CN114574466A - 一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用 - Google Patents

一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114574466A
CN114574466A CN202210495574.5A CN202210495574A CN114574466A CN 114574466 A CN114574466 A CN 114574466A CN 202210495574 A CN202210495574 A CN 202210495574A CN 114574466 A CN114574466 A CN 114574466A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ile
leu
lys
capping enzyme
asn
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210495574.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114574466B (zh
Inventor
滕以刚
袁灿灿
王雪琪
郭帅
王小敏
吴浩东
柴常生
惠丰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd
Original Assignee
Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd filed Critical Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority to CN202210495574.5A priority Critical patent/CN114574466B/zh
Publication of CN114574466A publication Critical patent/CN114574466A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114574466B publication Critical patent/CN114574466B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用。具体技术方案为：一种嵌合加帽酶，由牛痘病毒加帽酶的N端两个结构域和其它单链加帽酶的C端甲基转移酶的结构域嵌合而成。本发明构建了一种新的嵌合加帽酶，与野生型加帽酶例如牛痘病毒加帽酶相比，具有更高的蛋白表达量、更简单的纯化方式、更优的酶活性以及更优的热稳定性，因此具有更广泛的应用前景。

Description

一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用。
背景技术
真核生物中mRNA经转录后修饰在5'端形成一个特殊结构，即帽子结构，该结构对mRNA的稳定、转运与翻译过程均有较重要作用，并且可以降低其在细胞内的免疫原性。因此，在许多治疗应用中，为mRNA加帽非常重要。
加帽酶是催化形成帽子结构的有效酶，其兼具RNA三磷酸酯酶活性（TPase）、鸟苷酰基转移酶活性（GTase）和鸟嘌呤甲基转移酶活性（MTase），可将7-甲基鸟嘌呤帽结构（m7Gppp）连接到RNA的5'末端（m7GpppN，即Cap0结构）。
目前mRNA的加帽途径主要有两种。第一是基于加帽酶的转录后修饰，此方法可以合成传统的帽子结构：m7GpppN（Cap0）、m7GpppNmpN（Cap1）和m7GpppNmpNm（Cap2）；由于帽子结构mRNA 5’端没有游离的末端磷酸基团，所以可降低mRNA降解的风险。同时Cap1、Cap2mRNA后面两个核苷酸上的甲基分别封闭了磷酸酯键上游离的2’OH基团，因而对RNA酶A、T1、T2都很稳定。第二是在体外转录过程中添加帽类似物，比如抗-反转帽类似物（ARCA）的帽类似物和加帽的二核苷酸，这种方法通常被称为“共转录加帽”。
共转录加帽的方法更为通用、简便和便宜，并且可以将各种修饰的帽结构进行多样化设计。但此方法中有部分竞争性帽类似物会导致mRNA不完全加帽，同时部分帽类似物会反向定位到mRNA的末端。因此，与共转录加帽相比，利用加帽酶进行加帽的收率更高。
目前主要使用的加帽酶为牛痘病毒加帽酶，其含有一个大亚基D1和一个小亚基D12。牛痘病毒加帽酶的表达纯化效率较低，导致其价格居高不下，限制了其工业化生产。除牛痘病毒加帽酶外，其他种属来源的加帽酶的加帽率只有其50～80%。
因此，业内亟需一种加帽效果更稳定、加帽率更高，更易规模化、工业化生产的加帽酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种嵌合加帽酶，由牛痘病毒加帽酶的N端两个结构域和其它单链加帽酶的C端甲基转移酶的结构域嵌合而成。
优选的，所述其它单链加帽酶为非洲猪瘟病毒加帽酶、巨大病毒加帽酶或阿米巴病毒加帽酶中的任意一种。
优选的，所述其它单链加帽酶的C端甲基转移酶的结构域来自非洲猪瘟病毒来源的pNP868R或阿米巴病毒来源的D5b。
相应的，一种嵌合加帽酶，其蛋白质序列如SEQ ID NO.1所示。
相应的，一种嵌合加帽酶，其蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。
相应的，一种嵌合加帽酶，其蛋白质序列如SEQ ID NO.3所示。
相应的，含有所述嵌合加帽酶的重组表达载体或重组细胞株。
相应的，所述嵌合加帽酶的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备所述嵌合加帽酶的重组表达载体；
（2）培养所述重组表达载体，得菌液；
（3）向所述菌液中加入IPTG，诱导细胞表达蛋白，离心收集菌体沉淀；
（4）向所述菌体沉淀中加入裂解缓冲液，重悬菌体，破碎菌体，离心取上清液；
（5）进行镍离子亲和层析，蛋白变性电泳检测各个洗脱峰，收集含有目的蛋白的样品，即得所述嵌合加帽酶。
优选的，步骤（2）中，培养用培养基为2YT培养基。
优选的，所述2YT培养基中含有50μg/mL硫酸卡那霉素。
优选的，步骤（2）中，先用2YT培养基中培养获得种子液，再将种子液接种到新的2YT培养基中，培养获得菌液。
优选的，所述培养为振荡培养，培养条件为：37℃、150～200r/min。
优选的，步骤（3）中，IPTG加入至终浓度为0.1～0.5mM。
优选的，步骤（3）中，IPTG加入至终浓度为0.1mM。
优选的，步骤（3）中，诱导细胞表达蛋白的条件为：16℃诱导18h。
优选的，步骤（3）中，离心收集菌体沉淀的条件为：4℃下以4000g的转速离心30min。
优选的，步骤（4）中，所述的裂解缓冲液的组分为：20mM Tris HCl、100mM NaCl、10%v/v Glycerol、10mM Imidazole，pH=8.0。
优选的，步骤（4）中，超声破碎菌体，超声条件为：640W，超声3s，间隔5s，持续30min。
优选的，步骤（5）中，所述镍离子亲和层析的结合缓冲液的组分为：20mM TrisHCl、100mM NaCl、10%v/v Glycerol、10mM Imidazole、pH=8.0。
优选的，步骤（5）中，所述镍离子亲和层析的洗脱缓冲液的组分为：20mM TrisHCl、100mM NaCl、10%v/v Glycerol、500mM Imidazole、pH=8.0。
优选的，步骤（5）中，镍离子亲和层析的步骤为：
将层析柱接入快速蛋白质纯化仪柱位阀中，先用超纯水清洗系统和柱子，再用镍离子亲和层析的结合缓冲液平衡柱子，用样品泵将步骤（4）获取的上清液上样，上样结束后，先用镍离子亲和层析的结合缓冲液清洗柱子，再用镍离子亲和层析的洗脱缓冲液进行0～100％的线性洗脱。
相应的，所述嵌合加帽酶在mRNA加帽中的应用。
相应的，利用所述嵌合加帽酶制备的试剂、试纸或试剂盒。
相应的，一种试剂盒，包括所述嵌合加帽酶，还包括待加帽的目标RNA、加帽缓冲剂、鸟苷三磷酸和S-腺苷甲硫氨酸中的至少一种。
优选的，所述加帽缓冲剂的组成包括：50mM Tris HCl，5mM KCl，1mM MgCl2，1mMDTT，pH=8.0。
本发明具有以下有益效果：本发明构建了一种新的嵌合加帽酶，与野生型加帽酶例如牛痘病毒加帽酶相比，具有更高的蛋白表达量、更简单的纯化方式、更优的酶活性以及更优的热稳定性，因此具有更广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明的嵌合加帽酶结构示意图；
图2为牛痘病毒加帽酶（VCE）的蛋白表达情况示意图；
图3为牛痘病毒加帽酶和阿米巴病毒加帽酶的嵌合加帽酶（VFCE）蛋白表达情况示意图；
图4为牛痘病毒加帽酶和非洲猪瘟病毒加帽酶的嵌合加帽酶（VACE）的蛋白表达情况示意图；
图5为牛痘病毒加帽酶和巨大病毒加帽酶的嵌合加帽酶（VMCE）的蛋白表达情况示意图；
图6为7种加帽酶在37℃下的酶活检测结果示意图；
图7为加帽酶在50℃下的酶活检测结果示意图；
图8为未加帽的RNA质谱结果示意图；
图9为加帽后的RNA质谱结果示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种嵌合加帽酶，结构如图1所示，具体由牛痘病毒加帽酶的N端两个结构域和其它单链加帽酶的C端甲基转移酶的结构域嵌合而成。优选的方案为：所述C端甲基转移酶的结构域来自非洲猪瘟病毒加帽酶、巨大病毒加帽酶或阿米巴病毒加帽酶。更优选的方案为：所述C端甲基转移酶的结构域来自非洲猪瘟病毒来源的pNP868R（ACCESSION，UFQ11546）或阿米巴病毒来源的D5b（ACCESSION，KU702949.1）。
本发明还提供了所述嵌合加帽酶的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）制备所述嵌合加帽酶的重组表达载体。
（2）取所述嵌合加帽酶的重组表达载体，接种于2YT培养基（含50μg/mL硫酸卡那霉素）中，振荡培养，得到种子液。将所述种子液按1:100的体积比接种于新的2YT培养基（含50μg/mL硫酸卡那霉素）中，再次进行振荡培养，培养至OD600=0.6～0.8，得菌液。振荡培养的条件优选为：37℃、150～200r/min。
（3）向所述菌液中加入IPTG至终浓度为0.1～0.5mM，优选为IPTG的终浓度为0.1mM，16℃诱导18h，诱导细胞表达蛋白，随后在4℃下以4000g的转速离心30min，离心收集菌体沉淀。
（4）向所述菌体沉淀中加入裂解缓冲液重悬菌体，裂解缓冲液用量为：每克菌体沉淀中加入6mL裂解缓冲液，超声破碎菌体，离心取上清液。超声条件优选为：640W，超声3s，间隔5s，持续30min；离心条件优选为：4℃以12000g的转速离心40min；所述的裂解缓冲液的组分为：20mM Tris HCl、100mM NaCl、10%v/v Glycerol、10mM Imidazole，pH=8.0。
（5）将离心后的上清液进行镍离子亲和层析，蛋白变性电泳检测各个洗脱峰，收集含有目的蛋白的样品，即得所述嵌合体。所述镍离子亲和层析的结合缓冲液的组分为：20mMTris HCl、100mM NaCl、10%v/v Glycerol、10mM Imidazole、pH=8.0。所述镍离子亲和层析的洗脱缓冲液的组分为：20mM Tris HCl、100mM NaCl、10%v/v Glycerol、500mMImidazole、pH=8.0。
本发明还提供了所述嵌合加帽酶的应用方法。本领域技术人员可根据领域内的常规技术手段，将所述嵌合加帽酶用于mRNA的加帽工艺。具体还可将所述嵌合加帽酶进一步制备为试剂、试纸、试剂盒等。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所获得的数据均为进行至少3次重复后获得的平均值，且各重复获得的均为有效数据。
实施例一：制备、纯化各类嵌合加帽酶
1、采用本领域常规技术手段，构建多种嵌合加帽酶表达载体，具体包括：VACE（牛痘病毒与非洲猪瘟病毒的嵌合加帽酶），其蛋白质序列如SEQ ID NO.1所示；VFCE（牛痘病毒与阿米巴病毒的嵌合加帽酶），其蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示；VMCE（牛痘病毒与巨大病毒的嵌合加帽酶），其蛋白质序列如SEQ ID NO.3所示。并同时构建未嵌合的各加帽酶表达载体，具体包括：牛痘病毒加帽酶（VCE）、非洲猪瘟病毒加帽酶（ACE）、阿米巴病毒加帽酶（FCE）和巨大病毒加帽酶（MCE）。
2、将步骤1的各加帽酶和嵌合加帽酶重组表达载体分别转化到宿主细胞E.coliBL21（DE3）中。培养后，分别挑取单菌落，接种至液体2YT培养基中，培养至OD600为0.8。再加入IPTG至IPTG终浓度为0.1mM，在16℃下诱导18h。随后收集各菌体，超声破碎，然后通过SDSPAGE电泳检测各目的蛋白的表达，结果如图2～5所示。图2为牛痘病毒加帽酶（VCE）的表达情况，其中，上面的箭头代表VCE的大亚基D1，下面的箭头代表VCE的小亚基D12；图3为牛痘病毒加帽酶和阿米巴病毒加帽酶的嵌合加帽酶（VFCE）的表达情况；图4为牛痘病毒加帽酶和非洲猪瘟病毒加帽酶的嵌合加帽酶（VACE）的表达情况；图5为牛痘病毒加帽酶和巨大病毒加帽酶的嵌合加帽酶（VMCE）的表达情况。图2～5中，M代表宽范围（10～180kDa）蛋白上样Marker；1代表诱导表达前菌体细胞破碎后离心处理所得的上清液；2代表诱导表达前菌体细胞破碎后离心处理所得的沉淀；3为诱导表达后细胞破碎后离心处理所得的上清液；4为诱导表达后菌体细胞破碎后离心处理所得的沉淀。
结果显示，VCE诱导表达后上清液的条带较弱，表达量较低；而本步骤制备的转化体能够高效表达VACE、VFCE和VMCE，并且上清液有明显蛋白条带，证实了嵌合加帽酶的可溶性表达，且与VCE相比，具有更高的蛋白表达量。
3、将步骤2获得的能够表达VACE和VFCE的阳性转化体菌种接种至含50μg/mL硫酸卡那霉素的200mL 2YT培养基中，37℃摇床振荡培养过夜。取过夜培养的种子液，按种子液与培养基体积比为1:100接种至5L新的含有50μg/mL硫酸卡那霉素的2YT培养基中，37℃摇床继续振荡培养4h，培养至OD600＝0.8。随后向每瓶菌液加入IPTG至IPTG终浓度为0.1mM，16℃继续振荡诱导18h；离心收集诱导后菌体并称重，记录菌体湿重，储存于-80℃。
4、菌体超声破碎。取冻存的诱导表达菌体，根据步骤3记录的菌体湿重，按每克菌体加入6mL裂解缓冲液（20mM Tris HCl、100mM NaCl、10%v/v Glycerol、10mM Imidazole、pH=8.0）重悬菌体，用超声波细胞破碎仪裂解菌体，超声条件为：功率640W，超声3s，停5s，持续30min。将裂解后菌体放入高速冷冻离心机，4℃下12000g离心40min，取上清液至250mL灭菌玻璃瓶中。取样20μL，以诱导表达前菌体细胞破碎液作为对照。
5、镍离子亲和层析纯化。选用SDL-100 5mL的层析柱（购自YEASEN），结合缓冲液为缓冲液A：20mM Tris HCl、100mM NaCl、10%v/v Glycerol、10mM Imidazole、pH=8.0；洗脱缓冲液为缓冲液B：20mM Tris HCl、100mM NaCl、10%v/v Glycerol、500mM Imidazole、pH=8.0。
将SDL-100 5mL接入快速蛋白质纯化仪柱位阀中，先用超纯水清洗系统和柱子，再用缓冲液A平衡柱子，然后用样品泵将步骤4获取的各上清液上样，上样结束后，先用缓冲液A清洗柱子，再用缓冲液B进行0～100％的线性洗脱，并收集洗脱组分，最终获得纯化的嵌合加帽酶。
实施例二：各加帽酶的酶活力及加帽率对比展示
1、TPase活性检测。在50μL 1×RNA加帽缓冲剂（50mM Tris HCl,5mM KCl,1mMMgCl2,1mM DTT,pH=8.0）中，37℃下分别将1μg实施例一步骤1的加帽酶或嵌合加帽酶与0.5mM GTP温育60分钟。使用高效液相色谱（HPLC）分析TPase反应活性。GTP和GDP分别对应的峰面积被定量并用于计算60分钟加帽反应结束时TPase的相对活性。
2、MTase活性检测。在20μL 1×RNA加帽缓冲剂（50mM Tris HCl,5mM KCl,1mMMgCl2,1mM DTT,pH=8.0）中额外添加2mM SAM，37℃下将1μg实施例一步骤1的加帽酶或嵌合加帽酶（共7种）与0.5mM GpppA温育60分钟。使用高效液相色谱（HPLC）分析MTase反应活性。GpppA和m7GpppA分别对应的峰面积被定量并用于计算60分钟加帽反应结束时MTase的相对活性。
3、GTase活性检测及加帽率测定。在20μL 1×RNA加帽缓冲剂（50mM Tris HCl,5mMKCl,1mM MgCl2,1mM DTT,pH=8.0）中额外添加0.5mM GTP和0.4mM SAM，37℃下将1μg实施例一步骤1的加帽酶或嵌合加帽酶与10μg未加帽的目标RNA温育60分钟。使用HPLC-MS分析GTase反应活性，Capped RNA（m7Gppp-RNA）和uncapped RNA分别对应的峰面积被定量并用于计算60分钟加帽反应结束时GTase的相对活性及加帽率（Capping eff）。
加帽率=加帽的RNA对应的峰面积/总投入RNA对应的峰面积×100%。各峰面积根据质谱结果计算所得，数据较多，在此不进行赘述。步骤1、2、3的结果如图6所示。结果显示：嵌合加帽酶（尤其VACE和VFCE）较牛痘病毒加帽酶（VCE）具有更高的TPase和GTase活性，且呈现更高的加帽率。嵌合加帽酶较单独的单链加帽酶（ACE、FCE、MCE）具有更高的MTase活性，且呈现更高的加帽率。以VCE的加帽率为100%计，相对加帽率=加帽酶的加帽率/VCE的加帽率×100%。VCE、ACE、FCE、MCE、VACE、VFCE和VMCE相对加帽率分别为：100%、83%、86%、60%、115%、116%和87%。因此，嵌合加帽酶（尤其VACE和VFCE）具有更高的酶活力和加帽率。
实施例三：各加帽酶在高温下的酶活力及加帽率对比展示
用实施例二的检测方法分别测试实施例一的VACE、VFCE、VCE在50℃下的酶活性和加帽率。结果如图7所示。结果表明：嵌合加帽酶（尤其VACE和VFCE）较牛痘病毒加帽酶（VCE）具有更高的TPase、GTase和MTase活性，且呈现更高的加帽率（VCE、VACE和VFCE相对加帽率分别为：100%、168%和176%）。因此，嵌合加帽酶（尤其VACE和VFCE）较牛痘病毒加帽酶（VCE）具有更高的温度耐受性。
实施例四：利用嵌合加帽酶制备的试剂盒
利用实施例一制备的VACE和VFCE制备mRNA加帽试剂盒。所述试剂盒包含未加帽的目标RNA、加帽缓冲剂、鸟苷三磷酸(GTP)、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）中的至少一种和嵌合加帽酶。所述的加帽缓冲剂的组成为：50mM Tris HCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mM DTT，pH=8.0。
所述的试剂盒各组分具体用量及操作步骤如下：先将10μg未加帽的目标RNA进行70℃变性5min，然后立即置于冰上至少5min。接着，在20μL 1×RNA加帽缓冲剂（50mM TrisHCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mM DTT,pH=8.0）中额外添加0.5mM GTP和0.4mM SAM，37℃下将10U加帽酶与上述10μg变性后的RNA温育60分钟，即可获得加帽的RNA。使用HPLC-MS分析其加帽的效果，图8为未加帽的RNA质谱结果示意图；图9为加帽后的RNA质谱结果示意图。结果表明：加帽的RNA较未加帽的RNA分子量增加了一个帽子（甲基化的鸟苷）的大小（279），证明加帽成功。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 翌圣生物科技(上海) 股份有限公司
<120> 一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 827
<212> PRT
<213> 牛痘病毒与非洲猪瘟病毒嵌合加帽酶(VACE)
<400> 1
Met Asp Ala Asn Val Val Ser Ser Ser Thr Ile Ala Thr Tyr Ile Asp
1 5 10 15
Ala Leu Ala Lys Asn Ala Ser Glu Leu Glu Gln Arg Ser Thr Ala Tyr
20 25 30
Glu Ile Asn Asn Glu Leu Glu Leu Val Phe Ile Lys Pro Pro Leu Ile
35 40 45
Thr Leu Thr Asn Val Val Asn Ile Ser Thr Ile Gln Glu Ser Phe Ile
50 55 60
Arg Phe Thr Val Thr Asn Lys Glu Gly Val Lys Ile Arg Thr Lys Ile
65 70 75 80
Pro Leu Ser Lys Val His Gly Leu Asp Val Lys Asn Val Gln Leu Val
85 90 95
Asp Ala Ile Asp Asn Ile Val Trp Glu Lys Lys Ser Leu Val Thr Glu
100 105 110
Asn Arg Leu His Lys Glu Cys Leu Leu Arg Leu Ser Thr Glu Glu Arg
115 120 125
His Ile Phe Leu Asp Tyr Lys Lys Tyr Gly Ser Ser Ile Arg Leu Glu
130 135 140
Leu Val Asn Leu Ile Gln Ala Lys Thr Lys Asn Phe Thr Ile Asp Phe
145 150 155 160
Lys Leu Lys Tyr Phe Leu Gly Ser Gly Ala Gln Ser Lys Ser Ser Leu
165 170 175
Leu His Ala Ile Asn His Pro Lys Ser Arg Pro Asn Thr Ser Leu Glu
180 185 190
Ile Glu Phe Thr Pro Arg Asp Asn Glu Thr Val Pro Tyr Asp Glu Leu
195 200 205
Ile Lys Glu Leu Thr Thr Leu Ser Arg His Ile Phe Met Ala Ser Pro
210 215 220
Glu Asn Val Ile Leu Ser Pro Pro Ile Asn Ala Pro Ile Lys Thr Phe
225 230 235 240
Met Leu Pro Lys Gln Asp Ile Val Gly Leu Asp Leu Glu Asn Leu Tyr
245 250 255
Ala Val Thr Lys Thr Asp Gly Ile Pro Ile Thr Ile Arg Val Thr Ser
260 265 270
Asn Gly Leu Tyr Cys Tyr Phe Thr His Leu Gly Tyr Ile Ile Arg Tyr
275 280 285
Pro Val Lys Arg Ile Ile Asp Ser Glu Val Val Val Phe Gly Glu Ala
290 295 300
Val Lys Asp Lys Asn Trp Thr Val Tyr Leu Ile Lys Leu Ile Glu Pro
305 310 315 320
Val Asn Ala Ile Asn Asp Arg Leu Glu Glu Ser Lys Tyr Val Glu Ser
325 330 335
Lys Leu Val Asp Ile Cys Asp Arg Ile Val Phe Lys Ser Lys Lys Tyr
340 345 350
Glu Gly Pro Phe Thr Thr Thr Ser Glu Val Val Asp Met Leu Ser Thr
355 360 365
Tyr Leu Pro Lys Gln Pro Glu Gly Val Ile Leu Phe Tyr Ser Lys Gly
370 375 380
Pro Lys Ser Asn Ile Asp Phe Lys Ile Lys Lys Glu Asn Thr Ile Asp
385 390 395 400
Gln Thr Ala Asn Val Val Phe Arg Tyr Met Ser Ser Glu Pro Ile Ile
405 410 415
Phe Gly Glu Ser Ser Ile Phe Val Glu Tyr Lys Lys Phe Ser Asn Asp
420 425 430
Lys Gly Phe Pro Lys Glu Tyr Gly Ser Gly Lys Ile Val Leu Tyr Asn
435 440 445
Gly Val Asn Tyr Leu Asn Asn Ile Tyr Cys Leu Glu Tyr Ile Asn Thr
450 455 460
His Asn Glu Val Gly Ile Lys Ser Val Val Val Pro Ile Lys Phe Ile
465 470 475 480
Ala Glu Phe Leu Val Asn Gly Glu Ile Leu Lys Pro Arg Ile Asp Lys
485 490 495
Thr Met Lys Tyr Ile Asn Ser Glu Asp Tyr Tyr Gly Asn Gln His Asn
500 505 510
Ile Ile Val Glu His Leu Arg Asp Gln Ser Ile Lys Ile Gly Asp Ile
515 520 525
Phe Asn Glu Asp Lys Leu Ser Asp Val Gly His Gln Tyr Ala Asn Asn
530 535 540
Met Tyr Phe Ala Gly Ala Lys Thr Gly Ile Tyr Arg Ala Gln Thr Ala
545 550 555 560
Leu Ile Ser Phe Ile Lys Gln Glu Ile Ile Gln Lys Ile Ser His Gln
565 570 575
Ser Trp Val Ile Asp Leu Gly Ile Gly Lys Gly Gln Asp Leu Gly Arg
580 585 590
Tyr Leu Asp Ala Gly Val Arg His Leu Val Gly Ile Asp Lys Asp Gln
595 600 605
Thr Ala Leu Ala Glu Leu Val Tyr Arg Lys Phe Ser His Ala Thr Thr
610 615 620
Arg Gln His Lys His Ala Thr Asn Ile Tyr Val Leu His Gln Asp Leu
625 630 635 640
Ala Glu Pro Ala Lys Glu Ile Ser Glu Lys Val His Gln Ile Tyr Gly
645 650 655
Phe Pro Lys Glu Gly Ala Ser Ser Ile Val Ser Asn Leu Phe Ile His
660 665 670
Tyr Leu Met Lys Asn Thr Gln Gln Val Glu Asn Leu Ala Val Leu Cys
675 680 685
His Lys Leu Leu Gln Pro Gly Gly Met Val Trp Phe Thr Thr Met Leu
690 695 700
Gly Glu Gln Val Leu Glu Leu Leu His Glu Asn Arg Ile Glu Leu Asn
705 710 715 720
Glu Val Trp Glu Ala Arg Glu Asn Glu Val Val Lys Phe Ala Ile Lys
725 730 735
Arg Leu Phe Lys Glu Asp Ile Leu Gln Glu Thr Gly Gln Glu Ile Gly
740 745 750
Val Leu Leu Pro Phe Ser Asn Gly Asp Phe Tyr Asn Glu Tyr Leu Val
755 760 765
Asn Thr Ala Phe Leu Ile Lys Ile Phe Lys His His Gly Phe Ser Leu
770 775 780
Val Gln Lys Gln Ser Phe Lys Asp Trp Ile Pro Glu Phe Gln Asn Phe
785 790 795 800
Ser Lys Ser Leu Tyr Lys Ile Leu Thr Glu Ala Asp Lys Thr Trp Thr
805 810 815
Ser Leu Phe Gly Phe Ile Cys Leu Arg Lys Asn
820 825
<210> 2
<211> 849
<212> PRT
<213> 牛痘病毒与阿米巴病毒嵌合加帽酶(VFCE)
<400> 2
Met Asp Ala Asn Val Val Ser Ser Ser Thr Ile Ala Thr Tyr Ile Asp
1 5 10 15
Ala Leu Ala Lys Asn Ala Ser Glu Leu Glu Gln Arg Ser Thr Ala Tyr
20 25 30
Glu Ile Asn Asn Glu Leu Glu Leu Val Phe Ile Lys Pro Pro Leu Ile
35 40 45
Thr Leu Thr Asn Val Val Asn Ile Ser Thr Ile Gln Glu Ser Phe Ile
50 55 60
Arg Phe Thr Val Thr Asn Lys Glu Gly Val Lys Ile Arg Thr Lys Ile
65 70 75 80
Pro Leu Ser Lys Val His Gly Leu Asp Val Lys Asn Val Gln Leu Val
85 90 95
Asp Ala Ile Asp Asn Ile Val Trp Glu Lys Lys Ser Leu Val Thr Glu
100 105 110
Asn Arg Leu His Lys Glu Cys Leu Leu Arg Leu Ser Thr Glu Glu Arg
115 120 125
His Ile Phe Leu Asp Tyr Lys Lys Tyr Gly Ser Ser Ile Arg Leu Glu
130 135 140
Leu Val Asn Leu Ile Gln Ala Lys Thr Lys Asn Phe Thr Ile Asp Phe
145 150 155 160
Lys Leu Lys Tyr Phe Leu Gly Ser Gly Ala Gln Ser Lys Ser Ser Leu
165 170 175
Leu His Ala Ile Asn His Pro Lys Ser Arg Pro Asn Thr Ser Leu Glu
180 185 190
Ile Glu Phe Thr Pro Arg Asp Asn Glu Thr Val Pro Tyr Asp Glu Leu
195 200 205
Ile Lys Glu Leu Thr Thr Leu Ser Arg His Ile Phe Met Ala Ser Pro
210 215 220
Glu Asn Val Ile Leu Ser Pro Pro Ile Asn Ala Pro Ile Lys Thr Phe
225 230 235 240
Met Leu Pro Lys Gln Asp Ile Val Gly Leu Asp Leu Glu Asn Leu Tyr
245 250 255
Ala Val Thr Lys Thr Asp Gly Ile Pro Ile Thr Ile Arg Val Thr Ser
260 265 270
Asn Gly Leu Tyr Cys Tyr Phe Thr His Leu Gly Tyr Ile Ile Arg Tyr
275 280 285
Pro Val Lys Arg Ile Ile Asp Ser Glu Val Val Val Phe Gly Glu Ala
290 295 300
Val Lys Asp Lys Asn Trp Thr Val Tyr Leu Ile Lys Leu Ile Glu Pro
305 310 315 320
Val Asn Ala Ile Asn Asp Arg Leu Glu Glu Ser Lys Tyr Val Glu Ser
325 330 335
Lys Leu Val Asp Ile Cys Asp Arg Ile Val Phe Lys Ser Lys Lys Tyr
340 345 350
Glu Gly Pro Phe Thr Thr Thr Ser Glu Val Val Asp Met Leu Ser Thr
355 360 365
Tyr Leu Pro Lys Gln Pro Glu Gly Val Ile Leu Phe Tyr Ser Lys Gly
370 375 380
Pro Lys Ser Asn Ile Asp Phe Lys Ile Lys Lys Glu Asn Thr Ile Asp
385 390 395 400
Gln Thr Ala Asn Val Val Phe Arg Tyr Met Ser Ser Glu Pro Ile Ile
405 410 415
Phe Gly Glu Ser Ser Ile Phe Val Glu Tyr Lys Lys Phe Ser Asn Asp
420 425 430
Lys Gly Phe Pro Lys Glu Tyr Gly Ser Gly Lys Ile Val Leu Tyr Asn
435 440 445
Gly Val Asn Tyr Leu Asn Asn Ile Tyr Cys Leu Glu Tyr Ile Asn Thr
450 455 460
His Asn Glu Val Gly Ile Lys Ser Val Val Val Pro Ile Lys Phe Ile
465 470 475 480
Ala Glu Phe Leu Val Asn Gly Glu Ile Leu Lys Pro Arg Ile Asp Lys
485 490 495
Thr Met Lys Tyr Ile Asn Ser Glu Asp Tyr Tyr Gly Asn Gln His Asn
500 505 510
Ile Ile Val Glu His Leu Arg Asp Gln Ser Ile Lys Ile Gly Asp Ile
515 520 525
Phe Asn Glu Asp Lys Leu Ser Asp Val Gly His Gln Tyr Ala Asn Asn
530 535 540
Tyr Phe Glu Lys Asn Lys Ser Asp Ile Tyr Val Ala Pro Asn Lys Tyr
545 550 555 560
Arg Arg Tyr Leu Ile Lys Ser Leu Phe Gly Arg Tyr Leu Arg Asp Ala
565 570 575
Lys Trp Val Ile Asp Ala Ala Ala Gly Arg Gly Ala Asp Leu His Leu
580 585 590
Tyr Lys Ala Glu Cys Val Glu His Leu Leu Ala Ile Asp Ile Asp Pro
595 600 605
Thr Ala Ile Ser Glu Leu Val Arg Arg Arg Asn Glu Ile Thr Gly Tyr
610 615 620
Asn Lys Ser His Arg Gly Gly Arg Asn Met His Ser His Arg Gly Gln
625 630 635 640
Ser His Cys Ala Lys Ser Thr Ser Leu His Ala Leu Val Ala Asp Leu
645 650 655
Arg Glu Asn Pro Asp Val Leu Ile Pro Lys Ile Ile Gln Ser Arg Pro
660 665 670
His Glu Arg Cys Tyr Asp Ala Ile Val Ile Asn Phe Ala Ile His Tyr
675 680 685
Leu Cys Asp Thr Asp Glu His Ile Arg Asp Phe Leu Ile Thr Val Ser
690 695 700
Arg Leu Leu Ala Pro Asn Gly Val Phe Ile Phe Thr Thr Met Asp Gly
705 710 715 720
Glu Ser Ile Val Lys Leu Leu Ala Asp His Lys Val Arg Pro Gly Glu
725 730 735
Ala Trp Thr Ile His Thr Gly Asp Val Asn Ser Pro Asp Ser Thr Val
740 745 750
Pro Lys Tyr Ser Ile Arg Arg Leu Tyr Asp Ser Asp Lys Leu Thr Lys
755 760 765
Thr Gly Gln Gln Ile Glu Val Leu Leu Pro Met Ser Gly Glu Met Lys
770 775 780
Ala Glu Pro Leu Cys Asn Ile Lys Asn Ile Ile Ser Met Ala Arg Lys
785 790 795 800
Met Gly Leu Asp Leu Val Glu Ser Ala Asn Phe Ser Val Leu Tyr Glu
805 810 815
Ala Tyr Ala Arg Asp Tyr Pro Asp Ile Tyr Ala Arg Met Thr Pro Asp
820 825 830
Asp Lys Leu Tyr Asn Asp Leu His Thr Tyr Ala Val Phe Lys Arg Lys
835 840 845
Lys
<210> 3
<211> 848
<212> PRT
<213> 牛痘病毒与巨大病毒嵌合加帽酶(VMCE)
<400> 3
Met Asp Ala Asn Val Val Ser Ser Ser Thr Ile Ala Thr Tyr Ile Asp
1 5 10 15
Ala Leu Ala Lys Asn Ala Ser Glu Leu Glu Gln Arg Ser Thr Ala Tyr
20 25 30
Glu Ile Asn Asn Glu Leu Glu Leu Val Phe Ile Lys Pro Pro Leu Ile
35 40 45
Thr Leu Thr Asn Val Val Asn Ile Ser Thr Ile Gln Glu Ser Phe Ile
50 55 60
Arg Phe Thr Val Thr Asn Lys Glu Gly Val Lys Ile Arg Thr Lys Ile
65 70 75 80
Pro Leu Ser Lys Val His Gly Leu Asp Val Lys Asn Val Gln Leu Val
85 90 95
Asp Ala Ile Asp Asn Ile Val Trp Glu Lys Lys Ser Leu Val Thr Glu
100 105 110
Asn Arg Leu His Lys Glu Cys Leu Leu Arg Leu Ser Thr Glu Glu Arg
115 120 125
His Ile Phe Leu Asp Tyr Lys Lys Tyr Gly Ser Ser Ile Arg Leu Glu
130 135 140
Leu Val Asn Leu Ile Gln Ala Lys Thr Lys Asn Phe Thr Ile Asp Phe
145 150 155 160
Lys Leu Lys Tyr Phe Leu Gly Ser Gly Ala Gln Ser Lys Ser Ser Leu
165 170 175
Leu His Ala Ile Asn His Pro Lys Ser Arg Pro Asn Thr Ser Leu Glu
180 185 190
Ile Glu Phe Thr Pro Arg Asp Asn Glu Thr Val Pro Tyr Asp Glu Leu
195 200 205
Ile Lys Glu Leu Thr Thr Leu Ser Arg His Ile Phe Met Ala Ser Pro
210 215 220
Glu Asn Val Ile Leu Ser Pro Pro Ile Asn Ala Pro Ile Lys Thr Phe
225 230 235 240
Met Leu Pro Lys Gln Asp Ile Val Gly Leu Asp Leu Glu Asn Leu Tyr
245 250 255
Ala Val Thr Lys Thr Asp Gly Ile Pro Ile Thr Ile Arg Val Thr Ser
260 265 270
Asn Gly Leu Tyr Cys Tyr Phe Thr His Leu Gly Tyr Ile Ile Arg Tyr
275 280 285
Pro Val Lys Arg Ile Ile Asp Ser Glu Val Val Val Phe Gly Glu Ala
290 295 300
Val Lys Asp Lys Asn Trp Thr Val Tyr Leu Ile Lys Leu Ile Glu Pro
305 310 315 320
Val Asn Ala Ile Asn Asp Arg Leu Glu Glu Ser Lys Tyr Val Glu Ser
325 330 335
Lys Leu Val Asp Ile Cys Asp Arg Ile Val Phe Lys Ser Lys Lys Tyr
340 345 350
Glu Gly Pro Phe Thr Thr Thr Ser Glu Val Val Asp Met Leu Ser Thr
355 360 365
Tyr Leu Pro Lys Gln Pro Glu Gly Val Ile Leu Phe Tyr Ser Lys Gly
370 375 380
Pro Lys Ser Asn Ile Asp Phe Lys Ile Lys Lys Glu Asn Thr Ile Asp
385 390 395 400
Gln Thr Ala Asn Val Val Phe Arg Tyr Met Ser Ser Glu Pro Ile Ile
405 410 415
Phe Gly Glu Ser Ser Ile Phe Val Glu Tyr Lys Lys Phe Ser Asn Asp
420 425 430
Lys Gly Phe Pro Lys Glu Tyr Gly Ser Gly Lys Ile Val Leu Tyr Asn
435 440 445
Gly Val Asn Tyr Leu Asn Asn Ile Tyr Cys Leu Glu Tyr Ile Asn Thr
450 455 460
His Asn Glu Val Gly Ile Lys Ser Val Val Val Pro Ile Lys Phe Ile
465 470 475 480
Ala Glu Phe Leu Val Asn Gly Glu Ile Leu Lys Pro Arg Ile Asp Lys
485 490 495
Thr Met Lys Tyr Ile Asn Ser Glu Asp Tyr Tyr Gly Asn Gln His Asn
500 505 510
Ile Ile Val Glu His Leu Arg Asp Gln Ser Ile Lys Ile Gly Asp Ile
515 520 525
Phe Asn Glu Asp Lys Leu Ser Asp Val Gly His Gln Tyr Ala Asn Asn
530 535 540
Leu Thr Tyr Tyr Gln Lys Asn Thr Ser Asn Ala Ala Gly Met Arg Ala
545 550 555 560
Phe Asn Asn Trp Ile Lys Ser Asn Met Ile Thr Thr Tyr Cys Arg Asp
565 570 575
Gly Ser Lys Val Leu Asp Ile Gly Cys Gly Arg Gly Gly Asp Leu Ile
580 585 590
Lys Phe Ile Asn Ala Gly Val Glu Phe Tyr Val Gly Ile Asp Ile Asp
595 600 605
Asn Asn Gly Leu Tyr Val Ile Asn Asp Ser Ala Asn Asn Arg Tyr Lys
610 615 620
Asn Leu Lys Lys Thr Ile Gln Asn Ile Pro Pro Met Tyr Phe Ile Asn
625 630 635 640
Ala Asp Ala Arg Gly Leu Phe Thr Leu Glu Ala Gln Glu Lys Ile Leu
645 650 655
Pro Gly Met Pro Asp Phe Asn Lys Ser Leu Ile Asn Lys Tyr Leu Val
660 665 670
Gly Asn Lys Tyr Asp Thr Ile Asn Cys Gln Phe Thr Ile His Tyr Tyr
675 680 685
Leu Ser Asp Glu Leu Ser Trp Asn Asn Phe Cys Lys Asn Ile Asn Asn
690 695 700
Gln Leu Lys Asp Asn Gly Tyr Leu Leu Ile Thr Ser Phe Asp Gly Asn
705 710 715 720
Leu Ile His Asn Lys Leu Lys Gly Lys Gln Lys Leu Ser Ser Ser Tyr
725 730 735
Thr Asp Asn Arg Gly Asn Lys Asn Ile Phe Phe Glu Ile Asn Lys Ile
740 745 750
Tyr Ser Asp Thr Asp Lys Val Gly Leu Gly Met Ala Ile Asp Leu Tyr
755 760 765
Asn Ser Leu Ile Ser Asn Pro Gly Thr Tyr Ile Arg Glu Tyr Leu Val
770 775 780
Phe Pro Glu Phe Leu Glu Lys Ser Leu Lys Glu Lys Cys Gly Leu Glu
785 790 795 800
Leu Val Glu Ser Asp Leu Phe Tyr Asn Ile Phe Asn Thr Tyr Lys Asn
805 810 815
Tyr Phe Lys Lys Thr Tyr Asn Glu Tyr Gly Met Thr Asp Val Ser Ser
820 825 830
Lys Lys His Ser Glu Ile Arg Glu Phe Tyr Leu Ser Leu Glu Gly Asn
835 840 845

Claims (10)

1.一种嵌合加帽酶，其特征在于：由牛痘病毒加帽酶的N端两个结构域和其它单链加帽酶的C端甲基转移酶的结构域嵌合而成。
2.根据权利要求1所述嵌合加帽酶，其特征在于：所述其它单链加帽酶为非洲猪瘟病毒加帽酶、巨大病毒加帽酶或阿米巴病毒加帽酶中的任意一种。
3.根据权利要求2所述嵌合加帽酶，其特征在于：所述其它单链加帽酶的C端甲基转移酶的结构域来自非洲猪瘟病毒来源的pNP868R或阿米巴病毒来源的D5b。
4.一种嵌合加帽酶，其特征在于：其蛋白质序列如SEQ ID NO.1所示。
5.一种嵌合加帽酶，其特征在于：其蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。
6.一种嵌合加帽酶，其特征在于：其蛋白质序列如SEQ ID NO.3所示。
7.含有权利要求1～6任意一项所述嵌合加帽酶的重组表达载体或重组细胞株。
8.权利要求1～6任意一项所述嵌合加帽酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）制备所述嵌合加帽酶的重组表达载体，接种于2YT培养基中，培养，得到种子液；
（2）取所得种子液接种于2YT培养基中，培养，得到菌液；
（3）向所得菌液中加入IPTG至终浓度为0.1～0.5mM，诱导细胞表达蛋白，离心收集菌体沉淀；
（4）向所得菌体沉淀中加入裂解缓冲液重悬菌体，超声破碎菌体，离心取上清液；
（5）进行镍离子亲和层析，蛋白变性电泳检测各个洗脱峰，收集含有目的蛋白的样品，即获得所述的嵌合体。
9.权利要求1～6任意一项所述嵌合加帽酶在mRNA加帽中的应用。
10.利用权利要求1～6任意一项所述嵌合加帽酶制备的试剂、试纸或试剂盒。
CN202210495574.5A 2022-05-09 2022-05-09 一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用 Active CN114574466B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210495574.5A CN114574466B (zh) 2022-05-09 2022-05-09 一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210495574.5A CN114574466B (zh) 2022-05-09 2022-05-09 一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114574466A true CN114574466A (zh) 2022-06-03
CN114574466B CN114574466B (zh) 2022-08-02

Family

ID=81767735

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210495574.5A Active CN114574466B (zh) 2022-05-09 2022-05-09 一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114574466B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105051213A (zh) * 2013-03-14 2015-11-11 夏尔人类遗传性治疗公司 信使rna加帽效率的定量评估
CN111164207A (zh) * 2017-07-27 2020-05-15 优卡瑞斯 新型嵌合酶及其应用
CA3147797A1 (en) * 2019-08-23 2021-03-04 New England Biolabs, Inc. Enzymatic rna capping method
CN112714795A (zh) * 2019-08-23 2021-04-27 新英格兰生物实验室公司 酶促rna加帽方法
CN113862235A (zh) * 2021-09-24 2021-12-31 苏州近岸蛋白质科技股份有限公司 一种嵌合酶及其在体外一步反应合成Cap0 mRNA的用途和方法
WO2022029142A1 (en) * 2020-08-04 2022-02-10 Eukarys Artificial eukaryotic expression system with enhanced performances

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105051213A (zh) * 2013-03-14 2015-11-11 夏尔人类遗传性治疗公司 信使rna加帽效率的定量评估
CN111164207A (zh) * 2017-07-27 2020-05-15 优卡瑞斯 新型嵌合酶及其应用
CA3147797A1 (en) * 2019-08-23 2021-03-04 New England Biolabs, Inc. Enzymatic rna capping method
CN112714795A (zh) * 2019-08-23 2021-04-27 新英格兰生物实验室公司 酶促rna加帽方法
WO2022029142A1 (en) * 2020-08-04 2022-02-10 Eukarys Artificial eukaryotic expression system with enhanced performances
CN113862235A (zh) * 2021-09-24 2021-12-31 苏州近岸蛋白质科技股份有限公司 一种嵌合酶及其在体外一步反应合成Cap0 mRNA的用途和方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BENAMAR,S. ET AL.: "methyltransferase [Faustovirus],Accession NO：AMN83508.1", 《GENBANK》 *
SUSAN PARRISH ET AL.: "The African swine fever virus g5R protein possesses mRNA decapping activity", 《VIROLOGY》 *
XUEJIAN DU ET AL.: "Structure and Biochemical Characteristics of the Methyltransferase Domain of RNA Capping Enzyme from African Swine Fever Virus", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
张庆华等: "病毒与细胞中参与mRNA加帽过程的酶", 《生命的化学》 *
杜林萱: "非洲猪瘟病毒RNA加帽酶pNP868R甲基转移酶结构域的结构和功能研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114574466B (zh) 2022-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fu et al. HypB protein of Bradyrhizobium japonicum is a metal-binding GTPase capable of binding 18 divalent nickel ions per dimer.
CN109022387B (zh) 一种突变型Pfu DNA聚合酶及其制备方法和应用
JP2016136970A (ja) 変異型逆転写酵素
Seytter et al. Mam33p, an oligomeric, acidic protein in the mitochondrial matrix of Saccharomyces cerevisiae is related to the human complement receptor gC1q‐R
RIVOAL et al. Purification and characterization of high-and low-molecular-mass isoforms of phosphoenolpyruvate carboxylase from Chlamydomonas reinhardtii
Mayer et al. AMP-forming acetyl coenzyme A synthetase in the outermost membrane of the hyperthermophilic crenarchaeon Ignicoccus hospitalis
CN110777155B (zh) 最小霉素生物合成基因簇、重组菌及其应用
JP7404537B2 (ja) アルロースエピマー化酵素変異体、その製造方法及びそれを利用したアルロースの製造方法
Wang et al. High-level expression of soluble rat hsc70 in Escherichia coli: purification and characterization of the cloned enzyme
Moore et al. Expression and purification of aspartate β-semialdehyde dehydrogenase from infectious microorganisms
CN114574466B (zh) 一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用
Debarnot et al. Crystallization and diffraction analysis of the SARS coronavirus nsp10–nsp16 complex
CN114015672B (zh) 一种Pfu DNA聚合酶
CN111826366B (zh) 一种直扩型热启动dna聚合酶及其制备方法与应用
CN113302299B (zh) 阿洛酮糖差向异构酶变体、其生产方法以及使用其生产阿洛酮糖的方法
KR102131638B1 (ko) 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성이 향상된 헥수론산 c4-에피머화 효소 변이체
KR101663358B1 (ko) 다양한 미생물 유래의 과당 1,6-이인산 알돌레이즈 및 이를 이용한 과당 6-인산으로부터 타가토스 6-인산으로의 효소 전환 방법
US20110020896A1 (en) Mutant dna polymerases and their genes
CN112094853A (zh) 白斑综合征病毒vp28基因、重组蛋白、多克隆抗体及制备方法和应用
CN114381442B (zh) 一种可快速延伸的高保真dna聚合酶及其制备方法和应用
CN114958933B (zh) 一种利用黑芥子酶Emyr制备莱菔素的方法
KR101219716B1 (ko) 제한효소의 생산방법
CN115094047B (zh) 一种直扩型Bst DNA聚合酶及其制备方法与应用
KR20230073739A (ko) 열 안정성이 우수한 알룰로스 에피머화 효소 변이체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 알룰로스의 제조방법
Muttar et al. Over expression of recombinant Staphylokinase and reduction of inclusion bodies using IPTG as inducer in E. coli BL21 DE3

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Teng Yigang

Inventor after: Yuan Cancan

Inventor after: Wang Xueqi

Inventor after: Guo Shuai

Inventor after: Wang Xiaomin

Inventor after: Wu Haodong

Inventor after: Chai Changsheng

Inventor after: Hui Feng

Inventor before: Teng Yigang

Inventor before: Yuan Cancan

Inventor before: Wang Xueqi

Inventor before: Guo Shuai

Inventor before: Wang Xiaomin

Inventor before: Wu Haodong

Inventor before: Chai Changsheng

Inventor before: Hui Feng