより好ましくは40%以下であり、さらに好ましくは30%以下であり、最も好ましくは20%以下である。本発明者らの今回得られた知見によれば、キャビティ12内の核酸固定領域6の空間高さの変動係数が一定以下であることは、核酸固定領域6の単位面積あたりのハイブリダイズ液量(液厚)の均一性に大きく寄与していることがわかっている。
また、キャビティ12の空間の高さの平均値は、15μm以上であることが好ましい。15μm以上であると、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキがよく抑制されるからである。より好ましくは、20μm以上である。キャビティ12の空間高さを20μm以上とすることで、それによって確保される核酸固定領域6における液厚により、キャビティ12内に露出される領域の影響を抑制してハイブリダイズ液の対流ないし被験核酸の拡散を確保できる。また、空間高さの平均値の上限は、好ましくは1000μm以下である。さらに、こうしたキャビティ12が区画する基板4上の面積は、1mm2以上2000mm2以下であることが好ましい。
キャビティ12における上記空間高さの平均値および空間高さの変動係数は、例えば、以下の方法(以下、高さ−表面うねり量法という。)により測定することができる。
(1)計測部位
カバー部材10によって形成されるキャビティ12を分割する分割線、好ましくは、キャビティ12の中心線あるいは等分割線の分割線上を計測部位とする。計測部位は、例えば、図5(a)に示すように、キャビティ12の長手方向および短手方向のそれぞれ2等分する2本の分割線の組み合わせとすることもできる(分割線は計2本)。また、図5(b)に示すように、長手方向および短手方向にそれぞれ4等分する分割線の組み合わせとすることもできる(分割線は計6本)。さらに、図5(c)に示すように、長手方向に8等分する分割線と短手方向に4分割する分割線との組み合わせとすることもできる(分割線は計10本)。
(2)周縁高さの測定と基準高さの算出
まず基準高さ(H)を求める。基準高さ(H)とは、カバー部材10を基板4の核酸固定領域6に対向するように装着したとき形成されるキャビティ12の外縁に対応するカバー部材10の周縁部の核酸固定領域6を含む表面からの高さ(以下、周縁部高さという。)の平均値である。周縁部高さは、図5に示すとおり、分割線上の周縁部において計測する。分割線は、キャビティ12を分割しているため、一つの分割線について周縁部の高さは対向する周縁部の2点を計測することになる。したがって、周縁高さの測定箇所数は、分割線の数×2となる。すべての分割線上における周縁部高さを測定し、これらから平均値を求め、これを基準高さ(H)とする。なお、空間高さの平均値および変動係数を得るのに好ましい周縁高さの測定個所は、4箇所以上であり、より好ましくは、20箇所以上である。
(3)カバー部材の表面のうねり量の測定
カバー部材10の表面のうねり量は、分割線上のカバー部材10の対向領域14に対応する領域の外表面(基板4と対向しない側の表面)の周縁部を基準とした表面の凹凸の変動量として測定する。うねり量としては、一つの分割線をその測定軌跡として測定し、最高値と最低値とのみを用いればよい。したがって、うねり量の測定箇所は、結果として各分割線に対して2箇所ということになり、分割線の数×2がうねり量の測定箇所数となる。なお、空間高さの平均値および変動係数を得るのに好ましいうねり量の測定個所は、4箇所以上であり、より好ましくは、20箇所以上である。
(4)膜厚の測定
カバー部材10の膜厚は、対向領域14の膜厚を意味しており、対向領域14の膜厚の平均値(Tave)を用いてもよいし、あるいは上記うねり量の最高値と最低値とをそれぞれ測定した部位の膜厚(Tmax、Tmin))を用いてもよいが、好ましくは平均値を用いる。なお、膜厚は、ノギスなどの計測装置など公知の計測装置により測定できる。
(5)空間高さの算出
これらのデータから一つの分割線上において複数の空間高さを求めることができる。一つの分割線上においては、うねり量の最高値と最低値(それぞれMAXおよびMINとする)から最大の空間高さと最小の空間高さとを求めることができる。
最大空間高さ=基準高さ(H)+うねり量の最高値(MAX)−膜厚(TaveあるいはTmax)
最小空間高さ=基準高さ(H)+うねり量の最低値(MIN)−膜厚(TaveあるいはTmin)
として得ることができる。
こうして、一つの分割線から最大空間高さと最小空間高さを得て、他の分割線からも同様に最大空間高さと最小空間高さとを得て、これらの平均値を、空間高さの平均値とし、標準偏差/空間高さの平均値×100を変動係数(%)とする。
(1)計測部位
カバー部材10によって形成されるキャビティ12を分割する分割線、好ましくは、キャビティ12の中心線あるいは等分割線の分割線上を計測部位とする。計測部位は、例えば、図5(a)に示すように、キャビティ12の長手方向および短手方向のそれぞれ2等分する2本の分割線の組み合わせとすることもできる(分割線は計2本)。また、図5(b)に示すように、長手方向および短手方向にそれぞれ4等分する分割線の組み合わせとすることもできる(分割線は計6本)。さらに、図5(c)に示すように、長手方向に8等分する分割線と短手方向に4分割する分割線との組み合わせとすることもできる(分割線は計10本)。
(2)周縁高さの測定と基準高さの算出
まず基準高さ(H)を求める。基準高さ(H)とは、カバー部材10を基板4の核酸固定領域6に対向するように装着したとき形成されるキャビティ12の外縁に対応するカバー部材10の周縁部の核酸固定領域6を含む表面からの高さ(以下、周縁部高さという。)の平均値である。周縁部高さは、図5に示すとおり、分割線上の周縁部において計測する。分割線は、キャビティ12を分割しているため、一つの分割線について周縁部の高さは対向する周縁部の2点を計測することになる。したがって、周縁高さの測定箇所数は、分割線の数×2となる。すべての分割線上における周縁部高さを測定し、これらから平均値を求め、これを基準高さ(H)とする。なお、空間高さの平均値および変動係数を得るのに好ましい周縁高さの測定個所は、4箇所以上であり、より好ましくは、20箇所以上である。
(3)カバー部材の表面のうねり量の測定
カバー部材10の表面のうねり量は、分割線上のカバー部材10の対向領域14に対応する領域の外表面(基板4と対向しない側の表面)の周縁部を基準とした表面の凹凸の変動量として測定する。うねり量としては、一つの分割線をその測定軌跡として測定し、最高値と最低値とのみを用いればよい。したがって、うねり量の測定箇所は、結果として各分割線に対して2箇所ということになり、分割線の数×2がうねり量の測定箇所数となる。なお、空間高さの平均値および変動係数を得るのに好ましいうねり量の測定個所は、4箇所以上であり、より好ましくは、20箇所以上である。
(4)膜厚の測定
カバー部材10の膜厚は、対向領域14の膜厚を意味しており、対向領域14の膜厚の平均値(Tave)を用いてもよいし、あるいは上記うねり量の最高値と最低値とをそれぞれ測定した部位の膜厚(Tmax、Tmin))を用いてもよいが、好ましくは平均値を用いる。なお、膜厚は、ノギスなどの計測装置など公知の計測装置により測定できる。
(5)空間高さの算出
これらのデータから一つの分割線上において複数の空間高さを求めることができる。一つの分割線上においては、うねり量の最高値と最低値(それぞれMAXおよびMINとする)から最大の空間高さと最小の空間高さとを求めることができる。
最大空間高さ=基準高さ(H)+うねり量の最高値(MAX)−膜厚(TaveあるいはTmax)
最小空間高さ=基準高さ(H)+うねり量の最低値(MIN)−膜厚(TaveあるいはTmin)
として得ることができる。
こうして、一つの分割線から最大空間高さと最小空間高さを得て、他の分割線からも同様に最大空間高さと最小空間高さとを得て、これらの平均値を、空間高さの平均値とし、標準偏差/空間高さの平均値×100を変動係数(%)とする。
なお、カバー部材10の所定位置における周縁高さは、例えば、デジタル測長機(デジマイクロ、株式会社Nikon製)によって測定することができ、カバー部材10の表面のうねり量は、表面粗さ形状測定機(サーフコム、株式会社東京精密製)にて測定することができる。
さらに、キャビティ12の容積は、0.1μL以上2000μL以下であることが好ましい。より好ましくは1μL以上1000μL以下である。
さらに、カバー部材10の対向領域14を含む部分は、外部からキャビティ12内を視認可能な光透過性を有することが好ましいが、対向領域14を含む部分の厚みの平均値が300μm以上であることが好ましい。厚みの平均値が300μm以上であると、ハイブリダイズ産物のシグナル強度の変動係数がよく抑制されるからである。該厚みはより好ましくは350μm以上である。なお、上限は特に限定しないが、厚いため熱容量が大きくなり過ぎて加熱時にキャビティの温度分布の不均一性が生起してしまうことを考慮すれば3000μm以下であることが好ましい。
(その他の構造)
カバー部材10にはハイブリダイズ液を注入するための開口20を備えることができる。開口20は2以上備えることが好ましく、少なくとも一つの開口20は、カバー部材10においてキャビティ12を区画する輪郭近傍に開口していることが好ましい。かかる部位に開口されていることで、キャビティ12に注入したハイブリダイズ液がキャビティ12の内壁に留まりにくくキャビティ12全体にハイブリダイズ液が容易に拡散される。より好ましくは、開口20は、前記輪郭に沿って形成されおり、さらに好ましくは、前記開口20によってキャビティ12の内壁が外側に膨出した膨出部を構成するように形成されている。すなわち、図3に示すように、円形上にカバー部材10に開口された開口20は、平面形態が長円状のキャビティ12の長径方向の両端に形成されるとともに、該両端部において開口20の開口端縁の一部がキャビティ12の両端を外側に膨出させるように形成されている。かかる開口20からハイブリダイズ液が注入されると、開口20の両側および反対側のいずれにもハイブリダイズ液が容易に拡散されることになる。なお、開口20は、適当なシール材によって密閉される。
カバー部材10にはハイブリダイズ液を注入するための開口20を備えることができる。開口20は2以上備えることが好ましく、少なくとも一つの開口20は、カバー部材10においてキャビティ12を区画する輪郭近傍に開口していることが好ましい。かかる部位に開口されていることで、キャビティ12に注入したハイブリダイズ液がキャビティ12の内壁に留まりにくくキャビティ12全体にハイブリダイズ液が容易に拡散される。より好ましくは、開口20は、前記輪郭に沿って形成されおり、さらに好ましくは、前記開口20によってキャビティ12の内壁が外側に膨出した膨出部を構成するように形成されている。すなわち、図3に示すように、円形上にカバー部材10に開口された開口20は、平面形態が長円状のキャビティ12の長径方向の両端に形成されるとともに、該両端部において開口20の開口端縁の一部がキャビティ12の両端を外側に膨出させるように形成されている。かかる開口20からハイブリダイズ液が注入されると、開口20の両側および反対側のいずれにもハイブリダイズ液が容易に拡散されることになる。なお、開口20は、適当なシール材によって密閉される。
こうした本ハイブリダイズ装置2に用いるカバー部材10は、実質的にカバー部材10を構成する平板状体10aにシール層5を介してスペーサ8を積層することにより得ることができる。シール層5としては、平板状体10aとスペーサ8とを接着する接着剤層あるいは粘着剤層とすることができる。また、一つのカバー部材10に対して、隣合う区画を遮断するような形態のスペーサ8を用いることで基板4上に複数個のキャビティ12を形成するカバー部材10も容易に得ることができる。
また、カバー部材10は、複合体としてではなく一体の樹脂の成形体として得ることもできる。さらに、こうしたカバー部材10の基板4あるいは基板保持体に対して装着するための部位には、接着剤や粘着剤の層を形成しておくことが好ましく、さらに、このような接着層は剥離可能なシートによって保護されていることが好ましい。したがって、本発明の別の形態として、このハイブリダイズ装置2と基板4とを備えるハイブリダイズ反応用キットも提供されることになる。このようなキットに備えられる基板4に核酸プローブなどを固定すれば有効な好ましい核酸アレイを得ることができる。なお、カバー部材10は、基板4あるいは基板保持体に対して別個に備えられて適時に装着可能に備えられなくてもよい。カバー部材10は、基板4あるいは基板保持体に対して接着により予め一体化されていてもよく、また、基板4等と一体の成形体として一体化されていてもよい。また、カバー部材10は洗浄やシグナル検出のために基板4等に対し、該基板4等から分離可能に装着可能に形成されていてもよく、あるいは一体化されていてもよい。
カバー部材10の対向領域14を含む部分を弾性変形可能に形成してもよい。この部分あるいはカバー部材10の全体を弾性変形可能な材料で形成することにより、対向領域14にガス圧又は機械的外力を付加して変形させることでキャビティ12内の液体を攪拌することができる。
また、カバー部材10の対向領域14のキャビティ12に露出される側(基板4と対向される側の表面)には、凹部及び/又は凸部を備えることができる。この凹凸は、キャビティ12内の液体を撹拌する場合に、液体の流れを複雑化して撹拌効率を向上させ、ひいてはハイブリダイズ効率を向上させることができる。こうした凹部及び/又は凸部は、カバー部材10の対向領域14を構成する材料で一体に備えていてもよいし、カバー部材10の基板4に対向される側の表面にこうした凹部及び/又は凸部を備えるフィルムやシート状体を付着させることによっても形成できる。こうした凹部及び凸部の大きさは、特に限定しないで、キャビティの空間高さに応じて設定される。なお、こうした凹部及び/又は凸部に疎水性領域を備えていてもよい。
(他のプローブ保持体)
他の形態のプローブ保持体としては、固相担体を基板などの平板状体に替えて粒子状のものを用いる形態が挙げられる。粒子状体は、一般的なビーズなどの球形状のほか、針状、不定形状等各種の形態であってもよい。こうした粒子状の固相担体を用いる場合には、粒子毎に一つのプローブを固定化するとともに、色、蛍光、記号、数字、文字及び柄等から選択されるプローブ識別情報を有するようにする。こうした粒子識別情報とプローブの種類とを予め関連付けておくことにより、粒子上でのハイブリダイズ産物のシグナル変化と識別情報とを検出することで、その粒子に固定化されていたプローブとサンプルDNA等との関係を関連付けることができる。なお、固相担体が平板状である場合には、プローブの識別情報は、プローブの固相担体における位置として把握されている。なお、粒子状体の材料としては、基板と同様、例えば、ガラス、二酸化ケイ素、窒化ケイ素などのシリコン系セラミックスを含むセラミックス、シリコーン、ポリメチルメタクリレート、ポリ(メタ)アクリレートなどの樹脂、金、銀、銅等の金属などを用いることができ、所望の表面特性を付与するために適当なコートが施されたものであってもよい。
他の形態のプローブ保持体としては、固相担体を基板などの平板状体に替えて粒子状のものを用いる形態が挙げられる。粒子状体は、一般的なビーズなどの球形状のほか、針状、不定形状等各種の形態であってもよい。こうした粒子状の固相担体を用いる場合には、粒子毎に一つのプローブを固定化するとともに、色、蛍光、記号、数字、文字及び柄等から選択されるプローブ識別情報を有するようにする。こうした粒子識別情報とプローブの種類とを予め関連付けておくことにより、粒子上でのハイブリダイズ産物のシグナル変化と識別情報とを検出することで、その粒子に固定化されていたプローブとサンプルDNA等との関係を関連付けることができる。なお、固相担体が平板状である場合には、プローブの識別情報は、プローブの固相担体における位置として把握されている。なお、粒子状体の材料としては、基板と同様、例えば、ガラス、二酸化ケイ素、窒化ケイ素などのシリコン系セラミックスを含むセラミックス、シリコーン、ポリメチルメタクリレート、ポリ(メタ)アクリレートなどの樹脂、金、銀、銅等の金属などを用いることができ、所望の表面特性を付与するために適当なコートが施されたものであってもよい。
また、他の形態のプローブ保持体としては、平板状又は粒子状の固相担体が液体透過性で又は多孔質である場合が挙げられる。固相担体が液体透過性又は多孔質である場合には、プローブDNAの固定化領域、サンプルDNAとの接触領域も拡大するため、高感度な検出が可能となる。なお、液体透過性とは、固相担体の構造に寄らず液体が反対側まで通過するものであればよく、フィルター状、多孔質体等とすることができる。
(核酸のハイブリダイズ方法)
こうしたプローブ保持体2を用いたハイブリダイズ反応は常法に準じて行うことができる。例えば、本ハイブリダイズ装置2あるいはカバー部材10を用いるハイブリダイズ工程は次のようにして行うことができる。基板4としてのDNAマイクロアレイに、基板4への装着側にシール層を有するカバー部材10を該シール層を介して貼着し、開口20から所定の方法で調製したハイブリダイズ液を注入し、2つの開口20の双方をシール材でシールして、25℃以上80℃以下の温度で所定時間静置する。
こうしたプローブ保持体2を用いたハイブリダイズ反応は常法に準じて行うことができる。例えば、本ハイブリダイズ装置2あるいはカバー部材10を用いるハイブリダイズ工程は次のようにして行うことができる。基板4としてのDNAマイクロアレイに、基板4への装着側にシール層を有するカバー部材10を該シール層を介して貼着し、開口20から所定の方法で調製したハイブリダイズ液を注入し、2つの開口20の双方をシール材でシールして、25℃以上80℃以下の温度で所定時間静置する。
本ハイブリダイズ装置2によれば、キャビティ12内でハイブリダイズ反応を行うため、効率的なハイブリダイゼーションが可能である。また、キャビティ12内に露出される少なくとも一部に疎水性領域16を有する場合には、攪拌、振動、摩擦、噴流等を基板4に対して付与するなど、外力を加えなくても、キャビティ12内におけるハイブリダイズ液の対流あるいは被験核酸の拡散を促進してハイブリダイズ反応を促進し一層その効率を向上させることができる。したがって、本ハイブリダイズ装置2あるいはカバー部材10は、静置状態でハイブリダイズ反応を行うハイブリダイズ方法およびかかるハイブリダイズ工程を含む各種の検査方法に好ましく用いることができる。さらに、静置によっても十分なハイブリダイズ反応の促進効果を有するため、作業者の基板4やカバー部材10の取り扱い操作の違いなどの作業者によるバラツキ要因およびハイブリダイズ時のハイブリダイズ装置2の静置場所の水平性や外力の大小などの外部環境によるバラツキ要因による影響を抑制して再現性の高いハイブリダイズ結果を得ることができる。
さらに、本発明のプローブを用いることで、プローブがハイブリダイズによってシグナル変化を生じるため、ハイブリダイゼーション後の状態で(ハイブリダイズしていないDNA等がプローブと混在した状態のまま)、換言すれば洗浄工程を実施しないで、そのままシグナル検出工程を実施することができる。このため、洗浄工程に由来する誤差を排除することができ、より精度の良好な検出が可能となっている。
また、本ハイブリダイズ装置2およびカバー部材10が形成するキャビティ12においてキャビティ12の空間高さおよびその変動係数の制御ならびに対向領域14部分の厚みの制御をすることで、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキを抑制して精度の高いシグナル検出が可能となる。このようなキャビティ12の構造あるいは寸法制御によって、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキ抑制のために従来採用されていた各種の上記した手法を採用することなく簡易な構成でハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキ抑制という効果が得ることができる。なお、このようなキャビティ12の構造あるいは寸法制御は、核酸固定領域6の単位面積当たりのハイブリダイズ液量の均一化あるいは熱緩衝効果によって得られた効果であるということもできる。
また、カバー部材10の対向領域14の基板4に対向される側に凹部及び/又は凸部を有している場合には、静置によっても、好ましい液体の対流が得られ、ハイブリダイズ反応の効率を向上させることができる。
ハイブリダイズ工程においては、キャビティ12内の液体を攪拌する撹拌工程を実施してもよい。撹拌によりハイブリダイズ抑制が向上する。特にキャビティ12内の少なくとも一部に疎水領域16を有するときには、キャビティ12内の水性の液体が撹拌された際に、疎水性領域16において液体が撥液されることにより、キャビティ12内のハイブリダイズ液の移動が促進され、この結果、より一層ハイブリダイズ効率が向上される。
攪拌工程では、一時的、間欠的又は連続的にキャビティ12内の液体を強制的に攪拌してもよい。キャビティ12内の液体の攪拌のためには、例えば、キャビティ12を形成した基板4やハイブリダイズ装置2を動かすことが有効である。具体的な動作としては、基板4を含んでキャビティ12を構成する部材を、回転運動、旋回運動、シーソー運動、往復運動、転倒運動又はこれらの2種類以上の組み合わせなどの各種動作が挙げられる。他には、カバー部材10の対向領域14が弾性変形可能である場合には、この対向領域14を外力により変形させることによってもキャビティ12内の液体の攪拌が可能である。具体的には、ローラーなどの回転体を回転させつつ対向領域14上を移動させたり、その他の押圧部材を対向領域14上を押圧しながら移動させることが挙げられる。こうした撹拌工程は、ハイブリダイズ工程の全体を通じて実施してもよいし、断続的に又はその一部においてのみ実施してもよい。
こうしたキャビティ12内の液体の攪拌にあたっては、キャビティ12内にキャビティ12内の液体と分離して存在する程度に該液体に不溶解性のガス(例えば、空気のほか、窒素などの不活性ガスなど)を存在させた状態とすることが好ましい。通常、ガスがキャビティ12内に存在する場合、キャビティ12が静置状態であると、ガスが定位置で保持されるため、ガスの保持部分(ガス溜り)においてはハイブリダイゼーションが進行しにくいが、ガスを存在させた上でキャビティ12内の液体を移動させるような外力が付加されることで、キャビティ12内の液体の移動を促進することができ、これにより、ハイブリダイズ反応を促進することができる。
なお、キャビティ12を備えてないプローブ保持体を用いたハイブリダイゼーションは、固相担体の形態(基板状かあるいは粒子状か、多孔質状体、液体透過性か)に応じて適宜実施することができる。ガラス製基板など液体透過性を有しない基板状の固相担体の場合には、従来とおり、固相担体表面にサンプル溶液を供給してハイブリダイゼーションを行う。また、例えば、粒子状固相担体の場合には、固相担体をサンプル液に浸漬又は懸濁させた状態でハイブリダイゼーションを行う。さらに、平板状で液体透過性の固相担体の場合には、固相担体をサンプル溶液に浸漬したり、サンプル溶液を固相担体に浸透させた状態で行うことができる。なお、こうしたプローブ保持体を用いる場合であっても、ハイブリダイゼーション後の被験試料を洗浄等により除く必要はなく、ハイブリダイゼーション後の状態でシグナルを検出することができる。
以上のことから、本発明の別の形態として、予め1あるいは2以上の核酸プローブが固定された核酸固定領域を有する基板4と、前記核酸固定領域を含んで核酸ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材10と、を備えるアレイキット、好ましくは、カバー部材の核酸固定化領域に対向する部位など前記キャビティ内部に露出される少なくとも一部に疎水性領域を有する、アレイキットも提供される。こうしたアレイキットによれば、カバー部材10によって効率的なハイブリダイズ反応が可能なチャンバーを形成できるため、容易かつ効率的に核酸のハイブリダイズ反応を行うことができる。カバー部材10は、基板4あるいは基板保持体に対して接着剤や粘着剤等により一体化可能にしておくことができる。さらに、基板4や基板保持体に対して一体化後のカバー部材10は、その後において基板4等から分離可能とされていてもよい。
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例1
[塩基識別型蛍光核酸塩基(ヌクレオチド誘導体N1、N2、N3)を用いたオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブの合成]
[塩基識別型蛍光核酸塩基(ヌクレオチド誘導体N1、N2、N3)を用いたオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブの合成]
以下、表1に示すプローブのうち、プローブ2及び7以外のプローブ(1、3〜5及び6)について塩基識別型蛍光核酸塩基を用いて所定配列のプローブを合成した。
(プローブ1,4、5)
WO2004/058793特許記載のアデニン識別型蛍光性核酸塩基N1(AMPyUとする)を用いて、蛍光塩基含有のオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。3種のオリゴデオキシリボヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ社のDNA 自動合成機(3400 DNA/RNA シンセサイザー)で通常のホスホロアミダイト法に従って合成した。合成した配列は以下の通りであった。なお、5’末端はアミノ修飾されるとともにSpacerC12(12−(4−モノメトキシトリチルアミノ)ドデシル−[(2−シアノエチル)−(N,N’−ジイソプロピル)]ホスホアミダイトが導入された。
WO2004/058793特許記載のアデニン識別型蛍光性核酸塩基N1(AMPyUとする)を用いて、蛍光塩基含有のオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。3種のオリゴデオキシリボヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ社のDNA 自動合成機(3400 DNA/RNA シンセサイザー)で通常のホスホロアミダイト法に従って合成した。合成した配列は以下の通りであった。なお、5’末端はアミノ修飾されるとともにSpacerC12(12−(4−モノメトキシトリチルアミノ)ドデシル−[(2−シアノエチル)−(N,N’−ジイソプロピル)]ホスホアミダイトが導入された。
(プローブ3)
WO2004/058793特許記載のアデニン識別型蛍光性核酸塩基N1(AMPyUとする)及びN2(PyUとする)を用いて、蛍光塩基含有のオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。オリゴデオキシリボヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ社のDNA 自動合成機(3400 DNA/RNA シンセサイザー)で通常のホスホロアミダイト法に従って合成した。合成した配列は以下の通りであった。なお、5’末端はアミノ修飾されるとともにSpacerC12(12−(4−モノメトキシトリチルアミノ)ドデシル−[(2−シアノエチル)−(N,N’−ジイソプロピル)]ホスホアミダイトが導入された。
WO2004/058793特許記載のアデニン識別型蛍光性核酸塩基N1(AMPyUとする)及びN2(PyUとする)を用いて、蛍光塩基含有のオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。オリゴデオキシリボヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ社のDNA 自動合成機(3400 DNA/RNA シンセサイザー)で通常のホスホロアミダイト法に従って合成した。合成した配列は以下の通りであった。なお、5’末端はアミノ修飾されるとともにSpacerC12(12−(4−モノメトキシトリチルアミノ)ドデシル−[(2−シアノエチル)−(N,N’−ジイソプロピル)]ホスホアミダイトが導入された。
(プローブ6)
WO2004/058793特許記載のシトシン認識型蛍光性核酸塩基N3(PyCとする)を用いて、蛍光塩基含有のオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。オリゴデオキシリボヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ社のDNA 自動合成機(3400 DNA/RNA シンセサイザー)で通常のホスホロアミダイト法に従って合成した。合成した配列は以下の通りであった。なお、5’末端はアミノ修飾されるとともにSpacerC12(12−(4−モノメトキシトリチルアミノ)ドデシル−[(2−シアノエチル)−(N,N’−ジイソプロピル)]ホスホアミダイトが導入された。
WO2004/058793特許記載のシトシン認識型蛍光性核酸塩基N3(PyCとする)を用いて、蛍光塩基含有のオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。オリゴデオキシリボヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ社のDNA 自動合成機(3400 DNA/RNA シンセサイザー)で通常のホスホロアミダイト法に従って合成した。合成した配列は以下の通りであった。なお、5’末端はアミノ修飾されるとともにSpacerC12(12−(4−モノメトキシトリチルアミノ)ドデシル−[(2−シアノエチル)−(N,N’−ジイソプロピル)]ホスホアミダイトが導入された。
なお、プローブ1、2、3はALDH(アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ)2の多型のメジャー型検出用として、プローブ6、7はALDH2マイナー型検出用として用いた。また、プローブ4は慢性骨髄性白血病(CML)のフィラデルフィア染色体のbcr/abl遺伝子におけるb3a2型ブレークポイント検出用として、プローブ5はヒト9番染色体正常bcr遺伝子のb3(b3a2型bcr/abl遺伝子を生成する際のブレークポイント近傍配列)検出用として用いた(表1)。
これらのオリゴヌクレオチド合成後、固相担体からオリゴヌクレオチドをアンモニア水を用いて切り出し、エッペンドルフチューブに移し替え、55℃で8 時間加熱して脱保護を行った。得られたオリゴヌクレオチドの水溶液を高速液体クロマトグラフィー(600, Waters)で精製した。精製後、凍結乾燥機で溶媒を減圧留去することで目的物を得た。
実施例2
[オリゴデオキシリボヌクレオチドをプローブとして固定したDNAマイクロアレイの作製]
Amersham Bioscience社製Codelink基板にプローブ1,3,4及び5と5’末端をアミノ基で修飾したプローブ2及び7(株式会社日本遺伝子研究所製)をスポットした。なお、スポット溶液におけるプローブ濃度は50pmol/μl、スポット量は150plとし、上記7種のプローブを5スポットずつスポットした基板を作製した。
[オリゴデオキシリボヌクレオチドをプローブとして固定したDNAマイクロアレイの作製]
Amersham Bioscience社製Codelink基板にプローブ1,3,4及び5と5’末端をアミノ基で修飾したプローブ2及び7(株式会社日本遺伝子研究所製)をスポットした。なお、スポット溶液におけるプローブ濃度は50pmol/μl、スポット量は150plとし、上記7種のプローブを5スポットずつスポットした基板を作製した。
スポット後、20℃、相対湿度75%の条件下で一晩インキュベートした。次に、以下の組成のブロッキング溶液に0.1% SDSとなるように 10%SDS を添加した溶液に15分浸漬した。次に、滅菌水で2回洗浄を行った。次に、4×SSC 0.1%SDS(50℃)で30分洗浄を行った後、滅菌水で1回洗浄を行った。次に、沸騰水(98℃)に2分浸漬した後、滅菌水で2回洗浄を行った。その後、遠心機で5分間、800rpm遠心し、乾燥し、アレイを作製した。
実施例3
[サンプルDNAの調製]
ハイブリダイゼーションサンプルとして、表2に示す各種のサンプル1〜13を調製した。サンプル1〜6は、ALDH2遺伝子メジャー型、マイナー型及びへテロ型に対応する20mer合成DNAであり、サンプル7〜9は、ALDH2遺伝子メジャー型、マイナー型及びへテロ型に対応する189merPCR増幅サンプル(1本鎖化したもの)であり、サンプル10〜13は、b3a2型bcr/abl遺伝子及びb3遺伝子(b3におけルブレークポイント近傍配列)の所定領域に対応する129mer合成DNAであった。
[サンプルDNAの調製]
ハイブリダイゼーションサンプルとして、表2に示す各種のサンプル1〜13を調製した。サンプル1〜6は、ALDH2遺伝子メジャー型、マイナー型及びへテロ型に対応する20mer合成DNAであり、サンプル7〜9は、ALDH2遺伝子メジャー型、マイナー型及びへテロ型に対応する189merPCR増幅サンプル(1本鎖化したもの)であり、サンプル10〜13は、b3a2型bcr/abl遺伝子及びb3遺伝子(b3におけルブレークポイント近傍配列)の所定領域に対応する129mer合成DNAであった。
なお、20merおよび129mer合成DNAは株式会社日本遺伝子研究所製およびシグマジェノシス製のものを用いた。また、189merPCR増幅サンプルであるサンプル7及び8は表3記載のプライマーを用いて、以下の手順で合成した。サーマルサイクラーはGeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems社)を使用し、PCR産物の確認は、電気泳動装置(BIO-RAD社)で行った。
表3
*PrimerにおいてForward方向をF、Reverse方向をRと表記
**メジャーサンプル増幅のゲノム試料としてInvitrogen社CS0DM006YI23を使用
***マイナーサンプル増幅のゲノム試料としてOpenBiosystems社4849418を使用
*PrimerにおいてForward方向をF、Reverse方向をRと表記
**メジャーサンプル増幅のゲノム試料としてInvitrogen社CS0DM006YI23を使用
***マイナーサンプル増幅のゲノム試料としてOpenBiosystems社4849418を使用
増幅したメジャー及びマイナーのPCR増幅サンプルの配列分析を行った。その結果、得られたメジャー増幅産物及びマイナー増幅産物は、それぞれ目的の配列を含む189bpの二本鎖DNAであることを確認した。これら二本鎖サンプルはStreptavidinセファロース中NaOH存在下で一本鎖への変性を行った。
こうして取得した上記各種サンプル(10pmol/50μl)をそれぞれサンプルチューブに加え、0.1M塩化ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解させた溶液(50μl)を添加した。95℃ヒートブロックで2分間加熱した後、室温で5分間放置し、遠心してサンプル液を調製し(最終濃度:100nM)、ハイブリダイゼーションサンプルとした。
実施例4
[キャビティを有するハイブリダイズ装置(チャンバー)の作製]
本実施例で使用したハイブリダイズ装置(チャンバー)は以下の通りである。このチャンバーは、実施例2で作製したDNAマイクロアレイと、ポリカーボネート製スペーサーと、小孔つきガラス(ホウ珪酸ガラス)製カバーとで形成されている。図6に示すように、スペーサーは、プローブが固定化された領域表面上を長円状に区画して所定深さのキャビティを形成可能な孔部を有するシート状形態を有しており、カバーは、アレイ上に形成されたキャビティの開口を閉鎖するとともに、キャビティの長径の両端に位置されるハイブリダイズ液の供給用の小孔を有している。プローブを固定化した基板にスペーサーを一体化し、さらに、小孔付きカバーをキャビティの開口を覆うように一体化することで、キャビティの長径方向に沿った両端部にハイブリダイズ液供給用の開口をそれぞれ有するハイブリダイズ用チャンバーを有したハイブリダイズ装置が構成されるようになっている。なお、このハイブリダイズ装置におけるキャビティは、長径が約45mm、短径が約15mm、内部高さが500μm、及びガラス製カバーの厚みが150μm、容積が約400μlであった。またハイブリダイズ装置は、サンプルDNAとのハイブリダイズにより発生するシグナル変化(ここでは蛍光の発生)を検出可能な透過性を備えるとともに、シグナル変化の検出を妨げない程度の自家蛍光しか生じないように構成されている。こうして構成されたチャンバーを用いて、次の方法でハイブリダイズを実施し、次いで、蛍光測定の後、数値解析した。
[キャビティを有するハイブリダイズ装置(チャンバー)の作製]
本実施例で使用したハイブリダイズ装置(チャンバー)は以下の通りである。このチャンバーは、実施例2で作製したDNAマイクロアレイと、ポリカーボネート製スペーサーと、小孔つきガラス(ホウ珪酸ガラス)製カバーとで形成されている。図6に示すように、スペーサーは、プローブが固定化された領域表面上を長円状に区画して所定深さのキャビティを形成可能な孔部を有するシート状形態を有しており、カバーは、アレイ上に形成されたキャビティの開口を閉鎖するとともに、キャビティの長径の両端に位置されるハイブリダイズ液の供給用の小孔を有している。プローブを固定化した基板にスペーサーを一体化し、さらに、小孔付きカバーをキャビティの開口を覆うように一体化することで、キャビティの長径方向に沿った両端部にハイブリダイズ液供給用の開口をそれぞれ有するハイブリダイズ用チャンバーを有したハイブリダイズ装置が構成されるようになっている。なお、このハイブリダイズ装置におけるキャビティは、長径が約45mm、短径が約15mm、内部高さが500μm、及びガラス製カバーの厚みが150μm、容積が約400μlであった。またハイブリダイズ装置は、サンプルDNAとのハイブリダイズにより発生するシグナル変化(ここでは蛍光の発生)を検出可能な透過性を備えるとともに、シグナル変化の検出を妨げない程度の自家蛍光しか生じないように構成されている。こうして構成されたチャンバーを用いて、次の方法でハイブリダイズを実施し、次いで、蛍光測定の後、数値解析した。
実施例5
[実施例4に記載のハイブリダイズ装置を用いたハイブリダイゼーションの評価]
本実施例は、実施例4で作製したハイブリダイズ装置を用いてハイブリダイズしたときの蛍光シグナルの向上を評価した例である。すなわち、本実施例では、実施例4のハイブリダイズ装置を用いて、実施例3で調製したサンプル1(未標識ALDH2遺伝子メジャー配列サンプル)溶液を前記ハイブリダイズ装置のキャビティを満たした状態で16時間、42℃で静置してハイブリダイズし、プローブ1におけるハイブリダイズ産物の蛍光シグナルを測定し、評価した。対照として、実施例3で作製したDNAマイクロアレイ上に同じサンプルDNA溶液をスポット(200μl、スポット形状:直径約100μmの円状)し、カバーガラスをかぶせ、16hr、42℃で静置ハイブリダイズを行った後、洗浄および乾燥工程を経て、同様に蛍光を測定し、数値解析ソフト(GenePix pro Axon社製)で蛍光シグナルの数値化を行った(対照例5)。本実施例と対照のデバイス、工程およびその特徴を図7に示し、ハイブリダイズ評価及び蛍光シグナル評価の組み合わせを表4に示す。蛍光測定はバイオチップリーダー(Applied Precision 社製)を用いて行った。結果を図7に併せて示す。
表4
[実施例4に記載のハイブリダイズ装置を用いたハイブリダイゼーションの評価]
本実施例は、実施例4で作製したハイブリダイズ装置を用いてハイブリダイズしたときの蛍光シグナルの向上を評価した例である。すなわち、本実施例では、実施例4のハイブリダイズ装置を用いて、実施例3で調製したサンプル1(未標識ALDH2遺伝子メジャー配列サンプル)溶液を前記ハイブリダイズ装置のキャビティを満たした状態で16時間、42℃で静置してハイブリダイズし、プローブ1におけるハイブリダイズ産物の蛍光シグナルを測定し、評価した。対照として、実施例3で作製したDNAマイクロアレイ上に同じサンプルDNA溶液をスポット(200μl、スポット形状:直径約100μmの円状)し、カバーガラスをかぶせ、16hr、42℃で静置ハイブリダイズを行った後、洗浄および乾燥工程を経て、同様に蛍光を測定し、数値解析ソフト(GenePix pro Axon社製)で蛍光シグナルの数値化を行った(対照例5)。本実施例と対照のデバイス、工程およびその特徴を図7に示し、ハイブリダイズ評価及び蛍光シグナル評価の組み合わせを表4に示す。蛍光測定はバイオチップリーダー(Applied Precision 社製)を用いて行った。結果を図7に併せて示す。
表4
図7に示すように実施例5の蛍光シグナルは対照例5の1.8倍であり、サンプルDNAの検出能が向上していることがわかった。この結果によれば、実施例4で作製したハイブリダイズ装置を用いることにより、ハイブリダイズ効率を向上させることができることが明らかであった。また対照例5と比べ、実施例5では、ハイブリダイズから蛍光測定までの間の工程は不要なため、洗浄および乾燥に要する時間(およそ2時間)を短縮できた。
実施例6
本実施例は、Cy3蛍光試薬等で標識されていないALDH2遺伝子サンプルの検出を評価した例である。本実施例では、実施例5と同様、実施例4のハイブリダイズ装置を用いて、実施例3で調製した未標識のサンプルDNA溶液(サンプル1〜3)でハイブリダイズし、ハイブリダイズ産物の蛍光シグナルと同一プローブのスポット間の蛍光シグナルのバラツキ(CV)を評価した。対照としてCy3蛍光試薬で標識されたサンプルDNA溶液(サンプル4〜6)でハイブリダイズし、洗浄、乾燥後に蛍光を測定した。ハイブリダイズおよび蛍光シグナルの評価の組み合わせを表5に示す。蛍光測定はバイオチップリーダー(Applied Precision 社製)を用いて行った。結果を図8及び図9に示す。
本実施例は、Cy3蛍光試薬等で標識されていないALDH2遺伝子サンプルの検出を評価した例である。本実施例では、実施例5と同様、実施例4のハイブリダイズ装置を用いて、実施例3で調製した未標識のサンプルDNA溶液(サンプル1〜3)でハイブリダイズし、ハイブリダイズ産物の蛍光シグナルと同一プローブのスポット間の蛍光シグナルのバラツキ(CV)を評価した。対照としてCy3蛍光試薬で標識されたサンプルDNA溶液(サンプル4〜6)でハイブリダイズし、洗浄、乾燥後に蛍光を測定した。ハイブリダイズおよび蛍光シグナルの評価の組み合わせを表5に示す。蛍光測定はバイオチップリーダー(Applied Precision 社製)を用いて行った。結果を図8及び図9に示す。
図8と図9とを比較すると、図9の対照例6ではCVが高く、Cy3蛍光試薬で標識された各サンプルDNA(サンプル4〜6)の検出は困難であった。一方、図8の実施例6ではCVが低く、標識されていない各サンプルDNA(サンプル1〜3)をそれぞれ検出することができた。本実施例により、実施例4で作製した塩基認識型蛍光性核酸塩基含有のオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブが固定されたDNAマイクロアレイに対してチャンバーを備えるハイブリダイズ装置を用いることで、標識されていないサンプルDNAであってもALDH2遺伝子の一塩基多型を精度よく確実に検出できることがわかった。
実施例7
本実施例は、実施例4で作製したハイブリダイズ装置が形成するキャビティ内の液体を攪拌することと、DNAマイクロアレイ内の同一プローブのスポット間の蛍光シグナルのばらつき(CV)との関係を評価した例である。本実施例では、実施例5と同様、実施例4のハイブリダイズ装置(蛍光塩基含有のオリゴデオキシリボヌクレオチドが固定)に、実施例3で調製したサンプルDNAの調製に記載の未標識の長鎖DNAサンプル溶液3種(サンプル7〜9)を加え、ハイブリダイズ装置のチャンバーに供給したサンプル溶液を攪拌しながらハイブリダイズ(42℃、16hr)し、ハイブリダイズ産物の蛍光シグナルと同一プローブのスポット間の蛍光シグナルのCVを評価した。なお、キャビティ内のサンプル溶液の撹拌は、ハイブリダイズ装置を回転させることによって行った。対照として、サンプル溶液を加えたDNAマイクロアレイを静置(42℃、16hr)してハイブリダイズする以外は、実施例7と同様に操作して、ハイブリダイズ産物の蛍光シグナルと同一プローブのスポット間の蛍光シグナルのCVを評価した。ハイブリダイズ評価及び蛍光シグナルの評価の組み合わせを表6に示す。また、蛍光測定はバイオチップリーダー(Applied Precision 社製)を用いて行った。結果を図10に示す。
本実施例は、実施例4で作製したハイブリダイズ装置が形成するキャビティ内の液体を攪拌することと、DNAマイクロアレイ内の同一プローブのスポット間の蛍光シグナルのばらつき(CV)との関係を評価した例である。本実施例では、実施例5と同様、実施例4のハイブリダイズ装置(蛍光塩基含有のオリゴデオキシリボヌクレオチドが固定)に、実施例3で調製したサンプルDNAの調製に記載の未標識の長鎖DNAサンプル溶液3種(サンプル7〜9)を加え、ハイブリダイズ装置のチャンバーに供給したサンプル溶液を攪拌しながらハイブリダイズ(42℃、16hr)し、ハイブリダイズ産物の蛍光シグナルと同一プローブのスポット間の蛍光シグナルのCVを評価した。なお、キャビティ内のサンプル溶液の撹拌は、ハイブリダイズ装置を回転させることによって行った。対照として、サンプル溶液を加えたDNAマイクロアレイを静置(42℃、16hr)してハイブリダイズする以外は、実施例7と同様に操作して、ハイブリダイズ産物の蛍光シグナルと同一プローブのスポット間の蛍光シグナルのCVを評価した。ハイブリダイズ評価及び蛍光シグナルの評価の組み合わせを表6に示す。また、蛍光測定はバイオチップリーダー(Applied Precision 社製)を用いて行った。結果を図10に示す。
表6
図10に示すように、実施例4で作製したハイブリダイズ装置においてハイブリダイズ溶液を撹拌することで、サンプル間の蛍光シグナルの差は広がる結果を得た。一方、同一プローブのスポット間の蛍光シグナルのCVは6〜8%から5%未満に低減し、サンプル検出の信頼性が向上する結果を得た。以上のことから、キャビティ内のハイブリダイズ溶液を撹拌することにより、ハイブリダイゼーション効率が向上するとともに、検出精度が向上することがわかった。
図10に示すように、実施例4で作製したハイブリダイズ装置においてハイブリダイズ溶液を撹拌することで、サンプル間の蛍光シグナルの差は広がる結果を得た。一方、同一プローブのスポット間の蛍光シグナルのCVは6〜8%から5%未満に低減し、サンプル検出の信頼性が向上する結果を得た。以上のことから、キャビティ内のハイブリダイズ溶液を撹拌することにより、ハイブリダイゼーション効率が向上するとともに、検出精度が向上することがわかった。
実施例8
本実施例は、ALDH2遺伝子の変異部位検出用の蛍光塩基を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの定常領域配列中に内部標準検出用の異なる蛍光塩基をもつプローブによるALDH2遺伝子サンプルの検出を評価した例である。本実施例では、実施例5と同様、実施例4のハイブリダイズ装置に、実施例3で調製したサンプルDNAの調製に記載の未標識の長鎖DNAサンプル溶液種(サンプル7:ALDH2遺伝子メジャーホモサンプル、サンプル8:ALDH2遺伝子マイナーホモサンプル、サンプル9:ALDH2遺伝子へテロサンプル)を加え、ハイブリダイズ装置のキャビティに供給したハイブリダイズ溶液を、ハイブリダイズ装置を回転させることにより攪拌しながらハイブリダイズ(42℃、16hr)し、ハイブリダイズ産物の変異部位検出用の蛍光塩基由来の蛍光シグナルと内部標準検出用の蛍光塩基由来の蛍光シグナルとを測定し、評価した。ハイブリダイズ評価及び蛍光シグナルの評価の組み合わせを表7に示す。また、蛍光測定はバイオチップリーダー(Applied Precision 社製)を用いて行った。結果を図11に示す。
表7
本実施例は、ALDH2遺伝子の変異部位検出用の蛍光塩基を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの定常領域配列中に内部標準検出用の異なる蛍光塩基をもつプローブによるALDH2遺伝子サンプルの検出を評価した例である。本実施例では、実施例5と同様、実施例4のハイブリダイズ装置に、実施例3で調製したサンプルDNAの調製に記載の未標識の長鎖DNAサンプル溶液種(サンプル7:ALDH2遺伝子メジャーホモサンプル、サンプル8:ALDH2遺伝子マイナーホモサンプル、サンプル9:ALDH2遺伝子へテロサンプル)を加え、ハイブリダイズ装置のキャビティに供給したハイブリダイズ溶液を、ハイブリダイズ装置を回転させることにより攪拌しながらハイブリダイズ(42℃、16hr)し、ハイブリダイズ産物の変異部位検出用の蛍光塩基由来の蛍光シグナルと内部標準検出用の蛍光塩基由来の蛍光シグナルとを測定し、評価した。ハイブリダイズ評価及び蛍光シグナルの評価の組み合わせを表7に示す。また、蛍光測定はバイオチップリーダー(Applied Precision 社製)を用いて行った。結果を図11に示す。
表7
図11に示すように、内部標準検出用蛍光塩基シグナル強度を横軸に変異部位検出用蛍光塩基シグナルを縦軸に取ったとき、内部標準用蛍光塩基シグナルの強度はおおよそ一定であったのに対して、変異部位検出用蛍光塩基シグナルは、サンプル7〜9における変異の有無にほぼ対応して変化していた。内部標準検出用蛍光塩基シグナル強度に対する変異部位検出用蛍光塩基シグナルの比率は、サンプル7〜9(メジャーホモ、マイナーホモ、ヘテロ)における変異部位の比率に対応していることがわかった。以上のことから、プローブ3において用いた定常領域に導入した塩基識別型蛍光性核酸塩基は、内部標準シグナルとして使用できることがわかった。すなわち、こうした内部標準検出用塩基識別型蛍光性核酸塩基を有するプローブによれば、アレイに供給されるサンプル量の変動、標識量の変動及び遺伝子ごとのDNA量の変動に関わらず、サンプル中のターゲット部位の相対量を検出することができる。したがって、通常、変異遺伝子を検出するためには、メジャー型(例えば、プローブ1)のプローブとマイナー型(例えば、プローブ6)のプローブの2種類のプローブを用いて評価を行っていたが、本実施例によれば、1種類のプローブでしかもミスハイブリダイゼーションの影響もなく容易に変異遺伝子を検出できることが分かった。
実施例9
本実施例は、実施例塩基識別型蛍光性核酸塩基含有のオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブを用いて、慢性骨髄性白血病の原因遺伝子とされるbcr/abl遺伝子のサンプルの検出を評価した例である。すなわち、本実施例では、実施例5と同様、実施例4のハイブリダイズ装置を用いて、実施例3で調製した未標識のサンプルDNA溶液(サンプル10:bcr遺伝子のb3近傍の正常配列サンプル、サンプル11:bcr/abl遺伝子のb3a2型のブレークポイント近傍配列サンプル)でハイブリダイズし、ハイブリダイズ産物の蛍光シグナルを測定し、評価した。対照として、プローブ4及び5を用い、Cy3蛍光試薬で標識されたサンプルDNA溶液(サンプル12:bcr遺伝子のb3近傍の正常配列サンプル、サンプル13:bcr/abl遺伝子のb3a2型のブレークポイント近傍配列サンプル)でハイブリダイズし、洗浄、乾燥後にCy3の蛍光を測定した。ハイブリダイズ評価及び蛍光シグナルの評価の組み合わせを表8に示す。蛍光測定はバイオチップリーダー(Applied Precision 社製)を用いて行った。結果を図12及び図13に示す。
表8
本実施例は、実施例塩基識別型蛍光性核酸塩基含有のオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブを用いて、慢性骨髄性白血病の原因遺伝子とされるbcr/abl遺伝子のサンプルの検出を評価した例である。すなわち、本実施例では、実施例5と同様、実施例4のハイブリダイズ装置を用いて、実施例3で調製した未標識のサンプルDNA溶液(サンプル10:bcr遺伝子のb3近傍の正常配列サンプル、サンプル11:bcr/abl遺伝子のb3a2型のブレークポイント近傍配列サンプル)でハイブリダイズし、ハイブリダイズ産物の蛍光シグナルを測定し、評価した。対照として、プローブ4及び5を用い、Cy3蛍光試薬で標識されたサンプルDNA溶液(サンプル12:bcr遺伝子のb3近傍の正常配列サンプル、サンプル13:bcr/abl遺伝子のb3a2型のブレークポイント近傍配列サンプル)でハイブリダイズし、洗浄、乾燥後にCy3の蛍光を測定した。ハイブリダイズ評価及び蛍光シグナルの評価の組み合わせを表8に示す。蛍光測定はバイオチップリーダー(Applied Precision 社製)を用いて行った。結果を図12及び図13に示す。
表8
図12及び図13を比較すると、図12の実施例9では、bcr/abl遺伝子のb3a2型ブレークポイント特異的プローブ4と2種類のDNAサンプルのハイブリダイズ結果は、明らかにキメラ遺伝子のブレークポイント近傍配列サンプル(サンプル11)に有意に高いシグナルを示した。また、bcr正常配列を検出するプローブ5と2種類のDNAサンプルのハイブリダイズ結果は、反対に、bcr正常配列サンプル(サンプル10)に有意に高いシグナルを示した。これに対して、図13の対照例9では、プローブ4及びプローブ5に対するそれぞれのハイブリダイズ産物の蛍光シグナルの強度は、いずれのサンプル(サンプル12:bcr遺伝子正常配列サンプル、サンプル13:bcr/ablキメラ遺伝子ブレークポイント配列サンプル)の間に有意なシグナル強度の差が認められなかった。
以上のことから、本実施例によれば、共通配列を有しサンプルのミスハイブリダイゼーションを生じうるプローブであっても、両者プローブ間で配列の特異性の高い領域(例えば、ブレークポイント近傍あるいは両プローブ間で共通しない部分)に塩基識別型蛍光核酸塩基を含め、該塩基の蛍光シグナルを検出することで、容易に2種類のサンプルを区別することができることがわかった。なお、これらの2種類のプローブの配列はbcr遺伝子のb3遺伝子の部分配列を識別する配列を共通して有するとともに、2種類のサンプルにも同様にb3遺伝子の部分配列を共通していて有している。このため、b3正常配列サンプル(サンプル12)は、b3a2プローブ(プローブ4)に対してミスハイブリダイゼーションし、b3a2キメラ配列サンプル(サンプル13)は、b3近傍正常配列プローブ(プローブ5)にミスハイブリダイゼーションする。プローブ4及びプローブ5に対する同様のミスハイブリダイゼーションは、サンプル10及び11においても生じるが、プローブ4及び5に含まれる塩基識別型蛍光性塩基は、ミスハイブリダイゼーションの場合には、蛍光を発しない。このため、実施例9のようにプローブ4及び5における蛍光性塩基のシグナルを検出することで、共通部分を有するプローブであっても完全に一致するDNAサンプルのみを検出することができたと考えられる。
実施例10
[粒子状で多孔質の固相担体に固定されたBDFプローブによる評価]
本実施例は、塩基識別型蛍光性塩基含有ALDH2遺伝子メジャー配列プローブ(プローブ1)と塩基識別型蛍光性塩基含有ALDH2遺伝子マイナー配列プローブ(プローブ6)を別々に固定した粒子状で多孔質の固相担体を用い、ALDH2遺伝子サンプルの検出を評価した例である。固相担体材料としては、無機化合物、合成高分子化合物、天然高分子化合物、ガラスなどが挙げられるが、本実施例では、まず初めに、表面をプラズマ照射により活性化し、脱気した多孔質ガラス粒子(平均粒子径3.1μm、ポアサイズ30nm)を、エポキシを官能基にもつシラン剤(信越シリコーン、LS-2940)1wt%水溶液に浸漬(1hr、常温)してカップリングさせ、余剰分を水で洗浄したものを用いた。
[粒子状で多孔質の固相担体に固定されたBDFプローブによる評価]
本実施例は、塩基識別型蛍光性塩基含有ALDH2遺伝子メジャー配列プローブ(プローブ1)と塩基識別型蛍光性塩基含有ALDH2遺伝子マイナー配列プローブ(プローブ6)を別々に固定した粒子状で多孔質の固相担体を用い、ALDH2遺伝子サンプルの検出を評価した例である。固相担体材料としては、無機化合物、合成高分子化合物、天然高分子化合物、ガラスなどが挙げられるが、本実施例では、まず初めに、表面をプラズマ照射により活性化し、脱気した多孔質ガラス粒子(平均粒子径3.1μm、ポアサイズ30nm)を、エポキシを官能基にもつシラン剤(信越シリコーン、LS-2940)1wt%水溶液に浸漬(1hr、常温)してカップリングさせ、余剰分を水で洗浄したものを用いた。
プローブ1及び6の水溶液に上記多孔質ガラス粒子を加え、表面のシラン剤のエポキシ基と共有結合させた(16hrインキュベート)後、余剰分をPBS溶液で洗浄した。次に、これらのプローブをそれぞれ固定化したガラス粒子の等量混合物に対して、実施例3で調製した未標識の長鎖DNAサンプル溶液3種(サンプル7〜9、ALDH2遺伝子メジャーホモサンプル、同マイナーホモサンプル及び同へテロサンプル)をそれぞれ供給し、ハイブリダイズ(42℃、15min)を行った。最後に、フローサイトメーターで測定を行い、各プローブの蛍光性塩基のシグナル(プローブ1については、励起波長360±20nm、蛍光波長460±25nm、プローブ6については励起波長360±20nm、蛍光波長400nm)を測定した。フローサイトメーターによる測定はCyto ACE-300(日本分光製)を用いて行った。結果を図14に示す。
図14に示すように、それぞれのサンプルにおけるメジャー配列、マイナー配列の比率に応じた蛍光シグナル比が得られた。すなわち、本実施例によれば、粒子状の固相担体を用いた場合であっても、効率的なハイブリダイゼーションと特異的なハイブリダイゼーションが可能であることがわかった。
実施例11
[平板状で液体透過性の固相担体に固定されたBDFプローブによる評価]
本実施例は、塩基識別型蛍光性塩基含有ALDH2遺伝子メジャー配列プローブ(プローブ1)と塩基識別型蛍光性塩基含有ALDH2遺伝子マイナー配列プローブ(プローブ6)を固定した平板状で液体透過性の固相担体を用い、ALDH2遺伝子サンプルの検出を評価した例である。固相担体材料としては、無機化合物、合成高分子化合物、天然高分子化合物、ガラスなどが挙げられるが、本実施例では、まず初めに、表面をプラズマ照射により活性化し、脱気した多孔質ガラス板(ポアサイズ10nm)を、エポキシを官能基にもつシラン剤(信越シリコーン、LS-2940)1wt%水溶液に浸漬(1hr、常温)してカップリングさせ、余剰分を水で洗浄したものを用いた。
[平板状で液体透過性の固相担体に固定されたBDFプローブによる評価]
本実施例は、塩基識別型蛍光性塩基含有ALDH2遺伝子メジャー配列プローブ(プローブ1)と塩基識別型蛍光性塩基含有ALDH2遺伝子マイナー配列プローブ(プローブ6)を固定した平板状で液体透過性の固相担体を用い、ALDH2遺伝子サンプルの検出を評価した例である。固相担体材料としては、無機化合物、合成高分子化合物、天然高分子化合物、ガラスなどが挙げられるが、本実施例では、まず初めに、表面をプラズマ照射により活性化し、脱気した多孔質ガラス板(ポアサイズ10nm)を、エポキシを官能基にもつシラン剤(信越シリコーン、LS-2940)1wt%水溶液に浸漬(1hr、常温)してカップリングさせ、余剰分を水で洗浄したものを用いた。
次に、プローブ1及び6を予め定めたガラス板上の位置にインクジェット方式でスポットし、表面のシラン剤のエポキシ基と共有結合させた(16hrインキュベート)後、余剰分をPBS溶液で洗浄した。このガラス板内に、実施例3で調製したサンプルDNAの調製に記載の、未標識の長鎖DNAサンプル溶液3種(サンプル7〜9、ALDH2遺伝子メジャーホモサンプル、同マイナーホモサンプル及び同へテロサンプル)をそれぞれ供給し、含侵させて満たした状態でハイブリダイズ反応(42℃、15min)を行った。サンプル溶液は洗浄することなく、ガラス板内に満たされた状態で、蛍光顕微鏡(オリンパスBX50)およびCCDカメラ(オリンパスM3204-C)でスポット画像を取得した後、各プローブの蛍光塩基シグナル(プローブ1については、励起波長360±20nm、蛍光波長460±25nm、プローブ6については励起波長360±20nm、蛍光波長400nm)を測定し、評価した。結果を、図15に示す。
図15に示すように、それぞれのサンプルにおけるメジャー配列、マイナー配列の比率に応じた蛍光シグナル比が得られた。すなわち、本実施例によれば、粒子状の固相担体を用いた場合であっても、効率的なハイブリダイゼーションと特異的なハイブリダイゼーションが可能であることがわかった。
本明細書の一部には、2002年12月26日に出願された米国仮出願番号60/435,995、2003年9月5日に出願された日本国特許出願番号2003−314556、2003年11月20日に出願された米国仮出願番号60/523,318、2003年12月24日に出願された国際出願番号PCT/JP2003/016602、2004年3月9日に出願された米国出願番号10/795,436、および2005年3月9日に出願された国際出願番号PCT/JP2005/004703の全内容が引用により組み込まれる。
本発明は2005年1月14日に出願された米国仮出願番号60/643,603、および2005年3月11日に出願された米国仮出願番号60/660,334を優先権主張の基礎としており、引用によりその内容のすべてが編入される。
本発明は、生物由来の試料中の核酸の検出装置の製造及びその検出結果を利用する産業に利用できる。
配列番号1〜7:合成ヌクレオチド
配列番号14〜17:合成ヌクレオチド
配列番号14〜17:合成ヌクレオチド
Claims (67)
- アレイであって、
基板と、
該基板に固定され、被験試料とハイブリダイズすることによりシグナル変化を生じる核酸プローブと、
前記被験試料を含み前記被験試料と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応のための液体を充填可能な1又は2以上の空間と、
を備える、アレイ。 - 前記空間は、前記基板に形成され前記核酸プローブの固定領域を含む凹部内に備えられる、請求項1に記載のアレイ。
- カバー部材を備えている、請求項1に記載のアレイ。
- 前記空間は、前記核酸プローブの固定領域に対して所定高さを持って覆うカバー部材の中空部内に備えられる、請求項1又は2に記載のアレイ。
- 前記カバー部材は、前記アレイを収納可能な容器の一部を構成する、請求項4に記載のアレイ。
- 前記カバー部材は、前記基板に対して脱着可能に備えられる、請求項3〜5のいずれかに記載のアレイ。
- 前記カバー部材は、前記アレイに対して接着剤又は粘着剤によって固定される、請求項3〜6のいずれかに記載のアレイ。
- 前記カバー部材は前記核酸プローブと前記被験試料とのハイブリダイズにより発生するシグナル変化を検出可能な透過性を備えている、請求項3〜7のいずれかに記載のアレイ。
- 前記カバー部材には、前記ハイブリダイズ反応のための液体を前記空間に充填するための注入口を備える、請求項3〜8のいずれかに記載のアレイ。
- 前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域の厚みは300μm以上である、請求項3〜9のいずれかに記載のアレイ。
- 前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域を形成する材料は、ガラス、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂ならびにこれらのフッ化物およびポリハロゲン化ビニルからなる群から選択される1種あるいは2種以上からなる、請求項3〜10のいずれかに記載の装置。
- 前記空間の内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有している、請求項1〜11のいずれかに記載のアレイ。
- 前記カバー部材の少なくとも一部に疎水性領域を有している、請求項3〜12のいずれかに記載のアレイ。
- 前記疎水性領域は、前記核酸プローブの固定領域に対向する領域に備えられる、請求項12又は13に記載のアレイ。
- 前記疎水性領域は、水の接触角が30°以上である、請求項12〜14のいずれかに記載のアレイ。
- 前記空間の高さ(前記固定領域とこれに対向する対向領域との距離)の変動係数が50%以下及び/又は前記空間の高さの平均値が15μm以上である、請求項1〜15のいずれかに記載のアレイ。
- 前記核酸プローブは、ハイブリダイズにより、蛍光波長のシフト、蛍光強度の増大及び蛍光強度の減少のいずれかあるいは組み合わせからなる蛍光シグナルが変化するプローブである、請求項1〜16のいずれかに記載のアレイ。
- 前記核酸プローブは、塩基識別型蛍光性核酸塩基を含む、請求項17に記載のアレイ。
- 前記被験試料は標識されていない核酸である、請求項1〜18いずれかに記載のアレイ。
- 前記核酸プローブは20mer以上100mer以下であり、前記シグナルの検出精度がCV10%以下、好ましくは5%以下である、請求項1〜19いずれかに記載のアレイ。
- 体質(1塩基多型など)診断用、疾患遺伝子(遺伝子キメラなどの各種遺伝子変異)診断用、治療予後診断用、薬剤反応性診断用及び薬剤耐性診断用のいずれかあるいは2種以上の用途を有する、請求項1〜20記載のアレイ。
- 核酸のハイブリダイズ方法であって、
請求項1〜21いずれかに記載のアレイの前記空間に被験試料を含む液体を充填してハイブリダイズを実施するハイブリダイズ工程を備える、方法。 - 前記ハイブリダイズ工程は、前記アレイを静置して又は一時的若しくは間欠的若しくは連続的に前記空間内の液体を強制攪拌してハイブリダイズを実施する工程である、請求項22記載の方法。
- 標識されていない核酸を被験試料とする、請求項22又は23記載の方法。
- 前記ハイブリダイズ工程後、前記核酸プローブに基づくシグナル変化を検出する検出工程を備える、請求項22〜24のいずれかに記載の方法。
- 前記検出工程は、前記ハイブリダイズ工程後の前記被験試料を含む液体が前記空間に充填されたままの状態で前記シグナル変化を検出する工程である、請求項25に記載の方法。
- 前記検出工程は、前記ハイブリダイズ工程後に洗浄工程を経ることなく実施する、請求項26に記載の方法。
- 核酸ハイブリダイズ用のプローブ保持体であって、
固相担体と、
該固相担体に識別可能に固定され、被験試料とハイブリダイズすることによりシグナル変化を生じるプローブと、
を備える、プローブ保持体。 - 前記固相担体は、平板状あるいは粒子状である、請求項28に記載のプローブ保持体。
- 前記固相担体は、液体透過性又は多孔質である、請求項28又は29に記載のプローブ保持体。
- 前記固相担体に対して単一の種類のプローブが固定され、前記固相担体は色、蛍光、記号、数字、文字及び柄等から選択されるプローブ識別情報を有している、請求項28〜30のいずれかに記載のプローブ保持体。
- 前記プローブは、ハイブリダイズにより、蛍光波長のシフト、蛍光強度の増大及び蛍光強度の減少のいずれかあるいは組み合わせからなる蛍光シグナルが変化するプローブである、請求項28〜31のいずれかに記載のプローブ保持体。
- 前記プローブは、塩基識別型蛍光性核酸塩基を含む、請求項32に記載のプローブ保持体。
- 前記被験試料は標識されていない核酸である、請求項28〜33のいずれかに記載のプローブ保持体。
- 前記被験試料を含む液体に浸漬又は懸濁された状態で使用するための、請求項28〜34のいずれかに記載のプローブ保持体。
- 核酸のハイブリダイズ方法であって、
請求項28〜35のいずれかに記載のプローブ保持体を含む空間に被験試料を含有する液体を充填してハイブリダイズを実施するハイブリダイズ工程を備える、方法。 - 前記ハイブリダイズ工程後、前記被験試料を含む液体の存在下で前記シグナル変化を検出する工程である、請求項36に記載の方法。
- 核酸ハイブリダイズ用のプローブであって、
以下の(a)及び(b);
(a)被験試料について検出しようとする塩基配列上の特徴を検出可能な領域
(b)前記(a)領域における塩基配列上の特徴の近傍に存在する被験試料について定常的な塩基配列((1)変異が未だ検出されていない領域、(2)変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが推測される領域、(3)変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが確認された領域などが挙げられる。)を検出可能な領域
を備えており、
前記(a)の領域及び前記(b)の領域におけるハイブリダイズによりそれぞれ異なるシグナル変化を生じる、プローブ。 - 前記(a)の領域及び前記(b)の領域におけるハイブリダイズによって生じる前記シグナル変化は、蛍光波長のシフト、蛍光強度の増大及び蛍光強度の減少のいずれかあるいは組み合わせからなる蛍光シグナルが変化するプローブである、請求項38に記載のプローブ。
- 前記プローブは、塩基識別型蛍光性核酸塩基を含む、請求項38又は39に記載のプローブ。
- 前記被験試料は標識されていない核酸である、請求項38〜40のいずれかに記載のプローブ。
- 核酸ハイブリダイズ用のプローブ保持体であって、
固相担体と、
請求項38〜41のいずれかに記載のプローブと、
を備える、プローブ保持体。 - 前記固相担体は、平板状あるいは粒子状である、請求項42に記載のプローブ保持体。
- 前記固相担体は、液体透過性又は多孔質である、請求項42又は43に記載のプローブ保持体。
- 前記固相担体に対して単一の種類のプローブが固定され、前記固相担体は色、蛍光、記号、数字、文字及び柄等から選択されるプローブ識別情報を有している、請求項42〜44のいずれかに記載のプローブ保持体。
- 前記被験試料を含む液体に浸漬又は懸濁された状態で使用するための、請求項42〜45のいずれかに記載のプローブ保持体。
- 前記プローブは20mer以上100mer以下である、請求項42〜46のいずれかに記載のプローブ保持体。
- 前記シグナルの検出精度がCV10%以下である、請求項42〜47のいずれかに記載のプローブ保持体。
- 体質(1塩基多型など)診断用、疾患遺伝子(遺伝子キメラなどの各種遺伝子変異)診断用、治療予後診断用、薬剤反応性診断用及び薬剤耐性診断用のいずれかあるいは2種以上の用途を有する、請求項42〜48のいずれかに記載のプローブ保持体。
- 核酸ハイブリダイズ装置であって、
請求項42〜49のいずれかに記載のプローブ保持体と、
前記プローブ保持体における前記プローブとのハイブリダイズ反応のための液体を充填可能な1又は2以上の空間と、
を備える、核酸ハイブリダイズ装置。 - 前記空間の内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有する、請求項50に記載の核酸ハイブリダイズ装置。
- 前記疎水性領域は、水の接触角が30°以上である、請求項51に記載の核酸ハイブリダイズ装置。
- 前記疎水性領域は、ガラス、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂ならびにこれらのフッ化物およびポリハロゲン化ビニルからなる群から選択される1種あるいは2種以上で構成される、請求項51又は52に記載の核酸ハイブリダイズ装置。
- 前記空間の開口を覆うカバー部材を備えている、請求項51〜53のいずれかに記載の核酸ハイブリダイズ装置。
- 前記固相担体は基板であり、前記カバー部材を、前記基板に対して脱着可能に備える、請求項54に記載の核酸ハイブリダイズ装置。
- 前記カバー部材は前記プローブと前記被験試料とのハイブリダイズにより発生するシグナル変化を検出可能な透過性を備える、請求項54又は55に記載の核酸ハイブリダイズ装置。
- 前記カバー部材の前記プローブの固定領域に対向する領域の厚みは300μm以上である、54〜56のいずれかに記載の核酸ハイブリダイズ装置。
- 前記カバー部材の少なくとも一部に疎水性領域を有する、請求項54〜57のいずれかに記載の核酸ハイブリダイズ装置。
- 前記疎水性領域は、プローブが固定化された基板上の領域に対向する領域に備えられる、請求項58に記載の核酸ハイブリダイズ装置。
- 前記空間の高さ(前記基板上のプローブ固定領域とこれに対向する対向領域との距離)の変動係数が50%以下及び/又は前記空間の高さの平均値が15μm以上である、請求項54〜59のいずれかに記載の核酸ハイブリダイズ装置。
- 核酸のハイブリダイズ方法であって、
請求項42〜49のいずれかに記載のプローブ保持体を含む空間に被験試料を含有する液体を充填してハイブリダイズを実施するハイブリダイズ工程を備える、方法。 - 前記ハイブリダイズ工程は、前記ハイブリダイズ装置を静置して又は一時的若しくは間欠的若しくは連続的に前記空間内の液体を強制攪拌してハイブリダイズを実施する工程である、請求項61に記載の方法。
- 前記ハイブリダイズ工程後、前記プローブに基づくシグナル変化を検出する検出工程を備える、請求項61又は62に記載の方法。
- 前記検出工程は、前記ハイブリダイズ工程後の前記被験試料を含む液体の存在下で前記シグナル変化を検出する工程である、請求項63に記載の方法。
- 前記検出工程は、前記ハイブリダイズ工程後に洗浄工程を経ることなく実施する、請求項64に記載の方法。
- 核酸ハイブリダイズ用のプローブであって、
被験個体又は被験個体を含む群(家系、民族、人種等)において、定常的な塩基配列((1)変異が未だ検出されていない領域、(2)変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが推測される領域、(3)変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが確認された領域などが挙げられる。)を検出可能な領域を備えており、
当該領域におけるハイブリダイズによりシグナル変化を生じる、プローブ。 - 前記定常的塩基配列を検出可能な領域におけるハイブリダイズによって生じる前記シグナル変化は、蛍光波長のシフト、蛍光強度の増大及び蛍光強度の減少のいずれかあるいは組み合わせからなる蛍光シグナルが変化するプローブである、請求項66に記載のプローブ。
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A02 | Decision of refusal |
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