JPH09221498A - マラセチア由来の抗原性蛋白質 - Google Patents
マラセチア由来の抗原性蛋白質Info
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- JPH09221498A JPH09221498A JP8257612A JP25761296A JPH09221498A JP H09221498 A JPH09221498 A JP H09221498A JP 8257612 A JP8257612 A JP 8257612A JP 25761296 A JP25761296 A JP 25761296A JP H09221498 A JPH09221498 A JP H09221498A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】アレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に対
して結合能を有することを特徴とする、マラセチア属の
真菌由来の実質的に純粋な、単離された抗原性蛋白質、
該抗原性蛋白質由来の抗原性断片、並びに該抗原性蛋白
質あるいは該抗原性断片に対する抗体。 【効果】本発明により、単離されたマラセチア由来の高
純度の抗原性蛋白質、これらに由来する抗原性断片、お
よびこれらの抗原性蛋白質又は抗原性断片に対する特異
的抗体を提供することができる。また、これらの抗原性
蛋白質、抗原性断片を有効成分とするマラセチアアレル
ギー疾患の診断薬、治療薬、予防薬を提供することがで
きる。
して結合能を有することを特徴とする、マラセチア属の
真菌由来の実質的に純粋な、単離された抗原性蛋白質、
該抗原性蛋白質由来の抗原性断片、並びに該抗原性蛋白
質あるいは該抗原性断片に対する抗体。 【効果】本発明により、単離されたマラセチア由来の高
純度の抗原性蛋白質、これらに由来する抗原性断片、お
よびこれらの抗原性蛋白質又は抗原性断片に対する特異
的抗体を提供することができる。また、これらの抗原性
蛋白質、抗原性断片を有効成分とするマラセチアアレル
ギー疾患の診断薬、治療薬、予防薬を提供することがで
きる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、マラセチアを原因
菌とするアレルギー疾患及び感染症の診断、治療、予防
に利用可能な、マラセチア菌より単離精製された新規な
抗原性蛋白質、及びその抗原性断片に関する。更に、該
抗原性蛋白質又は抗原性断片に対する抗体に関する。ま
た、これに関連する一連の発明に関する。
菌とするアレルギー疾患及び感染症の診断、治療、予防
に利用可能な、マラセチア菌より単離精製された新規な
抗原性蛋白質、及びその抗原性断片に関する。更に、該
抗原性蛋白質又は抗原性断片に対する抗体に関する。ま
た、これに関連する一連の発明に関する。
【０００２】
【従来の技術】アレルギー疾患の多くは、その疾患の原
因抗原に感作されることにより、血清および組織で抗原
（アレルゲン）に特異的なＩｇＥ抗体（レアギン抗体）
が産生され、再びその抗原に暴露されることにより、肥
満細胞又は好塩基球と結合したＩｇＥと特異的なアレル
ゲンが組み合わさると、ＩｇＥが細胞表面上で架橋し、
ＩｇＥ−抗原相互作用の生理学的効果を生ずる。これら
の生理学的効果としては、ヒスタミン、セロトニン、ヘ
パリン、好酸球遊走因子又は各種ロイコトリエン等の放
出が挙げられる。そして、それにより長期間の気管支平
滑筋の収縮を起こす。放出されたこれらの物質は、ケミ
カルメディエーターであり、ＩｇＥと特定のアレルゲン
の組み合わせにより起こるアレルギー症状を惹起する。
アレルゲンの効果はそれらを通じて現れる。これらの効
果は抗原が体内に入る経路及び肥満細胞又は好塩基球上
にＩｇＥが沈着するパターンに依存して全身的又は局所
的に起こり得る。局所的症状は一般にアレルゲンが体内
に入った位置の上皮表面に起こる。全身的効果は、血管
内の抗原へのＩｇＥ−好塩基球応答の結果であり、アナ
フィラキシーショックがその典型である。これらの一連
の反応において重要な働きをしているのが、ヘルパーＴ
（Ｔｈ）細胞である。抗原刺激により活性化されたＴｈ
細胞の産生する種々のサイトカインのうち、ＩＬ４はＩ
ｇＥ産生を促進する。
因抗原に感作されることにより、血清および組織で抗原
（アレルゲン）に特異的なＩｇＥ抗体（レアギン抗体）
が産生され、再びその抗原に暴露されることにより、肥
満細胞又は好塩基球と結合したＩｇＥと特異的なアレル
ゲンが組み合わさると、ＩｇＥが細胞表面上で架橋し、
ＩｇＥ−抗原相互作用の生理学的効果を生ずる。これら
の生理学的効果としては、ヒスタミン、セロトニン、ヘ
パリン、好酸球遊走因子又は各種ロイコトリエン等の放
出が挙げられる。そして、それにより長期間の気管支平
滑筋の収縮を起こす。放出されたこれらの物質は、ケミ
カルメディエーターであり、ＩｇＥと特定のアレルゲン
の組み合わせにより起こるアレルギー症状を惹起する。
アレルゲンの効果はそれらを通じて現れる。これらの効
果は抗原が体内に入る経路及び肥満細胞又は好塩基球上
にＩｇＥが沈着するパターンに依存して全身的又は局所
的に起こり得る。局所的症状は一般にアレルゲンが体内
に入った位置の上皮表面に起こる。全身的効果は、血管
内の抗原へのＩｇＥ−好塩基球応答の結果であり、アナ
フィラキシーショックがその典型である。これらの一連
の反応において重要な働きをしているのが、ヘルパーＴ
（Ｔｈ）細胞である。抗原刺激により活性化されたＴｈ
細胞の産生する種々のサイトカインのうち、ＩＬ４はＩ
ｇＥ産生を促進する。
【０００３】ヒトにアレルギー症状を惹起させる物質は
多岐にわたっており、これまでアレルゲンは、花粉ある
いは室内塵に代表される、多くの物質の集合体として扱
われていた。近年になって、分離精製技術及びアレルゲ
ン活性評価法が進展した結果、アレルゲンは単独あるい
は数種の主要な物質がその本体であることが明らかとな
った。特に、スギ花粉、ダニ、ネコアレルゲン等におい
て急速な進歩を遂げ、スギ花粉よりCry j １、Cry j
２、ダニよりDer f １, Der f ２, Der f ３、ネコより
Fel d １といった主要アレルゲンが単離されている。更
に、それらのアレルゲン蛋白質をコードする遺伝子も単
離され、遺伝子工学的手法により純粋なアレルゲン蛋白
質を大量に調製することが可能になっている。
多岐にわたっており、これまでアレルゲンは、花粉ある
いは室内塵に代表される、多くの物質の集合体として扱
われていた。近年になって、分離精製技術及びアレルゲ
ン活性評価法が進展した結果、アレルゲンは単独あるい
は数種の主要な物質がその本体であることが明らかとな
った。特に、スギ花粉、ダニ、ネコアレルゲン等におい
て急速な進歩を遂げ、スギ花粉よりCry j １、Cry j
２、ダニよりDer f １, Der f ２, Der f ３、ネコより
Fel d １といった主要アレルゲンが単離されている。更
に、それらのアレルゲン蛋白質をコードする遺伝子も単
離され、遺伝子工学的手法により純粋なアレルゲン蛋白
質を大量に調製することが可能になっている。
【０００４】アレルギー疾患の診断においては、まず原
因となっている抗原を同定する必要があり、そのために
まず100 種を超える市販の抗原エキス、時には自製のも
のについて、疑わしい抗原エキスを用いて皮内テストに
より試験を行っている。原因抗原としての可能性の高い
抗原が見つかると、ＲＡＳＴ法等による血清中のＩｇＥ
抗体価の測定、誘発テスト、又は全血やリンパ球を用い
たヒスタミン遊離試験により抗原を特定することができ
る。しかし、これらの抗原エキスには明確な力価が規定
されていないため、使用の際にはアナフィラキシー誘発
の危険性を伴うため注意が必要である。アレルギー疾患
の治療法としては、抗ヒスタミン薬、ステロイド性抗炎
症薬、メディエーター遊離抑制薬などが使用されている
が、診断により特定された抗原を用いた減感作療法が優
れた治療法である。しかし、現在の減感作療法は抗原液
を週１〜２回、小量ずつ皮内に投与し３〜４ケ月かけて
増量し、維持量に上げ、更に１〜３年投与し続ける必要
がある。増量が容易であれば、優れた治療効果をより容
易に得られることが期待できる。しかし、前記のように
使用する抗原の力価がはっきりしないため、更にその抗
原が多くの不純物を伴っているため、重篤な副作用が起
こることがあり、使用に大きな制限がある。
因となっている抗原を同定する必要があり、そのために
まず100 種を超える市販の抗原エキス、時には自製のも
のについて、疑わしい抗原エキスを用いて皮内テストに
より試験を行っている。原因抗原としての可能性の高い
抗原が見つかると、ＲＡＳＴ法等による血清中のＩｇＥ
抗体価の測定、誘発テスト、又は全血やリンパ球を用い
たヒスタミン遊離試験により抗原を特定することができ
る。しかし、これらの抗原エキスには明確な力価が規定
されていないため、使用の際にはアナフィラキシー誘発
の危険性を伴うため注意が必要である。アレルギー疾患
の治療法としては、抗ヒスタミン薬、ステロイド性抗炎
症薬、メディエーター遊離抑制薬などが使用されている
が、診断により特定された抗原を用いた減感作療法が優
れた治療法である。しかし、現在の減感作療法は抗原液
を週１〜２回、小量ずつ皮内に投与し３〜４ケ月かけて
増量し、維持量に上げ、更に１〜３年投与し続ける必要
がある。増量が容易であれば、優れた治療効果をより容
易に得られることが期待できる。しかし、前記のように
使用する抗原の力価がはっきりしないため、更にその抗
原が多くの不純物を伴っているため、重篤な副作用が起
こることがあり、使用に大きな制限がある。
【０００５】マラセチア（Malassezia、以下、M.と略
す）属に属する菌としては、M. furfur (Pityrosporum
ovale やPityrosporum orbiculare とも呼ばれている
), M. pachydermatis, M. sympodialis等が知られてい
る。マラセチアは各種動物やヒトの体表に常在している
といわれており、その病原性及びアレルギー疾患におけ
る役割については、古くから研究されてきた。病原性に
ついては、皮膚炎、癜風、毛包炎、フケなどの原因菌と
して疑われている。また、アトピー性皮膚炎などのアレ
ルギー性疾患との関連も疑われており、原因菌として関
わっている可能性が高い。現在、マラセチア由来の抗原
エキスが市販されているが、これらはM. furfurの培養
物より得られた未精製または部分精製物であり、当然、
蛋白質、糖、脂質を始めとする複雑な混合物であると考
えられる。
す）属に属する菌としては、M. furfur (Pityrosporum
ovale やPityrosporum orbiculare とも呼ばれている
), M. pachydermatis, M. sympodialis等が知られてい
る。マラセチアは各種動物やヒトの体表に常在している
といわれており、その病原性及びアレルギー疾患におけ
る役割については、古くから研究されてきた。病原性に
ついては、皮膚炎、癜風、毛包炎、フケなどの原因菌と
して疑われている。また、アトピー性皮膚炎などのアレ
ルギー性疾患との関連も疑われており、原因菌として関
わっている可能性が高い。現在、マラセチア由来の抗原
エキスが市販されているが、これらはM. furfurの培養
物より得られた未精製または部分精製物であり、当然、
蛋白質、糖、脂質を始めとする複雑な混合物であると考
えられる。
【０００６】従来、このようにして得られた抗原エキス
中に含有されるマラセチア由来のアレルゲン性蛋白質と
しては、マラセチア菌由来の粗抽出物をSDS-ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（PAGE）により分離後、アレルギ
ー患者の血清中ＩｇＥ抗体を用いたイムノブロッティン
グにより検出される、87, 76, 67, 45, 37, 28, 25,14,
13 kDa等の多くのＩｇＥ結合性蛋白質がアレルゲン性
蛋白質として報告されている（Siv Johansson ら, Acta
Derm Venereol, 71巻, 11-16 頁, 1991年; E.Jensen-J
arolim ら, J. Allergy Clin Immunol, 89 巻, 44-51
頁, 1992年; Zargari ら, Allergy, 49 巻, 50-56 頁,
1994年）。しかし、それらのＩｇＥ結合性蛋白質の単離
精製には誰も成功していない。従って、単離された蛋白
質としてアレルギー患者血清を用いた抗原性の確認は行
われていない。さらに、その蛋白化学的性質、アミノ酸
配列に関しては全く報告されていない。そのため、上記
の報告に見られるＩｇＥ結合性蛋白質相互の異同、関連
性（一方が他方のプロテアーゼによる分解物である等）
等については全く不明である。
中に含有されるマラセチア由来のアレルゲン性蛋白質と
しては、マラセチア菌由来の粗抽出物をSDS-ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（PAGE）により分離後、アレルギ
ー患者の血清中ＩｇＥ抗体を用いたイムノブロッティン
グにより検出される、87, 76, 67, 45, 37, 28, 25,14,
13 kDa等の多くのＩｇＥ結合性蛋白質がアレルゲン性
蛋白質として報告されている（Siv Johansson ら, Acta
Derm Venereol, 71巻, 11-16 頁, 1991年; E.Jensen-J
arolim ら, J. Allergy Clin Immunol, 89 巻, 44-51
頁, 1992年; Zargari ら, Allergy, 49 巻, 50-56 頁,
1994年）。しかし、それらのＩｇＥ結合性蛋白質の単離
精製には誰も成功していない。従って、単離された蛋白
質としてアレルギー患者血清を用いた抗原性の確認は行
われていない。さらに、その蛋白化学的性質、アミノ酸
配列に関しては全く報告されていない。そのため、上記
の報告に見られるＩｇＥ結合性蛋白質相互の異同、関連
性（一方が他方のプロテアーゼによる分解物である等）
等については全く不明である。
【０００７】更に、マラセチア菌の生産する蛋白質は、
非常に多岐にわたるため、SDS-PAGEによる分離だけでは
不十分であり、従来報告されているSDS-PAGEにおける単
一の蛋白バンドが、均一の蛋白質であるとは到底考えら
れない。すなわち、SDS-PAGE上、同一の蛋白バンドを示
す蛋白質は通常複数個存在するため、ＩｇＥ結合性蛋白
質が単一の蛋白バンドを示したとしても、そのバンド中
に含まれる他の多くの蛋白質と分離する必要があり、そ
のためには他の効果的な分離方法を組み合わせる必要が
ある。更に、診断、治療の目的で利用されるためには、
抗原性蛋白質を単離し、蛋白化学的に品質を明確にした
抗原性蛋白質を供給する必要がある。そのため、各種ク
ロマトグラフィーによる分離、抗原活性の測定を繰り返
し、均一かつ単一の抗原性蛋白質を単離する必要があ
り、最終的に得られた蛋白質については、SDS-PAGEの単
一性のほかに、イオン交換クロマトグラフィーによる単
一性、等電点電気泳動的な単一性を確認する必要があ
る。
非常に多岐にわたるため、SDS-PAGEによる分離だけでは
不十分であり、従来報告されているSDS-PAGEにおける単
一の蛋白バンドが、均一の蛋白質であるとは到底考えら
れない。すなわち、SDS-PAGE上、同一の蛋白バンドを示
す蛋白質は通常複数個存在するため、ＩｇＥ結合性蛋白
質が単一の蛋白バンドを示したとしても、そのバンド中
に含まれる他の多くの蛋白質と分離する必要があり、そ
のためには他の効果的な分離方法を組み合わせる必要が
ある。更に、診断、治療の目的で利用されるためには、
抗原性蛋白質を単離し、蛋白化学的に品質を明確にした
抗原性蛋白質を供給する必要がある。そのため、各種ク
ロマトグラフィーによる分離、抗原活性の測定を繰り返
し、均一かつ単一の抗原性蛋白質を単離する必要があ
り、最終的に得られた蛋白質については、SDS-PAGEの単
一性のほかに、イオン交換クロマトグラフィーによる単
一性、等電点電気泳動的な単一性を確認する必要があ
る。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】原因菌の可能性を診断
するためには、微生物学的培養試験の他、上記のような
マラセチア菌体抽出物である粗抗原を用いた皮膚試験、
誘発試験、RAST法やヒスタミン遊離測定などによる各種
ＩｇＥ抗体の定量試験、等により診断が行われている。
しかし、この粗抗原は多種類の不純物を含んでいるた
め、正確な診断ができない。また、皮膚試験、誘発試験
に用いる際、副作用等が生ずる危険性がある。さらに、
アレルギー疾患の有用な治療法である減感作療法に使用
するためには、アナフィラキシー誘発の危険性を伴うた
め、この粗抗原の投与量が極度に制限され、治療効果を
期待できず、また、感染防御のためにワクチンとして利
用することも難しい。現在までのところ、このマラセチ
ア由来の精製された、純粋な抗原の単離に成功した例は
なく、マラセチアによる感染やアレルギー疾患の診断、
治療に非常に大きな困難が生じている。
するためには、微生物学的培養試験の他、上記のような
マラセチア菌体抽出物である粗抗原を用いた皮膚試験、
誘発試験、RAST法やヒスタミン遊離測定などによる各種
ＩｇＥ抗体の定量試験、等により診断が行われている。
しかし、この粗抗原は多種類の不純物を含んでいるた
め、正確な診断ができない。また、皮膚試験、誘発試験
に用いる際、副作用等が生ずる危険性がある。さらに、
アレルギー疾患の有用な治療法である減感作療法に使用
するためには、アナフィラキシー誘発の危険性を伴うた
め、この粗抗原の投与量が極度に制限され、治療効果を
期待できず、また、感染防御のためにワクチンとして利
用することも難しい。現在までのところ、このマラセチ
ア由来の精製された、純粋な抗原の単離に成功した例は
なく、マラセチアによる感染やアレルギー疾患の診断、
治療に非常に大きな困難が生じている。
【０００９】従って、かかる現状を考慮し、本発明は次
の目的を達成するものである。 （１）本発明の第１の目的は、マラセチア属の真菌由来
の実質的に純粋な、単離された抗原性蛋白質、すなわち
精製されたマラセチアアレルゲンを提供し、それらの蛋
白化学的な性質を明らかにすることにある。さらに、該
抗原性蛋白質と免疫学的に同等の性質を有する機能的同
等物をも提供することにある。 （２）本発明の第２の目的は、これらの抗原性蛋白質由
来の抗原エピトープを少なくとも１個有する抗原性断片
を提供することにある。 （３）本発明の第３の目的は、前記の抗原性蛋白質又は
抗原性断片に対する抗体を提供することにある。 （４）本発明の第４の目的は、前記の抗原性蛋白質又は
抗原性断片を有効成分とする、マラセチアを原因菌とす
るアレルギー疾患等の疾病の診断薬を提供することにあ
る。 （５）本発明の第５の目的は、前記の抗原性蛋白質又は
抗原性断片を有効成分とする、マラセチアを原因菌とす
るアレルギー疾患等の疾病の治療薬を提供することにあ
る。 （６）本発明の第６の目的は、マラセチアアレルゲンの
免疫学的定量方法を提供することにある。
の目的を達成するものである。 （１）本発明の第１の目的は、マラセチア属の真菌由来
の実質的に純粋な、単離された抗原性蛋白質、すなわち
精製されたマラセチアアレルゲンを提供し、それらの蛋
白化学的な性質を明らかにすることにある。さらに、該
抗原性蛋白質と免疫学的に同等の性質を有する機能的同
等物をも提供することにある。 （２）本発明の第２の目的は、これらの抗原性蛋白質由
来の抗原エピトープを少なくとも１個有する抗原性断片
を提供することにある。 （３）本発明の第３の目的は、前記の抗原性蛋白質又は
抗原性断片に対する抗体を提供することにある。 （４）本発明の第４の目的は、前記の抗原性蛋白質又は
抗原性断片を有効成分とする、マラセチアを原因菌とす
るアレルギー疾患等の疾病の診断薬を提供することにあ
る。 （５）本発明の第５の目的は、前記の抗原性蛋白質又は
抗原性断片を有効成分とする、マラセチアを原因菌とす
るアレルギー疾患等の疾病の治療薬を提供することにあ
る。 （６）本発明の第６の目的は、マラセチアアレルゲンの
免疫学的定量方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は、
（１） アレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に対して
結合能を有することを特徴とする、マラセチア属の真菌
由来の実質的に純粋な、単離された抗原性蛋白質、
（２） マラセチア粗抗原に対して皮膚反応陽性のアレ
ルギー疾患患者が反応する、マラセチア由来の主要アレ
ルゲンであることを特徴とする前記（１）記載の抗原性
蛋白質、（３） 分子量が１００００〜１０００００
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下または非還元条件下）
で、等電点が４〜７（未変性下または８Ｍ尿素変性下）
であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の抗
原性蛋白質、（４） マラセチア属の真菌細胞内に存在
する抗原性蛋白質であることを特徴とする前記（３）記
載の抗原性蛋白質、（５） 配列表の配列番号：１に示
す部分アミノ酸配列を有する蛋白質であって、分子量約
２１０００（SDS-PAGE、還元条件下) および約４０００
０（SDS-PAGE、非還元条件下) 並びに未変性下の等電点
約 4.7および８Ｍ尿素変性下の等電点約 5.3を有するこ
とを特徴とする前記（１）記載のマラセチア由来の抗原
性蛋白質、（６） 配列表の配列番号：２、配列番号：
３、または配列番号：４に示す部分アミノ酸配列を有す
る蛋白質であって、分子量約２００００（SDS-PAGE、還
元条件下) および約４００００（SDS-PAGE、非還元条件
下) 並びに未変性下の等電点約 4.7および８Ｍ尿素変性
下の等電点約 5.8を有することを特徴とする前記（１）
記載のマラセチア由来の抗原性蛋白質、（７） 配列表
の配列番号：５、配列番号：６、または配列番号：７に
示す部分アミノ酸配列を有する蛋白質であって、分子量
約２７０００（SDS-PAGE、還元条件下) および約２７０
００（SDS-PAGE、非還元条件下) 並びに未変性下の等電
点約 5.2および８Ｍ尿素変性下の等電点約 6.5を有する
ことを特徴とする前記（１）記載のマラセチア由来の抗
原性蛋白質、（８） 配列表の配列番号：８に示す部分
アミノ酸配列を有する蛋白質であって、分子量約２６０
００（SDS-PAGE、還元条件下) および約２６０００（SD
S-PAGE、非還元条件下) 並びに未変性下の等電点約 5.2
および８Ｍ尿素変性下の等電点約 6.3を有することを特
徴とする前記（１）記載のマラセチア由来の抗原性蛋白
質、（９） 配列表の配列番号：９に示す部分アミノ酸
配列を有する蛋白質であって、分子量約６６０００（SD
S-PAGE、還元条件下) および８Ｍ尿素変性下の等電点約
6.1を有することを特徴とする前記（１）記載のマラセ
チア由来の抗原性蛋白質、（１０） 配列表の配列番
号：１０に示す部分アミノ酸配列を有する蛋白質であっ
て、分子量約４３０００（SDS-PAGE、還元条件下) およ
び８Ｍ尿素変性下の等電点約 6.2を有することを特徴と
する前記（１）記載のマラセチア由来の抗原性蛋白質、
（１１） M. furfur(マラセチア ファーファ）TIMM27
82の培養菌体破砕抽出液を遠心分離にかけその上清を凍
結乾燥した後、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフ
ィーにかけ0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、限外ろ
過膜（MW 10,000)で濃縮した後、セファクリルS-200HR
カラムクロマトグラフィーにかけ分子量3〜5 万の溶出
画分を取得し、得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,
000)で濃縮した後、セファデックスＧ−７５スーパーフ
ァインカラムクロマトグラフィーにかけ分子量約４万に
溶出される画分を取得し、ついで亜鉛キレーティングセ
ファロースファーストカラムクロマトグラフィーにかけ
素通り画分を銅キレートクロマトグラフィーにかけｐＨ
約４で溶出される画分を取得し、濃縮後セファデックス
G-75スーパーファインカラムクロマトグラフィーで精製
し分子量約４万の溶出画分を取得して得られる、前記
（５）記載の抗原性蛋白質、（１２） M. furfur(マラ
セチア ファーファ）TIMM2782の培養菌体破砕抽出液を
遠心分離にかけその上清を凍結乾燥した後、DEAE−セル
ロースカラムクロマトグラフィーにかけ0.1MのNaClによ
る溶出画分を取得し、限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮し
た後、セファクリルS-200HR カラムクロマトグラフィー
にかけ分子量3〜5 万の溶出画分を取得し、得られる溶
出画分を限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮した後、セファ
デックスＧ−７５スーパーファインカラムクロマトグラ
フィーにかけ分子量約４万に溶出される画分を取得し、
ついで亜鉛キレーティングセファロースファーストカラ
ムクロマトグラフィーにかけ、ｐＨ約５で溶出される画
分を取得し、濃縮後セファデックスG-75スーパーファイ
ンカラムクロマトグラフィーで精製して得られる、前記
（６）記載の抗原性蛋白質、（１３） M. furfur(マラ
セチア ファーファ）TIMM2782の培養菌体破砕抽出液を
遠心分離にかけその上清を凍結乾燥した後、DEAE−セル
ロースカラムクロマトグラフィーにかけ0.1MのNaClによ
る溶出画分を取得し、限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮し
た後、セファクリルS-200HR カラムクロマトグラフィー
にかけ分子量3〜5 万の溶出画分を取得し、得られる溶
出画分を限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮した後、セファ
デックスＧ−７５スーパーファインカラムクロマトグラ
フィーにかけ分子量約４万に溶出される画分を取得し、
ついで亜鉛キレーティングセファロースファーストカラ
ムクロマトグラフィーにかけ素通り画分を取得し、銅キ
レートクロマトグラフィーにかけ、素通り画分を濃縮し
た後セファデックスG-75スーパーファインカラムクロマ
トグラフィーで精製し分子量約４万の溶出画分を取得
し、さらにMono Q陰イオン交換クロマトグラフィーで精
製して得られる、前記（７）記載の抗原性蛋白質、（１
４） M. furfur(マラセチア ファーファ）TIMM2782の
培養菌体破砕抽出液を遠心分離にかけその上清を凍結乾
燥した後、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィー
にかけ0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、限外ろ過膜
（MW 10,000)で濃縮した後、セファクリルS-200HR カラ
ムクロマトグラフィーにかけ分子量3〜5 万の溶出画分
を取得し、得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,000)
で濃縮した後、セファデックスＧ−７５スーパーファイ
ンカラムクロマトグラフィーにかけ分子量約４万に溶出
される画分を取得し、ついで亜鉛キレーティングセファ
ロースファーストカラムクロマトグラフィーにかけ素通
り画分を取得し、銅キレートクロマトグラフィーにか
け、素通り画分を濃縮した後セファデックスG-75スーパ
ーファインカラムクロマトグラフィーで精製し分子量約
４万の溶出画分を取得し、さらにMono Q陰イオン交換ク
ロマトグラフィーで精製して得られる、前記（８）記載
の抗原性蛋白質、（１５） 前記（５）〜（１４）いず
れか記載の抗原性蛋白質と免疫学的に同等の性質を有す
ることを特徴とする機能的同等物、（１６） 前記
（１）〜（１５）いずれか記載の抗原性蛋白質に含まれ
る抗原エピトープを有することを特徴とする該抗原性蛋
白質由来の抗原性断片、（１７） 該抗原性断片が、マ
ラセチアに特異的なＩｇＥ抗体に対して結合能を有しな
いか、ＩｇＥ抗体への結合が起こる場合でも、そのよう
な結合は肥満細胞又は好塩基球からヒスタミンを放出さ
せない程度であることを特徴とする前記（１６）記載の
抗原性断片、（１８） 該抗原性断片が、マラセチア由
来の抗原性蛋白質より実質的に低い程度でＩｇＥに結合
することを特徴とする前記（１７）記載の抗原性断片、
（１９） 該抗原性断片が、少なくとも１個のＴ細胞エ
ピトープを含むことを特徴とする前記（１６）〜（１
８）いずれか記載の抗原性断片、（２０） 該抗原性断
片が、抗原性蛋白質より少ないＩｇＥ賦活活性を有する
ことを特徴とする前記（１６）〜（１９）いずれか記載
の抗原性断片、（２１） マラセチアアレルギー患者に
投与した場合、投与された患者のマラセチアに対するア
レルギー応答を軽減させることができるものであること
を特徴とする前記（１）〜（１５）いずれか記載の抗原
性蛋白質、（２２） マラセチアアレルギー患者に投与
した場合、投与された患者のマラセチアに対するアレル
ギー応答を軽減させることができるものであることを特
徴とする前記（１６）〜（２０）いずれか記載の抗原性
断片、（２３） 前記（１）〜（１５）いずれか記載の
抗原性蛋白質、あるいは前記（１６）〜（２０）いずれ
か記載の抗原性断片に対する抗体、（２４） 前記
（１）〜（１５）いずれか記載の抗原性蛋白質、あるい
は前記（１６）〜（２０）いずれか記載の抗原性断片を
有効成分とすることを特徴とするマラセチアアレルギー
疾患又はマラセチア感染症の診断薬、（２５） 前記
（１）〜（１５）いずれか記載の抗原性蛋白質、あるい
は前記（１６）〜（２０）いずれか記載の抗原性断片を
有効成分とすることを特徴とするマラセチアアレルギー
疾患又はマラセチア感染症の治療薬、（２６） 前記
（１）〜（１５）いずれか記載の抗原性蛋白質をマラセ
チアアレルゲンの標準品とし、該抗原性蛋白質に対する
抗体を用いてマラセチアアレルゲンの免疫学的定量を行
うことを特徴とする、マラセチアアレルゲンの定量方
法、に関する。
（１） アレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に対して
結合能を有することを特徴とする、マラセチア属の真菌
由来の実質的に純粋な、単離された抗原性蛋白質、
（２） マラセチア粗抗原に対して皮膚反応陽性のアレ
ルギー疾患患者が反応する、マラセチア由来の主要アレ
ルゲンであることを特徴とする前記（１）記載の抗原性
蛋白質、（３） 分子量が１００００〜１０００００
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下または非還元条件下）
で、等電点が４〜７（未変性下または８Ｍ尿素変性下）
であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の抗
原性蛋白質、（４） マラセチア属の真菌細胞内に存在
する抗原性蛋白質であることを特徴とする前記（３）記
載の抗原性蛋白質、（５） 配列表の配列番号：１に示
す部分アミノ酸配列を有する蛋白質であって、分子量約
２１０００（SDS-PAGE、還元条件下) および約４０００
０（SDS-PAGE、非還元条件下) 並びに未変性下の等電点
約 4.7および８Ｍ尿素変性下の等電点約 5.3を有するこ
とを特徴とする前記（１）記載のマラセチア由来の抗原
性蛋白質、（６） 配列表の配列番号：２、配列番号：
３、または配列番号：４に示す部分アミノ酸配列を有す
る蛋白質であって、分子量約２００００（SDS-PAGE、還
元条件下) および約４００００（SDS-PAGE、非還元条件
下) 並びに未変性下の等電点約 4.7および８Ｍ尿素変性
下の等電点約 5.8を有することを特徴とする前記（１）
記載のマラセチア由来の抗原性蛋白質、（７） 配列表
の配列番号：５、配列番号：６、または配列番号：７に
示す部分アミノ酸配列を有する蛋白質であって、分子量
約２７０００（SDS-PAGE、還元条件下) および約２７０
００（SDS-PAGE、非還元条件下) 並びに未変性下の等電
点約 5.2および８Ｍ尿素変性下の等電点約 6.5を有する
ことを特徴とする前記（１）記載のマラセチア由来の抗
原性蛋白質、（８） 配列表の配列番号：８に示す部分
アミノ酸配列を有する蛋白質であって、分子量約２６０
００（SDS-PAGE、還元条件下) および約２６０００（SD
S-PAGE、非還元条件下) 並びに未変性下の等電点約 5.2
および８Ｍ尿素変性下の等電点約 6.3を有することを特
徴とする前記（１）記載のマラセチア由来の抗原性蛋白
質、（９） 配列表の配列番号：９に示す部分アミノ酸
配列を有する蛋白質であって、分子量約６６０００（SD
S-PAGE、還元条件下) および８Ｍ尿素変性下の等電点約
6.1を有することを特徴とする前記（１）記載のマラセ
チア由来の抗原性蛋白質、（１０） 配列表の配列番
号：１０に示す部分アミノ酸配列を有する蛋白質であっ
て、分子量約４３０００（SDS-PAGE、還元条件下) およ
び８Ｍ尿素変性下の等電点約 6.2を有することを特徴と
する前記（１）記載のマラセチア由来の抗原性蛋白質、
（１１） M. furfur(マラセチア ファーファ）TIMM27
82の培養菌体破砕抽出液を遠心分離にかけその上清を凍
結乾燥した後、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフ
ィーにかけ0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、限外ろ
過膜（MW 10,000)で濃縮した後、セファクリルS-200HR
カラムクロマトグラフィーにかけ分子量3〜5 万の溶出
画分を取得し、得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,
000)で濃縮した後、セファデックスＧ−７５スーパーフ
ァインカラムクロマトグラフィーにかけ分子量約４万に
溶出される画分を取得し、ついで亜鉛キレーティングセ
ファロースファーストカラムクロマトグラフィーにかけ
素通り画分を銅キレートクロマトグラフィーにかけｐＨ
約４で溶出される画分を取得し、濃縮後セファデックス
G-75スーパーファインカラムクロマトグラフィーで精製
し分子量約４万の溶出画分を取得して得られる、前記
（５）記載の抗原性蛋白質、（１２） M. furfur(マラ
セチア ファーファ）TIMM2782の培養菌体破砕抽出液を
遠心分離にかけその上清を凍結乾燥した後、DEAE−セル
ロースカラムクロマトグラフィーにかけ0.1MのNaClによ
る溶出画分を取得し、限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮し
た後、セファクリルS-200HR カラムクロマトグラフィー
にかけ分子量3〜5 万の溶出画分を取得し、得られる溶
出画分を限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮した後、セファ
デックスＧ−７５スーパーファインカラムクロマトグラ
フィーにかけ分子量約４万に溶出される画分を取得し、
ついで亜鉛キレーティングセファロースファーストカラ
ムクロマトグラフィーにかけ、ｐＨ約５で溶出される画
分を取得し、濃縮後セファデックスG-75スーパーファイ
ンカラムクロマトグラフィーで精製して得られる、前記
（６）記載の抗原性蛋白質、（１３） M. furfur(マラ
セチア ファーファ）TIMM2782の培養菌体破砕抽出液を
遠心分離にかけその上清を凍結乾燥した後、DEAE−セル
ロースカラムクロマトグラフィーにかけ0.1MのNaClによ
る溶出画分を取得し、限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮し
た後、セファクリルS-200HR カラムクロマトグラフィー
にかけ分子量3〜5 万の溶出画分を取得し、得られる溶
出画分を限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮した後、セファ
デックスＧ−７５スーパーファインカラムクロマトグラ
フィーにかけ分子量約４万に溶出される画分を取得し、
ついで亜鉛キレーティングセファロースファーストカラ
ムクロマトグラフィーにかけ素通り画分を取得し、銅キ
レートクロマトグラフィーにかけ、素通り画分を濃縮し
た後セファデックスG-75スーパーファインカラムクロマ
トグラフィーで精製し分子量約４万の溶出画分を取得
し、さらにMono Q陰イオン交換クロマトグラフィーで精
製して得られる、前記（７）記載の抗原性蛋白質、（１
４） M. furfur(マラセチア ファーファ）TIMM2782の
培養菌体破砕抽出液を遠心分離にかけその上清を凍結乾
燥した後、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィー
にかけ0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、限外ろ過膜
（MW 10,000)で濃縮した後、セファクリルS-200HR カラ
ムクロマトグラフィーにかけ分子量3〜5 万の溶出画分
を取得し、得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,000)
で濃縮した後、セファデックスＧ−７５スーパーファイ
ンカラムクロマトグラフィーにかけ分子量約４万に溶出
される画分を取得し、ついで亜鉛キレーティングセファ
ロースファーストカラムクロマトグラフィーにかけ素通
り画分を取得し、銅キレートクロマトグラフィーにか
け、素通り画分を濃縮した後セファデックスG-75スーパ
ーファインカラムクロマトグラフィーで精製し分子量約
４万の溶出画分を取得し、さらにMono Q陰イオン交換ク
ロマトグラフィーで精製して得られる、前記（８）記載
の抗原性蛋白質、（１５） 前記（５）〜（１４）いず
れか記載の抗原性蛋白質と免疫学的に同等の性質を有す
ることを特徴とする機能的同等物、（１６） 前記
（１）〜（１５）いずれか記載の抗原性蛋白質に含まれ
る抗原エピトープを有することを特徴とする該抗原性蛋
白質由来の抗原性断片、（１７） 該抗原性断片が、マ
ラセチアに特異的なＩｇＥ抗体に対して結合能を有しな
いか、ＩｇＥ抗体への結合が起こる場合でも、そのよう
な結合は肥満細胞又は好塩基球からヒスタミンを放出さ
せない程度であることを特徴とする前記（１６）記載の
抗原性断片、（１８） 該抗原性断片が、マラセチア由
来の抗原性蛋白質より実質的に低い程度でＩｇＥに結合
することを特徴とする前記（１７）記載の抗原性断片、
（１９） 該抗原性断片が、少なくとも１個のＴ細胞エ
ピトープを含むことを特徴とする前記（１６）〜（１
８）いずれか記載の抗原性断片、（２０） 該抗原性断
片が、抗原性蛋白質より少ないＩｇＥ賦活活性を有する
ことを特徴とする前記（１６）〜（１９）いずれか記載
の抗原性断片、（２１） マラセチアアレルギー患者に
投与した場合、投与された患者のマラセチアに対するア
レルギー応答を軽減させることができるものであること
を特徴とする前記（１）〜（１５）いずれか記載の抗原
性蛋白質、（２２） マラセチアアレルギー患者に投与
した場合、投与された患者のマラセチアに対するアレル
ギー応答を軽減させることができるものであることを特
徴とする前記（１６）〜（２０）いずれか記載の抗原性
断片、（２３） 前記（１）〜（１５）いずれか記載の
抗原性蛋白質、あるいは前記（１６）〜（２０）いずれ
か記載の抗原性断片に対する抗体、（２４） 前記
（１）〜（１５）いずれか記載の抗原性蛋白質、あるい
は前記（１６）〜（２０）いずれか記載の抗原性断片を
有効成分とすることを特徴とするマラセチアアレルギー
疾患又はマラセチア感染症の診断薬、（２５） 前記
（１）〜（１５）いずれか記載の抗原性蛋白質、あるい
は前記（１６）〜（２０）いずれか記載の抗原性断片を
有効成分とすることを特徴とするマラセチアアレルギー
疾患又はマラセチア感染症の治療薬、（２６） 前記
（１）〜（１５）いずれか記載の抗原性蛋白質をマラセ
チアアレルゲンの標準品とし、該抗原性蛋白質に対する
抗体を用いてマラセチアアレルゲンの免疫学的定量を行
うことを特徴とする、マラセチアアレルゲンの定量方
法、に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下に本発明について詳細に説明
する。 （１）本発明の抗原性蛋白質及びその機能的同等物 本発明の抗原性蛋白質は、マラセチア属の真菌由来の実
質的に純粋な、単離された抗原性蛋白質（以下、単に
「マラセチア由来の単離された抗原性蛋白質」と略す場
合がある。）であり、ここで「実質的に純粋な、単離さ
れた」とは、蛋白質として実質的に均一であり、他の不
純な蛋白質を実質的に含まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおい
ても等電点電気泳動においても単一な物質として認識さ
れる単離された蛋白質であることをいう。本発明の抗原
性蛋白質は、アレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体、特
にマラセチアアレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に認
識されるエピトープを有することを特徴とする蛋白質で
ある。
する。 （１）本発明の抗原性蛋白質及びその機能的同等物 本発明の抗原性蛋白質は、マラセチア属の真菌由来の実
質的に純粋な、単離された抗原性蛋白質（以下、単に
「マラセチア由来の単離された抗原性蛋白質」と略す場
合がある。）であり、ここで「実質的に純粋な、単離さ
れた」とは、蛋白質として実質的に均一であり、他の不
純な蛋白質を実質的に含まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおい
ても等電点電気泳動においても単一な物質として認識さ
れる単離された蛋白質であることをいう。本発明の抗原
性蛋白質は、アレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体、特
にマラセチアアレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に認
識されるエピトープを有することを特徴とする蛋白質で
ある。
【００１２】また本発明の抗原性蛋白質を得るのに用い
られる菌株としてはマラセチア属に属する菌株であれば
いかなる菌株でもよく、その具体例としては、例えばM.
furfur（マラセチア ファーファ）TIMM2782株が挙げら
れる。該菌株はMalassezia furfur TIMM2782と表示さ
れ、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所〔あ
て名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番
号３０５）〕にＦＥＲＭＢＰ−５６１１（原寄託日；平
成７年９月１２日、国際寄託への移管請求日；平成８年
７月２９日）として寄託されている。
られる菌株としてはマラセチア属に属する菌株であれば
いかなる菌株でもよく、その具体例としては、例えばM.
furfur（マラセチア ファーファ）TIMM2782株が挙げら
れる。該菌株はMalassezia furfur TIMM2782と表示さ
れ、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所〔あ
て名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番
号３０５）〕にＦＥＲＭＢＰ−５６１１（原寄託日；平
成７年９月１２日、国際寄託への移管請求日；平成８年
７月２９日）として寄託されている。
【００１３】本明細書でいうマラセチア由来の主要アレ
ルゲンとは、マラセチアアレルギー患者（市販のマラセ
チア粗抗原である抗原エキスに対して皮膚反応陽性のア
レルギー疾患患者）の５０％以上に反応する、ＩｇＥ抗
体に認識される抗原性蛋白質である。本明細書でいうア
レルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に対する結合能は、
125Ｉ標識抗ＩｇＥ血清を用いたＲＡＳＴ法、酵素標識
抗ＩｇＥ血清を用いたDirect−ＲＡＳＴ ＲＩＡ法やＥ
ＬＩＳＡ法により測定して、標準血清との比較等により
有意な結合が得られることをいう。
ルゲンとは、マラセチアアレルギー患者（市販のマラセ
チア粗抗原である抗原エキスに対して皮膚反応陽性のア
レルギー疾患患者）の５０％以上に反応する、ＩｇＥ抗
体に認識される抗原性蛋白質である。本明細書でいうア
レルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に対する結合能は、
125Ｉ標識抗ＩｇＥ血清を用いたＲＡＳＴ法、酵素標識
抗ＩｇＥ血清を用いたDirect−ＲＡＳＴ ＲＩＡ法やＥ
ＬＩＳＡ法により測定して、標準血清との比較等により
有意な結合が得られることをいう。
【００１４】本発明のマラセチア由来の単離された抗原
性蛋白質は、分子量が１００００〜１０００００（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ、還元条件下または非還元条件下）で、等
電点（未変性下または８Ｍ尿素変性下）が４〜７のもの
であり、マラセチア属の真菌細胞内に存在するものであ
る。具体的には、以下のMF−１、MF−２、MF−３、MF−
４、MF−５、MF−６等が挙げられる。以下、これらにつ
いての分子量、等電点、部分アミノ酸配列について述べ
る。 (i) MF−１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下で
約２１ｋＤａ、非還元条件下で約４０ｋＤａの分子量を
示し、未変性下の等電点は約４．７および８Ｍ尿素変性
下の等電点は約５．３であり、配列表の配列番号：１で
示されるアミノ酸配列を含んでいる。 (ii) MF −２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下
で約２０ｋＤａ、非還元条件下で約４０ｋＤａの分子量
を示し、未変性下の等電点は約４．７および８Ｍ尿素変
性下の等電点は約５．８であり、配列番号：２、配列番
号：３、および配列番号：４で示されるアミノ酸配列を
含んでおり、Ｎ末端はブロックされている。 (iii) MF−３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下
で約２７ｋＤａ、非還元条件下でも約２７ｋＤａの分子
量を示し、未変性下の等電点は約５．２および８Ｍ尿素
変性下の等電点は約６．５であり、配列番号：５、配列
番号：６、および配列番号：７で示されるアミノ酸配列
を含んでおり、Ｎ末端はブロックされている。 (iv) MF −４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下
で約２６ｋＤａ、非還元条件下でも約２６ｋＤａの分子
量を示し、未変性下の等電点は約５．２および８Ｍ尿素
変性下の等電点は約６．３であり、配列番号：８で示さ
れるアミノ酸配列を含んでいる。 (v) MF−５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下で
約６６ｋＤａの分子量を示し、８Ｍ尿素変性下の等電点
は約６．１であり、配列番号：９で示されるアミノ酸配
列を含んでいる。 (vi)MF−６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下で
約４３ｋＤａの分子量を示し、８Ｍ尿素変性下の等電点
は約６．２であり、配列番号：１０で示されるアミノ酸
配列を含んでいる。
性蛋白質は、分子量が１００００〜１０００００（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ、還元条件下または非還元条件下）で、等
電点（未変性下または８Ｍ尿素変性下）が４〜７のもの
であり、マラセチア属の真菌細胞内に存在するものであ
る。具体的には、以下のMF−１、MF−２、MF−３、MF−
４、MF−５、MF−６等が挙げられる。以下、これらにつ
いての分子量、等電点、部分アミノ酸配列について述べ
る。 (i) MF−１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下で
約２１ｋＤａ、非還元条件下で約４０ｋＤａの分子量を
示し、未変性下の等電点は約４．７および８Ｍ尿素変性
下の等電点は約５．３であり、配列表の配列番号：１で
示されるアミノ酸配列を含んでいる。 (ii) MF −２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下
で約２０ｋＤａ、非還元条件下で約４０ｋＤａの分子量
を示し、未変性下の等電点は約４．７および８Ｍ尿素変
性下の等電点は約５．８であり、配列番号：２、配列番
号：３、および配列番号：４で示されるアミノ酸配列を
含んでおり、Ｎ末端はブロックされている。 (iii) MF−３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下
で約２７ｋＤａ、非還元条件下でも約２７ｋＤａの分子
量を示し、未変性下の等電点は約５．２および８Ｍ尿素
変性下の等電点は約６．５であり、配列番号：５、配列
番号：６、および配列番号：７で示されるアミノ酸配列
を含んでおり、Ｎ末端はブロックされている。 (iv) MF −４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下
で約２６ｋＤａ、非還元条件下でも約２６ｋＤａの分子
量を示し、未変性下の等電点は約５．２および８Ｍ尿素
変性下の等電点は約６．３であり、配列番号：８で示さ
れるアミノ酸配列を含んでいる。 (v) MF−５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下で
約６６ｋＤａの分子量を示し、８Ｍ尿素変性下の等電点
は約６．１であり、配列番号：９で示されるアミノ酸配
列を含んでいる。 (vi)MF−６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下で
約４３ｋＤａの分子量を示し、８Ｍ尿素変性下の等電点
は約６．２であり、配列番号：１０で示されるアミノ酸
配列を含んでいる。
【００１５】本発明のマラセチア由来の単離された抗原
性蛋白質としては、マラセチア由来のヒトを始めとする
哺乳類の抗原として認識される蛋白質であればよく、上
記に例示した６種類の抗原性蛋白質に制限されるもので
はない。
性蛋白質としては、マラセチア由来のヒトを始めとする
哺乳類の抗原として認識される蛋白質であればよく、上
記に例示した６種類の抗原性蛋白質に制限されるもので
はない。
【００１６】更に、これらの抗原性蛋白質を用いた診断
は、従来のマラセチア粗抗原である抗原エキスを用いた
皮膚試験やＲＡＳＴ法による診断の結果と相関してい
る。即ち、粗抗原を用いた皮膚試験で陽性の患者の多く
がマラセチア粗抗原に対するＩｇＥ抗体価陽性である。
そして、これらの粗抗原に対するＩｇＥ抗体価陽性の患
者の５０％以上が、上記の単離精製された本発明の抗原
性蛋白質に対して高いＩｇＥ抗体価を有している（後述
の実施例における表２及び表３を参照）。また、本発明
の抗原性蛋白質は、マラセチアアレルギー患者に投与し
た場合、投与された患者のマラセチアに対するアレルギ
ー応答を軽減させることができるものである。
は、従来のマラセチア粗抗原である抗原エキスを用いた
皮膚試験やＲＡＳＴ法による診断の結果と相関してい
る。即ち、粗抗原を用いた皮膚試験で陽性の患者の多く
がマラセチア粗抗原に対するＩｇＥ抗体価陽性である。
そして、これらの粗抗原に対するＩｇＥ抗体価陽性の患
者の５０％以上が、上記の単離精製された本発明の抗原
性蛋白質に対して高いＩｇＥ抗体価を有している（後述
の実施例における表２及び表３を参照）。また、本発明
の抗原性蛋白質は、マラセチアアレルギー患者に投与し
た場合、投与された患者のマラセチアに対するアレルギ
ー応答を軽減させることができるものである。
【００１７】さらに、本発明においては、前記のような
抗原性蛋白質と免疫学的に同等の性質を有する機能的同
等物をも提供する。例えば、上記６種類の抗原性蛋白質
と免疫学的に同等の性質を有する機能的同等物として、
例えば、各種M. furfur 、更にM. furfur 以外のマラセ
チア属真菌の機能的同等物も本発明に含まれる。即ち、
MF−２は、ペルオキシゾーム膜蛋白質であるPMP-20（L.
Garrard ら、J. Biol.Chem. 23 巻、13929-13937 頁、1
989年）とホモロジーがあり、同様の免疫学的性質を有
するマラセチア由来の蛋白質は本発明に含まれる。ま
た、MF−３及びMF−４は異なる蛋白質であるが、いずれ
も鉄／マンガン−スーパーオキシドジスムターゼとホモ
ロジーがあり（T. Matsumotoら、Biochemistry、30巻、
3210-3216頁、1991年；M. L. Ludwigら、J. Mol. Biol.
、219 巻、335-358 頁、1991年）、同様の免疫学的性
質を有するマラセチア由来の蛋白質も本発明に含まれ
る。
抗原性蛋白質と免疫学的に同等の性質を有する機能的同
等物をも提供する。例えば、上記６種類の抗原性蛋白質
と免疫学的に同等の性質を有する機能的同等物として、
例えば、各種M. furfur 、更にM. furfur 以外のマラセ
チア属真菌の機能的同等物も本発明に含まれる。即ち、
MF−２は、ペルオキシゾーム膜蛋白質であるPMP-20（L.
Garrard ら、J. Biol.Chem. 23 巻、13929-13937 頁、1
989年）とホモロジーがあり、同様の免疫学的性質を有
するマラセチア由来の蛋白質は本発明に含まれる。ま
た、MF−３及びMF−４は異なる蛋白質であるが、いずれ
も鉄／マンガン−スーパーオキシドジスムターゼとホモ
ロジーがあり（T. Matsumotoら、Biochemistry、30巻、
3210-3216頁、1991年；M. L. Ludwigら、J. Mol. Biol.
、219 巻、335-358 頁、1991年）、同様の免疫学的性
質を有するマラセチア由来の蛋白質も本発明に含まれ
る。
【００１８】なお、安定性の強化及び／又は所望の反応
性の強化、すなわち診断目的からすれば、抗原と抗体の
特異的結合を強化し、治療目的からすればアレルギー反
応を減弱化または酵素活性を消失させるために、本発明
の抗原性蛋白質を改変し、誘導体化したり、ポリエチレ
ングリコール（PEG)法（Wie ら, Int. Arch. AllergyAp
pl. Immunol., 64 巻, 84-99 頁, 1981年）を用いてＰ
ＥＧと結合させることができる。蛋白質の改変には、ピ
リジルエチル化、還元、アルキル化、アシル化、適当な
担体への化学的カップリング、温和なホルマリン処理、
又は塩酸グアニジン処理も含まれる。
性の強化、すなわち診断目的からすれば、抗原と抗体の
特異的結合を強化し、治療目的からすればアレルギー反
応を減弱化または酵素活性を消失させるために、本発明
の抗原性蛋白質を改変し、誘導体化したり、ポリエチレ
ングリコール（PEG)法（Wie ら, Int. Arch. AllergyAp
pl. Immunol., 64 巻, 84-99 頁, 1981年）を用いてＰ
ＥＧと結合させることができる。蛋白質の改変には、ピ
リジルエチル化、還元、アルキル化、アシル化、適当な
担体への化学的カップリング、温和なホルマリン処理、
又は塩酸グアニジン処理も含まれる。
【００１９】（２）本発明の抗原性断片 本発明の抗原性断片は、前記の抗原性蛋白質に含まれる
抗原エピトープを有することを特徴とする抗原性蛋白質
由来の抗原性断片である。例えば、MF−１、MF−２、MF
−３、MF−４、MF−５、MF−６等に含まれる抗原エピト
ープを少なくとも１個含む抗原性蛋白質由来の抗原性断
片が例示される。なかでも、少なくとも１個のＴ細胞エ
ピトープを含むものが好適なものとして挙げられる。本
発明の抗原性断片に、哺乳類、特にヒトにおける免疫応
答、例えば最小量のＩｇＥの刺激、ＩｇＥの結合、Ｉｇ
Ｇ及びＩｇＭ抗体の生産の誘起、又は増殖などのＴ細胞
応答及び／又はリンホカイン分泌及び／又はＴ細胞アナ
ージー誘導などを引き起こす、マラセチア由来の抗原性
蛋白質の断片が含まれる。
抗原エピトープを有することを特徴とする抗原性蛋白質
由来の抗原性断片である。例えば、MF−１、MF−２、MF
−３、MF−４、MF−５、MF−６等に含まれる抗原エピト
ープを少なくとも１個含む抗原性蛋白質由来の抗原性断
片が例示される。なかでも、少なくとも１個のＴ細胞エ
ピトープを含むものが好適なものとして挙げられる。本
発明の抗原性断片に、哺乳類、特にヒトにおける免疫応
答、例えば最小量のＩｇＥの刺激、ＩｇＥの結合、Ｉｇ
Ｇ及びＩｇＭ抗体の生産の誘起、又は増殖などのＴ細胞
応答及び／又はリンホカイン分泌及び／又はＴ細胞アナ
ージー誘導などを引き起こす、マラセチア由来の抗原性
蛋白質の断片が含まれる。
【００２０】本発明の抗原性断片を治療目的で用いる場
合には、Ｔ細胞応答性活性化作用が小さいか、又はＴ細
胞アナージー作用を誘起するものが望ましい。また、本
発明の抗原性断片は、マラセチアに特異的なＩｇＥ抗体
に対して実質的に結合能を有しないか、ＩｇＥ抗体への
結合が起こる場合でも、肥満細胞又は好塩基球からヒス
タミン等のメディエーターを遊離しないような程度の結
合能であるのが好ましい。即ち、ＩｇＥ抗体への結合が
起こる場合でも、該抗原性断片は、マラセチア由来の抗
原性蛋白質より実質的に低い程度でＩｇＥに結合するも
のが好ましい。このように本発明の抗原性断片は、治療
目的で用いる場合には、抗原性蛋白質より少ないＩｇＥ
賦活活性を有するものが好ましい。従って、マラセチア
アレルギー患者に投与した場合、投与された患者のマラ
セチアに対するアレルギー応答を軽減させることができ
るものである。
合には、Ｔ細胞応答性活性化作用が小さいか、又はＴ細
胞アナージー作用を誘起するものが望ましい。また、本
発明の抗原性断片は、マラセチアに特異的なＩｇＥ抗体
に対して実質的に結合能を有しないか、ＩｇＥ抗体への
結合が起こる場合でも、肥満細胞又は好塩基球からヒス
タミン等のメディエーターを遊離しないような程度の結
合能であるのが好ましい。即ち、ＩｇＥ抗体への結合が
起こる場合でも、該抗原性断片は、マラセチア由来の抗
原性蛋白質より実質的に低い程度でＩｇＥに結合するも
のが好ましい。このように本発明の抗原性断片は、治療
目的で用いる場合には、抗原性蛋白質より少ないＩｇＥ
賦活活性を有するものが好ましい。従って、マラセチア
アレルギー患者に投与した場合、投与された患者のマラ
セチアに対するアレルギー応答を軽減させることができ
るものである。
【００２１】本発明の抗原性断片の抗原性は、ヒトのボ
ランティアへの皮膚試験、皮内試験の他、ＲＡＳＴ、Ｅ
ＬＩＳＡ、又はヒスタミン遊離などの試験管内試験にお
いても評価することができる。
ランティアへの皮膚試験、皮内試験の他、ＲＡＳＴ、Ｅ
ＬＩＳＡ、又はヒスタミン遊離などの試験管内試験にお
いても評価することができる。
【００２２】エピトープとは、レセプター、特に抗体
（免疫グロブリン）、組織適合性抗原及びＴ細胞レセプ
ターにより認識される基本的要素又は最小単位であり、
エピトープはレセプター認識に必須のアミノ酸配列を含
む。エピトープのアミノ酸配列を模してあり、マラセチ
アアレルゲンに対するアレルギー応答を下げることがで
きるアミノ酸配列もエピトープとして用いることができ
る。現在利用できる蛋白質の構造に関する情報を用い、
マラセチアアレルギー患者に十分な量で投与すると、マ
ラセチアに対する患者のアレルギー応答を変えるであろ
うマラセチアアレルゲンペプチドを設計することができ
る。また、マラセチアアレルゲンの患者にアレルギー反
応を誘起する作用を阻害することができる試薬又は薬剤
を設計することもできる。そのような薬剤は、例えばマ
ラセチアアレルゲンに対するＩｇＥ抗体に結合し、それ
によりＩｇＥ−アレルゲン結合及びその後の肥満細胞か
らの脱顆粒を妨げるように設計することができる。
（免疫グロブリン）、組織適合性抗原及びＴ細胞レセプ
ターにより認識される基本的要素又は最小単位であり、
エピトープはレセプター認識に必須のアミノ酸配列を含
む。エピトープのアミノ酸配列を模してあり、マラセチ
アアレルゲンに対するアレルギー応答を下げることがで
きるアミノ酸配列もエピトープとして用いることができ
る。現在利用できる蛋白質の構造に関する情報を用い、
マラセチアアレルギー患者に十分な量で投与すると、マ
ラセチアに対する患者のアレルギー応答を変えるであろ
うマラセチアアレルゲンペプチドを設計することができ
る。また、マラセチアアレルゲンの患者にアレルギー反
応を誘起する作用を阻害することができる試薬又は薬剤
を設計することもできる。そのような薬剤は、例えばマ
ラセチアアレルゲンに対するＩｇＥ抗体に結合し、それ
によりＩｇＥ−アレルゲン結合及びその後の肥満細胞か
らの脱顆粒を妨げるように設計することができる。
【００２３】また、Ｔ細胞エピトープを含むペプチドの
選択は、マラセチアアレルゲンに対して感受性の個体
（ＩｇＥ仲介免疫応答を有する個体）から得られたＴ細
胞を含むリンパ球をアレルゲン由来のペプチドと共に培
養し、例えばトリチウム化チミジンの細胞への取り込み
促進作用を測定し、ペプチドに応答してＴ細胞の増殖が
起こるかどうかを決定することによって、ヒトＴ細胞の
刺激活性（幼若化活性）を測定することができる。Ｂ及
びＴ細胞のエピトープペプチド、又はその改変物も同様
に利用できる。
選択は、マラセチアアレルゲンに対して感受性の個体
（ＩｇＥ仲介免疫応答を有する個体）から得られたＴ細
胞を含むリンパ球をアレルゲン由来のペプチドと共に培
養し、例えばトリチウム化チミジンの細胞への取り込み
促進作用を測定し、ペプチドに応答してＴ細胞の増殖が
起こるかどうかを決定することによって、ヒトＴ細胞の
刺激活性（幼若化活性）を測定することができる。Ｂ及
びＴ細胞のエピトープペプチド、又はその改変物も同様
に利用できる。
【００２４】本発明の抗原性断片の範囲内には、マラセ
チアアレルゲンを始めとするマラセチア由来の抗原性蛋
白質の断片と免疫学的に関連する、例えばその断片に対
する特異的な抗体や特異的なＴ細胞に認識される、交差
反応性を有するペプチドも含まれる。
チアアレルゲンを始めとするマラセチア由来の抗原性蛋
白質の断片と免疫学的に関連する、例えばその断片に対
する特異的な抗体や特異的なＴ細胞に認識される、交差
反応性を有するペプチドも含まれる。
【００２５】本発明の抗原性断片を調製するには、単離
された抗原性蛋白質を原料として、リジルエンドペプチ
ダーゼ、トリプシン等のプロテアーゼによる酵素消化、
臭化シアン等による化学的処理による切断後、目的の抗
原性を有する断片を蛋白質の精製において既知の方法に
より単離精製することにより得ることができる。また、
マラセチア由来の抗原性蛋白質をコードする遺伝子の一
部を用いて、目的の抗原性断片を発現、調製することも
できる。更に、抗原性断片の化学構造に関する情報を基
に、ペプチド合成技術を利用して化学合成による製造も
可能である。
された抗原性蛋白質を原料として、リジルエンドペプチ
ダーゼ、トリプシン等のプロテアーゼによる酵素消化、
臭化シアン等による化学的処理による切断後、目的の抗
原性を有する断片を蛋白質の精製において既知の方法に
より単離精製することにより得ることができる。また、
マラセチア由来の抗原性蛋白質をコードする遺伝子の一
部を用いて、目的の抗原性断片を発現、調製することも
できる。更に、抗原性断片の化学構造に関する情報を基
に、ペプチド合成技術を利用して化学合成による製造も
可能である。
【００２６】また、遺伝子工学的手法、化学合成的手法
を用いることにより、アミノ酸の置換、挿入及び欠失も
可能である。例えば、安定性の強化及び／又は所望の反
応性の強化のために、本発明の抗原性断片を改変し、誘
導体化したり、少なくとも１個のアミノ酸を欠失、挿
入、置換、付加させることもできる。更にD-アミノ酸、
非天然アミノ酸、又は非天然アミノ酸類似体に置換した
り又はこれらを付加して本発明の範囲内の改変蛋白質又
はペプチドを製造することができる。更に、本発明の抗
原性断片をポリエチレングリコールと結合させ、化学的
に修飾することができる。該抗原性断片の改変には、還
元、アルキル化、アシル化、又は適した担体への化学的
カップリングも含まれる。
を用いることにより、アミノ酸の置換、挿入及び欠失も
可能である。例えば、安定性の強化及び／又は所望の反
応性の強化のために、本発明の抗原性断片を改変し、誘
導体化したり、少なくとも１個のアミノ酸を欠失、挿
入、置換、付加させることもできる。更にD-アミノ酸、
非天然アミノ酸、又は非天然アミノ酸類似体に置換した
り又はこれらを付加して本発明の範囲内の改変蛋白質又
はペプチドを製造することができる。更に、本発明の抗
原性断片をポリエチレングリコールと結合させ、化学的
に修飾することができる。該抗原性断片の改変には、還
元、アルキル化、アシル化、又は適した担体への化学的
カップリングも含まれる。
【００２７】このようにして得られた抗原性断片につい
て免疫応答活性（Ｔ細胞応答性活性化作用、Ｔ細胞アナ
ージー作用、抗体との結合作用等）を測定することによ
り、抗原性断片を決定、単離することができる。
て免疫応答活性（Ｔ細胞応答性活性化作用、Ｔ細胞アナ
ージー作用、抗体との結合作用等）を測定することによ
り、抗原性断片を決定、単離することができる。
【００２８】次に、本発明の抗原性蛋白質の製造法につ
いて述べる。従来使用されていた粗抗原は、培養物の培
養ろ液の凍結乾燥物であったり、又は、培養菌体を適当
な方法で破砕し、抽出物を得、これを硫安沈殿、凍結乾
燥するといった、極めて限られた方法で精製されたもの
であった。本発明者らも、これらの粗抗原を原料として
蛋白質の精製法として一般的に用いられている方法、例
えばゲル濾過、イオン交換等のクロマトグラフィーによ
る精製を試みたが、これらの手法のみでは単一の純粋な
抗原性蛋白質の単離に成功しなかった。
いて述べる。従来使用されていた粗抗原は、培養物の培
養ろ液の凍結乾燥物であったり、又は、培養菌体を適当
な方法で破砕し、抽出物を得、これを硫安沈殿、凍結乾
燥するといった、極めて限られた方法で精製されたもの
であった。本発明者らも、これらの粗抗原を原料として
蛋白質の精製法として一般的に用いられている方法、例
えばゲル濾過、イオン交換等のクロマトグラフィーによ
る精製を試みたが、これらの手法のみでは単一の純粋な
抗原性蛋白質の単離に成功しなかった。
【００２９】本発明のマラセチア由来の単離された抗原
性蛋白質は、マラセチア菌体より調製した粗抗原を原料
として、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、キレ
ート樹脂クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を用いた効果的な分
離方法を組み合わせて分画した後、各画分について患者
血清ＩｇＥ抗体との結合をＲＡＳＴ法やイムノブロッテ
ィング等で測定することにより、アレルギー患者血清中
のＩｇＥ抗体と結合する蛋白質を探索する、又は患者の
リンパ球を用いて免疫応答活性（Ｔ細胞応答性活性化作
用、Ｔ細胞アナージー作用等）を誘起する蛋白質を種々
の方法で探索することにより単離することができる。
性蛋白質は、マラセチア菌体より調製した粗抗原を原料
として、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、キレ
ート樹脂クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を用いた効果的な分
離方法を組み合わせて分画した後、各画分について患者
血清ＩｇＥ抗体との結合をＲＡＳＴ法やイムノブロッテ
ィング等で測定することにより、アレルギー患者血清中
のＩｇＥ抗体と結合する蛋白質を探索する、又は患者の
リンパ球を用いて免疫応答活性（Ｔ細胞応答性活性化作
用、Ｔ細胞アナージー作用等）を誘起する蛋白質を種々
の方法で探索することにより単離することができる。
【００３０】即ち、まず、M. furfur 等のマラセチア属
菌をディクソン（Dixon ）培地等のオリーブオイル又は
ツィーン40、60を添加した、マラセチア菌の生育に適し
た栄養分を含む培地を用い、適当な温度、通気等の条件
下で培養し、得られた菌体を適当な方法で破砕し、抽出
物を得る。この抽出物よりイオン交換クロマトグラフィ
ー、キレート樹脂クロマトグラフィー、疎水クロマトグ
ラフィーを含む分離手段を用いて抗原性蛋白質を精製す
ることができる。即ち、イオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー、キレート樹脂クロマトグラフィー、電気泳動、も
しくはマラセチア由来の抗原性蛋白質又はその抗原性断
片に特異的な抗体を結合させた樹脂を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィー等の、ペプチド及び蛋白質の精
製に関して既知の方法を各種組み合わせることにより高
純度な蛋白質として単離することができる。培養ろ液中
に含まれる抗原性蛋白質も同様の方法により単離するこ
とができる。
菌をディクソン（Dixon ）培地等のオリーブオイル又は
ツィーン40、60を添加した、マラセチア菌の生育に適し
た栄養分を含む培地を用い、適当な温度、通気等の条件
下で培養し、得られた菌体を適当な方法で破砕し、抽出
物を得る。この抽出物よりイオン交換クロマトグラフィ
ー、キレート樹脂クロマトグラフィー、疎水クロマトグ
ラフィーを含む分離手段を用いて抗原性蛋白質を精製す
ることができる。即ち、イオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー、キレート樹脂クロマトグラフィー、電気泳動、も
しくはマラセチア由来の抗原性蛋白質又はその抗原性断
片に特異的な抗体を結合させた樹脂を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィー等の、ペプチド及び蛋白質の精
製に関して既知の方法を各種組み合わせることにより高
純度な蛋白質として単離することができる。培養ろ液中
に含まれる抗原性蛋白質も同様の方法により単離するこ
とができる。
【００３１】具体的には、実施例で示すように、分子量
的に分離不可能な蛋白質を、等電点の違いを利用したイ
オン交換クロマトグラフィーや疎水性の違いを利用した
疎水クロマトグラフィー、金属とのキレート能の違いを
利用したキレート樹脂クロマトグラフィー、および分子
量の違いを利用したゲル濾過クロマトグラフィー等を組
合せることにより、よく似た多数の蛋白質の集合を相互
に分離することができる。これらのことは、従来のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥのイムノブロッティングによる分子量的な
抗原性蛋白質に関する知見からは予想されなかったこと
であり、例えば、MF−１とMF−２は分子量的にはほとん
ど同じであり、従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは分離不可能
なものである。また、MF−３とMF−４も分子量的には分
離することが不可能である。
的に分離不可能な蛋白質を、等電点の違いを利用したイ
オン交換クロマトグラフィーや疎水性の違いを利用した
疎水クロマトグラフィー、金属とのキレート能の違いを
利用したキレート樹脂クロマトグラフィー、および分子
量の違いを利用したゲル濾過クロマトグラフィー等を組
合せることにより、よく似た多数の蛋白質の集合を相互
に分離することができる。これらのことは、従来のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥのイムノブロッティングによる分子量的な
抗原性蛋白質に関する知見からは予想されなかったこと
であり、例えば、MF−１とMF−２は分子量的にはほとん
ど同じであり、従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは分離不可能
なものである。また、MF−３とMF−４も分子量的には分
離することが不可能である。
【００３２】更に各種分離手段の組み合わせについて具
体的に述べれば、下記の工程により本発明の抗原性蛋白
質MF−１〜MF−４を製造することができる。 工程ａ：マラセチア菌の培養菌体破砕抽出液を遠心分離
にかけその上清を凍結乾燥した後、DEAE−セルロースカ
ラムクロマトグラフィーにかけ0.1MのNaClによる溶出画
分を取得する工程、 工程ｂ：工程ａで得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 1
0,000)で濃縮した後、セファクリルS-200HR カラムクロ
マトグラフィーにかけ分子量３〜５万の溶出画分を取得
する工程、 工程ｃ：工程ｂで得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 1
0,000)で濃縮した後、セファデックスＧ−７５スーパー
ファインカラムクロマトグラフィーにかけ分子量約４万
に溶出される画分を取得する工程、 工程ｄ：工程ｃで得られる溶出画分を亜鉛キレーティン
グセファロースファーストカラムクロマトグラフィーに
かけ、素通り画分をさらに銅キレートクロマトグラフィ
ーにかけて素通り画分又はｐＨ約４で溶出される画分を
取得する工程、 工程ｅ：工程ｄで得られる素通り画分又はｐＨ約４で溶
出される画分を濃縮後、セファデックスG-75スーパーフ
ァインカラムクロマトグラフィーで精製し分子量約４万
の溶出画分を取得する工程、および 工程ｆ：工程ｅで得られる溶出画分をさらに Mono Q イ
オン交換クロマトグラフィーにかけて精製する工程。
体的に述べれば、下記の工程により本発明の抗原性蛋白
質MF−１〜MF−４を製造することができる。 工程ａ：マラセチア菌の培養菌体破砕抽出液を遠心分離
にかけその上清を凍結乾燥した後、DEAE−セルロースカ
ラムクロマトグラフィーにかけ0.1MのNaClによる溶出画
分を取得する工程、 工程ｂ：工程ａで得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 1
0,000)で濃縮した後、セファクリルS-200HR カラムクロ
マトグラフィーにかけ分子量３〜５万の溶出画分を取得
する工程、 工程ｃ：工程ｂで得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 1
0,000)で濃縮した後、セファデックスＧ−７５スーパー
ファインカラムクロマトグラフィーにかけ分子量約４万
に溶出される画分を取得する工程、 工程ｄ：工程ｃで得られる溶出画分を亜鉛キレーティン
グセファロースファーストカラムクロマトグラフィーに
かけ、素通り画分をさらに銅キレートクロマトグラフィ
ーにかけて素通り画分又はｐＨ約４で溶出される画分を
取得する工程、 工程ｅ：工程ｄで得られる素通り画分又はｐＨ約４で溶
出される画分を濃縮後、セファデックスG-75スーパーフ
ァインカラムクロマトグラフィーで精製し分子量約４万
の溶出画分を取得する工程、および 工程ｆ：工程ｅで得られる溶出画分をさらに Mono Q イ
オン交換クロマトグラフィーにかけて精製する工程。
【００３３】あるいは、下記の工程により本発明の抗原
性蛋白質を製造することができる。 工程ａ：マラセチア菌の培養菌体破砕抽出液を遠心分離
にかけその上清を凍結乾燥した後、DEAE−セルロースカ
ラムクロマトグラフィーにかけ0.1MのNaClによる溶出画
分を取得する工程、 工程ｂ：工程ａで得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 1
0,000)で濃縮した後、セファクリルS-200HR カラムクロ
マトグラフィーにかけ分子量３〜５万の溶出画分を取得
する工程、 工程ｃ：工程ｂで得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 1
0,000)で濃縮した後、セファデックスＧ−７５スーパー
ファインカラムクロマトグラフィーにかけ分子量約４万
に溶出される画分を取得する工程、 工程ｄ：工程ｃで得られる溶出画分を亜鉛キレーティン
グセファロースファーストカラムクロマトグラフィーに
かけ、ｐＨ約５で溶出される画分を取得する工程、およ
び工程ｇ：工程ｄで得られる溶出画分を濃縮後、セファ
デックスG-75スーパーファインカラムクロマトグラフィ
ーで精製する工程。
性蛋白質を製造することができる。 工程ａ：マラセチア菌の培養菌体破砕抽出液を遠心分離
にかけその上清を凍結乾燥した後、DEAE−セルロースカ
ラムクロマトグラフィーにかけ0.1MのNaClによる溶出画
分を取得する工程、 工程ｂ：工程ａで得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 1
0,000)で濃縮した後、セファクリルS-200HR カラムクロ
マトグラフィーにかけ分子量３〜５万の溶出画分を取得
する工程、 工程ｃ：工程ｂで得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 1
0,000)で濃縮した後、セファデックスＧ−７５スーパー
ファインカラムクロマトグラフィーにかけ分子量約４万
に溶出される画分を取得する工程、 工程ｄ：工程ｃで得られる溶出画分を亜鉛キレーティン
グセファロースファーストカラムクロマトグラフィーに
かけ、ｐＨ約５で溶出される画分を取得する工程、およ
び工程ｇ：工程ｄで得られる溶出画分を濃縮後、セファ
デックスG-75スーパーファインカラムクロマトグラフィ
ーで精製する工程。
【００３４】次に、本発明の抗原性蛋白質（MF−１、MF
−２、MF−３、およびMF−４）の製造方法の例について
より詳細に説明する。しかし、以下の工程は、単なる例
示であってこれに限定されるものではない。 １．MF−１の製造例について M.furfur（マラセチア ファーファ）TIMM2782の培養菌
体破砕抽出液を遠心分離にかけその上清を凍結乾燥した
後、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィーにかけ
0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、限外ろ過膜（MW 1
0,000)で濃縮した後、セファクリルS-200HR カラムクロ
マトグラフィーにかけ分子量3 〜5 万の溶出画分を取得
し、得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮
した後、セファデックスＧ−７５スーパーファインカラ
ムクロマトグラフィーにかけ分子量約４万に溶出される
画分を取得し、ついで亜鉛キレーティングセファロース
ファーストカラムクロマトグラフィーにかけ素通り画分
を銅キレートクロマトグラフィーにかけｐＨ約４で溶出
される画分を取得し、濃縮後セファデックスG-75スーパ
ーファインカラムクロマトグラフィーで精製し分子量約
４万の溶出画分を取得して得られる。
−２、MF−３、およびMF−４）の製造方法の例について
より詳細に説明する。しかし、以下の工程は、単なる例
示であってこれに限定されるものではない。 １．MF−１の製造例について M.furfur（マラセチア ファーファ）TIMM2782の培養菌
体破砕抽出液を遠心分離にかけその上清を凍結乾燥した
後、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィーにかけ
0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、限外ろ過膜（MW 1
0,000)で濃縮した後、セファクリルS-200HR カラムクロ
マトグラフィーにかけ分子量3 〜5 万の溶出画分を取得
し、得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮
した後、セファデックスＧ−７５スーパーファインカラ
ムクロマトグラフィーにかけ分子量約４万に溶出される
画分を取得し、ついで亜鉛キレーティングセファロース
ファーストカラムクロマトグラフィーにかけ素通り画分
を銅キレートクロマトグラフィーにかけｐＨ約４で溶出
される画分を取得し、濃縮後セファデックスG-75スーパ
ーファインカラムクロマトグラフィーで精製し分子量約
４万の溶出画分を取得して得られる。
【００３５】２．MF−２の製造例について M.furfur（マラセチア ファーファ）TIMM2782の培養菌
体破砕抽出液を遠心分離にかけその上清を凍結乾燥した
後、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィーにかけ
0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、限外ろ過膜（MW 1
0,000)で濃縮した後、セファクリルS-200HR カラムクロ
マトグラフィーにかけ分子量3 〜5 万の溶出画分を取得
し、得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮
した後、セファデックスＧ−７５スーパーファインカラ
ムクロマトグラフィーにかけ分子量約４万に溶出される
画分を取得し、ついで亜鉛キレーティングセファロース
ファーストカラムクロマトグラフィーにかけ、ｐＨ約５
で溶出される画分を取得し、濃縮後セファデックスG-75
スーパーファインカラムクロマトグラフィーで精製して
得られる。
体破砕抽出液を遠心分離にかけその上清を凍結乾燥した
後、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィーにかけ
0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、限外ろ過膜（MW 1
0,000)で濃縮した後、セファクリルS-200HR カラムクロ
マトグラフィーにかけ分子量3 〜5 万の溶出画分を取得
し、得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮
した後、セファデックスＧ−７５スーパーファインカラ
ムクロマトグラフィーにかけ分子量約４万に溶出される
画分を取得し、ついで亜鉛キレーティングセファロース
ファーストカラムクロマトグラフィーにかけ、ｐＨ約５
で溶出される画分を取得し、濃縮後セファデックスG-75
スーパーファインカラムクロマトグラフィーで精製して
得られる。
【００３６】３．MF−３の製造例について M.furfur（マラセチア ファーファ）TIMM2782の培養菌
体破砕抽出液を遠心分離にかけその上清を凍結乾燥した
後、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィーにかけ
0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、限外ろ過膜（MW 1
0,000)で濃縮した後、セファクリルS-200HR カラムクロ
マトグラフィーにかけ分子量3 〜5 万の溶出画分を取得
し、得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮
した後、セファデックスＧ−７５スーパーファインカラ
ムクロマトグラフィーにかけ分子量約４万に溶出される
画分を取得し、ついで亜鉛キレーティングセファロース
ファーストカラムクロマトグラフィーにかけ素通り画分
を取得し、銅キレートクロマトグラフィーにかけ、素通
り画分を濃縮した後セファデックスG-75スーパーファイ
ンカラムクロマトグラフィーで精製し分子量約４万の溶
出画分を取得し、さらにMono Q陰イオン交換クロマトグ
ラフィーで精製して得られる。
体破砕抽出液を遠心分離にかけその上清を凍結乾燥した
後、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィーにかけ
0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、限外ろ過膜（MW 1
0,000)で濃縮した後、セファクリルS-200HR カラムクロ
マトグラフィーにかけ分子量3 〜5 万の溶出画分を取得
し、得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮
した後、セファデックスＧ−７５スーパーファインカラ
ムクロマトグラフィーにかけ分子量約４万に溶出される
画分を取得し、ついで亜鉛キレーティングセファロース
ファーストカラムクロマトグラフィーにかけ素通り画分
を取得し、銅キレートクロマトグラフィーにかけ、素通
り画分を濃縮した後セファデックスG-75スーパーファイ
ンカラムクロマトグラフィーで精製し分子量約４万の溶
出画分を取得し、さらにMono Q陰イオン交換クロマトグ
ラフィーで精製して得られる。
【００３７】４．MF−４の製造例について M.furfur（マラセチア ファーファ）TIMM2782の培養菌
体破砕抽出液を遠心分離にかけその上清を凍結乾燥した
後、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィーにかけ
0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、限外ろ過膜（MW 1
0,000)で濃縮した後、セファクリルS-200HR カラムクロ
マトグラフィーにかけ分子量3 〜5 万の溶出画分を取得
し、得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮
した後、セファデックスＧ−７５スーパーファインカラ
ムクロマトグラフィーにかけ分子量約４万に溶出される
画分を取得し、ついで亜鉛キレーティングセファロース
ファーストカラムクロマトグラフィーにかけ素通り画分
を取得し、銅キレートクロマトグラフィーにかけ、素通
り画分を濃縮した後セファデックスG-75スーパーファイ
ンカラムクロマトグラフィーで精製し分子量約４万の溶
出画分を取得し、さらにMono Q陰イオン交換クロマトグ
ラフィーで精製して得られる。
体破砕抽出液を遠心分離にかけその上清を凍結乾燥した
後、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィーにかけ
0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、限外ろ過膜（MW 1
0,000)で濃縮した後、セファクリルS-200HR カラムクロ
マトグラフィーにかけ分子量3 〜5 万の溶出画分を取得
し、得られる溶出画分を限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮
した後、セファデックスＧ−７５スーパーファインカラ
ムクロマトグラフィーにかけ分子量約４万に溶出される
画分を取得し、ついで亜鉛キレーティングセファロース
ファーストカラムクロマトグラフィーにかけ素通り画分
を取得し、銅キレートクロマトグラフィーにかけ、素通
り画分を濃縮した後セファデックスG-75スーパーファイ
ンカラムクロマトグラフィーで精製し分子量約４万の溶
出画分を取得し、さらにMono Q陰イオン交換クロマトグ
ラフィーで精製して得られる。
【００３８】また、本発明のマラセチア由来の抗原性蛋
白質は、前記のアミノ酸配列の情報をもとに、ＰＣＲ等
により該蛋白質をコードする遺伝子を単離し、これらを
利用して遺伝子工学的手法により大腸菌、酵母、カビ、
哺乳類細胞等において発現されるようにベクターに組み
込み、組換え蛋白質として調製することもできる。
白質は、前記のアミノ酸配列の情報をもとに、ＰＣＲ等
により該蛋白質をコードする遺伝子を単離し、これらを
利用して遺伝子工学的手法により大腸菌、酵母、カビ、
哺乳類細胞等において発現されるようにベクターに組み
込み、組換え蛋白質として調製することもできる。
【００３９】（３）本発明の抗原性蛋白質又はその抗原
性断片に対する抗体の調製 マラセチア由来の単離された抗原性蛋白質又はその抗原
性断片に対する本発明の抗体は、本発明のマラセチア由
来の抗原性蛋白質、該蛋白質の酵素的又は化学的方法に
よる処理により得られる抗原性断片、又は化学合成的に
得られる抗原性ペプチドを抗原として使用することによ
り調製することができる。抗体の作製は常法により行う
ことができるが、例えば上記の蛋白質又はその断片をア
ジュバントと共にウサギ等の動物に免疫することによっ
て、抗血清として得ることができる。また、モノクロー
ナル抗体は、抗原を免疫して得られた抗体産生Ｂ細胞と
ミエローマ細胞を融合し、目的の抗体を産生するハイブ
リドーマを選択し、この細胞を培養することによって調
製することができる。これらの抗体は、後述のように、
抗原性蛋白質の製造やマラセチアアレルゲン抗原エキス
の力価測定等において使用することができる。前記のハ
イブリドーマとして、抗原性蛋白質MF−１に対するＭ−
４０モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは５
Ｂ４、抗原性蛋白質MF−２に対するＭ−３モノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマは８Ｇ１１、また抗原
性蛋白質MF−３に対するＭ−１モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマは１０Ｃ１とそれぞれ命名、表示
され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
〔あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵
便番号３０５）〕にそれぞれＦＥＲＭ ＢＰ−５６０
８、ＦＥＲＭ ＢＰ−５６０９、ＦＥＲＭ ＢＰ−５６
１０（原寄託日；平成７年９月１２日、国際寄託への移
管請求日；平成８年７月２９日）として寄託されてい
る。
性断片に対する抗体の調製 マラセチア由来の単離された抗原性蛋白質又はその抗原
性断片に対する本発明の抗体は、本発明のマラセチア由
来の抗原性蛋白質、該蛋白質の酵素的又は化学的方法に
よる処理により得られる抗原性断片、又は化学合成的に
得られる抗原性ペプチドを抗原として使用することによ
り調製することができる。抗体の作製は常法により行う
ことができるが、例えば上記の蛋白質又はその断片をア
ジュバントと共にウサギ等の動物に免疫することによっ
て、抗血清として得ることができる。また、モノクロー
ナル抗体は、抗原を免疫して得られた抗体産生Ｂ細胞と
ミエローマ細胞を融合し、目的の抗体を産生するハイブ
リドーマを選択し、この細胞を培養することによって調
製することができる。これらの抗体は、後述のように、
抗原性蛋白質の製造やマラセチアアレルゲン抗原エキス
の力価測定等において使用することができる。前記のハ
イブリドーマとして、抗原性蛋白質MF−１に対するＭ−
４０モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは５
Ｂ４、抗原性蛋白質MF−２に対するＭ−３モノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマは８Ｇ１１、また抗原
性蛋白質MF−３に対するＭ−１モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマは１０Ｃ１とそれぞれ命名、表示
され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
〔あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵
便番号３０５）〕にそれぞれＦＥＲＭ ＢＰ−５６０
８、ＦＥＲＭ ＢＰ−５６０９、ＦＥＲＭ ＢＰ−５６
１０（原寄託日；平成７年９月１２日、国際寄託への移
管請求日；平成８年７月２９日）として寄託されてい
る。
【００４０】（４）本発明の抗原性蛋白質又はその抗原
性断片を有効成分とする診断薬 本発明は、マラセチア由来の単離された抗原性蛋白質又
はそれに由来する少なくとも１個の抗原エピトープを有
する抗原性断片を用いる、マラセチア菌を原因菌とした
アレルギー性疾患又は感染症の診断薬を提供する。ここ
で述べるマラセチアによるアレルギー疾患とは、アトピ
ー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜
炎、アトピー性皮膚炎等、マラセチア菌が原因となるあ
らゆるアレルギー性疾患を言う。また、マラセチアによ
る感染症とは、癜風、マラセチア毛包炎、フケ等のマラ
セチア菌が原因となるあらゆる感染症をいう。
性断片を有効成分とする診断薬 本発明は、マラセチア由来の単離された抗原性蛋白質又
はそれに由来する少なくとも１個の抗原エピトープを有
する抗原性断片を用いる、マラセチア菌を原因菌とした
アレルギー性疾患又は感染症の診断薬を提供する。ここ
で述べるマラセチアによるアレルギー疾患とは、アトピ
ー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜
炎、アトピー性皮膚炎等、マラセチア菌が原因となるあ
らゆるアレルギー性疾患を言う。また、マラセチアによ
る感染症とは、癜風、マラセチア毛包炎、フケ等のマラ
セチア菌が原因となるあらゆる感染症をいう。
【００４１】本発明のアレルギー疾患診断薬は、マラセ
チアによるアレルギー疾患に対する皮内反応診断試薬及
びアレルギー診断用滴定試薬として用いられる。皮内反
応診断試薬として用いる場合は、本発明の単離された抗
原性蛋白質又は本発明の抗原性断片をフェノールを含む
生理食塩水で溶解し、希釈し常法に従って用いられる。
また、アレルギー診断用滴定試薬として用いる場合も同
様に常法により調製されるが、例えば本発明の単離され
た抗原性蛋白質又は本発明の抗原性断片をハンクス緩衝
液で適当に溶解し、希釈してヒスタミン遊離滴定用試薬
として用いる。使用方法は、通常、以下の操作手順によ
る、即ち、アレルギー疾患患者の血液及びこの血液から
遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に懸濁した血
球浮遊液の一定量に対し、該抗原性蛋白質の溶液を滴定
試薬として滴定し、アレルゲン刺激により好塩基球から
遊離するヒスタミン量をHPLCを用いて測定する。
チアによるアレルギー疾患に対する皮内反応診断試薬及
びアレルギー診断用滴定試薬として用いられる。皮内反
応診断試薬として用いる場合は、本発明の単離された抗
原性蛋白質又は本発明の抗原性断片をフェノールを含む
生理食塩水で溶解し、希釈し常法に従って用いられる。
また、アレルギー診断用滴定試薬として用いる場合も同
様に常法により調製されるが、例えば本発明の単離され
た抗原性蛋白質又は本発明の抗原性断片をハンクス緩衝
液で適当に溶解し、希釈してヒスタミン遊離滴定用試薬
として用いる。使用方法は、通常、以下の操作手順によ
る、即ち、アレルギー疾患患者の血液及びこの血液から
遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に懸濁した血
球浮遊液の一定量に対し、該抗原性蛋白質の溶液を滴定
試薬として滴定し、アレルゲン刺激により好塩基球から
遊離するヒスタミン量をHPLCを用いて測定する。
【００４２】本発明の単離された抗原性蛋白質又は本発
明の抗原性断片は、マラセチアアレルギー疾患の検出及
び診断に用いることもできる。例えば、これはマラセチ
アに対する感受性を評価しなければならない患者から得
た血液又は血液成分を、本発明の単離された抗原性蛋白
質等と適当な条件下でインキュベートし、抗原性蛋白質
と血液中の成分（例えば抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）との結
合の程度を決定することにより診断を行うことができ
る。
明の抗原性断片は、マラセチアアレルギー疾患の検出及
び診断に用いることもできる。例えば、これはマラセチ
アに対する感受性を評価しなければならない患者から得
た血液又は血液成分を、本発明の単離された抗原性蛋白
質等と適当な条件下でインキュベートし、抗原性蛋白質
と血液中の成分（例えば抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）との結
合の程度を決定することにより診断を行うことができ
る。
【００４３】（５）本発明の抗原性蛋白質又はその抗原
性断片を有効成分とする治療薬 本発明は、マラセチア由来の単離された抗原性蛋白質又
は少なくとも１個の抗原エピトープを有する抗原性断片
を有効成分とする、マラセチア菌を原因菌としたアレル
ギー性疾患の治療薬を提供する。本発明のアレルギー疾
患治療剤は、通常の投与経路例えば経口、皮内、皮下、
筋肉内、腹腔内等の投与経路により行うことができる。
更に、例えば、トローチ、舌下剤、点眼剤、鼻腔内噴霧
剤、パップ剤、クリーム剤、ローション剤等の経皮、経
粘膜薬として使用することができる。本発明のアレルギ
ー疾患治療剤の投与量及び投与回数は、投与経路、症状
などに応じて成人１回あたり約20mg以下の範囲となるよ
うに適宜選択し、毎週１回程度投与される。また、本発
明のアレルギー疾患治療剤は、マラセチアによるアレル
ギー疾患に対する治療剤のみならず予防剤としても有用
である。アナフィラキシー誘発作用は少ないか又はな
く、人体に対して安全に用いることができるからであ
る。
性断片を有効成分とする治療薬 本発明は、マラセチア由来の単離された抗原性蛋白質又
は少なくとも１個の抗原エピトープを有する抗原性断片
を有効成分とする、マラセチア菌を原因菌としたアレル
ギー性疾患の治療薬を提供する。本発明のアレルギー疾
患治療剤は、通常の投与経路例えば経口、皮内、皮下、
筋肉内、腹腔内等の投与経路により行うことができる。
更に、例えば、トローチ、舌下剤、点眼剤、鼻腔内噴霧
剤、パップ剤、クリーム剤、ローション剤等の経皮、経
粘膜薬として使用することができる。本発明のアレルギ
ー疾患治療剤の投与量及び投与回数は、投与経路、症状
などに応じて成人１回あたり約20mg以下の範囲となるよ
うに適宜選択し、毎週１回程度投与される。また、本発
明のアレルギー疾患治療剤は、マラセチアによるアレル
ギー疾患に対する治療剤のみならず予防剤としても有用
である。アナフィラキシー誘発作用は少ないか又はな
く、人体に対して安全に用いることができるからであ
る。
【００４４】本発明のマラセチアアレルギー疾患治療剤
は、前記の精製された抗原性蛋白質、その抗原性断片を
有効成分とするものであり、各種のマラセチアによるア
レルギー疾患の治療剤および予防剤として用いられる。
本発明のアレルギー疾患治療剤の調製方法は、特に制限
はない。例えば、本発明の抗原性蛋白質またはエピトー
プを有する抗原性断片を乾燥して粉末状とし、マラセチ
アによるアレルギー疾患に対する減感作治療剤として用
いることができる。その場合、そのままで、または必要
に応じて一般的に用いられるアジュバントや各種の添加
剤、例えば安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩
衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を常法により添加し
た配合剤として用いることができる。例えば、粉末状の
精製された抗原性蛋白質をフェノールを添加した生理食
塩水に溶解し、減感作治療用抗原の原液として用いる。
減感作治療剤として用いるためには、エピトープを有
し、かつマラセチアに特異的なＩｇＥに結合しないかま
たは結合しても肥満細胞もしくは好塩基球からヒスタミ
ンを放出させないものが特に有利である。
は、前記の精製された抗原性蛋白質、その抗原性断片を
有効成分とするものであり、各種のマラセチアによるア
レルギー疾患の治療剤および予防剤として用いられる。
本発明のアレルギー疾患治療剤の調製方法は、特に制限
はない。例えば、本発明の抗原性蛋白質またはエピトー
プを有する抗原性断片を乾燥して粉末状とし、マラセチ
アによるアレルギー疾患に対する減感作治療剤として用
いることができる。その場合、そのままで、または必要
に応じて一般的に用いられるアジュバントや各種の添加
剤、例えば安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩
衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を常法により添加し
た配合剤として用いることができる。例えば、粉末状の
精製された抗原性蛋白質をフェノールを添加した生理食
塩水に溶解し、減感作治療用抗原の原液として用いる。
減感作治療剤として用いるためには、エピトープを有
し、かつマラセチアに特異的なＩｇＥに結合しないかま
たは結合しても肥満細胞もしくは好塩基球からヒスタミ
ンを放出させないものが特に有利である。
【００４５】（６）マラセチアアレルゲンの定量方法 本発明はマラセチアアレルゲンの定量方法をも提供す
る。マラセチア由来の抗原性蛋白質に対する抗体は、マ
ラセチア菌を原因菌としたアレルギー性疾患又は感染症
の診断に使用されるマラセチアアレルゲンの免疫学的定
量に用いることができる。本発明の単離された抗原性蛋
白質をマラセチアアレルゲンの標準品として、それに対
する抗体を用いた、ＥＬＩＳＡ等の定量方法を確立する
ことが容易である。マラセチア抗原エキスとしては、前
記のように市販のものがいくつかある、また、マラセチ
アがヒトの頭皮を始めとする皮膚の常在菌であることか
ら、市販のハウスダスト中にもマラセチアアレルゲンが
含有されていると考えられる。これらの市販の抗原エキ
スについてマラセチアアレルゲンの含量を明らかにする
ことは、診断、治療上非常に有用である。
る。マラセチア由来の抗原性蛋白質に対する抗体は、マ
ラセチア菌を原因菌としたアレルギー性疾患又は感染症
の診断に使用されるマラセチアアレルゲンの免疫学的定
量に用いることができる。本発明の単離された抗原性蛋
白質をマラセチアアレルゲンの標準品として、それに対
する抗体を用いた、ＥＬＩＳＡ等の定量方法を確立する
ことが容易である。マラセチア抗原エキスとしては、前
記のように市販のものがいくつかある、また、マラセチ
アがヒトの頭皮を始めとする皮膚の常在菌であることか
ら、市販のハウスダスト中にもマラセチアアレルゲンが
含有されていると考えられる。これらの市販の抗原エキ
スについてマラセチアアレルゲンの含量を明らかにする
ことは、診断、治療上非常に有用である。
【００４６】
【実施例】以下、実施例および比較例により本発明をさ
らに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によ
りなんら限定されるものではない。
らに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によ
りなんら限定されるものではない。
【００４７】実施例１マラセチア由来の抗原性蛋白質の単離及びその物理化学
的性質 １−１）マラセチア部分精製粗抗原２７８２の調製 M. furfur TIMM2782株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６１１）を
ディクソン培地（バクトマルトエキストラクトブロス6.
0%、バクトオックスゴール 2.0% 、ツィーン４０ 1.0%
、グリセロールα−モノオレイン酸 0.25%）１５０ｍ
ｌを入れた５００ｍｌ容三角フラスコ50本中で27℃、5
日間振とう培養して得た培養物から、遠心分離によって
集めた菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で５回洗浄し
た後、菌体湿重量の２倍量のＰＢＳに浮遊させ、等量の
０．５ｍｍ径のガラスビーズを加え、ＭＳＫセルホモゲ
ナイザー（Ｂ．ブラウン社製）により菌体を破砕抽出し
た。得られた菌体破砕抽出液を遠心分離（18,000 rpm,
30 min）にかけ、上清を得た。この上清を精製水に対し
て透析、0.45μm のメンブレンフィルターでろ過滅菌
後、凍結乾燥することによりマラセチア粗抗原２７８２
約 900ｍｇを得た。前記マラセチア粗抗原２７８２約80
0 ｍｇを0.05M トリス塩酸緩衝液（pH 8.0）に溶解し
て、硫安塩析を行った。硫安50％から90％飽和で沈殿す
る画分を遠心で集め、0.05M トリス塩酸緩衝液（pH 8.
0）に溶解し、続いて同緩衝液に透析し、マラセチア部
分精製粗抗原２７８２とした。
的性質 １−１）マラセチア部分精製粗抗原２７８２の調製 M. furfur TIMM2782株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６１１）を
ディクソン培地（バクトマルトエキストラクトブロス6.
0%、バクトオックスゴール 2.0% 、ツィーン４０ 1.0%
、グリセロールα−モノオレイン酸 0.25%）１５０ｍ
ｌを入れた５００ｍｌ容三角フラスコ50本中で27℃、5
日間振とう培養して得た培養物から、遠心分離によって
集めた菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で５回洗浄し
た後、菌体湿重量の２倍量のＰＢＳに浮遊させ、等量の
０．５ｍｍ径のガラスビーズを加え、ＭＳＫセルホモゲ
ナイザー（Ｂ．ブラウン社製）により菌体を破砕抽出し
た。得られた菌体破砕抽出液を遠心分離（18,000 rpm,
30 min）にかけ、上清を得た。この上清を精製水に対し
て透析、0.45μm のメンブレンフィルターでろ過滅菌
後、凍結乾燥することによりマラセチア粗抗原２７８２
約 900ｍｇを得た。前記マラセチア粗抗原２７８２約80
0 ｍｇを0.05M トリス塩酸緩衝液（pH 8.0）に溶解し
て、硫安塩析を行った。硫安50％から90％飽和で沈殿す
る画分を遠心で集め、0.05M トリス塩酸緩衝液（pH 8.
0）に溶解し、続いて同緩衝液に透析し、マラセチア部
分精製粗抗原２７８２とした。
【００４８】１−２）マラセチア由来の抗原性蛋白質の
探索 マラセチア部分精製粗抗原２７８２を凍結乾燥後、４ｍ
ｇ／ｍｌとなるように２Ｍ硫酸アンモニウムを含有する
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）で溶解後、そ
のうち１００μｌを２Ｍ硫酸アンモニウムを含有する同
緩衝液（pH 7.0）で予め平衡化した Phenyl Superose P
C1.6/5（カラム容積0.1 ml、ファルマシア社製）にか
け、0.1 Ｍ同緩衝液で硫酸アンモニウム２Ｍから０Ｍま
での直線的グラジエント溶出を行った。得られた抗原性
蛋白質含有画分をビストリス緩衝液（pH 6.5）に対して
透析した後、MonoQ PC 1.6/5（カラム容積0.1 ml、ファ
ルマシア社製）にかけ、同緩衝液で食塩0 M から0.3 M
までの直線的グラジエント溶出を行った（図１、流速：
100 μl ／分、検出：280 nm）。50μl ずつ26本に分画
後、分画１〜２０について患者血清を用いたDirect RAS
T(EIA)法によるＩｇＥ抗体結合性を調べた。
探索 マラセチア部分精製粗抗原２７８２を凍結乾燥後、４ｍ
ｇ／ｍｌとなるように２Ｍ硫酸アンモニウムを含有する
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）で溶解後、そ
のうち１００μｌを２Ｍ硫酸アンモニウムを含有する同
緩衝液（pH 7.0）で予め平衡化した Phenyl Superose P
C1.6/5（カラム容積0.1 ml、ファルマシア社製）にか
け、0.1 Ｍ同緩衝液で硫酸アンモニウム２Ｍから０Ｍま
での直線的グラジエント溶出を行った。得られた抗原性
蛋白質含有画分をビストリス緩衝液（pH 6.5）に対して
透析した後、MonoQ PC 1.6/5（カラム容積0.1 ml、ファ
ルマシア社製）にかけ、同緩衝液で食塩0 M から0.3 M
までの直線的グラジエント溶出を行った（図１、流速：
100 μl ／分、検出：280 nm）。50μl ずつ26本に分画
後、分画１〜２０について患者血清を用いたDirect RAS
T(EIA)法によるＩｇＥ抗体結合性を調べた。
【００４９】即ち、各分画を0.01% ツィーン20入り0.1
M ほう酸緩衝液（pH8.0 ）で10、100 、1000倍希釈し、
その45μl を臭化シアンで活性化したペーパーディスク
にカップリングし、ついでエタノールアミンでブロッキ
ングした。その後、各ディスクに５倍希釈したプール血
清（ＲＡＳＴ法で高値を示した患者血清１０名分をまと
めたもの）50μl ずつを加えて、その後、希釈したβ−
ガラクトシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗血清を反応さ
せ、酵素基質を加え、415nm の吸光度を測定した。その
結果を図２に示した。図２より複数のアレルゲン蛋白質
が存在することが明らかであるが、例えばフラクション
６及びフラクション１２、１３付近に患者ＩｇＥと結合
する蛋白質が存在する。
M ほう酸緩衝液（pH8.0 ）で10、100 、1000倍希釈し、
その45μl を臭化シアンで活性化したペーパーディスク
にカップリングし、ついでエタノールアミンでブロッキ
ングした。その後、各ディスクに５倍希釈したプール血
清（ＲＡＳＴ法で高値を示した患者血清１０名分をまと
めたもの）50μl ずつを加えて、その後、希釈したβ−
ガラクトシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗血清を反応さ
せ、酵素基質を加え、415nm の吸光度を測定した。その
結果を図２に示した。図２より複数のアレルゲン蛋白質
が存在することが明らかであるが、例えばフラクション
６及びフラクション１２、１３付近に患者ＩｇＥと結合
する蛋白質が存在する。
【００５０】また、各分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クー
マシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により蛋白質
の検出（図３）を行うと共に、代表的画分について下記
のようにイムノブロッティングを行った。即ち、それぞ
れの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ニトロセルロース膜へ
トランスファーし、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
でブロッキングし、そして患者プール血清で処理した。
その後、希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗
ヒトＩｇＥ抗血清を反応させ、酵素基質を加え、アレル
ゲン蛋白質を検出した。その結果、図４のように、複数
のアレルゲン蛋白質の存在が明らかとなった。例えば、
フラクション12に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の20 kDa付近に
検出される蛋白質（アレルゲンMF−１として単離した）
等がアレルゲン蛋白質として含まれていることが明らか
である。フラクション６には、フラクション12の20 kDa
とほぼ同じ分子量のアレルゲン蛋白質（アレルゲンMF−
２として単離した）および80 kDa付近に検出される蛋白
質等が含まれていることが明らかである。
マシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により蛋白質
の検出（図３）を行うと共に、代表的画分について下記
のようにイムノブロッティングを行った。即ち、それぞ
れの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ニトロセルロース膜へ
トランスファーし、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
でブロッキングし、そして患者プール血清で処理した。
その後、希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗
ヒトＩｇＥ抗血清を反応させ、酵素基質を加え、アレル
ゲン蛋白質を検出した。その結果、図４のように、複数
のアレルゲン蛋白質の存在が明らかとなった。例えば、
フラクション12に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の20 kDa付近に
検出される蛋白質（アレルゲンMF−１として単離した）
等がアレルゲン蛋白質として含まれていることが明らか
である。フラクション６には、フラクション12の20 kDa
とほぼ同じ分子量のアレルゲン蛋白質（アレルゲンMF−
２として単離した）および80 kDa付近に検出される蛋白
質等が含まれていることが明らかである。
【００５１】１−３）抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF
−３、MF−４の単離 前記のマラセチア部分精製粗抗原２７８２の凍結乾燥物
０．２５ｍｇをビストリス緩衝液（pH 6.5）溶液１ｍｌ
に溶解後、１−２）に示したMono Qによるクロマトグラ
フィーと同様の方法で、Mono Q HR 5/5 （カラム容積１
ml、ファルマシア社製）にかけ、ピーク１（図１のフラ
クション 5, 6 対応分画) 、ピーク２（図１のフラクシ
ョン10, 11, 12対応分画) 、ピーク３（図１のフラクシ
ョン15,16対応分画) 、ピーク４（図１のフラクション1
8, 19, 20対応分画）を集めた。それぞれのピークにつ
いて、ゲルろ過、疎水クロマトグラフィー、最後にMono
Qによるイオン交換クロマトグラフィーを行い、ピーク
１よりMF−２、ピーク２よりMF−１、ピーク３よりMF−
３、ピーク４よりMF−４と命名した、純粋な抗原性蛋白
質を単離した。単離された４種類の蛋白質については、
上記の患者プール血清を用いたEIA 法によるＩｇＥ抗体
結合性を調べることにより、マラセチアアレルゲン蛋白
質であることを確認した。
−３、MF−４の単離 前記のマラセチア部分精製粗抗原２７８２の凍結乾燥物
０．２５ｍｇをビストリス緩衝液（pH 6.5）溶液１ｍｌ
に溶解後、１−２）に示したMono Qによるクロマトグラ
フィーと同様の方法で、Mono Q HR 5/5 （カラム容積１
ml、ファルマシア社製）にかけ、ピーク１（図１のフラ
クション 5, 6 対応分画) 、ピーク２（図１のフラクシ
ョン10, 11, 12対応分画) 、ピーク３（図１のフラクシ
ョン15,16対応分画) 、ピーク４（図１のフラクション1
8, 19, 20対応分画）を集めた。それぞれのピークにつ
いて、ゲルろ過、疎水クロマトグラフィー、最後にMono
Qによるイオン交換クロマトグラフィーを行い、ピーク
１よりMF−２、ピーク２よりMF−１、ピーク３よりMF−
３、ピーク４よりMF−４と命名した、純粋な抗原性蛋白
質を単離した。単離された４種類の蛋白質については、
上記の患者プール血清を用いたEIA 法によるＩｇＥ抗体
結合性を調べることにより、マラセチアアレルゲン蛋白
質であることを確認した。
【００５２】精製方法について詳しく説明すると、Mono
Qにより分離されたピーク１〜４をそれぞれ４M 硫酸ア
ンモニウムを含有する0.1 M リン酸カリウム緩衝液（pH
7.0）で２倍に希釈後、 2M 硫酸アンモニウムを含有す
る0.1 M リン酸カリウム緩衝液（pH7.0 ）で予め平衡化
した Phenyl Superose PC1.6/5 (カラム容積 0.1ml、フ
ァルマシア社製）にかけ、0.1 M 同緩衝液で硫酸アンモ
ニウム２M から０M までの直線的グラジエント溶出を行
った。得られた抗原性蛋白質含有画分を限外濾過膜（MW
10,000 ）で濃縮後、セファデックスG-75スーパーファ
インカラム（1.5 x 100 cm）によるゲルろ過クロマトグ
ラフィーを行い、分子量４万付近に溶出される画分を得
た。さらに、得られたゲルろ過物を再度Mono Q PC 1.6/
5 によるイオン交換クロマトグラフィーを行い、前記と
同様の溶出を行い、抗原性蛋白質を単離した。即ち、ピ
ーク２よりMF−１（図５）、ピーク１よりMF−２を（図
６）、ピーク３よりMF−３を（図７）、ピーク４よりMF
−４を（図８）を単離した。
Qにより分離されたピーク１〜４をそれぞれ４M 硫酸ア
ンモニウムを含有する0.1 M リン酸カリウム緩衝液（pH
7.0）で２倍に希釈後、 2M 硫酸アンモニウムを含有す
る0.1 M リン酸カリウム緩衝液（pH7.0 ）で予め平衡化
した Phenyl Superose PC1.6/5 (カラム容積 0.1ml、フ
ァルマシア社製）にかけ、0.1 M 同緩衝液で硫酸アンモ
ニウム２M から０M までの直線的グラジエント溶出を行
った。得られた抗原性蛋白質含有画分を限外濾過膜（MW
10,000 ）で濃縮後、セファデックスG-75スーパーファ
インカラム（1.5 x 100 cm）によるゲルろ過クロマトグ
ラフィーを行い、分子量４万付近に溶出される画分を得
た。さらに、得られたゲルろ過物を再度Mono Q PC 1.6/
5 によるイオン交換クロマトグラフィーを行い、前記と
同様の溶出を行い、抗原性蛋白質を単離した。即ち、ピ
ーク２よりMF−１（図５）、ピーク１よりMF−２を（図
６）、ピーク３よりMF−３を（図７）、ピーク４よりMF
−４を（図８）を単離した。
【００５３】さらに、前記のマラセチア部分精製粗抗原
２７８２の１５０μｇを８Ｍ尿素、０．５％ＮＰ−４
０、２％β−メルカプトエタノール、０．８％Pharmaly
te（ファルマシア製）、０．０１％ブロモフェノールブ
ルーを含む溶液に溶解した。一次元目の等電点電気泳動
は、Immobiline DryStrip ゲル（ｐＨ４〜７、ファルマ
シア製）を用いて常法により行った。二次元目のＳＤＳ
−ＰＡＧＥは、ExelGelSDS-Homogeneous(１２．５％、
ファルマシア社製）を用いて行った後、ＣＢＢ染色によ
り蛋白質の検出（図９）を行うと共に、ＰＶＤＦ膜（ミ
リポア社製）に転写後、アレルギー患者ＩｇＥ抗体およ
び健常者ＩｇＥ抗体を用いてイムノブロットを行い、陽
性スポットを検出した（図１０）。陽性スポットのう
ち、分子量約２１ｋＤａで等電点約５．３、分子量約２
０ｋＤａで等電点約５．８、分子量約２７ｋＤａで等電
点約６．５、分子量約２６ｋＤａで等電点６．３のスポ
ットについて、Ｎ末端配列の結果などをもとに、各々Ｍ
Ｆ−１、ＭＦ−２、ＭＦ−３、およびＭＦ−４であると
同定した。また、新たに分子量約６６ｋＤａ、等電点約
６．１（ＭＦ−５と命名）、及び分子量約４３ｋＤａ、
等電点約６．２（ＭＦ−６と命名）の蛋白質がアレルギ
ー患者ＩｇＥ抗体に結合する蛋白質であることを見出
し、これらの蛋白質をゲルより抽出し、単離した。
２７８２の１５０μｇを８Ｍ尿素、０．５％ＮＰ−４
０、２％β−メルカプトエタノール、０．８％Pharmaly
te（ファルマシア製）、０．０１％ブロモフェノールブ
ルーを含む溶液に溶解した。一次元目の等電点電気泳動
は、Immobiline DryStrip ゲル（ｐＨ４〜７、ファルマ
シア製）を用いて常法により行った。二次元目のＳＤＳ
−ＰＡＧＥは、ExelGelSDS-Homogeneous(１２．５％、
ファルマシア社製）を用いて行った後、ＣＢＢ染色によ
り蛋白質の検出（図９）を行うと共に、ＰＶＤＦ膜（ミ
リポア社製）に転写後、アレルギー患者ＩｇＥ抗体およ
び健常者ＩｇＥ抗体を用いてイムノブロットを行い、陽
性スポットを検出した（図１０）。陽性スポットのう
ち、分子量約２１ｋＤａで等電点約５．３、分子量約２
０ｋＤａで等電点約５．８、分子量約２７ｋＤａで等電
点約６．５、分子量約２６ｋＤａで等電点６．３のスポ
ットについて、Ｎ末端配列の結果などをもとに、各々Ｍ
Ｆ−１、ＭＦ−２、ＭＦ−３、およびＭＦ−４であると
同定した。また、新たに分子量約６６ｋＤａ、等電点約
６．１（ＭＦ−５と命名）、及び分子量約４３ｋＤａ、
等電点約６．２（ＭＦ−６と命名）の蛋白質がアレルギ
ー患者ＩｇＥ抗体に結合する蛋白質であることを見出
し、これらの蛋白質をゲルより抽出し、単離した。
【００５４】１−４）抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF
−３、MF−４、MF−５、MF−６の物理化学的性質 MF−１、MF−２、MF−３、MF−４、MF−５、MF−６のSD
S-PAGE（図１１）、等電点電気泳動による分析の結果を
表１に示した。未変性下での等電点電気泳動は、IsoGel
Plate pH3〜10（ＦＭＣ社製）を用いて常法により行っ
た。ＭＦ−５、ＭＦ−６のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電
気泳動による分析結果は図９の二次元電気泳動の結果よ
り算出した。
−３、MF−４、MF−５、MF−６の物理化学的性質 MF−１、MF−２、MF−３、MF−４、MF−５、MF−６のSD
S-PAGE（図１１）、等電点電気泳動による分析の結果を
表１に示した。未変性下での等電点電気泳動は、IsoGel
Plate pH3〜10（ＦＭＣ社製）を用いて常法により行っ
た。ＭＦ−５、ＭＦ−６のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電
気泳動による分析結果は図９の二次元電気泳動の結果よ
り算出した。
【００５５】
【表１】
【００５６】次に、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行った。
その結果、MF−１は Pro Gly Asp Pro Thr Ala Thr Ala Lys Gly Asn Glu Il
e Pro Asp Thr Leu MetGly Tyr Ile Pro Trp Thr Pro G
lu Leu Asp（配列番号：１） のアミノ酸配列を有することが明らかとなった。MF−２
については、Ｎ末端がブロックされていたため、ピリジ
ルエチル化後、リジルエンドペプチダーゼで消化し、得
られたペプチド断片をC18 逆相HPLCにより分析した。得
られた種々のピークを分取し、いくつかについてアミノ
酸配列決定を行い、27.07 、28.20 、31.15 分に溶出さ
れた３種類のペプチド断片のＮ末端アミノ酸配列をそれ
ぞれ、 Val Glu Tyr Phe Gly Ile Asp Glu Gly Glu Pro Lys
（配列番号２）、 Asp Asn Leu Thr Phe Ala Gln Asp Val Asn Cys Glu Ph
e（配列番号：３）、 Val Val Ile Val Ala Val Pro Gly Xaa Phe Thr Pro Th
r Cys Thr Ala Asn HisVal Pro Xaa Tyr Xaa Glu（配列
番号：４）（Xaa は未決定のアミノ酸である）、 と決定した。
その結果、MF−１は Pro Gly Asp Pro Thr Ala Thr Ala Lys Gly Asn Glu Il
e Pro Asp Thr Leu MetGly Tyr Ile Pro Trp Thr Pro G
lu Leu Asp（配列番号：１） のアミノ酸配列を有することが明らかとなった。MF−２
については、Ｎ末端がブロックされていたため、ピリジ
ルエチル化後、リジルエンドペプチダーゼで消化し、得
られたペプチド断片をC18 逆相HPLCにより分析した。得
られた種々のピークを分取し、いくつかについてアミノ
酸配列決定を行い、27.07 、28.20 、31.15 分に溶出さ
れた３種類のペプチド断片のＮ末端アミノ酸配列をそれ
ぞれ、 Val Glu Tyr Phe Gly Ile Asp Glu Gly Glu Pro Lys
（配列番号２）、 Asp Asn Leu Thr Phe Ala Gln Asp Val Asn Cys Glu Ph
e（配列番号：３）、 Val Val Ile Val Ala Val Pro Gly Xaa Phe Thr Pro Th
r Cys Thr Ala Asn HisVal Pro Xaa Tyr Xaa Glu（配列
番号：４）（Xaa は未決定のアミノ酸である）、 と決定した。
【００５７】MF−３についても、Ｎ末端がブロックされ
ていたため、ピリジルエチル化後、リジルエンドペプチ
ダーゼで消化し、得られたペプチド断片をC18 逆相HPLC
により分析した。得られた種々のピークを分取し、いく
つかについてアミノ酸配列決定を行い、35.68 、36.68
、29.15 分に溶出された３種類のペプチド断片のＮ末
端アミノ酸配列をそれぞれ Asp Gln Asp Pro Leu Thr Thr His His Pro Val Ile Gl
y Trp Asp Xaa Xaa GluHis Ala（配列番号：５）（Xaa
は未決定のアミノ酸である）、 Ala Trp Trp Asn Val Val Asn Trp Ala Glu Ala Glu Ly
s（配列番号：６）、 Phe Xaa Gly Gly Gly His Ile Asn Xaa Ser Leu Phe
（配列番号：７）（Xaa は未決定のアミノ酸である）、 と決定した。
ていたため、ピリジルエチル化後、リジルエンドペプチ
ダーゼで消化し、得られたペプチド断片をC18 逆相HPLC
により分析した。得られた種々のピークを分取し、いく
つかについてアミノ酸配列決定を行い、35.68 、36.68
、29.15 分に溶出された３種類のペプチド断片のＮ末
端アミノ酸配列をそれぞれ Asp Gln Asp Pro Leu Thr Thr His His Pro Val Ile Gl
y Trp Asp Xaa Xaa GluHis Ala（配列番号：５）（Xaa
は未決定のアミノ酸である）、 Ala Trp Trp Asn Val Val Asn Trp Ala Glu Ala Glu Ly
s（配列番号：６）、 Phe Xaa Gly Gly Gly His Ile Asn Xaa Ser Leu Phe
（配列番号：７）（Xaa は未決定のアミノ酸である）、 と決定した。
【００５８】また、MF−４は Lys Tyr Thr Leu Pro Pro Leu Pro Tyr Asp Tyr Gly Al
a Leu Glu Pro Ala IleSer Gly Glu Ile Met Glu Thr H
is Tyr Glu Lys His（配列番号：８） のアミノ酸配列を有することが明らかとなった。
a Leu Glu Pro Ala IleSer Gly Glu Ile Met Glu Thr H
is Tyr Glu Lys His（配列番号：８） のアミノ酸配列を有することが明らかとなった。
【００５９】また、MF−５は Glu Pro Tyr Asp Val Ile Xaa Ile Gly Gly Gly Pro Gl
y Gly Tyr Val Ala AlaIle Lys Ala Ala Gln （配列番
号：９） のアミノ酸配列を有することが明らかとなった。
y Gly Tyr Val Ala AlaIle Lys Ala Ala Gln （配列番
号：９） のアミノ酸配列を有することが明らかとなった。
【００６０】また、MF−６は Arg Lys Val Ala Val Leu Gly Ala Ser Gly Gly Ile Gl
y Gln Pro Leu Ser LeuLeu Met Lys Leu Asn Pro Lys V
al Thr Glu Leu Arg （配列番号：１０） のアミノ酸配列を有することが明らかとなった。
y Gln Pro Leu Ser LeuLeu Met Lys Leu Asn Pro Lys V
al Thr Glu Leu Arg （配列番号：１０） のアミノ酸配列を有することが明らかとなった。
【００６１】既知蛋白質とのホモロジー検索の結果、MF
−２は、配列番号：４の部分アミノ酸配列がカンジダ・
ボイジニ（Candida boidinii）由来のペルオキシゾーム
膜蛋白質(PMP−２０）と、MF−３は上記の部分アミノ酸
配列が鉄／マンガン−スーパーオキシドジスムターゼと
ホモロジーのある蛋白質であることが明らかとなった。
また、MF−４は、上記のＮ末端アミノ酸配列が、MF−３
と同じく鉄／マンガン−スーパーオキシドジスムターゼ
とホモロジーのある蛋白質であることが明らかとなっ
た。
−２は、配列番号：４の部分アミノ酸配列がカンジダ・
ボイジニ（Candida boidinii）由来のペルオキシゾーム
膜蛋白質(PMP−２０）と、MF−３は上記の部分アミノ酸
配列が鉄／マンガン−スーパーオキシドジスムターゼと
ホモロジーのある蛋白質であることが明らかとなった。
また、MF−４は、上記のＮ末端アミノ酸配列が、MF−３
と同じく鉄／マンガン−スーパーオキシドジスムターゼ
とホモロジーのある蛋白質であることが明らかとなっ
た。
【００６２】１−５）抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF
−３、MF−４の大量調製 上記のマラセチア部分精製粗抗原２７８２の0.05M トリ
ス塩酸緩衝液（pH 8.0）溶液を予め同緩衝液で平衡化し
ておいたDEAE−セルロースカラムに吸着させた。同緩衝
液で洗浄後、0.1M、0.2M、0.5Mの食塩を含む同緩衝液で
段階的に溶出させた。0.1M食塩入り緩衝液溶出画分を限
外濾過膜（MW 10,000 ）で濃縮後、セファクリルS-200H
R カラムクロマトグラフィー（1.5 x 90cm）にかけた。
見掛け上の分子量３〜５万の溶出画分を集め、限外濾過
膜（MW 10,000 ）で濃縮後、セファデックスG-75スーパ
ーファインカラム（1.5 x 100 cm）でクロマトグラフィ
ーを行い、分子量約４万に溶出される画分Ｆ２を得た。
このＦ２画分を0.5M食塩入り0.05M トリス塩酸緩衝液
（pH 8.0）に対して透析後、予め亜鉛イオンをキレート
させ、同緩衝液で平衡化したキレーティングセファロー
スファーストカラム（1 x 15 cm ）クロマトグラフィー
にかけた。同緩衝液で洗浄後、緩衝液のpHを7.0 、6.0
、5.0 、4.0 と低下させて溶出した。pH 5.0の緩衝液
で溶出される画分を集め濃縮後、セファデックスG-75ス
ーパーファインカラム（1.5 x 100 cm）クロマトグラフ
ィーで更に精製することにより、MF−２を単離した。
−３、MF−４の大量調製 上記のマラセチア部分精製粗抗原２７８２の0.05M トリ
ス塩酸緩衝液（pH 8.0）溶液を予め同緩衝液で平衡化し
ておいたDEAE−セルロースカラムに吸着させた。同緩衝
液で洗浄後、0.1M、0.2M、0.5Mの食塩を含む同緩衝液で
段階的に溶出させた。0.1M食塩入り緩衝液溶出画分を限
外濾過膜（MW 10,000 ）で濃縮後、セファクリルS-200H
R カラムクロマトグラフィー（1.5 x 90cm）にかけた。
見掛け上の分子量３〜５万の溶出画分を集め、限外濾過
膜（MW 10,000 ）で濃縮後、セファデックスG-75スーパ
ーファインカラム（1.5 x 100 cm）でクロマトグラフィ
ーを行い、分子量約４万に溶出される画分Ｆ２を得た。
このＦ２画分を0.5M食塩入り0.05M トリス塩酸緩衝液
（pH 8.0）に対して透析後、予め亜鉛イオンをキレート
させ、同緩衝液で平衡化したキレーティングセファロー
スファーストカラム（1 x 15 cm ）クロマトグラフィー
にかけた。同緩衝液で洗浄後、緩衝液のpHを7.0 、6.0
、5.0 、4.0 と低下させて溶出した。pH 5.0の緩衝液
で溶出される画分を集め濃縮後、セファデックスG-75ス
ーパーファインカラム（1.5 x 100 cm）クロマトグラフ
ィーで更に精製することにより、MF−２を単離した。
【００６３】亜鉛キレートクロマトグラフィーにおける
素通り画分は、次に銅キレートクロマトグラフィーで精
製した。即ち、予め銅イオンをキレートさせ、0.5M食塩
入り0.05M トリス塩酸緩衝液（pH 8.0）で平衡化したキ
レーティングセファロースファーストカラム（1 x 15 c
m ）クロマトグラフィーを行った。同緩衝液で洗浄後、
緩衝液のpHを7.0 、6.0 、5.0 、4.0 と低下させて溶出
した。pH 4.0溶出画分を限外濾過膜（MW 10,000 ）で濃
縮後、前記セファデックスG-75スーパーファインカラム
クロマトグラフィーで更に精製し、分子量約４万の溶出
画分MF−１を得た。また、素通り画分は限外濾過膜（MW
10,000 ）で濃縮後、前記セファデックスG-75スーパー
ファインカラムクロマトグラフィーで精製し、分子量約
４万の溶出画分を取得後、更にMono Q陰イオン交換カラ
ムクロマトグラフィーにより精製し、MF−３及びMF−４
を単離した。最終的に、約 0.5ｇのマラセチア部分精製
粗抗原２７８２を出発材料として用い、MF−１、MF−
２、MF−３、MF−４を各々10 mg 、2 mg、3 mg、2 mgず
つ得た。このように大量調製された抗原性蛋白質は、Ｓ
ＤＳ電気泳動、等電点電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分
析において、前記１−４）で述べた結果と同様であっ
た。
素通り画分は、次に銅キレートクロマトグラフィーで精
製した。即ち、予め銅イオンをキレートさせ、0.5M食塩
入り0.05M トリス塩酸緩衝液（pH 8.0）で平衡化したキ
レーティングセファロースファーストカラム（1 x 15 c
m ）クロマトグラフィーを行った。同緩衝液で洗浄後、
緩衝液のpHを7.0 、6.0 、5.0 、4.0 と低下させて溶出
した。pH 4.0溶出画分を限外濾過膜（MW 10,000 ）で濃
縮後、前記セファデックスG-75スーパーファインカラム
クロマトグラフィーで更に精製し、分子量約４万の溶出
画分MF−１を得た。また、素通り画分は限外濾過膜（MW
10,000 ）で濃縮後、前記セファデックスG-75スーパー
ファインカラムクロマトグラフィーで精製し、分子量約
４万の溶出画分を取得後、更にMono Q陰イオン交換カラ
ムクロマトグラフィーにより精製し、MF−３及びMF−４
を単離した。最終的に、約 0.5ｇのマラセチア部分精製
粗抗原２７８２を出発材料として用い、MF−１、MF−
２、MF−３、MF−４を各々10 mg 、2 mg、3 mg、2 mgず
つ得た。このように大量調製された抗原性蛋白質は、Ｓ
ＤＳ電気泳動、等電点電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分
析において、前記１−４）で述べた結果と同様であっ
た。
【００６４】実施例２モノクローナル抗体の作製 ２−１）マウスの免疫、細胞融合及びハイブリドーマの
クローニング 実施例１のようにして得られた、抗原性蛋白質MF−１、
MF−２及びMF−３を、それぞれ10μg ずつフロイント完
全アジュバントに懸濁させ、５週令の雄のBALB/cマウス
の腹腔内に投与した。４週後に、フロイント完全アジュ
バントに懸濁させたアレルゲン20μg で腹腔内に追加免
疫後、更にその４週後に生理食塩水に溶解した同じアレ
ルゲン20μg を静脈内に投与した。最終免疫から３日後
に脾臓細胞を取り出し、４：１の割合でミエローマ細胞
（P3X63-Ag8.653 ）と混合し、43% ポリエチレングリコ
ール2000を加えて細胞融合を実施した。これを96穴マイ
クロプレートのウェルに脾臓細胞２x １０5 個／ウェル
の割合でまき込み、HAT 培地中でハイブリドーマを選択
的に増殖させた。培養上清を用いて目的の抗体産生の有
無をELISA により測定し、抗体産生細胞を選択した。そ
の結果、抗原性蛋白質MF−１に対するＭ−４０モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンとして
５Ｂ４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６０８）を取得した。抗
原性蛋白質MF−２に対するＭ−３モノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマのクローンとして８Ｇ１１株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６０９）を取得した。抗原性蛋白
質MF−３に対するＭ−１モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマのクローンとして１０Ｃ１株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５６１０）を取得した。
クローニング 実施例１のようにして得られた、抗原性蛋白質MF−１、
MF−２及びMF−３を、それぞれ10μg ずつフロイント完
全アジュバントに懸濁させ、５週令の雄のBALB/cマウス
の腹腔内に投与した。４週後に、フロイント完全アジュ
バントに懸濁させたアレルゲン20μg で腹腔内に追加免
疫後、更にその４週後に生理食塩水に溶解した同じアレ
ルゲン20μg を静脈内に投与した。最終免疫から３日後
に脾臓細胞を取り出し、４：１の割合でミエローマ細胞
（P3X63-Ag8.653 ）と混合し、43% ポリエチレングリコ
ール2000を加えて細胞融合を実施した。これを96穴マイ
クロプレートのウェルに脾臓細胞２x １０5 個／ウェル
の割合でまき込み、HAT 培地中でハイブリドーマを選択
的に増殖させた。培養上清を用いて目的の抗体産生の有
無をELISA により測定し、抗体産生細胞を選択した。そ
の結果、抗原性蛋白質MF−１に対するＭ−４０モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンとして
５Ｂ４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６０８）を取得した。抗
原性蛋白質MF−２に対するＭ−３モノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマのクローンとして８Ｇ１１株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６０９）を取得した。抗原性蛋白
質MF−３に対するＭ−１モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマのクローンとして１０Ｃ１株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５６１０）を取得した。
【００６５】２−２）腹水の調製及びモノクローナル抗
体の精製 予めプリスタンで前処理したヌードマウスの腹腔内に10
7 個のハイブリドーマを注射して増殖させ、１〜２週後
に腹水を採取した。得られた腹水からプロテインＡカラ
ムのキット（アマーシャム社製）によりモノクローナル
抗体を精製した。MF−１に対するＭ−４０モノクローナ
ル抗体、MF−２に対するＭ−３モノクローナル抗体、MF
−３に対するＭ−１モノクローナル抗体を得た。これら
のモノクローナル抗体のアイソタイプは、すべてＩｇＧ
１であった。
体の精製 予めプリスタンで前処理したヌードマウスの腹腔内に10
7 個のハイブリドーマを注射して増殖させ、１〜２週後
に腹水を採取した。得られた腹水からプロテインＡカラ
ムのキット（アマーシャム社製）によりモノクローナル
抗体を精製した。MF−１に対するＭ−４０モノクローナ
ル抗体、MF−２に対するＭ−３モノクローナル抗体、MF
−３に対するＭ−１モノクローナル抗体を得た。これら
のモノクローナル抗体のアイソタイプは、すべてＩｇＧ
１であった。
【００６６】２−３）モノクローナル抗体の固定化カラ
ムの調製及び同カラムを用いた抗原性蛋白質MF−３の精
製 上記のＭ−１モノクローナル抗体１５mgをカップリング
緩衝液（0.1M NaHCO3,0.5 M NaCl, pH 8.3 ）で透析
後、１ｇの臭化シアン活性化セファロース４Ｂ（ファル
マシア社製）に常法に従ってカップリングさせ、抗体の
固定化樹脂を調製した。得られた樹脂を５mlの小カラム
に移し、マラセチア部分精製粗抗原２７８２を４０mgと
り、これを0.05M トリス塩酸緩衝液（pH 8.0）に溶解
後、カラムにかけた。0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH 8.0）
で充分に洗浄後、抗体に結合した抗原性蛋白質を0.1Mグ
リシン−塩酸緩衝液(pH 2.5 ）で溶出した。溶出液は直
ちに１M トリス塩酸緩衝液（pH 8.0）を加えて中性に戻
した後、限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮後、上記と同様
にセファデックスG-75スーパーファインカラム（1.5 x
100cm）によるゲルろ過クロマトグラフィーを行い、純
度の高いMF−３を約300 μg単離した。
ムの調製及び同カラムを用いた抗原性蛋白質MF−３の精
製 上記のＭ−１モノクローナル抗体１５mgをカップリング
緩衝液（0.1M NaHCO3,0.5 M NaCl, pH 8.3 ）で透析
後、１ｇの臭化シアン活性化セファロース４Ｂ（ファル
マシア社製）に常法に従ってカップリングさせ、抗体の
固定化樹脂を調製した。得られた樹脂を５mlの小カラム
に移し、マラセチア部分精製粗抗原２７８２を４０mgと
り、これを0.05M トリス塩酸緩衝液（pH 8.0）に溶解
後、カラムにかけた。0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH 8.0）
で充分に洗浄後、抗体に結合した抗原性蛋白質を0.1Mグ
リシン−塩酸緩衝液(pH 2.5 ）で溶出した。溶出液は直
ちに１M トリス塩酸緩衝液（pH 8.0）を加えて中性に戻
した後、限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮後、上記と同様
にセファデックスG-75スーパーファインカラム（1.5 x
100cm）によるゲルろ過クロマトグラフィーを行い、純
度の高いMF−３を約300 μg単離した。
【００６７】実施例３抗原性蛋白質の診断への応用 ３−１）RAST法による特異的ＩｇＥ抗体の測定方法 臭化シアンによるペーパーディスクの活性化、及び精製
アレルゲンのペーパーディスクへのカップリングは宮本
らの方法（アレルギー、２２巻、５８４−５９４頁、１
９７３年）に準じて行った。ポリスチレンチューブにア
レルゲンをカップリングさせたペーパーディスク１枚と
患者血清５０μl を加えて、室温で３時間インキュベー
トした。0.2%のツィーン20を含む生理食塩水でペーパー
ディスクを３回洗浄後、ファルマシア製RAST-RIAキット
の 125Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体５０μl を加えて室温で
一晩インキュベートした。再度３回洗浄後、ガンマカウ
ンターで放射能を測定した。同時に測定したキットのリ
ファレンス試薬で作成した標準曲線からＩｇＥ抗体価を
算出した。標準曲線の上限（＞17.5 PRU/ml ）より高い
値が得られた検体は、ウマ血清で10倍、又は100 倍に希
釈してから再測定を行い、抗体価を算出した。
アレルゲンのペーパーディスクへのカップリングは宮本
らの方法（アレルギー、２２巻、５８４−５９４頁、１
９７３年）に準じて行った。ポリスチレンチューブにア
レルゲンをカップリングさせたペーパーディスク１枚と
患者血清５０μl を加えて、室温で３時間インキュベー
トした。0.2%のツィーン20を含む生理食塩水でペーパー
ディスクを３回洗浄後、ファルマシア製RAST-RIAキット
の 125Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体５０μl を加えて室温で
一晩インキュベートした。再度３回洗浄後、ガンマカウ
ンターで放射能を測定した。同時に測定したキットのリ
ファレンス試薬で作成した標準曲線からＩｇＥ抗体価を
算出した。標準曲線の上限（＞17.5 PRU/ml ）より高い
値が得られた検体は、ウマ血清で10倍、又は100 倍に希
釈してから再測定を行い、抗体価を算出した。
【００６８】３−２）抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF
−４による診断 アトピー性皮膚炎(Atopic Dermatitis：以下ＡＤと略
す。）、アレルギー性喘息（Bronchial Asthma：以下Ｂ
Ａと略す。）及び両方の合併（ＡＤ＋ＢＡ）の患者に対
して、マラセチア粗抗原による皮膚試験を実施したとこ
ろ、ＡＤ患者が５７名中４３名（７５％）、ＢＡ患者が
９１９名中１０８名（１２％）、ＡＤ＋ＢＡ患者が１０
２名中４７名が陽性であり、ＡＤ患者で非常に高い陽性
率を示した。また、皮膚テスト陽性のＡＤ、ＢＡ、及び
ＡＤ＋ＢＡ患者中、各々１００％、５９％、及び８５％
の患者がＲＡＳＴ法によるＩｇＥ抗体測定において陽性
であった。
−４による診断 アトピー性皮膚炎(Atopic Dermatitis：以下ＡＤと略
す。）、アレルギー性喘息（Bronchial Asthma：以下Ｂ
Ａと略す。）及び両方の合併（ＡＤ＋ＢＡ）の患者に対
して、マラセチア粗抗原による皮膚試験を実施したとこ
ろ、ＡＤ患者が５７名中４３名（７５％）、ＢＡ患者が
９１９名中１０８名（１２％）、ＡＤ＋ＢＡ患者が１０
２名中４７名が陽性であり、ＡＤ患者で非常に高い陽性
率を示した。また、皮膚テスト陽性のＡＤ、ＢＡ、及び
ＡＤ＋ＢＡ患者中、各々１００％、５９％、及び８５％
の患者がＲＡＳＴ法によるＩｇＥ抗体測定において陽性
であった。
【００６９】マラセチア粗抗原を用いた皮膚試験で陽
性、更にRAST陽性（スコア１以上）の患者76例（ＡＤ：
30名，ＢＡ：20名，ＡＤ＋ＢＡ：26名）を対象にして、
３種類の抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF−４に対する
ＩｇＥ抗体価をRAST法(RIA法)で測定した。皮膚試験陰
性者（健常人）12名についても同様に抗原性蛋白質に対
するＩｇＥ抗体価を測定した。その結果、表２に示すよ
うに非常に高率に患者血清中に抗原性蛋白質に対するＩ
ｇＥ抗体が存在することが明確になった。特に、MF−
１、MF−２に対する陽性率が高かった。更に、驚くべき
ことにＩｇＥ抗体価が非常に高く（表３）、特にＡＤの
患者ではMF−１、MF−２に対して平均100 ＰＲＵ、最高
1000ＰＲＵを超える患者もあった。また、マラセチア粗
抗原に対するRAST陽性の患者全員の血清中に抗原性蛋白
質MF−１、MF−２、MF−４のいずれかに対するＩｇＥ抗
体が存在していた。
性、更にRAST陽性（スコア１以上）の患者76例（ＡＤ：
30名，ＢＡ：20名，ＡＤ＋ＢＡ：26名）を対象にして、
３種類の抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF−４に対する
ＩｇＥ抗体価をRAST法(RIA法)で測定した。皮膚試験陰
性者（健常人）12名についても同様に抗原性蛋白質に対
するＩｇＥ抗体価を測定した。その結果、表２に示すよ
うに非常に高率に患者血清中に抗原性蛋白質に対するＩ
ｇＥ抗体が存在することが明確になった。特に、MF−
１、MF−２に対する陽性率が高かった。更に、驚くべき
ことにＩｇＥ抗体価が非常に高く（表３）、特にＡＤの
患者ではMF−１、MF−２に対して平均100 ＰＲＵ、最高
1000ＰＲＵを超える患者もあった。また、マラセチア粗
抗原に対するRAST陽性の患者全員の血清中に抗原性蛋白
質MF−１、MF−２、MF−４のいずれかに対するＩｇＥ抗
体が存在していた。
【００７０】
【表２】
【００７１】
【表３】
【００７２】３−３）抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF
−３、MF−４の免疫学的性質 患者プール血清を用いたＲＡＳＴcross-inhibitionテス
トで、３種の抗原性蛋白質（MF−１、MF−２、MF−４）
の交差反応性を見たところ（表４）、互いに交差しなか
った。即ち、それぞれに対して特異的ＩｇＥ抗体が患者
血清中に存在することが明らかとなった。
−３、MF−４の免疫学的性質 患者プール血清を用いたＲＡＳＴcross-inhibitionテス
トで、３種の抗原性蛋白質（MF−１、MF−２、MF−４）
の交差反応性を見たところ（表４）、互いに交差しなか
った。即ち、それぞれに対して特異的ＩｇＥ抗体が患者
血清中に存在することが明らかとなった。
【００７３】
【表４】
【００７４】次に、抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF−
４を段階的に希釈し、抗原としての強さをDirect RAST
EIA 法により測定した。すなわち、抗原性蛋白質MF−
１、MF−２、MF−４の希釈液を臭化シアンで活性化した
ペーパーディスクにカップリングし、ついでエタノール
アミンでブロッキングした。その後、各ディスクに５倍
希釈したプール血清５０μｌずつを加えて、その後、希
釈したβ−ガラクトシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗血
清を反応させ、酵素基質を加え、４１５ｎｍの吸光度を
測定した。その結果を図１２に示したが、MF−１が最も
低濃度で患者血清ＩｇＥに結合することが明らかとなっ
た。
４を段階的に希釈し、抗原としての強さをDirect RAST
EIA 法により測定した。すなわち、抗原性蛋白質MF−
１、MF−２、MF−４の希釈液を臭化シアンで活性化した
ペーパーディスクにカップリングし、ついでエタノール
アミンでブロッキングした。その後、各ディスクに５倍
希釈したプール血清５０μｌずつを加えて、その後、希
釈したβ−ガラクトシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗血
清を反応させ、酵素基質を加え、４１５ｎｍの吸光度を
測定した。その結果を図１２に示したが、MF−１が最も
低濃度で患者血清ＩｇＥに結合することが明らかとなっ
た。
【００７５】また、抗原性蛋白質MF−３を段階的に希釈
し、抗原としての強さをELISA 法により測定した。すな
わち、抗原性蛋白質MF−３の希釈液をマイクロプレート
にコーティングした後、０．０１％ツィーン２０を含む
生理食塩水で洗浄し、３％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッ
キングし、０．０１％ツィーン２０を含む生理食塩水で
洗浄した後、プール血清を加えた。３７℃、２時間放置
後、二次抗体であるペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩ
ｇＥ抗血清を加え、次に基質溶液を加え、発色後、４５
０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図１３に示し
た。
し、抗原としての強さをELISA 法により測定した。すな
わち、抗原性蛋白質MF−３の希釈液をマイクロプレート
にコーティングした後、０．０１％ツィーン２０を含む
生理食塩水で洗浄し、３％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッ
キングし、０．０１％ツィーン２０を含む生理食塩水で
洗浄した後、プール血清を加えた。３７℃、２時間放置
後、二次抗体であるペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩ
ｇＥ抗血清を加え、次に基質溶液を加え、発色後、４５
０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図１３に示し
た。
【００７６】実施例４抗原性蛋白質MF−２のシステイン残基のピリジルエチル
化物の調製 精製抗原性蛋白質MF−２（0.04mg）をホウ酸緩衝食塩水
（pH 8.0）200 μl に溶解し、これに800 μl の５Ｍ塩
酸グアニジン、1 μl の４−ビニルピリジン、２μl の
トリブチルホスフィンを加えた。窒素ガス置換後、37℃
で一晩反応、そしてＨＰＬＣ（カラム：μ-Bondasphere
C4-300 、２×150mm 、ウォーターズ（Waters) 社製；
溶媒：0.05% TFA ／水で15分洗浄、60分後0.05% TFA/ア
セトニトリル８０％となるように直線的グラジエント溶
出；流速：220 μl ／分；検出：220nm ；カラム温度：
40℃、図１４）により単離精製した。得られたものは、
非還元条件（メルカプトエタノール非存在）下でのＳＤ
Ｓ電気泳動において２０ｋＤａ付近に泳動されること、
また、リジルエンドペプチダーゼ消化後得られたペプチ
ド断片（図１５）のうち、配列番号３及び４のＮ末端ア
ミノ酸配列を有するペプチド断片（各々２８．２０、３
１．１５に溶出）がピリジルエチルシステイン基を有す
ることから、MF−２のピリジルエチル化物であることが
明らかとなった。得られたMF−２のピリジルエチル化物
は、MF−２と同様にマラセチアアレルギー患者血清Ｉｇ
Ｅへ結合することが、ＳＤＳ電気泳動後のイムノブロッ
ティングにより確認された。
化物の調製 精製抗原性蛋白質MF−２（0.04mg）をホウ酸緩衝食塩水
（pH 8.0）200 μl に溶解し、これに800 μl の５Ｍ塩
酸グアニジン、1 μl の４−ビニルピリジン、２μl の
トリブチルホスフィンを加えた。窒素ガス置換後、37℃
で一晩反応、そしてＨＰＬＣ（カラム：μ-Bondasphere
C4-300 、２×150mm 、ウォーターズ（Waters) 社製；
溶媒：0.05% TFA ／水で15分洗浄、60分後0.05% TFA/ア
セトニトリル８０％となるように直線的グラジエント溶
出；流速：220 μl ／分；検出：220nm ；カラム温度：
40℃、図１４）により単離精製した。得られたものは、
非還元条件（メルカプトエタノール非存在）下でのＳＤ
Ｓ電気泳動において２０ｋＤａ付近に泳動されること、
また、リジルエンドペプチダーゼ消化後得られたペプチ
ド断片（図１５）のうち、配列番号３及び４のＮ末端ア
ミノ酸配列を有するペプチド断片（各々２８．２０、３
１．１５に溶出）がピリジルエチルシステイン基を有す
ることから、MF−２のピリジルエチル化物であることが
明らかとなった。得られたMF−２のピリジルエチル化物
は、MF−２と同様にマラセチアアレルギー患者血清Ｉｇ
Ｅへ結合することが、ＳＤＳ電気泳動後のイムノブロッ
ティングにより確認された。
【００７７】実施例５抗原性蛋白質MF−３由来の抗原性断片ペプチドの単離 精製抗原性蛋白質MF−３（0.04 mg ）をホウ酸緩衝食塩
水（pH 8.0）100 μlに溶解し、これに900 μl の５Ｍ
塩酸グアニジン、1 μl の４−ビニルピリジン、２μl
のトリブチルホスフィンを加えた。窒素ガス置換後、37
℃で一晩反応、そしてＨＰＬＣ（カラム：μ-Bondasphe
re C4-300 、２×150mm 、ウォーターズ(Waters)社製；
溶媒：0.05% TFA ／水で15分洗浄、60分後0.05% TFA/ア
セトニトリル８０％となるように直線的グラジエント溶
出）により単離精製した。得られた抗原性蛋白質MF−３
の塩酸グアニジン処理体に５０mM N−エチルモルフィン
−酢酸（pH 9.0）100 μl 、リジルエンドペプチダーゼ
（Achromobacter proteaseI、和光純薬社製）を加え、3
7℃で一晩反応後、ＨＰＬＣ（カラム：μ-Bondasphere
C18-300、２×150mm 、ウォーターズ(Waters)社製；溶
媒：0.05% TFA/水から0.05% TFA/アセトニトリル60％ま
での直線的グラジエント溶出；流速：200 μl ／分；検
出：214nm ；カラム温度：40℃；図１６）にかけた。各
ペプチド断片を分取、凍結乾燥後、各ペプチド断片につ
いてマラセチアアレルギー患者血清ＩｇＥに対する結合
性を下記のようにＥＬＩＳＡ法により測定した。
水（pH 8.0）100 μlに溶解し、これに900 μl の５Ｍ
塩酸グアニジン、1 μl の４−ビニルピリジン、２μl
のトリブチルホスフィンを加えた。窒素ガス置換後、37
℃で一晩反応、そしてＨＰＬＣ（カラム：μ-Bondasphe
re C4-300 、２×150mm 、ウォーターズ(Waters)社製；
溶媒：0.05% TFA ／水で15分洗浄、60分後0.05% TFA/ア
セトニトリル８０％となるように直線的グラジエント溶
出）により単離精製した。得られた抗原性蛋白質MF−３
の塩酸グアニジン処理体に５０mM N−エチルモルフィン
−酢酸（pH 9.0）100 μl 、リジルエンドペプチダーゼ
（Achromobacter proteaseI、和光純薬社製）を加え、3
7℃で一晩反応後、ＨＰＬＣ（カラム：μ-Bondasphere
C18-300、２×150mm 、ウォーターズ(Waters)社製；溶
媒：0.05% TFA/水から0.05% TFA/アセトニトリル60％ま
での直線的グラジエント溶出；流速：200 μl ／分；検
出：214nm ；カラム温度：40℃；図１６）にかけた。各
ペプチド断片を分取、凍結乾燥後、各ペプチド断片につ
いてマラセチアアレルギー患者血清ＩｇＥに対する結合
性を下記のようにＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００７８】即ち、各ペプチド断片（各約１０〜１００
ｐｍｏｌ）をペプチドコーティングキット（宝酒造製）
を用いて、マイクロプレートにコーティング後、0.01%
ツィーン20を含む生理食塩水で洗浄し、3%ＢＳＡでブロ
ッキングし、そして患者血清で処理した。その後、希釈
したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗血清を反
応させ、酵素基質を加え、一定時間後吸光度を測定し、
抗原性断片を検出した。その結果、20.02 、21.41 、2
4.07 分付近に溶出されるピークに患者血清ＩｇＥと結
合する抗原性断片が存在すると思われた。これらのう
ち、21.41 分のピークはＨＨＱＴＹＶＮＮＬＮＡＡＸＫ
（配列番号：１１、Ｘは未決定のアミノ酸である）から
なるアミノ酸配列を有するペプチドが含まれていた。
ｐｍｏｌ）をペプチドコーティングキット（宝酒造製）
を用いて、マイクロプレートにコーティング後、0.01%
ツィーン20を含む生理食塩水で洗浄し、3%ＢＳＡでブロ
ッキングし、そして患者血清で処理した。その後、希釈
したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗血清を反
応させ、酵素基質を加え、一定時間後吸光度を測定し、
抗原性断片を検出した。その結果、20.02 、21.41 、2
4.07 分付近に溶出されるピークに患者血清ＩｇＥと結
合する抗原性断片が存在すると思われた。これらのう
ち、21.41 分のピークはＨＨＱＴＹＶＮＮＬＮＡＡＸＫ
（配列番号：１１、Ｘは未決定のアミノ酸である）から
なるアミノ酸配列を有するペプチドが含まれていた。
【００７９】実施例６リンパ球幼若化試験 被験者［アレルギー患者８名（表５中No. １〜８）、健
常人２名（表５中No.９、10）］より静脈血をヘパリン
採血し、フィコール比重遠心法でリンパ球を分離した。
細胞数が５×１０5 ／mlになるように１０％ＦＣＳ添加
RPMI1640培地で調製後、0.2ml ずつ96ウェルマイクロプ
レートに分注し、上記のマラセチア部分精製粗抗原２７
８２を10、100 μg/mlとなるように、抗原性蛋白質（MF
−１、MF−２、MF−４）を１、10μg/mlとなるように添
加し、５％CO2 、37℃で高湿度条件下に５日間培養し
た。４日目に、0.5 μCiのトリチウム化( 3H)−チミジ
ンを加えた。培養終了後、リンパ球を集め、液体シンチ
レーションカウンターで 3H-チミジン取り込み量を測定
した。実験は３連で行い、その平均値を用い、抗原非添
加群と添加群の 3H-チミジン取り込み量の比をＳＩ（st
imulation index ）として表わした。結果を表５に示し
た。表５より明らかなように、患者No. ４由来のリンパ
球は、抗原性蛋白質MF−１、MF−２に反応して増殖して
いる。また、患者No. １、No. ６由来のリンパ球は特に
MF−２に反応して増殖している。
常人２名（表５中No.９、10）］より静脈血をヘパリン
採血し、フィコール比重遠心法でリンパ球を分離した。
細胞数が５×１０5 ／mlになるように１０％ＦＣＳ添加
RPMI1640培地で調製後、0.2ml ずつ96ウェルマイクロプ
レートに分注し、上記のマラセチア部分精製粗抗原２７
８２を10、100 μg/mlとなるように、抗原性蛋白質（MF
−１、MF−２、MF−４）を１、10μg/mlとなるように添
加し、５％CO2 、37℃で高湿度条件下に５日間培養し
た。４日目に、0.5 μCiのトリチウム化( 3H)−チミジ
ンを加えた。培養終了後、リンパ球を集め、液体シンチ
レーションカウンターで 3H-チミジン取り込み量を測定
した。実験は３連で行い、その平均値を用い、抗原非添
加群と添加群の 3H-チミジン取り込み量の比をＳＩ（st
imulation index ）として表わした。結果を表５に示し
た。表５より明らかなように、患者No. ４由来のリンパ
球は、抗原性蛋白質MF−１、MF−２に反応して増殖して
いる。また、患者No. １、No. ６由来のリンパ球は特に
MF−２に反応して増殖している。
【００８０】
【表５】
【００８１】実施例７マラセチアアレルギー皮内反応診断試薬および診断用滴
定試薬の調製 精製されたアレルゲン活性成分を乾燥して粉末状で採取
して、マラセチアアレルギー疾患に対する皮内反応診断
試薬及びマラセチアアレルギー診断用滴定試薬として用
いる。皮内反応診断試薬には0.5 ％フェノールを添加し
た0.9 ％生理食塩水を溶媒とし、アレルゲン活性成分の
20万倍希釈液を調製して用いる。また、マラセチアアレ
ルギー診断用滴定試薬には、アレルゲン活性成分を１ｍ
ｇ／ｍｌの濃度でハンクス緩衝液に溶解し、これをヒス
タミン遊離滴定用試薬の原液としてその希釈液を用い
る。
定試薬の調製 精製されたアレルゲン活性成分を乾燥して粉末状で採取
して、マラセチアアレルギー疾患に対する皮内反応診断
試薬及びマラセチアアレルギー診断用滴定試薬として用
いる。皮内反応診断試薬には0.5 ％フェノールを添加し
た0.9 ％生理食塩水を溶媒とし、アレルゲン活性成分の
20万倍希釈液を調製して用いる。また、マラセチアアレ
ルギー診断用滴定試薬には、アレルゲン活性成分を１ｍ
ｇ／ｍｌの濃度でハンクス緩衝液に溶解し、これをヒス
タミン遊離滴定用試薬の原液としてその希釈液を用い
る。
【００８２】実施例８減感作治療用抗原製剤の調製 精製されたアレルゲン活性成分を乾燥して粉末状で採取
して、マラセチアアレルギー疾患に対する減感作治療剤
として用いる。アレルゲン活性成分を１ｍｇ／ｍｌの濃
度で0.5 ％フェノールを添加した0.9 ％生理食塩水に溶
解し、減感作治療用抗原の原液とする。
して、マラセチアアレルギー疾患に対する減感作治療剤
として用いる。アレルゲン活性成分を１ｍｇ／ｍｌの濃
度で0.5 ％フェノールを添加した0.9 ％生理食塩水に溶
解し、減感作治療用抗原の原液とする。
【００８３】実施例９室内塵中のマラセチア抗原性蛋白質MF-1の定量とマラセ
チアの培養 気管支喘息患者住居の室内や寝具などから掃除機により
塵を一定条件で採集した。MF−１の定量は、ウサギポリ
クローナル抗体と実施例２−２）で得られたマウスモノ
クローナル抗体（Ｍ−４０）を用いるサンドイッチＥＬ
ＩＳＡ法で行い、塵は１：１０（ｗ／ｖ）で抽出した上
清をMF−１定量のための試料とした。マラセチアの培養
のためには、塵を滅菌水で１：１０（ｗ／ｖ）となるよ
うに混濁し、平板培地上にまいた。また、寝具表面に滅
菌テープを一度貼り、剥がして平板培地上に置いた。培
地はＰＤＡ、Ｍ４０ＹＡ、ディクソン寒天培地を用い
て、２５℃で１週間培養後コロニー数を算定した。サン
ドイッチＥＬＩＳＡ法により、１ｎｇ／ｇ塵以上のMF−
１の定量が可能であり、寝具由来の塵２４検体中１６検
体に８７．１〜１．１ｎｇ／ｇ塵のMF−１が検出され
た。テープ法による寝具表面のマラセチアの培養成績
は、２４検体中１０検体が陽性であった。なお、２４検
体中、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるMF−１の検出結
果と培養成績の結果が一致していた検体は、陽性８検
体、陰性６検体の合計１４検体（５８％）であった。
チアの培養 気管支喘息患者住居の室内や寝具などから掃除機により
塵を一定条件で採集した。MF−１の定量は、ウサギポリ
クローナル抗体と実施例２−２）で得られたマウスモノ
クローナル抗体（Ｍ−４０）を用いるサンドイッチＥＬ
ＩＳＡ法で行い、塵は１：１０（ｗ／ｖ）で抽出した上
清をMF−１定量のための試料とした。マラセチアの培養
のためには、塵を滅菌水で１：１０（ｗ／ｖ）となるよ
うに混濁し、平板培地上にまいた。また、寝具表面に滅
菌テープを一度貼り、剥がして平板培地上に置いた。培
地はＰＤＡ、Ｍ４０ＹＡ、ディクソン寒天培地を用い
て、２５℃で１週間培養後コロニー数を算定した。サン
ドイッチＥＬＩＳＡ法により、１ｎｇ／ｇ塵以上のMF−
１の定量が可能であり、寝具由来の塵２４検体中１６検
体に８７．１〜１．１ｎｇ／ｇ塵のMF−１が検出され
た。テープ法による寝具表面のマラセチアの培養成績
は、２４検体中１０検体が陽性であった。なお、２４検
体中、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるMF−１の検出結
果と培養成績の結果が一致していた検体は、陽性８検
体、陰性６検体の合計１４検体（５８％）であった。
【００８４】
【発明の効果】本発明により、単離されたマラセチア由
来の高純度の抗原性蛋白質、これらに由来する抗原性断
片、およびこれらの抗原性蛋白質又は抗原性断片に対す
る特異的抗体を提供することができる。また、これらの
抗原性蛋白質、抗原性断片を有効成分とするマラセチア
アレルギー疾患の診断薬、治療薬、予防薬を提供するこ
とができる。
来の高純度の抗原性蛋白質、これらに由来する抗原性断
片、およびこれらの抗原性蛋白質又は抗原性断片に対す
る特異的抗体を提供することができる。また、これらの
抗原性蛋白質、抗原性断片を有効成分とするマラセチア
アレルギー疾患の診断薬、治療薬、予防薬を提供するこ
とができる。
【００８５】
配列番号：１ 配列の長さ：２８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Pro Gly Asp Pro Thr Ala Thr Ala Lys Gly Asn Glu Ile Pro Asp Thr 5 10 15 Leu Met Gly Tyr Ile Pro Trp Thr Pro Glu Leu Asp 20 25
【００８６】配列番号：２ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００８７】配列番号：３ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Asn Leu Thr Phe Ala Gln Asp Val Asn Cys Glu Phe 5 10
【００８８】配列番号：４ 配列の長さ：２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Val Ile Val Ala Val Pro Gly Xaa Phe Thr Pro Thr Cys Thr Ala 5 10 15 Asn His Val Pro Xaa Tyr Xaa Glu 20
【００８９】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Gln Asp Pro Leu Thr Thr His His Pro Val Ile Gly Trp Asp Xaa 5 10 15 Xaa Glu His Ala 20
【００９０】配列番号：６ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Trp Trp Asn Val Val Asn Trp Ala Glu Ala Glu Lys 5 10
【００９１】配列番号：７ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００９２】配列番号：８ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Tyr Thr Leu Pro Pro Leu Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Leu Glu Pro 5 10 15 Ala Ile Ser Gly Glu Ile Met Glu Thr His Tyr Glu Lys His 20 25 30
【００９３】配列番号：９ 配列の長さ：２３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Pro Tyr Asp Val Ile Xaa Ile Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Val 5 10 15 Ala Ala Ile Lys Ala Ala Gln 20
【００９４】配列番号：１０ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Arg Lys Val Ala Val Leu Gly Ala Ser Gly Gly Ile Gly Gln Pro Leu 5 10 15 Ser Leu Leu Met Lys Leu Asn Pro Lys Val Thr Glu Leu Arg 20 25 30
【００９５】配列番号：１１ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 His His Gln Thr Tyr Val Asn Asn Leu Asn Ala Ala Xaa Lys 5 10
【図１】図１は、マラセチア部分精製粗抗原２７８２の
Mono Qによるクロマトグラフィーの結果を示す図であ
る。
Mono Qによるクロマトグラフィーの結果を示す図であ
る。
【図２】図２は、マラセチア部分精製粗抗原２７８２の
Mono Q分画物について、患者血清中のＩｇＥ抗体との結
合性を示す図である。
Mono Q分画物について、患者血清中のＩｇＥ抗体との結
合性を示す図である。
【図３】図３は、マラセチア部分精製粗抗原２７８２の
Mono Q分画物のSDS-PAGE後にＣＢＢ染色を行った電気泳
動の写真である。
Mono Q分画物のSDS-PAGE後にＣＢＢ染色を行った電気泳
動の写真である。
【図４】図４は、マラセチア部分精製粗抗原２７８２の
Mono Q分画物のSDS-PAGE後にイムノブロッティングを行
った電気泳動の写真である。
Mono Q分画物のSDS-PAGE後にイムノブロッティングを行
った電気泳動の写真である。
【図５】図５は、Mono Q クロマトグラフィーによるMF
−１のピークを示す図である。
−１のピークを示す図である。
【図６】図６は、Mono Q クロマトグラフィーによるMF
−２のピークを示す図である。
−２のピークを示す図である。
【図７】図７は、Mono Q クロマトグラフィーによるMF
−３のピークを示す図である。
−３のピークを示す図である。
【図８】図８は、Mono Q クロマトグラフィーによるMF
−４のピークを示す図である。
−４のピークを示す図である。
【図９】図９は、マラセチア粗抗原２７８２の二次元電
気泳動の写真である。クーマシーブリリアントブルー染
色により蛋白質の検出を行う。
気泳動の写真である。クーマシーブリリアントブルー染
色により蛋白質の検出を行う。
【図１０】図１０は、マラセチア粗抗原２７８２の二次
元電気泳動の写真である。健常者ＩｇＥ抗体（Ａ）およ
びアレルギー患者ＩｇＥ抗体（Ｂ）を用いてイムノブロ
ット法によりスポットを検出する。
元電気泳動の写真である。健常者ＩｇＥ抗体（Ａ）およ
びアレルギー患者ＩｇＥ抗体（Ｂ）を用いてイムノブロ
ット法によりスポットを検出する。
【図１１】図１１は、MF−１、MF−２、MF−３、MF−４
のSDS-PAGE（還元条件下）による電気泳動の写真であ
る。
のSDS-PAGE（還元条件下）による電気泳動の写真であ
る。
【図１２】図１２は、抗原性蛋白質MF−１、MF−２、MF
−４のＩｇＥ結合性の濃度依存性を示す図である。
−４のＩｇＥ結合性の濃度依存性を示す図である。
【図１３】図１３は、MF−３のＩｇＥ結合性の濃度依存
性を示す図である。
性を示す図である。
【図１４】図１４は、MF−３のピリジルエチル化物のＨ
ＰＬＣによる精製を示す図である。
ＰＬＣによる精製を示す図である。
【図１５】図１５は、MF−２（ピリジルエチル化物）の
リジルエンドペプチダーゼ消化物のＨＰＬＣ分析結果を
示す図である。
リジルエンドペプチダーゼ消化物のＨＰＬＣ分析結果を
示す図である。
【図１６】図１６は、MF−３（ピリジルエチル化物）の
リジルエンドペプチダーゼ消化物のＨＰＬＣ分析結果を
示す図である。
リジルエンドペプチダーゼ消化物のＨＰＬＣ分析結果を
示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 1/18 Ｃ０７Ｋ 1/22 1/22 1/34 1/34 1/36 1/36 7/06 7/06 16/14 16/14 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/532 Ａ 33/532 33/569 Ａ 33/569 Ｚ Ｃ１２Ｎ 1/14 Ａ // Ｃ１２Ｎ 1/14 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＦ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 竹迫 一任 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 大西 佳美 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 八木原 朋子 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内
Claims (26)
- 【請求項１】 アレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体に
対して結合能を有することを特徴とする、マラセチア属
の真菌由来の実質的に純粋な、単離された抗原性蛋白
質。 - 【請求項２】 マラセチア粗抗原に対して皮膚反応陽性
のアレルギー疾患患者が反応する、マラセチア由来の主
要アレルゲンであることを特徴とする請求項１記載の抗
原性蛋白質。 - 【請求項３】 分子量が１００００〜１０００００（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ、還元条件下または非還元条件下）で、
等電点が４〜７（未変性下または８Ｍ尿素変性下）であ
ることを特徴とする請求項１又は２記載の抗原性蛋白
質。 - 【請求項４】 マラセチア属の真菌細胞内に存在する抗
原性蛋白質であることを特徴とする請求項３記載の抗原
性蛋白質。 - 【請求項５】 配列表の配列番号：１に示す部分アミノ
酸配列を有する蛋白質であって、分子量約２１０００
（SDS-PAGE、還元条件下) および約４００００（SDS-PA
GE、非還元条件下) 並びに未変性下の等電点約 4.7およ
び８Ｍ尿素変性下の等電点約 5.3を有することを特徴と
する請求項１記載のマラセチア由来の抗原性蛋白質。 - 【請求項６】 配列表の配列番号：２、配列番号：３、
または配列番号：４に示す部分アミノ酸配列を有する蛋
白質であって、分子量約２００００（SDS-PAGE、還元条
件下) および約４００００（SDS-PAGE、非還元条件下)
並びに未変性下の等電点約 4.7および８Ｍ尿素変性下の
等電点約 5.8を有することを特徴とする請求項１記載の
マラセチア由来の抗原性蛋白質。 - 【請求項７】 配列表の配列番号：５、配列番号：６、
または配列番号：７に示す部分アミノ酸配列を有する蛋
白質であって、分子量約２７０００（SDS-PAGE、還元条
件下) および約２７０００（SDS-PAGE、非還元条件下)
並びに未変性下の等電点約 5.2および８Ｍ尿素変性下の
等電点約 6.5を有することを特徴とする請求項１記載の
マラセチア由来の抗原性蛋白質。 - 【請求項８】 配列表の配列番号：８に示す部分アミノ
酸配列を有する蛋白質であって、分子量約２６０００
（SDS-PAGE、還元条件下) および約２６０００（SDS-PA
GE、非還元条件下) 並びに未変性下の等電点約 5.2およ
び８Ｍ尿素変性下の等電点約 6.3を有することを特徴と
する請求項１記載のマラセチア由来の抗原性蛋白質。 - 【請求項９】 配列表の配列番号：９に示す部分アミノ
酸配列を有する蛋白質であって、分子量約６６０００
（SDS-PAGE、還元条件下) および８Ｍ尿素変性下の等電
点約 6.1を有することを特徴とする請求項１記載のマラ
セチア由来の抗原性蛋白質。 - 【請求項１０】 配列表の配列番号：１０に示す部分ア
ミノ酸配列を有する蛋白質であって、分子量約４３００
０（SDS-PAGE、還元条件下) および８Ｍ尿素変性下の等
電点約 6.2を有することを特徴とする請求項１記載のマ
ラセチア由来の抗原性蛋白質。 - 【請求項１１】 M. furfur(マラセチア ファーファ）
TIMM2782の培養菌体破砕抽出液を遠心分離にかけその上
清を凍結乾燥した後、DEAE−セルロースカラムクロマト
グラフィーにかけ0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、
限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮した後、セファクリルS-
200HR カラムクロマトグラフィーにかけ分子量3 〜5 万
の溶出画分を取得し、得られる溶出画分を限外ろ過膜
（MW 10,000)で濃縮した後、セファデックスＧ−７５ス
ーパーファインカラムクロマトグラフィーにかけ分子量
約４万に溶出される画分を取得し、ついで亜鉛キレーテ
ィングセファロースファーストカラムクロマトグラフィ
ーにかけ素通り画分を銅キレートクロマトグラフィーに
かけｐＨ約４で溶出される画分を取得し、濃縮後セファ
デックスG-75スーパーファインカラムクロマトグラフィ
ーで精製し分子量約４万の溶出画分を取得して得られ
る、請求項５記載の抗原性蛋白質。 - 【請求項１２】 M. furfur(マラセチア ファーファ）
TIMM2782の培養菌体破砕抽出液を遠心分離にかけその上
清を凍結乾燥した後、DEAE−セルロースカラムクロマト
グラフィーにかけ0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、
限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮した後、セファクリルS-
200HR カラムクロマトグラフィーにかけ分子量3 〜5 万
の溶出画分を取得し、得られる溶出画分を限外ろ過膜
（MW 10,000)で濃縮した後、セファデックスＧ−７５ス
ーパーファインカラムクロマトグラフィーにかけ分子量
約４万に溶出される画分を取得し、ついで亜鉛キレーテ
ィングセファロースファーストカラムクロマトグラフィ
ーにかけ、ｐＨ約５で溶出される画分を取得し、濃縮後
セファデックスG-75スーパーファインカラムクロマトグ
ラフィーで精製して得られる、請求項６記載の抗原性蛋
白質。 - 【請求項１３】 M. furfur(マラセチア ファーファ）
TIMM2782の培養菌体破砕抽出液を遠心分離にかけその上
清を凍結乾燥した後、DEAE−セルロースカラムクロマト
グラフィーにかけ0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、
限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮した後、セファクリルS-
200HR カラムクロマトグラフィーにかけ分子量3 〜5 万
の溶出画分を取得し、得られる溶出画分を限外ろ過膜
（MW 10,000)で濃縮した後、セファデックスＧ−７５ス
ーパーファインカラムクロマトグラフィーにかけ分子量
約４万に溶出される画分を取得し、ついで亜鉛キレーテ
ィングセファロースファーストカラムクロマトグラフィ
ーにかけ素通り画分を取得し、銅キレートクロマトグラ
フィーにかけ、素通り画分を濃縮した後セファデックス
G-75スーパーファインカラムクロマトグラフィーで精製
し分子量約４万の溶出画分を取得し、さらにMono Q陰イ
オン交換クロマトグラフィーで精製して得られる、請求
項７記載の抗原性蛋白質。 - 【請求項１４】 M. furfur(マラセチア ファーファ）
TIMM2782の培養菌体破砕抽出液を遠心分離にかけその上
清を凍結乾燥した後、DEAE−セルロースカラムクロマト
グラフィーにかけ0.1MのNaClによる溶出画分を取得し、
限外ろ過膜（MW 10,000)で濃縮した後、セファクリルS-
200HR カラムクロマトグラフィーにかけ分子量3 〜5 万
の溶出画分を取得し、得られる溶出画分を限外ろ過膜
（MW 10,000)で濃縮した後、セファデックスＧ−７５ス
ーパーファインカラムクロマトグラフィーにかけ分子量
約４万に溶出される画分を取得し、ついで亜鉛キレーテ
ィングセファロースファーストカラムクロマトグラフィ
ーにかけ素通り画分を取得し、銅キレートクロマトグラ
フィーにかけ、素通り画分を濃縮した後セファデックス
G-75スーパーファインカラムクロマトグラフィーで精製
し分子量約４万の溶出画分を取得し、さらにMono Q陰イ
オン交換クロマトグラフィーで精製して得られる、請求
項８記載の抗原性蛋白質。 - 【請求項１５】 請求項５〜１４いずれか１項記載の抗
原性蛋白質と免疫学的に同等の性質を有することを特徴
とする機能的同等物。 - 【請求項１６】 請求項１〜１５いずれか１項記載の抗
原性蛋白質に含まれる抗原エピトープを有することを特
徴とする該抗原性蛋白質由来の抗原性断片。 - 【請求項１７】 該抗原性断片が、マラセチアに特異的
なＩｇＥ抗体に対して結合能を有しないか、ＩｇＥ抗体
への結合が起こる場合でも、そのような結合は肥満細胞
又は好塩基球からヒスタミンを放出させない程度である
ことを特徴とする請求項１６記載の抗原性断片。 - 【請求項１８】 該抗原性断片が、マラセチア由来の抗
原性蛋白質より実質的に低い程度でＩｇＥに結合するこ
とを特徴とする請求項１７記載の抗原性断片。 - 【請求項１９】 該抗原性断片が、少なくとも１個のＴ
細胞エピトープを含むことを特徴とする請求項１６〜１
８いずれか１項記載の抗原性断片。 - 【請求項２０】 該抗原性断片が、抗原性蛋白質より少
ないＩｇＥ賦活活性を有することを特徴とする請求項１
６〜１９いずれか１項記載の抗原性断片。 - 【請求項２１】 マラセチアアレルギー患者に投与した
場合、投与された患者のマラセチアに対するアレルギー
応答を軽減させることができるものであることを特徴と
する請求項１〜１５いずれか１項記載の抗原性蛋白質。 - 【請求項２２】 マラセチアアレルギー患者に投与した
場合、投与された患者のマラセチアに対するアレルギー
応答を軽減させることができるものであることを特徴と
する請求項１６〜２０いずれか１項記載の抗原性断片。 - 【請求項２３】 請求項１〜１５いずれか１項記載の抗
原性蛋白質、あるいは請求項１６〜２０いずれか１項記
載の抗原性断片に対する抗体。 - 【請求項２４】 請求項１〜１５いずれか１項記載の抗
原性蛋白質、あるいは請求項１６〜２０いずれか１項記
載の抗原性断片を有効成分とすることを特徴とするマラ
セチアアレルギー疾患又はマラセチア感染症の診断薬。 - 【請求項２５】 請求項１〜１５いずれか１項記載の抗
原性蛋白質、あるいは請求項１６〜２０いずれか１項記
載の抗原性断片を有効成分とすることを特徴とするマラ
セチアアレルギー疾患又はマラセチア感染症の治療薬。 - 【請求項２６】 請求項１〜１５いずれか１項記載の抗
原性蛋白質をマラセチアアレルゲンの標準品とし、該抗
原性蛋白質に対する抗体を用いてマラセチアアレルゲン
の免疫学的定量を行うことを特徴とする、マラセチアア
レルゲンの定量方法。
Priority Applications (16)
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|---|---|---|---|
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| KR10-1998-0704249A KR100465382B1 (ko) | 1995-12-12 | 1996-12-10 | 말라세지아에서 유래된 항원성 단백질 |
| CA002238278A CA2238278C (en) | 1995-12-12 | 1996-12-10 | Antigenic protein originating in malassezia |
| EP96941211A EP0955366B1 (en) | 1995-12-12 | 1996-12-10 | Antigenic protein originating in malassezia |
| DE69636527T DE69636527D1 (de) | 1995-12-12 | 1996-12-10 | Antigenes protein aus malassezia |
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| JP52192697A JP3990730B2 (ja) | 1995-12-12 | 1996-12-10 | マラセチア由来の抗原性蛋白質 |
| US09/091,097 US6432407B1 (en) | 1995-12-12 | 1996-12-10 | Antigenic protein originating in malassezia |
| EP06018603A EP1792992A1 (en) | 1995-12-12 | 1996-12-10 | Antigenic protein originating in Malassezia |
| PCT/JP1996/003602 WO1997021817A1 (fr) | 1995-12-12 | 1996-12-10 | Proteine antigenique provenant de la malassezia |
| TW085115374A TW565567B (en) | 1995-12-12 | 1996-12-12 | Antigenic protein originating in Malassezia |
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| US11/116,371 US7491405B2 (en) | 1995-12-12 | 2005-04-28 | Antigenic protein originating in Malassezia |
| JP2007118138A JP4044605B2 (ja) | 1995-12-12 | 2007-04-27 | マラセチア由来の抗原性蛋白質 |
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| JP34662795 | 1995-12-12 | ||
| JP7-346627 | 1995-12-12 | ||
| JP8257612A JPH09221498A (ja) | 1995-12-12 | 1996-09-05 | マラセチア由来の抗原性蛋白質 |
Publications (1)
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|---|---|
| JPH09221498A true JPH09221498A (ja) | 1997-08-26 |
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Family Applications (1)
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Country Status (1)
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|---|---|
| JP (1) | JPH09221498A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002332296A (ja) * | 2001-05-11 | 2002-11-22 | National Federation Of Dairy Cooperative Associations | タンパク質の濃縮方法 |
-
1996
- 1996-09-05 JP JP8257612A patent/JPH09221498A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002332296A (ja) * | 2001-05-11 | 2002-11-22 | National Federation Of Dairy Cooperative Associations | タンパク質の濃縮方法 |
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