NO319856B1 - Vaksine for a lindre symptomene ved, eller forhindre inntreden av,IgE-formidlede,allergiske reaksjoner hos et pattedyr,samt anvendelse av aminosyresekvensen fra de konstante CH2-CH3-domener i epsilonkjeden for fremstilling av en vaksine mot IgE-formidlede allergiske reaksjoner. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår vaksine for å lindre symptomene ved, eller forhindre inntreden av, IgE-formidlede, allergiske reaksjoner hos et pattedyr,samt anvendelse av aminosyresekvensen fra de konstante CH2-CH3-domener i epsilon-kjeden for fremstilling av en vaksine mot IgE-formidlede allergiske reaksjoner. Selv om foreliggende oppfinnelse generelt angår en vaksine til anvendelse på et pattedyr, angår en foretrukket utførelsesform derav en vaksine til anvendelse på mennesker, og derfor vil foreliggende oppfinnelse i det etter-følgende beskrives generelt med referanse til en slik vaksine til anvendelse på mennesker.

Bakgrunn for oppfinnelsen

IgE (immunglobulin E) er, til tross for dets vanligvis meget lave konsentrasjon i humant plasma {10-400 ng/ml)( en hovedårsak til hypersensitiviteter funnet innen den humane befolkning. Denne egenskap skyldes dets interaksjon med høy-affinitetsreseptoren for IgE på mastceller og basofile leukocytter.

Tverrbinding av to IgE-reseptorer på overflaten av disse celletyper, ved allergenbinding, initierer frigivelsen av et antall fysiologisk aktive stoffer, slik som histamin, PAF (blodplateaktiverende faktor), heparin, kjemotaktiske fak-torer for eosinofile og nøytrofile granulocytter, leukotri-ener, prostaglandiner og tromboksaner. Det er disse formidlere som forårsaker de direkte symptomer for IgE-formidlede, allergiske reaksjoner (type I hypersensitivitet). Sykdomstilstander som tilhører denne gruppe, inkluderer de fleste typer av astma, pelsallergier, pollenallergier, mange typer mataller-gier og visse typer eksem.

Høyaffinitetsreseptoren for IgE er blitt karakterisert på både protein- og gennivå i mus, rotte og menneske (Kinet et al., 1987; Shimizu et al., 1988; Tepler et al., 1989; Blank et al., 1989; Kinet et al., 1989). Denne reseptor er antagelig til stede kun på mastceller og basofile leukocytter i menneskekroppen. Reseptoren er et kompleks av tre forskjellige subenheter, de såkalte a-, J3- og y-kjeder. Det er a-kjeden, hovedsakelig lokalisert ekstracellulært, som reagerer med IgE-molekylet.

Detaljerte undersøkelser angående området av epsilon-kjeden av IgE-molekylet som reagerer med høyaffinitetsresep-toren for IgE, har vist at et område på 76 aminosyrer ved grensen mellom CH2- og CH3-domenene (CH = konstante domener i den tunge kjede) er av avgjørende betydning for reaksjonen mellom IgE-molekylet og dets høyaffinitetsreseptor.

Dette peptid er in vitro vist å være i stand til å inhibere reaksjonen mellom nativt IgE og dets høyaffinitets-reseptor i et molart forhold på nesten 1:1 sammenlignet med det totale CH2-CH3-CH4-område (Helm et al., 1988). Peptidet er også vist å være i stand til å inhibere en IgE-formidlet opp-blussingsreaksjon i allergenstimulering. I dette tilfellet er imidlertid konsentrasjonen ca. 10 ganger høyere enn konsentrasjonen som tilveiebringer den samme inhiberende effekt med nativt IgE (Helm et al., 1989).

Når IgE-molekylet bindes til sin reseptor, vil visse områder av epsilon-kjeden blokkeres med hensyn til interaksjon med andre molekyler, slik som f.eks. antistoffer rettet mot epitoper innen det samme område av IgE-molekylet. IgE-antistoffet kan da kun bindes til enten et IgE-antistoff mot CH2-CH3-området av IgE-molekylet, eller til reseptoren, og således aldri til begge disse molekyler samtidig. Antistoffer som bindes til epitoper utenfor området som direkte reagerer med reseptoren, vil i motsetning til de ovennevnte, forårsake tverrbinding av IgE-molekylene som er bundet til overflaten av en mastcelle. I dette tilfellet vil det forekomme en meget sterk frigivelse av granuler og et anafylaktisk sjokk hos sub-jektet hvori et slikt antistoff injiseres. Antistoffene som binder seg til reseptorbindingsdelen, vil, i motsetning til dette, ikke være i stand til å tverrbinde disse reseptorer, og det oppstår ingen umiddelbar reaksjon, men en effekt av den mer forlengede reduksjon av konsentrasjonen av fritt sirkulerende IgE. Dette vil formodentlig forhindre frigivelse av granuler ved at IgE-antistoffer ikke lenger er til stede i subjektets plasma.

Disse anti-IgE-antistoffer vil formodentlig også mer varig slå ut den IgE-produserende B-cellepopulasjon, hvilket øker muligheten for å oppnå en mer langvarig undertrykkelse av IgE-syntesen. Under perioder med kraftige pollenangrep vil da antistoffene binde og fullstendig eliminere forrådet av IgE som er årsaken til den sterke inflammatoriske reaksjon hos pollenallergiske subjekter. Et antall observasjoner indikerer at ikke-allergiske subjekter har en forholdsvis høy konsentrasjon av endogene anti-IgE-antistoffer, hvilket antas å ha en lignende allergiinhiberende effekt.

Virkningen av vaksinen ifølge foreliggende oppfinnelse er basert på dens evne til å indusere en immunrespons mot kroppens,eget IgE, hvilket av denne grunn vil forhindre bindingen av IgE-antistoffene til disse reseptorer. Av denne årsak vil frigivelsen av de allergiinduserende stoffer lagret i mastcellene, forhindres.

Foreliggende oppfinnelse omfatter vaksine for å lindre symptomene ved, eller forhindre inntreden av, IgE-formidlede, allergiske reaksjoner hos et pattedyr, kjennetegnet ved at den omfatter et immunogent konjugat, omfattende et heterologt bærerprotein til hvilket det er koblet et protein som har (a) hele aminosyresekvensen for de konstante CH2-CH3-domener i epsilonkjeden av IgE-molekylet fra den aktuelle pattedyrart, eller (b) en strukturelt stabil enhet av denne aminosyresekvens inneholdende mer enn 12 aminosyrer, hvori nevnte hele aminosyresekvens eller nevnte strukturelt stabile enhet derav er i sin opprinnelige eller i en lett mutert eller multimerisert form, videre kjennetegnet ved at når pattedyret injiseres med det immunogene konjugat, produserer det polyklonale antistoffer som har evnen til å binde til sirkulerende, nativt IgE og hvori slike polyklonale antistoffer er rettet mot og har evnen til samtidig å binde til ulike epitoper innen CH2-CH3-området av et IgE-antistoff, og er også kjennetegnet ved at vaksinen eventuelt kan inneholde et adjuvans. Også omfattet av oppfinnelsen er anvendelse av hele aminosyresekvensen for de konstante CH2-CH3-domener i epsilonkjeden i IgE-molekylet fra en pattedyrart, eller en strukturelt stabil enhet av denne aminosyresekvens inneholdende mer enn 12 aminosyrer, i dens opprinnelige eller i en lett mutert eller multimerisert form, for fremstilling av en vaksine mot IgE-formidlede, allergiske reaksjoner i de aktuelle pattedyrarter, hvori administreringen av vaksinen til pattedyret muliggjør at pattedyret etter å ha mottatt nevnte immunogene konjugat ved injeksjon, produserer polyklonale antistoffer som har evne til å binde til sirkulerende, nativt IgE, hvor i slike polyklonale antistoffer er rettet mot og har evnen til å binde samtidig til ulike epitoper innen CH2-CH3-området av et IgE-antistoff.

Kjent teknikk

A. Reseptorbindingspeptider og andre reseptorantagonister

I dag arbeider flere forskningsgrupper over hele verden med å fremstille korte peptider eller andre molekyler med evnen til å bindes til IgE-reseptoren og derved forhindre binding av antigen-spesifikt IgE. Disse stoffer forventes da å være i stand til å anvendes som legemidler ved behandling av allergier.

Problemet i dette tilfelle er den store vanskelighet med å erholde et molekyl som har en bindingsstyrke til reseptoren som tilsvarer den meget sterke interaksjon mellom det native IgE-molekyl og dets reseptor. For å erholde et effek-tivt preparat må det formodentlig arbeides med stoffer som bindes irreversibelt til reseptoren. Slike stoffer er imidlertid forholdsvis toksiske fordi de kan bindes kovalent og blokkere andre strukturelt lignende molekyler i kroppen. Av interesse i denne sammenheng er at IgE-reseptorens a-kjede tilhører en større genfamilie hvor blant annet flere av de forskjellige IgG Fc-reseptorer er inneholdt. Disse reseptorer er absolutt nødvendige for kroppens forsvar mot blant annet bakterieinfek-sjoner. Molekyler aktiverte for kovalent binding, er dessuten ofte forholdsvis ustabile, og derfor må de formodentlig administreres flere ganger pr. dag og da i forholdsvis høye konsentrasjoner for å gjøre det mulig å fullstendig blokkere det kontinuerlig fornyende forråd av IgE-reseptorer på mastceller og basofile leukocytter.

B. Anti- IgE- monoklonale antistoffer for behandling av allergi

Et bioteknologifirma i USA arbeider etter en modell som involverer produksjon av monoklonale antistoffer i mus

rettet mot IgE-reseptorbindingsområdet av det humane IgE-molekyl. Disse antistoffer blir deretter "humanisert" ved hjelp av genteknikk ved at de konstante områder av det muse-monoklonale antistoff erstattes med de tilsvarende humane områder. Disse

antistoffer må deretter fremstilles i ren form i stor skala for å kunne anvendes til injeksjon. Humaniseringen utføres for å redusere kroppens immunreaksjon mot disse antistoffer, noe som ellers, etter den andre eller tredje injeksjon, vil forårsake en massiv dannelse av immunkompleks som kan føre til direkte livstruende komplikasjoner.

For behandling av pollenallergiske personer vil det antakeligvis være nødvendig å injisere disse antistoffer én eller flere ganger pr. uke under perioder med høye pollenkon-sentrasjoner. Problemet med injeksjon av monoklonale antistoffer er at de, selv om de er "humanisert", vil inneholde høye konsentrasjoner av nye epitoper som kroppen aldri tidligere er blitt utsatt for, og antagelig vil høye antistofftitere mot disse monoklonale antistoffer forekomme forholdsvis hurtig. Dette vil formodentlig, på samme måte som for muse-monoklonale antistoffer, frembringe livstruende komplikasjoner ved immun-kompleksdannelse, fordi de monoklonale antistoffer fremdeles inneholder "rammeverk"-områdene fra muse-V-området. For å unngå disse komplikasjoner vil det antakeligvis være nødvendig å anvende et meget stort utvalg av humaniserte antistoffer som vellykket kan alterneres under behandlingsforløpet. Selv om de administreres meget nøyaktig, vil de imidlertid hele tiden følges av risikoen for når og i hvilken grad immunkomplekser vil dannes.

C. Peptidvaksiner ( CH4- e)

En forskningsgruppe ledet av dr. Stanworth, har ar-beidet etter en strategi som inkluderer anvendelsen av et humant peptid koblet til et heterologt bærerprotein for immunisering i kanin eller rotte. I eksperimentene beskrevet av dr. Stanworth, er det anvendt heterologt antiserum fra kanin for å behandle rotter. De har ikke vært i stand til å påvise noen immunrespons ved hjelp av ELISA i kaninene hvori anti-genet er injisert, noe som viser at immunresponsen, selv med et ikke-artsspesifikt peptid, er så svak at den ikke kan påvises med noen av de mest sensitive metoder som er kjent i dag (Stanworth et al., 1990). Forskningsgruppen anvender korte peptider fra et område som klart ligger utenfor reseptorbindingsdelen (CH2-CH3) av IgE-molekylet, hvilket derved er klart forskjellig fra foreliggende oppfinnelsesidé som vil beskrives i detalj nedenfor. En generell ufordelaktighet ved anvendelse av korte peptider er at de nesten fullstendig mangler evnen til å danne en stabil sekundærstruktur, hvilket antakeligvis også er en av årsakene til den meget svake immunrespons i modellsystemet til dr. Stanworth.

EP 0403312 omfatter fremstilling av kanin- og museantistoffer mot human IgE ved anvendelse av et kort peptid fra det humane CH4-domenet på IgE.

Burt et al. { Mol. Immunol. 24:379-389, 1987) beskriver fremstilling av kaninantistoffer mot rotte-IgE ved anvendelse av et kort peptid fra rotte-CH3-domenet på IgE.

EP 0303625 og Gold et al. (Int. Archs. Allergy Appl. Immun. 82:392-393, 1987) omfatter anvendelse av 76 aminosyrer fra CH2-CH3-domenene av IgE for å konkurrere med nativt IgE for binding til IgE-reseptorseter.

WO 9804834 omfatter anvendelse av et aminosyrepoly-peptid og 208 aminosyrer fra CH3-CH4-området av IgE for å konkurrerere med nativt IgE med hensyn til binding til lavaffinitets-IgE-reseptorseter på mastceller og basofiler.

EP 0396505 beskriver fremstilling av (a) rotteantistoffer mot muse-IgE, og (b) museantistoffer mot human IgE. Dette mothold omfatter også anvendelse av antistoffene som blokkerer binding av IgE til FC-reseptorer.

Foreliggende oppfinnelse avviker fra omfanget av de ovennevnte publikasjoner ved at de blant annet tilveiebringer en vaksine som fører til produksjon av polyklonale antistoffer mot nativ IgE i et pattedyr. I tillegg fører de tilveiebrakte vaksiner til en anti-selv-IgE-respons som kan forebygge eller lindre allergiske reaksjoner.

Mål for foreliggende oppfinnelse

Målet for foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en vaksine utformet for å lindre symptomene eller induksjonen av IgE-formidlede, allergiske reaksjoner i et pattedyr, inklu-dert menneske, hvilken vaksine induserer en immunrespons mot kroppens eget IgE og vil derved forhindre bindingen av IgE-antistof f er til IgE-reseptorene, hvorved frigivelsen av de allergiinduserende stoffer lagret i mastcellene, vil forhindres .

Sammendrag av oppfinnelsen

Det ovenfor angitte mål oppnås ifølge foreliggende oppfinnelse ved hjelp av en vaksine som er kjennetegnet ved at den inneholder protein som inkluderer hele aminosyresekvensen for de konstante CH2-CH3-domener av epsilon-kjeden av IgE-molekylet fra de aktuelle pattedyrarter, eller en strukturelt stabil enhet av denne aminosyresekvens inneholdende mer enn 12 aminosyrer, i dens opprinnelige form eller i en mutert eller multimerisert form, hvor proteinet eventuelt er koblet til ett eller flere heterologe bærerproteiner, og eventuelt inneholdende et adjuvans.

Foreliggende oppfinnelse angår også en fremgangsmåte for fremstilling av vaksinen og anvendelse av hele aminosyresekvensen for de konstante CH2-CH3-domener av epsilon-kjeden av IgE-molekylet fra en pattedyrart, eller en strukturelt stabil enhet av aminosyresekvensen inneholdende mer enn 12 aminosyrer, i dens opprinnelige eller i en mutert eller multimerisert form, for fremstilling av en vaksine mot IgE-formidlede, allergiske reaksjoner i den aktuelle pattedyrart.

Kort beskrivelse av figurene

De tilhørende figurer viser følgende:

Figur la og lb viser antistoffresponsen (mengden av anti-IgE-antistoffer) i et panel av fire forskjellige rottestammer, ved hjelp av ELISA-måling av antistofftitere mot nativt rotte-IgE og mot humant IgE (som kontroll). Figur 2 viser undertrykkelsen av en IgE-formidlet, inflammatorisk reaksjon i en vaksinert rotte sammenlignet med en blindprøve-immunisert rotte ved injeksjon av polyklonalt ant i-IgE-ant i serum.

Beskrivelse av foreliggende oppfinnelse

Angivelsen at aminosyresekvensen (hele sekvensen eller deler derav) av de konstante CH2-CH3-domener er til stede i "mutert" form, betyr at aminosyrene i sekvensen kan være mutert ved henholdsvis direkte utskiftning eller ved deler inger og innføyeIser. En "ubetydelig" mutert form betyr da at hoveddelen av aminosyresekvensen fremdeles er sekvensen av proteinet i dets opprinnelige form, og at virkningen således er nesten den samme eller muligens noe redusert i forhold til den opprinnelige sekvens; proteinet med den "ubetydelig" mut-erte aminosyresekvens blir således fremdeles tolerert av kroppen og må derfor, i likhet med sin opprinnelige form, bli koblet, i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, til et heterologt bærerprotein for å virke som et antigen.

Med "kraftig" mutert form er det ment at utskiftnin-gen, deleringen og/eller innføyelsen av aminosyrer involverer et slikt inngrep i den opprinnelige aminosyresekvens at den virker som et antigen i seg selv fordi nye T-celle-epitoper dannes ved den utførte mutasjon mot hvilken kroppen ikke er tolerant; i dette tilfelle er det ikke nødvendig å koble proteinet til et heterologt bærerprotein.

Ved "multimerisert" form er det ment at aminosyresekvensen (hele sekvensen eller en del derav) av proteinet er polymerisert til en form inneholdende to eller flere gjen-takende enheter derav; ved denne prosedyre kan nye T-celle-epitoper dannes ved grensen mellom de atskilte enheter og muliggjør også at denne multimeriserte form av proteinet kan virke som et antigen i seg selv, hvorved enhver kobling til et heterologt bærerprotein ikke er nødvendig.

Den foretrukne utføreIsesform av foreliggende oppfinnelse er anvendelse av et protein hvor aminosyresekvensen (hele sekvensen eller en del derav) for de konstante CH2-CH3-domener av epsilon-kjeden av IgE-molekylet foreligger i sin opprinnelige form, idet proteinet er koblet til ett eller flere heterologe bærerproteiner, og derfor vil foreliggende oppfinnelse bli beskrevet i detalj i det etterfølgende med referanse til denne spesielle utførelsesform.

Foreliggende oppfinnelse er basert på et fullstendig nytt konsept for å løse problemene forbundet med kjente metoder for immunisering mot IgE-formidlede, allergiske reaksjoner, ved at vaksinen ifølge foreliggende oppfinnelse har evnen til å indusere en immunrespons mot kroppens eget IgE.

Ved å utløse at kroppen selv produserer en polyklonal anti-IgE-respons, erholdes antistoffer som er fullstendig artsspesifikke og derfor mye mindre immunogene. Disse antistoffer vil deretter binde det frie forråd av IgE som sirkulerer i kroppen og derved forhindre bindingen til IgE-reseptoren. Det faktum at immunresponsen er polyklonal og derved at antallet molekyler av den samme idiotype er meget lavt, vil forårsake den nesten fullstendige eliminering av problemet med en anti-idiotype-respons.

Det faktum at fremgangsmåten beskrevet heri ikke er forsøkt i teknikken, er antakeligvis forbundet med problemet med hvordan en sterk IgG-respons mot kroppens eget IgE kan oppnås, fordi dette er et molekyl som kroppen har vært tolerant overfor siden fødselen og således ikke reagerer mot immunologisk. For å løse dette problem anvendes det ifølge foreliggende oppfinnelse en egenskap for immunsystemet som nesten ikke er kjent, men som på en enestående måte kan løse problemene som med stor sannsynlighet vil påvirke de monoklonale prosjekter. Ved å koble CH2-CH3-området (proteinet) til et ikke-artsspesifikt protein omgås toleransen av immunsystemet overfor kroppens eget IgE. Dette fører til tilgang av en ikke-tolererende T-cellepopulasjon som vanligvis kun ville ha frembrakt en antistoffrespons mot det fremmede molekyl utvalgt som bærer, men som også vil hjelpe B-celler til å prod-usere antistoffer mot artsspesifikt molekyl. Denne effekt oppnås ved å koble CH2-CH3-området direkte til bærerproteinet.

Konsekvensene av dette fenomen er blitt nesten fullstendig ignorert i det immunologiske forskningsmiljøet, noe som kan forklare hvorfor ingen andre forskningsgrupper i verden har forsøkt en lignende fremgangsmåte. Da meget få eller ingen lignende undersøkelser er utført, har foreliggende oppfinner analysert i detalj muligheten til å anvende dette fenomen. I de utførte undersøkelser med kobling av peptider er det blitt anvendt humane peptider til injeksjon i kanin, mus eller rotte, og ikke peptider fra den samme dyreart, og årsaken til dette er den dominerende oppfatning at det ikke kan produseres en sterk immunrespons mot artsspesifikke molekyler.

For å bekrefte at det ifølge foreliggende oppfinnelse kan oppnås en sterk immunrespons mot et artsspesifikt IgE, er det utført eksperimenter hvor et panel av rottestammer er immunisert med et fusjonsprotein inneholdende et bærermolekyl koblet til de fullstendige CH2-CH3-domener av IgE hos rotte

(eksempel 2). I disse rotter er det oppnådd (etter kun 4 uker) en sterk antistoffrespons mot nativt rotte-IgE, dvs. i form av IgE som sirkulerer i rotteplasmaet. Denne antistoffrespons har en styrke som kun er ubetydelig lavere ann nivået (av antistoff respons) som ved ELISA-målinger erholdes mot et fullstendig ikke-artsspesifikt protein, i dette tilfelle humant IgG (figur 1).

Årsaken til at foreliggende oppfinner, i motsetning til dr. Stanworth, oppnår en slik sterk immunrespons, er formodentlig fordi det ved foreliggende oppfinnelse anvendes større områder enn peptider med en lengde på kun 10 aminosyrer, dvs. i dette tilfelle opp til de fullstendige CH2-CH3-domener. Dette er årsaken til at det erholdes et mye større antall epitoper, mot hvilke antistoffer kan dannes, og videre at disse epitoper foreligger i den samme konformasjon som i det native IgE-molekyl.

Ved "heterologt bærerprotein" er det heri ment ethvert ikke-artsspesifikt protein som helst ikke utviser for høy homologi med det tilsvarende protein i den art hvori proteinet skal anvendes som bærer. Proteiner som vanligvis ikke eksisterer i våre omgivelser, bør imidlertid unngås, fordi en meget sterk immunreaksjon kan forårsake problemer dersom mennesker ofte utsettes for dette protein.

Ved å koble små peptider til et heterologt bærerprotein, oppnås vanligvis kun en forholdsvis svak immunrespons mot et meget begrenset område av molekylet. Peptider frem-kaller dessuten i meget høy grad en immunrespons som kun reagerer mot peptidet og ikke mot det tilsvarende område i det native protein.

Det er viktig å oppnå en meget sterk immunrespons som dessuten gjenkjenner nativt IgE, fordi bindingskonstanten for interaksjonen mellom IgE-molekylet og høyaffinitetsreseptoren er meget høy og innenfor området 1 x 10"B til 2,6 x IO'<10> eller høyere (Froese, 1980). Ved oppnåelse etter immunisering av en polyklonal respons vil flere forskjellige antistoffer mot forskjellige epitoper innen CH2-CH3-området være i stand til samtidig å bindes til det samme IgE-antistoff. Dette gir oppnåelse av en meget høy kombinert bindingsstyrke for fritt IgE. Derved vil anti-IgE-antistoffene i vesentlig lettere grad, sammenlignet med tilfellet med et monoklonalt antistoff eller antistoffer dannet mot korte peptider, være i stand til å konkurrere om fritt IgE i den immuniserte person. Dette har stor betydning fordi interaksjonen mellom IgE og høyaffinitetsres-eptoren er meget sterk. Den oppfinneriske idé ved anvendelse av fullstendige domener eller strukturelt stabile deler derav, gir derfor en meget stor fordel og et fullstendig nytt konsept sammenlignet med de tidligere beskrevne peptidfremgangsmåter.

Antistoffresponsen mot peptider har ofte liten eller ingen affinitet for det tilsvarende aminosyreområdet i det native protein, hvilket betyr at den erholdte antistoffrespons mot fullstendige domener eller strukturelt stabile enheter av domener, medfører en avgjørende forskjell sammenlignet med tidligere fremgangsmåter i teknikken.

Ved kun å anvende CH2-CH3-området (og ikke som tidligere beskrevet, heterologe CH4-peptider) av IgE-molekylet, vil kroppen etter immunisering nesten utelukkende danne antistoffer mot det område av IgE-molekylet som reagerer med IgE-reseptoren. I teorien foreligger det en risiko for at antistoffer mot den N-terminale del av CH2-domenet, eller den C-terminale del av CH3-domenet, kan forårsake et anafylaktisk sjokk hos pattedyrene hvori disse antistoffer dannes. Det variable område av antistoffet tilsvarer imidlertid størrelsen av et fullstendig domene, og i de fleste tilfeller vil det derfor oppnås sterisk hindring av reseptorbinding selv med slike antistoffer. I tillegg vil antistoffene mot et stort antall epitoper produseres kontinuerlig under oppbygning av immunresponsen, og derfor er antakeligvis sannsynligheten for at kun ett av disse meget få antistoffer alene skal binde et IgE-molekyl, meget lav. Flere dyretester har imidlertid vist at slike effekter av immuniseringen ikke kan påvises {se eksempel 2 nedenfor). Rottene med høye innhold av anti-CH2-CH3-antistoffer i blodet viser ingen tendens på symptomer på noe anafylaktisk sjokk. Fra et helsesynspunkt kan de ikke skjelnes fra dyr som kun er immunisert med adjuvans (uten antigen) eller fra dyr som er immunisert med humant IgG. Dette indikerer at i testdyr foreligger det ingen påviselige negative effekter av denne immunisering selv om dyrene har meget høye anti-IgE-titere. Det er derved den første gang at det er vist at det kan erholdes høye anti-IgE-titere mot artsspesifikt IgE. Disse rotter viser dessuten ingen påviselige negative effekter av denne behandling, noe som indikerer at behand-lingsprosedyren også med høy sannsynlighet kan anvendes uten komplikasjoner til behandling av mennesker. Disse data indikerer dessuten sterkt at det IgE-reseptorbundne IgE-forråd i disse rotter i realiteten ikke eksisterer. En sterk anafylaktisk reaksjon av anti-IgE-antistoffene som er i stand til å bindes til de tidligere nevnte ytre områder av CH2- og CH3-domenene, skulle ellers bli indusert selv om antistofftiteren er forholdsvis lav for slike antistoffer. Dette skyldes at mastcellene er meget sensitive selv overfor meget lave konsentrasjoner av tverrbindende antistoffer. I innledende under-søkelser er det vist at, ved immunisering, dyrene hvori høye anti-IgE-titere forekommer, har en meget sterkt redusert tendens til å frigi sine mastcellegranuler etter utfordring med anti-IgE-antistoffer (eksempel 3, figur 2). Foreliggende oppfinner utfører for tiden en større undersøkelse som innbefat-ter behandling av rotter som er gjort sterkt allergiske mot hønseovalbumin. Resultatene fra testene på rotter utført så langt, er meget lovende fra flere synspunkter fordi de viser at det erholdes en sterk immunrespons som ikke har noen påviselige negative effekter, og endelig at det oppnås en sterkt redusert frigivelse av granuler ved tilførsel av en polyklonal aktivator i disse rotter.

En vaksine av denne type kan møte visse vanskelig-heter. Én faktor som sterkt påvirker mulighetene, er konsentrasjonen av den forbindelse som ønskes fjernet fra kroppen. Høye konsentrasjoner betyr i dette tilfellet større vanskelig-heter. Dersom i denne sammenheng enhver av de andre immunglo-bulinisotyper ble utvalgt, ville problemet bli enda større på grunn av de generelt mye høyere plasmakonsentrasjoner av disse antistoffer.

I denne sammenheng, på grunn av dets lave plasma-nivåer, er IgE ideelt. Plasmanivåene i en normal populasjon av ikke-allergiske personer er fra 10 til 400 ng/ml. Denne mengde tilsvarer mindre enn 0,01% av den totale immunglobulinmengde i vårt blod. Disse nivåer er ofte noe forhøyet i allergiske personer, men overstiger meget sjelden 5 ug/ml. Som en sammenlig-ning kan det heri nevnes noen tester utført på mus hvor, ved anvendelse av antistoffer mot en av immunglobulinenes lette kjeder, det er blitt erholdt dyr som nesten fullstendig mangler denne type immunglobuliner. I disse tester, ved injeksjon av monoklonale antistoffer mot k-kjeden av muse-immunglobu-linet, tilsvarende ca. 95% av den totale immunglobulinmengde i mus, er det oppnådd et nesten fullstendig tap av disse antistoffer i musenes blod (Weiss et al., 1984). De resterende antistoffer funnet i mus, er nesten 100% av lg A-typen (den originale konsentrasjon av lg A er kun ca. 5%). Dette viser at, selv med betydelig høyere konsentrasjoner av forbindelsen som skal fjernes fra kroppen, foreligger det en mulighet til å fjerne dette materiale fra sirkulasjonen nesten fullstendig.

En annen mulig komplikasjon er at ingenting er kjent om langtidsvirkningene ved å indusere en sterk autoimmunitet. En fordel er imidlertid at i dette tilfellet anvendes T-celler mot ikke-artsspesifikke molekyler for å danne en immunrespons mot et artsspesifikt antigen. Dersom vaksinasjonsprogrammet avsluttes, vil antistoffresponsen mot kroppens eget IgE lang-somt reduseres til ikke-påviselige nivåer etter noen måneder. Dette forekommer dersom man ikke forsterker med CH2-CH3 koblet til det samme bærermolekyl som anvendes ved den innledende vaksinasjon. Dette fenomen er vist ved mange detaljerte under-søkelser av mus hvor det er vist at den sekundære immunrespons mot haptener, koblet til forskjellige bærere, er fullstendig avhengig av det opprinnelig utvalgte bærermolekyl. Dersom noe subjekt av en usannsynlig uforutsigbar årsak reagerer negativt på denne immunisering, kan immuniseringen avsluttes, og antistofftiterne vil formodentlig nå upåviselige nivåer innen noen få måneder. Dette er lignende det som ville være tilfellet ved injeksjon av monoklonale antistoffer mot kroppens eget IgE.

Det koblede protein anvendt som den viktigste be-standdel av anti-allergivaksinen, kan fra et teknisk stand-punkt fremstilles på to forskjellige måter. Én måte innbe-fatter produksjonen av et allerede koblet protein, et såkalt fusjonsprotein, i prokaryotiske eller eukaryotiske vertsceller. Som prokaryotiske vertsceller anvendes vanligvis bak-terien Escherichia coli, mens et stort antall forskjellige systemer, slik som gjærceller eller cellelinjer, kan anvendes som eukaryotiske vertsceller. Cellelinjene kan stamme fra insekter til mennesker. Menneskeceller blir imidlertid vanligvis unngått for klinisk anvendelse fordi det bestandig foreligger en risiko for forurensning av humant virus i cellekul-turene. Den andre teknikk er basert på en direkte kjemisk kobling av bærerproteinet og den aktive artsspesifikke komponent, i dette tilfelle hele, eller deler av, CH2-CH3-området av IgE-molekylet. Ved denne teknikk produseres proteinene hver for seg. Denne teknikk er den eneste som vanligvis anvendes ved immuniseringer med syntetiske peptider, så vel som ved immunisering med små haptener (av forbindelser som ikke er proteiner) , og er basert på kjemisk aktivering av bærerproteinet med f.eks. CNBr, etterfulgt av blanding av den aktiverte bærer med peptidet eller proteinfragmentet som man ønsker å koble sammen. Disse to kobles deretter kovalent til hverandre.

Immuniseringen utføres ved å blande oppløselig eller aggregert proteinvaksine med et immunresponspotensierende materiale (adjuvans), hvilket deretter injiseres subkutant, intraperitonealt eller intramuskulært. De hittil undersøkte rotter er blitt injisert med vaksinen subkutant eller intraperitonealt. I disse tester er det anvendt mengder på ca.

100 ug antigen pr. rotte og immuniseringstilfelle, og med disse konsentrasjoner er det oppnådd meget sterke immunres-

ponser i et panel av forskjellige rottestammer (figur 1). For mennesker vil det først og fremst anvendes forholdsvis svake, ikke-toksiske adjuvanser, slik som alun, eller som et alter-nativ, injeksjoner av større mengder aggregert fusjonsprotein uten tilsetning av adjuvans. Det aggregerte fusjonsprotein er ment å øke proteinets immunogenitet.

For mennesker vil det videre antakeligvis anvendes betydelig større mengder antigen, muligens i størrelsesorden 100-500 mg rent protein. Fra et teknisk synspunkt involverer dette ikke noen større problemer fordi det er mulig å erholde meget store mengder av dette fusjonsprotein i en meget ren

form og til en pris som ikke er for avskrekkende. I den nåvær-.v

ende situasjon foreligger det et stort antall fusjonsprotein-varianter produsert i liten skala for den humane vaksine så vel som for rottevaksinen. Imidlertid venter analysen av den humane vaksine på resultatene fra den meget store undersøkelse som for tiden utføres på forskjellige rottestammer.

Gjentatte injeksjoner utføres først med ca. 3 ukers mellomrom for å oppnå en sterk immunrespons. Deretter vil det antakeligvis være nødvendig å utføre immuniseringene kun noen få uker før hver pollenperiode på et pollenallergisk subjekt, for å aktivere den ovennevnte immunrespons og sterkt forsterke denne respons før den nye høyrisikoperiode.

Ved anvendelse av et antall heterologe bærermolekyler til hvilke artsspesifikke proteiner eller proteinfragmenter er koblet, vil det prosentvise antall T-celler øke. Disse vil gi hjelp til B-celler som produserer antistoffer mot, som i dette tilfellet, CH2-CH3-området av det humane IgE-molekyl. Ved denne foredling av immuniseringsprotokollen er det forventet at de mengder antigen som må anvendes til immuniseringen, kan reduseres under bibeholdelse av immuniseringseffekten. Dette vil ikke ha umiddelbar interesse før kliniske tester utføres på mennesker, hvor sterke adjuvanser ikke kan anvendes og derfor alle tilgjengelige metoder må benyttes for å øke vaksinens immunogenitet.

Som nevnt ovenfor, er målet for foreliggende oppfinnelse primært å fremstille en vaksine for anvendelse på mennesker. Innen rammen for foreliggende oppfinnelse faller imidlertid også vaksiner for andre pattedyrarter det er økonomisk viktig å vaksinere mot IgE-formidlede, allergiske reaksjoner. Eksempler på slike arter er hunder, hester og griser.

Foreliggende oppfinnelse vil bli nærmere illustrert i det etterfølgende ved hjelp av de spesifikke utførelseseks-empler.

Eksempel 1

Fremstilling av et fusjonsproteinpreparat av IgE- epsilon-kjedens CH2- CH3- område fra menneske og rotte

I dette eksempel er det benyttet et system hvor det artsspesifikke protein og bærerproteinet produseres i bak-terier, i dette tilfellet Escherichia coli, i en koblet form. Ved hjelp av PCR-teknikk (polymerasekjedereaksjon) er cDNA-sekvensene for IgE-epsilon-kjedens CH2-CH3-områder fra både menneske og rotte klonet. Aminosyresekvensen kodet av det amplifiserte, humane cDNA var: NKTFSVCSRDFTPPTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDL STASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLS RPSPFDLFIRKSPTYTCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTL PVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPR, og aminosyresekvensen kodet av rotte-cDNA var: DLTIRARPVNITKPTVDLLHSSCDPNAFHSTIQLYCFVYGHIQNDVSIHWLMDDRKIYETHAQ NVLIKEEGKLASTYSRLNITQQQWMSESTFTCKVTSQGENYWAHTRRCSDDEPRGVITYLIPP SPLDLYENGTPKLTCLVLDLESEENITVTWVRERKKSIGSASQRSTKHHNATTSITSILPVDA KDWIEGEGYQCRVDHPHFPKPIVRSITKAPGKR. PCR-produktene ble ligert i en kommersielt tilgjengelig vektor for produksjon av et fusjonsprotein i bakterielle verter. Den anvendte vektor er et medlem av de såkalte pGEX-vektorer av form 1, 2 eller 3 med forskjellige avlesningsrammer for ligering av cDNA-fragmenter (Smith og Johnson, 1988). Denne type vektorer er i dette tilfelle vist å gi høye utbytter av rent fusjonsprotein for direkte immunisering. I denne vektorfamilie er hele kodingsområdet for en 26 kD glutation-S-transferase (Sj26) fra den parasittiske mark Schistosoma japonicum klonet inn etter en sterk og induserbar, bakteriell promotor. Denne promotor, en såkalt tac-promotor, er negativt regulert av lac-repressoren. For å erholde store mengder protein oppheves inhibering av promotoren ved hjelp av IPTG (isopropyl-p-D-tiogalaktosid). Etter ligering av CH2-CH3-fragmentet i vektoren i den C-terminale ende av Sj26-genet transformeres denne vektor inn i en E, coli-stamme for produksjon av fusjonsproteinet. En overnattskultur av denne nye bakterie som inneholder vektoren hvori det ønskede fragment er ligert, for-tynnes i forholdet 1:10 i bakterievekstmedium og tillates å vokse i ytterligere 2 timer. IPTG tilsettes deretter til 100 uM, og kulturen inkuberes under kraftig omrøring i ytterligere 4 timer. Bakteriene innhøstes deretter ved sentrifuger-ing, og cellepelleten vaskes deretter tre ganger med PBS. Ettervvask suspenderes cellene i PBS + 1% "Triton X-100" og sonikeres i 5 x 15 sekunder for å nedbryte bakterienes celle-vegger og frigi proteinet fra cellene. Det er vist at for CH2-CH3-fusjonsproteinene fra både rotte og menneske utfelles proteinet intracellulært i form av krystaller og må derfor opp-løses ved hjelp av en løsning inneholdende 8 M urea. Det humane protein kan deretter dialyseres mot rent PBS og bli fullstendig oppløselig. Det pågår for tiden arbeide for å erholde en protokoll for rensing av det humane fusjonsprotein i stor skala til en renhet på nesten 100%. CH2-CH3-fusjonsproteinet fra rotte er imidlertid mer uoppløselig, og det meste av proteinet utfelles allerede etter dialyse i 1/2 til 1 time. I de etterfølgende eksempler er det benyttet et fusjonsproteinpreparat av CH2-CH3 fra rotte med en renhet på ca. 50%. Disse preparater er anvendt for å undersøke muligheten for å erholde en sterk antistoffrespons mot rottens eget IgE og undersøke mulighetene for å blokkere en sterk IgE-formidlet infiammatorisk reaksjon i rotte. De resterende 50% av proteinet i preparatet består av forskjellige kontaminerende bak-terieproteiner, hvorved et enkelt protein ikke utgjør mer enn 10% av det totale protein.

Eksempel 2

Immunisering av rotte - måling av immunrespons

Immunisering eller vaksinering utføres ved hjelp av fusjonsproteinpreparatet fra eksempel 1 i blanding med et immunresponsøkende materiale (adjuvans) for å danne en vaksine. De undersøkte rotter er blitt injisert med vaksinen subkutant eller intraperitonealt med en blanding av oppløselig og aggregert protein. I disse tester er det benyttet mengder på ca. 100 ug antigen pr. rotte i henholdsvis 0,2 ml Freunds fullstendige og ufullstendige adjuvans pr. immuniseringstilfelle og rotte. Med disse konsentrasjoner og adjuvanser er det oppnådd meget sterke immunresponser i et panel av forskjellige rottestammer.

Figur la og b viser en test med fire forskjellige rottestammer og tre rotter pr. stamme. Antistofftiterne mot nativt IgE er målt ved hjelp av ELISA. Denne analyse er utført på en slik måte at nativt IgE i beleggingsbuffer (5 ug/ml) er anvendt for å belegge ELISA-platene. Suksessive fortynninger (1/5) av rotteserum fra de forskjellige testdyr er deretter testet med hensyn på fargereaksjon i ELISA. Absorpsjonsver-di ene ved 400 nm er avbildet på Y-aksene i figur 1, og de forskjellige 1/5-fortynninger, med økende fortynninger mot venstre i figuren, er avbildet på X-aksene.

De fire rottestammer {Lewis, Sprague Dawley, Wistar og Brown Norway) er i det venstre felt analysert med hensyn på deres evne til å reagere mot CH2-CH3-vaksinen, og i det høyre felt mot humant IgG (som kontroll). Den anvendte vaksine er rotte-CH2-CH3, hvilket i rotten fullstendig tilsvarer den humane vaksine. Disse rotter er kun vaksinert to ganger; først en vaksinasjon med Freunds fullstendige adjuvans og protein-oppløsning, og deretter en andre vaksinasjon tre uker senere med den samme proteinoppløsning i Freunds ufullstendige adjuvans. Én uke etter den andre vaksinasjon ble blodprøver tatt fra rottene. Innholdet av anti-IgE-antistoffer i blodet ble deretter bestemt ved hjelp av ELISA-analyse. Som det klart fremgår fra figuren, utviser tre av stammene god respons mot vaksinen, mens den fjerde stammen er en såkalt "non-responder", hvilket ikke er så uvanlig når det, som i dette tilfelle, anvendes innavlede stammer. Med dette menes at akkurat denne rottestammen ikke kan presentere sitt antigen for immunsystemet, og at det derfor ville være nødvendig å anvende et annet heterologt bærerprotein i denne rottestamme for å erholde den ønskede effekt av allergivaksinen.

Son» det fremgår fra disse innledende ELI SA-mål inger, erholdes en meget sterk immunrespons mot kun to domener av rottens IgE, hvilket må sammenlignes med den kun ubetydelig sterkere reaksjon som erholdes mot det humane IgG, hvilket dessuten har en størrelse som tilsvarer fire domener. Disse rotter som utviser meget høye anti-IgE-titere, viser overhodet ingen negative symptomer. I praksis kan de ikke med noen kri-terier skjelnes fra de rotter som kun er immunisert med rent PBS i Freunds adjuvans (kontrollene, merket "blank" i figur 1) •

Eksempel 3

Immunisering av rotte - undertrykkelse av en IgE- formidlet inflammasjonsreaksjon

Undersøkelser med det mål å vurdere evnen til vaksinen ifølge foreliggende oppfinnelse til å undertrykke en sterk IgE-formidlet inflammasjonsreaksjon, er også utført. Som et analysesystem er det benyttet det faktum at anti-IgE-antistoffer har en evne til å tverrbinde IgE-antistoffer bundet til mastceller i huden, og gjennom deres evne til å tverrbinde disse IgE-molekyler å indusere en kraftig granulfrigivelse og derved utløse en sterk inflammatorisk reaksjon på stedet hvor antistoffene er injisert (i dette tilfelle i huden). I dette tilfellet er det benyttet et polyklonalt anti-IgE-antiserum mot hele det konstante område av IgE. Dette serum bør derfor inneholde store mengder tverrbindende antistoffer, hvilket også bekreftes av resultatene. Styrke på inflammasjonen måles deretter ved hjelp av en fargereaksjon. Permeabiliteten og dermed lekkasjen av forskjellige blodproteiner fra blodet øker kraftig i. området hvor inflammasjonen er fremkalt. Jo kraf-tigere inflammasjonen er, desto større blåsone blir det erholdt dersom det injiseres en 1% Evans blå-oppløsning i blodet til testrottene to timer før avlesning av blåsonens størrelse under huden på testdyrene. Testen som vises skjematisk i figur 2, ble utført på en slik måte at fire injeksjoner, hver på 50 ul av en konsentrert oppløsning av et polyklonalt anti-IgE-antiserum, ble utført under huden på en vaksinert rotte og en blank-immunisert rotte to timer før huden ble fjernet og inflammasjonssonene målt. Som kontroll ble det utført injeksjoner av IgE + anti-IgE på ett punkt pr. rotte og kun PBS på ett punkt. To typiske eksempler på disse rotter er vist i figuren hvor én av rottene ble immunisert med CH2-CH3-vaksine i Freunds adjuvans, og den andre kontrollrotte ble immunisert med PBS i Freunds adjuvans. Sonene for IgE + anti-IgE-kontrollene har svært lignende størrelse for de to rotter, mens deri-mot sonene for injeksjoner med kun anti-IgE-antistoffer er redusert til nesten null for den vaksinerte rotte. Kun anti-IgE-antistoffer ga kraftige blåsoner for den blank-immuniserte rotte (som kontroll). Dette viser at den vaksinerte rotte formodentlig helt mangler IgE-antistoffer på overflaten av sine mastceller, hvilket fullstendig overensstemmer med det resul-tatet som kan forventes fra immuniseringene, hvor det i disse rotter er funnet høye konsentrasjoner av endogene anti-IgE-antistoffer. De mangler imidlertid ikke mastceller fordi det er mulig å erholde en normal blåsone ved å tilsette eksogent IgE sammen med anti-IgE-antistoffene og derved på nytt binde mastcellereseptorene på disse mastceller som opprinnelig formodentlig ikke inneholdt IgE.

For tiden utføres arbeide med meget lovende resultater i en ny rottemodell hvor det først dannes en meget kraftig IgE-respons i Wistar-rotter som viser god respons på rottevaksinen ifølge foreliggende oppfinnelse (se figur 1). Immunisering av rottene utføres med et spesifikt antigen som i dette tilfellet er ovalbumin sammen med toksinet Ricin, ifølge en nylig utviklet protokoll av dr. Kemeny (Diaz-Sanchez og Kemeny, 1991) . Etter et antall uker erholder disse rotter en meget kraftig IgE-respons mot ovalbumin, og denne immunrespons er dessuten forholdsvis langvarig. Innledende undersøkelser har gitt meget gode resultater med denne protokoll. Et antall rotter er analysert med hensyn på deres evne til å forårsake en kraftig inflammatorisk reaksjon i huden etter injeksjon av 50 ul av en oppløsning inneholdende 5 mg/ml ovalbumin. Dette har gitt blåsoner som nesten er dobbelt så store som de tidligere nevnte, positive kontroller med IgE + anti-IgE, hvilket viser at disse rotter er ekstremt allergiske mot ovalbumin. Denne type rotter anvendes i dag for å undersøke muligheten for å blokkere allergireaksjoner i huden og deretter å under-søke effektene på sammentrekninger av bronkier og andre typiske allergirelaterte symptomer.

Nedenfor følger i fire punkter et sammendrag av disse vesentlige forskjeller mellom foreliggende oppfinnelse og kjent teknikk. 1. Foreliggende oppfinnelse er kun rettet på de domener' av IgE-molekylet som er direkte involvert i interaksjonen med IgE-reseptoren, og ikke som i tidligere undersøkelser, på områder i det ikke-reseptorreagerende C4-område. 2. Vaksinen ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder artsspesifikke proteinfragmenter koblet til én eller flere heterologe bærere, hvilket gjør det mulig å frembringe en kraftig autoimmunrespons, i motsetning til tidligere under-søkelser hvor det er anvendt epsilon-peptider fra en annen art enn den det koblede peptid injiseres i, dvs. humane peptider i mus, rotte eller kanin. 3. I motsetning til de monoklonale prosjekter som pågår i flere laboratorier rundt om i verden, er foreliggende oppfinnelse basert på dannelsen av en polyklonal immunrespons mot et artsspesifikt protein, hvilket i betydelig grad øker mulighetene for å oppnå et vellykket resultat fordi medfølgende immunkompleksrelaterte komplikasjoner som fører til livstruende inflammatoriske reaksjoner, med stor sannsynlighet vil unngås. 4. Den viktigste forskjell er at det ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes hele domener eller strukturelt stabile deler derav (med mer enn 12 aminosyrer) som vaksine. Derved oppnås en kraftig polyklonal respons i testdyrsystemet (allerede vist) mot nativt IgE, hvilket er en meget viktig egenskap for en vaksine av denne type (også vist). Dette oppnås etter kun noen få ukers immunisering, noe som betyr et meget stort fremskritt sammenlignet med de tidligere forsøk utført i teknikken med korte, syntetiske peptider.

Referanser:

Blank U., Miller R., White K., Metzger H. og Kinet J.; Com-plete structure and expression in transfected cells of high affinity IgE receptor. Nature 337 (1989) 187-189.

Froese A., CRC crit. Rev. Immunol. 1. (1980) 79-132.

Helm B., Marsh P., Vercelli D., Padlan E., Gould H. og

Geha R.; The mast cell binding site on human immunoglobulin E. Nature 331 (1988) 180-183.

Helm B., Kebo D., Vercelli D., Glovsky M., Gould H., Ishizaka K., Geha R. og Ishizaka T.; Blocking of passive sensitization of human mast cells and basophil granulocytes with IgE antibodies by a recombinant human £-chain fragment of 76 amino acids. Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 86 (1989) 9465-9469.

Kinet J.( Metzger H., Hakimi J. og Kochan J.; A cDNA presump-tively coding for the a subunit of the receptor with high affinity for immunoglobulin E. Biochemistry 26 (1987) 4605-4610.

Kinet J., Blank U. , Ra C, White K. , Metzger H. og Kochan J. ; Isolation and characterization of cDNAs coding for the p subunit of the high-affinity receptor for immunoglobulin E. Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 85 (1988) 6483-6487.

Stadier B., Nakajima K., Yang X. og Weck A.; Potential role of anti-IgE antibodies in vivo. Int. Aren. Allergy Applied Immunol. 88 (1989) 206-208.

Shimizu A., Tepler I., Benfey P., Berenstein E., Siraganian R. og Leder O.; Human and rat mast cell high-affinity immunoglobulin E receptors: Characterization of putative a-chain gene products. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85 (1988) 1907-1911.

Stanworth, D. R. Jones, V. M., Lewin, I. V. og Nayvar, S.; Allergy treatment with a peptide vaccine. The Lancet 336

(1990) 1279-1281.

Tepler I., Shimizu A. og Leder P.; The gene for the rat mast cell high affinity IgE receptor a chain. J. Biol. Chem. 264

(1989) 5912-5915.

Weiss S.; Lehmann K., Raschke W. C. og Cohn M.; Mice com-pletely suppressed for the expression of immunoglobulin k light chain. Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 81 (1984) 211-215.

Vercelli D., Helm B., Marsh P.( Padlan E., Geha R. og

Gould H.; The B-cell binding site on human immunoglobulin E. Nature 338 (1989) 649-651.

Smith, D. B. og Johnson, K. S.; Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusion with glutathion S-transferase. Gene 67 (1988) 31-40.

Diaz-Sanchez, D. og Kemeny, D. M.; Generation of long-lived IgE response in high and low responder strains of rat by co-administration of ricin and antigen, Immunology 72 (1991) 297-303.

Claims (12)

1. Vaksine for å lindre symptomene ved, eller forhindre inntreden av, IgE-formidlede, allergiske reaksjoner hos et pattedyr, karakterisert ved at den omfatter et immunogent konjugat, omfattende et heterologt bærerprotein til hvilket det er koblet et protein som har (a) hele aminosyresekvensen for de konstante CH2-CH3-domener i epsilon-kjeden av IgE-molekylet fra den aktuelle pattedyrart, eller (b) en strukturelt stabil enhet av denne aminosyresekvens inneholdende mer enn 12 aminosyrer, hvori nevnte hele aminosyresekvens eller nevnte strukturelt stabile enhet derav er i sin opprinnelige eller i en lett mutert eller multimerisert form, videre kjennetegnet ved at når pattedyret injiseres med det immunogene konjugat, produserer det polyklonale antistoffer som har evnen til å binde til sirkulerende, nativt IgE og hvori slike polyklonale antistoffer er rettet mot og har evnen til samtidig å binde til ulike epitoper innen CH2-CH3-området av et IgE-antistoff, og er også kjennetegnet ved at vaksinen eventuelt kan inneholde et adjuvans.

2. Vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at hele aminosyresekvensen til de konstante CH2-CH3-domener eller den strukturelt stabile enhet derav foreligger i sin opprinnelige eller en lett mutert form.

3. Vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at hele aminosyresekvensen til de konstante CH2-CH3-domener eller den strukturelt stabile enhet derav foreligger i en multimerisert form.

4. Vaksine ifølge ethvert av kravene 1 til 3, karakterisert ved at pattedyret er menneske og at hele aminosyresekvensen av CH2-CH3-domenene eller den strukturelt stabile enhet derav stammer fra humant IgE.

5. Vaksine ifølge krav 2 eller 4, karakterisert ved at det koblede protein er et fusjonsprotein produsert ved hjelp av rekombinant DNA-tek-nologi i en prokaryot eller eukaryot vert.

6. Vaksine ifølge krav 5, karakterisert ved at det koblede protein er et fusjonsprotein fra en prokaryot vert, fortrinnsvis bak-terien Escherichia coli.

7. Anvendelse av hele aminosyresekvensen for de konstante CH2-CH3-domener i epsilon-kjeden i IgE-molekylet fra en pattedyrart, eller en strukturelt stabil enhet av denne aminosyresekvens inneholdende mer enn 12 aminosyrer, i dens opprinnelige eller i en lett mutert eller multimerisert form, for fremstilling av en vaksine mot IgE-formidlede, allergiske reaksjoner i de aktuelle pattedyrarter, hvori administreringen av vaksinen til pattedyret muliggjør at pattedyret etter å ha mottatt nevnte immunogene'konjugat ved injeksjon, produserer polyklonale antistoffer som har evne til å binde til sirkulerende, nativt IgE, hvor i slike polyklonale antistoffer er rettet mot og har evnen til å binde samtidig til ulike epitoper innen CH2-CH3-området av et IgE-antistoff.

8. Anvendelse ifølge krav 7, kjennetegnet ved at patte-dyrarten er et menneske og at hele aminosyresekvensen av de konstante CH2-CH3-domener eller den strukturelt stabile enhet derav er avledet fra humant IgE.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine ifølge krav 2, karakterisert ved kloning av cDNA-sekvensen for aminosyresekvensen til hele CH2-CH3-domene av IgE-epsilon-kjeden, eller en strukturelt stabil enhet derav, ligering av denne inn i en egnet vektor, transformasjon av vektoren inn i en eukaryot eller prokaryot vertscelle for fremstilling av et fusjonsprotein som inneholder hele CH2-CH3-domenet eller en strukturelt stabil enhet derav, og rensing og eventuelt isol-ering av det erholdte fusjonsprotein, så vel som eventuelt blanding av dette med et egnet adjuvans.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved. at det som vert for trans-formasjonen av vektoren anvendes en bakteriestamme, fortrinnsvis Escherichia coli.

11. Vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at den strukturelt stabile enhet,er CH2-domenet eller CH3-domenet av epsilonkjeden til IgE-molekylet fra de angjeldende pattedyrarter.

12. Anvendelse ifølge krav 7, hvori den strukturelt stabile enhet er CH2-domenét eller CH3-domenet av epsilon-kjeden til IgE-molekylet fra de angjeldende pattedyrarter.