WO2019194656A1 - 신규한 면역글로불린 e의 에피토프, 그와 결합하는 항체 및 상기 항체를 포함하는 시료 중 면역글로불린 e를 분석하기 위한 키트 - Google Patents

신규한 면역글로불린 e의 에피토프, 그와 결합하는 항체 및 상기 항체를 포함하는 시료 중 면역글로불린 e를 분석하기 위한 키트 Download PDF

Info

Publication number
WO2019194656A1
WO2019194656A1 PCT/KR2019/004104 KR2019004104W WO2019194656A1 WO 2019194656 A1 WO2019194656 A1 WO 2019194656A1 KR 2019004104 W KR2019004104 W KR 2019004104W WO 2019194656 A1 WO2019194656 A1 WO 2019194656A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
kit
sample
positivity
voice
antibody
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/004104
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김봉휘
박은영
장하경
홍광원
Original Assignee
(주)에스엘에스바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)에스엘에스바이오 filed Critical (주)에스엘에스바이오
Priority to CA3096363A priority Critical patent/CA3096363C/en
Priority to JP2021503687A priority patent/JP7266252B2/ja
Priority to AU2019247321A priority patent/AU2019247321A1/en
Priority to CN201980024338.1A priority patent/CN111936856A/zh
Priority to EP19781906.3A priority patent/EP3779443A4/en
Priority to US17/045,760 priority patent/US20210055305A1/en
Publication of WO2019194656A1 publication Critical patent/WO2019194656A1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • an allergy When an organism comes into contact with a foreign substance, an abrupt and sensitive change occurs in the body by an antigen-antibody reaction, which is called an allergy, and the foreign substance that causes it is called an allergen.
  • an allergen Of all types of allergic reactions, allergies involving immunoglobulin-E (IgE) are called type 1 allergies.
  • Type 1 allergy occurs when allergens are attached to an immunoglobulin on the surface of mast cells or basophils, stimulating mast cells or basophils to release compounds that cause hypersensitivity.
  • allergic symptoms include asthma, eczema hives, dermatitis, rhinitis, and the like.
  • total IgE antibodies and allergen-specific IgE antibodies can be increased in the blood of individuals with allergies, measurement of total IgE or allergen-specific IgE levels in serum distinguishes symptoms from allergic reactions and diseases similar to allergies. It is used as a useful test.
  • the identification of specific allergens provides information for tracking the disease and allergens include ticks, pollen, animal epithelial cells and various foods. Measurement of IgE antibodies in serum will provide useful clinical information for the treatment of allergic patients.
  • One aspect provides a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, which is an epitope of immunoglobulin E (IgE).
  • IgE immunoglobulin E
  • Another aspect provides an anti immunoglobulin E antibody that binds to said peptide.
  • Another aspect provides a kit for analyzing immunoglobulin E in a sample comprising the antibody.
  • kits provides a device for diagnosing allergy or prognosis including a sample loading unit.
  • Another aspect includes taking a subject's blood and mixing it with a sample diluent; It provides a method for diagnosing allergic diseases comprising the step of dropping the diluted solution to the sample loading unit.
  • One aspect provides a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, which is an epitope of immunoglobulin E (IgE).
  • IgE immunoglobulin E
  • the epitope may be conjugated with a substance or carrier for increasing immunogenicity, and the substance or carrier for increasing immunogenicity may be, for example, KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin).
  • KLH Keyhole Limpet Hemocyanin
  • the peptide may consist of an amino acid sequence of a part of the amino acid sequence of immunoglobulin E, and may be used as an epitope of immunoglobulin E, that is, a binding site of an antibody.
  • the peptide has excellent binding ability when combined with the anti-immunoglobulin E.
  • the amino acid sequence of the epitope of immunoglobulin E may be a peptide consisting of 12 to 15 amino acid sequences, and more specifically, may be a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • peptide refers to a polymer consisting of two or more amino acids linked by an amide bond or a peptide bond.
  • the polypeptide may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO. At least about 70%, at least about 75%, at least about 80%, at least about 85%, at least about 90%, at least 92%, at least about 95%, at least about 97%, at least about the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 Peptides having at least 98%, or at least about 99% sequence homology.
  • the protecting group may be an acetyl group, fluorenyl methoxy carbonyl group, formyl group, palmitoyl group, myristyl group, stearyl group, or polyethylene glycol (PEG), but a component capable of improving the modification of the peptide, in particular the stability of the peptide. If so, it can be included without limitation.
  • stability may mean not only in vivo stability that protects the peptide from attack of protein cleavage enzymes in vivo, but also storage stability (eg, room temperature storage stability).
  • the peptide may further comprise amino acid sequences prepared for specific purposes for targeting sequences, tags, and labeled residues.
  • homology is intended to indicate a degree of similarity to wild-type amino acid sequences, and such homology comparisons can be performed using comparative programs well known in the art, and homology between two or more sequences. Can be calculated as a percentage (%).
  • the peptide may be derived from nature, or may be obtained by various peptide synthesis methods well known in the art. As an example, it may be prepared using a polynucleotide recombination and protein expression system or by in vitro synthesis through chemical synthesis such as peptide synthesis, cell-free protein synthesis, and the like.
  • the peptide may be a product obtained by culturing a polypeptide, an extract of plant-derived tissues or cells, a microorganism (for example, a bacterium or a fungus, and especially a yeast), and specifically, one derived from immunoglobulin E. And more specifically, may be part of the amino acid sequence of immunoglobulin E.
  • one aspect provides a gene encoding the epitope, wherein the gene encodes a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • one aspect provides a vector comprising a gene encoding said epitope.
  • the vector can be introduced into a host so that the host can be used to express the gene and thereby be used to prepare the peptide.
  • the vector may be introduced into the gene in an expression vector known in the art.
  • the vector may be a vector which is linked with a promoter, a nucleotide sequence encoding a signal sequence and an expression control sequence, and the vector may include an antibiotic resistance marker for selection of the host into which the vector is introduced, which is inherent in the vector. It may be made or introduced from the outside.
  • Another aspect provides an anti immunoglobulin E antibody that binds to said peptide.
  • the antibody may recognize the peptide as an epitope and bind to a corresponding moiety, thereby specifically binding to immunoglobulin E.
  • the antibody not only has excellent binding ability with the peptide but also has excellent binding ability with immunoglobulin E.
  • the antibody may be prepared by a known antibody manufacturing method, and specifically, may be prepared from cells which produce polyclonal antibodies or monoclonal antibodies.
  • kits for diagnosing or prognostic allergic diseases capable of qualitative analysis of allergen-specific immunoglobulin E (IgE) within 10 to 40 minutes after contacting a sample with an individual. It provides a kit comprising.
  • IgE immunoglobulin E
  • the kit may comprise an allergen and a membrane coated with the antibody.
  • the allergen may be a representative inhalation or food allergy with a high frequency of occurrence in Koreans.
  • the allergen may be a representative inhalation or food allergy with a high frequency of occurrence in Koreans.
  • Koreans house dust mite, rye grass, oak, wormwood, round ginseng, garlic, pork, tuna, mold, dog, sesame, peanut, beef, fragrant grass, shrimp, apple, cat, alder, birch, soybean Beans, walnuts, cod, ducklings, milk, peaches, potatoes, ragweed, egg whites, wheat, crabs, barley, reeds, cockroaches, buckwheat or house dust and the like.
  • the antibody is as described above.
  • the membrane may be a material that may include a marker, and may be, for example, nitrocellulose, nylon, polyvinylidene fluoride (PVDF), glass, plastic, or the like.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • the kit according to one embodiment may be for immunochromatography analysis.
  • the kit is based on the immunochromatography method to develop the human serum or plasma on the nitrocellulose membrane immobilized each allergen at the site of the test line to determine the presence or absence of a specific IgE antibody against the allergen. It may be to check.
  • ICA Immunochromatographic Assay
  • the kit first reacts an anti-IgE gold conjugate with a sample containing a specific IgE antibody against an allergen, and then immobilizes allergens at the test line and mouse IgG at the control line.
  • Samples are run on a porous nitrocellulose membrane.
  • Gold antigen-antibody complexes pass through each allergen-fixed site when specific IgE antibodies for each allergen immobilized on the membrane are present in the sample in an antigen (sample) -anti-IgE antibody gold complex that migrates along the membrane.
  • the control line may be configured to develop at all times because a reddish violet band is formed at the corresponding position, and the goat anti-mouse IgG gold conjugate is captured by the mouse IgG and the antigen-antibody reaction at the control region.
  • kits provides a device for diagnosing allergy or prognosis including a sample loading unit. Details of the kit are as described above.
  • the sample loading portion may include a developing solution
  • the developing solution may include, for example, bovine serum albumin, goat serum, sodium chloride, potassium chloride, polysorbate 20, sodium azide, tertiary distilled water, proclean 300, Triaminomethane or a mixed solution thereof.
  • Another aspect includes taking a subject's blood and mixing it into a sample diluent; And it provides a method for diagnosing allergic diseases comprising the step of dropping the diluent to the sample loading (drop) to react for 10 to 40 minutes.
  • the method comprises taking a blood of the subject and mixing it with the sample diluent.
  • the blood may be collected by a known method, and the volume of the blood mixed in the diluent may be 0.5 ml to 2 ml.
  • it may be 0.5 ml to 1.8 ml, 0.5 ml to 1.5 ml, 0.7 ml to 2 ml, 0.7 ml to 1.5 ml, 0.8 ml to 1.4 ml, or 1 ml to 1.5 ml.
  • the sample dilution may be a 2-fold dilution of the sample to 64 times, for example, may be diluted 2-fold, 4-fold, 8-fold, 16-fold, 32-fold or 64-fold.
  • the blood may be plasma or serum.
  • the volume of the plasma or serum may be 0.1 ml to 1 ml.
  • it may be 0.1 ml to 1 ml, 0.1 ml to 0.9 ml, 0.1 ml to 0.8 ml, 0.2 ml to 1 ml, or 0.2 ml to 0.8 ml.
  • the volume of the plasma or serum is less than the above range, there is a problem that the antigen-antibody reaction does not occur sufficiently and the accuracy of diagnosis may be reduced.
  • the method according to one embodiment includes loading the diluent to the sample loading unit and reacting for 10 to 40 minutes.
  • the diluent may be used to drop 1 to 5 drops onto the sample loading unit using a dropper, for example, 1 to 5 drops, 1 to 4 drops, 2 to 5 drops, or 2 to 4 drops. Can load.
  • the reaction may be performed for 10 to 40 minutes, for example, 10 to 40 minutes, 10 to 35 minutes, 10 to 30 minutes, 15 to 40 minutes, 15 to 35 minutes, or 15 to 30 minutes. .
  • the reaction time is less than the above range, there is a problem that the sample diluent cannot fully react with the IgE of the sample loading portion.
  • Method according to one embodiment may further comprise the step of confirming the presence or absence of each allergen-specific antibody using a card for confirming the result of the reaction complete device.
  • kits and antibodies according to one aspect may be used as an epitope of immunoglobulin E, such as in the diagnosis or treatment of immunology, allergy, and the like.
  • the kit containing the antibody can be qualitatively analyzed for the presence of a typical inhalation, food allergy with a high incidence in Korean, it is possible to confirm the results with the naked eye as soon as possible after blood collection.
  • it is possible to minimize the amount of sample required for the test there is an advantage that it can be applied to children with difficult blood collection.
  • 1 is a schematic of the reaction of a kit according to one aspect.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a manufacturing process of a device according to one embodiment.
  • Antigen emulsions were prepared by mixing 100 ⁇ l of antigen (IgE pep-40) with the same amount of Complete adjuvant, followed by subcutaneous administration of 6-week-old female mice (BALB / C) to induce an immune response. After the first dose, 100 ⁇ l of the same antigen and the same amount of Incomplete adjuvant were administered subcutaneously in the mice at two week intervals (Table 1).
  • the plate was washed with PBST and diluted HRP-conjugated Goat anti-mouse IgG-HRP at a ratio of 1: 2000, and 100 ⁇ l of the wells was reacted at room temperature for 1 hour. . Thereafter, the mixture was washed using PBST, and the reaction was terminated using a reaction stopper after reacting for 15 minutes by dispensing the TMB solution. Absorbance values were measured at 450/620 nm to determine titers in serum (Table 2).
  • Antibody titer was confirmed to produce antibodies with high titers based on the serum titers of mice confirmed through experiments, and lymphocytes of the mice were isolated and cell fusion was performed. Immune response-induced spleens of mice were intact, washed with DMEM (Dulbecco / Vogt modified Eagle's minimal essential medium) medium, lymphocytes were isolated, and DMEM medium was contained in 60 mm dishes and separated into single cells. Thereafter, red blood cells mixed with lymphocytes were removed using RBC lysis buffer, washed with DMEM medium, and prepared myeloma cells (SP2 / 0 Ag 14-ATCC # CRL-1581) and lymphocytes were prepared. Mix 1: 5 by number.
  • the screening was performed using an enzyme immunization method.
  • the medium was changed 12 days after cell fusion, and the ELISA test was performed using the replaced medium as a primary antibody. After the ELISA test, the wells positive for the antigen were selected and transferred to 24 wells for incubation. Hybridoma cell lines cultured in 24 wells were again subjected to ELISA tests in the same manner to confirm antibody titers. The absorbance (OD value) of the fusion cells grown in 24 wells was confirmed by ELISA, and only the fusion cells with absorbance greater than 1 were selected, transferred to a 6-well culture flask, incubated and centrifuged, and the supernatant was collected. Screening was performed. Based on the third screening, the selected fusion cells were transferred to a 75T / C culture flask and cultured, and the absorbance was confirmed by ELISA to select only fusion cells having absorbance greater than 1.
  • Epitope mapping was performed using the peptide used for antibody production.
  • Peptides used for mapping used peptides with 12, 13, 15 amino acid sequences that are part of the IgE pep-40 protein that was used for conventional antigen production (Table 3).
  • Pep-6 was determined to be an epitope of a novel antigen (IgE pep-40), which was not previously known.
  • Peptide Class Amino acid sequence SEQ ID NO: Pep-1 LEDGQVMDVDLST One Pep-4 EVTRAEWEQKDE 2 Pep-6 SRASGKPVNHSTR 3
  • Raw material name standard amount Raw material name standard amount anti-IgE Company standard 0.1 ⁇ g cat Company standard 0.5 ⁇ g European House Dust Mite Company standard 0.5 ⁇ g Alder Company standard 0.3 ⁇ g North American House Dust Mite Company standard 0.5 ⁇ g Birch Trees Company standard 0.5 ⁇ g Rye grass Company standard 0.5 ⁇ g Soybeans Company standard 0.5 ⁇ g kind of oak Company standard 0.5 ⁇ g Walnut Company standard 0.5 ⁇ g Mugwort Company standard 0.5 ⁇ g Dae-gu Company standard 0.5 ⁇ g Round ginseng Company standard 0.5 ⁇ g Duck Company standard 0.5 ⁇ g garlic Company standard 0.5 ⁇ g milk Company standard 0.5 ⁇ g Pork Company standard 0.3 ⁇ g peach Company standard 0.5 ⁇ g tuna Company standard 0.5 ⁇ g potato Company standard 0.5 ⁇ g Alternaria alternate Company standard 0.5 ⁇ g Ragweed Company standard 0.5 ⁇ g dog Company standard 0.5 ⁇ g Egg white Company standard 0.5 ⁇ g Sesame Company standard 0.5 ⁇ g
  • the supernatant was separated by centrifugation at 4 ° C. and 15,000 rpm for 30 minutes, and then filtered using Whatman paper.
  • the samples were then dialyzed for 24 to 48 hours using 0.1 ⁇ PBS pH 7.5. The dialyzed sample was allowed to air dry in the cold room while it was dried until the volume was reduced to around 1/10. After centrifugation for 1 hour at 4 °C, 15,000 rpm, and filtered using a 45 ⁇ m Syringe Filter. Thereafter, the protein was quantified using Bradford assay and lyophilized.
  • the antibody bound to the Pep-6 peptide was found and the monoclonal antibody cell line was established using the same, and the titer of the antibody was tested using the cell culture. At this time, KLH protein was used as a carrier of Pep-6.
  • the three antibodies (8-7_100cell, 140-13_500cell, 302-2_100cell) is similar to the antibody having a different binding site and the recombinant IgE binding force is similar degree It was found that the three antibodies (8-7_100cell, 140-13_500cell, 302-2_100cell) can be used for the preparation of the kit.
  • three antibodies (8-7_100cell, 140-13_500cell, 302-2_100cell) having similar binding capacity to recombinant IgE were selected.
  • three antibodies were confirmed by ELISA test in the following method to determine the degree of binding force to native IgE present in the blood.
  • 2 ⁇ g / ml of the antibody against human IgE on the market was coated by reacting 100 ⁇ l per well at 4 ° C. for 18 hours. The next day was blocked for 1 hour at room temperature using a blocking buffer (blocking buffer). During blocking, the three antibodies selected were biotinylated according to the instructions for use of the commercially available biotinylation kit. Thereafter, 10 ⁇ l of each patient serum determined to be allergic to the recombinant IgE protein was dispensed into each well, and then reacted at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, the plate was washed with PBST and diluted with HRP-conjugated straptavidin in a 1: 5000 ratio.
  • colloidal gold chloride and a reducing agent were used to prepare colloidal gold particles having a diameter of 40 to 60 nm.
  • Tertiary distilled water is added to the colloidal gold particles so that the OD value is 1.0 ⁇ 1.0 at 520 nm.
  • 5 ⁇ g to 15 ⁇ g of the monoclonal anti-Human IgE antibody prepared in Example 1-2 was added to 1 ml of the gold solution, followed by shaking for 1 hour at room temperature. After completion of the reaction, the gold particles were washed, measured at 520 nm using an absorbance meter, quantified and diluted to a concentration of OD value of 5.0 ⁇ 1.0, and a preservative was added.
  • Allergen antigens prepared in Example 1- (1) were diluted to 5 mg / mL and anti-mouse IgG to 2 mg / mL, respectively, using the excipient buffer solution. Each was dispensed on to coat the membrane. Thereafter, the coated membrane was placed on a check test table, and each coating solution was visually inspected to determine whether the coating was normally dispensed. Normally dispensed membrane was incubated at 37 ⁇ 2 ° C. for at least 1 hour and then sealed and stored in a dehumidified state until assembly.
  • the gold conjugate prepared in Example 1- (3) was mixed with a stabilizer to be homogeneously absorbed into the glass fiber.
  • a stabilizer since 19.63 ⁇ l of glass fiber 1.1 cm ⁇ 0.4 cm is used, monoclonal anti-Human IgE antibody gold conjugate is added to 14.59 ⁇ 1.06 ⁇ g stock solution mass in one device.
  • the glass fibers dried at 37 ⁇ 2 ° C. for 1 hour were sealed and stored in a dehumidified state until assembly.
  • the conjugate pad and the sample pad were sequentially attached to the bottom of the coated membrane, and the absorbent pad was attached to the top of the membrane.
  • Using a dedicated cutter cut to (45 ⁇ 5.2) mm x (4.4 ⁇ 1.5) mm dimensions and stored in moisture-proof packaging until device assembly. Thereafter, the cut strips were placed on the lower plastic device, covered with the upper plastic device, and sealed packed in silver foil with dried silica gel.
  • the detection limit of the kit according to one embodiment was determined to be positive in the quantitative value of 2 to 8ng or more, but it was not determined that all the samples of 1.68 to 8.39 ng were positive, so the quantitative value of 8.4 kit or more was determined based on the EIA class. The detection limit was set.
  • Example 2 Three different testers were tested for the kit prepared in Example 2 using negative standards and positive standards, respectively, and the results were analyzed.
  • Example 2 For the kit prepared in Example 2, one tester was tested for 5 days at a daily interval using a negative standard and a positive standard, respectively, and the results were analyzed.
  • Example 2 One tester for each of the three kits prepared in Example 2 was tested using a negative standard and a positive standard, and the results were analyzed.
  • Example 2 For the kit prepared in Example 2, one tester tested using a negative standard and a positive standard at three different places (laboratory, QC room, etc.), and analyzed the results.
  • Example 2 As a result, as shown in Table 9, the device of Example 2 was negative for the test using the negative standard material and positive for the test using the positive standard material regardless of the tester, test date, lot, and test location. Test results were confirmed.
  • Test substance density Human albumin 20 g / dL Sodium citrate 500 mg / dL Cyanocobalamin (vitamin B12) 1 mg / dL Bilirubin 20 mg / dL EDTA 800 mg / dL Glucose 10 g / dL Ascorbic acid 521 mg / dL hemoglobin 250 mg / dL
  • the false positive means that the negative standard material is found to be positive by the interference material
  • the false negative means that the positive standard material containing the interference material is determined to be negative under the influence of the interference material.
  • the kit according to the present invention was confirmed that there is no effect on all eight interference materials.
  • IgA, IgM, IgG, and IgD were respectively added to the negative standard to confirm the presence or absence of cross-reaction due to the nonspecific binding of the immunoglobulin subspecies present in the sample and the antibody used in the test. It was tested according to the standard test method and judged according to the acceptance criteria.
  • the allergy kit was prepared according to Example 2 using 8-7_100 cells of three antibodies prepared and selected according to Example 1-2, and the incidence frequency among 39 kinds of substrates (LG, Alloscan) and allergens was high. 13 allergens (European house dust mite (DP), North American house dust mite (DF), cat, house dust, dog, birch, alternaria, peach, apple, rye grass, fragrant grass, duck bird, big mantle, oak, egg white, potato Test for concordance rate). The test used 160 specimens positive for one or more allergens in 13 species, and the specimens with inconsistency were subjected to a unicap test, which is a third test and considered as a standard test for allergy testing, to determine the result. The test using the board kit and the unicap inspection were conducted by the entrusting agency. The self-developed kit was performed by two inspectors (Table 12).
  • the allergy test kit using the antibody according to Example 2 means that the specificity of the antibody or the binding ability with allergens is excellent, so that the concordance rate is high.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

신규한 면역글로불린 E(Immunoglobulin E: IgE)의 에피토프(epitope)인 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 상기 펩티드에 결합하는 항 면역글로불린 E 항체에 관한 것으로, 상기 펩티드 및 항체를 알레르기 질환의 진단 또는 치료제 연구 등에 활용할 수 있다. 또한, 상기 항체를 포함하는 시료 중 면역글로불린 E을 분석하기 위한 키트 및 상기 키트를 이용한 알레르기 질환의 진단방법에 관한 것으로, 한국인에게서 발생 빈도가 높은 대표적인 흡입성, 음식 알레르기의 유무를 정성분석 가능하며, 채혈 후 빠른 시간 내에 알레르기를 진단할 수 있다.

Description

신규한 면역글로불린 E의 에피토프, 그와 결합하는 항체 및 상기 항체를 포함하는 시료 중 면역글로불린 E를 분석하기 위한 키트
신규한 면역글로불린 E의 에피토프, 그와 결합하는 항체 및 상기 항체를 포함하는 시료 중 면역글로불린 E를 분석하기 위한 키트에 관한 것이다.
생물체가 어떤 외래성 물질과 접하게 되면 항원-항체 반응에 의하여 생체 내에 급격하고 과민한 변화가 일어나는데 이를 알레르기(allergy)라고 하며 이를 일으키는 외래성 물질을 알레르겐(allergen)이라고 한다. 여러 타입의 알레르기 반응 중 면역글로불린-E(immunoglobulin E; IgE)가 관여하는 알레르기를 제 1형 알레르기라고 한다.
제 1형 알레르기는 마스트 세포(mast cell)나 호염구(basophil) 표면에 붙어 있는 면역글로불린(immunoglobulin)에 알레르겐이 붙으면 마스트 세포나 호염구가 자극되어 과민반응을 일으키는 화합물을 방출하게 되면서 일어난다. 일반적으로 알레르기 증상은 천식(astma), 습진(eczema) 두드러기(hives), 피부염(dermatitis), 비염(rhinitis) 등을 포함한다.
전체 IgE 항체 및 알레르겐-특이적인 IgE 항체는 알레르기가 있는 개인의 혈액에서 증가될 수 있으므로 혈청 중 총 IgE농도 혹은 알레르겐-특이적인 IgE 농도의 측정은 전형적인 알레르기 반응에 의한 증상과 알레르기와 유사한 질병을 구분하는데 유용한 검사로 사용되고 있다. 일반적으로 출생시의 제대혈 내 총 IgE 항체의 농도는 1 IU/ml(2.4 ng = 1 IU)정도이고 나이가 들면서 점차 증가하여 성인의 경우 대개 83.3 IU/ml (200ng/ml) 이하로 유지된다.
특이적인 알레르기 항원의 식별은 질병을 추적하기 위한 정보를 제공하며 알레르기 항원은 진드기, 꽃가루, 동물의 상피세포와 다양한 음식을 포함한다. 혈청내의 IgE 항체의 측정이 알레르기 환자의 치료에 유용한 임상 정보를 제공할 것이다.
일 양상은 면역글로불린 E(Immunoglobulin E: IgE)의 에피토프(epitope)인 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 제공한다.
다른 양상은 상기 펩티드에 결합하는 항 면역글로불린 E 항체를 제공한다.
또 다른 양상은 상기 항체를 포함하는 시료 중 면역글로불린 E를 분석하기 위한 키트를 제공한다.
또 다른 양상은 상기 키트; 및 검체 적재부를 포함하는 알레르기 진단 또는 예후 예측용 디바이스를 제공한다.
다른 양상은 개체의 혈액을 채취하여 검체 희석액에 혼합하는 단계; 상기 희석액을 검체 적재부에 적재(drop)하여 반응시키는 단계를 포함하는 알레르기 질환의 진단 방법을 제공한다.
일 양상은 면역글로불린 E(Immunoglobulin E: IgE)의 에피토프(epitope)인 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 제공한다.
상기 에피토프는 면역원성을 증가시키는 물질 또는 담체(carrier)과 접합된 것일 수 있고, 상기 면역원성을 증가시키는 물질 또는 담체는 예를 들면, KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)일 수 있다.
상기 펩티드는 면역글로불린 E의 아미노산 서열의 일부의 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 면역글로불린 E의 에피토프 즉,항체의 결합부위로서 이용될 수 있다. 상기 펩티드는 상기 항 면역글로불린 E와 결합시 그 결합력이 우수하다.
상기 면역글로불린 E의 에피토프의 아미노산 서열은 12개 내지 15개의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있고, 보다 구체적으로, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있다.
상기 용어 “펩티드(Peptide)”는 아마이드 결합 또는 펩티드 결합으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다. 상기 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 상기 서열번호 3의 아미노산 서열과 각각 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다.
또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 상기 펩티드의 N- 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 상기 보호기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 펩티드의 개질, 특히 펩티드의 안정성 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함될 수 있다.
상기 용어 "안정성"은 생체 내 단백질 절단효소의 공격으로부터 상기 펩티드를 보호하는 인 비보(in vivo) 안정성 뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미하는 것일 수 있다.
아울러, 상기 펩티드는 표적화 서열, 태그 (tag), 표지된 잔기를 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 용어 "상동성(Homology)"은 야생형 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 이러한 상동성의 비교는 당업계에서 널리 알려진 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있으며, 2개 이상의 서열간 상동성을 백분율 (%)로 계산할 수 있다.
상기 펩티드는 천연으로부터 유래될 수도 있고, 당해 분야에서 널리 공지된 다양한 펩티드 합성 방법으로 획득할 수 있다. 일례로서, 폴리뉴클레오티드 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 펩티드 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다. 또한, 일례로서, 상기 펩티드는 폴리펩티드, 식물 유래 조직이나 세포의 추출물, 미생물(예를 들어 세균류 또는 진균류, 그리고 특히 효모)의 배양으로 얻어진 생산물일 수 있고, 구체적으로는 면역글로불린 E로부터 유래되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 면역글로불린 E의 아미노산 서열의 일부일 수 있다.
또한, 일 양상은 상기 에피토프를 코딩하는 유전자를 제공하며, 상기 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 코딩한다.
또한, 일 양상은 상기 에피토프를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 숙주로 도입되어 숙주가 상기 유전자를 발현시키는데 사용될 수 있고, 이에 의해 상기 펩티드를 제조하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 벡터는 당 분야에 공지된 발현 벡터에 상기 유전자가 도입된 것일 수 있다.
상기 벡터는 프로모터, 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과은 발현 조절 서열과 연결된 것인 벡터일 수 있고, 상기 벡터는 벡터가 도입된 숙주의 선별을 위해 항생제 저항성 마커를 포함할 수 있고, 이는 벡터에 내재된 것이거나 외부에서 도입된 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 펩티드에 결합하는 항 면역글로불린 E 항체를 제공한다.
상기 항체는 상기 펩티드를 에피토프로 인식하여 해당 부분에 결합할 수 있어, 면역글로불린 E에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 항체는 상기 펩티드와의 결합력이 우수할 뿐만 아니라 면역글로불린 E와의 결합력도 우수하다. 상기 항체는 공지의 항체 제조 방법으로 제조될 수 있으며, 구체적으로는 다클론항체 또는 단일클론항체를 생성하는 세포 등으로부터 제조될 수 있다.
또 다른 양상은 개체에 시료를 접촉시킨 후 10분 내지 40분 이내에 알레르겐(allergen) 특이 면역글로불린 E(Immunoglobulin E, IgE)의 정성 분석이 가능한 알레르기 질환의 진단 또는 예후 분석용 키트로서, 상기 항체를 포함하는 키트를 제공한다.
상기 키트는 알레르겐 및 상기 항체가 코팅된 멤브레인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 알레르겐은 한국인에게서 발생 빈도가 높은 대표적인 흡입성 또는 음식 알레르기일 수 있다. 예를 들어, 집먼지진드기, 호밀풀, 참나무, 쑥, 환삼덩굴, 마늘, 돼지고기, 참치, 곰팡이, 개, 참깨, 땅콩, 소고기, 향기풀, 새우, 사과, 고양이, 오리나무, 자작나무, 대두콩, 호두, 대구, 오리새, 우유, 복숭아, 감자, 돼지풀, 계란흰자, 밀, 게, 보리, 갈대, 바퀴벌레, 메밀 또는 집먼지 등일 수 있다. 상기 항체는 전술한 바와 같다.
상기 멤브레인은 마커를 포함할 수 있는 소재일 수 있으며, 예를 들어, 니트로셀룰로스, 나일론, 폴리플루오린화비닐리덴(PVDF), 유리 또는 플라스틱 등일 수 있다.
또한, 일 구체예에 따른 키트는 면역크로마토그래피 분석용인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 키트는 면역크로마토그래피법을 원리로 하여 검사선 부위에 각각의 알레르겐을 고정(Immobilization)시킨 나이트로셀룰로즈 멤브레인 상에 사람 혈청 또는 혈장을 전개시켜 알레르겐에 대한 특정 IgE 항체의 존재 유무를 검사하는 것일 수 있다.
상기 용어 "면역크로마토그래피법(Immunochromatographic Assay; ICA)"이란 면역화학(mmuno-chemistry)과 얇은 막 크로마토그래피(thin-layer chromatography) 기술을 응용한 검사방법으로 항원(antigen)에 대한 항체(antibody)의 특이적인 반응성, 콜로이달 골드의 발색특성 및 유동성, 다공성 나이트로셀룰로즈 멤브레인 상에서의 모세관 힘(capillary force)에 의한 검체 및 분자의 이동을 응용한 것이다.
즉, 일 구체예에 따른 키트는 알레르겐에 대한 특정 IgE 항체가 포함된 검체와 항 IgE 골드 콘쥬게이트를 먼저 반응시킨 다음, 검사선 부위에는 알레르겐을 고정(immobilization)하고 대조선 부위에는 마우스 IgG를 고정시킨 다공성 나이트로셀룰로오즈 멤브레인 상에서 검체를 전개시킨다. 멤브레인을 따라 이동하는 항원(검체)-항 IgE 항체 골드 복합체 중에 멤브레인 상에 고정시킨 각각의 알레르겐에 대한 특정 IgE 항체가 검체 내에 존재할 경우, 골드 항원-항체 복합체는 각각의 알레르겐이 고정된 부위를 통과하게 되므로 해당 위치에서 적자색 밴드를 형성하고, 또한 대조선 부위에서는 산양 항-마우스 IgG 골드 콘쥬게이트가 마우스 IgG와 항원-항체 반응에 의하여 포획되므로 대조선은 항상 발색되도록 구성될 수 있다.
또 다른 양상은 상기 키트; 및 검체 적재부를 포함하는 알레르기 진단 또는 예후 예측용 디바이스를 제공한다. 상기 키트의 구체적은 내용은 전술한 바와 같다.
상기 검체 적재부는 전개용액이 포함되는 것일 수 있으며, 상기 전개용액을 예를 들어, 소혈청알부민, 산양혈청, 염화나트륨, 염화칼륨, 폴리소르베이트 20, 아지드화 나트륨, 3차 증류수, 프로클린 300, 트리아미노메테인 또는 이의 혼합용액일 수 있다.
또 다른 양상은 개체의 혈액을 채취하여 검체 희석액에 혼합하는 단계; 및 상기 희석액을 검체 적재부에 적재(drop)하여 10 내지 40분간 반응시키는 단계를 포함하는 알레르기 질환의 진단 방법을 제공한다.
일 구체예에 따른 방법은 개체의 혈액을 채취하여 검체 희석액에 혼합하는 단계를 포함한다. 상기 혈액은 공지된 방법으로 채취할 수 있으며, 희석액에 혼합하는 혈액의 부피는 0.5 ㎖ 내지 2 ㎖일 수 있다. 예를 들어, 0.5 ㎖ 내지 1.8 ㎖, 0.5 ㎖ 내지 1.5 ㎖, 0.7 ㎖ 내지 2 ㎖, 0.7 ㎖ 내지 1.5 ㎖, 0.8 ㎖ 내지 1.4 ㎖, 또는 1 ㎖ 내지 1.5 ㎖일 수 있다. 이때, 혈액의 부피가 상기 범위 미만인 경우, 항원-항체 반응이 충분히 일어나지 않아 진단의 정확도가 떨어질 수 있다는 문제점이 있다. 상기 검체 희석액은 검체를 2배 내지 64배 희석한 것일 수 있으며, 예를 들어, 2배, 4배, 8배, 16배, 32배 또는 64배로 희석한 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 방법은 상기 혈액은 혈장 또는 혈청일 수 있다. 상기 검체 희석액에 혈장 또는 혈청을 혼합하는 경우, 상기 혈장 또는 혈청의 부피는 0.1 ㎖ 내지 1 ㎖일 수 있다. 예를 들어, 0.1 ㎖ 내지 1 ㎖, 0.1 ㎖ 내지 0.9 ㎖, 0.1 ㎖ 내지 0.8 ㎖, 0.2 ㎖ 내지 1 ㎖, 또는 0.2 ㎖ 내지 0.8 ㎖일 수 있다. 이때, 혈장 또는 혈청의 부피가 상기 범위 미만인 경우, 항원-항체 반응이 충분히 일어나지 않아 진단의 정확도가 떨어질 수 있다는 문제점이 있다.
일 구체예에 따른 방법은 상기 희석액을 검체 적재부에 적재하여 10 내지 40분 동안 반응시키는 단계를 포함한다. 구체적으로, 상기 희석액을 스포이드를 이용하여 검체 적재부에 1 내지 5 방울 적재(drop)할 수 있으며, 예를 들어, 1 내지 5방울, 1 내지 4방울, 2 내지 5방울, 또는 2 내지 4방울 적재할 수 있다. 이후, 10 내지 40분 동안 반응시키는 데, 예를 들어, 10 내지 40분, 10 내지 35분, 10 내지 30분, 15 내지 40분, 15 내지 35분, 또는 15 내지 30분 동안 반응시킬 수 있다. 이때, 반응 시간이 상기 범위 미만인 경우, 검체 희석액이 검체 적재부의 IgE와 충분히 반응할 수 없다는 문제점이 있다.
일 구체예에 따른 방법은 상기 반응이 완료된 디바이스에 결과 확인용 카드를 이용하여 각 알레르겐 특이 항체의 유무를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 펩티드 및 항체는 면역글로불린 E의 에피토프로서 면역학, 알레르기 등의 진단 또는 치료제 연구 등에 활용될 수 있다. 또한, 상기 항체를 포함하는 키트는 한국인에게서 발생 빈도가 높은 대표적인 흡입성, 음식 알레르기의 유무를 정성분석 가능하며, 채혈 후 빠른 시간 내에 육안으로 결과 확인이 가능하다. 또한, 검사에 필요한 검체량의 최소화가 가능하므로 채혈이 어려운 소아에게도 적용이 가능하다는 이점이 있다.
도 1은 일 양상에 따른 키트의 반응 모식도이다.
도 2는 일 구체예에 따른 디바이스의 제조 공정을 나타낸 모식도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 신규 면역글로불린 E 에피토프의 확인
(1) 다클론 항체의 제조 및 역가 확인
항원(IgE pep-40) 100 ㎕와 동량의 컴플리트 애쥬번트(Complete adjuvant)를 혼합하여 항원 유화액을 만든 후, 6주령의 암컷 마우스(BALB/C) 피하에 투여하여 면역반응을 유도하였다. 1차 투여 후, 2주 간격으로 동일한 항원 100 ㎕와 동량의 인컴플리트 애쥬번트(Incomplete adjuvant)를 이용하여 상기 마우스의 피하에 투여하였다(표 1).
차수 항원 농도(㎎/㎖) 투여량(㎍)
1차 항원(IgE pep-40) 1 75 + 컴플리트 애쥬번트(v/v 1:1 혼합)
2차 항원(IgE pep-40) 1 75 + 인컴플리트 애쥬번트(v/v 1:1 혼합)
3차 항원(IgE pep-40) 1 75 + 컴플리트 애쥬번트(v/v 1:1 혼합)
항원 투여를 3회 진행한 후, 상기 마우스의 꼬리 정맥에서 혈청(serum)을 소량 채혈하여 ELISA test를 통해 혈청 내 다클론 항체의 역가를 확인하였다. 구체적으로, 항원(IgE pep-40) 2 ㎍/㎖을 well당 100 ㎕씩 4℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, 코팅하였다. 다음날 블로킹 버퍼(blocking buffer)를 이용하여 실온에서 1시간 동안 반응(blocking)시켰다. 이후, 마우스 혈액에서 얻은 혈청을 사용하여 배율에 맞게 희석하여 웰에 100 ㎕를 분주한 후, 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 플레이트는 PBST를 사용하여 세척한 후 HRP가 컨쥬게이션(conjugation)되어 있는 Goat anti-mouse IgG-HRP를 1:2000 비율로 희석하여 웰에 100 ㎕를 분주하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, PBST를 사용하여 세척하고, TMB 용액을 분주하여 15분간 반응 시킨 후 반응 정지액을 사용하여 반응을 종결하였다. 450/620 nm에서 흡광도 값을 측정하여 혈청 내 역가(titer)를 확인하였다(표 2).
혈청 농도 구별 대조군 NC1 IgE pep-40
x 100 A 0.203 0.087 2.576
x 200 B 0.084 0.037 2.195
x 400 C 0.03 0.014 2.001
x 800 D 0.013 0.009 1.637
x 1600 E 0.009 0.006 1.119
x 3200 F 0.006 0.006 0.583
x 6400 G 0.005 0.005 0.332
x 12800 H 0.005 0.005 0.117
(2) 하이브리도마 세포의 제조
항체 역가 확인 실험을 통해 확인된 마우스의 혈청 내 역가를 기준으로 높은 역가를 갖는 항체가 생성되었음을 확인하고 상기 마우스의 림프구를 분리하여 세포 융합을 실시하였다. 면역 반응이 유도된 마우스의 비장을 손상 없이 적출하여 DMEM (Dulbecco/Vogt modified Eagle's minimal essential medium) 배지로 세척하고, 림프구를 분리하여 60 ㎜ 디쉬(dish)에 DMEM 배지를 담아 단일 세포로 분리시켰다. 이후, RBC 용해 버퍼 (lysis buffer)를 사용하여 림프구에 섞여있는 적혈구를 제거한 후, DMEM 배지로 세척하고, 준비된 골수종 세포(Myeloma cell, SP2/0 Ag 14 - ATCC #CRL-1581)과 림프구를 세포 수 대비 1:5로 혼합하였다. 이 후, 상기 혼합된 세포들에 PEG1500 1.7 ㎖를 첨가해 세포 융합을 유도하고, 96 웰 플레이트에 웰 당 200 ㎕씩 세포를 분주 한 뒤 CO2 인큐베이터(incubator)에서 배양하였다. 세포 융합 2일 후, 각 웰 당 50%를 HAT 배지(hypoxanthine-aminopterinthymidine medium)로 교체하였고, 12일 후, 콜로니(colony)를 확인하여 IgE pep-40 단백질 펩티드(ELISA 확인용 항원)와의 반응 여부를 위의 ELISA (Asb. 450 nm) 방식으로 진행하여 결정하였다. 상기 ELISA 결과 중, O.D 값을 기준으로 1.0 이상인 경우, 양성(positive)으로 선정하여 단일클론 세포를 선별하였다.
(3) 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 선별
제조한 융합세포군 중 IgE pep-40에만 특이적으로 반응하는 세포를 선별하고 항체의 생성여부를 확인하기 위하여, 효소 면역방법을 이용하여 스크리닝 하였다.
세포융합 후 12일째에 배지를 교환하고, 교환한 배지를 1차 항체로 하여 ELISA 시험을 수행하였다. ELISA 시험 후 해당 항원에 양성을 보이는 웰을 선택하여 24 웰로 옮겨 배양하였다. 24 웰에서 배양한 하이브리도마 세포주를 동일한 방법으로 다시 ELISA 시험을 수행하여 항체 역가를 확인하였다. 24 웰에서 키운 융합세포의 흡광도(O.D값)를 ELISA로 확인하고, 흡광도가 1이 넘는 융합세포만 선택하여 6-웰 배양 플라스크로 옮겨 배양하고 원심분리한 후 상층액을 거두어 ELISA 확인하여 3차 스크리닝을 수행하였다. 3차 스크리닝을 토대로 선택된 융합세포를 다시 75T/C 배양 플라스크로 옮겨 배양하고 ELISA로 흡광도를 확인하여 흡광도가 1이 넘는 융합세포만 선택하였다.
(4) IgE pep-40 단백질에 대한 단일클론 항체의 에피토프 분석(epitope mapping)
항체 생산에 사용한 펩티드를 사용하여 에피토프 맵핑(epitope mapping)을 실시하였다. 맵핑에 사용된 펩티드는 기존 항원 생산에 사용되었던 IgE pep-40 단백질의 일부인 12, 13, 15개의 아미노산 서열을 가진 펩티드를 사용하였다(표 3).
그 중 Pep-6 펩티드와 결합하는 항체를 발견하였고, Pep-6는 기존에 알려지지 않았던 신규 항원(IgE pep-40)의 결합부위(epitope)라고 판단하였다.
펩티드 종류 아미노산 서열 서열번호
Pep-1 LEDGQVMDVDLST 1
Pep-4 EVTRAEWEQKDE 2
Pep-6 SRASGKPVNHSTR 3
실시예 2. 알레르기 질환 진단 또는 예후 분석용 키트의 제조
(1) 알레르겐의 분리
하기 표 4에 나타낸 원 재료를 TSM Allergen Source가 잠길 만큼 Ether를 넣어준 다음, 잘 섞어주면서 상온에서 5분간 인큐베이션(incubation) 시켰다.
원재료명 규격 분량 원재료명 규격 분량
anti-IgE 자사기준 0.1㎍ 고양이 자사기준 0.5㎍
유럽집먼지진드기 자사기준 0.5㎍ 오리나무 자사기준 0.3㎍
북아메리카집먼지진드기 자사기준 0.5㎍ 자작나무 자사기준 0.5㎍
호밀풀 자사기준 0.5㎍ 대두콩 자사기준 0.5㎍
참나무 자사기준 0.5㎍ 호두 자사기준 0.5㎍
쑥 자사기준 0.5㎍ 대구 자사기준 0.5㎍
환삼덩굴 자사기준 0.5㎍ 오리새 자사기준 0.5㎍
마늘 자사기준 0.5㎍ 우유 자사기준 0.5㎍
돼지고기 자사기준 0.3㎍ 복숭아 자사기준 0.5㎍
참치 자사기준 0.5㎍ 감자 자사기준 0.5㎍
Alternaria alternate 자사기준 0.5㎍ 돼지풀 자사기준 0.5㎍
개 자사기준 0.5㎍ 계란흰자 자사기준 0.5㎍
참깨 자사기준 0.5㎍ 밀 자사기준 0.5㎍
Cladosporium herbarum 자사기준 0.5㎍ 게 자사기준 0.3㎍
Aspergillus fumigateus 자사기준 0.3㎍ 보리 자사기준 0.5㎍
땅콩 자사기준 0.2㎍ 갈대 자사기준 0.5㎍
소고기 자사기준 0.5㎍ 바퀴벌레 자사기준 0.5㎍
향기풀 자사기준 0.5㎍ 큰조아재비 자사기준 0.3㎍
새우 자사기준 0.5㎍ 메밀 자사기준 0.5㎍
사과 자사기준 0.5㎍ 집먼지 자사기준 0.5㎍
이 후, Ether를 조심스럽게 따라내고, 다시 fresh ether를 넣어주어, 상기 과정을 3회 반복하여 탈지(Defatting) 시켜 각각의 샘플을 준비하였다. 이후, i) 상기 각각의 샘플을 PBS(pH 8.0)과 1:5(v/v)의 비율로 혼합한 후, 얼음 상에서 Polytron Homogenizer를 이용하여 추출하고, 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션시키거나, ii) 상기 샘플에 5배 부피의 COCA’s solution을 첨가한 후 4℃에서 24시간 동안 회전하면서 인큐베이션시켰다.
이 후, 4℃, 15,000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 그 상등액을 분리한 후, 와트만 용지(whatman paper)를 이용하여 걸러주었다. 이후, 상기 샘플을 0.1 x PBS(pH 7.5)를 이용하여 24 내지 48시간 동안 투석시켰다. 투석시킨 샘플을 그 상태로 냉장실에서 대기건조(air dry)시키면서, 부피가 1/10 정도로 줄어들 때까지 말렸다. 4℃, 15,000 rpm으로 1시간 동안 원심분리 한 후, 45 ㎛ Syringe Filter를 이용하여 걸러주었다. 이후, Bradford assay를 이용하여 단백질을 정량하고, 동결건조시켰다.
(2) Pep-6에 결합하는 항체의 제조
1) 항체의 역가 확인
상기 Pep-6 펩티드와 결합하는 항체를 발견하고 이를 이용한 단일클론 항체 세포주 확립 후 세포 배양액을 이용하여 항체의 역가 확인 시험을 실시하였다. 이 때, Pep-6의 캐리어로서 KLH 단백질을 사용하였다.
clone Pep6-KLH human IgE KLH
8-7_100cell 1.5540 0.4070 0.0660
59-3_500cell 1.3840 0.1000 0.0670
67-2_500cell 1.5000 0.2470 0.0670
140-13_500cell 1.5090 0.3320 0.0650
213-1_100cell 1.3890 0.1310 0.0660
285-1_100cell 1.5030 0.2150 0.0630
302-2_100cell 1.4480 0.3030 0.0670
370-7_500cell 0.9040 0.0620 0.0640
373-3_500cell 1.5030 0.1770 0.0670
405-1_100cell 1.4370 0.2020 0.0640
H5-14_500cell 1.4040 0.2130 0.0630
H8-1_500cell 1.3990 0.0830 0.0640
563-5(seperating) 1.4420 0.1210 0.0640
Blank 0.0610 0.0580 0.0580
Plate coating: Pep-6-KLH, Human IgE, KLH
Blank: 세포 배양액이 첨가되지 않은 negative control
그 결과, 상기 표 5와 같은 결과를 확인할 수 있었고, 8-7_100cell, 140-13_500cell, 302-2_100cell이 KLH에는 결합하지 않고, 재조합 IgE whole protein에는 결합력을 가지며, pep-6-KLH에 높은 결합력을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
2) 기판매 항체와의 성능 비교
상기 항체의 역가 확인에서 Pep-6-KLH에 결합력이 높았던 8-7_100cell, 140-13_500cell, 302-2_100cell을 기판매되고 있는 항 IgE 항체와의 성능 비교 시험을 진행하였다(표 6).
clone Pep6-KLH Human IgE KLH
8-7_100cell 1.7200 0.4420 0.0820
59-3_500cell 1.5030 0.1440 0.0840
67-2_500cell 1.5930 0.2330 0.0870
140-13_500cell 1.6540 0.3670 0.0850
213-1_100cell 1.5020 0.1410 0.0810
285-1_100cell 1.5730 0.2240 0.0770
302-2_100cell 1.5370 0.3450 0.0740
370-7_500cell 1.0410 0.0820 0.0790
373-3_500cell 1.6430 0.2120 0.0880
405-1_100cell 1.5620 0.2220 0.1090
H5-14_500cell 1.5510 0.2590 0.0850
H8-1_500cell 1.4720 0.1060 0.0830
563-5(seperating) 1.5450 0.1530 0.0820
anti-IgE(2ug/ml, 판매제품) 0.0800 0.4940 0.0760
blank 0.0800 0.0740 0.0770
그 결과, 상기 표 8에서 나타난 바와 같이, 항체 3종(8-7_100cell, 140-13_500cell, 302-2_100cell)은 기판매되고 있는 항체와 다른 결합 부위를 가지는 항체이나 재조합 IgE에 대한 결합력은 유사한 정도임을 알 수 있었고, 상기 항체 3종(8-7_100cell, 140-13_500cell, 302-2_100cell)을 키트의 제조에 사용할 수 있다고 판단되었다.
3) 선별된 항체의 native IgE에 대한 결합력 확인
키트 제조에 사용된 항체의 선별 기준은 재조합 IgE에 대한 결합력이 판매제품과 유사한 세 종의 항체(8-7_100cell, 140-13_500cell, 302-2_100cell)를 선정하였다. 또한 세 종의 항체가 혈액 내 존재하는 native IgE에 대한 결합력의 정도를 확인하기 위하여 아래의 방법으로 ELISA 시험을 통하여 확인하였다.
판매되고 있는 human IgE에 대한 항체 2 ㎍/㎖을 well당 100 ㎕씩 4℃에서 18시간 동안 반응시켜 코팅하였다. 다음날 블로킹 버퍼(blocking buffer)를 이용하여 실온에서 1시간 동안 반응(blocking)시켰다. 블로킹이 진행되는 동안 상용화 되어 있는 biotinylation kit의 사용 설명에 따라 선별한 세 종의 항체를 biotinylation하였다. 이후, 재조합 IgE 단백질과 알레르기가 있는 것으로 판정된 환자 혈청을 각 웰에 10 ㎕를 분주한 후, 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 플레이트는 PBST를 사용하여 세척한 후 HRP가 컨쥬게이션(conjugation)되어 있는 straptavidin을 1:5000 비율로 희석하여 웰에 100 ㎕를 분주하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, PBST를 사용하여 세척하고, TMB 용액을 분주하여 15분간 반응 시킨 후 반응 정지액을 사용하여 반응을 종결하였다. 450/620 nm에서 흡광도 값을 측정하여 선별한 항체들의 재조합 IgE, native IgE에 결합 정도를 확인하였다.
recombinant serum Y serum L
농도(10 ug/ml) 8-7-100cell 140-13-500cell 302-2-100cell 8-7-100cell 140-13-500cell 302-2-100cell 8-7-100cell 140-13-500cell 302-2-100cell
10 0.615 0.61 0.612 1.374 1.375 1.374 1.43 1.431 1.430
5 0.504 0.507 0.505 1.077 1.082 1.079 1.133 1.138 1.135
2.5 0.416 0.403 0.409 0.847 0.859 0.853 0.903 0.915 0.909
1.25 0.317 0.307 0.312 0.616 0.614 0.615 0.672 0.67 0.671
0.625 0.224 0.214 0.219 0.384 0.375 0.379 0.44 0.431 0.435
0.3125 0.132 0.129 0.130 0.185 0.173 0.179 0.241 0.229 0.235
Blank 0.041 0.047 0.055 0.04 0.039 0.038 0.038 0.038 0.038
시험 결과 상기 표 7에 나타나는 것처럼 선별한 항체들 3종은 재조합 IgE, native IgE에 결합하였음을 확인할 수 있었고, 항체 3종 모두 키트의 제조에 사용할 수 있다고 판단되었다.
(3) 골드 접합체의 준비
염화금산과 환원제를 사용하여 직경 40 내지 60 nm의 콜로이드성 금 입자를 제조하였다. 콜로이드성 금 입자를 520 ㎚에서 OD값이 1.0 ± 1.0이 되도록 3차 증류수를 첨가한다. 골드 용액 1 ml에 실시예 1-2에서 준비한 단일클론 anti-Human IgE 항체 5 ㎍ 내지 15 ㎍을 첨가한 후 실온에서 1시간 동안 진탕 반응시켰다. 반응이 완료된 금 입자를 세척하고 흡광도계를 이용하여 520 ㎚에서 측정하여 정량한 후 농도가 OD값 5.0 ± 1.0이 되도록 희석하고 보존제를 첨가하였다.
(4) 키트 및 디바이스의 제작
봉산염 완충액을 사용하여 실시예 1-(1)에서 준비한 알레르겐 항원은 5 ㎎/㎖로 각각 희석하고 anti-mouse IgG는 2 ㎎/㎖로 희석하여 자동 정량 분주기를 사용하여 검사선 및 대조선 위치에 각각 분주하여 멤브레인을 코팅하였다. 이후, 상기 코팅된 멤브레인을 확인 검사대에 올려놓고, 각 코팅액이 정상적으로 분주되었는지 전량 육안으로 검사하였다. 정상적으로 분주된 멤브레인을 1시간 이상 37±2℃에서 항온 건조한 후, 조립 전까지 밀봉하여 제습된 상태로 보관하였다.
상기 실시예 1-(3)에서 제조한 골드 접합체를 안정제와 혼합하여 유리섬유에 균질하게 흡수시켰다. 이때, 유리섬유 1.1 ㎝ x 0.4 ㎝ 당 19.63 ㎕를 사용하므로, 한 개의 디바이스에는 단일클론 anti-Human IgE 항체 골드 접합체가 14.59 ± 1.06 ㎍ 원액 기준 질량으로 첨가된다. 37±2℃에서 1시간 건조된 유리섬유를 조립 전까지 밀봉하여 제습 상태로 보관하였다.
상기에서 코팅한 멤브레인의 하단에 접합체 패드와 검체 패드를 순차적으로 중첩되도록 하여 부착하고 상단에선 흡수 패드를 부착하였다. 전용 절삭기를 사용하여 (45 ± 5.2) ㎜ x (4.4 ± 1.5) ㎜ 규격으로 절단하고 디바이스 조립 전까지 방습 포장하여 보관하였다. 이후, 절단한 스트립을 하부 플라스틱 디바이스 위에 놓은 후 상부 플라스틱 디바이스를 덮고 건조된 실리카겔과 함께 은박포에 넣어 밀봉 포장하였다.
[실험예]
검출한계 확인
상기 실시예 2에서 제작한 키트의 검출한계를 확인하기 위하여, immuno-CAP 검사에서 양성(3.5 IU/㎖ 이상) 판정을 받은 검체를 원액, 2배, 4배, 8배, 16배, 32배 희석한 후, 각 알레르겐에 대한 검체를 3회 반복하여 표준 시험법에 따라 시험하고, 판정기준에 따라 판정하고 그 결과를 하기 표 8에 나타냈다.
알레르겐 strip No. 검체번호 검사방법(판정) 1X 2X 4X 8X 16X 32X
Total IgE hA-SP040-3 Immuno_CAP (IU/ml) 213.0 106.50 53.25 26.63 13.31 6.66
SSmarTEST 양성 양성 음성 음성 음성 음성
자작나무 1-2 hA-SP022-1 Immuno_CAP (IU/ml) 73.36 36.68 18.34 9.17 4.59 2.29
SSmarTEST 양성 양성 양성 양성 양성 음성
오리새 1-3 hA-SP026-1 Immuno_CAP (IU/ml) 8.70 4.35 2.18 1.09 0.54 0.27
SSmarTEST 양성 양성 음성 음성 음성 음성
향기풀 1-4 hA-SP017-3 Immuno_CAP (IU/ml) 9.04 4.52 2.26 1.13 0.57 0.28
SSmarTEST 양성 양성 음성 음성 음성 음성
호밀풀 1-5 hA-SP003-2 Immuno_CAP (IU/ml) 31.40 15.70 7.85 3.93 1.96 0.98
SSmarTEST 양성 양성 양성 양성 음성 음성
참나무 1-6 hA-SP004-2 Immuno_CAP (IU/ml) 4.07 2.04 1.02 0.51 0.25 0.13
SSmarTEST 양성 음성 음성 음성 음성 음성
오리나무 1-7 hA-SP021-3 Immuno_CAP (IU/ml) 4.21 2.11 1.05 0.53 0.26 0.13
SSmarTEST 양성 음성 음성 음성 음성 음성
돼지풀 1-8 hA-SP030-1 Immuno_CAP (IU/ml) 16.30 8.15 4.08 2.04 1.02 0.51
SSmarTEST 양성 양성 양성 음성 음성 음성
쑥 1-9 hA-SP005-2 Immuno_CAP (IU/ml) 4.38 2.19 1.10 0.55 0.27 0.14
SSmarTEST 양성 음성 음성 음성 음성 음성
D.P. 1-10 hA-SP001-4 Immuno_CAP (IU/ml) 57.05 28.53 14.26 7.13 3.57 1.78
SSmarTEST 양성 양성 양성 양성 양성 음성
사과 2-1 hA-SP019-2 Immuno_CAP (IU/ml) 4.42 2.21 1.11 0.55 0.28 0.14
SSmarTEST 양성 음성 음성 음성 음성 음성
메일 2-2 hA-SP037-1 Immuno_CAP (IU) 5.91 2.96 1.48 0.74 0.37 0.18
SSmarTEST 양성 음성 음성 음성 음성 음성
바퀴벌레 2-3 hA-SP038-1 Immuno_CAP (IU/ml) 4.35 2.18 1.09 0.54 0.27 0.14
SSmarTEST 양성 음성 음성 음성 음성 음성
Aspergillus fumigateus 2-4 hA-SP014-2 Immuno_CAP (IU/ml) 8.15 4.08 2.04 1.02 0.51 0.25
SSmarTEST 양성 양성 음성 음성 음성 음성
Cladosporium herbarum 2-5 hA-SP013-3 Immuno_CAP (IU/ml) 4.92 2.46 1.23 0.62 0.31 0.15
SSmarTEST 양성 음성 음성 음성 음성 음성
Alternaria alternate 2-6 hA-SP010-2 Immuno_CAP (IU/ml) 9.28 4.64 2.32 1.16 0.58 0.29
SSmarTEST 양성 양성 음성 음성 음성 음성
환삼덩굴 2-7 hA-SP006-2 Immuno_CAP (IU/ml) 7.45 3.73 1.86 0.93 0.47 0.23
SSmarTEST 양성 양성 음성 음성 음성 음성
갈대 2-8 hA-SP035-2 Immuno_CAP (IU/ml) 4.37 2.19 1.09 0.55 0.27 0.14
SSmarTEST 양성 음성 음성 음성 음성 음성
큰조아재비 2-9 hA-SP036-1 Immuno_CAP (IU/ml) 3.90 1.95 0.98 0.49 0.24 0.12
SSmarTEST 양성 음성 음성 음성 음성 음성
D.F. 2-10 hA-SP002-2 Immuno_CAP (IU/ml) 60.20 30.10 15.05 7.53 3.76 1.88
SSmarTEST 양성 양성 양성 양성 양성 음성
밀 3-1 hA-SP032-2 Immuno_CAP (IU/ml) 47.23 23.62 11.81 5.90 2.95 1.48
SSmarTEST 양성 양성 양성 양성 음성 음성
마늘 3-2 hA-SP007-3 Immuno_CAP (IU/ml) 7.57 3.79 1.89 0.95 0.47 0.24
SSmarTEST 양성 양성 음성 음성 음성 음성
우유 3-3 hA-SP027-1 Immuno_CAP (IU/ml) 32.07 16.04 8.02 4.01 2.00 1.00
SSmarTEST 양성 양성 양성 양성 음성 음성
참깨 3-4 hA-SP012-2 Immuno_CAP (IU/ml) 4.06 2.03 1.02 0.51 0.25 0.13
SSmarTEST 양성 음성 음성 음성 음성 음성
땅콩 3-5 hA-SP015-3 Immuno_CAP (IU/ml) 20.66 10.33 5.17 2.58 1.29 0.65
SSmarTEST 양성 양성 양성 음성 음성 음성
감자 3-6 hA-SP029-2 Immuno_CAP (IU/ml) 3.81 1.91 0.95 0.48 0.24 0.12
SSmarTEST 양성 음성 음성 음성 음성 음성
대두콩 3-7 hA-SP023-1 Immuno_CAP (IU/ml) 30.60 15.30 7.65 3.83 1.91 0.96
SSmarTEST 양성 양성 양성 양성 음성 음성
계란흰자 3-8 hA-SP031-3 Immuno_CAP (IU/ml) 29.15 14.58 7.29 3.64 1.82 0.91
SSmarTEST 양성 양성 양성 양성 음성 음성
고양이 3-9 hA-SP020-2 Immuno_CAP (IU/ml) 76.83 38.42 19.21 9.60 4.80 2.40
SSmarTEST 양성 양성 양성 양성 양성 음성
집먼지 3-10 hA-SP039-2 Immuno_CAP (IU/ml) 15.46 7.73 3.87 1.93 0.97 0.48
SSmarTEST 양성 양성 양성 음성 음성 음성
복숭아 4-1 hA-SP028-1 Immuno_CAP (IU/ml) 8.92 4.46 2.23 1.12 0.56 0.28
SSmarTEST 양성 양성 음성 음성 음성 음성
보리 4-2 hA-SP034-1 Immuno_CAP (IU/ml) 4.02 2.01 1.01 0.50 0.25 0.13
SSmarTEST 양성 음성 음성 음성 음성 음성
대구 4-3 hA-SP025-1 Immuno_CAP (IU/ml) 4.50 2.25 1.13 0.56 0.28 0.14
SSmarTEST 양성 음성 음성 음성 음성 음성
돼지고기 4-4 hA-SP008-1 Immuno_CAP (IU/ml) 7.37 3.69 1.84 0.92 0.46 0.23
SSmarTEST 양성 양성 음성 음성 음성 음성
호두 4-5 hA-SP024-1 Immuno_CAP (IU/ml) 72.90 36.45 18.23 9.11 4.56 2.28
SSmarTEST 양성 양성 양성 양성 양성 음성
게 4-6 hA-SP033-1 Immuno_CAP (IU/ml) 8.60 4.30 2.15 1.08 0.54 0.27
SSmarTEST 양성 양성 음성 음성 음성 음성
참치 4-7 hA-SP009-1 Immuno_CAP (IU/ml) 3.97 1.99 0.99 0.50 0.25 0.12
SSmarTEST 양성 음성 음성 음성 음성 음성
소고기 4-8 hA-SP016-2 Immuno_CAP (IU/ml) 5.89 2.95 1.47 0.74 0.37 0.18
SSmarTEST 양성 음성 음성 음성 음성 음성
새우 4-9 hA-SP018-3 Immuno_CAP (IU/ml) 3.90 1.95 0.98 0.49 0.24 0.12
SSmarTEST 양성 음성 음성 음성 음성 음성
개 4-10 hA-SP011-2 Immuno_CAP (IU/ml) 58.47 29.24 14.62 7.31 3.65 1.83
SSmarTEST 양성 양성 양성 양성 양성 음성
그 결과, 표 8에 나타난 바와 같이, 각 알레르겐 별로 복수의 검체를 5 단계로 희석하여 희석 검체당 3회 반복 시험하였으며 시험 3회 모두에서 양성 판정이 된 검체로서 Immuno-Cap 정량값이 최저값을 나타내는 값을 각 알레르겐의 검출한계로 설정하였다. 즉, 일 구체예에 따른 키트의 검출 한계는 정량값 2 내지 8ng 범위 이상에서 양성으로 판정하였으나, 1.68 내지 8.39ng의 검체를 모두 양성으로 판정하지는 못하였기 때문에 EIA class 기준으로 정량값 8.4ng 이상을 검출한계로 설정하였다.
정밀도 및 정확도 확인
상기 실시예 2에서 제작한 키트의 (1) 시험자간, (2) 시험일간, (3) 시험(Lot)간, (4) 동일시험일, 시험 장소간 알레르겐에 대한 정확도를 판정하기 위하여 표준시험법에 따라 테스트하였다. 알레르겐에 대한 음성표준물질 및 양성표준물질을 각각 준비하여 하기의 시험 방법으로 테스트를 진행하였으며, 그 결과를 하기 표 9에 나타냈다.
(1) 시험자 간
상기 실시예 2에서 제작한 키트에 대하여 3명의 각기 다른 시험자가 각각 음성표준물질 및 양성표준물질을 사용하여 시험하고, 그 결과를 분석하였다.
(2) 시험일 간
상기 실시예 2에서 제작한 키트에 대하여 한 명의 시험자가 각각 음성표준물질 및 양성표준물질을 사용하여 1일 간격으로 총 5일 동안 시험하여, 그 결과를 분석하였다.
(3) 시험(Lot) 간
상기 실시예 2에서 제작한 키트 3개에 대하여 한 명의 시험자가 각각 음성표준물질 및 양성표준물질을 사용하여 시험하고, 그 결과를 분석하였다.
(4) 동일 시험일(시험 장소) 간
상기 실시예 2에서 제작한 키트에 대하여 한 명의 시험자가 각기 다른 세 곳의 장소(실험실, QC실 등)에서 음성표준물질 및 양성표준물질을 사용하여 시험하고, 그 결과를 분석하였다.
시험항목 시험구분 시험결과
음성표준물질 양성표준물질
저양성 고양성
시험내(시험자)간 시험자 1 3/3* 3/3** 3/3**
시험자 2 3/3* 3/3** 3/3**
시험자 3 3/3* 3/3** 3/3**
시험일간 2017.06.19 3/3* 3/3** 3/3**
2017.06.20 3/3* 3/3** 3/3**
2017.06.21 3/3* 3/3** 3/3**
2017.06.22 3/3* 3/3** 3/3**
2017.06.23 3/3* 3/3** 3/3**
시험(Lot) 간 huAL1706-001 3/3* 3/3** 3/3**
huAL1706-002 3/3* 3/3** 3/3**
huAL1706-003 3/3* 3/3** 3/3**
동일시험일(시험장소)간 유전체의학연구소 품질관리실 3/3* 3/3** 3/3**
대사체사업부 연구실 3/3* 3/3** 3/3**
QC 사업부 연구실 3/3* 3/3** 3/3**
동일인 시험자 1 36/36* 36/36** 36/36**
Abb.: *, 음성판정 키트수/시험키트수, **, 양성판정 키트수/시험키트수
그 결과, 표 9에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 디바이스는 동일인, 시험자, 시험일, Lot간 및 시험 장소간에 관계없이 음성표준물질을 이용한 시험에서는 음성으로, 양성표준물질을 이용한 시험에서는 양성으로 동일한 시험 결과가 나타남을 확인할 수 있었다.
특이도 확인
위양성/위음성 여부의 확인
검체 내에 존재하는 물질에 따른 간섭효과를 측정하기 위하여, 음성표준물질 및 양성표준물질에 하기 표 10의 물질을 첨가하여 위양성(false positive) 및 위음성(false negative) 여부를 시험하였으며, 그 결과를 하기 표 11에 나타냈다.
시험물질 농도
인간 알부민 20 g/dL
시트르산나트륨 500 ㎎/dL
시아노코발라민(비타민 B12) 1 ㎎/dL
빌리루빈 20 ㎎/dL
EDTA 800 ㎎/dL
글루코오스 10 g/dL
아스코르브산 521 ㎎/dL
헤모글로빈 250 ㎎/dL
　 1차시험 2차시험 3차시험
음성표준물질 양성표준물질 음성표준물질 양성표준물질 음성표준물질 양성표준물질
인간 알부민 음성 양성 음성 양성 음성 양성
시트르산 나트륨 음성 양성 음성 양성 음성 양성
시아노코발라민 음성 양성 음성 양성 음성 양성
빌리루빈 음성 양성 음성 양성 음성 양성
EDTA 음성 양성 음성 양성 음성 양성
글루코오스 음성 양성 음성 양성 음성 양성
아스코르브산 음성 양성 음성 양성 음성 양성
헤모글로빈 음성 양성 음성 양성 음성 양성
이때, 위양성이란, 간섭물질에 의해 음성표준물질이 양성으로 판명되는 것을 의미하고, 위음성이란, 간섭물질이 포함되어 있는 양성표준물질이 간섭물질의 영향으로 음성으로 판정되는 것을 의미한다.
그 결과, 표 11에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 키트는 간섭 물질 8가지에 대한 영향이 모두 없는 것을 확인할 수 있었다.
교차 반응 여부의 확인
또한, 검사과정에서 사용되는 항체와 검체 내에 존재 가능한 면역글로불린 아종의 비특이적인 결합으로 인한 교차 반응 유/무를 확인하기 위하여 음성표준물질에 IgA, IgM, IgG, 및 IgD를 각각 3 ㎎/㎖ 첨가하여 표준시험법에 따라 시험하고 판정기준에 따라 판정하였다.
그 결과, IgA, IgM, IgG, 및 IgD를 첨가한 음성표준물질은 모두 음성으로 나타나 간섭반응이 없음을 확인할 수 있었다.
기판매 제품과의 유니캡 검사 비교
실시예 1-2에 따라 제조 및 선별된 항체 3종 중 8-7_100 cell를 이용하여 실시예 2에 따라 알러지 kit를 제조하여 기판매중인 키트(LG, Alloscan)와 알레르겐 39종 중 발생 빈도수가 높은 알레르겐 13종(유럽집먼지진드기(DP), 북아메리카집먼지진드기(DF), 고양이, 집먼지, 개, 자작나무, alternaria, 복숭아, 사과, 호밀풀, 향기풀, 오리새, 큰조아재비, 참나무, 계란흰자, 감자)에 대한 일치율 확인 시험을 진행하였다. 시험은 13종에 대해 하나 이상의 알러젠에 대해 양성을 보이는 160 검체를 사용하였으며 불일치를 보이는 검체는 제 3의 검사법이면서 알레르기 검사에 있어 표준 시험법으로 간주되는 유니캡 검사를 진행하여 결과를 판정하였다. 기판매제품 키트를 이용한 시험과 유니캡 검사는 수탁기관에 의뢰하여 실시하였으며 자체 개발한 키트는 두 명의 검사원이 검사하는 형태로 자체 실시하였다(표 12).
결과값 음성, 양성으로 표기
No. Allergen 환자명 LG 마스트 SLSbio 유니캡 SLS:유니캡
1 DP 검체 1 + + + 일치
2 검체2 + + + 일치
3 검체 3 + + + 일치
4 검체 4 + + + 일치
5 검체 5 + - - 일치
6 검체 6 + - + 불일치
7 검체 7 + - - 일치
8 검체 8 + - - 일치
9 검체 9 + - - 일치
10 검체 10 + + + 일치
11 DF 검체 11 + + + 일치
12 검체 12 + + + 일치
13 검체 13 + + + 일치
14 검체 14 + - - 일치
15 검체 15 + - - 일치
16 검체 16 + + + 일치
17 검체 17 + - - 일치
18 검체 18 + - - 일치
19 검체 19 + + + 일치
20 검체 20 + + + 일치
21 검체 21 + + + 일치
22 검체 22 + - - 일치
23 검체 23 + + + 일치
24 고양이 검체 24 + - - 일치
25 검체 25 + + - 불일치
26 검체 26 + - - 일치
27 검체 27 + + + 일치
28 검체 28 + + - 불일치
29 검체 29 + - - 일치
30 검체 30 + - - 일치
31 검체 31 + - - 일치
32 검체 32 + + + 일치
33 검체 33 + - - 일치
34 검체 34 + + + 일치
35 검체 35 + + + 일치
36 검체 36 + - + 불일치
37 집먼지 검체 37 + - - 일치
38 검체 38 + - - 일치
39 검체 39 + - - 일치
40 검체 40 + - - 일치
41 검체 41 + - - 일치
42 검체 42 + - - 일치
43 검체 43 + - - 일치
44 검제 44 + - - 일치
45 검체 45 + - - 일치
46 개 검체 46 + - - 일치
47 검체 47 + - - 일치
48 검체 48 + - - 일치
49 검체 49 + - - 일치
50 검체 50 + - - 일치
51 검체 51 + - - 일치
52 검체 52 + + + 일치
53 검체 53 + - - 일치
54 검체 54 + - - 일치
55 검체 55 + + + 일치
56 검체 56 + + + 일치
57 검체 57 + - + 불일치
58 검체 58 + + + 일치
59 자작나무 검체 59 + + + 일치
60 검체 60 + - - 일치
61 검체 61 + - + 불일치
62 검체 62 + - + 불일치
63 검체 63 + + + 일치
64 검체 64 + - + 불일치
65 검체 65 + + + 일치
66 Alternaria 검체 66 + - + 불일치
67 검체 67 + - + 불일치
68 검체 68 + - + 불일치
69 검체 69 + - + 불일치
70 검체 70 + - + 불일치
71 복숭아 검체 71 + - - 일치
72 검체 72 + - - 일치
73 거멫 73 + - - 일치
74 사과 검체 74 + - + 불일치
75 검체 75 + - + 불일치
76 호밀풀 검체 76 + - - 일치
77 참나무 검체 77 + - - 일치
78 계란흰자 검체 78 + + + 일치
79 검체 79 + + - 불일치
80 검체 80 + + + 일치
81 검체 81 + - - 일치
82 검체 82 + + + 일치
그 결과 표 12에 나타난 바와 같이, 160개의 검체 중 52개의 검체에서 불일치가 나왔으며 불일치가 나온 검사 중 유니캡 시험 결과 자체 개발한 항체를 이용한 키트와의 일치는 36개 검체이며 기판매중인 키트를 이용한 검사와 일치되는 검체는 16개였다.
상기 결과는 실시예 2에 따른 항체를 이용한 알레르기 검사 키트가 항체의 비특이 반응 혹은 알러젠과의 결합력이 우수하여 일치율이 높은 것을 의미한다는 것을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (16)

  1. 면역글로불린 E(Immunoglobulin E: IgE)의 에피토프(epitope)인 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
  2. 청구항 1의 펩티드에 결합하는 항 면역글로불린 E 항체.
  3. 청구항 2의 항체를 포함하는 시료 중 면역글로불린 E를 분석하기 위한 키트.
  4. 청구항 3에 있어서, 담체 또는 희석제를 더 포함하는 것인 키트.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 시료는 개체를 알레르겐과 접촉시킨 후 개체로부터 분리된 생물학적 시료인 것인 키트.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 시료는 접촉 후 10분 내지 40분에 분리된 것인 키트.
  7. 청구항 3에 있어서, 상기 키트는 알레르겐 및 상기 항체가 코팅된 멤브레인을 포함하는 것인 키트.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 알레르겐은 집먼지진드기, 호밀풀, 참나무, 쑥, 환삼덩굴, 마늘, 돼지고기, 참치, 곰팡이, 개, 참깨, 땅콩, 소고기, 향기풀, 새우, 사과, 고양이, 오리나무, 자작나무, 대두콩, 호두, 대구, 오리새, 우유, 복숭아, 감자, 돼지풀, 계란흰자, 밀, 게, 보리, 갈대, 바퀴벌레, 메밀 및 집먼지로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것인 키트.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 멤브레인은 니트로셀룰로스, 나일론, 폴리플루오린화비닐리덴(PVDF), 유리 및 플라스틱으로 구성된 군에서 선택되는 것인 키트.
  10. 청구항 3에 있어서, 상기 키트는 면역크로마토그래피 분석용인 것인 키트.
  11. 청구항 3의 키트; 및 검체 적재부를 포함하는 알레르기 진단 또는 예후 예측용 디바이스.
  12. 개체의 혈액을 채취하여 검체 희석액에 혼합하는 단계; 및
    상기 희석액을 검체 적재부에 적재(drop)하여 반응시키는 단계를 포함하는 알레르기 질환의 진단 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 반응은 10 내지 40분 간 이루어지는 것인 방법.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 혈액의 부피는 0.5 ㎖ 내지 2 ㎖인 것인 방법.
  15. 청구항 12에 있어서, 상기 혈액은 혈장 또는 혈청인 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 혈장 또는 혈청의 부피는 0.1 ㎖ 내지 1 ㎖인 것인 방법.
PCT/KR2019/004104 2018-04-06 2019-04-05 신규한 면역글로불린 e의 에피토프, 그와 결합하는 항체 및 상기 항체를 포함하는 시료 중 면역글로불린 e를 분석하기 위한 키트 WO2019194656A1 (ko)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA3096363A CA3096363C (en) 2018-04-06 2019-04-05 Novel epitope of immunoglobulin e, antibody binding thereto, and kit for analyzing immunoglobulin e in sample containing same
JP2021503687A JP7266252B2 (ja) 2018-04-06 2019-04-05 新規の免疫グロブリンｅのエピトープ、それと結合する抗体および前記抗体を含む試料のうち免疫グロブリンｅを分析するためのキット
AU2019247321A AU2019247321A1 (en) 2018-04-06 2019-04-05 Novel epitope of immunoglobulin E, antibody binding thereto, and kit for analyzing immunoglobulin E in sample containing same
CN201980024338.1A CN111936856A (zh) 2018-04-06 2019-04-05 新型免疫球蛋白e的表位、与其结合的抗体及包括所述抗体的用于分析试料中免疫球蛋白e的试剂盒
EP19781906.3A EP3779443A4 (en) 2018-04-06 2019-04-05 NEW IMMUNOGLOBULIN E EPITOPE, BINDING ANTIBODY AND KIT FOR THE ANALYSIS OF IMMUNOGLOBULIN E IN A SAMPLE CONTAINING IT
US17/045,760 US20210055305A1 (en) 2018-04-06 2019-04-05 Novel epitope of immunoglobulin e, antibody binding thereto, and kit for analyzing immunoglobulin e in sample containing same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20180040605 2018-04-06
KR10-2018-0040605 2018-04-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019194656A1 true WO2019194656A1 (ko) 2019-10-10

Family

ID=68101015

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2019/004104 WO2019194656A1 (ko) 2018-04-06 2019-04-05 신규한 면역글로불린 e의 에피토프, 그와 결합하는 항체 및 상기 항체를 포함하는 시료 중 면역글로불린 e를 분석하기 위한 키트

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20210055305A1 (ko)
EP (1) EP3779443A4 (ko)
JP (1) JP7266252B2 (ko)
KR (1) KR102031845B1 (ko)
CN (1) CN111936856A (ko)
AU (1) AU2019247321A1 (ko)
CA (1) CA3096363C (ko)
WO (1) WO2019194656A1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030147906A1 (en) * 1999-07-21 2003-08-07 Smithkline Beecham Biologicals, S.A. Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-3 or C-epsilon-4 domains of lgE, antagonists thereof, and their therapeutic uses
WO2013009210A1 (en) * 2011-07-13 2013-01-17 Uchrezhdenie Rossyskoi Akademii Nauk Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V. A. Engelgardta Ran (Imb Ran) Biological microchip for the estimation of immunoglobulin e and g levels in human blood, method of assay thereof, and reagent kit comprising same
KR20140111192A (ko) * 2013-03-08 2014-09-18 (주)프로테옴텍 다중 진단용 병렬식 라인형 바이오칩
KR20170074241A (ko) * 2014-12-02 2017-06-29 다이호야쿠힌고교 가부시키가이샤 신규 큰다리먼지진드기 단백질

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09501043A (ja) * 1993-04-14 1997-02-04 イミュロジク ファーマスーティカル コーポレイション Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ（室内塵ダニ）由来の主要アレルゲンのｔ細胞エピトープ
CN1202125C (zh) * 1998-11-12 2005-05-18 卫生部上海生物制品研究所 肽免疫原、用其制成的治疗变态反应的疫苗及其制备方法
NZ513680A (en) * 1999-02-25 2001-09-28 Peptide Therapeutics Ltd Epitodes or mimotopes derived from the c-epsilon-3 or c-epsilon-4 domains of IgE, antagonists thereof, and their therapeutic uses
GB0020717D0 (en) * 2000-08-22 2000-10-11 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds and process
JP4578709B2 (ja) * 2001-03-28 2010-11-10 三菱化学メディエンス株式会社 複数項目同時分析可能なイムノクロマトグラフ法及びイムノクロマトグラフ用ストリップ
WO2007103792A2 (en) * 2006-03-02 2007-09-13 The University Of Chicago Methods and compositions for diagnosis and immunotherapy of pollen allergy
GB2490652A (en) * 2011-04-18 2012-11-14 Microtest Matrices Ltd Methods of quantifying antibodies, especially IgE antibodies in a sample
ES2831723T3 (es) * 2012-06-15 2021-06-09 Immunomic Therapeutics Inc Acidos nucleicos para tratar alergias
DE102014222214A1 (de) * 2014-10-30 2016-05-04 Robert Bosch Gmbh Integrierte Halbleiterschaltung

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030147906A1 (en) * 1999-07-21 2003-08-07 Smithkline Beecham Biologicals, S.A. Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-3 or C-epsilon-4 domains of lgE, antagonists thereof, and their therapeutic uses
WO2013009210A1 (en) * 2011-07-13 2013-01-17 Uchrezhdenie Rossyskoi Akademii Nauk Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V. A. Engelgardta Ran (Imb Ran) Biological microchip for the estimation of immunoglobulin e and g levels in human blood, method of assay thereof, and reagent kit comprising same
KR20140111192A (ko) * 2013-03-08 2014-09-18 (주)프로테옴텍 다중 진단용 병렬식 라인형 바이오칩
KR20170074241A (ko) * 2014-12-02 2017-06-29 다이호야쿠힌고교 가부시키가이샤 신규 큰다리먼지진드기 단백질

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3779443A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021517972A (ja) 2021-07-29
US20210055305A1 (en) 2021-02-25
EP3779443A1 (en) 2021-02-17
EP3779443A4 (en) 2022-05-04
CA3096363A1 (en) 2019-10-10
CA3096363C (en) 2024-04-16
CN111936856A (zh) 2020-11-13
KR102031845B1 (ko) 2019-10-15
AU2019247321A1 (en) 2020-10-22
JP7266252B2 (ja) 2023-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0216191B1 (en) Immunoassay for htlv-iii antigens
Esch Allergen source materials and quality control of allergenic extracts
WO2018092969A1 (ko) 지카 바이러스의 표피단백질과 비구조단백질 1에 특이적인 단클론항체를 이용한 지카 바이러스 항체의 검출방법 및 지카 바이러스 항체 검출을 위한 신속진단키트
CN112679605B (zh) 针对新型冠状病毒核衣壳蛋白的抗体或其抗原结合片段及其应用
WO2003031971A1 (fr) Reactif pour detecter un facteur de risque de la maladie d'alzheimer, necessaire de detection a cet effet, et procede de detection du facteur de risque de la maladie d'alzheimer au moyen de ce necessaire
Abd-Alla et al. Serum IgM antibody response to the galactose-inhibitable adherence lectin of Entameoba histolytica.
WO2007001895A2 (en) Monoclonal antibodies, hybridoma cell lines, methods and kits for detecting phytase
CN110361547A (zh) 一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂及其检测方法和其在检测下消化道健康的用途
US20040106146A1 (en) Immunochemical methods
US20060177876A1 (en) Monoclonal antibody against asialo alpha 1-acid glycoprotein, immunochromatographic strip comprising the monoclonal antibody, and method for diagnosing liver diseases using the immunochromatographic strip
CA2109088A1 (en) Methods to detect and treat diseases caused by bacterial allergens
WO2015037907A1 (ko) Ast 양의 측정을 통한 간 질환 진단, 예후 또는 모니터링 키트 및 방법
US5210019A (en) Pseudomonas screening assay
WO2019194656A1 (ko) 신규한 면역글로불린 e의 에피토프, 그와 결합하는 항체 및 상기 항체를 포함하는 시료 중 면역글로불린 e를 분석하기 위한 키트
WO2019013392A1 (ko) En2 단백질을 특이적으로 인식하는 특정 항원으로부터 얻어진 단클론 항체 또는 이를 함유하는 전립선암 진단용 조성물
WO2019013394A1 (ko) En2 단백질을 특이적으로 인식하는 단클론 항체 또는 이를 함유하는 전립선암 진단용 조성물
Batra et al. Dot-enzyme linked immunosorbent assay for the detection of antibodies in bovine brucellosis
Sirisinha et al. Immunodiagnosis of opisthorchiasis
EP2287607B1 (en) Method for quantification of antigen-specific canine or human ige
Maleewong Recent advances in diagnosis of paragonimiasis
KR20060027404A (ko) 사료 효소 검출 시약, 방법 및 키트
JP6357425B2 (ja) 干渉ペプチド及び微生物の検出方法
Mahfouz et al. Evaluation of different immunological techniques for diagnosis of Schistosomiasis haematobium in Egypt
WO2023277599A1 (ko) 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물
Payne et al. Enzyme-linked immunosorbent assays for the measurement of specific antibodies in experimentally induced ovine toxoplasmosis

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19781906

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3096363

Country of ref document: CA

Ref document number: 2021503687

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019247321

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20190405

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2019781906

Country of ref document: EP