WO2023277599A1 - 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물 - Google Patents
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Images
Classifications
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
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- G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
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- G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints
Definitions
- the present application relates to a biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease.
- Still's disease is a systemic form of juvenile rheumatoid arthritis, which was first described by Still and has yet to be identified, and affects both children and adults.
- Still's disease is mainly based on clinical findings, such as high fever, arthralgia or arthritis, characteristic skin lesions, enlarged lymph nodes, hepatomegaly, splenomegaly, serositis and sore throat, as well as leukocytosis, increased blood needle velocity, and antinuclear. Diagnosis is made through laboratory findings such as antibody negative and rheumatoid factor negative.
- Korean Patent Registration No. 10-1806681 which is the background of the present application, relates to a biomarker composition, diagnostic kit, and diagnostic method for diagnosing Still's disease, and specifically, the expression level of CD11b or CD32 and the frequency ratio of granulocytes to lymphocytes It is disclosed that Still's disease can be diagnosed in children and adults using as an index. However, a method for conveniently diagnosing adult-type Still's disease using TLR2, a diagnostic biomarker composition, and a kit are not mentioned.
- the present application is to solve the problems of the prior art described above, and an object of the present invention is to provide a biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease.
- an object of the present application is to provide a kit for diagnosing adult-type Still's disease comprising an antibody that specifically binds to a TLR2 antigen protein or a TLR7 antigen protein.
- an object of the present application is to provide an information providing method for diagnosing adult-type Still's disease.
- an object of the present application is to provide a screening method for a therapeutic agent for adult-type Still's disease.
- the first aspect of the present application provides a biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease comprising a TLR2 protein.
- the adult type Still's disease may include those in which arthritis is expressed, but is not limited thereto.
- the composition may further include a TLR7 protein, but is not limited thereto.
- a second aspect of the present application provides a kit for diagnosing adult-type Still's disease comprising an antibody that specifically binds to a TLR2 antigen protein or a TLR7 antigen protein.
- the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but is not limited thereto.
- the kit may diagnose adult-type Still's disease by detecting TLR2 protein or TLR7 protein in a sample using an antigen-antibody binding reaction, but is not limited thereto.
- the sample is from the group consisting of whole blood, serum, plasma, tissue, saliva, tears, urine, sputum, lymph, cerebrospinal fluid, intercellular fluid, bone marrow, ascites, and combinations thereof isolated from an individual. It may include a selected one, but is not limited thereto.
- the sample may be peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from an individual, but is not limited thereto.
- PBMC peripheral blood mononuclear cells
- the method for detecting the TLR2 protein or the TLR7 protein is Western blot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), dot blot assay, radioimmunoassay, radioimmuno-diffusion method, oxteroney immunoassay A method selected from the group consisting of diffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FLOW CYTOMETRY ANALYSIS (FACS), protein chip, Sandwich assay, and combinations thereof It may be performed using, but is not limited thereto.
- ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
- dot blot assay assay
- radioimmunoassay radioimmuno-diffusion method
- oxteroney immunoassay A method selected from the group consisting of diffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FLOW CYTOMETRY
- the third aspect of the present application is measuring the frequency of cells expressing TLR2 or TLR7 in a sample of an individual suspected of having adult-type Still's disease; comparing the measured frequency with that of a normal control sample; and diagnosing adult-type Still's disease when the frequency of cells expressing the TLR2 or TLR7 is increased in the sample of the subject suspected of having adult-type Still's disease compared to the control group. provide a method of delivery.
- the sample is from the group consisting of whole blood, serum, plasma, tissue, saliva, tears, urine, sputum, lymph, cerebrospinal fluid, intercellular fluid, bone marrow, ascites, and combinations thereof isolated from an individual. It may include a selected one, but is not limited thereto.
- the sample may be peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from an individual, but is not limited thereto.
- PBMC peripheral blood mononuclear cells
- a fourth aspect of the present application comprises measuring the frequency of cells expressing TLR2 or TLR7 in a sample of an individual suspected of having adult-type Still's disease; processing a candidate substance for the treatment of adult-type Still's disease in the subject; And it provides a screening method for an adult-type Still's disease treatment agent comprising measuring the therapeutic effect of the adult-type Still's disease treatment candidate.
- measuring the therapeutic effect comprises measuring the frequency of cells expressing TLR2 or TLR7 in a sample of an individual treated with the candidate drug substance; Comparing the frequency of cells expressing TLR2 or TLR7 measured in a sample of an individual treated with the candidate drug substance with the frequency of cells expressing the TLR2 or TLR7 measured before the step of treating the drug candidate substance; and when the frequency of cells expressing TLR2 or TLR7 measured in a sample of an individual treated with the candidate drug substance is reduced compared to the frequency of cells expressing the TLR2 or TLR7 measured before the step of treating the drug candidate substance. It may include the step of considering the drug candidate as a drug for adult-type Still's disease, but is not limited thereto.
- the sample is from the group consisting of whole blood, serum, plasma, tissue, saliva, tears, urine, sputum, lymph, cerebrospinal fluid, intercellular fluid, bone marrow, ascites, and combinations thereof isolated from an individual. It may include a selected one, but is not limited thereto.
- the sample may be peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from an individual, but is not limited thereto.
- PBMC peripheral blood mononuclear cells
- the biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease according to the present application can accurately and quickly diagnose adult-type Still's disease, which is difficult to diagnose.
- biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease according to the present invention can accurately and quickly diagnose adult-type Still's disease in which arthritis is expressed.
- biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease can easily diagnose adult-type Still's disease using a non-invasive biological sample without using histological examination or imaging technology, so convenience and economy can be excellent. .
- biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease can be usefully used for disease onset, disease progression, diagnosis and prognosis of the disease
- adult-type still disease that explains the etiology of the disease and reflects the activity of the disease Disease specific biomarkers can be provided.
- biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease can be usefully used for initial diagnosis, discrimination of severity, reflection of disease activity, evaluation of treatment efficacy, confirmation of efficacy of drugs, and identification of other accompanying diseases such as infectious diseases. Therefore, there is an advantage of increasing the treatment efficiency of adult-type Still's disease treatment.
- biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease according to the present invention can be usefully used to distinguish adult-type Still's disease from other mimicers.
- the screening method for adult-onset Still's disease therapeutics according to the present invention can simply and quickly screen the treatment effects of various candidate substances for adult-onset Still's disease, it can be usefully utilized for the development of adult-onset Still's disease therapeutics.
- 1 is a table showing clinical characteristics of clinical test subjects.
- Figure 2 is a table showing the results of measuring the frequency of cells expressing TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 and TLR9 in whole peripheral blood mononuclear cells.
- FIG. 3 is an image showing a representative example of a histogram of flow cytometry analysis of surface-stained cells presenting various TLR markers in whole peripheral blood mononuclear cells of one patient with AOSD.
- Figure 4 is a table showing the correlation between the frequency of stained cells expressing various TLR markers and disease activity markers or systemic scores in AOSD patients.
- FIG. 5 is a table showing various TLR expression levels according to clinical symptoms in AOSD patients.
- 6 is a table showing the skin biopsy results of AOSD patients.
- TLR7 is a table showing the results of TLR1, TLR2, TLR4, TLR7, and TLR9 immunohistochemical staining performed on AOSD patients, eczema patients, psoriasis patients, and controls.
- Figure 8 Inflammatory cell grade (CD4/CD8/CD68 staining) in the skin of AOSD patients; and average percentages of inflammatory cells expressing CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCR3, CXCL12, and CXCR4; and average percentages of inflammatory cells expressing TLR1, TLR2, TLR4, TLR7, and TLR9.
- FIG. 9 is a graph showing the results of evaluating the correlation between TLR markers in the skin of AOSD patients.
- 10 is a table showing the results of lymph node biopsies of AOSD patients.
- TLR1, TLR2, TLR4, TLR7, and TLR9 immunohistochemical staining performed in AOSD patients, T-cell lymphoma patients, histiocytic lymphadenitis patients, tuberculous lymphadenitis patients, non-specific reactive hyperplasia patients, and controls. It is a table.
- Figure 12 Inflammatory cell grade (CD4/CD8 staining) in the skin of AOSD patients; and average percentages of inflammatory cells expressing CXCL10, CXCL13, CXCR3, and S100A8/A9; and average percentages of inflammatory cells expressing TLR1, TLR2, TLR4, TLR7, and TLR9.
- the term "combination thereof" included in the expression of the Markush form means one or more mixtures or combinations selected from the group consisting of the components described in the expression of the Markush form, and the components It means including one or more selected from the group consisting of.
- the first aspect of the present application provides a biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease comprising a TLR2 protein.
- AOSD autism's disease
- Still's disease is mainly based on clinical findings, such as high fever, arthralgia or arthritis, characteristic skin lesions, enlarged lymph nodes, hepatomegaly, splenomegaly, serositis and sore throat, as well as leukocytosis, increased blood needle velocity, and antinuclear. Diagnosis is made through laboratory findings such as antibody negative and rheumatoid factor negative.
- a biomarker is molecular information based on a single molecule or a pattern of molecules derived from DNA, RNA, metabolites, proteins and protein fragments, etc., and detects changes in the body caused by the effects of genetic or epigenetic changes in the body. indicates what can be done.
- Proteomes, as protein biomarkers, are present in the patient's serum and show important value as biomarkers due to the advantage of easy detection.
- the biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease according to the present application can accurately and quickly diagnose adult-type Still's disease, which is difficult to diagnose.
- the composition may further include a TLR7 protein, but is not limited thereto.
- the biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease is to discover, discover, and verify the difference in the frequency of TLR2 or TLR7-expressing cells in a normal person and an adult-type Still's disease patient.
- PBMC peripheral blood mononuclear cells
- TLR2 refers to a protein encoded by the TLR2 gene in humans. TLR2 has also been designated as CD282 (cluster of differentiation 282). TLR2 is one of the Toll-like receptors and plays a role in the immune system. In particular, the sequence of the human TLR2 protein is provided in NCBI database entry NP_003255 (25 May 2014).
- the TLR2 (or Toll-like receptor 2) refers to a protein encoded by the TLR2 gene in humans. TLR2 is one of the Toll-like receptors and plays a role in the immune system. In particular, the sequence of the human TLR2 protein is provided in NCBI database entry NP_003255 dated May 30, 2021.
- the TLR7 (or Toll-like receptor 7) refers to a protein encoded by the TLR7 gene in humans. TLR7 is one of the Toll-like receptors and plays a role in the immune system. In particular, the sequence of human TLR7 protein is provided in NCBI database entry NP_057646 dated May 3, 2021.
- the diagnosis means to confirm the presence or characteristics of a pathological state, to determine the susceptibility of an object, that is, a test subject, to a specific disease or disorder, to determine whether an object currently has a specific disease or disorder.
- determining the prognosis e.g., determining the stage of progression or determining the responsiveness of a disease to treatment
- determining the therametrics e.g., the efficacy of a treatment. monitoring the state of an object to provide information about
- the diagnosis may be interpreted as confirming the onset of adult-type Still's disease, but is not limited thereto.
- the adult type Still's disease may include those in which arthritis is expressed, but is not limited thereto.
- TLR2 frequency of whole cells of adult-type Still's disease patients correlated with the whole body score, LDH level, and ferritin level, and in AOSD patients with arthritis, TLR2 It was confirmed that the expression level was significantly high (Example 3).
- the biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease can accurately and quickly diagnose adult-type Still's disease with specific disease activity markers (whole body score, LDH level and ferritin level) and specific clinical symptoms (arthritis) There are advantages to being
- biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease can easily diagnose adult-type Still's disease using a non-invasive biological sample without using histological examination or imaging technology, so convenience and economy can be excellent. .
- biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease can be usefully used for disease onset, disease progression, diagnosis and prognosis of the disease
- adult-type still disease that explains the etiology of the disease and reflects the activity of the disease Disease specific biomarkers can be provided.
- biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease can be usefully used for initial diagnosis, discrimination of severity, reflection of disease activity, evaluation of treatment efficacy, confirmation of efficacy of drugs, and identification of other accompanying diseases such as infectious diseases. Therefore, there is an advantage of increasing the treatment efficiency of adult-type Still's disease treatment.
- biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease according to the present invention can be usefully used to distinguish adult-type Still's disease from other mimicers.
- the average percentage of TLR2 or TLR7-expressing inflammatory cells is a distinguishing feature from other mimicers. It was confirmed to have (Example 4 and Example 5).
- a second aspect of the present application provides a kit for diagnosing adult-type Still's disease comprising an antibody that specifically binds to a TLR2 antigen protein or a TLR7 antigen protein.
- the antigen refers to a proteinaceous immunogen capable of carrying out antigen-antibody binding with an antibody. These antigens can be synthetically isolated and purified through genetic recombination methods by conventional methods.
- the antibody may be a monoclonal antibody (monoclonal antibody) or a polyclonal antibody (polyclonal antibody), but is not limited thereto.
- the monoclonal antibody may be produced by a technology for generating an immortalized cell line by fusion known to those skilled in the art.
- a mouse is immunized with a protein expressed by the gene or a synthesized peptide is conjugated with bovine serum albumin to immunize a mouse.
- Antigen-producing B lymphocytes isolated from mice are fused with human or mouse myeloma to create an immortalized hybridoma, and an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (enzyme-linked immunosorbent assay) is performed using the hybridoma cells.
- Monoclonal antibodies can be produced by confirming the production of monoclonal antibodies using linked immunoabsorbent assays (ELISA), selecting positive clones, culturing them, isolating and purifying the antibodies, or injecting them into the abdominal cavity of rats and collecting ascites. there is.
- ELISA linked immunoabsorbent assays
- the monoclonal antibody is generally quantified by a color reaction using a secondary antibody coupled with enzymes such as alkaline phosphatase (AP) or horseradish peroxidase (HRP) and their substrates Alternatively, quantification can be performed by directly using a monoclonal antibody against the protein coupled to an AP or HRP enzyme.
- enzymes such as alkaline phosphatase (AP) or horseradish peroxidase (HRP) and their substrates
- AP alkaline phosphatase
- HRP horseradish peroxidase
- antibodies attached with various fluorescent markers including fluorescein isothiocyanat (FITC) and phycoerythrin (PE) may be used.
- FITC fluorescein isothiocyanat
- PE phycoerythrin
- the polyclonal antibody may be prepared by injecting TLR2 or TLR7 protein or a fragment thereof as an immunogen into an external host according to a method known to those skilled in the art.
- External hosts include mammals such as mice, rats, sheep or rabbits.
- the immunogen is injected intramuscularly, intraperitoneally or subcutaneously, and is generally administered together with an adjuvant to increase antigenicity. Serum is regularly collected from an external host to collect serum showing improved titer and antigen specificity, or antibodies are separated and purified therefrom.
- the kit may diagnose adult-type Still's disease by detecting TLR2 protein or TLR7 protein in a sample using an antigen-antibody binding reaction, but is not limited thereto.
- the kit can be used to diagnose the onset of adult-onset Still's disease by measuring the level of TLR2 protein or TLR7 protein in a sample derived from a subject with adult-onset Still's disease.
- the kit analyzes the intensity of the final signal of the sample through the antigen-antibody complex detection process using the antigen-antibody binding reaction, and diagnoses Sjogren's syndrome if it is higher than the signal of the sample of the normal control group, or determines the course of treatment. can do.
- the kit may further include an antigen, antibody, aptamer, one or more other component compositions suitable for the analysis method for measuring the level of the TLR2 or TLR7 protein, a solution, a device, and a combination thereof.
- an antigen, antibody, aptamer one or more other component compositions suitable for the analysis method for measuring the level of the TLR2 or TLR7 protein, a solution, a device, and a combination thereof.
- the kit may be labeled with a labeling material described below, or may use a detection antibody or a secondary antibody, and may further include a buffer solution, a color-developing substrate solution, and the like. , but is not limited thereto.
- the detection antibody specifically binds to human IgG or IgA, and the detection antibody may be labeled with a substance that can be detected using visual or various image detection equipment, but is not limited thereto.
- the antigen or the detection antibody may be a marker such as a peroxidase such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, or beta-galactosidase.
- a peroxidase such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, or beta-galactosidase.
- beta-galactosidase urease, catalase, asparginase, ribonuclease, malate dehydrogenase, staphylococcal nuclease Staphylococcal nuclease, triose phosphate isomerase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glucoamylase or acetylcholine esterase ), but may be labeled with an enzyme capable of catalyzing a chemical reaction in the presence of a specific substrate to emit a detectable color reaction or light, but is not limited there
- the antigen or the detection antibody emits light having a different wavelength from the irradiated light by irradiation of light through bioluminescence, chemiluminescence, electroluminescence, electrochemiluminescence, or photoluminescence.
- a chromophore used in Nesons for example, green fluorescent protein as a protein or fluorescein isothiocyanate as an organic compound, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin ( phycocyanin), allophycocyanin, or fluorecamine, but is not limited thereto.
- the antigen or the detection antibody may be labeled with various radioisotope materials, but is not limited thereto.
- the detection of the labeling material may be performed by, for example, a scintillation counter when the labeling material is a radioisotope, and for example, when the labeling material is a fluorescent material, spectroscopy, a phosphorimaging device, or It can be performed by a method such as a fluorometer, etc., and in the case of labeling with an enzyme, it can be performed by measuring the color development product produced by conversion of a chromogenic substrate by an enzyme in the presence of an appropriate substrate, and Through comparison, it can be detected as a color comparison of color development products produced by an enzymatic reaction, but is not limited thereto.
- the color-developing substrate solution may be ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), OPD (o-phenylenediamine) or TMB (tetramethyl benzidine). It may be, but is not limited thereto.
- the kit may include reagents such as reagents necessary for performing negative and positive control reactions or buffers necessary for hybridization reactions, but is not limited thereto. Optimal amounts of reagents to be used in a particular reaction can be readily determined by one skilled in the art upon reading the present specification.
- the kit of the present invention may include the components described above in separate packages or compartments, but is not limited thereto.
- the antigen is a microwell plate such as a 96-well microwell plate, beads or particles including colloidal gold particles or colored latex particles, or cellulose, nitrocellulose, polyethersulfone, polyvinylidine, It can be attached to membranes such as fluoride, nylon, charged nylon and polytetrafluoroethylene, but is not limited thereto.
- membranes such as fluoride, nylon, charged nylon and polytetrafluoroethylene, but is not limited thereto.
- known methods may be used, and reference may be made to those described in the Examples herein.
- the sample is from the group consisting of whole blood, serum, plasma, tissue, saliva, tears, urine, sputum, lymph, cerebrospinal fluid, intercellular fluid, bone marrow, ascites, and combinations thereof isolated from an individual. It may include a selected one, but is not limited thereto.
- the sample may be peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from an individual, but is not limited thereto.
- PBMC peripheral blood mononuclear cells
- the subject refers to a person suspected of adult-type Still's disease, a person suffering from adult-type Still's disease, or a person receiving treatment after being diagnosed with adult-type Still's disease.
- the sample refers to a direct subject to measure the expression level of the TLR2 protein or TLR7 protein separated from the subject.
- a sample is not particularly limited as long as it can detect the TLR2 protein or TLR7 protein, and refers to a substance or a mixture of substances containing one or more detectable components, such as cells, tissues, or body fluids derived from living organisms, particularly humans. Examples include, but are not limited to, bodily fluids such as saliva and tears, whole blood, plasma, and serum.
- the sample may be blood, serum or plasma, specifically, peripheral blood mononuclear cells of a patient with adult-onset Still's disease, but is not limited thereto.
- the method for detecting the TLR2 protein or the TLR7 protein is Western blot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), dot blot assay, radioimmunoassay, radioimmuno-diffusion method, oxteroney immunoassay A method selected from the group consisting of diffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FLOW CYTOMETRY ANALYSIS (FACS), protein chip, Sandwich assay, and combinations thereof It may be performed using, but is not limited thereto.
- ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
- dot blot assay assay
- radioimmunoassay radioimmuno-diffusion method
- oxteroney immunoassay A method selected from the group consisting of diffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FLOW CYTOMETRY
- the detection includes quantitative and / or qualitative analysis, and includes detection of presence or absence and measurement of concentration. Such methods are known in the art, and those skilled in the art will be able to select an appropriate method for the practice of the present application. .
- a method for detecting the TLR2 protein or the TLR7 protein may be a Western blot, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), or a dot blot assay, but is not limited thereto.
- ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
- the method can be applied to antigen bound to a solid substrate such as a bead, membrane, slide or microwell plate made of glass, plastic (eg polystyrene), polysaccharide, nylon or nitrocellulose.
- a label that can be directly or indirectly detected, for example, a radioactive substance such as 3H or 125I, a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, a hapten, biotin, digoxigenin, etc. It can be detected qualitatively or quantitatively through binding with an antibody conjugated with enzymes such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, and malate dehydrogenase capable of developing color or luminescence.
- enzymes such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, and malate dehydrogenase capable of developing color or luminescence.
- the ELISA kit may further include a reagent capable of detecting the bound antibody, for example, a secondary detection antibody labeled with a substance such as chromophores, an enzyme, and the like, and a substrate used for detection. It may be, but is not limited thereto.
- kit according to the present application may further include a guide for use, and may further include a reagent capable of detecting an antibody specific to a control or a bound antibody, but is not limited thereto.
- the third aspect of the present application is measuring the frequency of cells expressing TLR2 or TLR7 in a sample of an individual suspected of having adult-type Still's disease; comparing the measured frequency with that of a normal control sample; and diagnosing adult-type Still's disease when the frequency of cells expressing the TLR2 or TLR7 is increased in the sample of the subject suspected of having adult-type Still's disease compared to the control group. provide a method of delivery.
- adult-type Still's disease when the frequency of cells expressing TLR2 or TLR7 in a sample of an individual suspected of having adult-type Still's disease is significantly increased compared to the frequency of cells expressing TLR2 or TLR7 in a normal control sample, adult-type Still's disease It can be determined that this has occurred, and if there is no significant increase, it can be determined that the adult-type Still's disease is not developed in the subject suspected of adult-type Still's disease, but is not limited thereto.
- the sample is from the group consisting of whole blood, serum, plasma, tissue, saliva, tears, urine, sputum, lymph, cerebrospinal fluid, intercellular fluid, bone marrow, ascites, and combinations thereof isolated from an individual. It may include a selected one, but is not limited thereto.
- the sample may be peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from an individual, but is not limited thereto.
- PBMC peripheral blood mononuclear cells
- a fourth aspect of the present application comprises measuring the frequency of cells expressing TLR2 or TLR7 in a sample of an individual suspected of having adult-type Still's disease; processing a candidate substance for the treatment of adult-type Still's disease in the subject; And it provides a screening method for an adult-type Still's disease treatment agent comprising measuring the therapeutic effect of the adult-type Still's disease treatment candidate.
- the screening method for adult-type Still's disease therapeutics using the biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease according to the present invention is useful for developing adult-type Still's disease therapeutics because it can screen the treatment effect of adult-type Still's disease simply and quickly. can be utilized
- measuring the therapeutic effect comprises measuring the frequency of cells expressing TLR2 or TLR7 in a sample of an individual treated with the candidate drug substance; Comparing the frequency of cells expressing TLR2 or TLR7 measured in a sample of an individual treated with the candidate drug substance with the frequency of cells expressing the TLR2 or TLR7 measured before the step of treating the drug candidate substance; and when the frequency of cells expressing TLR2 or TLR7 measured in a sample of an individual treated with the candidate drug substance is reduced compared to the frequency of cells expressing the TLR2 or TLR7 measured before the step of treating the drug candidate substance. It may include the step of considering the drug candidate as a drug for adult-type Still's disease, but is not limited thereto.
- the sample is from the group consisting of whole blood, serum, plasma, tissue, saliva, tears, urine, sputum, lymph, cerebrospinal fluid, intercellular fluid, bone marrow, ascites, and combinations thereof isolated from an individual. It may include a selected one, but is not limited thereto.
- the sample may be peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from an individual, but is not limited thereto.
- PBMC peripheral blood mononuclear cells
- 1 is a table showing clinical characteristics of clinical test subjects.
- AOSD Still's disease
- HC healthy controls
- PBMCs of each subject of Example 1-1 were isolated using a BD Vacutainer CPT TM (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).
- FIG. 2 is a table showing the results of measuring the frequency of cells expressing TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 and TLR9 in whole peripheral blood mononuclear cells
- FIG. 3 is a table showing various TLR markers in whole peripheral blood mononuclear cells of one patient with AOSD. It is an image showing a representative example of the flow cytometry analysis histogram of the surface-stained cells presented.
- the frequencies of cells expressing various types of TLRs were measured in the PBMCs isolated in Example 1-2, respectively.
- each 1 x 10 6 cells were incubated with FACS blocking buffer, then reacted with different fluorescent anti-TLR1, anti-TLR2, anti-TLR4, anti-TLR7 or anti-TLR9 antibodies, respectively.
- the number of antibody-attached cells was counted using flow cytometry (FACS), and the frequency of these cells in total cells (10,000 cells) was analyzed.
- TLR2-expressing cells and TLR7-expressing cells are higher when PBMCs of adult-type Still's disease patients are compared to normal controls, so that it is possible to accurately and quickly diagnose adult-type Still's disease, which is difficult to diagnose by analyzing them. This means that it can be accurately diagnosed.
- Example 3 Measuring the frequency of cells expressing TLR2 or TLR7 according to disease activity markers or clinical manifestations in AOSD patients
- Figure 4 is a table showing the correlation between the frequency of stained cells expressing various TLR markers and disease activity markers or systemic scores in AOSD patients.
- FIG. 5 is a table showing various TLR expression levels according to clinical symptoms in AOSD patients.
- biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease can accurately and quickly diagnose adult-type Still's disease in which arthritis is expressed.
- 6 is a table showing the skin biopsy results of AOSD patients.
- TLR7 is a table showing the results of TLR1, TLR2, TLR4, TLR7, and TLR9 immunohistochemical staining performed on AOSD patients, eczema patients, psoriasis patients, and controls.
- TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 and TLR9 antibodies were used as primary antibodies, respectively, and immunohistochemical staining was performed using the Ventana Optiview DAB kit (Ventana Medical Systems Inc.). IHC results were graded according to the percentage of positive lymphoid cells and histiocytes.
- the average percentages of inflammatory cells expressing TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 and TLR9 in skin lesions of AOSD patients were 81.9 ⁇ 8.2, 34.8 ⁇ 24.1, 52.3 ⁇ 29.8, 19.3 ⁇ 15.7 and 40.2 ⁇ 27.9, respectively, and normal
- the mean percentages of inflammatory cells expressing TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 and TLR9 in the skin of the control group were 70.0 ⁇ 18.4, 6.2 ⁇ 3.6, 77.0 ⁇ 11.0, 9.6 ⁇ 6.6 and 5.4 ⁇ 4.5, respectively, in skin lesions caused by eczema.
- the mean percentages of inflammatory cells expressing TLR1, TLR2, TLR4, TLR7, and TLR9 were 70.0 ⁇ 16.0, 27.0 ⁇ 30.9, 75.0 ⁇ 10.0, 24.4 ⁇ 31.2, and 17.6 ⁇ 20.2, respectively.
- the average percentages of inflammatory cells expressing TLR4, TLR7, and TLR9 were 72.0 ⁇ 5.7, 27.2 ⁇ 21.4, 64.0 ⁇ 11.4, 19.3 ⁇ 15.7, and 7.4 ⁇ 9.9, respectively.
- Figure 8 Inflammatory cell grade (CD4/CD8/CD68 staining) in the skin of AOSD patients; and the average percentages of inflammatory cells expressing CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCR3, CXCL12, and CXCR4 and the average percentages of inflammatory cells expressing TLR1, TLR2, TLR4, TLR7, and TLR9.
- FIG. 9 is a graph showing the results of evaluating the correlation between TLR markers in the skin of AOSD patients.
- biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease can be usefully used to distinguish adult-type Still's disease from other mimicers.
- FIG. 10 is a table showing the results of lymph node biopsies of AOSD patients. Specifically, the results of TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 and TLR9 immunohistochemical staining performed in AOSD patients, T-cell lymphoma patients, histiocytic lymphadenitis patients, tuberculous lymphadenitis patients, non-specific reactive hyperplasia patients and controls were shown. It is a table.
- the lymph node biopsy samples were 9 AOSD patients, T cell lymphoma patients, histiocytic necrotizing lymphadenitis (HNL, kikuchi disease) patients, tuberculous lymphadenitis (Tbc lymphadenitis) patients, and Collected from patients with nonspecific reactive hyperplasia. Subsequently, H&E staining was performed on each sample, and skin pathological parameters were independently evaluated by three pathologists.
- TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 and TLR9 antibodies were used as primary antibodies, respectively, and immunohistochemical staining was performed using the Ventana Optiview DAB kit (Ventana Medical Systems Inc.). IHC results were graded according to the percentage of positive lymphoid cells and histiocytes.
- the average percentages of inflammatory cells expressing TLR1, TLR2, TLR4, TLR7, and TLR9 in lymph nodes of AOSD patients were 34.4 ⁇ 17.9, 17.3 ⁇ 16.6, 31.1 ⁇ 13.6, 27.2 ⁇ 20.0, and 18.3 ⁇ 9.7, respectively, and reactive lymph nodes.
- the mean percentages of inflammatory cells expressing TLR1, TLR2, TLR4, TLR7, and TLR9 in patients were 7.6 ⁇ 7.6, 8.6 ⁇ 4.7, 12.2 ⁇ 7.2, 8.0 ⁇ 2.7, and 2.6 ⁇ 1.7, respectively;
- the mean percentages of inflammatory cells expressing TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 and TLR9 in the lymph nodes of patients with tuberculosis lymphadenitis were 13.2 ⁇ 13.2, 6.8 ⁇ 5.7, 44.0 ⁇ 26.0, 32.0 ⁇ 4.5 and 11.2 ⁇ 11.2, respectively, compared to T-cell lymphomas.
- the mean percentages of inflammatory cells expressing TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 and TLR9 in patients were 9.2 ⁇ 6.2, 20.0 ⁇ 31.8, 4.4 ⁇ 3.4, 8.2 ⁇ 7.2 and 3.6 ⁇ 4.0, respectively, in the lymph nodes of patients with histocytic lymphadenitis. found that the average percentages of inflammatory cells expressing TLR1, TLR2, TLR4, TLR7, and TLR9 were 24.0 ⁇ 12.9, 4.8 ⁇ 3.0, 52.0 ⁇ 17.5, 49.0 ⁇ 12.5, and 21.0 ⁇ 19.2, respectively.
- biomarker composition for diagnosing adult-type Still's disease can be usefully used to distinguish adult-type Still's disease from other mimicers.
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Abstract
본원은 TLR2 단백질을 포함하는 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
Description
본원은 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
스틸병(Still’s disease)은 연소성 류마티스 관절염의 전신형으로 스틸(Still)이 처음 기술한 후 아직 원인이 밝혀지지 않은 질환이며 소아와 성인에서 모두 발병한다. 성인에서 발병하는 성인형 스틸병은 1971년 바이워터(Bywaters)에 의해서 보고된 이래, 세계 각지에서 보고되고 있으며, 드문 질환이나 불명열의 한 원인 질환으로서 알려져 있다.
대개 성인형 스틸병은 양성 질환으로 예후가 좋다고 보고되고 있으나, 일부의 환자가 이로 인해 사망한 치명적인 경우도 보고되고 있으며, 혈구 탐식 증후군, 간 기능 악화, 감염 등이 동반될 경우 환자가 사망할 수 있는 상태에 이를 수도 있다. 국내의 연구 결과에서도 발병 환자의 약 10%에서 사망하는 예후를 보고한 바 있다.
스틸병의 진단은 주로 임상소견에 기초하는데, 고열, 관절통이나 관절염, 특징적인 피부 병변, 림프절 종대, 간종대, 비종대, 장막염과 인후통 등의 임상소견 및 백혈구 증가증, 혈침속도의 증가, 항핵항체 음성, 류마티스 인자 음성 등의 검사실 소견을 통해 진단을 한다.
성인형 스틸병에서 이루어지고 있는 연구의 대부분은 환자의 혈청을 이용한 염증성 사이토카인, 급성반응기 물질에 대한 간단한 효소면역분석법(Enzyme-LinKed ImmunoSpecific Assay, ELISA) 연구, 또는 유전자 연구이며, 체계적인 바이오마커에 대한 보고는 없었다. 더불어 병인 기전에 대한 이해의 부족으로 경험에 의존하여 치료하고 있으며 이에 대한 합의(consensus)도 없는 실정이다.
따라서, 성인형 스틸병 진단에 유용하게 활용될 수 있는 바이오마커에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.
본원의 배경이 되는 기술인 한국 등록특허공보 제 10-1806681 호는 스틸씨병 진단용 바이오마커 조성물, 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것으로서, 구체적으로, CD11b 또는 CD32의 발현 수준과, 림프구에 대한 과립구의 빈도 비율을 지표로 하여 소아와 성인에게서 스틸씨병을 진단하는 할 수 있음을 개시하고 있다. 그러나, TLR2 를 이용하여 간편하게 성인형 스틸병을 진단하는 방법, 진단용 바이오마커 조성물 및 키트에 대해서는 언급하지 않고 있다.
본원은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본원은 TLR2 항원 단백질 또는 TLR7 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 성인형 스틸병 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본원은 성인형 스틸병 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본원은 성인형 스틸병 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
다만, 본원의 실시예가 이루고자 하는 기술적 과제는 상기된 바와 같은 기술적 과제들로 한정되지 않으며, 또 다른 기술적 과제들이 존재할 수 있다.
상기한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본원의 제 1 측면은, TLR2 단백질을 포함하는 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 성인형 스틸병은 관절염이 발현된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 조성물은 TLR7 단백질을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 2 측면은 TLR2 항원 단백질 또는 TLR7 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 성인형 스틸병 진단용 키트를 제공한다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 키트는 항원-항체 결합반응을 이용하여 시료 내 TLR2 단백질 또는 TLR7 단백질을 검출하여 성인형 스틸병을 진단하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 시료는 개체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 조직, 타액, 눈물, 소변, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액, 골수액, 복수 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 시료는 개체로부터 분리된 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 TLR2 단백질 또는 TLR7 단백질을 검출하는 방법은 웨스턴 블럿, 효소면역측정법(ELISA), 닷 블랏 분석(dot blot assay), 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법, 보체 고정 분석법, 유세포분석법 (FLOW CYTOMETRY ANALYSIS, FACS), 단백질 칩, 샌드위치 측정법(Sandwich assay) 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 3 측면은 성인형 스틸병이 의심되는 개체의 시료에서 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도를 측정하는 단계; 상기 측정된 빈도를 정상 대조군 시료의 빈도와 비교하는 단계; 및 상기 대조군에 비하여 상기 성인형 스틸병이 의심되는 개체의 시료에서 상기 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도가 증가한 경우, 성인형 스틸병으로 진단하는 단계를 포함하는 성인형 스틸병 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 시료는 개체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 조직, 타액, 눈물, 소변, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액, 골수액, 복수 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 시료는 개체로부터 분리된 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 4 측면은 성인형 스틸병이 의심되는 개체의 시료에서 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도를 측정하는 단계; 상기 개체에 성인형 스틸병 치료제 후보 물질을 처리하는 단계; 및 상기 성인형 스틸병 치료제 후보 물질의 치료 효과를 측정하는 단계를 포함하는 성인형 스틸병 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 치료 효과를 측정하는 단계는 상기 치료제 후보 물질을 처리한 개체의 시료에서 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도를 측정하는 단계; 상기 치료제 후보 물질을 처리한 개체의 시료에서 측정된 상기 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도를 상기 치료제 후보 물질을 처리하는 단계 전 측정된 상기 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도와 비교하는 단계; 및 상기 치료제 후보 물질을 처리하는 단계 전 측정된 상기 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도에 비하여 상기 치료제 후보 물질을 처리한 개체의 시료에서 측정된 상기 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도가 감소한 경우 상기 치료제 후보 물질을 성인형 스틸병 치료제로 고려하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 시료는 개체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 조직, 타액, 눈물, 소변, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액, 골수액, 복수 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 시료는 개체로부터 분리된 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본원을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.
전술한 본원의 과제 해결 수단에 의하면, 본원에 따른 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물은 진단이 어려운 성인형 스틸병을 정확하고 신속하게 진단할 수 있다.
또한, 본원에 따른 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물은 관절염이 발현된 성인형 스틸병을 정확하고 신속하게 진단할 수 있다.
또한, 본원에 따른 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물은 조직검사 또는 영상촬영 기술을 사용하지 않고도 비침습적 생물학적 시료를 이용하여 간편하게 성인형 스틸병을 진단할 수 있으므로, 편의성 및 경제성이 우수할 수 있다.
또한, 본원에 따른 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물은 질병의 발병, 질환의 진행, 질환의 진단 및 예후 예측에 유용하게 활용할 수 있으므로, 질병의 병인을 설명하고 질병의 활성을 반영하는 성인형 스틸병 특이적 바이오마커를 제공할 수 있다.
또한, 본원에 따른 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물은 초기 진단, 중증도 판별, 질병의 활성도 반영, 치료 효용 평가, 약제의 효용성 확인 및 감염성 질환과 같은 동반된 다른 질환의 유무 파악 등에 유용하게 활용할 수 있으므로, 성인형 스틸병 치료의 치료 효율을 높일 수 있는 장점이 있다.
또한, 본원에 따른 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물은 다른 유사 병변(mimickers)으로부터 성인형 스틸병을 구분하는데 유용하게 활용될 수 있다.
또한, 본원에 따른 성인형 스틸병 치료제의 스크리닝 방법은 다양한 후보 물질의 성인형 스틸병 치료 효과를 간이하고 신속하게 스크리닝 할 수 있으므로, 성인형 스틸병 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다.
다만, 본원에서 얻을 수 있는 효과는 상기된 바와 같은 효과들로 한정되지 않으며, 또 다른 효과들이 존재할 수 있다.
도 1 은 임상 시험 대상체의 임상 특성(clinical characteristic)을 나타낸 표이다.
도 2 는 전체 말초혈액 단핵세포에서 TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 및 TLR9 를 발현하는 세포의 빈도를 측정한 결과를 나타낸 표이다.
도 3 은 AOSD 환자 1 명의 전체 말초혈액 단핵세포에서 다양한 TLR 마커를 제시하는 표면 염색 세포의 유세포 분석 히스토그램의 대표예를 나타낸 이미지이다.
도 4 는 AOSD 환자에서 여러 TLR 마커를 나타내는 염색된 세포의 빈도와 질병 활성 마커 또는 전신 점수(systemic score)의 상관 관계를 나타낸 표이다.
도 5 는 AOSD 환자에서 임상 증상에 따른 여러 TLR 발현 수준을 나타낸 표이다.
도 6 은 AOSD 환자의 피부 조직 검사 결과를 나타낸 표이다.
도 7 은 AOSD 환자, 습진 환자, 건선 환자 및 대조군에서 수행한 TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 및 TLR9 면역조직화학염색(Immunohistochemical staining) 결과를 나타낸 표이다.
도 8 은 AOSD 환자의 피부에서 염증 세포 등급(CD4/CD8/CD68 염색); 및 CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCR3, CXCL12 및 CXCR4 를 발현하는 염증 세포의 평균 백분율;과 TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 및 TLR9를 발현하는 염증 세포의 평균 백분율의 상관 관계를 나타낸 표이다.
도 9 는 AOSD 환자의 피부에서 TLR 마커 간의 상관 관계를 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10 은 AOSD 환자의 림프절 조직 검사 결과를 나타낸 표이다.
도 11 은 AOSD 환자, T 세포 림프종 환자, 조직세포 괴사 림프선염 환자, 결핵 임파선염 환자, 비특이 반응성 과형성증 환자 및 대조군에서 수행한 TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 및 TLR9 면역조직화학염색 결과를 나타낸 표이다.
도 12 는 AOSD 환자의 피부에서 염증 세포 등급(CD4/CD8 염색); 및 CXCL10, CXCL13, CXCR3 및 S100A8/A9 를 발현하는 염증 세포의 평균 백분율;과 TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 및 TLR9를 발현하는 염증 세포의 평균 백분율의 상관 관계를 나타낸 표이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다.
그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 "전기적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에", "상부에", "상단에", "하에", "하부에", "하단에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 합성 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 본원 명세서 전체에서, "~ 하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A 또는 B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.
이하에서는 본원의 TLR2 단백질을 포함하는 성인형 스틸병(Adult-onset Still's disease, AOSD) 진단용 바이오마커 조성물에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
상기한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본원의 제 1 측면은, TLR2 단백질을 포함하는 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
성인형 스틸병(Adult-onset Still's disease, AOSD)은 1971년 바이워터(Bywaters)에 의해서 보고된 이래, 세계 각지에서 보고되고 있으며, 발열, 관절염, 소실성 발진, 관절통 혹은 관절염, 백혈구 증가증을 특징적인 증상으로 발현되는 염증질환으로서 발병 기전은 명확하게 밝혀진 바 없다.
스틸병의 진단은 주로 임상소견에 기초하는데, 고열, 관절통이나 관절염, 특징적인 피부 병변, 림프절 종대, 간종대, 비종대, 장막염과 인후통 등의 임상소견 및 백혈구 증가증, 혈침속도의 증가, 항핵항체 음성, 류마티스 인자 음성 등의 검사실 소견을 통해 진단을 한다.
성인형 스틸병에서 이루어지고 있는 연구의 대부분은 환자의 혈청을 이용한 염증성 사이토카인, 급성반응기 물질에 대한 간단한 효소면역분석법(Enzyme-LinKed ImmunoSpecific Assay, ELISA) 연구, 또는 유전자 연구이며, 체계적인 바이오마커에 대한 보고는 없었다. 더불어 병인 기전에 대한 이해의 부족으로 경험에 의존하여 치료하고 있으며 이에 대한 합의(consensus)도 없는 실정이다.
이에, 조직검사 또는 영상촬영 기술을 사용하지 않고도 초기에 간편하게 성인형 스틸병을 진단할 수 있는 바이오마커에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.
바이오마커란 DNA, RNA, 대사물질, 단백질 및 단백질 조각 등에서 유래된 단일 분자 또는 분자들의 패턴을 근거로 한 분자적 정보로서 체내에서 유전적 또는 후생 유전적 변화의 영향으로 유발된 신체의 변화를 감지할 수 있는 지표를 의미한다. 단백질체는 단백질 바이오마커들로써 환자의 혈청 내에 존재하며 검출이 용이한 장점으로 인해 바이오마커로의 중요한 가치를 나타낸다.
전술한 본원의 과제 해결 수단에 의하면, 본원에 따른 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물은 진단이 어려운 성인형 스틸병을 정확하고 신속하게 진단할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 조성물은 TLR7 단백질을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 본원에 따른 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물은 정상인과 성인형 스틸병 환자에게서 TLR2 또는 TLR7 을 발현하는 세포의 빈도 수 차이를 발견하고, 이를 발굴하고 검증한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 성인형 스틸병 환자의 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 정상 대조군과 비교하였을 때, TLR2 를 발현하는 세포의 빈도 및 TLR7 을 발현하는 세포의 빈도가 더 높음을 확인하였다(실시예 2).
상기 TLR2(또는 Toll-유사 수용체 2) 는 인간에서 TLR2 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 의미한다. TLR2는 CD282(분화 클러스터 282)로도 지정되었다. TLR2는 Toll-유사 수용체 중 하나이며, 면역계에서 역할을 한다. 특히, 인간 TLR2 단백질의 서열은 NCBI 데이터베이스 항목 NP_003255(2014년 5월 25일자)에 제공되어 있다.
상기 TLR2(또는 Toll-유사 수용체 2) 는 인간에서 TLR2 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 의미한다. TLR2 는 Toll-유사 수용체 중 하나이며, 면역계에서 역할을 한다. 특히, 인간 TLR2 단백질의 서열은 NCBI 데이터베이스 항목 NP_003255(2021 년 5 월 30 일자) 에 제공되어 있다.
상기 TLR7(또는 Toll-유사 수용체 7) 은 인간에서 TLR7 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 의미한다. TLR7 은 Toll-유사 수용체 중 하나이며, 면역계에서 역할을 한다. 특히, 인간 TLR7 단백질의 서열은 NCBI 데이터베이스 항목 NP_057646(2021 년 5 월 3 일자)에 제공되어 있다.
상기 진단은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 진행 단계 결정 또는 치료에 대한 질환의 반응성 결정)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
예를 들어, 상기 진단은 성인형 스틸병의 발병 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 성인형 스틸병은 관절염이 발현된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 성인형 스틸병 환자의 전체 세포의 TLR2 빈도는 전신 점수, LDH 수준 및 페리틴 수준과 상관 관계가 있음을 확인하였으며, 관절염(Arthritis)이 발현된 AOSD 환자에서 TLR2 발현 수준이 유의하게 높음을 확인하였다(실시예 3).
따라서, 본원에 따른 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물은 특정 질병 활성 마커(전신 점수, LDH 수준 및 페리틴 수준) 및 특정 임상 증상(관절염)이 발현된 성인형 스틸병을 정확하고 신속하게 진단할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본원에 따른 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물은 조직검사 또는 영상촬영 기술을 사용하지 않고도 비침습적 생물학적 시료를 이용하여 간편하게 성인형 스틸병을 진단할 수 있으므로, 편의성 및 경제성이 우수할 수 있다.
또한, 본원에 따른 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물은 질병의 발병, 질환의 진행, 질환의 진단 및 예후 예측에 유용하게 활용할 수 있으므로, 질병의 병인을 설명하고 질병의 활성을 반영하는 성인형 스틸병 특이적 바이오마커를 제공할 수 있다.
또한, 본원에 따른 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물은 초기 진단, 중증도 판별, 질병의 활성도 반영, 치료 효용 평가, 약제의 효용성 확인 및 감염성 질환과 같은 동반된 다른 질환의 유무 파악 등에 유용하게 활용할 수 있으므로, 성인형 스틸병 치료의 치료 효율을 높일 수 있는 장점이 있다.
또한, 본원에 따른 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물은 다른 유사 병변(mimickers)으로부터 성인형 스틸병을 구분하는데 유용하게 활용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 AOSD 환자의 피부 병변 및 림프절(LN) 시료의 면역 조직 화학 염색 결과, TLR2 또는 TLR7를 발현하는 염증 세포의 평균 백분율이 다른 유사 병변(mimickers)과 구분되는 특징을 가짐을 확인하였다(실시예 4 및 실시예 5).
본원의 제 2 측면은 TLR2 항원 단백질 또는 TLR7 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 성인형 스틸병 진단용 키트를 제공한다.
본원의 제 2 측면의 상기 성인형 스틸병 진단용 키트에 대하여, 본원의 제 1 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면에 기재된 내용은 본원의 제 2 측면에 동일하게 적용될 수 있다.
상기 항원은 항체와 항원-항체 결합을 수행할 수 있는 단백질성 면역원을 의미한다. 이러한 항원은 통상적인 방법에 의해 유전자 재조합 방법을 통해 합성 분리 및 정제될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 항체는 모노클로날 항체(단일클론 항체) 또는 폴리클로날 항체(다클론성 항체)인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단일클론 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자에 의해 발현된 단백질을 마우스에 면역화시키거나 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화시킨다. 마우스에서 분리된 항원-생산 B 임파구를 인간 또는 마우스의 골수종(myeloma)과 융합하여 불멸화된 하이브리도마(hybridoma)를 생성하며, 상기 하이브리도마 세포를 가지고 간접적인 효소 결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunoabsorbent assays, ELISA)을 사용하여 모노클노날 항체의 생성 여부를 확인하고 양성 클론을 택하여 배양한 후 항체를 분리정제하거나 랫트의 복강에 주입한 후 복수를 채취함으로써, 단일클론 항체를 제조할 수 있다.
상기 단일클론 항체는 일반적으로 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 또는 호올스래디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP) 등의 효소가 결합된 2차 항체 및 이들의 기질을 사용하여 발색반응 시킴으로써 정량분석할 수도 있고, 또는 직접 상기 단백질에 대한 단일클론 항체에 AP 또는 HRP 효소 등이 결합된 것을 사용하여 정량분석할 수 있다. 또한 플루오레세인이소티오시안산염(fluorescein isothiocyanat, FITC), 피코에리트린(phycoerythrin, PE) 등을 포함하는 여러가지 형광표지자가 붙은 항체를 사용할 수도 있다.
상기 다클론성 항체는 당업자에 알려진 방법에 따라 면역원으로 TLR2 또는 TLR7 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조할 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 랫트, 양 또는 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여된다. 외부숙주로부터 정기적으로 혈청을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리정제한다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 키트는 항원-항체 결합반응을 이용하여 시료 내 TLR2 단백질 또는 TLR7 단백질을 검출하여 성인형 스틸병을 진단하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 키트는 성인형 스틸병이 발병된 개체에서 유래된 시료로부터 TLR2 단백질 또는 TLR7 단백질의 수준을 측정하여 성인형 스틸병의 발병여부를 진단하는데 사용될 수 있다.
상기 키트는 항원-항체 결합반응을 이용하여 항원-항체 복합체 검출 과정을 통해 시료의 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 정상 대조군의 시료의 시그널보다 높은 경우 쇼그렌증후군으로 진단하거나, 치료 경과에 대한 판단을 할 수 있다.
상기 키트는 상기 TLR2 단백질 또는 TLR7 단백질의 수준을 측정하기 위한 항원, 항체, 앱타머, 분석 방법에 적합한 한 종류 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액, 장치 및 이들의 조합들로부터 선택되는 것을 추가 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 키트는 상기 항원-항체 복합체의 검출을 위해, 항원이 후술하는 표지물질로 표지되거나 검출항체 또는 2차 항체를 사용할 수 있으며, 완충용액, 발색 기질액 등을 추가 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 검출 항체는 인간 IgG 또는 IgA에 특이적으로 결합하며, 상기 검출항체는 시각적 또는 다양한 이미지 검출 장비를 이용하여 검출할 수 있는 물질로 표지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 항원 또는 상기 검출항체는 표지물질로서 호스라디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)와 같은 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase), 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase), 유레아제(urease), 카탈라아제(catalase), 아스파르기나아제(asparginase), 리보뉴클레아제(ribonuclease), 말레이트 데하이드로지나아제(malate dehydrogenase), 스타필로코칼 뉴클레아제(staphylococcal nuclease), 트리오스 포스페이트 이소머라아제(triose phospate isomerase), 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로지나아제(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 또는 아세틸콜린 에스터라아제(acetylcholine esterase)와 같이 특정 기질(substrate)의 존재하에서 화학반응을 촉매하여 검출가능한 발색반응 또는 광을 방출할 수 있는 효소로 표지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 항원 또는 상기 검출항체는 광의 조사에 의해 조사된 광과 상이한 파장의 광을 방출하는 바이로루미네슨스, 케미루미네슨스, 일렉트로루미네슨스, 일렉트로케미루미네슨스 또는 포토루미네슨스에 사용되는 발색단으로, 예를 들어, 단백질로서 그린형광단백질 또는 유기화합물로서 플루오르세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 파이코에리쓰린(phycoerythrin), 파이코시아닌(phycocyanin), 알로파이코시아닌(allophycocyanin) 또는 플루오르카민(fluorecamine)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 항원 또는 상기 검출항체는 다양한 방사선 동위원소 물질로 표지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 표지물질의 검출은 예를 들어 방사선동위원소인 경우 신틸레이션 카운터(scintillation counter)에 의해 수행할 수 있으며, 예를 들어 표지물질이 형광물질인 경우, 스펙트로스코피, 포스포이미징 장치 또는 형광계측기 등과 같은 방법에 의해 수행할 수 있고, 효소로 표지된 경우, 적절한 기질의 존재하에서 효소에 의한 발색성 기질의 변환에 의해 나타나는 발색 산물을 계측을 함으로써 수행할 수 있으며, 적당한 표준 혹은 대조군과의 비교를 통해 효소반응에 의해 나타나는 발색 산물의 색 비교로서 탐지할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(o-페닐렌디아민) 또는 TMB(테트라메틸 벤지딘) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 키트는 음성 및 양성 대조군 반응을 수행하는데 필요한 시약 또는 혼성화 반응에 필요한 완충액과 같은 시약을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 반응에서 이용되는 시약의 최적량은 본 명세서의 내용을 파악한 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 분리된 패키지 또는 컴파트먼트에 상술한 성분들을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본원에 따른 키트에서 상기 항원은 96 웰 마이크로웰플레이트와 같은 마이크로웰플레이트, 콜로이드성 금 입자 또는 착색 라텍스 입자를 포함하는 비드 또는 입자 또는 셀룰로스, 나이트로셀룰로스, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리딘, 플루오라이드, 나일론, 하전나일론 및 폴리테트라플루오로에틸렌 등과 같은 멤브레인에 부착될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 부착 또는 코팅하는 방법은 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 본원 실시예에 기재된 것을 참고할 수 있다
본원의 일 구현예에 따르면 상기 시료는 개체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 조직, 타액, 눈물, 소변, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액, 골수액, 복수 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 본원의 일 구현예에 따르면 상기 시료는 개체로부터 분리된 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개체는 성인형 스틸병이 의심되는 사람 또는 성인형 스틸병에 걸린 사람 또는 성인형 스틸병으로 진단 후 치료를 받고 있는 사람을 의미하는 것이다.
구체적으로, 상기 시료는 상기 개체에서 분리되어 상기 TLR2 단백질 또는 TLR7 단백질의 발현수준을 측정하는 직접적인 대상을 의미한다. 이러한 시료는 상기 TLR2 단백질 또는 TLR7 단백질을 검출 할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 인간 유래의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들면 타액, 눈물과 같은 체액, 전혈, 혈장, 및 혈청을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 시료는 성인형 스틸병이 발병된 환자의 혈액, 혈청 또는 혈장, 구체적으로, 말초혈액 단핵세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 TLR2 단백질 또는 TLR7 단백질을 검출하는 방법은 웨스턴 블럿, 효소면역측정법(ELISA), 닷 블랏 분석(dot blot assay), 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법, 보체 고정 분석법, 유세포분석법 (FLOW CYTOMETRY ANALYSIS, FACS), 단백질 칩, 샌드위치 측정법(Sandwich assay) 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 검출은 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 농도 측정을 포함하는 것으로서 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
예를 들어, 상기 TLR2 단백질 또는 TLR7 단백질을 검출하는 방법은 웨스턴 블럿, 효소면역측정법(ELISA) 또는 닷 블랏 분석(dot blot assay)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 방법은 고상의 기질 예를 들어, 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 멤브레인, 슬라이드 또는 마이크로웰플레이트에 결합된 항원에 검체를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들어, 3H 또는 125I 와 같은 방사성 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 정성 또는 정량적으로 검출 할 수 있다.
예를 들어, 상기 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들어, 발색단(chromophores), 효소 등과 같은 물질로 표지된 2 차 검출항체 및 검출에 사용되는 기질 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본원에 따른 키트는 사용법에 관한 안내서를 추가로 포함할 수 있으며, 대조군에 특이적인 항체 또는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 3 측면은 성인형 스틸병이 의심되는 개체의 시료에서 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도를 측정하는 단계; 상기 측정된 빈도를 정상 대조군 시료의 빈도와 비교하는 단계; 및 상기 대조군에 비하여 상기 성인형 스틸병이 의심되는 개체의 시료에서 상기 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도가 증가한 경우, 성인형 스틸병으로 진단하는 단계를 포함하는 성인형 스틸병 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본원의 제 3 측면의 상기 성인형 스틸병 진단을 위한 정보제공 방법에 대하여, 본원의 제 1 측면 및 제 2 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면 및 제 2 측면에 기재된 내용은 본원의 제 3 측면에 동일하게 적용될 수 있다.
예를 들어, 상기 성인형 스틸병이 의심되는 개체의 시료에서 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도가 정상 대조군 시료의 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도와 비교하여 유의하게 증가한 경우 성인형 스틸병이 발병한 것으로 판단할 수 있으며, 유의하게 증가하지 않는 경우에는 상기 성인형 스틸병이 의심되는 개체에서 성인형 스틸병이 발병하지 않았다고 판단할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 시료는 개체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 조직, 타액, 눈물, 소변, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액, 골수액, 복수 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 본원의 일 구현예에 따르면 상기 시료는 개체로부터 분리된 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 4 측면은 성인형 스틸병이 의심되는 개체의 시료에서 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도를 측정하는 단계; 상기 개체에 성인형 스틸병 치료제 후보 물질을 처리하는 단계; 및 상기 성인형 스틸병 치료제 후보 물질의 치료 효과를 측정하는 단계를 포함하는 성인형 스틸병 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본원의 제 4 측면의 상기 성인형 스틸병 치료제의 스크리닝 방법에 대하여, 본원의 제 1 측면 내지 제 3 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면 내지 제 3 측면에 기재된 내용은 본원의 제 4 측면에 동일하게 적용될 수 있다.
본원에 따른 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물을 이용한 성인형 스틸병 치료제의 스크리닝 방법은 다양한 후보 물질의 성인형 스틸병 치료 효과를 간이하고 신속하게 스크리닝 할 수 있으므로, 성인형 스틸병 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 치료 효과를 측정하는 단계는 상기 치료제 후보 물질을 처리한 개체의 시료에서 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도를 측정하는 단계; 상기 치료제 후보 물질을 처리한 개체의 시료에서 측정된 상기 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도를 상기 치료제 후보 물질을 처리하는 단계 전 측정된 상기 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도와 비교하는 단계; 및 상기 치료제 후보 물질을 처리하는 단계 전 측정된 상기 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도에 비하여 상기 치료제 후보 물질을 처리한 개체의 시료에서 측정된 상기 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도가 감소한 경우 상기 치료제 후보 물질을 성인형 스틸병 치료제로 고려하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 시료는 개체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 조직, 타액, 눈물, 소변, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액, 골수액, 복수 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
*본원의 일 구현예에 따르면 상기 시료는 개체로부터 분리된 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예 1] 실험준비
[실시예 1-1] 대상체 선별
도 1 은 임상 시험 대상체의 임상 특성(clinical characteristic)을 나타낸 표이다.
구체적으로, 20 명의 성인형 스틸병(Adult-onset Still’s disease, AOSD) 환자와 15 명의 건강한 대조군(Healthy controls, HC)이 참여하였다. AOSD 환자는 감염, 기타 자가 면역 질환, 악성 종양을 배제한 후 야마구치(Yamaguchi) 진단 기준에 따라 진단되었다. HC 는 자가 면역, 류마티스 또는 기타 악성 질환의 병력이 없는 건강한 개인이었다.
[실시예 1-2] 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 분리
상기 실시예 1-1 의 각각의 대상체의 PBMC는 BD Vacutainer CPTTM(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)을 이용하여 분리하였다.
[실시예 2] 말초혈액 단핵세포에서 TLR2 또는 TLR7 을 발현하는 세포의 빈도 측정
도 2 는 전체 말초혈액 단핵세포에서 TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 및 TLR9 를 발현하는 세포의 빈도를 측정한 결과를 나타낸 표이고, 도 3 은 AOSD 환자 1 명의 전체 말초혈액 단핵세포에서 다양한 TLR 마커를 제시하는 표면 염색 세포의 유세포 분석 히스토그램의 대표예를 나타낸 이미지이다.
구체적으로, 상기 실시예 1-2 에서 분리한 PBMC에서 여러 종류의 TLR 을 발현하는 세포의 빈도를 각각 측정하였다.
더욱 구체적으로, 각 1 x 106 세포를 FACS 블로킹 버퍼와 함께 배양한 후, 각각 다른 형광이 붙어 있는 항-TLR1, 항-TLR2, 항-TLR4, 항-TLR7 또는 항-TLR9 항체와 반응시킨 후 유세포분석기(flow cytometry, FACS)를 이용하여 항체가 붙은 세포의 수를 카운트하고, 이 세포가 전체 세포(10,000 개)에서 차지하는 빈도를 분석하였다.
이를 통하여, 전혈에서 TLR2 를 나타내는 표면 염색 세포의 평균 빈도가 HC(0.98 ± 0.04, p <0.001)보다 AOSD(1.27 ± 0.43) 환자군에서 유의하게 더 높음을 확인할 수 있었다.
또한, 전혈에서 TLR7을 나타내는 세포의 빈도가 HC(1.06 ± 0.86, p = 0.006)보다 AOSD(1.28 ± 0.29) 환자군에서 훨씬 더 높음을 확인할 수 있었다.
한편, AOSD 군과 HC 사이에 TLR1, TLR4 또는 TLR9 를 나타내는 세포의 빈도에는 유의한 차이가 없음을 확인할 수 있었다.
이는 성인형 스틸병 환자의 PBMC 를 정상 대조군과 비교하였을 때, TLR2 를 발현하는 세포의 빈도 및 TLR7 을 발현하는 세포의 빈도가 더 높음으로, 이를 분석하여 진단이 어려운 성인형 스틸병을 정확하고 신속하게 진단할 수 있음을 시사하는 것이다.
[실시예 3] AOSD 환자에서 질병 활성 마커(disease activity markers) 또는 임상 증상(clinical manifestations)에 따른 TLR2 또는 TLR7 을 발현하는 세포의 빈도 측정
도 4 는 AOSD 환자에서 여러 TLR 마커를 나타내는 염색된 세포의 빈도와 질병 활성 마커 또는 전신 점수(systemic score)의 상관 관계를 나타낸 표이다.
이를 통하여, 전체 세포의 TLR2 빈도는 전신 점수(r = 0.446, p = 0.049), LDH 수준(r = 0.728, p <0.001) 및 페리틴(r = 0.829, p <0.001) 수준과 상관 관계가 있음을 확인하였고, TLR1 빈도는 LDH (r = 0.716, p <0.001) 및 페리틴(r = 0.804, p <0.001)과 상관 관계가 있음을 확인할 수 있었다.
또한, AOSD 환자에서 각 세포 표면 TLR 마커 간의 상관 관계를 평가한 결과, PBMC 에서 TLR2 의 빈도는 TLR4(r = 0.838, p <0.001), TLR7(r = 0.588, p <0.001) 및 TLR9(r = 0.932, p <0.001)와 양의 상관 관계가 있음을 확인할 수 있었다.
도 5 는 AOSD 환자에서 임상 증상에 따른 여러 TLR 발현 수준을 나타낸 표이다.
이를 통하여, 임상 증상으로 관절염(Arthritis)이 발현된 AOSD 환자에서 TLR2 발현 수준이 유의하게 높음을 확인할 수 있었다.
이는 본원에 따른 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물이 관절염이 발현된 성인형 스틸병을 정확하고 신속하게 진단할 수 있음을 시사하는 것이다.
[실시예 4] AOSD 환자의 피부 시료의 조직 병리학적 평가
도 6 은 AOSD 환자의 피부 조직 검사 결과를 나타낸 표이다.
구체적으로, 피부 조직 검사 시료는 2000 년 내지 2019 년에 피부 발진 평가를 위해 32 명의 AOSD 환자, 5명의 습진(eczema) 환자, 5명의 건선(psoriasis) 환자 및 5명의 대조군(normal controls, NC)으로부터 수집되었다. 림프절 조직 검사 시료는 9 명의 AOSD 환자로부터 수집되었다. 이어서, 각 시료에 H&E staining 을 진행하여 3 명의 병리학자가 독립적으로 피부 병리학적 매개 변수를 평가하였다.
도 7 은 AOSD 환자, 습진 환자, 건선 환자 및 대조군에서 수행한 TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 및 TLR9 면역조직화학염색(Immunohistochemical staining) 결과를 나타낸 표이다.
구체적으로, TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 및 TLR9 항체를 각각 1 차 항체로 사용하고, Ventana Optiview DAB 키트 (Ventana Medical Systems Inc.)를 이용하여 면역 조직 화학 염색을 수행하였다. IHC 결과값은 양성 임파상 세포(positive lymphoid cells) 및 histiocytes 의 백분율에 따라 등급을 산정하였다.
이를 통하여, AOSD 환자의 피부 병변에서 TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 및 TLR9를 발현하는 염증 세포의 평균 백분율은 각각 81.9 ± 8.2, 34.8 ± 24.1, 52.3 ± 29.8, 19.3 ± 15.7 및 40.2 ± 27.9 이고, 정상 대조군의 피부에서 TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 및 TLR9를 발현하는 염증 세포의 평균 백분율은 각각 70.0 ± 18.4, 6.2 ± 3.6, 77.0 ± 11.0, 9.6 ± 6.6 및 5.4 ± 4.5 이며, 습진으로 인한 피부 병변에서 TLR1, TLR2, TLR4, TLR7, TLR9를 발현하는 염증 세포의 평균 백분율은 각각 70.0 ± 16.0, 27.0 ± 30.9, 75.0 ± 10.0, 24.4 ± 31.2 및 17.6 ± 20.2 이고, 건선으로 인한 피부 병변에서 TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 및 TLR9를 발현하는 염증 세포의 평균 백분율은 각각 72.0 ± 5.7, 27.2 ± 21.4, 64.0 ± 11.4, 19.3 ± 15.7 및 7.4 ± 9.9 임을 확인할 수 있었다.
비교 분석에 따라, AOSD 환자의 피부 병변에서 TLR2 를 발현하는 염증 세포의 비율은 대조군(HC)에서보다 유의하게 더 큼을 확인할 수 있었다(p = 0.002).
도 8 은 AOSD 환자의 피부에서 염증 세포 등급(CD4/CD8/CD68 염색); 및 CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCR3, CXCL12 및 CXCR4 를 발현하는 염증 세포의 평균 백분율과 TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 및 TLR9를 발현하는 염증 세포의 평균 백분율의 상관 관계를 나타낸 표이다.
이를 통하여, AOSD 환자의 피부에서 TLR2 를 발현하는 염증 세포의 비율은 CXCL10을 발현하는 염증 세포의 평균 백분율과 양의 상관 관계(r = 0.467, p = 0.021)가 있음을 확인할 수 있었다.
도 9 는 AOSD 환자의 피부에서 TLR 마커 간의 상관 관계를 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
이를 통하여, AOSD 환자의 피부에서 TLR2 의 빈도는 TLR4(r = 0.370, p = 0.037) 및 TLR9(r = 0.398, p = 0.024)와 양의 상관 관계가 있음을 확인할 수 있었다.
종합하면, 이는 본원에 따른 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물이 다른 유사 병변(mimickers)으로부터 성인형 스틸병을 구분하는데 유용하게 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.
[실시예 5] AOSD 환자의 림프절(LN) 시료의 면역 조직 화학 염색
도 10 은 AOSD 환자의 림프절 조직 검사 결과를 나타낸 표이다. 구체적으로, AOSD 환자, T 세포 림프종 환자, 조직세포 괴사 림프선염 환자, 결핵 임파선염 환자, 비특이 반응성 과형성증 환자 및 대조군에서 수행한 TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 및 TLR9 면역조직화학염색 결과를 나타낸 표이다.
상기 림프절 조직 검사 시료는 9 명의 AOSD 환자, T 세포 림프종(T cell lymphoma) 환자, 조직세포 괴사 림프선염(histiocytic necrotizing lymphadenitis, HNL, kikuchi 병) 환자, 결핵 임파선염(tuberculous lymphadenitis, Tbc lymphadenitis) 환자 및 비특이 반응성 과형성증(nonspecific reactive hyperplasia) 환자로부터 수집되었다. 이어서, 각 시료에 H&E staining 을 진행하여 3 명의 병리학자가 독립적으로 피부 병리학적 매개 변수를 평가하였다.
TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 및 TLR9 항체를 각각 1 차 항체로 사용하고, Ventana Optiview DAB 키트 (Ventana Medical Systems Inc.)를 이용하여 면역 조직 화학 염색을 수행하였다. IHC 결과값은 양성 임파상 세포(positive lymphoid cells) 및 histiocytes 의 백분율에 따라 등급을 산정하였다.
이를 통하여, AOSD 환자의 림프절에서 TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 및 TLR9 를 발현하는 염증 세포의 평균 백분율은 각각 34.4 ± 17.9, 17.3 ± 16.6, 31.1 ± 13.6, 27.2 ± 20.0 및 18.3 ± 9.7 이고, 반응성 임파절(Reactive Lymph Node, reactive LNs) 환자에서 TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 및 TLR9를 발현하는 염증 세포의 평균 백분율은 각각 7.6 ± 7.6, 8.6 ± 4.7, 12.2 ± 7.2, 8.0 ± 2.7 및 2.6 ± 1.7이며, 결핵 임파선염 환자의 림프절에서 TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 및 TLR9를 발현하는 염증 세포의 평균 백분율은 각각 13.2 ± 13.2, 6.8 ± 5.7, 44.0 ± 26.0, 32.0 ± 4.5 및 11.2 ± 11.2 이며, T 세포 림프종 환자에서 TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 및 TLR9를 발현하는 염증 세포의 평균 백분율은 각각 9.2 ± 6.2, 20.0 ± 31.8, 4.4 ± 3.4, 8.2 ± 7.2 및 3.6 ± 4.0 이고, 조직세포 괴사 림프선염 환자의 림프절에서 TLR1, TLR2, TLR4, TLR7 및 TLR9를 발현하는 염증 세포의 평균 백분율은 각각 24.0 ± 12.9, 4.8 ± 3.0, 52.0 ± 17.5, 49.0 ± 12.5 및 21.0 ± 19.2 임을 확인할 수 있었다.
비교 분석에 따라, AOSD 환자의 림프절에서 TLR2 를 발현하는 염증 세포의 비율은 림프선염 환자의 림프절(kikuchi)에서보다 유의하게 더 큼을 확인할 수 있었으며(p = 0.042), AOSD 환자의 림프절에서 TLR4, TLR7 및 TLR9 를 발현하는 염증 세포의 비율은 T 세포 림프종 환자(p = 0.001) 및 반응성 임파절 환자(p = 0.012)에서보다 유의하게 높음을 확인할 수 있었다.
종합하면, 이는 본원에 따른 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물이 다른 유사 병변(mimickers)으로부터 성인형 스틸병을 구분하는데 유용하게 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (16)
- TLR2 단백질을 포함하는 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 성인형 스틸병은 관절염이 발현된 것을 포함하는 것인, 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 조성물은 TLR7 단백질을 추가로 포함하는 것인, 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물.
- TLR2 항원 단백질 또는 TLR7 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 성인형 스틸병 진단용 키트.
- 제 4 항에 있어서,상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체인 것인, 성인형 스틸병 진단용 키트.
- 제 4 항에 있어서,상기 키트는 항원-항체 결합반응을 이용하여 시료 내 TLR2 단백질 또는 TLR7 단백질을 검출하여 성인형 스틸병을 진단하는 것인, 성인형 스틸병 진단용 키트.
- 제 6 항에 있어서,상기 시료는 개체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 조직, 타액, 눈물, 소변, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액, 골수액, 복수 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것인, 성인형 스틸병 진단용 키트.
- 제 6 항에 있어서,상기 시료는 개체로부터 분리된 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)인 것인, 성인형 스틸병 진단용 키트.
- 제 6 항에 있어서,상기 TLR2 단백질 또는 TLR7 단백질을 검출하는 방법은 웨스턴 블럿, 효소면역측정법(ELISA), 닷 블랏 분석(dot blot assay), 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법, 보체 고정 분석법, 유세포분석법 (FLOW CYTOMETRY ANALYSIS, FACS), 단백질 칩, 샌드위치 측정법(Sandwich assay) 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 수행되는 것인, 성인형 스틸병 진단용 키트.
- 성인형 스틸병이 의심되는 개체의 시료에서 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도를 측정하는 단계;상기 측정된 빈도를 정상 대조군 시료의 빈도와 비교하는 단계; 및상기 대조군에 비하여 상기 성인형 스틸병이 의심되는 개체의 시료에서 상기 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도가 증가한 경우, 성인형 스틸병으로 진단하는 단계;를 포함하는 성인형 스틸병 진단을 위한 정보제공 방법.
- 제 10 항에 있어서,상기 시료는 개체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 조직, 타액, 눈물, 소변, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액, 골수액, 복수 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것인, 성인형 스틸병 진단을 위한 정보제공 방법.
- 제 10 항에 있어서,상기 시료는 개체로부터 분리된 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)인 것인, 성인형 스틸병 진단을 위한 정보제공 방법.
- 성인형 스틸병이 의심되는 개체의 시료에서 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도를 측정하는 단계;상기 개체에 성인형 스틸병 치료제 후보 물질을 처리하는 단계; 및상기 성인형 스틸병 치료제 후보 물질의 치료 효과를 측정하는 단계;를 포함하는 성인형 스틸병 치료제의 스크리닝 방법.
- 제 13 항에 있어서,상기 치료 효과를 측정하는 단계는 상기 치료제 후보 물질을 처리한 개체의 시료에서 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도를 측정하는 단계;상기 치료제 후보 물질을 처리한 개체의 시료에서 측정된 상기 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도를 상기 치료제 후보 물질을 처리하는 단계 전 측정된 상기 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도와 비교하는 단계; 및상기 치료제 후보 물질을 처리하는 단계 전 측정된 상기 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도에 비하여 상기 치료제 후보 물질을 처리한 개체의 시료에서 측정된 상기 TLR2 또는 TLR7을 발현하는 세포의 빈도가 감소한 경우 상기 치료제 후보 물질을 성인형 스틸병 치료제로 고려하는 단계;를 포함하는 것인, 성인형 스틸병 치료제의 스크리닝 방법.
- 제 13 항에 있어서,상기 시료는 개체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 조직, 타액, 눈물, 소변, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액, 골수액, 복수 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것인, 성인형 스틸병 치료제의 스크리닝 방법.
- 제 13 항에 있어서,상기 시료는 개체로부터 분리된 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)인 것인, 성인형 스틸병 치료제의 스크리닝 방법.
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| JUNG JU-YANG, KIM JI-WON, SUH CHANG-HEE, KIM HYOUN-AH: "Roles of Interactions Between Toll-Like Receptors and Their Endogenous Ligands in the Pathogenesis of Systemic Juvenile Idiopathic Arthritis and Adult-Onset Still’s Disease", FRONTIERS IN IMMUNOLOGY, vol. 11, 5 November 2020 (2020-11-05), XP093018088, DOI: 10.3389/fimmu.2020.583513 * |
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