CN103898144B - 突变型TNF-α基因和提高抗原TNF-α基因表达量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了碱基组成如SEQ ID NO 7所示的突变型TNF‑α基因和抗原TNF‑α基因表达的方法，包括以下步骤：以人分泌型TNF‑α基因cDNA克隆为模板，以引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2进行扩增，得到扩增产物T1；以引物SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4进行扩增，得到扩增产物T2；以扩增产物T1和T2为模板，以SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 4为引物，进行重叠PCR扩增，得到突变型TNF‑α基因；双酶切突变型TNF‑α基因后，插入pET28a表达载体中，然后转化大肠杆菌；诱导培养，得到TNF‑α蛋白。本发明将TNF‑α基因中两对相距较近的大肠杆菌稀有密码子突变为大肠杆菌偏爱密码子，密码子优化后的TNF‑α基因表达量提高了至少1.5倍。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是涉及一种突变型TNF-α基因和提高抗原TNF-α基因表达量的方法。
背景技术
肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)是一类具有广泛生物学活性的细胞因子，主要由单核细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、B细胞、T细胞和自然杀伤(NK)细胞等免疫细胞产生。体内TNF-α蛋白有跨膜型TNF-α和分泌型TNF-α。跨膜TNF-α全长233个氨基酸，其中1-76位氨基酸是信号肽(包括跨膜氨基酸)，77-233氨基酸是胞外段。第77-233个氨基酸也是分泌型TNF-α的氨基酸序列，其大小为17KD，以三聚体形式与细胞表面的TNF受体(TNFR)结合，介导多种生物学效应。
TNF-α是迄今发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子，但TNF-α在体内的大量产生和释放则会破坏机体的免疫平衡与其他炎症因子一起产生多种病理损伤。在许多疾病，如心血管疾病、恶病质和败血症休克所致的多器官功能衰竭、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、炎症性肠病(IBD)、移植物抗宿主病(GVHD)和骨髓造血紊乱综合征(MDS)等的病理生理过程中TNF-α起着重要的介质作用。临床上，抗TNF-α的治疗性抗体被成功用于治疗RA、Crohn’s病，同时研究表明其对牛皮癣和强直性脊髓炎也具有肯定的疗效。
目前上市的TNF-α单抗药物主要有两个：Infliximab(英夫利昔单抗，商品Remicade)和adalimumab(阿达木单抗，商品名Humira)。Infliximab是人鼠嵌合单抗，其中约25％为鼠源VH、VL区，75％为人源CH1和Fc恒定区序列，主要用于治疗克罗恩病、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、牛皮癣关节炎、溃疡性结肠炎。Infliximab为瑞士Cilag AG公司生产，在中国由西安杨森公司负责上市。其2011年全球销售额为65亿美元。制备Infliximab的抗原为人的分泌型TNF-α蛋白(Knight D et al.Molecular Immunology.1993)，来源为大肠杆菌表达的重组TNF-α。人的分泌型TNF-α基因共477bp，编码157个氨基酸，存在多个大肠杆菌稀有密码子，其中在基因7-21bp和300-312bp中有两对相距较近的稀有密码子，严重制约TNF-α基因在大肠杆菌中的高效表达。
制备抗TNF-α的单克隆抗体所需要的抗原TNF-α量比较大，往往达数毫克以上。目前商品化的蛋白TNF-α非常昂贵，价格超过70元/μg，而实验室用大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和哺乳动物细胞表达系统生产TNF-α的效率并不高，亟需创新性思维提高人TNF-α基因的表达量。
发明内容
基于此，本发明需要解决的技术问题之一是提供一种抗原TNF-α基因表达的方法，该方法能提高TNF-α基因的表达量。
解决上述技术问题的技术方案如下。
一种抗原TNF-α基因表达的方法，包括以下步骤：
NCOI和HindIII双酶切碱基组成如SEQ ID NO.7所示的突变型TNF-α基因后，分别插入同样双酶切的pET28a表达载体中，然后转化大肠杆菌BL21；诱导培养，得到TNF-α蛋白。
在其中一个实施例中，所述突变型TNF-α基因可以通过以下步骤制备得到：
(1)以人分泌型TNF-α基因cDNA克隆为模板，以引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行扩增，得到突变型TNF-α基因第1-321bp核苷酸的扩增产物T1；
(2)以人分泌型TNF-α基因cDNA克隆为模板，以引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4进行扩增，得到突变型TNF-α基因第280-474bp核苷酸的扩增产物T2；
(3)以扩增产物T1和T2为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4为引物，进行重叠PCR扩增，得到所述突变型TNF-α基因。
本发明需要解决的技术问题之二是提供一种突变型TNF-α基因，该基因可用于抗原TNF-α的表达方法中，提高TNF-α蛋白的表达量。
解决上述技术问题的技术方案如下。
碱基组成如SEQ ID NO.7所示的突变型TNF-α基因。
本发明需要解决的技术问题之三是提供一种上述突变型TNF-α基因的制备方法。
一种突变型TNF-α基因的制备方法，包括以下步骤：
(1)以人分泌型TNF-α基因cDNA克隆为模板，以引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行扩增，得到突变型TNF-α基因第1-321bp核苷酸的扩增产物T1；
(2)以人分泌型TNF-α基因cDNA克隆为模板，以引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4进行扩增，得到突变型TNF-α基因第280-474bp核苷酸的扩增产物T2；
(3)以扩增产物T1和T2为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4为引物，进行重叠PCR扩增，得到碱基组成如SEQ ID NO.7所示突变型TNF-α基因。
在其中一个实施例中，上述重叠PCR扩增的反应体系为：
PrimerSTAR 2.5U/ul，Polymerase：0.5±0.05ul；
100ng/ul，扩增产物T1：3±0.5ul；
100ng/ul，扩增T2：3±0.5ul；
2.5mM dNTP：4±0.5ul；
5x PrimerSTAR Buffer：10±0.5ul
10uM，SEQ ID NO 1：1±0.05ul
10uM，SEQ ID NO 4：1±0.05ul
加H2O至总量为50ul。
在其中一个实施例中，上述重叠PCR扩增的反应程序为：
94℃，3min；
94℃：30s；
55℃：1min；
72℃：40s；
72℃：10min；
循环数35±2。
为了获得足够的抗原TNF-α免疫小鼠制备抗TNF-α单抗，本发明通过设计含有点突变的突变引物和重叠PCR等方法，将TNF-α基因中两对相距较近的大肠杆菌稀有密码子突变为大肠杆菌偏爱密码子。简单的密码子优化后得到的突变型TNF-α基因插入pET28a表达载体，然后转化大肠杆菌BL21，密码子优化后的TNF-α基因表达量提高了至少1.5倍。
附图说明
图1为野生型和突变型TNF-α基因的琼脂糖凝胶电泳结果示意图；其中M：Marker；1：野生型TNF-α基因；2：突变型TNF-α基因；
图2为实施例1的野生型TNF-α基因和突变型TNF-α基因的序列比对结果示意图；
图3为实施例1的SDS-PAGE分析两种转化菌TNF-α表达的情况示意图，其中，M：Marker；1：突变型TNF-α基因转化菌；2：野生型TNF-α基因转化菌。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
实施例1
本发明通过突变引物和重叠PCR等方法，把人的分泌型TNFα基因第三个精氨酸、第101个脯氨酸和第104个精氨酸的大肠杆菌稀有密码子突变为大肠杆菌偏爱密码子，成功提高TNF-α产量1.57倍，具体方法如下：
(1)设计和合成扩增突变型TNF-α基因的含有NCOI酶切位点(下划线)和点突变(斜体碱基)的突变引物
F1：CATGCCATGGTCTCATCTTCTCGAACC(SEQ ID NO.1)；
R1：GCTCTTGATGGCAGAGAGGAG(SEQ IDNO.2)(双下划线为重叠部分)；
F2：GAGACCCCAGAGGGGGC(SEQ ID NO.3)；
含有HindIII酶切位点(下划线)的下游引物
R2：GCTAAGCTTCAGGGCAATGATCCC(SEQ ID NO.4)。
设计和合成扩增野生型TNF-α基因的引物
F3：CATGCCATGGTCAGATCATCTTCTCGAACC(SEQ ID NO.5)；
R3：GCTAAGCTTCAGGGCAATGATCCCAAAG(SEQ ID NO.6)。
(2)以人TNF-α基因cDNA克隆(购自Sino Biological Inc.)为模板，以引物F1(SEQID NO.1)和R1(SEQ ID NO.2)扩增突变型TNF-α基因第1-321bp核苷酸(T1)；以人TNF-α基因cDNA克隆(购自Sino Biological Inc.)为模板，以引物F2(SEQ ID NO.3)和R2(SEQ IDNO.4)扩增突变型TNF-α基因第280-474bp核苷酸(T2)，然后以T1和T2为模板，F1(SEQ IDNO.1)和R2(SEQ ID NO.4)为引物，执行重叠PCR扩增突变型TNF-α(图1)，反应体系和反应程序如下。
T1扩增产物的PCR体系：
T1扩增产物PCR的反应体系
T2扩增产物的PCR体系
T2扩增产物PCR反应体系
重叠PCR扩增突变型TNF-Aα基因的反应体系
重叠PCR反应程序
(3)以人TNF-α基因cDNA克隆(购自Sino Biological Inc.)为模板，用引物F3(SEQID NO.5)和R3(SEQ ID NO.6)扩增野生型TNF-α基因(图1)。
野生型TNF-α基因的扩增体系如下：
野生型TNF-α基因反应体系
把突变型基因和野生型基因送到Invitrogen公司测序，确定其碱基组成分别为如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。野生型TNF-α基因和突变型TNF-α基因的序列比对结果如图2所示，人TNF-α基因第三个精氨酸、第101个脯氨酸和第104个精氨酸的大肠杆菌稀有密码子AGA、CCC和AGG分别突变为大肠杆菌偏爱密码子CGC、CCG和CGT。
(4)使用NCOI和HindIII双酶切突变型TNF-α基因和野生型TNF-α基因，按照常规方法，分别插入同样双酶切的pET28a表达载体中，然后转化大肠杆菌BL21(本实验保存)。37℃，0.5mM IPTG诱导培养转化菌3个小时。蛋白电泳结果如图3所示。经测序验证，所述突变型TNF-α基因转化菌表达的TNF-α蛋白的的碱基组成如SEQ ID NO.9所示。经密码子优化的突变型TNF-α基因转化菌表达的TNF-α蛋白和野生型TNF-α基因转化菌表达的TNF-α蛋白分别占总蛋白的45％和35.8％。使用Bradford试剂盒(生工生物工程有限公司)测定蛋白质浓度，结果发现，突变型TNF-α基因转化菌和野生型TNF-α基因转化菌的总蛋白质浓度分别为99.5mg/L和81.6mg/L。通过计算所得，突变型TNF-α基因转化菌和野生型TNF-α基因转化菌的TNF-α蛋白分别为44.775mg/L和29.2mg/L，经密码子优化后TNF-α基因表达量增加了1.53倍。
突变型TNF-α基因转化菌表达的TNF-α蛋白的氨基酸序列如下：
MVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(SEQ ID NO.9)。
重复以上实验3次，发现经密码子优化后突变型TNF-α基因表达量都增加了1.5-1.7倍。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种抗原TNF-α基因表达的方法，其特征是，包括以下步骤：
NCOI和HindIII双酶切碱基组成如SEQ ID NO.7所示的突变型TNF-α基因后，插入同样双酶切的pET28a表达载体中，然后转化大肠杆菌；诱导培养，得到TNF-α蛋白。
2.根据权利要求1所述的抗原TNF-α基因表达的方法，其特征是，所述突变型TNF-α基因通过以下步骤制备得到：
(1)以人分泌型TNF-α基因cDNA克隆为模板，以引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行扩增，得到扩增产物T1；
(2)以人分泌型TNF-α基因cDNA克隆为模板，以引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4进行扩增，得到扩增产物T2；
(3)以扩增产物T1和T2为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4为引物，进行重叠PCR扩增，得到所述突变型TNF-α基因。
3.根据权利要求1或2所述的抗原TNF-α基因表达的方法，其特征是，所述大肠杆菌是大肠杆菌BL21。
4.根据权利要求2所述的抗原TNF-α基因表达的方法，其特征是，所述重叠PCR扩增的反应体系为：
PrimerSTAR 2.5U/μL，Polymerase：0.5±0.05μL；
100ng/μL，扩增产物T1：3±0.5μL；
100ng/μL，扩增T2：3±0.5μL；
2.5mM dNTP：4±0.5μL；
5x PrimerSTAR Buffer：10±0.5μL
10uM，SEQ ID NO 1：1±0.05μL
10uM，SEQ ID NO 4：1±0.05μL
加H2O至总量为50μL。
5.根据权利要求4所述的抗原TNF-α基因表达的方法，其特征是，
所述重叠PCR扩增的反应程序为：
94℃，3min；
94℃：30s；
55℃：1min；
72℃：40s；
72℃：10min；
循环数35±2。
6.碱基组成如SEQ ID NO.7所示的突变型TNF-α基因。
7.一种突变型TNF-α基因的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)以人分泌型TNF-α基因cDNA克隆为模板，以引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行扩增，得到扩增产物T1；
(2)以人分泌型TNF-α基因cDNA克隆为模板，以引物SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4进行扩增，得到扩增产物T2；
(3)以扩增产物T1和T2为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4为引物，进行重叠PCR扩增，得到碱基组成如SEQ ID NO.7所示的突变型TNF-α基因。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征是，所述重叠PCR扩增的反应体系为：
PrimerSTAR 2.5U/μL，Polymerase：0.5±0.05μL；
100ng/μL，扩增产物T1：3±0.5μL；
100ng/μL，扩增T2：3±0.5μL；
2.5mM dNTP：4±0.5μL；
5x PrimerSTAR Buffer：10±0.5μL
10uM，SEQ ID NO 1：1±0.05μL
10uM，SEQ ID NO 4：1±0.05μL
加H2O至总量为50μL。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征是，所述重叠PCR扩增的反应程序为：
94℃，3min；
94℃：30s；
55℃：1min；
72℃：40s；
72℃：10min；
循环数35±2。
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