CN103260638A - 免疫球蛋白裂解片段疫苗组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备和利用治疗性的免疫特异性的IgG分解产物的方法和试剂，所述产物保留抗原结合性但丧失效应子功能。本发明的试剂可作为免疫原用于人受试者预防性或治疗性疫苗接种目的。
Description
背景技术
技术领域
本发明涉及与靶向特异性的天然的或治疗性免疫球蛋白具有反应性的免疫球蛋白的方法、组合物和用途，其中所述反应结合恢复靶向性天然的或治疗性免疫球蛋白的裂解片段或结合片段固有的生物活性，从而提供或再造所述生物活性。本发明还提供了在疫苗中的用于这种免疫球蛋白体外或体内生产用途的免疫原性的免疫球蛋白片段。
相关领域的说明
循环免疫球蛋白，特别是IgG类的那些抗体，是主要的血清蛋白。众所周知，人蛋白酶与炎性疾病、增殖性疾病、转移性疾病以及传染性疾病有关。如细菌蛋白酶如谷氨酰基内肽酶(金黄色葡萄球菌(Staph.aureus))或链球菌(化脓性链球菌(Strep.pyogenes))的免疫球蛋白降解酶那样，人蛋白酶诸如基质金属蛋白酶(MMP)和嗜中性粒细胞弹性蛋白酶在各蛋白酶特有的残基处裂解IgG重链多肽。重链中的裂解位点聚集在被称为铰链域的区域周围，两条重链的链间二硫键出现在该区域中。铰链以下的区域构成Fc区，包含负责IgG的效应子功能的结合位点。在微生物中，蛋白酶的表达是一个潜在的附属毒理途径，以使生物体避免调理作用(Rooijakkers等人，Microbes and Infection7：476-484，2005)，其通过裂解铰链下方导致的Fc结构域的蛋白分解释放有效地中和那些将导致攻击和杀害病理细胞的功能。因此，特异性蛋白酶的活动可以表示众多疾病状态，包括癌症、炎性疾病以及传染性疾病。
结合到已裂解的铰链域的天然IgG自身抗体的存在，进一步证实病理体内环境中的IgG降解程度增大(Knight等人，1995，Nasu等人，1980，Persselin和Stevens，1985，Terness等人，1995，J Imunol.154：6446-6452)。这些自身抗体还结合源自一些蛋白酶(包括木瓜蛋白酶和胃蛋白酶)的Fab和F(ab′)2片段，并与保留在F(ab′)2分子中作为C-末端残基的下铰链域具有特别强烈的反应性(Terness等人，1995)。已有报道检测到实际裂解产物(Fick等人，1985，Goldberg和Whitehouse，1970，Waller，1974)，但尚未开发出能使这些片段作为生物标记的强力测定方法，这可能是由于各片段被快速清除导致血清中浓度低，或由于在血液和组织中的大量完整免疫球蛋白当中检测所述片段的技术问题。过去制备了特异性抗体(Eckle等人，1988，Adv.Exp.Med.Biol.240：531-534)，用于检测人嗜中性粒细胞弹性蛋白裂解的Fc结构域，在类风湿性关节炎患者的滑液中直接检测到0.62ug/ml的中位浓度的Fc，但在患有其它类型的关节疾病的患者的滑液中没有检测到。
校正在体内IgG抗体功能损失和补偿在患蛋白酶特异性疾病活性的受试者体内的IgG裂解过程的能力，迄今尚未设想作为一种治疗策略。
发明内容
本发明涉及用于生产IgG裂解产物特异性抗体的抗体和疫苗，所述裂解产物导致能够降解靶标结合或非结合IgG的蛋白水解酶的释放。所述抗体和疫苗用于恢复经受蛋白酶降解的治疗性IgG抗体组合物的效应子功能。
在本发明的另一个实施例中，提供了表示新制备的IgG裂解产物C-末端序列的疾病特异性裂解位点肽。这些肽也可用于本发明的抗IgG裂解产物抗体的免疫、平移和选择。在一个方面，所述肽选自至少五(5)个连续氨基酸，所述连续氨基酸选自蛋白酶裂解位点氨基末端侧上的人IgG铰链区序列SEQ ID NO：1、2、3或4。在一个实施例中，所述多肽选自SEQ ID NO：5-11和它们的N-末端截短形式。另一方面，提供了基于人IgG分子的蛋白水解裂解位点来设计肽免疫原的方法。
在本发明的一个实施例中，提供了制备本发明的抗IgG裂解产物抗体的方法，包括用于重组产生抗IgG裂解产物抗体的核酸序列、载体以及宿主细胞。在抗IgG裂解产物抗体的制造方法的另一个方面，提供了免疫宿主动物，所述宿主动物提供了本发明的抗体。在一个具体实施例中，所述动物是人，并且所述抗IgG裂解产物源自选自至少五(5)个连续氨基酸的裂解位点多肽免疫原的给予，所述连续氨基酸选自蛋白酶裂解位点氨基末端侧上的人IgG铰链区序列SEQ ID NO：1、2、3或4，例如序列SEQ ID NO：5-11和它们的N-末端截短形式。
在本发明的另一个实施例中，提供了检测抗IgG裂解产物的试剂盒，包括本发明的抗IgG裂解产物抗体，其用于诊断或监测以IgG裂解蛋白酶产生为特征的疾病。
本发明的另一实施例，是作为一种治疗方法将抗IgG裂解特异性抗体给予患者的方法，从而恢复经受蛋白酶降解的治疗性抗体组合物的效应子功能。按照该方法，对IgG裂解产物的效应子功能的恢复是通过给予本发明的特异性结合IgG裂解产物的抗体。
在本发明的另一个方面，对经受以特异性蛋白酶为疾病特征的患者可以通过给予选自人IgG的铰链区序列的至少五(5)个连续氨基酸的裂解位点特异性肽免疫原来治疗，所述序列选自SEQ ID NO：1、2、3或4；并且它们的位置位于蛋白酶裂解位点的氨基(N)末端侧的位置(例如，序列SEQ ID NO：5-11和N-末端截短形式、物种同源物和化学同系物)，从而在这样的患者中恢复IgG裂解产物的效应子功能。在一个具体实施例中，裂解位点特异性肽免疫原由一个肽片段表示，该片段是以氨基酸Glu233(EU编号)终止的N-末端裂解人IgG1，并且所述疾病选自金黄色葡萄球菌(S.aureaus)感染，其特征在于组织蛋白酶G的谷氨酰基内肽酶I(GluV8)释放、或嗜中性粒细胞释放。在另一个实施例中，裂解位点特异性肽免疫原由氨基酸Pro232(EU编号)终止的N-末端裂解的人IgG1肽片段表示，并且其特征在于以MMP-3、MMP-12的释放为特征的人癌症形式。在另一个实施例中，裂解位点特异性肽免疫原由化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)IdeS裂解的终止在Gly236(EU编号)的人IgG1的N-末端多肽片段表示，并且所述疾病是链球菌(Streptococcus spp)感染。
在本发明的另一个实施例中，提供了包括本发明的抗IgG裂解产物抗体和使用说明的试剂盒。
附图说明
图1描绘了典型的哺乳动物IgG类抗体的多种结构域，示出它们与铰链和被定义为Fab、F(ab′)2和Fc的胃蛋白酶和木瓜蛋白水解裂解产物的关系。
图2示出铰链区周围的人IgG1重链序列；主要蛋白水解裂解的位置用箭头表示。
图3是曲线图，示出在三个不同蛋白酶MMP-3、V8和IdeS酶促产生的人IgG片段免疫的兔中产生的抗血清的相对特异性；用具有下列序列的缀合肽免疫兔：TCPPCPAP，SEQ ID NO：1的残基7-14，对应于MMP-3裂解位点；TCPPCPAPE，SEQ ID NO：1的残基7-15，对应于谷氨酰基内肽酶裂解位点；以及TCPPCPAPELLG，SEQ ID NO：1的残基7-18，对应于IdeS裂解位点。三个单独的兔多克隆抗裂解位点特异性肽抗体制剂的ELISA反应性，由它们与F(ab′)2片段(来自Mab3IgG1k)，以及ScIgG和完整的IgG结合的能力进行了测试。F(ab′)2片段产生自人重组MMP-3、金黄色葡萄球菌的谷氨酰基内肽酶I和来自化脓性链球菌的重组IdeS。抗体制剂示出与scIgG和F(ab1)2的结合，但未结合完整的IgG。柱形对应于三个重复孔的均值的标准偏差。
图4示出兔多克隆抗体制剂与抗体消化反应性的蛋白质印迹：完整的或已用MMP-3、谷氨酰基内肽酶(V8)或IdeS部分消化的MAB3人IgG1，其通过SDS-PAGE分离，然后通过免疫印迹法，其中(A)用抗人IgG(H+L)[泳道1-4]或抗...LLG兔多克隆[泳道6-10]印迹。(B)用抗...PAP[泳道2-5]或抗...APE[泳道7-10]印迹。通过板A泳道5和板B泳道6与抗体孵育前裂解印迹，以便用单独的抗血清检测。
图5是使用RAH-1试剂对来自5名类风湿性关节炎的滑液中IgG降解的分析样品进行显影的蛋白质印迹，并与来自使用MMP-3、谷氨酰基内肽酶(V8)以及IdeS进行的单克隆IgG1的体外蛋白水解消化物的样品进行比较。
图6是在来自经诊断患有图中所示疾病的患者的人血清样品中通过试剂RAH-1检测到的scIgG各数值的点图，与正常人血清样品组中相比较，其中线条表示各组的均值。
图7示出靶向作为肽类似物的人IgG1铰链的裂解片段和在指定残基处终止的抗体片段(见图3)的家兔单克隆抗体的相对反应性。
图8示出三种不同的靶向人IgG1铰链裂解片段的家兔单克隆抗体在对用IdeS消化IgG1而产生的F(ab′)2恢复补体依赖性细胞裂解(CDC)时的浓度依赖性，与所制备的抗裂解肽类似物的家兔多克隆抗体(rb poly)相比较。
图9示出对照兔(黑线)与免疫兔(虚线)的金黄色葡萄球菌接种后的克隆菌落细菌总数平均对数值和whiffle球中的SEM。
图10为用金黄色葡萄球菌接种家兔的Kaplan Meier生存曲线，示出对照兔(黑线)和免疫兔(虚线)。
图11示出五组小鼠肿瘤体积随着时间的变化，所述小鼠植入人乳腺癌细胞(MDA-MB231)和单独的肿瘤定向的Mab(860)处理(实心三角形)；蛋白酶处理的860，860scIgG制剂(实心圆)；抗铰链抗体制剂2095-2；860scIgG加抗铰链抗体制剂2095-2；或PBS(空心圆)。
图12示出犬血小板计数中的抗血小板整联蛋白Mab(c7E3)或Mab的蛋白水解裂解产物在单独施用和结合抗裂解位点mAb、2095-2下的循环血小板数量效应，其中每个点表示三只动物测定的平均值±标准偏差。
序列表说明
具体实施方式
缩写
Abs＝抗体；ADCC＝抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；CDC＝补体定向细胞毒性；HNE＝人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶；IdeS＝化脓性链球菌的免疫球蛋白降解酶；Ig＝免疫球蛋白；Mab＝单克隆抗体；MMP＝基质金属蛋白酶或金属蛋白酶；N-terminal＝N-末端；scIgG＝单链裂解的IgG；SA＝链霉抗生物素蛋白；GluV8＝来自金黄色葡萄球菌的谷氨酰基内肽酶I。
定义
抗体片段：Fab、F(ab′)2和Fc是描述IgG抗体蛋白水解裂解产物的术语，其可以通过重链(铰链区的核心)之间的二硫键的还原进一步解离。经典的蛋白水解产生的抗体片段，包括：Fab(例如，通过木瓜蛋白酶消化)、Fab′(例如，通过胃蛋白酶消化和部分还原)和F(ab′)2(例如，通过胃蛋白酶消化)、facb(例如，由纤溶酶消化)、pFc’(例如，通过胃蛋白酶或纤溶酶消化)、Fd(例如，通过胃蛋白酶消化、部分还原和重新组合)，其中还原消除了形成链间联系的半胱氨酸残基之间的二硫键(参考图1)。由于Fc片段被描述为木瓜蛋白裂解片段，所述木瓜蛋白酶在相对于铰链处在N-末端的残基224(EU编号)处解离人IgG1，所以认为Fc片断保留铰链以及重链间二硫键，然而，由于抗体中重链CH2-CH3二聚体之间高度缔合，甚至在不存在二硫键(铰链)的情况下二聚体结构也得以保留。因此，如本文所使用，“Fc”是指由重链CH2-CH3区段缔合(不管是共价结合还是非共价结合)而形成的二聚体结构。应理解，由于非共价结合的Fc具有在变性剂如去污剂的存在下离解成CH2-CH3单体的能力，它可与二硫键连接的Fc相区别。
人抗体是基本结构为两个异源二聚体的二聚体形式的免疫球蛋白，其中每个异源二聚体由一条重链和一条轻链多肽组成。
术语“蛋白水解”、“蛋白酶”、“蛋白水解酶”、“蛋白水解的酶”可替换使用，意指能够裂解多肽链产生两个或多个片段的物质，例如酶，其中所述酶在正常温度下和在生理条件下或生理相容性条件下起作用。生理条件包括自然存在于健康或有疾病的活哺乳动物体内的任何温度、缓冲剂、阳离子、阴离子、底物、催化剂、pH、辅因子等。然而，蛋白酶可衍生自非哺乳动物来源，诸如来自可为任何类型的生命形式的病原体。蛋白酶是作用于肽键的水解酶。
“scIgG”或“单链裂解的IgG”是指具有包含两个重链和两个轻链的异二聚体结构的任何免疫球蛋白G类分子，其中一个重链已经经受在单条重链上的蛋白水解裂解，而另一个重链保持完整。
与从N-末端到C-末端残基书写的氨基酸序列有关的“上游”是指该序列中自给定的残基起至N末端的残基。相反地，与氨基酸序列相关的“下游”是指该序列中自给定的残基起至C-末端的残基。
亚结构的抗体功能
通常，免疫球蛋白、抗体由包含约100个氨基酸的连续多肽链区域组成，且每个大小约10-11kDa，所述区域显示特征性折叠的球形结构域并表示结构的不同元件。γ免疫球蛋白类是蛋白大小约150kDa的抗体(IgG)，其蛋白内的结构域组合成片段；Fab片段包括轻链可变区结合到轻链恒定区的单链，该单链通过二硫键连接与重链可变区相邻的重链第一恒定区(CH1)；Fc是由两个通过铰链区的两个或三个二硫键相连的邻接重链恒定区(CH2和CH3)组成。研究表明，蛋白酶，诸如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，优选地在片段之间的位点裂解抗体。两个完全相同的Fab片段通过铰链区与一个Fc片段连接，由此形成Y形构象的150kDa结构(见图1)。使用木瓜蛋白酶产生的Fab片段通常具有46kDa的分子量，非还原的F(ab′)2通常具有90-100kDa的分子量，非糖基化非还原Fc具有约50-60kDa的表观分子量。然而，由于各抗体种类和某种类中各亚类抗体稍有不同，确切的裂解性质和位置以及和裂解产物也不同。
抗原通过每对轻重链的可变结构域中的抗原结合位点来结合抗体(图1)。被称为效应子的其它分子或细胞结合分子其余部分中的其它位点，即抗原结合位点以外的位点，抗体的这个部分包括变异性较弱的免疫球蛋白序列——抗体的“恒定部分”，这些位点尤其位于由重链的延伸超过下列轻链末端的部分构成的Fc区：上铰链、下铰链、CH2和CH3结构域。
抗体具有通过效应分子的结合而介导的几种效应子功能。例如，补体的C1组分结合抗体会激活补体系统。补体的激活在调理作用和细胞病原体的裂解(被称为补体介导的细胞毒作用或CDC的过程)中重要。补体的激活会刺激炎症反应，且还可涉及自身免疫性超敏反应。另外，抗体通过Fc区结合细胞，即抗体Fc区上的Fc受体位点结合细胞上的FC受体(FcR)。有许多种对不同类别的抗体有特异性的Fc受体，所述抗体包括IgG(γ受体)、IgE(η受体)、IgA(α受体)以及IgM(μ受体)。抗体结合细胞表面的Fc受体会引发许多重要的和各式各样的生物反应，包括吞噬和破坏抗体包裹颗粒，清除免疫复合物，杀伤细胞裂解抗体包裹的靶细胞(被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，补体介导的细胞毒作用，或ADCC)，释放炎症介质，胎盘转移，内皮细胞再吸收(通过新生儿Fc受体或FcRn)和调节免疫球蛋白产生。
一般地，围绕铰链域的序列在IgG亚型(SEQ ID NO：1-4)和哺乳动物物种之间是保守的。IgG1(SEQ ID NO：1)和IgG3(SEQ ID NO：1)亚型包括Leu-Leu对，其作为结合Fcγ受体和Fc效应子功能的结构基序。“铰链核心”下游的其它残基也是保守的，所述铰链核心通常包括至少由两个非半胱氨酸残基分开的一个半胱氨酸。
人IgG1的裂解产物(单链裂解或scIgG)是蛋白水解发生在包含IgG的两条重链多肽中的之一时由人和细菌蛋白酶所形成，同时不破坏如前面所提到的异二聚体分子的整体组成(Gearing AJH等人，Immunol.Lett.81：41-48，2002；Vincents等人，Biochemistry43：15540-15549，2004)。相比较其它片段，scIgG可能是存在于血清中的体内水解的主要产物。
在生理条件下蛋白水解裂解的动力学导致蛋白水解裂解的IgG处于scIgG构象的比例大于作为多个裂解事件的产物的物质，例如F(ab′)2(图1)(U.S.专利序列号12/185,333，2008年8月4日提交)。在检测大量蛋白酶的过程中确定到，完整IgG中的重链恒定区的第一裂解进行得比第二裂解要快，这样的顺序导致单链裂解的物质暂时聚集。这种单链裂解形式的IgG分子与其完整母体在许多方面(例如，分子大小、抗原结合、被蛋白A/G识别的能力)不能区分。
使用本发明中的裂解位点类似肽生产能够特异性结合包括F(ab′)2和scIgG在内的蛋白水解裂解产物的抗体，其能识别人IgG1的裂解产物但不识别完整的IgG。上述共同未决的专利申请还进一步公开了可选择的特异性识别保留抗原结合特异性的IgG酶切产物以及恢复裂解IgG的效应子功能(例如CDC和ADCC)的抗体制剂。
蛋白水解酶和疾病的相关性
申请人证实，在患有类风湿性关节炎的患者的炎性渗出物如滑液中，可检测到其大小与体外酶组(enzyme panel)所产生的那些产物相似的抗体裂解产物，包括scIgG在内。另外，在多种疾病的患者的血清中可检测到scIgG，在所述疾病中，局部的蛋白酶解活性是已知的病理特征。这些疾病状态中的scIgG的浓度比健康正常志愿者高，且比患有较不严重的炎性疾病的患者的血清高。
表1是关于人蛋白酶活性和人IgG1的两个细菌蛋白酶的关系的结果的图表。术语“凝血蛋白酶”是指血清凝血级联反应蛋白质，包括：FXIIa、FIXa、FXa、凝血酶和活化蛋白C；纤溶酶是与纤溶酶原激活物共同孵育的纤溶酶原；TPA、链激酶和葡激酶；“独纤溶酶原激活剂”是不含纤溶酶原；并且MMP在材料中具体是以活性形式或酶原获得的重组蛋白酶；并且“无”表示在24小时内没有检测到裂解。除非指明，否则所有的酶均为人的酶。对IgG1抗体重链残基命名为EU编号系统，其中SEQ ID NO：1的25个氨基酸残基对应于完整成熟重链的残基219至243。
表1：
(1)Barrett A.J.，Rawlings N.D.and Woessner J.F.(Eds.)，Handbook ofProteolytic Enzymes Vol.1，Elsevier，Amsterdam，2004(Barrett A.J.、Rawlings N.D.和Woessner J.F.(编辑)，《蛋白水解酶手册》，第1卷，Elsevier，Amsterdam，2004年)。
(2)Barrett A.J.，Rawlings N.D.and Woessner J.F.(Eds.)，Handbook ofProteolytic Enzymes Vol.2，Elsevier，Amsterdam，2004(Barrett A.J.、Rawlings N.D.和Woessner J.F.(编辑)，《蛋白水解酶手册》，第2卷，Elsevier，Amsterdam，2004年)。
(3)Powers，JC.“Proteolytic Enzymes and Disease Treatment”，1982.In：Feeneyand Whitaker(eds)Modification of Proteins：Food，Nutritional，andPharmacological Aspects，Advances in Chemistry Series198，ACS，Washington，D.C.1982pp347-367(Powers，JC，“蛋白水解酶和疾病治疗”，1982年，发表于：Feeney和Whitaker(编辑)，“蛋白修饰：食品、营养和药理方面”，《化学进展丛书》，第198卷，第347-367页，ACS，Washington，D.C.，1982年)。
(4)Tchetverikov I.，Ronday H.K.，van El B.，Kiers G.H.，Verzijl N.，TeKoppeleJ.M.，Huizinga T.W.J.，DeGroot J.and Hannemaaijer R.，2004.MMP Profilein paired serum and synovial fluid samples of patients with rheumatoid arthritis.Ann.Rheum.Dis.63，881-883(Tchetverikov I.、Ronday H.K.、van El B.、Kiers G.H.、Verzijl N.、TeKoppele J.M.、Huizinga T.W.J.、DeGroot J.和Hannemaaijer R.，2004年，“患有类风湿性关节炎的患者的血清和滑液样品的MMP特征”，Ann.Rheum.Dis.，63，第881-883页)。
(5)Vincents B.，von Pawel-Rammingen U.，
L.and Abrahamson M.，2004.Enzymatic characterization of the streptococcal endopeptidase，IdeS，reveals thatit is a cysteine protease with strict specificity for IgG cleavage due to exositebinding.Biochemistry43，15540-15549(Vincents B.、von Pawel-RammingenU.、
L.和Abrahamson M.，2004年，“链球菌内肽酶IdeS的酶学鉴定表明其为因外位点结合而具有IgG裂解严格特异性的半胱氨酸蛋白酶”，《生物化学》，第43卷，第15540-15549页)。
(6)Sun H.，Ringdahl U.，Homeister J.W.，Fay W.P.，Engleberg N.C.，YangA.Y.，Rozek L.S.，Wang X.，Sjobring U.，Ginsburg D.，2004.Plasminogen isa critical host pathogenicity factor for group A streptococcal infection.Science.305，1283-1286(Sun H.、Ringdahl U.、Homeister J.W.、Fay W.P.、Engleberg N.C.、Yang A.Y.、Rozek L.S.、Wang X.、Sjobring U.、GinsburgD.，2004年，纤溶酶原对于组A链球菌感染是关键的宿主病原因子，《科学》，305，第1283-1286页)。
通过产生亲和纯化的多克隆抗体(家兔)使得能够完成包括scIgG在内的裂解IgG的检测，所述抗体特异性结合裂解的重链的铰链二硫键处或周围的新暴露表位，但与完整的非裂解的IgG分子不起反应。能在血清中检测scIgG的确证理由是它具有与完整IgG相似的长期循环寿命。能够检测患病个体的体液或血液中的scIgG，这是一种潜在新型的生物标记策略。
抗体制备
用于本发明方法的具有特异性的裂解位点特异性肽作为诊断，预防或治疗剂的抗体，可利用本文所例举的标准、方法、免疫原通过本领域熟知的几种方法来提高或选择在本发明实践中有用的抗体。
一方面，从杂交瘤方便地获得抗体，所述杂交瘤通过使用观察到的裂解片段或由此衍生的裂解位点特异性类似肽来免疫动物而制备。因此，可通过使用抗体裂解片段(包括F(ab′)2和scIgG或其N末端截短形式或结构类似物)免疫动物或筛选抗体文库来获得抗体。在一个实施例中，用于产生抗体的肽选自SEQ ID NO：5-11中的IgG1的4聚体肽片段，其中多肽或肽的C-末端残基表示如表1中所示残基裂解对的裂解位点的上游残基(N-末端侧)。包含例如IgG1的-T-C-P-P-C-的铰链基序的片段(SEQ ID NO：1的残基7-11)将由于二硫键的形成成为多聚体，除非半胱氨酸残基(C)被例如丙氨酸(A)或丝氨酸(S)残基取代从而产生裂解肽的化学同系物的形式。
在一个具体实施例中，生产抗体使用对应于MMP-3裂解位点(TCPPCPAP，SEQ ID NO：1的残基7-14)氨基末端侧上氨基酸序列的8聚体肽，或对应于谷氨酰基内肽酶位点(TCPPCPAPE，SEQ ID NO：1的残基7-15)的延伸肽；或IdeS位点(TCPPCPAPELLG，SEQ ID NO：1的残基7-18)。当作为免疫原，所述肽可以通过N-末端或通过一个附加的连接子残基或肽方便地共价连接到匙孔血蓝蛋白(KLH)或其它载体蛋白如血清白蛋白的键孔。
具有期望特异性的抗体可使用任一本领域公知的杂交瘤技术获得，参见例如Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.，NY，NY(1987-2001)；Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Harlow和Lane，antibodies，a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，NY(1989)；Colligan等人编辑，Current Protocols inImmunology，John Wiley & Sons，Inc.，NY(1994-2001)；Colligan等人，Current Protocols in Protein Science，John Wiley & Sons，NY，NY(1997-2001)，每篇均以引用的方式并入本文。本发明的抗体可包括或来自任何哺乳动物，例如，包括但不限于人、小鼠、兔、大鼠、啮齿动物、灵长类动物、或它们的任何组合，并且包括分离自人、灵长类、啮齿类动物、哺乳动物、嵌合、人源化的和/或CDR-移植的抗整联蛋白抗体、免疫球蛋白、酶切产物以及其它指定的部分和变体。
也可用噬菌体展示抗体或肽文库来鉴定对scIgG和其它抗体片断有期望的特异性的新型结合结构域。
在引生或选择可用于本发明的抗体或其它结合物时，用于这个目的的特异性试剂是本发明的另一方面。为此目的而开发的特定免疫原或测试试剂，其特征为包含绕IgG1的铰链核心残基，包括但不限于残基SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFP(SEQ ID NO：1)，如图3所示。其它的人同种型抗体(与蛋白水解酶接触生成抗体片段时)铰链区域也可以作为类似物来源以实现制备，选择或测试抗体或酶裂解产品的其它结合分子的目的。人IgG4重链的一个类似区域包括残基TCNVDHKPSNTKVDKRVESK YGPPCPSCPA PEFLGGPSVF LF(SEQ ID NO：2)和分别示于SEQ ID NO：3和4的IgG2和IgG3。在每一种情况下，所述肽由至少5个连续氨基酸组成，所述氨基酸选自位于蛋白酶裂解位点氨基末端侧的人IgG的铰链区序列SEQ ID NO：1、2、3或4。在一个方面，用于产生抗体的特定抗原或肽至少包括IgG1铰链核心(定义为残基-C-P-P-C-)。在特定的实施例中，肽是人IgG1下铰链的12聚体肽类似物和具有序列TCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：1的残基7-18)的邻接的CH2结构域。
制备用于生产、选择或测试抗体或蛋白水解裂解产品的其它结合分子的肽片段的一般方法是：a)确定被蛋白酶裂解的抗体重链一对残基的N-末端残基，所述蛋白酶例如在表1中所示例列举的特异性蛋白酶，b)从其中N-末端残基将成为所定义序列的C-末端的裂解位点确定5-14或更多个上游残基，和c)产生所需目的足够量的肽。任选地，在无反应性侧基团存在或反应性侧基团是不可逆的或可逆阻塞时，任一半胱氨酸残基可以被丝氨酸或丙氨酸或其它的氨基酸取代。如上描述的肽选自SEQ ID NO：5-11和它们的N-末端截短形式。所述肽可进行标记、缀合或交联或者互相混合或与佐剂混合使用，目的是检测结合，或者作为免疫原或者用于例如从噬菌体展示文库选择结合物(binder)的淘选靶标。
一方面，本发明还提供了这样的分离核酸，其包含与编码前述特异性肽或其抗体的多核苷酸、与该多核苷酸互补、或与该多核苷酸杂交，包括至少一种指定序列、结构域、其部分或变异体。本发明包括编码至少一种如本文所述对scIgG具有特异性的分离单克隆抗体的分离核酸、和包含所述分离核酸的核酸载体、和/或包含所述分离核酸的原核或真核宿主细胞。此外，任选地，宿主细胞可选自大肠杆菌(E.Coli)，COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、海拉细胞、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞、或它们的任何衍生的、永生的或其转化的细胞中的至少一种。还提供了一种用于产生至少一种本发明的抗体的方法，其包括在体外、体内或原位条件下翻译编码抗体的核酸，使得所述肽或抗体以可检测或可回收的量表达。
使用方法
诊断
使用IgG裂解肽制备的抗体可作为检测试剂，用于鉴定或确定起源于、引起或或以其它方式与蛋白水解酶活性和蛋白水解酶(蛋白酶)相关联的疾病的病理或进程。所述疾病和过程包括促成、加剧、产生于或起因于感染、中风、血管疾病、心肌梗塞和几种其它急性和慢性炎性病症的那些疾病和过程。申请人已经证实，蛋白酶解活性的一种特别有用的生物标记是scIgG，其在某些前述病症中以增加的水平检测到。由于scIgG在病理或病理过程或感染的部位局部产生，所以scIgG提供了这些过程的独特和特异性标记，作为特定组织或细胞类型在疾病部位的参与情况的度量。
在本发明的方法的一个实施例中，从疑似正患有、已经患有具有蛋白酶水平升高特征的疾病或因患有该疾病而进行了治疗的受试者获取样品。使样品与对IgG裂解片段具有特异性的结合剂(诸如抗体制剂)接触，已知所述IgG裂解片段因疾病刺激的蛋白酶和血清IgG群体之间的接触而产生。
本发明的方法可用于评价先前诊断患有疾病或病症的患者是否处于重病的危险(例如，癌症转移、迅速蔓延的肿瘤生长、持续感染等)之中。
在某些情况中，例如在癌症患者中，scIgG的检测可用于指示涉及转移扩散的重病进展，已知转移扩散涉及蛋白酶的活动(elaboration)，尤其是MMP。在某些方面，肿瘤性疾病通常和炎症过程、组织修复以及痊愈共有这些机制(Coussens，L.M.和Werb，Z.2002，Nature420(19)：860-867)之间互感的变化。其它研究已经显示，例如脂质降低与心脏和血管事件(例如，血栓形成)的危险降低有关，也与MMP(例如，MMP-2和MMP-9)的降低有关，这些酶是由动脉粥样硬化斑块产生(Deguchi，J，Maanori，A.，Ching-Hsuan，T.等人，2006，Circulation114：555-62)之间互感的变化。因此，本发明的方法特别可适用于但不限于患有严重关节炎综合征(RA，强直性脊柱炎)、某些癌症(尤其是炎性乳腺癌)、重症冠状动脉疾病(心肌梗塞和充血性心力衰竭)以及其它疾病例如哮喘的患者。本发明的方法可用于将其中病理生理涉及或诱导能够作用于IgG的蛋白酶的那些疾病和病症与不具有水平增高的分泌性蛋白酶或其中蛋白酶不裂解IgG的疾病区分开来。
因此，尽管使用本发明描述的试剂的方法对于检测裂解的片段具有特异性，但对于裂解片段的更具有特异性的分析包括对于裂解的抗体的可变区的结合特异性的分析。例如，将抗原结合选择性与片段化抗体检测相结合的固相测定可用于确定某些抗原和蛋白酶是否在受试者中共定位，由此提供关于蛋白水解活性部位的组织、疾病或病理的性质的信息。
抽取血液是最常实践的从健康或患病的人或动物受试者进行组织取样的形式。在此程度上，由于scIgG可见于全身，并不限于形成部位，即蛋白酶活性的部位，它是可能局限于特定隔室的疾病活动的报告标记。一种这样的隔室是滑液。因此，血液或血清采集提供了用于使用本发明提供的试剂和方法检测早期疾病的方便和可行的来源。可选地，局部环境如RA滑液、肺渗出物、活组织检查等的取样也可在任何阶段(包括诊断)应用于患者或应用于重症疾病的患者。裂解的抗体片段可在所述组织样品中通过直接染色(免疫组织化学法)检测到或在衍生自所述样品的切片样品中检测到。
组织样品包括血液应该进行处理，以抑制任何残留的活性蛋白酶。金属的螯合作用(例如，EDTA)可有效抑制MMP。碘乙酰胺可阻断半胱氨酸蛋白酶(例如，IdeS)，使用DFP和相似的化合物可阻断丝氨酸蛋白酶。活性蛋白酶存在于滑液中，因此应进行处理。样品还应冷冻维持直到测定时为止。一旦已经合适地处理样品，可将本发明的scIgG特异性试剂用于本领域已知或还待于开发的基于任何抗体的技术，例如ELISA、基于微珠的形式(bead-based format)、RIA。
本发明的抗IgG蛋白水解裂解片段试剂可包装于试剂盒中用于研究或诊断用途，和用于和其它试剂连同用于检测的说明书一起商业销售，所述其它试剂例如缓冲液和标准物例如完整的人IgG和已知量的裂解的IgG，所述说明书指导如何测量和如果需要的话定量来自受试者的组织样品收获物中的IgG蛋白水解裂解片段。
抗体治疗
对铰链肽裂解片段具有免疫特异性的本发明抗体能够结合保留抗原结合结构域例如Fab、F(ab′)2、scIgG的蛋白水解的IgG的残留物，并由此通过提供完整Fc区而恢复Fc相关的结合特性和伴随的效应子功能。因此，通过本文教导的方法产生的抗体或具有体内结合蛋白水解产生的抗体片段的特性的抗体可用作治疗分子。本发明的抗IgG裂解片段抗体可用于治疗患有具有疾病诱导的IgG蛋白水解裂解的特征的疾病的患者。一方面，抗IgG裂解片段抗体可用于恢复保留靶标特异性结合能力的抗体片段的效应子功能。
如上所述使用本发明的肽作为免疫原或选择试剂的方法，可制得抗IgG的裂解位点抗体用于治疗或预防人疾病或病变。也可使用特异性裂解铰链片段的其它结合结构域，只要该结合结构域与能够恢复对免疫特异性IgG裂解产物的效应子(例如CDC或ADCC)功能的Fc域结合结构域相关联。当然，也涵盖用于本发明目的的加强一些FcR驱动相互作用和衰减其它作用的改性的或变体Fc序列。改性Fc区域的教导存在于例如US6737056、US7083784、US7317091、US7355008、US7364731、US7371826、US7632497、US7670600、US20040002587A1、WO06105338A2WO200905849和WO2009086320。
因此，本发明提供了用于重组生产抗-IgG裂解产物抗体或能够结合蛋白酶裂解IgG和恢复效应子功能的Fc融合蛋白的核酸序列，载体和宿主细胞。
疫苗
本发明抗体对裂解位点特异性片段的免疫特异性，能够结合保留抗原结合结构域(例如FAB，F(ab′)2，scIgG)的酶裂解IgG的残余，并且通过提供一个功能性的FC-区域从而恢复Fc相关的结合特性和随之而来的抗体效应子功能，该抗体可能会在受试者体内通过与本发明的裂解片段肽免疫来诱导。可通过用蛋白酶裂解位点的特异性肽或蛋白水解裂解的IgG片段免疫宿主动物，并从动物血清中回收抗体来制备抗IgG裂解产物抗体。在这种方法中，被免疫的动物是用本发明所描述方法或本领域已知的方法制备的抗体来源，该抗体被用作诊断测试的试剂，或者，也可以用于治疗性用途。在一个具体的实施例中，人受试者用蛋白酶裂解位点特异性肽或蛋白水解裂解的抗体片段免疫，并且在体内产生的抗IgG的裂解产物。在一个实施例中，蛋白酶裂解位点特异性肽免疫原选自至少五(5)个连续氨基酸，所述氨基酸选自位于蛋白酶裂解位点的氨基末端侧的人IgG的铰链区序列SEQ ID NO：1、2、3或4，例如SEQ ID NO：5-11、它们的N-末端截短形式和化学同系物。
使用裂解位点特异性免疫或“疫苗策略”将给不依赖蛋白酶起源的(即，细菌来源或在富含蛋白水解的肿瘤中宿主起源)IgG固有Fc域提供一般修复，就IgG内残基特异性裂解形成的表位而言仅限于裂解位点特异性抗体的特异性。对于更广泛的抗体恢复能力，个体可能需要与一种以上的裂解位点肽或类似肽接种疫苗，如果需要的话。作为另外一种选择，患者可在裂解位点特异性抗体治疗之前，期间或之后被接种以产生裂解位点特异性抗体应答。在一个具体的实施例中，个体可在旨在治疗给定疾病状态的靶向抗体制剂给予之前、期间或之后接种疾病特异性裂解位点特异性肽或类似肽，其中靶向抗体活性涉及效应子功能，并且所述抗体经受一个或多个IgG裂解的蛋白酶裂解。以这种方式，靶向抗体的效应子功能可以被恢复而且抗体治疗的效果得以增强或恢复，同时抗体的靶向功能没有改变。在一个实施例中，在受试者中所治疗的疾病特征在于所阐述的一个或多个IgG的裂解蛋白酶(见表1)。
接种疫苗的方法在本技术领域是众所周知的，并且具体地，当其多个缀合到可能具有免疫原性载体分子如匙孔血蓝蛋白(KLH)上时，抗原或半抗原和线性肽具有更强的免疫原性是已知的。大量的缀合方法在本领域中是已知的，并进行了描述，例如，G.T.Hermanson，“BioconjugateTechniques”，Academic Press，1996。简单地说，半抗原与载体的缀合通常受连接子或更适当的交叉连接子结构影响，所述连接子两端包括各种长度骨架反应性官能团的线性分子。在同双功能连接子(如戊二醛)中两个官能团是相同的；在异双功能连接子中，它们是不同的。详细的化学缀合是众所周知的。由于靶向IgG裂解片段保留了与免疫球蛋白(可变区，CH1，和在一些情况下的一些核心铰链域)N-末端部分相关联的抗原特异性结合结构域，抗体反应应定向于在裂解位点表示新的C-末端的类似肽部分。因此，期望缀合类似肽的N-末端，且存在游离的C-末端残基作为免疫原。
在疫苗接种方法中，可以使用佐剂(例如，含铝佐剂(矾)，不完全弗氏佐剂(IFA)，完全福氏佐剂(CFA))与定向免疫反应的非缀合或缀合的铰链区域类似肽以产生抗体(体液的或Th2驱动)和定位对裂解位点特异性片段的结合域。CD40激动剂如天然配体gp39可用于刺激免疫应答。激活CD40受体的CD40激动剂优选位于抗原呈递细胞，优选的一个例子是树突状细胞。
人疫苗
已开发安全和有效的人疫苗制剂。为了提高重组蛋白质基的疫苗的免疫原性，佐剂是必需的。最广泛使用的佐剂是不溶性铝盐，一般称为矾，例如勃姆石和羟基磷酸铝。矾佐剂主要诱导Th2型细胞因子的响应(Lindblad，2004；Raz & Spiegelberg，1999；Valensi等人，1994)。因此，需要替代佐剂用于成功开发肽疫苗。
评估了聚合物微粒包封的抗原作为疫苗佐剂(Eyles等人，2003J DrugTarget11，509-514；Singh等人，2004Expert Opin Biol Ther4，483-491)。微粒形式的聚(DL-丙交酯共乙交酯)(PLG)在本技术领域是众所周知的。
已经开发各种水包油乳液作为替代矾佐剂。其中最先进的是角鲨烯水包油乳液(MF59)，它是一种具有可接受安全性的强效佐剂。称为Fluad的流感疫苗产品包含MF59。类似矾，MF59可以在体内通过树突状细胞促进抗原吸收。此外，已被证明，肌肉注射后，MF59内在地被APC迁移到淋巴结。除了促进抗原传递，MF59也可能作为局部促炎症佐剂，由于其在注射后被观察到促进血液单核细胞流入。
可以在结合矾MF59或微粒使用的其它分子包括但不限于以增强对疫苗Th1型响应的CpG、GM-CSF和IL-2。
制备的含或不含混合佐剂或“疫苗”的免疫原可经由任何合适的途径给予，例如但不限于皮内、皮下、鼻内和肌内。
多种方案可用于疫苗。作为本发明一个方面的可能方案是免疫加强，其中包含所需免疫原的第一疫苗组合物是主要的疫苗组合物，结合一个包含相应免疫原的加强疫苗组合物施用，该相应的免疫原与主要疫苗组合物中的免疫原形式不同。该加强的疫苗组合物可同时被作为首要的疫苗组合物给予，或在首要疫苗组合物初次给予之后同一时间给予。首要和加强疫苗组合物可以通过相同的路径给予，或者它们可以通过不同的途径给予。如果首要的和加强疫苗的组合物是在同一时间给予，它们可以相同制剂或作为不同制剂的一部分给予。首要疫苗组合物和加强疫苗组合物二者均可给予一次或多次。因此，首要疫苗的一些剂量可在给予一定剂量的加强疫苗之后给予。使用这些和其它已知或尚未被发现的疫苗给予途径及其时序的改变来优化接种方案，属于本技术领域的普通技术知识。
已对本发明进行了一般性的描述，以下实例将进一步公开本发明的实施例。
实例1：使用肽免疫原引发免疫球蛋白裂解位点特异性抗体制剂
测定由内源性蛋白酶产生的宿主(患者)抗体片段的存在，需要能选择性结合裂解的IgG但不结合完整的IgG的试剂。裂解的组分的鉴定和来自患病的患者的样品的片段含量与正常群体相比的定量差异应该能够使用该试剂来进行评价。
检测含有较高浓度的完整IgG的溶液中未知的但可能小量的IgG片段是困难的。尽管已经认为scIgG是可能的IgG裂解片段(Gearing2002，同上文)，但先前未进行在人样品中的定量。出于该目的，在家兔中产生具有必需的特异性的试剂，其对裂解的IgG但非完整的IgG具有高度特异性。
将人IgG1铰链的三种缀合的和渐进地更长的单链肽类似物用于免疫(Invitrogen Corporation)。使与MMP-3裂解位点的氨基末端侧氨基酸序列对应的8聚体肽通过N-末端(TCPPCPAP，SEQ ID NO：1的残基7-14)与匙孔血蓝蛋白(KLH)连接。分别制备对应于谷氨酰基内肽酶位点(TCPPCPAPE，SEQ ID NO：1的残基7-15)和IdeS位点(TCPPCPAPELLG，SEQ ID NO：1的残基7-18)的延伸肽作为免疫原。通过皮下注射0.2mg于完全福氏佐剂中的缀合肽免疫新西兰家兔(每种免疫原两只)，并于第14、42和56天使用0.1mg于不完全福氏佐剂中的抗原再加强免疫三次。在4、8和10周时收集血清，将每种免疫原汇集用于抗体纯化。通过基于固相抗原肽的ELISA监测免疫滴度。
抗体的亲和纯化应用固定于激活的载体上的各肽抗原。汇集使用相同抗原免疫的两只家兔的抗血清，并使其穿过抗原柱，之后充分洗涤柱子。分别使用3M KSCN和0.1M甘氨酸(pH2.5)将特异性抗体洗脱为低亲和力和高亲和力汇集物。两份汇集物产生不可区分的结合特征，因此可互换使用和/或汇集。使三份分别洗脱的结合抗体汇集物接着进行第二个亲和吸附步骤，这次是在含有包含人IgG1重链恒定区的完整抗体(Mab3)的柱子上进行。第二个亲和层析步骤的意图是去除不想要的可识别完整IgG的抗体。然而，很少家兔抗体或无家兔抗体吸附至IgG柱，表明抗体群体仅以其暴露的羧基末端与“裂解的”序列具有反应性。
通过ELISA检测各亲和纯化的家兔抗肽抗体与酶解产生的人IgG的片段和完整的IgG结合的能力(图3)。来自用KLH缀合SEQ ID NO：1残基7-14(MMP-3位点类似物)免疫家兔的纯化抗体不结合完整的IgG，并且对MMP-3消化IgG产生的scIgG和F(ab′)2高度特异性。该抗体制剂对GV8蛋白酶或IdeS产生的scIgG和F(ab′)2表现出最低反应性。与此相反，从V8-裂解位点铰链肽类似物(SEQ ID NO：1的残基7-15)和IdeS-裂解位点铰链肽类似物(SEQ ID NO：1的残基7-18)免疫家兔获得的抗体对该两种酶任一种产生的scIgG和F(ab′)2表现出交叉反应结合特征。然而，这些制剂对MMP-3消化的产物显示最小的反应性。所述抗体制剂中无一结合完整的IgG，且所述抗体制剂中无一与由三种不同的酶产生的片段(包括F(ab′)2和scIgG)具有同等反应性，如图4中所示。
抗铰链试剂的预期用途是检测scIgG和F(ab′)2(以及其它潜在的片段)，它们在体内复杂环境中由存在于疾病特异性组织中的酶产生，或由疾病特异性细胞类型或细胞群体(例如浸润的巨噬细胞或嗜中性粒细胞)产生。对于潜在的IgG片段的最佳涵盖范围，认为优选的是具有尽可能广泛的裂解位点识别谱。出于这个原因，将三种家兔抗体汇集物各自以0.33mg/mL各组分(总计＝1mg/mL)制备混合物，用于后续的蛋白印迹和基于血清的ELISA检测。这个汇集的试剂被称为RAH-1。
检测RAH-1试剂在另一种炎性液体——患有类风湿性关节炎(RA)的患者的滑液中检测IgG片段的能力。购买市售如图5示来自RA患者的关节滑液样品，RAH-1制剂与完整的IgG没有反应，但检测到的scIgG、F(ab′)2、可能的Fab′来自所有3个蛋白酶消化。对于来自RA患者的所有五个滑液样品，在scIgG、F(ab′)2以及Fab′的大约大小下检测到条带，表明这些蛋白酶解片段存在于患有RA的个体的滑液中。
从Genomics Collaborative获得来自10个患有类风湿性关节炎(RA)的受试者和10个年龄和性别匹配的健康个体的血清样品。ELISA检测结果表明，10个RA患者中的4个显示血清scIgG浓度＞60μg/mL。在健康对照组中，scIgG的浓度范围是从＜8.2μg/mL至52.7μg/mL。该比较的样品没有严格地选择疾病阶段、治疗方案等，但是，对这些商业样品的实验表明在疾病患者中可检测到升高的scIgG浓度。
在另一个试验中，患病个体血清的商业来源是Genomics Collaborative(现在的SeraCare Life Sciences Inc.)。购买了来自8种疾病的每一种的10个不同个体的小量血清(300微升)。所述疾病范畴为类风湿性关节炎、骨关节炎、哮喘、1型糖尿病、乳腺癌、肺癌、心肌梗塞、以及充血性心力衰竭。另外，从该商业来源获得来自28名年龄和性别相匹配的正常健康志愿者的血清作为对照。
使用ELISA形式测定，对样品进行分析，结果示于图6。基于RAH-1试剂的选择性的测定证明，与由已知的特异性蛋白酶产生的那些IgG裂解产物相当的IgG裂解产物是明显可检测的，并且对于炎性自身免疫性疾病类风湿性关节炎来说大于在健康或正常供体中维持的水平。相比之下，骨关节炎患者显示了与正常个体样品相似和在其范围内的水平。
实例2：抗铰链IgG单克隆抗体的制备
产生出用于生产和潜在用于人患者的确定的(defined)分子将是合乎需要的，所述分子结合裂解的IgG而不结合完整的IgG，诸如单克隆抗体。下列程序代表着用于产生这样的分子的方法。
人IgG1下部铰链区的12聚体肽类似物且连接CH2结构域的免疫原为：TCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：1的残基7-18)，其为人IgG1的IdeS裂解位点的肽类似物。天然存在的半胱氨酸被丙氨酸替代，得到变异体TAPPAPAPELLG(SEQ ID NO：12)。添加N末端半胱氨酸，以使得可以通过用于进行与游离巯基的反应的标准化学方法来与匙孔血蓝蛋白(KLH)缀合。
使用多个皮下部位(5个)，用在完全福氏佐剂中的0.5mg KLH肽来免疫新西兰白色家兔(3只)。以3周间隔使用在不完全福氏佐剂中的0.25mg免疫原对动物加强免疫，共进行4次附加免疫。
在免疫过程中通过标准ELISA方法监测BSA缀合形式的相同肽的血清抗体滴度。基于滴度数据选择动物(2只)用于脾切除术。从与家兔融合伴侣细胞融合的脾衍生淋巴细胞生成家兔杂交瘤(Spieker-Polet，1995，PNAS，USA，92(20)：9348-9352)。在多个培养板中融合之后2-3周检查细胞生长情况。
在包被有BSA免疫原肽缀合物的培养板上通过ELISA筛选阳性杂交瘤。鉴定来自各融合的多个阳性克隆。进一步筛选参与结合完整IgG1和各种酶促产生的IgG1的F(ab′)2片段。从这些筛选和计数-筛选策略中，在免疫原肽的C-末端或附近基于结合免疫原肽和具有C-末端的F(ab′)2片段的强选择性以及对完整IgG1的最小结合性来选择三个克隆(命名为33-2、91-2和68-6)。亚克隆并展开阳性杂交瘤。
通过包括固定化A蛋白色谱法在内的标准方法从各细胞上清液纯化兔IgG的标准方法，包括色谱法纯化兔IgG。通过标准ELISA规程测试纯化的兔IgG的以下特异性结合：人IgG1铰链区的肽类似物，以及完整的IgG用IdeS和MMP-3酶产生的单抗的单或双裂解((F(ab′)2)纯化的IgG片段。简而言之，将通过标准肽化学合成和进行了N-末端生物素酰化的肽捕获在链霉亲和素包被的孔上。以10μg/mL直接包被IgG和片段。通过得到很好表征的山羊抗家兔IgG Fc辣根过氧化物酶和OPD底物系统检测家兔单抗的结合。
兔单克隆抗体91-2的ELISA结果显示在图7。对结合终止于任一SEQID NO：1的残基16-23(L-L-G-G-P-S-V-F)的下铰链肽有很明显的选择性。对终止于任一上游铰链、核心铰链或早期下游铰链的被SEQ ID NO：1的残基3-15(D-K-T-H-T-C-P-P-C-P-A-P-E)所涵盖的上游残基的多肽很少结合或不结合。对MMP-3产生的F(ab′)2片段和scIgG片段具有可忽略的结合(这和与在SEQ ID NO：1残基14和15之间的MMP-3裂解位点(终止于P-A-P)的肽类似物无结合相一致)。与此相反，对Ides产生的F(ab′)2片段和scIgG(其应具有C-末端序列(-P-A-P-E-L-L-G))具有实质的结合。因此，家兔mAb的结合特异性与引生它的免疫原非常一致。直接包被的rb(家兔)IgG是阳性对照。
补体测定
WIL2-S细胞，表达CD20(ATCC CRL-8885)的类淋巴母B细胞系用作CDC检测的靶细胞。将于RPMI[5％热灭活的FBS、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、青霉素(500U/ml)、链霉素(500U/ml)、2mM L-谷氨酰胺]中的50μl细胞添加至96孔培养板的各孔，最终浓度为于每孔8×104个细胞。额外加入50μl加入到具有或没有不同浓度抗体的孔中，将板在室温下孵育2小时。50μl10％兔补体(Invitrogen公司)加入到孔中，并将板在37℃下温育20分钟。所有样品以一式三份操作。在200g下对培养板离心3分钟，将50μl上清液移取到分开的培养板，使用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒(Roche)检测CDC。使用Spectra max Plus384(PerkinElmer)检测吸光度。将数据归一化到使用Triton X-100(SigmaAldrich)的最大细胞毒性和仅含细胞和单独补体的最小对照。
图8示出了在结合CD20的抗体的F(ab′)2片段固定浓度存在下滴定时，3个兔裂解位点特异性单克隆抗体能够恢复对靶细胞的补体依赖性细胞裂解。兔单克隆抗体在较低浓度时比多克隆兔裂解位点特异性单克隆抗体制剂(前面描述的血清scIgG的相同检测系统的一个组分)更有效。如所预期的，CD20的完整抗体具有活性，但单独其F(ab′)2片段和scIgG形式无活性。在无结合细胞的F(ab′)2片段的情况下，家兔裂解位点特异性mAb不能够指导细胞裂解。这些结果确立的是，单克隆裂解位点特异性抗体能够重建IgG1的无活性的蛋白酶解产物的补体介导效应子功能。
为了测试在人系统中的效应子功能的修复，克隆了兔抗体单克隆抗体91-2的可变结构域，融合到人的恒定结构域并在HEK293细胞中表达。由此制得命名为2095-2的兔嵌合单克隆抗体。通过在ELISA中结合裂解位点肽再次测试抗体特异性，并确认对终止于-P-A-P-E-L-L-G的肽的最高亲和力。
利用表面等离子体共振平台(即Biacore)通过2095-2抗体的Fab片段进一步研究结合的特异性。简单地说，使用标准的NHS/EDC耦合法在三个不同的面密度(8500，1650和350RU)下，在Biacore2000中固定Fab到CM5传感器芯片上。运行缓冲液包含pH为7.4的10mM HEPES，150mM氯化钠，0.01％Tween-20。在25℃下采集数据。
测试三个N-末端生物素化的肽结合固定化Fab：WT，表示经化脓性链球菌IdeS蛋白酶裂解后的来自人IgG1裂解位点的肽片段期望序列；E233A，表示具有在C-末端上游四个位置上氨基酸残基的单个丙氨酸置换的变体；L234A，表示在C-末端上游三个位置上的氨基酸残基具有单个丙氨酸置换的变体。T通过半胱氨酸取代成丝氨酸修饰肽，以使其相容耦合化学和保存单体结构。
分别以588nM和2.9uM为最高浓度在3倍稀释系列中测试肽的野生型和E233A。在最高浓度为14.7uM的2倍稀释系列中测试肽L234A。每种肽浓度系列的测试在三个不同密度的Fab表面重复三次。监测结合和解离1分钟。曲面用1/500稀释磷酸的12second注入再生。全局匹配每个表面的应答数据以测定下表中汇总的结合常数。每个肽相互作用很好地符合一个简单的1∶1(朗缪尔)模型。
结合常数(ka在M-1s-1)中以小于10的因数变化，但是，解离率(kd在s-1)变化超过200倍。三个肽以nM计算出的KD如下所示(表2)。
表2：
这些结果表明，单克隆抗体2095-2对结合所用的免疫原具有高特异性，所述免疫原是来自人IgG1的N-末端(上游)序列的IdeS裂解位点肽的类似物，并且由于移除半胱氨酸残基而成单体构象。
实例3：裂解位点特异性抗体的体内模型
为了测试体内裂解位点特异性抗体拯救裂解IgG的能力，采用“组织架”细菌感染模型(Fernandez JA等人，(1997)Antimicrob.AgentsChemother.43(3)：667-671)。在这个系统中，在背颈部区域外科手术性地皮下植入wiffle球。该模型允许传染性病原体位于一个容易触及的液舱、组织袋，并用于评估对细菌的抗生素功效。
在本系统中，发现兔wiffle流体球含有约1.5mg/ml的IgG，相反地，兔血清报告含5-10mg/ml的IgG。我们的假设是GluV8表达金黄色葡萄球菌对兔的感染会导致wiffle球内兔IgG的裂解。此外，用GluV8裂解的IgG裂解位点特异性肽类似物对兔疫苗接种会导致强大的裂解位点特异性滴度，其将提供对金黄色葡萄球菌的保护测定。
为了使模型能提供显示兔裂解位点特异性抗体可以提供一定程度的保护对金黄色葡萄球菌感染的积极结果，必须操作四个因素。首先，GluV8必须能够裂解兔的IgG。其次，兔要么必须有一些预先存在的对金黄色葡萄球菌抗原的免疫反应性，或者它们必须能够对金黄色葡萄球菌感染后不久产生抗体介导的免疫反应，因为这些将成为受试者的IgG。第三，接种方法必须产生足够亲和力的裂解位点特异性抗体和结合裂解兔IgG的特异性。最后，裂解抗体类似物免疫的动物相比较非免疫动物必须显示出一种可测量的不同应答。
我们以前发现在体外GluV8在位于下部铰链区的氨基酸E233和L234(WO2009/023457A1，Ryan MH等人，(2008)Mol Immunol45(7)：1837-1846)之间酶切人IgG1。除了单个氨基酸A231P的改变，在这个区域的兔IgG下部铰链区序列与人IgG1序列相同。由于GluV8裂解位点，期望这种酶会作用于兔IgG。
人IgG1 229CPAPELLGG236
兔IgG1 229CPPPELLGG236
接种三天后，使用蛋白A试剂分别纯化来自血清和来自含有兔wiffle球流体的金黄色葡萄球菌的兔IgG。将所得兔IgG制剂通过MALDI进行分析，以确定IgG裂解量。兔血清IgG的MALDI分析显示三个主要的峰，对应于完整IgG抗体单电荷的分子离子(143,600Da)，完整IgG抗体的双电荷分子离子(71,700Da)和兔白蛋白(65,800Da)。与此相反，wiffle球兔IgG的MADLI分析，包含Fc片段的单电荷分子离子(52,800Da)，Fc片段双电荷分子离子(25,500Da)，和一个对应完整IgG单电荷分子离子(143,700Da)的小峰。这些结果表明，从包含wiffle球流体的金黄色葡萄球菌中纯化的兔IgG含有裂解IgG，而从包含完整IgG的血清中纯化的兔IgG没有可检测到的IgG裂解产物。因此，我们推断像在兔体内的IgG像体外的人IgG1一样容易在含有金黄色葡萄球菌的微环境内裂解。
对于金黄色葡萄球菌研究动物的免疫状态，使用两个来自金黄色葡萄球菌衍生的抗原通过ELISA测试了血清中预先存在的免疫反应性。这些都是金黄色葡萄球菌α毒素(α-溶血素，H1A)和金黄色葡萄球菌肠毒素B(通常与食物中毒相关的毒素)。对于两种毒素的结合，在1∶50、1∶200和1∶800稀释浓度下测试来自随后被铰链类似肽免疫的六只兔子的前期研究血清和来自6只非免疫对照家兔的未接种血清。正滴度进行定量作为最高稀释度，其光密度值(490nm)为相应的对照槽(非抗原包被)得到的信号两折或更多。此外，人整合素和卵清白蛋白作为潜在的阴性对照进行了测试，因为它不太可能像兔一样将暴露于此类蛋白质。果列于下表(表3)。
表3：
| 抗原 | 正反应性的发生率 | 滴度(n) |
| 金黄色葡萄球菌α毒素 | 8/12 | 1∶50(2)、1∶200(1)＞1∶800(5) |
| 金黄色葡萄球菌肠毒素B | 12/12 | 1∶50(3)、1∶200(3)＞1∶800(6) |
| 人整联蛋白 | 1/12 | 1∶50(1) |
| 鸡卵清蛋白(卵清蛋白) | 4/12 | 1∶50(4) |
结果
结果表明在12个研究动物中存在较大发生率的抗金黄色葡萄球菌毒素反应性，在12个研究动物的发病率。在一些兔子中，滴度明显会超过测试的最大稀释(1∶800)。与此相反，人和鸡抗原的免疫反应性的发生率显著降低，并仅1∶50稀释可检测到。这些结果支持这样的假设：兔在其生命周期自然性地暴露于金黄色葡萄球菌，且在接种时能够立即靶向S.抗原，或具备迅速实施重现响应的能力。这些研究结果表明，对金黄色葡萄球菌抗原的抗体谱可能存在，包括对细胞表面组分的抗体。
实例4：免疫
在实例3中描述的步骤验证了受检家兔对金黄色葡萄球菌抗原已经在先发展出了免疫效价，其提供天然性细菌靶向抗体。为了确定裂解位点肽接种之后的兔子是否产生足够的特异性和加强的裂解位点特异性抗体应答以防止细菌攻击，随后进行如下实验：用共轭KLH免疫原的裂解GluV8-裂解位点肽类似物(SEQ ID NO：1的残基7-15，TCPPCPAPE)免疫家兔。
化学合成人IgG1铰链残基225-233的肽类似物。设计了免疫原肽C-T-S-P-P-S-P-S-P-A-P-E(Cys-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Ala-Pro-Glu，SEQ ID NO：16)，其包括用于键合的N-末端半胱氨酸和IgG上发生在位置226和229Cys残基取代成Ser的内部取代，以避免肽在那些位置的氧化和二聚化。
使用0.25毫摩尔规模FastMoc化学和Fmoc-Glu(OtBu)-Wang树脂在ABI433A肽合成仪上制备肽。约190毫克粗肽从树脂上释放和通过多次注射到两个Vydac-18柱进行纯化，。通过RP-HPLC和MALDI-TOF MS收集馏分和分析。Pooled fractions yielded38mg of lyophilized product having freecysteine by Elllman’s test.汇集馏份得到38毫克含游离半胱氨酸的冻干产品(通过Elllman测试)。
通过Imject免疫原EDC试剂盒(Pierce产品no.77622)用EDC耦合化学(1-乙基-3-[3-二甲氨基]碳二亚胺)实现匙孔血蓝蛋白(KLH)与肽的缀合。22毫克纯化肽以4毫克/毫升溶于EDC缀合缓冲液，与在水中的10mg/mL等质量KLH结合。肽与KLH键合，随后向混合物加入EDC溶液，在室温下轻轻混合2小时。上述所有步骤根据制造商的指示进行。对PBS透析缀合混合物以除去过量的键合试剂。通过夹心免疫测定法，分别使用实例1所描述的多克隆兔裂解位点特异抗体制剂RAH(与以序列C-P-P-C-P-A-P-E结束的裂解位点特异性类似肽反应)和生物素化的抗-KLH抗体作为捕获和探测抗体，确认KLH-肽的缀合。
免疫后，用ELISA法检测兔血清与肽类似物的反应性。表4示出滴度(在检测到信号时稀释度的倒数)，表明所有的兔子对在血清中检测到的裂解位点特异性类似肽具有抗体反应性。一例动物(657)对免疫原的抗体检测水平非常低(1/滴度等同于640)。在所有六个兔的wiffle球中的裂解位点的特异性抗体检测中，同一只动物(657)具有低水平的可探测抗体。因此，六只兔子中的五只在血清和wiffle球流体检测中表现出强大的裂解位点特异性抗体滴度。
表4：
| 兔 | 血清(滴度) | Wiffle球(效价) |
| 651 | 12,800 | 3,200 |
| 653 | 51,000 | 12,800 |
| 656 | 820,000 | 51,000 |
| 657 | 640 | 320 |
| 659 | 51,000 | 12,800 |
| 661 | 205,000 | 12,800 |
在研究最后阶段，用6.2log10菌落形成单位数(CFU)的金黄色葡萄球菌(ATCC29213)接种免疫的和非免疫的兔，直接进入wiffle球空间。
对细菌数量和生存的细菌计数和测试者活力检测超过两个星期。在图9中所示的数据表明，在该研究的第一周，对照组动物的平均细菌计数高出裂解位点特异性接种疫苗的动物好几个数量级。例如，在第2天对照组有7.2log10CFU/ml wiffle球流体，同时免疫组有5.2log10CFU/ml wiffle球流体。
细菌数量的差异可转换成兔活力的深刻差异。在两周研究的末期，只有40％的对照组动物存活，而裂解位点特异性接种疫苗的动物100％是存活的(图10)。
因此，这些结果支持了这种假设，对病原体的先天免疫(当存在时)可以由目前的抵抗病原体蛋白酶副产品(裂解的但仍具有免疫反应性的抗金黄色葡萄球菌IgG)的免疫方法恢复到一个有效的水平。不仅降低的高蛋白水解细菌接种动物的细菌计数，而且这些动物被救出死亡的事实证实了这个方法。
实例4：被动免疫治疗癌症
为了展示通过裂解位点特异性抗体对肿瘤靶向单克隆抗体的效应子功能修复原理，人肿瘤异种移植模型小鼠，在SCID Beige小鼠中的MDAMB231原位移植瘤模型，被与名为CNTO860(US7605235)的抗体一起使用，所述抗体定位人组织因子(CD142)并在先前显示了在模型中减少肿瘤生长的能力。
该研究的目的是表明，CNTO860的IgG1下铰链结构域的蛋白水解裂解将使抗体无效，并且评估在SCID Beige小鼠中的MDA-MB-231原位移植瘤模型中裂解位点特异性的裂解位点单克隆抗体是否将恢复裂解CNTO860的抗肿瘤疗效。
完整的抗肿瘤抗原抗体CNTO860包括人IgG1恒定区。使用细菌蛋白酶IdeS制备蛋白酶裂解抗体CNTO860，如上所述。
每周新鲜稀释抗体制剂，并在PBS中以10mg/mL提供给动物，按0.1mg/kg的剂量。同时对860变种以1.0mg/kg剂量单独施用单克隆抗体2095-2(嵌合体裂解位点特异性裂解Ides)。
麻醉免疫功能低下小鼠(SCID Beige小鼠(CB-17/IcrCrl-scid-bgBR)约18-20g重量，获取自Charles River实验室)，并用MDA-MB-231人乳腺癌细胞系(ATCC HTB-26)细胞(以5×107细胞/mL悬浮在无血清DMEM)体积50μL植入(右腋下数2或3)乳腺脂肪垫，如IACUC规程所具体规定的。
小鼠(每组八只)接受测试物质或PBS(对照组)，如表5所示(下表)。第4组接受CNTO860单链裂解的IgG，剂量如上述指定的单治疗加单克隆抗体2095-2(按1.0mg/kg施用)，i.p延迟2小时给予。研究第3天开始投药，每周重复一次。
表5：
当对照组肿瘤量达到800mm3体积时终止研究。在终止时，通过心脏穿刺收集来自所有动物的全血，置于准备好的EDTA涂层管收集。研究终止时，记录体重和肿瘤的测量，手术切除原发肿瘤并称重。
结果
在实验过程中在特定的时间每个组小鼠的平均肿瘤体积表示在图11中。据统计，在研究第11天开始，CNTO860处理组的肿瘤体积比其它每个组明显降低。从研究18-40天，CNTO860和mAb2095-2组合组的肿瘤体积低于PBS组的那些；从研究26-40天，低于单独CNTO860scIgG组的那些；从研究18-40天，低于在单独mAb2095-2组的那些。各治疗组的肿瘤体积没有其它差异。
单独CNTO860组比所有其它的组有更小的最终肿瘤重量。此外，相比单独的PBS和mAb2095-2组，结合CNTO860和mAb2095-2的组有较小的肿瘤。各治疗组肿瘤重量没有其它方面的差异。
这些结果表明，用裂解位点特异性抗体制剂被动免疫修复了裂解靶特异性抗体的抗肿瘤活性。
实例5：使用裂解位点特异性抗体和裂解靶向抗体的靶细胞清楚
在下面的实验中，研究了裂解位点特异性抗体(对IdeS裂解的人IgG1具有特异性的兔-人嵌合单克隆抗体mAb2095-2(嵌合裂解位点特异性裂解Ides))体内给予之后给予单链裂解的IgG或双裂解的IgG，F(ab′)2。
抗血小板整合素(αIIbβIIIa，也被称为IIb/IIIa)结合的抗体c7E3，出于几个原因被用来作为靶标抗体。试点研究显示抗血小板单克隆抗体是人IgG1嵌合，其在修复超过5天之后的24小时造成显著的血小板清除(表明通过犬科动物Fcγ受体犬和/或补体系统的显著迅速的单抗识别)。此外，该效果在完整的IgG一定剂量(0.05mg/kg)时是可明显分辨的，该剂量没有引起血小板功能抑制，并且因此不容易引起临床相关的出血并发症。最后，在这种非终端的研究中循环血小板的数字提供了一个容易量化的端点和多个血液采样，且没有导致人工失血痕迹或该类大小动物的风险。
材料和方法
使用c7E3的三个制剂：完整的小鼠-人IgG1嵌合抗体，单链裂解的和使用细菌酶IdeS制备的F(ab′)2。
首先，在狗身上建立c7E3抗体抗原结合和血小板清除参数。输注测试结果表明，0.01mg/kg剂量(可计算出超过足以在人中驱动血小板清除)在2和24小时对狗无效，并且与生理盐水组难以区别。0.05mg/kg剂量在2小时时的影响不大，但在24小时导致＞90％血小板清除。0.2mg/kg剂量的c7E3IgG在2小时时产生显著的血小板清除，然后在24小时时保持。这些结果提供了在狗体内分配最小剂量(0.05mg/kg)所需要的信息，其将导致显著迅速的血小板清除(24小时)。
对血小板功能的影响
c7E3通过结合到血小板表面IIb/III3受体抑制血小板聚集-从而阻断纤维蛋白原结合活化血小板上受体的能力并且将其聚集在一起。在血小板聚集测定法中检测完整的和单链裂解的c7E3IgG的相应抑制能力特点。通过用生理激动剂激活后的血小板悬浮液透光率增加测量血小板聚集。抑制与5μM二磷酸腺苷(ADP)对照组聚集相比较。％抑制如下计算：对照聚集-测试聚集×100％，再除以对照聚集。
结果表明，经过IdeS蛋白酶的单下铰链裂解，c7E3对血小板的结合/抑制没有损耗。
c7E3IgG和IdeS蛋白酶单链裂解的c7E3IgG也在体内进行了比较。三组5只动物分别接受生理盐水对照，完整的c7E3IgG(0.05mg/kg)或c7E3单链裂解的IgG(0.05mg/kg)。给予后在基线和2、24、48、72和96小时监测血小板计数。限制研究5天，最小化可能会混淆对结果解释的抗c7E3免疫反应的可能性。每个动物组在各个时间点以平均血小板计数±SD的结果列在图3中。误差线的程度意味着在不同的动物中血小板计数的正常变化(例如，单链裂解的IgG治疗组的5只动物在给予前计数分别为175,000、355,000、305,000、276,000、334,000每微升)。然而，平均结果清楚地证实，完整的c7E3IgG引起血小板数明显大幅下降并在24小时达到最低点。单链裂解版的c7E3IgG在同一0.05mg/kg剂量基本上没有效果。在整个96小时监控期间，单链裂解c7E3和生理盐水对照组表现出相似的特征。在生理盐水对照组和单裂的c7E3组最后的96-小时测定的血小板计数下降表明了非免疫介导的原因(如来自重复抽样的血量体积损失)。
完整的c7E3IgG组的血小板计数呈现逐渐恢复，96小时时达到给予前水平的约50％。任何一组均无不良的临床研究结果(如出血)出现，并且这与低循环血小板计数和/或显著抑制血小板的有限时期内已知的人体耐受性是一致的。
在这项研究中的发现是下铰链的IgG单一蛋白水解裂解导致显著地效应子功能损失。尽管与血小板的等效结合，单链裂解的衍生物c7E3无法接合通常移除调理细胞(如在该研究中与完整的c7E3)的免疫系统的组分。这些体内结果被几个细胞靶向的单克隆抗体的类似的体外发现证实，所述单克隆抗体的单链裂解衍生物在ADCC和补体测定中基本上失去了所有的效应子功能。
与在先的实验一致，c7E3的变体均在0.05mg/kg的剂量给予。本研究方案包括每组3只动物的7个不同组，如表6中列出的。实验独特的方面(组6和7)涉及第一靶向单克隆抗体注入，经过10分钟延迟然后通过裂解位点特异性单克隆抗体注入，以0.5mg/kg给予裂解位点特异性IdeS裂解位点单克隆抗体2095-2；高于用于所有c7E3变体的剂量10倍。选择较高剂量以最大化限度地络合裂解位点特异性mAb与血小板结合c7E3变种。所有单克隆抗体以超过20分钟的时间内缓慢滴注来递送。以超过96小时的周期监测血小板计数。为清楚阐述，在每个动物中相对给予前计数对血小板计数归一化，并且在这些小的3-动物组中最小化血小板计数数值的正常变动。
表6：在狗中修复功能研究的研究方案。
结果示于图12中。从这项研究中出现一些研究结果。对于剂量探索研究，完整的c7E3IgG在0.05mg/kg下给予诱发大量的血小板清除，并在24-48小时出现明显最低点。血小板计数恢复开始于约72小时，并在96小时测定期慢慢增加。在7天(168小时)额外的血液样本被结合到该研究，以允许评估是否会发生完全恢复。通过7天，所有适用的治疗组中发生全面恢复。
与此相反，完整的c7E3IgG，单链裂解的IgG和F(ab′)2不影响血小板数，并且这些组的血小板计数变化与生理盐水对照组没有差异。同样的裂解位点特异性单克隆抗体2095-2，当单独注入时(第5组)对循环中的血小板没有可测量的影响。然而，在c7E3F(ab′)2加mAb2095-2组，发生血小板计数迅速下降，以致在2小时时效果几乎是最大的。此外，在裂解抗体组分后给予裂解位点特异性抗体组的血小板下降的程度似乎比在2和24小时测定接收完整c7E3IgG(单独；组2)的组要高。此后，血小板计数逐渐恢复并且通过48小时后恢复的速度等同于完整的c7E3IgG组。
在F(ab′)2组合组，当mAb2095-2加上单链裂解的c7E3IgG时血小板清除程度不如F(ab′)2组观察到的那么显著，可能是由于反应不佳的某只动物在scIgG组(也体现在这组的宽误差线)。尽管如此，血小板清除发生的速度比在完整c7E3IgG组显现的更快。scIgG的结果是重要的，因为单克隆抗体在体内对该衍生物的定位看起来与F(ab′)2一样有效-这种结果基于体外研究是不可预测的。
讨论/结论
本文描述的一系列的动物实验研究证实了先前的体外研究结果，即IgG单链裂解的蛋白水解衍生物的失去了移除他们所结合的细胞的能力(在体内的该方案)。完整的c7E3IgG以剂量×0.05mg/kg在狗身上显示了在24小时内诱导血小板清除。计算0.05mg/kg剂量足以为每血小板提供几千份IgG拷贝，或约5％αIIbβ3受体阻断剂。已知抑制血小板功能需要显著高水平的受体阻断剂(每个血小板约80,000份)。因此，犬的免疫系统在这个水平具有清除与IgG调理的细胞的能力。
结果表明，人IgG1下铰链的单一蛋白水解裂解去除了c7E3IgG的血小板清除属性。在此，在体外由IdeS蛋白酶部分消化制备了功能失活的、单链裂解IgG，然而如本文所示的，其它蛋白酶也产生了类似的功能丧失的IgG。如在体外血小板抑制测定中所示，单IdeS裂解没有影响c7E3的抗原结合特性。该发现提出了一个机制来解释处于与敌对蛋白水解环境(如某些肿瘤，细菌感染，炎症部位)相关病症中的宿主免疫系统某些缺点。
研究结果指出了纠正IgG中蛋白分解缺陷的手段。即，特异性单克隆抗体与蛋白水解断裂的位点应在不活跃的细胞结合的抗体上存在功能性的Fc结构域，从而恢复FC-介导的效应子功能。
IgG铰链中IdeS裂解位点的单克隆抗体通过免疫家兔产生。此单抗2095-2经修饰后结合人的恒定区，在ADCC和补体测定中容易修复杀伤失活F(ab′)2或单链裂解IgG的体外细胞。
关键测试是在体内采用2095-2组合IdeS生成的c7E3IgG蛋白水解衍生物。设计2-阶段方案以允许c7E3首次结合血小板，然后过量的裂解位点特异性mAb与c7E3的血小板络合。相比单独的完整c7E3IgG诱导，在耦合的抗-裂解铰链Mab和裂解Mab的存在下，血小板清除更迅速和快速血小板清除程度更深刻(与c7E3F(ab′)2)。联合治疗的血小板清除快速性意味着免疫细胞的杀伤/移除模式增强。
实例6：裂解位点特异性疫苗治疗癌症
使用的铰链类似肽疫苗具有潜在的治疗人慢性疾病如浸润性和转移性癌症的能力。目前存在几个浸润性癌动物模型，适合测试作为来治疗浸润性癌手段的裂解位点特异性定向疫苗的功效。
相对于单独的抗肿瘤单克隆抗体治疗，疫苗接种方法会赋予显著不同的药效动力学曲线。在后者中，已存在的肿瘤其表面上的一个特定靶标经受突然剂量的单克隆抗体。在这些细胞中肿瘤可能(或可能不)被宿主抗体靶向相同抗原(或附加的抗原)。疫苗接种策略如果早期开始，将提供连续和相对稳定的裂解位点特异性宿主抗体水平，以接合存在于肿瘤生长或浸润位点的任何肿瘤表面裂解的抗体。
在前面描述的感染模型中通过使用兔子的先天体液免疫反应，显示了初次应答的细胞靶标几乎是微不足道的。二级抗体波对任何存在的已损坏的初次抗体修复效应子功能。失活的和细胞结合的宿主抗体为裂解位点特异性Abs提供的各种抗原靶标(和表面位置)。
如本文所示，定位并结合细胞表面抗原的单或双裂解的抗体可被裂解位点特异性抗体靶向，从而使用完整裂解位点特异性抗体提供的效应子功能修复宿主清除靶细胞的能力。另一个并且显著不同的方法是免疫宿主免受与特异性疾病如转移性癌症相关的蛋白酶引起的裂解位点损伤。例如，肿瘤细胞详述了在铰链区裂解IgG的基质金属蛋白酶。预防裂解位点的疫苗可提供宿主抗体以在局部环境克服分子缺陷和增强免疫功能。
利用裂解位点特异性肽的混合物，损坏的mAb靶标可以是特定的或者可多层定向以防止多个无需进行详细鉴定的蛋白水解酶的作用。
因此，根据本发明，用裂解位点肽免疫原接种一个需要治疗的癌症受试者以生成裂解位点特异性抗体反应(在癌症治疗抗体组合物治疗之前、之后或同时)。在一个实例中，免疫原是MMP-3或MMP-12裂解位点肽，其序列终止于氨基酸序列P-C-P-A-P(即SEQ ID NO：1的残基10至14)。
Claims (33)
1. 一种保护人受试者不受病理状况的方法，所述病理状况的特征在于释放蛋白酶，其中所述方法包括给予肽免疫原，其中所述肽能够产生与IgG上的蛋白水解裂解位点反应的抗体。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述病理状况是选自下列的疾病：关节炎疾病、恶性疾病、存在传染性病原体或寄生虫、以及血管疾病。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述疾病是类风湿性关节炎。
4. 根据权利要求2所述的方法，其中所述疾病是葡萄球菌（Stapholycoccus spp.）感染。
5. 根据权利要求2所述的方法，其中所述疾病是乳腺癌。
6. 根据权利要求2所述的方法，其中所述受试者已经被诊断或疑似患有心肌梗塞、或正患充血性心力衰竭。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述肽表示人IgG中的蛋白酶特异性裂解位点，所述蛋白酶特异性裂解位点由选自下列的蛋白酶产生：MMP-3、MMP-7、MMP-12、HNE、纤溶酶、组织蛋白酶G、胃蛋白酶、IdeS、或来自金黄色葡萄球菌（Staph. aureus）的谷氨酰基内肽酶I。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中使用对所述蛋白酶特异性裂解位点具有特异性的抗体，已经在来自患者的样品中检测到所述人IgG中的蛋白酶特异性裂解位点。
9. 一种治疗患者的方法，其中所述患者正用包含特异性抗体的组合物治疗，其中抗体易受一个或多个蛋白酶的裂解影响，所述蛋白酶与正被治疗的特定疾病相关，所述方法包括将肽免疫原给予患者的步骤，其中所述肽是表示IgG上的蛋白水解裂解位点的肽片段或类似物，所述蛋白水解裂解位点由所述一个或多个蛋白酶产生，所述蛋白酶与正通过抗体治疗而治疗的特定疾病相关。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述病理状况是选自下列的疾病：关节炎疾病、恶性疾病、存在传染性病原体或寄生虫、以及血管疾病。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述疾病是类风湿性关节炎。
12. 根据权利要求10所述的方法，其中所述疾病是葡萄球菌感染。
13. 根据权利要求10所述的方法，其中所述疾病是乳腺癌。
14. 根据权利要求10所述的方法，其中所述受试者已经被诊断或疑似患有心肌梗塞、或正患充血性心力衰竭。
15. 根据权利要求9所述的方法，其中所述肽表示人IgG1中的蛋白酶特异性裂解位点，所述蛋白酶特异性裂解位点由选自下列的蛋白酶产生：MMP-3、MMP-7、MMP-12、HNE、纤溶酶、组织蛋白酶G、胃蛋白酶、IdeS、或来自金黄色葡萄球菌的谷氨酰基内肽酶I。
16. 根据权利要求9所述的方法，其中使用对所述蛋白酶特异性裂解位点具有特异性的抗体，已经在来自患者的样品中检测到所述人IgG中的蛋白酶特异性裂解位点。
17. 根据权利要求9所述的方法，其中所述给予肽免疫原能够恢复、提高或维持所述包含抗体的组合物的效应子功能。
18. 根据权利要求1或9所述的方法，其中所述裂解产物类似物肽免疫原由下列步骤制备：
a. 鉴定一对抗体重链残基的残基，所述抗体在最邻近所述重链的N-末端处被蛋白酶裂解；
b. 鉴定包括至少5个连续氨基酸残基的肽序列，所述连续氨基酸残基位于所述蛋白酶裂解位点的上游，其中最邻近所述多肽的N-末端的所述蛋白酶裂解位点的残基将变成所定义序列的C-末端；以及
c. 制备足以用于免疫的量的肽、或肽同源物或化学同系物的溶液。
19. 根据权利要求1或9所述的方法，其中所述肽免疫原包括至少5个连续氨基酸、或物种同源物或化学类似物，所述连续氨基酸选自位于所述蛋白酶裂解位点的氨基末端侧的上游的人IgG铰链区序列SEQ ID NO: 1、2、3或4。
20. 根据权利要求1或9所述的方法，其中所述肽免疫原至少包括IgG1的铰链核心、或物种同源物或化学类似物，所述铰链核心被定义为残基-T-C-P-P-C-（SEQ ID NO: 1的残基7-11）。
21. 根据权利要求1或9所述的方法，其中所述肽免疫原包括人IgG1下铰链的12聚体肽类似物和具有序列TCPPCPAPELLG（SEQ ID NO: 1的残基7-18）的邻接的CH2结构域。
22. 根据权利要求1或9所述的方法，其中所述肽免疫原包括具有氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO: 5-11和它们的N-末端截短形式，所述肽包括至少5个氨基酸并且包含位于所述IgG蛋白酶裂解位点的N-末端侧的上游的氨基酸序列。
23. 根据权利要求1或9所述的方法，其中所述肽免疫原包括选自下列的氨基酸序列：（a）IgG1 MMP-3裂解位点（TCPPCPAP，SEQ ID NO: 1的残基7-14）的氨基末端侧上的氨基酸序列；（b）谷氨酰基内肽酶IgG1裂解位点（TCPPCPAPE，SEQ ID NO: 1的残基7-15）；以及（c）包括IdeS IgG1裂解位点（TCPPCPAPELLG，SEQ ID NO: 1的残基7-18）的肽。
24. 根据权利要求19所述的方法，其中所述肽是化学同系物，其中半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代。
25. 根据权利要求19所述的方法，其中所述肽以该肽的C-末端化学键合至另一部分的方式缀合到载体蛋白。
26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述载体蛋白选自匙孔血蓝蛋白（KLH）或血清白蛋白。
27. 根据权利要求19所述的方法，其中所述肽选自SEQ ID NO: 5-16的那些。
28. 一种包含肽的疫苗组合物，所述肽包括在与通过特定给药途径向患者给药相容的药学上可接受的载体中的至少5个连续氨基酸、或其物种同源物或化学类似物，所述连续氨基酸选自位于所述蛋白酶裂解位点的氨基末端侧的上游的人IgG铰链区序列SEQ ID NO: 1、2、3或4。
29. 一种权利要求28的疫苗制剂，其中所述肽结合佐剂给予，所述佐剂用于提高对所述肽的体液应答的目的。
30. 根据权利要求29所述的疫苗制剂，其中所述佐剂选自：CD40激动剂、矾、聚合物微粒、水包油乳液、MF59、CpG、GM-CSF、IL-12和IL-2。
31. 根据权利要求28、29或30所述的疫苗组合物，其中所述肽选自SEQ ID NO: 5-16的那些。
32. 一种提高或维持抗体的效应子功能的方法，所述抗体用于向患者给药以治疗病理状况，其中所述抗体在患者中经受一个或多个蛋白酶的裂解，所述方法包括在抗体治疗之前、之后或同时用人IgG蛋白酶裂解位点肽接种患者，所述肽能够产生结合所述治疗抗体且能够恢复其效应子功能的抗体。
33. 根据权利要求32所述的方法，其中用于接种患者的人IgG蛋白酶裂解位点肽是选自SEQ ID NO: 5-16的那些的肽。
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