CN103782172A

CN103782172A - 检测针对使用TNFα的生物疗法的中和性自体抗体的测定法

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Publication number: CN103782172A
Application number: CN201280043142.5A
Authority: CN
Inventors: S·豪恩施泰因; L·奥尔穆德; S·辛格; S·L·王
Original assignee: Societe dAssistance Technique pour Produits Nestle SA
Current assignee: Nestec SA
Priority date: 2011-07-06
Filing date: 2012-07-06
Publication date: 2014-05-07
Also published as: US20170176433A1; AU2016201196A1; RU2013158256A; EP3130921B1; WO2013006810A1; EP2729807A1; MX343324B; CA2840232A1; US10794906B2; MX2013015420A; US9465027B2; US20140186973A1; JP2014525036A; HK1194467A1; KR20140047628A; JP6181646B2; EP2729807B1; EP3130921A1; ZA201309703B; SG10201605516YA

Abstract

本发明提供用于检测和测量样品中针对生物制剂例如抗TNFα药物治疗剂的中和性和非中和性自体抗体的存在或水平的测定法。本发明用于在对象接受生物制剂疗法时监测中和性和/或非中和性抗药物抗体随时间的形成。本发明也用于预测和/或确定患者样品中的中和性抗药物抗体与备选生物制剂治疗的交叉反应性。因此，本发明提供用于指导接受使用生物制剂疗法的对象的治疗决定的信息，并改善对生物疗法的优化治疗、降低毒性和/或监测治疗效力的准确度。

Description

检测针对使用TNFα的生物疗法的中和性自体抗体的测定法

与相关申请的交叉引用

本申请要求2011年7月6日提交的美国临时申请号61/505,031、2011年8月26日提交的美国临时申请号61/528,072和2011年9月16日提交的美国临时申请号61/535,884的优先权，所述申请的公开在此处为了各种目的以其整体引入作为参考。

发明背景

自身免疫疾病是重要的且普遍的医学问题。例如，在美国，类风湿性关节炎（RA）是影响两百万以上人群的自身免疫疾病。RA引起关节的慢性炎症，并通常是渐进性疾病，其可能造成关节破坏和功能性病废。尽管遗传素质、感染物和环境因素都涉及该疾病的病因学，但类风湿性关节炎的原因仍是未知的。在活性RA中，症状包括疲乏、缺乏食欲、低热、肌肉和关节疼痛以及僵硬。并且，在疾病突然发作期间，由于滑膜的炎症，关节通常变成红色、肿胀、疼痛和敏感。此外，由于RA是全身疾病，炎症可能会影响关节外的其他器官和身体部位，包括眼和口的腺体、肺内壁、心包膜和血管。

RA和其他自身免疫病症管理的传统治疗包括快速作用的“一线药物”和较慢作用的“二线药物”。一线药物减轻疼痛和炎症。此类一线药物的实例包括阿司匹林、甲氧萘丙酸、布洛芬依托度酸和其他非甾体抗炎性药物（NSJAID），以及皮质甾类，通过口服或直接注射到组织和关节内施用。二线药物促进疾病减轻并防止进行性关节破坏，也称为疾病改变性抗类风湿药物或DMARD。二线药物的实例包括金、hydrochloroquine、柳氮磺胺吡啶以及免疫抑制剂，例如甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、环磷酰胺、苯丁酸氮芥和环孢霉素。然而，这些药物中许多可能具有有害的副作用。因此，一直在寻找类风湿性关节炎和其他自身免疫病症的额外疗法。

肿瘤坏死因子α（TNF-α）是由众多细胞类型，包括单核细胞和巨噬细胞产生的细胞因子，其最初基于其能诱导某些小鼠肿瘤坏死的能力而鉴定。随后，一种称为恶液质素的因子（与恶病质相关）显示出与TNF-α相同。TNF-α涉及多种其他人类疾病和病症的病理生理学，包括休克、败血病、感染、自身免疫疾病、RA、克罗恩病、移植排斥和移植物抗宿主病。

由于人TNF-α（hTNF-α）在多种人类疾病中的有害作用，已经设计了治疗策略，以抑制或者抵消hTNF-α活性。具体而言，已经探寻了与hTNF-α结合并中和其的抗体，作为抑制hTNF-α活性的方法。一些最早的此类抗体是小鼠单克隆抗体（mAb），其由制备自用hTNF-α免疫的小鼠的淋巴细胞的杂交瘤分泌（参见，例如Moeller等人的美国专利号No.5,231,024）。尽管这些小鼠抗hTNF-α抗体通常对hTNF-α表现出高亲和力，并且能中和hTNF-α活性，但由于与将小鼠抗体施用给人相关的问题，其体内用途受到了限制，所述问题例如短的血清半寿期、不能引发某些人效应子功能，以及在人中引起针对小鼠抗体的不想要的免疫应答（“人抗小鼠抗体”（HAMA）反应）。

最近，已经将生物治疗用于自身免疫疾病如类风湿性关节炎的治疗。例如，FDA已经批准将4种TNFα抑制剂：REMICADE^TM（英夫利昔单抗（infliximab））、嵌合的抗-TNFαmAb，ENBREL^TM（依那西普（etanercept））、TNFR-Ig Fc融合蛋白、HUMIRA^TM（阿达木单抗（adalimumab））、人抗-TNFαmAb，和

（赛妥珠单抗（certolizumab pegol））、聚乙二醇化Fab片段用于治疗类风湿性关节炎。还将

用于治疗中度至重度克罗恩病（CD）。尽管已经显示，此类生物学治疗在治疗类风湿性关节炎和其他自身免疫疾病如CD中是成功的，但并非全部经治疗的对象都应答或者良好应答此类疗法。此外，TNFα抑制剂的施用能诱导对药物的免疫应答，并导致产生自体抗体如人抗嵌合抗体（HACA）、人抗人源化抗体（HAHA）和人抗小鼠抗体（HAMA）。此类HACA、HAHA或HAMA免疫应答能够与超敏反应和免疫治疗性TNFα抑制剂的药物动力学和生物分布的急剧改变相关，后者阻碍了用药物的进一步治疗。因此，本领域存在对用于检测患者样品中针对生物制剂例如抗TNFα药物的自体抗体的存在的测定法的需求，以监测生物疗法并指导治疗决定。本发明满足了该需求，并还提供了相关的优点。

发明概述

本发明提供用于检测和测量样品中针对生物制剂例如抗TNFα药物治疗剂的中和性和非中和性自体抗体的存在或水平的测定法。本发明用于当对象接受生物疗法（例如抗TNFα药物疗法）时监测中和性和/或非中和性抗药物抗体随时间的形成。本发明也用于预测和/或确定对象样品中中和性抗药物抗体与备选生物疗法（例如备选抗TNFα疗法）的交叉反应性。同样地，本发明提供用于指导接受使用生物制剂疗法的对象的治疗决定的信息，以及改善对生物疗法的优化疗法、降低毒性和/或监测治疗效力的准确度。

在一方面，本发明提供用于检测样品中针对生物制剂的中和性和/或非中和性形式的自体抗体的存在的方法，所述方法包括：

（a）将样品与经标记的生物制剂和经标记的生物制剂结合部分接触，以形成：

(i)经标记的生物制剂和自体抗体的第一经标记的复合物（即免疫复合物或缀合物）（即其中第一经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着）；和/或

(ii)经标记的生物制剂、经标记的生物制剂结合部分，和自体抗体的第二经标记的复合物（即免疫复合物或缀合物）（即其中第二经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着）；

(b)对第一经标记的复合物和/或第二经标记的复合物进行大小排阻色谱以将它们与游离（即未结合）的经标记的生物制剂结合部分、游离的经标记的生物制剂，和/或经标记的生物制剂和经标记的生物制剂结合部分的复合物分离；

(c)在大小排阻色谱后测量游离的经标记的生物制剂结合部分的水平（例如通过在大小排阻色谱（SEC）后测量游离的经标记的生物制剂结合部分峰的曲线下面积（AUC））；和

(d)比较在步骤（c）中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平与对照样品中游离的经标记的生物制剂结合部分的水平（例如，通过测量只含游离的经标记的生物制剂结合部分的参考样品在SEC后游离的经标记的生物制剂结合部分峰的AUC），从而确定中和性和/或非中和性形式的自体抗体的存在。

在某些实施方式中，当在步骤（c）中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平与对照样品中的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平相同或实质上相同时，检测到中和性形式的自体抗体。在某些其他实施方式中，当在步骤（c）中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平与对照样品中的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平相比降低（例如实质上降低）或不存在（例如不可检测）时，检测到非中和性形式的自体抗体。

另一方面，本发明提供用于测量样品中针对生物制剂的中和性形式的自体抗体的水平或百分比的方法，所述方法包括：

(a)将样品与经标记的生物制剂和经标记的生物制剂结合部分接触，以形成：

(d)比较在步骤（c）中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平与对照样品中游离的经标记的生物制剂结合部分的经标准化的水平或百分比（例如，通过测量并标准化只含游离的经标记的生物制剂结合部分的参考样品在SEC后游离的经标记的生物制剂结合部分峰的AUC以计算游离的经标记的生物制剂结合部分的水平或百分比），其中对照样品中游离的经标记的生物制剂结合部分的经标准化的水平或百分比对应于中和性形式的自体抗体的水平或百分比。

在一些实施方式中，对照样品中游离的经标记的生物制剂结合部分的经标准化的水平或百分比与步骤（c）中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平的差异对应于非和中和性形式的自体抗体的水平或百分比。

在另一方面，本发明提供用于确定针对第一生物制剂的中和性形式的自体抗体是否与第二（即不同）生物制剂具有交叉反应性的方法，所述方法包括：

(a)根据本文说明的测定法检测或测量样品中中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比，以确定样品是中和性形式的自体抗体阳性或阴性的；和

如果样品是中和性形式的自体抗体阳性的，则：

(b)将样品与经标记的第二生物制剂接触，以形成经标记的第二生物制剂和中和性形式的自体抗体的经标记的复合物（即其中经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着）；

(c)对经标记的复合物进行大小排阻色谱以分离经标记的复合物（即与游离的经标记的第二生物制剂分离）；和

(d)检测经标记的复合物，从而确定针对第一生物制剂的中和性形式的自体抗体是否与第二生物制剂具有交叉反应性。

在某些实施方式中，经标记的复合物的存在指示针对第一生物制剂的中和性自体抗体与第二生物制剂具有交叉反应性，即中和性自体抗体将抑制第一和第二生物药物的活性。

在某些其他实施方式中，经标记的复合物的不存在指示针对第一生物制剂的中和性自体抗体不与第二生物制剂具有交叉反应性，即中和性自体抗体将不抑制第二生物药物的活性。

在一些实施方式中，生物制剂包括抗体（例如抗TNFα单克隆抗体）、抗体片段、蛋白质（例如细胞因子诸如白介素）、多肽、肽、融合蛋白、多价结合蛋白、抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其改造形式及其组合。

在其他实施方式中，样品是全血、血清或血浆样品，例如来自接受生物制剂疗法的对象。在优选的实施方式中，样品是血清。在特别的实施方式中，对象患有疾病或病症，例如自体免疫疾病（例如类风湿性关节炎）、炎性疾病（例如炎性肠病（IBD）例如克罗恩病（CD）或溃疡性结肠炎（UC））或癌症。

在某些实施方式中，样品含有或被怀疑含有针对生物制剂的自体抗体。在其他实施方式中，生物制剂自体抗体包括，但不限于，人抗嵌合抗体（HACA）、人抗人源化抗体（HAHA）和人抗小鼠抗体（HAMA）及其组合。

在某些方面，本发明的测定方法还包括酸解步骤，所述步骤包括在将样品与经标记的生物制剂和经标记的生物制剂结合部分接触之前、期间和/或之后将样品与酸接触。

在某些其他方面，本发明的测定方法包括检测样品中针对生物制剂的中和性和/或非中和性形式的自体抗体的一种或多种同种型的存在或水平。

在一个特别的方面，本发明提供检测样品中针对抗TNFα药物的中和性和/或非中和性形式的自体抗体的存在的方法，所述方法包括：

(a)将样品与经标记的抗TNFα药物和经标记的TNFα接触，以形成：

(i)经标记的抗TNFα药物和自体抗体的第一经标记的复合物（即免疫复合物或缀合物）（即其中第一经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着）；和/或

(ii)经标记的抗TNFα药物、经标记的TNFα，和自体抗体的第二经标记的复合物（即免疫复合物或缀合物）（即其中第二经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着）；

(b)对第一经标记的复合物和/或第二经标记的复合物进行大小排阻色谱以将它们与游离（即未结合）的经标记的TNFα、游离的经标记的抗TNFα药物，和/或经标记的抗TNFα药物和经标记的TNFα的复合物分离；

(c)在大小排阻色谱后测量游离的经标记的TNFα的水平（例如通过在大小排阻色谱（SEC）后测量游离的经标记的TNFα峰的曲线下面积（AUC））；和

(d)比较在步骤（c）中测量的游离的经标记的TNFα的水平与对照样品中游离的经标记的TNFα的水平（例如，通过测量只含游离的经标记的TNFα的参考样品在SEC后游离的经标记的TNFα峰的AUC），从而检测中和性和/或非中和性形式的自体抗体的存在。

在某些实施方式中，当在步骤（c）中测量的游离的经标记的TNFα的水平与对照样品中的游离的经标记的TNFα的水平相同或实质上相同时，检测到中和性形式的自体抗体。在某些其他实施方式中，当在步骤（c）中测量的游离的经标记的TNFα的水平与对照样品中的游离的经标记的TNFα的水平相比降低（例如实质上降低）或不存在（例如不可检测）时，检测到非中和性形式的自体抗体。

另一方面，本发明提供用于测量样品中针对抗TNFα药物的中和性形式的自体抗体的水平或百分比的方法，所述方法包括：

(d)比较在步骤（c）中测量的游离的经标记的TNFα的水平与对照样品中游离的经标记的TNFα的经标准化的水平或百分比（例如，通过测量并标准化只含游离的经标记的TNFα的参考样品在SEC后游离的经标记的TNFα峰的AUC，以计算游离的经标记的TNFα的水平或百分比），其中对照样品中游离的经标记的TNFα的经标准化的水平或百分比对应于中和性形式的自体抗体的水平或百分比。

在一些实施方式中，对照样品中游离的经标记的TNFα的经标准化的水平或百分比与步骤（c）中测量的游离的经标记的TNFα的水平的差异对应于非和中和性形式的自体抗体的水平或百分比。

在另一个特别的方面，本发明提供确定针对第一抗TNFα药物的中和性形式的自体抗体是否与第二（即不同）抗TNFα药物具有交叉反应性的方法，所述方法包括：

如果样品是中和性形式的自体抗体阳性的，则：

(b)将样品与经标记的第二抗TNFα药物接触，以形成经标记的第二抗TNFα药物和中和性形式的自体抗体的经标记的复合物（即其中经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着）；

(c)对经标记的复合物进行大小排阻色谱以分离经标记的复合物（即与游离的经标记的第二抗TNFα药物分离）；和

(d)检测经标记的复合物，从而确定针对第一抗TNFα药物的中和性形式的自体抗体是否与第二抗TNFα药物具有交叉反应性。

在某些实施方式中，经标记的复合物的存在指示针对第一抗TNFα药物的中和性自体抗体与第二抗TNFα药物具有交叉反应性，即中和性自体抗体将抑制第一和第二抗TNFα药物的活性。

在某些其他实施方式中，经标记的复合物的不存在指示针对第一抗TNFα药物的中和性自体抗体不与第二抗TNFα药物具有交叉反应性，即中和性自体抗体将不抑制第二抗TNFα药物的活性。

在一些实施方式中，抗TNFα药物选自REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBREL^TM(依那西普)、HUMIRA^TM(阿达木单抗)、(赛妥珠单抗)、

(戈利木单抗（golimumab）；CNTO148)及其组合。

在其他实施方式中，样品是全血、血清或血浆样品，例如来自接受抗TNFα药物疗法的对象。在优选的实施方式中，样品是血清。在特别的实施方式中，对象患有TNFα介导的疾病或病症，例如自体免疫疾病（例如类风湿性关节炎）或炎性疾病（例如炎性肠病（IBD）例如克罗恩病（CD）或溃疡性结肠炎（UC））。

在某些实施方式中，样品含有或被怀疑含有针对抗TNFα药物的自体抗体。在其他实施方式中，抗TNFα药物自体抗体包括但不限于人抗嵌合抗体（HACA）、人抗人源化抗体（HAHA）和人抗小鼠抗体（HAMA）及其组合。

在某些方面，本发明的测定方法还包括酸解步骤，所述步骤包括在将样品与经标记的抗TNFα药物和经标记的TNFα接触之前、期间和/或之后将样品与酸接触。

在某些其他方面，本发明的测定方法包括检测样品中针对抗TNFα药物的中和性和/或非中和性形式的自体抗体的一种或多种同种型的存在或水平。

在其他方面，本发明提供用于在接受使用生物制剂的疗程的对象中对生物制剂进行监测和/或优化疗法的方法，所述方法包括：

(a)根据本文所说明的测定法在疗程中的多个时间点检测或测量针对生物制剂的中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比；

(b)检测中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比随时间的改变；和

(c)基于中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比随时间的改变，确定对象的疗程随后的剂量或是否应当向对象施用不同的疗程。

在一个特别的方面，本发明提供用于在接受使用生物制剂的疗程的对象中对生物制剂进行监测和/或优化疗法的方法，所述方法包括：

(a)在时间点t₀如本文所述测量来自对象的第一样品中针对生物制剂的中和性形式的自体抗体的水平或百分比；

(b)在时间点t₁如本文所述测量来自对象的第二样品中的中和性形式的自体抗体的水平或百分比；

(c)在时间点t_n+1任选地对来自对象的n个额外的样品重复步骤（b），其中n是从1至约25的整数（例如n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25，或其中的任何范围）；

(d)检测中和性形式的自体抗体的水平或百分比从时间点t₀至t₁或从时间点t₀至t_n+1的改变；和

(e)基于中和性形式的自体抗体的水平或百分比随时间的改变，确定对象的疗程随后的剂量或是否应当向对象施用不同的疗程。

在额外的方面，本发明提供用于在接受使用第一生物制剂的疗程的对象中优化疗法和/或降低毒性的方法，所述方法包括：

(a)通过根据本文说明的测定法检测或测量来自对象的样品中中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比，确定针对第一生物制剂的中和性形式的自体抗体是否与第二（即不同的）生物制剂具有交叉反应性；和

(b)如果中和性形式的自体抗体与第二生物制剂具有交叉反应性，确定应当向对象施用不同的疗程。

在一个特别的方面，本发明提供用于在接受使用抗TNFα药物的疗程的对象中对抗TNFα药物进行监测和/或优化疗法的方法，所述方法包括：

(a)根据本文所说明的测定法在疗程中的多个时间点检测或测量针对抗TNFα药物的中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比；

在另一个特别的方面，本发明提供用于在接受使用抗TNFα药物的疗程的对象中对抗TNFα药物进行监测和/或优化疗法的方法，所述方法包括：

(a)在时间点t₀如本文所述测量来自对象的第一样品中针对抗TNFα药物的中和性形式的自体抗体的水平或百分比；

在另一个特别的方面，本发明提供用于在接受使用第一抗TNFα药物的疗程的对象中优化疗法和/或降低毒性的方法，所述方法包括：

(a)通过根据本文说明的测定检测或测量来自对象的样品中的中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比，确定针对第一抗TNFα药物的中和性形式的自体抗体是否与第二（即不同的）抗TNFα药物具有交叉反应性；和

(b)如果中和性形式的自体抗体与第二抗TNFα药物具有交叉反应性，确定应当向对象施用不同的疗程。

从以下的详细说明和附图中，本发明的其他目的、特征和优势对本领域技术人员是显而易见的。

附图简述

图1说明了Nab百分比（y轴）和ATI水平之间存在明显的关系。

图2说明了≥60U/ml的ATI浓度预示着Nab+。

图3说明了ATI预测Nab的ROC AUC为0.931。

图4说明了用本发明的液相迁移率变动测定法检测ATI。

图5说明了本发明的示例性ATI/IFX液相迁移率变动测定法。

图6说明了本发明的非中和性抗药物抗体（ADA）测定法。

图7说明了本发明的中和性ADA测定法。

图8说明了间隔1、2或3个月取自UC患者的5个样品中IFX和ATI水平随时间过程的变化。

图9显示了确定UC患者中随时间的游离TNFα的百分比的峰分析。

图10说明了在间隔2或3个月取自UC患者的并掺有IFX的3个样品中从非中和性自体抗体到中和性自体抗体的存在的转变。

图11显示了确定取自UC患者的掺有IFX的样品中随时间的游离TNFα的百分比的峰分析。

图12显示了使用兔抗人IgG1Fc作为非中和性抗体（Ab）对照。

图13显示了使用ATI阳性血清作为混合的中和性抗体（NAb）/非中和性抗体（Ab）对照。

图14显示了从ATI阳性血清纯化ATI导致较弱亲和性Nab的损失。

图15说明了对UC患者案例研究的峰分析，以确定游离TNFα在多种对照中的百分比。

图16说明了对CD患者案例研究的峰分析，以确定在30周的期间间隔7或8周取得的4个样品中随时间过程的游离TNFα的百分比。

图17说明了对另一个CD患者案例研究的峰分析，以确定在50周的期间取得的3个样品中随时间过程的游离TNFα的百分比。

图18说明了来自4个额外的CD患者案例研究中的峰分析，以确定在诱导或维持疗法期间或之后的特别周时的样品中的游离TNFα的百分比。

图19说明了通过迁移率变动测定法检测非中和性抗体活性。

图20描述了ADA对IFX和ADL的交叉反应性，其中ADA的结合位点模拟TNFα的结合位点，因而可以结合多种抗TNFα药物。

图21说明了2个患者样品（患者1和2），其中确定了应答一种抗TNF药物产生的Nab对于其他抗TNF药物的交叉反应性。特别地，针对Humira(ADL)对患者接受Remicade(IFX)治疗时产生的Nab进行测试。

图22说明了检测针对药物例如IFX或ADL的非中和性抗体（非NAb）（顶部）或中和性抗体（NAb）（底部）的存在的本发明的测定法的示例性实施方式。

图23说明了Nab标准曲线的产生和使用。

图24提供了用IFX治疗，但失去了对IFX的应答的患者3的案例研究的结果，以确定针对IFX产生的Nab对ADL的交叉反应性。

图25提供了用IFX治疗，但失去了对IFX的应答的患者4的案例研究的结果，以确定针对IFX产生的Nab对ADL的交叉反应性。

图26说明了证明ATI亲和性成熟和交叉反应性ATI产生的患者研究的非限制性实例。

发明详述

I.引言

本发明部分基于下述发现：使用大小排阻层析和任选地酸解离以使得能够平衡免疫复合物的同质迁移率变动测定法对于测量针对生物制剂例如抗TNFα药物产生的中和性和非中和性形式的自身抗体（例如，HACA、HAHA等）的存在或水平是特别有利的。此类自身抗体也被称为抗药物抗体或ADA，并且其中和性和非中和性形式也被分别称为NAb和非NAb。

在特别的实施方式中，本发明的同质迁移率变动测定法是通过将对象的样品与（例如荧光）经标记的生物制剂（例如抗TNFα药物）和（例如荧光）经标记的生物制剂结合部分（例如TNFα）接触进行的。至少由于以下原因，本文说明的测定法是有优势的：它们避免了对移除低亲和力ADA的洗脱步骤的需求；它们使用不同的标记例如荧光团，所述荧光团允许在可见、IR和/或近IR（NIR）光谱检测，降低背景和血清干扰问题；它们由于荧光标记检测的高灵敏度，增加了检测对象中的低滴度的中和性或非中和性ADA的能力；并且它们以液相反应进行，从而减少通过附着到固体表面例如ELISA板导致表位的任何改变的机会。

在示例性实施方式中，本发明的测定法是有优势的，因为它们使得能够进行接受抗TNFα药物疗法的IBD对象的时间过程案例研究，用于监测不同时间点的多个样品中的中和性和/或非中和性抗药物抗体的形成。本发明的测定法也是有优势的，因为它们使得能够确定在对象接受抗TNFα药物疗法期间是否存在随着时间的从非中和性抗药物抗体至中和性抗药物抗体的转变。不限于任何特别理论，中和性抗药物抗体可具有显著的负面临床结果，因为它们干扰抗TNFα药物与TNFα之间的结合，从而导致效力损失。

在额外的示例性实施方式中，本发明的测定法用于预测和/或确定对象的样品中的中和性抗药物抗体与备选生物药物例如其他抗TNFα药物的交叉反应性。仅用于说明目的，如果样品含有针对一种抗TNFα药物的中和性ADA，这些中和性ADA将可能与其他抗TNFα药物交叉反应并中和，使得对象的推荐的治疗调整将为转变为具有不同作用机制的药物（例如非抗TNF剂）。然而，如果样品含有针对一种抗TNFα药物的非中和性ADA，对象的推荐的治疗调整可为转变为另一抗TNFα药物。

因此，本发明通过提供用于指导接受抗TNFα药物疗法的对象的治疗决定的信息，部分地解决并克服了现有的与抗TNFα药物，例如英夫利昔单抗和阿达木单抗的施用相关的限制。本发明的方法特别用于监测接受抗TNFα药物疗法的那些对象以检测或测量中和性ADA的形成和/或发展（例如在抗TNFα药物疗法过程中随时间），并且也用于检测或测量当对象接受抗TNFα药物疗法时中和性ADA的量、百分比或比率与非中和性ADA相比随时间的改变（例如增加）。

因此，本发明提供了这样的方法，所述方法用于确定何时和/或如何（1）根据中和性ADA的存在、水平或百分比调整或修改（例如增加或减少）抗TNFα药物随后的剂量以优化治疗效力和/或降低毒性，（2）根据中和性ADA的存在、水平或百分比组合抗TNFα药物（例如以起始、增加的、减少的或相同的剂量）与一种或多种免疫抑制剂例如甲氨蝶呤（MTX）或硫唑嘌呤（AZA），和/或（3）根据中和性ADA的存在、水平或百分比改变现有疗程（例如转变为不同的抗TNFα药物或转变为靶向不同机制的药物）。此类方法用于确保接受抗TNFα药物的对象获得正确的剂量，即他们不发展出针对药物的免疫应答，以及他们由于起始药物的失败（例如发展出针对起始抗TNFα药物的交叉反应性中和性ADA）应当转变为不同的药物。

II.定义

如本文所用，除非另有说明，以下术语具有给定的含义。

如本文所用的术语“生物制剂”或“生物活性剂”或“生物药物”包含从生物系统（例如活生物体）生产或提取的产品和物质。生物制剂的非限制性实例包括抗体、抗体片段、蛋白、多肽、肽、融合蛋白（例如Ig融合蛋白或Fc融合蛋白）、多价结合蛋白（例如DVD Ig）、抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其改造形式及其组合。

术语“生物制剂结合部分”包括（例如特异性地）与生物制剂结合或相互作用的任何分子、活性剂或物质。在某些情况下，中和性形式的自体抗体干扰生物制剂结合部分和生物制剂之间的结合。在某些其他情况下，非中和性形式的自体抗体不干扰生物制剂结合部分和生物制剂之间的结合。作为一个非限制性实例，当生物制剂包含抗TNFα药物时，生物制剂结合部分包含TNFα。作为另一个非限制性实例，当生物制剂包含白介素例如IL-2时，生物制剂结合部分包含白介素受体（例如白介素受体的可溶性细胞外片段）。

如本文所用的术语“抗TNFα药物”或“TNFα抑制剂”意欲包含通过例如抑制TNFα与TNFα的细胞表面受体的相互作用、抑制TNFα蛋白生产、抑制TNFα基因表达、抑制TNFα从细胞分泌、抑制TNFα受体发信号或导致对象中TNFα活性降低的任何其他方法直接或间接抑制TNFα活性的活性剂，包括蛋白、抗体、抗体片段、融合蛋白（例如Ig融合蛋白或Fc融合蛋白）、多价结合蛋白（例如DVD Ig）、小分子TNFα拮抗剂和类似的天然或非天然存在分子，和/或其重组和/或改造的形式。术语“抗TNFα药物”或“TNFα抑制剂”优选地包括干扰TNFα活性的活性剂。抗TNFα药物的实例包括但不限于英夫利昔单抗(REMICADE^TM,Johnson and Johnson)、人抗TNF单克隆抗体阿达木单抗(D2E7/HUMIRA^TM,Abbott Laboratories)、依那西普(ENBREL^TM,Amgen)、CDP571(Celltech)，CDP870(Celltech)，以及其他抑制TNFα活性的化合物，使得当施用于罹患或有风险罹患TNFα活性有害的病症（例如RA）的对象中时，病症被治疗。

术语“TNFα”意欲包括以17kDa分泌形式和26kDa膜缔合形式存在的人细胞因子，其生物学活性形式由非共价结合的17kDa分子的三聚体组成。TNFα的结构还描述于，例如Jones等人，Nature，338：225-228（1989）中。术语TNFα意欲包括人TNFα、重组人TNFα（rhTNF-α）或与人TNFα蛋白质具有至少约80%同一性的TNFα。人TNFα由35个氨基酸（aa）的胞质结构域、21个氨基酸的跨膜区段，以及177个氨基酸胞外结构域（ECD）组成（Pennica，D.等人（1984）Nature312：724）。在ECD内，人TNFα与恒河猴TNFα共有97%的氨基酸序列同一性，并且与牛、犬、棉鼠、马、猫、小鼠、猪和大鼠TNFα共有71%至92%的氨基酸序列同一性。可以通过标准重组表达方法或商业购买（R&D Systems，货号210-TA，Minneapolis，Minn.）制备TNFα。

在某些实施方式中，“TNFα”是抗原，其包括能被抗TNF-α药物结合的分子或者该分子的一部分。TNFα可以具有一个或一个以上的表位。在某些实例中，TNFα将以高选择性方式与抗TNFα抗体反应。与抗体、抗TNFα抗体的片段和区域结合的优选的抗原包括人TNFα的至少5个氨基酸。在某些实例中，TNFα具有足够长度以具有TNFα的表位，所述表位能结合抗TNFα抗体、其片段和区域。

术语“大小排阻色谱”或“SEC”包括其中溶液中的分子基于其大小和/或流体动力学体积分离的色谱方法。它用于大分子或大分子复合物例如蛋白质及其缀合物。通常，当用水性溶液运送样品通过柱时，技术称为凝胶过滤色谱。

术语“复合物”、“免疫复合物”、“缀合物”和“免疫缀合物”包括但不限于，结合于（例如通过非共价方式）抗TNFα药物的TNFα、结合于（例如通过非共价方式）针对抗TNFα药物的自体抗体（例如中和性或非中和性抗药物抗体）的抗TNFα药物，和结合于（例如通过非共价方式）TNFα和针对抗TNFα药物的自体抗体（例如中和性或非中和性抗药物抗体）的抗TNFα药物。

如本文中所用，受术语“经标记的”修饰的实体包括与在经验上可检测到的另一分子或化学实体缀合的任何实体、分子、蛋白质、酶、抗体、抗体片段、细胞因子或相关种类。适合作为用于经标记的实体的标记的化学种类包括但不限于，荧光染料，例如Alexa染料如Alexa

647、量子点（quantum dot）、光学染料、发光染料和放射性核素如¹²⁵I。

短语“荧光标记检测”包括检测荧光标记的工具。用于检测的工具包括但不限于分光光度计、荧光光度计、光度计以及通常与色谱设备，例如但不限于大小排阻高效液相色谱，例如但不限于Agilent-1200HPLC系统整合的检测装置。

短语“优化疗法”包括优化特定疗法的剂量（例如有效量或水平）和/或类型。例如，优化抗TNFα药物的剂量包括增加或减少随后施用给对象的抗TNFα药物的量。在某些情况下，优化抗TNFα药物的类型包括将施用的抗TNFα药物从一种药物改为不同的药物（例如，不同的抗TNFα药物或靶向不同机制的药物）。在其他情况下，优化疗法包括将一定剂量的抗TNFα药物（例如，以增加的、减少的或者与以前的剂量相同的剂量）与一种或多种免疫抑制药物组合共同施用。

术语“共同施用”包括施用一种以上的活性剂，以使一种活性剂的生理作用的持续时间与第二种活性剂的生理作用重叠。

术语“对象”、“患者”或“个体”通常指人，但也指其他动物，包括例如其他灵长类、啮齿类、犬、猫、马、绵羊、猪等。

术语“疗程”包括用于缓解或预防与疾病或病症相关的一种或多种症状的治疗方法。该术语包括施用用于改善患疾病或病症的个体的健康的任何化合物、药物、方法和/或方案，并包括本文中所述的任意治疗剂。作为非限制性的实例，基于TNFα、抗TNFα药物和/或抗药物抗体的存在或浓度水平（例如，使用本发明方法确定的中和性和/或非中和性抗药物抗体的存在、水平，或百分比），可以改变（例如，增加或减少）疗程或者当前疗程的剂量。

术语“免疫抑制药物”或“免疫抑制剂”包括能产生免疫抑制作用（例如防止或减少免疫应答）的任何物质，例如通过辐射或者通过施用药物，如抗代谢物、抗淋巴细胞血清、抗体等。免疫抑制药物的实例包括但不限于，巯基嘌呤药物如硫唑嘌呤（AZA）及其代谢物；抗代谢物如甲氨蝶呤（MTX）；西罗莫司（纳巴霉素）；坦罗莫司；依维莫司；他克莫司（FK-506）；FK-778；抗淋巴细胞球蛋白抗体、抗胸腺细胞球蛋白抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体和抗体-毒素缀合物；环孢霉素；麦考酚酯（mycophenolate）；咪唑立宾单磷酸（mizoribine monophosphate）；蒿属香豆素；格拉默醋酸盐（glatiramer acetate）；其代谢物；其制药学上可接受的盐；其衍生物；其前体药物；及其组合。

术语“巯基嘌呤药物”包括硫唑嘌呤（AZA）、6-巯基嘌呤（6-MP）或者具有治疗作用的其任意代谢物，并且包括但不限于，6-硫代鸟嘌呤（6-TG）、6-甲基巯基嘌呤核苷、6-硫代肌苷核苷酸（例如，6-硫代肌苷单磷酸（thioinosine monophosphate）、6-硫代肌苷二磷酸（6-thioinosine diphosphate）、6-硫代肌苷三磷酸（6-thioinosinetriphosphate））、6-硫鸟嘌呤核苷酸（例如，6-硫代鸟嘌呤单磷酸、6-硫鸟嘌呤二磷酸、6-硫鸟嘌呤三磷酸）、6-硫代黄苷（thioxanthosine）核苷酸（例如，6-硫代黄苷单磷酸、6-硫黄苷二磷酸、6-硫黄苷三磷酸)，其衍生物、其类似物及其组合。

术语“样品”包括获自个体的任何生物样本。样品包括但不限于，全血、血浆、血清、红血细胞、白血细胞（例如，外周血单核细胞（PBMC）、多形核（PMN）细胞）、导管灌洗液、乳头吸出物、淋巴（例如，淋巴结的弥散性肿瘤细胞）、骨髓吸出物、唾液、尿液、粪便（即，大便）、痰、支气管灌洗液、泪液、细针吸出物（例如，通过随机的乳晕细针吸出获取）、任意其他体液、组织样品如炎症位点的活检（例如，穿刺活检）、其细胞提取物，以及来源于一种或多种这些体液或组织的免疫球蛋白富集级分。在一些实施方式中，样品是全血、其分级组分，如血浆、血清或细胞沉淀，或者其免疫球蛋白富集级分。本领域技术人员应当理解，可以在分析前稀释样品，如血清样品。在某些实施方式中，使用本领域已知的任何技术，可以通过分离PBMC和/或PMN细胞获得样品。在某些其他实施方式中，样品是例如来自炎症位点（如胃肠道或滑膜组织的一部分）的组织活检。

本发明方法的步骤不需要必须以它们所显示的特定顺序进行。本领域技术人员应当理解，本发明方法的步骤的其他顺序包括在本发明范围内。

括号，“[]”表示括号内的种类以其浓度提及。

III.实施方式说明

本发明提供用于检测和测量样品中针对生物制剂例如抗TNFα药物治疗剂的中和性和非中和性自体抗体的存在或水平的测定。本发明用于当对象接受生物制剂疗法（例如抗TNFα药物疗法）时监测中和性和/或非中和性抗药物抗体的形成。本发明也用于预测和/或确定对象样品中的中和性抗药物抗体与备选生物制剂疗法（例如备选抗TNFα疗法）的交叉反应性。因此，本发明提供用于指导接受使用生物活性剂疗法的对象的治疗决定的信息，以及改善对生物疗法的优化疗法、降低毒性和/或监测治疗效力的准确度。

(d)比较在步骤（c）中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平与对照样品中游离的经标记的生物制剂结合部分的水平（例如，通过测量只含游离的经标记的生物制剂结合部分的参考样品在SEC后游离的经标记的生物制剂结合部分峰的AUC），从而检测中和性和/或非中和性形式的自体抗体的存在。

在一些实施方式中，中和性形式的自体抗体干扰生物制剂和生物制剂结合部分之间的结合。在其他实施方式中，非中和性形式的自体抗体不干扰生物制剂和生物制剂结合部分之间的结合。

在一些情况下，游离的经标记的生物制剂结合部分由实质上不含结合的生物制剂（例如经标记的和/或未标记的生物制剂）的经标记的生物制剂结合部分组成。

在特别的实施方式中，当步骤（c）中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平是对照样品中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平的至少约70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%时，它被认为与对照样品中的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平实质上相同。在特别的实施方式中，当步骤（c）中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平比对照样品中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平的低至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%时，它被认为与对照样品中的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平相比实质上降低。

在一些实施方式中，游离的经标记的生物制剂结合部分的水平是通过对来自大小排阻色谱（例如SEC-HPLC）的作为洗脱时间的函数的信号强度图的游离的经标记的生物制剂结合部分峰的曲线下面积（AUC）进行积分测量的。

在某些实施方式中，样品含有或被怀疑含有针对生物制剂的自体抗体。在其他实施方式中，生物制剂自体抗体包括但不限于人抗嵌合抗体（HACA）、人抗人源化抗体（HAHA），和人抗小鼠抗体（HAMA）及其组合。

(ii)经标记的生物制剂、经标记的生物制剂结合部分和自体抗体的第二经标记的复合物（即免疫复合物或缀合物）（即其中第二经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着）；

(d)比较在步骤（c）中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平与对照样品中游离的经标记的生物制剂结合部分的经标准化的水平或百分比（例如，通过测量并标准化只含游离的经标记的生物制剂结合部分的参考样品在SEC后游离的经标记的生物制剂结合部分峰的AUC，以计算游离的经标记的生物制剂结合部分的水平或百分比），其中对照样品中游离的经标记的生物制剂结合部分的经标准化的水平或百分比对应于中和性形式的自体抗体的水平或百分比。

在一些实施方式中，对照样品中游离的经标记的生物制剂结合部分的经标准化的水平或百分比与步骤（c）中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平之间的差异对应于非和中和性形式的自体抗体的水平或百分比。

在特别的实施方式中，对照样品中的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平或百分比是通过测量经标记的生物制剂和经标记的生物制剂结合部分之间形成的复合物（例如“经标记的复合物”）的峰面积（例如通过测量AUC），并然后从游离的经标记的生物制剂结合部分的峰面积（例如通过测量游离的经标记的生物制剂结合部分峰的AUC）减去经标记的复合物的测量的峰面积而标准化的。

在某些实施方式中，游离的经标记的生物制剂结合部分的水平是通过对来自大小排阻色谱（例如SEC-HPLC）的作为洗脱时间的函数的信号强度图的游离的经标记的生物制剂结合部分峰的曲线下面积（AUC）进行积分测量的。在其他实施方式中，在经标记的生物制剂和经标记的生物制剂结合部分之间形成的复合物的水平是通过对来自大小排阻色谱（例如SEC-HPLC）的作为洗脱时间的函数的信号强度图的游离的经标记的生物制剂结合部分峰的AUC进行积分测量的。

在某些实施方式中，针对生物制剂（例如ADA）的自体抗体的亚群是中和性形式的自体抗体（例如NAb）。在一些实施方式中，样品中针对生物制剂的自体抗体的总水平可通过将根据本发明的方法测量的中和性和非中和性形式的自体抗体的水平相加而计算。

在一些实施方式中，步骤（c）中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平还与阴性对照、阳性对照或其组合比较。在其他实施方式中，步骤（d）中确定的中和性形式的自体抗体（例如NAb）的百分比与从健康对照（例如正常人血清）建立的截断值或参考范围相比较。在一些实施方式中，截断值或参考范围表示为样品为了被认为是NAb阳性所必须具有的NAb的阈值百分比。在此类实施方式中，当步骤（d）中确定的NAb的百分比大于或等于从健康对照建立的截断值或参考范围时，样品被认为是NAb阳性。在其他实施方式中，当步骤（d）中确定的NAb的百分比小于从健康对照建立的截断值或参考范围时，样品被认为是NAb阴性。截断值或参考范围的非限制性的实例包括例如至少约0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、2.60%、2.70%、2.80%、2.90%、3.00%、3.01%、3.02%、3.03%、3.04%、3.05%、3.06%、3.07%、3.08%、3.09%、3.10%、3.20%、3.30%、3.40%、3.50%、4.00%、4.50%、5.00%、5.50%、6.00%、6.50%、7.00%、7.50%、8.00%、8.50%、9.00%、9.50%、10.00%NAb，或其中任何范围。

在一些实施方式中，所有的针对生物制剂的自体抗体都是中和性抗体，且样品被定义为含有100%的中和性抗药物抗体（NAb）和/或0%非中和性抗药物抗体（非NAb）。在此类实施方式中，步骤（c）中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平大体上与对照样品中的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平相同，并且自体抗体被预测完全阻断或干扰生物制剂和生物制剂结合部分之间的结合。

在其他实施方式中，没有自体抗体是中和性自体抗体，且样品被定义为含有100%的非NAb和/或0%的NAb。在此类实施方式中，与对照样品中的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平相比，步骤（c）中测量的游离的经标记的生物制剂结合部分的水平通常为不存在，并且自体抗体被预测不完全阻断或干扰生物制剂和生物制剂结合部分之间的结合。

在其他实施方式中，当中和性和非中和性形式的自体抗体均存在于样品中时，两类抗体的百分比可以它们本身表示（例如50%NAb或50%非NAb被定义为样品中相等比例的NAb和非NAb）或以比例表示。在某些情况下，比例是通过NAb的百分比除以非NAb的百分比计算的，或者反之亦然。在其他情况下，比例是通过NAb的水平除以非NAb的水平计算的，或者反之亦然。

在其他实施方式中，样品是全血、血清或血浆样品，例如来自接受生物疗法的对象。在优选的实施方式中，样品是血清。在特别的实施方式中，对象患有疾病或病症，例如自体免疫疾病（例如类风湿性关节炎）、炎性疾病（例如炎性肠病（IBD）例如克罗恩病（CD）或溃疡性结肠炎（UC））或癌症。

在某些实施方式中，样品含有或被怀疑含有针对生物制剂的自体抗体。在其他实施方式中，生物制剂自体抗体包括但不限于人抗嵌合抗体（HACA）、人抗人源化抗体（HAHA）和人抗小鼠抗体（HAMA）及其组合。

(a)根据本文说明的测定法检测或测量样品中的中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比，以确定样品是中和性形式的自体抗体阳性或阴性的；和

如果样品是中和性形式的自体抗体阳性的，则：

在某些其他实施方式中，经标记的复合物的不存在指示针对第一生物制剂的中和性自体抗体不与第二生物制剂具有交叉反应性，即中和性自体抗体将不会抑制第二生物药物的活性。

在一些实施方式中，第一和第二生物制剂独立地选自抗体（例如抗TNFα单克隆抗体）、抗体片段、蛋白质（例如细胞因子诸如白介素）、多肽、肽、融合蛋白、多价结合蛋白、抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其改造形式及其组合。

在一个特别的方面，本发明提供用于检测样品中针对抗TNFα药物的中和性和/或非中和性形式的自体抗体的存在的方法，所述方法包括：

(ii)经标记的抗TNFα药物、经标记的TNFα和自体抗体的第二经标记的复合物（即免疫复合物或缀合物）（即其中第二经标记的复合物的组分不是彼此共价地附着）；

在一些实施方式中，中和性形式的自体抗体干扰抗TNFα药物和TNFα之间的结合。在其他实施方式中，非中和性形式的自体抗体不干扰抗TNFα药物和TNFα之间的结合。

在一些情况下，游离的经标记的TNFα由实质上不含结合的抗TNFα药物（例如经标记的和/或未标记的抗TNFα药物）的经标记的TNFα组成。

在特别的实施方式中，当步骤（c）中测量的游离的经标记的TNFα的水平是对照样品中测量的游离的经标记的TNFα的水平的至少约70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%时，它被认为与对照样品中游离的经标记的TNFα的水平实质上相同。在特别的实施方式中，当步骤（c）中测量的游离的经标记的TNFα的水平比对照样品中测量的游离的经标记的TNFα水平低至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%时，它被认为与对照样品中游离的经标记的TNFα的水平相比实质上降低。

在某些实施方式中，游离的经标记的TNFα水平是通过对来自大小排阻色谱（例如SEC-HPLC）的作为洗脱时间的函数的信号强度图的游离的经标记的TNFα峰的曲线下面积（AUC）进行积分测量的。

在一些实施方式中，抗TNFα药物选自REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBREL^TM(依那西普)、HUMIRA^TM(阿达木单抗)、

(赛妥珠单抗)、

(戈利木单抗；CNTO148)及其组合。

在某些实施方式中，样品含有或被怀疑含有针对抗TNFα药物的自体抗体。在其他实施方式中，抗TNFα药物自体抗体包括但不限于人抗嵌合抗体（HACA）、人抗人源化抗体（HAHA），和人抗小鼠抗体（HAMA）及其组合。

在另一方面，本发明提供用于测量样品中针对抗TNFα药物的中和性形式的自体抗体的水平或百分比的方法，所述方法包括：

(b)对第一经标记的复合物和/或第二经标记的复合物进行大小排阻色谱以将它们与游离（即未结合）的经标记的TNFα、游离的经标记的抗TNFα药物和/或经标记的抗TNFα药物和经标记的TNFα的复合物分离；

在特别的实施方式中，对照样品中游离的经标记的TNFα水平或百分比是通过测量经标记的抗TNFα药物和经标记的TNFα之间形成的复合物（例如“经标记的复合物”）的峰面积（例如通过测量AUC），然后从游离的经标记的TNFα的峰面积（例如通过测量游离的经标记的TNFα峰的AUC）减去经标记的复合物的测量的峰面积而标准化的。

在某些实施方式中，游离的经标记的TNFα的水平是通过对来自大小排阻色谱（例如SEC-HPLC）的作为洗脱时间的函数的信号强度图的游离的经标记的TNFα峰的曲线下面积（AUC）进行积分测量的。在其他实施方式中，在经标记的抗TNFα药物和经标记的TNFα之间形成的复合物的水平是通过对来自大小排阻色谱（例如SEC-HPLC）的作为洗脱时间的函数的信号强度图的游离的经标记的TNFα峰的AUC积分测量的。

在某些实施方式中，针对抗TNFα药物（例如ADA）的自体抗体的亚群是中和性形式的自体抗体（例如NAb）。在一些实施方式中，样品中针对抗TNFα药物的自体抗体的总水平可通过将根据本发明的方法测量的中和性和非中和性形式的自体抗体的水平相加而计算。

在一些实施方式中，步骤（c）中测量的游离的经标记的TNFα的水平还与阴性对照、阳性对照或其组合比较。阴性对照的非限制性实例包括小鼠单克隆抗人IgG₁Fc样品和/或兔单克隆抗人IgG₁Fc样品。阳性对照的非限制性实例包括混合的ADA阳性患者血清样品和/或针对抗TNFα药物的F(ab’)₂片段的兔多克隆抗体的样品。

在其他实施方式中，步骤（d）中确定的中和性形式的自体抗体（例如NAb）的百分比与从健康对照（例如正常人血清）建立的截断值或参考范围相比较。在特别的实施方式中，截断值或参考范围表示为样品为了被认为是NAb阳性所必须具有的NAb的阈值百分比。在此类实施方式中，当步骤（d）中确定的NAb的百分比大于或等于从健康对照建立的截断值或参考范围时，样品是NAb阳性。在其他实施方式中，当步骤（d）中确定的NAb的百分比小于从健康对照建立的截断值或参考范围时，样品是NAb阴性。截断值或参考范围的非限制性的实例包括例如至少约0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、2.60%、2.70%、2.80%、2.90%、3.00%、3.01%、3.02%、3.03%、3.04%、3.05%、3.06%、3.07%、3.08%、3.09%、3.10%、3.20%、3.30%、3.40%、3.50%、4.00%、4.50%、5.00%、5.50%、6.00%、6.50%、7.00%、7.50%、8.00%、8.50%、9.00%、9.50%、10.00%NAb，或其中任何范围。在一些情况下，截断值或参考范围是约3.00%NAb或约3.06%NAb或在3.00%-3.10%NAb之间。

在一些实施方式中，所有的针对抗TNFα药物的自体抗体都是中和性抗体，并且样品被定义为含有100%中和性抗药物抗体（NAb）和/或0%非中和性抗药物抗体（非NAb）。在此类实施方式中，步骤（c）中测量的游离的经标记的TNFα的水平大体上与对照样品中的游离的经标记的TNFα水平的相同，并且自体抗体被预测完全阻断或干扰抗TNFα药物和TNFα之间的结合。

在某些实施方式中，没有针对抗TNFα药物的自体抗体是中和性抗体，并且样品被定义为含有100%的非NAb和/或0%的NAb。在此类实施方式中，步骤（c）中测量的游离的经标记的TNFα的水平大体上与对照样品中的游离的经标记的TNFα水平相比是不存在（例如不可检测），并且自体抗体被预测不完全阻断或干扰抗TNFα药物和TNFα之间的结合。

在其他实施方式中，当中和性和非中和性形式的自体抗体均存在于样品中时，两类抗体的百分比可以其本身表示（例如50%NAb或50%非NAb被定义为样品中相等比例的NAb和非NAb）或以比例表示。在某些情况下，比例是通过NAb的百分比除以非NAb的百分比计算的，或者反之亦然。在其他情况下，比例是通过NAb的水平除以非NAb的水平计算的，或者反之亦然。

在一些实施方式中，抗TNFα药物选自REMICADE^TM(英夫利昔单抗)、ENBREL^TM(依那西普)、HUMIRA^TM(阿达木单抗)、(赛妥珠单抗)、

(戈利木单抗；CNTO148)及其组合。

在另一个特别的方面，本发明提供用于确定针对第一抗TNFα药物的中和性形式的自体抗体是否与第二（即不同）抗TNFα药物具有交叉反应性的方法，所述方法包括：

如果样品是中和性形式的自体抗体阳性的，则：

在特别的实施方式中，第一和第二抗TNFα药物独立地选自REMICADE^TM(英夫利昔单抗)、ENBREL^TM(依那西普)、HUMIRA^TM(阿达木单抗)、

(赛妥珠单抗)、

(戈利木单抗；CNTO148)及其组合。

在其他实施方式中，样品是全血、血清或血浆样品，例如来自接受抗TNFα药物疗法的对象。在优选的实施方式中，样品是血清。在具体实施方式中，对象患有TNFα介导的疾病或病症，例如自体免疫疾病（例如类风湿性关节炎）或炎性疾病（例如炎性肠病（IBD）例如克罗恩病（CD）或溃疡性结肠炎（UC））。

使用酸解检测抗药物抗体的方法在本文和2012年2月16日提交的PCT申请号PCT/US2012/025437中说明，出于全部目的将其公开内容在此以整体并入作为参考。

在某些其他方面，本发明的测定方法包括检测样品中针对抗TNFα药物的中和性和/或非中和性形式的自体抗体的一种或多种同种型的存在或水平。作为非限制性实例，本发明的测定法能够用于确定来自接受抗TNFα药物例如REMICADE^TM(英夫利昔单抗)或HUMIRA^TM(阿达木单抗)的ADA阳性患者的样品中不同的中和性和/或非中和性ADA同种型。在某些实施方式中，所述一种或多种同种型包含至少两种、三种、四种、五种或更多的同种型。在其他实施方式中，所述一种或多种同种型选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM同种型、其亚类及其组合。在某些实施方式中，每个自体抗体同种型通过其保留时间表征、鉴定，和/或检测。在其他实施方式中，每个自体抗体同种型是根据信号表征、鉴定，和/或检测的，所述信号由检测器部分例如经标记的抗TNFα药物和不同抗体同种型特异性的经标记的抗Ig抗体的临近结合产生。在一些情况下，信号包含荧光信号，所述荧光信号可用荧光共振能量转移（FRET）检测。

检测抗药物抗体（ADA）同种型的方法在PCT公开号WO2012/054532中进一步说明，其公开内容出于全部目的在此以整体并入本文作为参考。

生物制剂（例如抗TNFα药物）或生物制剂结合部分（例如TNFα）可用多种可检测基团中的任一种标记。在优选的实施方式中，生物制剂（例如抗TNFα药物）和生物制剂结合部分（例如TNFα）包含不同的标记。在某些实施方式中，生物制剂（例如抗TNFα药物）或生物制剂结合部分（例如TNFα）用荧光团或荧光染料标记。荧光团或荧光染料的非限制性实例包括在Molecular Probes Catalogue中列出的那些，其以引文合并入本文（参见R.Haugland,The Handbook-A Guide to FluorescentProbes and Labeling Technologies,第10版,Molecular probes,Inc.(2005)）。此类示例性荧光团或荧光染料包括但不限于Alexa染料例如Alexa

350、Alexa

405、Alexa

430、Alexa

488、Alexa

514、Alexa

532、Alexa

546、Alexa

555、Alexa

568、Alexa

594、Alexa610、Alexa

633、Alexa

635、Alexa

647、Alexa

660、Alexa680、Alexa

700、Alexa

750，和/或Alexa

790，以及其他荧光团，包括但不限于丹磺酰氯(DNS-Cl)、5-(碘乙酰胺基)荧光素(5-IAF)、荧光素5-异硫氰酸酯(FITC)、四甲基罗丹明-5(和6-)异硫氰酸酯(TRITC)、6-丙烯酰-2-二甲氨基萘(acrylodan)、7-硝基苯-2-氧杂-1,3,-重氮-4-基氯(NBD-Cl)、溴化乙锭、荧光黄、5-羧基罗丹明6G盐酸、丽丝胺若丹明B磺酰氯、Texas Red^TM磺酰氯、BODIPY^TM、萘胺磺酸(例如1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)、6-（对甲苯胺基）萘2-磺酸(TNS)等)、Anthroyl脂肪酸、DPH、十八烷四烯酸、TMA-DPH、芴基脂肪酸、荧光素-磷脂酰乙醇胺、Texas Red-磷脂酰乙醇胺、芘基磷脂酰胆碱、芴基磷脂酰胆碱、部花青540、1-(3-磺酸丙基)-4-[β-[2[(二-正-丁氨基)-6萘基]乙烯基]吡啶甜菜碱(萘基苯乙烯)、3,3二丙基硫杂二羰菁(diS-C3-(5))、4-(对二戊基氨基苯乙烯基)-l-甲基吡啶盐(di-5-ASP)、Cy-3碘代乙酰胺、Cy-5-N-羟基琥珀酰亚胺、Cy-7-异硫氰酸盐、若丹明800、IR-125、噻唑橙、天青B、尼罗蓝、Al酞菁、oxaxine1,4’、6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、Hoechst33342、TOTO、吖啶橙、乙锭同型二聚体、N(乙氧基羰甲基)-6-甲氧基喹啉盐(MQAE)、Fura-2、钙绿、羧基SNARF-6、BAPTA、香豆素、phytofluor、六苯并苯、金属-配体复合物、

700DX、

700、800RS、

800CW、

800、Cy5、Cy5.5、Cy7、DY676、DY680、DY682、DY780及其混合物。额外的适当的荧光团包括酶辅因子；镧系元素、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白或其突变体或衍生物。在本发明的一个实施方式中，特异性结合对的第二个成员具有附着于其上的可检测基团。

通常，荧光基团是选自包含聚甲炔、酞菁、菁、氧杂蒽、芴、若丹明、香豆素、荧光素和BODIPY^TM的染料种类的荧光团。

在一个实施方式中，荧光基团是近红外（NIR）荧光团，在约650至约900nm的范围内发射。使用近红外荧光技术在生物测定法中是有利的，因为它实质上消除或减少来自生物底物的自发荧光的背景。近IR荧光技术的另一益处是来自激发源的散射光大大减少，因为散射强度与波长的四次方倒数成比例。低背景荧光和低散射导致高信噪比，这是高灵敏性检测必需的。此外，生物组织中在近IR区（650nm至900nm）的光学透明窗口使得NIR荧光是需要光透过生物组分的体内成像和亚细胞检测应用的有价值的技术。在此实施方式的方面内，荧光基团优选地选自

700DX、

700、

800RS、

800CW、

800、Alexa

660、Alexa680、Alexa

700、Alexa

750、Alexa790、Cy5、Cy5.5、Cy7、DY676、DY680、DY682和DY780。在某些实施方式中，近红外基团是800CW、

800、

700DX、700或Dynomic DY676。

荧光标记是用荧光团的化学反应性衍生物完成的。常见的反应性基团包括胺类反应性异硫氰酸酯衍生物例如FITC和TRITC（荧光素和若丹明的衍生物）、胺类反应性琥珀酰亚胺酯例如NHS-荧光素，和巯基反应性马来酰亚胺活化的荧石例如荧光素-5-马来酰亚胺，其中许多可从市场购得。此类反应性染料中的任一种与生物制剂（例如抗TNFα药物）或生物制剂结合部分（例如TNFα）的反应导致在荧光团和生物制剂（例如抗TNFα药物）或生物制剂结合部分（例如TNFα）之间形成稳定的共价键。

在某些情况下，在荧光标记反应后，通常需要从经标记的靶分子移去任何未反应的荧光团。这通常是利用荧光团和经标记的蛋白之间的大小差异，用大小排阻色谱完成的。

反应性荧光染料可从许多来源获得。所获得的它们具有不同的反应性基团，用于附着至靶分子内的多种功能基团。它们也可从含有进行标记反应的所有组分的试剂盒中获得。在一个优选的实施方式中，使用来自Invitrogen的Alexa

647C2马来酰亚胺（货号A-20347）。

可直接或间接检测中和性和/或非中和性抗药物抗体（例如NAb或非NAb）与生物制剂（例如抗TNFα药物）和/或生物制剂的特异性免疫结合。直接标记包括附着至抗体的荧光或发光标签、金属、染料、放射核素等。在某些情况下，用不同的放射性核素标记的生物制剂（例如抗TNFα药物）或生物制剂结合部分（例如TNFα）可用于确定样品中NAb和/或非NAb的存在或水平。在其他情况下，使用化学发光生物制剂（例如抗TNFα药物）和生物制剂结合部分（例如TNFα）的化学发光测定法适于敏感、非放射性地确定样品中NAb和/或非NAb的存在或水平。在特别的情况下，用不同的荧光染料标记的生物制剂（例如抗TNFα药物）或生物制剂结合部分（例如TNFα）适于检测样品中NAb和/或非NAb的存在或水平。荧光染料的实例包括但不限于Alexa

染料、DAPI、荧光素、Hoechst33258、R-藻青蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、若丹明、Texas red，和丽丝胺。可商购与荧光染料连接的二抗，例如，可从TagoImmunologicals(Burlingame,CA)获得山羊F(ab’)2抗人IgG-FITC。

间接标记包括本领域熟知的多种酶，例如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、β-半乳糖苷酶、脲酶等。可使用辣根过氧化物酶检测系统和生色底物例如，四甲基联苯胺（TMB），它在过氧化氢存在下产生可溶性产物，所述产物可在450nm检测到。可使用碱性磷酸酶检测系统和生色底物例如，对硝基苯基磷酸酯，它产生可在405nm方便地检测的可溶性产物。类似地，可使用β-半乳糖苷酶检测系统和生色底物邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG），它产生可在410nm检测的可溶性产物。可使用脲酶检测系统和底物例如尿素-溴甲酚紫（SigmaImmunochemicals;St.Louis,MO）。可从多种市售来源获得与酶连接的有用的二抗，例如可从Jackson ImmunoResearch(West Grove,PA.)购买山羊F(ab’)₂抗人IgG-碱性磷酸酶。

可分析来自直接或间接标记的信号，例如使用分光光度计检测来自生色底物的颜色；用辐射计数器检测辐射，例如用于检测¹²⁵I的γ计数器；或用荧光光度计在特定波长的光存在下检测荧光。为检测酶联抗体，可根据生产商的说明使用分光光度计例如EMAX酶标仪（MolecularDevices;Menlo Park,CA）对NAb和非NAb的水平进行定量分析。如果需要，本发明的测定可自动化或由机器人完成，并且可同时检测来自多个样品的信号。

在某些实施方式中，使用大小排阻色谱。SEC的基本原理是不同大小的颗粒以不同的速率洗脱（过滤）通过固定相。这导致颗粒溶液基于大小分离。如果所有颗粒同时或接近同时装载，相同大小的颗粒一同洗脱。每个大小排阻柱具有可分离的分子量范围。排阻限制限定了此范围的分子量上限，此时分子过大，不能捕获在固定相中。渗透限制限定了分离范围的分子量下限，此时分子足够小，可以完全渗透入固定相的孔中，并且所有低于此分子量的分子太小以至于他们洗脱为单一条带。

在某些方面，洗脱液以恒定的体积，或级分收集。颗粒大小越相似，它们越可能处在同一级分中而不能分别检测。优选地，用光谱技术检测收集的级分，以确定被洗脱的颗粒的浓度。通常，用于本发明的光谱学检测技术包括但不限于荧光测定发、折射指数（RI）和紫外线（UV）。在某些情况下，洗脱体积大体上随着分子流体动力学体积的对数线性地减小（即较重的部分首先洗脱）。

在某些实施方式中，多个时间点包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多个时间点。

(c)任选地在时间点t_n+1对来自对象的n个额外的样品重复步骤（b），其中n是从1至约25的整数（例如n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25，或其中的任何范围）；

(d)检测中和性形式的自体抗体的水平或百分比从时间点t₀至t₁或从时间点t₀至t_n+1之间的改变；和

在某些其他实施方式中，在生物制剂药物疗法期间在以下周中的一个或多个（例如多个）测量中和性形式的自体抗体（例如NAb）的水平或百分比：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、80、90、100等。

在一些实施方式中，确定对象疗程的随后的剂量包括维持、增加或减少对象疗程的随后的剂量。在其他实施方式中，确定对象不同的疗程包括用不同的生物制剂药物治疗。在其他实施方式中，确定对象不同的疗程包括用现有疗程连同另一治疗剂治疗。在其他实施方式中，确定对象不同的疗程包括改变现有疗程（例如转变为不同的生物制剂或靶向不同机制的药物。）

在特别的实施方式中，中和性形式的自体抗体（例如NAb）的水平或百分比随时间的增加提示应当向对象建议治疗调整。在某些其他实施方式中，中和性形式的自体抗体（例如NAb）随时间从不存在向存在的改变提示应当向对象建议治疗调整。在此类实施方式中，对象可用现有疗程（例如服用已有生物制剂）连同一种或多种其他治疗剂治疗。在某些备选实施方式中，对象可换用不同生物制剂。在某些其他备选实施方式中，对象可换用靶向不同机制的药物（例如生物制剂和/或非生物制剂）。

(a)通过根据本文说明的测定法检测或测量来自对象的样品中的中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比，确定针对第一生物制剂的中和性形式的自体抗体是否与第二（即不同的）生物制剂具有交叉反应性；和

在某些实施方式中，确定应当施用不同的疗程包括转变为靶向不同机制的药物（例如生物制剂和/或非生物制剂）。

在一些实施方式中，方法还包括确定现有疗程随后的剂量增加或减少，或者如果中和性形式的自体抗体不与第二生物制剂具有交叉反应性应当向对象施用不同的疗程。在某些情况中，不同的疗程包括用第二生物制剂治疗。在某些其他情况中，不同的疗程包括用第一或第二生物制剂连同一种或多种其他治疗剂治疗。

在某些其他实施方式中，在抗TNFα药物疗法期间在以下周中的一个或多个（例如多个）测量中和性形式的自体抗体（例如NAb）的水平或百分比：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、80、90、100等。

在一些实施方式中，确定对象疗程的随后的剂量包括维持、增加或减少对象疗程的随后的剂量。在其他实施方式中，确定对象不同的疗程包括用不同的抗TNFα药物治疗。在其他实施方式中，确定对象的不同疗程包括用现有疗程连同另一治疗剂治疗，该治疗剂包括但不限于抗TNFα疗法、免疫抑制剂、皮质类固醇、靶向不同机制的药物、营养疗法和其他组合治疗。在其他实施方式中，确定对象的不同疗程包括改变现有疗程（例如转变为不同的抗TNF药物或转变为靶向不同机制的药物，例如IL-6受体抑制性单克隆抗体、抗整联蛋白分子（例如Tysabri、Vedaluzamab）、JAK-2抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂，或转变为营养疗法（例如特殊碳水化合物食物））。

在特别的实施方式中，中和性形式的自体抗体（例如NAb）的水平或百分比随时间的增加提示应当向对象建议治疗调整。在某些其他实施方式中，中和性形式的自体抗体（例如NAb）随时间从不存在向存在的改变提示应当向对象建议治疗调整。在此类实施方式中，对象可用现有疗程（例如服用已有抗TNFα药物）连同一种或多种免疫抑制剂例如甲氨蝶呤（MTX）或硫唑嘌呤（AZA）治疗。在某些备选实施方式中，对象可转变为不同的抗TNFα药物。在某些其他备选实施方式中，对象可转变为靶向不同机制的药物（例如非抗TNFα药物）。

(a)通过根据本文说明的测定法检测或测量来自对象的样品中的中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比，确定针对第一抗TNFα药物的中和性形式的自体抗体是否与第二（即不同的）抗TNFα药物具有交叉反应性；和

在某些实施方式中，确定应当施用不同的疗程包括转变为靶向不同机制的药物（例如非抗TNFα药物）。此类药物的非限制性实例包括IL-6受体抑制性单克隆抗体、抗整联蛋白分子（例如Tysabri、Vedaluzamab）、JAK-2抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂、营养疗法（例如特殊碳水化合物食物）及其混合物。

在一些实施方式中，方法还包括确定现有疗程随后的剂量增加或减少，或者应当向对象施用不同的疗程，如果中和性形式的自体抗体不与第二抗TNFα药物具有交叉反应性。在某些情况下，不同的疗程包括用第二抗TNFα药物治疗。在某些其他情况下，不同的疗程包括用第一或第二抗TNFα药物连同一种或多种免疫抑制剂例如MTX或AZA治疗。

用于检测抗TNFα药物和抗药物抗体的方法在PCT公开号WO2011/056590中进一步说明，其公开内容出于全部目的在此以其整体并入本文作为参考。

在某些情况下，本发明还可包括向对象施用治疗有效量的用于治疗一种或多种与TNFα介导的疾病或病症相关的症状（例如IBD例如CD或UC）的疗程，例如抗TNFα药物或靶向不同机制（例如非抗TNFα药物）的药物。为治疗应用，疗程可单独施用或与一种或多种如本文说明的额外的活性剂共同施用。因此，本发明通过指导治疗决定和启示疗法选择和优化抗TNFα药物，使得在正确的时间给予正确的对象正确的药物，有利地使得临床医生实施“个性化医药”。

IV.酸解

在某些方面，本发明的测定方法还包括酸解步骤，例如使得免疫复合物平衡，以测量针对生物制剂例如抗TNFα药物产生的中和性自体抗体（NAb）、非中和性自体抗体（非NAb）和/或其同种型的存在或水平。因此，也可测量针对向有需要的对象施用的生物制剂（例如抗TNFα药物）的NAb和/或非NAb的存在或水平而不受也存在于对象的样品中的施用的生物制剂的实质干扰。特别地，对象的样品可与一定量的酸孵育，所述量足以提供在生物制剂（例如抗TNFα药物）存在下NAb和/或非NAb的存在或水平的测量而不会受高生物制剂药物水平的实质干扰。

在某些实施方式中，本发明的测定方法的步骤（a）可包括：

(a’)将样品与酸接触，以解离预先形成的自体抗体（例如包括其中和性和/或非中和性形式）和生物制剂（例如抗TNFα药物）的复合物；

(b’)在预先形成的复合物解离后，将样品与经标记的生物制剂（例如抗TNFα药物）和经标记的生物制剂结合部分（例如TNFα）接触；和

(c’)中和样品中的酸，以形成：

(i)经标记的生物制剂（例如抗TNFα药物）和自体抗体的第一经标记的复合物；和/或

(ii)经标记的生物制剂（例如抗TNFα药物）、经标记的生物制剂结合部分（例如TNFα）和自体抗体的第二经标记的复合物。

在一些备选实施方式中，步骤（a’）和（b’）同时进行，例如样品与酸、经标记的生物制剂（例如抗TNFα药物），和经标记的生物制剂结合部分（例如TNFα）同时接触。在其他备选实施方式中，步骤（b’）在步骤（a’）之前进行，例如样品首先与经标记的生物制剂（例如抗TNFα药物）和经标记的生物制剂结合部分（例如TNFα）接触，然后与酸接触。在其他实施方式中，步骤（b’）和（c’）同时进行，例如样品同时与经标记的生物制剂（例如抗TNFα药物）和经标记的生物制剂结合部分（例如TNFα）接触并被中和（例如通过将样品与一种或多种中和剂接触）。

在特别的实施方式中，样品与一定量的酸接触，所述量足以解离预先形成的自体抗体和生物制剂（例如抗TNFα药物）的复合物，使得经标记的生物制剂结合部分（例如TNFα）、经标记的生物制剂（例如抗TNFα药物）、未标记的生物制剂（例如抗TNFα药物）和针对生物制剂（例如抗TNFα药物）的自体抗体可平衡并在其间形成复合物。在某些实施方式中，样品可与一定量的酸接触，所述量足以允许在高水平的生物制剂（例如抗TNFα药物）的存在下检测和/或测量自体抗体。

在一些实施方式中，短语“高水平的生物制剂”例如高水平的抗TNFα药物包括从约10至约100μg/mL、约20至约80μg/mL、约30至约70μg/mL或约40至约80μg/mL的药物水平。在其他实施方式中，短语“高水平的生物制剂”例如高水平的抗TNFα药物包括大于或等于约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100μg/mL的药物水平。

在一些实施方式中，酸包含有机酸。在其他实施方式中，酸包含无机酸。在其他实施方式中，酸包含有机酸和无机酸的混合物。有机酸的非限制性实例包括柠檬酸、异柠檬酸、谷氨酸、乙酸、乳酸、甲酸、草酸、尿酸、三氟乙酸、苯磺酸、氨基甲磺酸、樟脑-10-磺酸、氯乙酸、溴乙酸、碘乙酸、丙酸、丁酸、甘油酸、琥珀酸、苹果酸、天冬氨酸及其组合。无机酸的非限制性实例包括氢氯酸、硝酸、磷酸、硫酸、硼酸、氢氟酸、氢溴酸及其组合。

在某些实施方式中，酸的量对应于从约0.01M至约10M、约0.1M至约5M、约0.1M至约2M、约0.2M至约1M，或约0.25M至约0.75M的酸或酸的混合物的浓度。在其他实施方式中，酸的量对应于大于或等于约0.01M、0.05M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、2M、3M、4M、5M、6M、7M、8M、9M或10M的酸或酸的混合物的浓度。酸的pH可以是例如约0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或6.5。

在一些实施方式中，样品与酸接触一定量的时间，所述量足以解离预先形成的自体抗体和生物制剂（例如抗TNFα药物）的复合物。在某些情况下，样品与酸接触（例如孵育）从约0.1小时至约24小时、约0.2小时至约16小时、约0.5小时至约10小时，约0.5小时至约5小时或约0.5小时至约2小时的时间段。在其他情况下，样品与酸接触（例如孵育）大于或等于约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10小时的时间段。样品可与酸在4℃、室温（RT）或37℃接触。

在某些实施方式中，中和酸的步骤包括升高样品的pH以允许形成本文说明的第一和/或第二经标记的复合物。在一些实施方式中，酸是通过加入一种或多种中和剂例如强碱、弱碱、缓冲溶液及其组合进行中和的。本领域技术人员将理解，中和反应不一定暗示结果的pH为7。在一些情况下，酸中和获得碱性样品。在其他情况下，酸中和获得酸性样品（但比加入中和剂之前的样品的pH高）。在特别的实施方式中，中和剂包含缓冲剂，例如pH约为7.3的磷酸盐缓冲的盐水（例如10x PBS）。

在一些实施方式中，步骤（b’）还包括将内参与样品以及经标记的生物制剂（例如抗TNFα药物）和经标记的生物制剂结合部分（例如TNFα）共同接触（例如在预先形成的复合物解离之前、期间或之后）。在某些情况下，内参包含经标记的内参例如Biocytin-Alexa488。在某些其他情况下，经标记的内参的量在从约1ng至约25ng、约5ng至约25ng、约5ng至约20ng、约1ng至约20ng、约1ng至约10ng、或约1ng至约5ng每100μL分析的样品的范围内。在其他情况下，经标记的内参的量大于或等于约1ng、5ng、10ng、15ng、20ng或25ng每100μL分析的样品。

作为本发明的方法的非限制性实例，样品例如血清样品（例如来自接受抗TNFα药物例如Remicade(IFX)的疗法的对象的血清样品）可与pH3.0的0.5M柠檬酸在室温孵育1小时。在（未标记的）抗TNFα药物和针对抗TNFα药物的自体抗体（例如抗药物自体抗体例如抗IFX抗体（ATI））之间预先形成的复合物解离后，可加入经标记的抗TNFα药物（例如IFX-Alexa488）、经标记的TNFα（例如TNFα-Alexa532）以及任选地内参，并用中和剂例如10x PBS，pH7.3将反应混合物（例如立即）中和。在中和后，反应混合物可在室温再孵育1小时（例如在摇床上），以允许平衡并完成经标记的TNFα、经标记的抗TNFα药物、未标记的抗TNFα药物和/或针对抗TNFα药物的自体抗体之间免疫复合物的重新形成。然后可过滤并如本文说明，用SEC-HPLC分析样品。

在特别的实施方式中，本发明的方法（例如包括酸解之后均质溶液相结合动力学）显著增加IFX药物耐受，使得可在高达60μg/mL的IFX存在下测量NAb和/或非NAb ATI。换言之，本发明的方法可在高水平的抗TNFα药物（例如IFX）存在下检测针对抗TNFα药物的NAb和/或非NAb例如ATI以及针对其他抗TNFα药物的自体抗体的存在或水平，而不受其实质性干扰。

使用酸解检测抗药物抗体的方法在2012年2月16日提交的PCT申请号PCT/US2012/025437中进一步说明，其公开内容出于全部目的以其整体在此并入本文作为参考。

V.生物制剂疗法

本发明的测定法适于检测和/或测量来自对象（例如接受生物制剂疗法的对象）的样品中针对任何生物制剂的中和性和/或非中和性自体抗体的存在或不存在（例如是阳性或阴性）、水平或百分比。生物制剂的非限制性实例包括抗体、抗体片段、蛋白、多肽、肽、融合蛋白（例如Ig融合蛋白或Fc融合蛋白）、多价结合蛋白（例如DVD Ig）、抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其改造形式及其组合。

基于抗体的生物制剂的实例包括但不限于治疗性单克隆抗体及其抗原结合片段。在特别的实施方式中，抗体包括抗TNFα药物，例如REMICADE^TM(英夫利昔单抗)、HUMIRA^TM(阿达木单抗)、

(赛妥珠单抗)、

(戈利木单抗;CNTO148)或其组合。基于抗体的生物制剂的额外的实例包括抗体-药物缀合物例如Adcetris^TM(brentuximabvedotin)。表1提供了已被批准或目前正在开发的治疗性单克隆抗体的示例性列表。在名为“18Biotechnology Medicines in Testing Promise to Bolsterthe Arsenal Against Disease”的2006PhRMA报告中提供了正在临床开发的单克隆抗体治疗剂和已批准的产品的广泛列表，其公开内容出于全部目的以其整体在此并入本文作为参考。

基于蛋白质或基于多肽的生物制剂的非限制性实例包括细胞因子（例如白介素）、趋化因子、生长因子、造血刺激蛋白（例如促红细胞生成素）、激素（例如

（促卵泡激素）、生长激素）、酶（例如（阿法链道酶））、凝集因子、胰岛素、白蛋白、其片段、其保守修饰变体、其类似物及其组合。

细胞因子的实例包括但不限于TNFα、TNF相关的弱凋亡诱导物（TWEAK）、骨保护素（OPG）、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白介素（例如IL-1α、IL-1β、IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、可溶性IL-6受体(sIL-6R)、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-23和IL-27）、脂肪细胞因子（例如瘦素、脂联素、抵抗素、活性或总纤溶酶原激活因子抑制剂1（PAI-1）、内脏脂肪素和视黄醇结合蛋白4（RBP4））及其组合。在特别的实施方式中，白介素包含IL-2例

(阿地白介素;重组IL-2)。

趋化因子的实例包括但不限于CXCL1/GRO1/GROα、CXCL2/GRO2、CXCL3/GRO3、CXCL4/PF-4、CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL9/MIG、CXCL10/IP-10、CXCL11/I-TAC、CXCL12/SDF-1、CXCL13/BCA-1、CXCL14/BRAK、CXCL15、CXCL16、CXCL17/DMC、CCL1、CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1α、CCL4/MIP-1β、CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CCL9/CCL10、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14/HCC-1、CCL15/MIP-5、CCL16/LEC、CCL17/TARC、CCL18/MIP-4、CCL19/MIP-3β、CCL20/MIP-3α、CCL21/SLC、CCL22/MDC、CCL23/MPIF1、CCL24/嗜酸性粒细胞趋化因子-2、CCL25/TECK、CCL26/嗜酸性粒细胞趋化因子-3、CCL27/CTACK、CCL28/MEC、CL1、CL2和CX3CL1及其组合。

生长因子的非限制性实例包括表皮生长因子（EGF）、肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、色素上皮衍生因子（PEDF；又称为SERPINF1）、双调蛋白（AREG；又称为神经鞘瘤衍生生长因子（SDGF））、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、肝细胞生长因子（HGF）、转化生长因子-α（TGF-α）、转化生长因子–β（TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3等）、内皮素-1（ET-1）、角质细胞生长因子（KGF；又称为FGF7）、骨形成蛋白（例如BMP1-BMP15）、血小板衍生生长因子（PDGF）、神经生长因子（NGF）、β-神经生长因子（β-NGF）、神经营养因子（例如脑衍生神经营养因子（BDNF）、神经营养因子3（NT3）、神经营养因子4（NT4）等）、生长分化因子-9（GDF-9）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、肌肉生长抑制素（GDF-8）、红细胞生成素（EPO）、促血小板生成素（TPO）及其组合。

基于受体构建物或基于融合蛋白的生物制剂的实例包括但不限于与免疫球蛋白框架连接的天然存在的受体（例如(阿巴西普；免疫球蛋白CTLA-4融合蛋白)、

(阿来西普；IgG1融合蛋白)、ENBREL^TM(依那西普；重组人TNF受体融合蛋白)）、组合两个不同多肽种类的改造的蛋白（例如,

(地尼白介素-毒素连接物；包含白介素-2和白喉毒素的改造的蛋白）及其组合。

因此，本发明可用于检测和测量来自对象的样品中针对生物制剂例如抗TNFα药物治疗剂的中和性和非中和性自体抗体的存在或水平的方法，所述对象接受对于本文和表1提到的一种或多种疾病或病症，包括以下一种或多种的疾病或病症的生物疗法：

炎性疾病，例如炎性肠病（IBD）（例如克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC））、葡萄膜炎、肉状瘤病、韦格纳氏肉芽肿病，和其他以炎症作为中心特征的疾病；

自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎（RA）、多发性硬化（MS）、全身性红斑狼疮（SLE）、强制性脊柱炎（别赫捷列夫氏病）、狼疮、牛皮癣关节炎、青少年特发性关节炎、牛皮癣和红斑；

癌症，例如消化和胃肠癌症（例如结直肠癌、小肠癌症；胃肠间质瘤、胃肠类癌瘤、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胆管癌、胃癌；食道癌、阑尾癌症等）；膀胱癌；肝癌；胰腺癌、乳腺癌、肺癌（例如非小细胞肺癌）；前列腺癌；卵巢癌、肾癌（例如肾细胞癌）；中枢神经系统癌症；皮肤癌；绒毛膜癌；头颈癌；血液恶性肿瘤（例如白血病、淋巴瘤例如B细胞非霍奇金淋巴瘤）；骨源性肉瘤（例如Ewing肉瘤)；软组织肉瘤（例如隆凸性皮肤纤维肉瘤（DFSP）、横纹肌肉瘤）；其他软组织恶性肿瘤，和乳头状甲状腺癌症；

传染性疾病，例如难辨梭菌疾病、呼吸道合胞体病毒（RSV）、HIV、炭疽、念珠菌症、葡萄球菌感染和丙肝；

血液病症，例如败血症、败血性休克、阵发性夜间血红蛋白尿症和溶血性尿毒症综合征；

心血管疾病，例如动脉硬化症、急性心肌梗塞、心肺分流和心绞痛；

代谢病症，例如糖尿病，例如I型糖尿病；

遗传病症，例如阵发性夜间血红蛋白尿症（PNH）；

神经病症，例如骨关节炎痛和阿兹海默病；

呼吸病症，例如哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD）、鼻息肉和小儿哮喘；

皮肤疾病，例如牛皮癣，包括慢性中度至重度斑块状牛皮癣；

移植排斥，例如急性肾移植排斥、反向心肝移植排斥、预防肾移植排斥、预防急性肾移植排斥，和肾移植排斥；和/或

其他病症，例如肾炎症、绝经期后骨质疏松（骨病症）、嗜酸细胞增多综合征、嗜酸细胞性食管炎和花生过敏。

在特别的实施方式中，对象患有TNFα介导的疾病或病症，例如自体免疫疾病（例如类风湿性关节炎）或炎性疾病（例如炎性肠病（IBD）例如克罗恩病（CD）或溃疡性结肠炎（UC））。

VI.实施例

将通过具体实例更详细地说明本发明。以下实例以说明的目的提供，不意欲以任何方式限制本发明。本领域技术人员容易认识到，多种非关键参数可被改变或修改而获得本质上相同的结果。

来自2012年2月16日提交的PCT申请号PCT/US2012/025437的实施例出于全部目的以整体合并入本文作为参考。

实施例1监测IBD患者中中和性抗药物抗体形成的新测定法的开发

此实施例说明使用大小排阻色谱检测在经标记（例如荧光标记）的抗TNFα药物和经标记的TNFα存在下检测或测量患者样品（例如血清）中中和性和/或非中和性自体抗体（ADA）的存在或水平的新均质测定法。在特别的实施方式中，此测定法是有利的，因为它避免了对移除低亲和力ADA的洗脱步骤的需求，使用允许在可见和/或IR光谱检测的不同的标记（例如荧光团），这降低背景和血清干扰问题，由于荧光标记检测的高灵敏度增加检测患者中的低滴度中和性或非中和性ADA的能力，并且以液相反应进行，从而减少通过附着到固体表面例如ELISA板导致表位的任何改变的机会。

英夫利昔单抗(IFX)和阿达木单抗(ADL)是处方用于治疗炎性肠病（IBD）的抗TNF单克隆抗体。抗药物抗体（ADA）通常在疗程期间产生。此类ADA部分是中和性抗体（NAb）。在ADA将负面影响药物药代动力学的同时，NAb的存在通过阻断药物结合位点额外地导致药物效力损失。本实施例说明了基于均质迁移率变动测定法（HMSA）平台监测接受IFX治疗的IBD患者中NAb发展的测定法，并展示了抗英夫利昔单抗抗体(ATI)成熟和NAb形成之间的关系。

方法：如例如2012年2月16日提交的PCT申请号PCT/US2012/025437和PCT公开号WO2011/056590中说明，用HMSA测量IFX和ATI的血清浓度，其公开内容出于全部目的以整体并入本文作为参考。对于NAb测定发，首先将含有ATI的患者血清酸解，然后加入两种经标记的蛋白（例如IFX-Alexa488和TNFα-Alexa532），随后中和。将溶液稀释至2%血清，通过HPLC注射到大小排阻柱上，并用荧光监测复合物。计算对照和患者样品的每个谱（例如图或色谱）中游离TNFα-Alexa532峰的曲线下面积（AUC），并然后计算百分比NAb。完全阻断抗原结合的ATI被定义为100%NAb，50%表示样品中等量的部分是非NAb，0%表示所有ATI是非NAb。用来自75位健康志愿者的血清建立参考范围。对来自筛选IFX和ATI水平的132位残留IBD患者血清的ATI阳性血清样品（>3.13U/mL）进行NAb分析。阳性对照是用混合的ATI阳性患者血清创造的。

对于数据分析，使用峰检测算法找出每个实验的每个谱中所有的峰和谷。对每个谱用立方平滑曲线拟合，峰和谷定义为信号一阶导数的改变。峰是谱的斜率符号从正变为负。相反，谷定义为符号从负变为正。位于窗口内游离TNF-Alexa532峰的预期位置（例如11.5至13分钟）的最大峰作为游离峰本身。紧邻检测到的游离峰上下的谷限定为峰本身的上下限。结合、游离（TNF和IFX）和阴性对照峰下的面积是通过用梯形规则对如上限定的界限内的峰面积进行积分得到的。然后用以下公式计算每个样品的TNF-Alexa532峰面积的百分比：

%=[(a-b)/c]*100

其中a=未知样品中TNF-Alexa532峰的AUC，b=NAb阴性对照（例如正常人血清中IFX-Alexa488+TNF-Alexa532）中TNF-Alexa532峰的AUC，c=正常人血清中游离TNF-Alexa532峰的AUC。对于计算，“c”被设定为100%，“b”尽可能接近0%，尽管它可能根据反应条件变化。“b”和“c”之间的范围限定灵敏度的最大窗口。

结果：本发明的NAb测定法显示了高可重复性、准确度和精确度。测定内和测定间精确度是少于20%CV，测定的准确度是25%以内。用本发明的NAb测定法获得的精确度和准确度实质地优于基于细胞的测定法或ELISA。IFX药物耐受度是～6μg/mL，而TNFα在大于1.0ng/mL时干扰。来自混合的ATI阳性患者血清的阳性对照从40-5%NAb线性稀释。健康对照的分析表明返回≥3%（例如3.06%）的值的样品被认为是NAb阳性。对超过30个ATI阳性患者血清样品（3.12-199.43U/mL）筛选NAb，132个ATI阳性患者血清样品中26个是NAb阳性（平均22.47%，范围3.29-51.63%）。高于60U/mL的ATI水平对应高度中和性Ab。NAb阳性样品的进一步分析显示ATI滴度和NAb阳性之间的线性关系。特别地，图1说明了NAb百分比（y轴）和ATI水平之间存在明显的关系（斯皮尔曼等级相关，ρ=0.564，p<<0.0001）。图2说明了≥60U/ml的ATI浓度预示着NAb阳性（NAb+）。灵敏度=77.8%；特异性=98.1%；比值比=63.6，p<<0.0001，费希尔精确检验。图3说明了ATI截断分析，并证明ATI预测NAb，ROC AUC为0.931。真阳性率（TPR）=灵敏度；假阳性率（FPR）=1-特异性。

结论：除了药物和ADA水平，NAb的监测提供关于ADA应答的必要信息，并帮助指导早期治疗介入。此方法可用于表征针对任何生物制剂疗法的ADA。

实施例2监测中和性抗药物抗体随时间形成的患者案例研究。

此实施例说明使用大小排阻色谱检测在经标记（例如荧光标记）的抗TNFα药物和经标记的TNFα存在下检测或测量患者样品（例如血清）中中和性和/或非中和性自体抗体（ADA）的存在或水平的新均质测定法的额外的实施方式。此外，此实施例展示监测在患者接受疗法时中和性和/或非中和性抗药物抗体的形成和/或从非中和性到中和性抗药物抗体的转变的接受抗TNFα药物疗法的IBD患者的时间过程案例研究。

1.药物和抗药物抗体测定法

图4说明了用本文说明的液相迁移率变动测定法检测ATI（即抗IFX抗体；“HACA”）。例如，将444ng经Alexa-488标记的IFX（100%血清中18.8μg/ml）掺入样品中以超过游离IFX。在特别的实施方式中，可对含有IFX和ATI的复合物的患者血清样品进行酸解，其中在中和后进行用酸解平衡和标记添加。

图5说明了本发明的示例性ATI/IFX液相迁移率变动测定法。例如，将用荧光标记的英夫利昔单抗(IFX-488)平衡的含有多种浓度的ATI的样品（标准物或未知物）在2%血清中注射到大小排阻柱上。图5说明大IFX-488/ATI复合物首先洗脱，然后是较小的复合物，然后是未结合的IFX-488和Alexa-488装载对照。通过从标准曲线插值确定未知浓度。根据类似的方法检测IFX。

2.中和性和非中和性抗药物抗体测定法

图6和图7说明了本发明的使用大小排阻色谱检测此类自体抗体与经荧光标记的抗TNFα药物在经荧光标记的TNFα存在下的结合，确定抗药物抗体例如ATI是中和性或非中和性自体抗体的测定法。在一个示例性实施方式中，抗TNFα药物例如IFX用荧光团“F1”标记，其中荧光团可用可见或红外光谱或二者检测。类似地，TNFα用荧光团“F2”标记，其中荧光团也可用可见或红外光谱或二者检测，并且其中“F1”和“F2”是不同的荧光团。经标记的抗TNFα药物和经标记的TNFα与人血清在液相反应中孵育，以允许在经标记的抗TNFα药物（例如IFX）、经标记的TNFα，和/或血清中存在的抗药物抗体（例如ATI）之间形成复合物（即免疫复合物）。

在孵育后，将样品直接装载到大小排阻色谱上，进行HPLC迁移率变动测定法。图6说明了本发明的非中和性抗药物抗体（ADA）测定法，其中抗药物抗体（例如ATI）和经标记的TNFα（例如Alexa532标记的TNFα；“TNF-532”）与经标记的抗TNFα药物（例如Alexa488标记的IFX；“IFX-488”）的结合都导致游离TNF-532水平的降低。图7说明了本发明的中和性ADA测定法，其中抗药物抗体（例如ATI）与经标记的抗TNFα药物（例如IFX-488）的结合而不结合经标记的TNFα（例如TNF-532）导致与TNF-532对照实质上相同量的游离TNF-532水平。

3.用于监测中和性和非中和性抗药物抗体的时间过程研究

图8-图11说明了来自使用本发明的迁移率变动测定法确定抗药物抗体例如ATI是中和性或非中和性自体抗体的UC患者案例研究的数据。例如，图8说明了间隔1、2或3个月取得的5个样品中IFX和ATI水平随时间的变化。图9说明了确定游离TNFα的百分比随时间变化的峰分析。特别地，从全部样品的游离的经标记的TNFα面积减去TNF-532/IFX-488复合物的峰面积，然后计算游离TNFα的百分比。值得注意的是，图9证明了游离TNFα的水平随着间隔1、2或3个月取得的5个样品的时间过程的增加，提示中和性自体抗体水平的增加。图10说明了如在间隔2或3个月取得的并掺有IFX的3个样品中所示例的从非中和性自体抗体到中和性自体抗体的存在的转变。对于“第1年11月”的样品，非中和性抗体结合掺入的IFX，显示TNF-532峰的降低。对于“第2年1月”的样品，中和性抗体（NAb）/非中和性抗体（Ab）的混合物显示TNF-532峰相对于起始复合物水平的少量降低。随着ATI变成几乎完全中和性（“第2年4月”），高IFX水平不能克服ATI对IFX的结合，阻止任何TNFα结合。因此，图10展示了UC患者的ATI谱，其中随着IFX疗法的时间过程，ATI谱从非中和性ATI谱转变到含有中和性ATI和非中和性ATI混合物的谱，到中和性ATI谱。图11说明了确定掺有IFX的样品中游离随时间的TNFα百分比的峰分析。特别地，从全部样品的游离的经标记的TNFα面积减去TNF-532/IFX-488复合物的峰面积，然后计算游离TNFα的百分比。值得注意的是，图11展示了取自UC患者的样品中游离TNFα水平随时间过程的增加，提示在患者接受IFX疗法时中和性自体抗体水平的增加以及从非中和性ATI向中和性ATI的转变。

图12-图14说明了用本发明的迁移率变动测定法进行的多种对照。特别地，图12说明了使用兔抗人IgG1Fc作为非中和性抗体（Ab）对照。图13说明了使用ATI阳性血清作为混合的中和性抗体（NAb）/非中和性抗体（Ab）对照。图14说明了从ATI阳性血清纯化ATI导致较弱亲和性NAb的损失。图15说明了对UC患者案例研究的峰分析，以确定在多种对照中游离TNFα的百分比。特别地，从全部样品的游离的经标记的TNFα面积减去TNF-532/IFX-488复合物的峰面积，然后计算游离TNFα的百分比。

图16-图18说明了来自CD患者案例研究的数据，用于用本发明的迁移率变动测定法确定抗药物抗体例如ATI是中和性或非中和性自体抗体。例如，图16说明了对来自CD患者案例研究的峰分析，以确定在30周的期间间隔7或8周取得的4个样品中随时间的游离TNFα的百分比。此外，图17说明了来自另一CD患者案例研究的峰分析，以确定在50周的期间取得的3个样品中随时间的游离TNFα的百分比。此外，图18说明了来自4个额外的CD患者案例研究中的峰分析，确定在诱导或维持疗法期间或之后的特定周时的样品中的游离TNFα百分比。

实施例3：通过HPLC迁移率变动竞争性配体结合测定法检测中和性抗体（NAb）活性

此实施例说明用大小排阻色谱测定法检测或测量患者样品（例如血清）中的中和性和/或非中和性自体抗体（ADA）的存在或水平的新均质测定法的额外的实施方式。此外，此实施例证明预测和/或确定NAb与备选生物制剂药物例如其他抗TNF药物的交叉反应性的方法。

在一些实施方式中，免疫原性测试的多层级方法包括首先用快速、灵敏的筛选测定法筛选药物和抗药物抗体。FDA和EMEA都推荐此方法，它是大量临床试验和每个患者多时间点的有用的管理工具。在确认ADA例如ATI的存在后，然后进一步检测患者样品中可具有显著负面临床后果的中和性抗体的存在。中和性抗体通过结合至活性位点或其附近，或通过诱导构象改变干扰生物活性，导致效力损失。也可筛选含有ATI的样品的同种型和表型特异性。比较ADA发展前后患者对产品的临床反应可提供关于ADA发展（以及抗体特征）和临床反应之间的关系的信息。

开发了如本文所述的利用HPLC迁移率变动测定法的NAb测定法。在某些实施方式中，多层级方法或测试包含或由以下任意1、2或全部3级组成：(1)筛选以定性地确定样品是否是NAb阳性（是/否基于从正常人血清分析建立的截点）；(2)使用例如免疫竞争和/或免疫耗尽确认样品是NAb阳性；和(3)预测和/或确定NAb与备选生物药物的交叉反应性。

I.筛选层级

在患者样品被确认是ADA阳性后，可对其作NAb筛选。在某些方面，ADA的亚群是NAb。在某些实施方式中，含ADA（例如IFX的抗体，又称为“ATI”或“HACA”）的患者血清首先用0.5M柠檬酸在HPLC水中室温（RT）下酸解1hr。样品在96孔板中制备，孵育在平板震荡仪上黑暗中进行。然后，加入两种经标记的蛋白质（例如含0.1%BSA的HPLC水中的药物-Alexa488（例如IFX-Alexa488）和TNFα-Alexa532）。然后通过加入10X PBS，pH7.3，并在平板震荡仪上RT在黑暗中孵育1小时，中和样品。用额外的10X缓冲液和HPLC水将样品稀释至2%血清。然后将样品通过HPLC注射到大小排阻柱上。不同大小的复合物或种类被分开并用荧光监测，例如游离TNFα-Alexa532(“TNF532”)、游离IFX-Alexa488(“IFX488”)、TNF532/IFX488复合物、TNF532/IFX488/ATI复合物（非中和性Ab）和ATI/IFX488复合物（NAb）。在将结果与阴性（参见例如图12、图19）和阳性（参见例如图13）对照以及从正常人血清建立的截断值（例如3.06%NAb的参考范围）比较后，样品可被确定是NAb阳性或阴性，并可确定滴度。

图19说明了通过迁移率变动测定法检测非中和性抗体活性。TNF532与IFX488结合后，存在约8分的保留时间变动，说明形成较高分子量的复合物。游离IFX-488峰（约10.5分钟附近）完全消失，游离TNF-532峰（12分钟附近）也几乎完全消失（说明形成ATI/IFX/TNF三重复合物）。远离IFX活性位点结合的非中和性Ab具有相似的图式。小鼠单克隆抗体（例如7分钟附近）表现与希望的相同。

图13说明了通过迁移率变动测定法检测中和性抗体活性。完全中和性Ab阻止IFX结合TNF的能力（例如由于活性位点的阻断）。这在色谱图中表现为随着较高分子量种类的形成，IFX-488峰的消失。TNF-532峰不会改变。实际上，如图13中的混合的患者血清（ATI Pos.血清，粗实线）所示，绝大部分患者经历非中和性/中和性Ab的组合。针对IFX/Humira的F(ab’)2片段的兔多克隆抗体作为改进的NAb阳性对照也是有用的。

图8说明了在IFX治疗过程期间，患者中NAb应答随时间的发展。虽然它们在所有时间点都是ATI阳性，直到第2年1月（浅灰色箭头，～12min处上起第3个）的时间点，NAb才发展。ATI/IFX-488复合物变动为略微不同的保留时间（～7.8分钟）提示与TNF532/IFX488/ATI的复合物（～8.2和8.8分钟）相比不同大小的复合物。也可在额外的IFX存在下，进行相对无关蛋白（免疫竞争）的中和活性的确认。诸如此类患者是治疗调整的理想候选者。

图9将数据绘制成剩余游离TNF峰%的AUC的条形图，清楚地表明患者随着时间发展NAb。即使在早期时间点观察到的低水平的Nab发展可预测疾病复发；推荐对显示此类活性的患者进行治疗调整。例如，在接受已有抗TNF药物和/或换用不同的抗TNF药物的同时，应向患者施用一种或多种免疫抑制剂例如甲氨蝶呤（MTX）或硫唑嘌呤（AZA）。

II.确认层级

在确认层级中，将药物（例如抗TNFα抗体）以多种浓度（例如1-50μg/mL）掺入到样品中以确定样品的中和能力。平行地，将非特异性IgG以相似水平掺入。掺有药物的样品应显示对药物的剂量应答，并可计算NAb的EC50。非特异性IgG应当没有效果。如果必要，也可进行免疫耗尽以排除基质的影响。

图10说明了如在间隔2或3个月取得的并掺有IFX的3个样品中示例的随时间从非中和性自体抗体到中和性自体抗体的存在的转变。来自每个时间点的患者血清对掺入的IFX应答，显示应答的特异性。NAb随着时间变得更具中和性，并最终可中和>20μg/mL的IFX（第2年4月的样品当掺入IFX时不减小）。可进行完全滴定以确定每个时间点的NAb的EC50。

III.交叉反应性层级

交叉反应性层级特别用于预测患者是否应答药物或疗法例如抗TNFα药物或疗法。

在一些实施方式中，本发明提供基于抗药物抗体（ADA）与多种不同的抗TNF治疗剂交叉反应的能力，快速确定治疗药物是否将在患者（例如克罗恩病、溃疡性结肠炎，或类风湿性关节炎患者）中起效的方法。作为非限制性实例，可在具有针对Remicade(英夫利昔单抗)的NAb患者（例如克罗恩病、溃疡性结肠炎和/或类风湿性关节炎患者）中测试以下药物中一种或多种：Enbrel(依那西普)、Humira(阿达木单抗)、Cimzia(赛妥珠单抗)；和Simponi(戈利木单抗)。在用特异性药物（例如IFX）测试NAb阳性后，可使用上述的初始NAb测试方法，用多种其他药物（例如荧光标记的药物）进行NAb测定法。

通过防止使用会被患者的抗体中和的药物（例如抗TNFα药物），本发明的预测性测试可用于管理患者治疗。不意欲受限于任何具体理论，中和性ADA的结合位点的序列可能以类似TNFα的结合位点的方式产生（见图20）。如果NAb中和任何其他抗NTF药物，则这些其他抗TNF药物可能是已经施用的药物的不理想的替代，因为患者可能具有免疫应答。在一些实施方式中，从正常人血清建立的截断值可用于确定来自患者的测试样品是阳性或阴性。测试可以快速、经济的方式在体外设施中进行。

以下的非限制性案例研究包括患者1和患者2，他们接受Remicade(英夫利昔单抗)治疗，但随后失去对Remicade的应答。患者1患有UC，患者2患有CD。本文说明的迁移率变动测定法清楚地证明患者1和患者2丧失对Remicade的应答，因为他们发展出了抗Remicade抗体（例如ATI）。此类抗Remicade抗体随后被证明是中和性抗体（例如NAb）。

图21说明了患者1和患者2发展出中和性抗体（NAb）。此类NAb与TNFα竞争Remicade结合位点。重要的是，此类NAb可与其他抗TNF治疗剂交叉反应。如果NAb与其他抗TNF治疗剂交叉反应，改变为另一抗TNF治疗剂不会帮助这些患者。因此，本发明的预测性测定法提供优于丧失对Remicade应答的患者的现有管理方法的优势，在现有方法中阳性HACA（可检测抗体）是通过改变为另一抗TNF活性剂管理的（参见例如Afif等人,Am.J.Gastroenterol.,105(5):1133-9(2010)）。

为确定应答一种抗TNF药物产生的NAb与其他抗TNF药物的交叉反应性，针对Humira(阿达木单抗)对患者接受Remicade(IFX)时产生的NAb进行了测试。图21所示的数据清楚地证明针对IFX产生的NAb与Humira交叉反应。图21说明当加入含有NAb的患者血清时，游离Humira峰（10分钟和11分钟之间，每个患者研究的底部图）被完全变动至较高分子量（～12分钟，患者研究#1；～12分钟，患者研究#2；每个患者研究的底部图）。这些结果提示Nab以这样的方式与Humira结合，所述方式在某种程度上使得NAb阻止TNFα进入Humira的抗原结合位点。图22对NAb和非NAb的确定进行了示意图说明。

在某些实施方式中，本发明的测定方法预测这些患者不会应答Humira或任何其他抗TNF治疗剂。患者应当不用抗TNF疗法治疗，并应改换至备选疗法选择，包括但不限于Actemra、Kineret、Orencia、Rituxan和/或Arzerra用于类风湿性关节炎（RA），或Tysabri和/或类固醇用于克罗恩病（CD）。

因此，本发明的方法特别有利于通过确定或测量来自患者的样品中的中和性抗体（NAb）和/或非NAb的存在和/或浓度水平，预测患者是否会应答抗TNFα疗法。在一个实施方式中，如果样品含有针对一种抗TNFα药物的NAb，这些Nab将可能与其他抗TNFα药物交叉反应将其中和，因而患者的推荐的治疗调整应当改为具有不同作用机制的药物（例如非抗TNF活性剂）。在另一实施方式中，如果样品含有针对一种抗TNFα药物的非中和性ADA，患者的推荐的治疗调整可为改为另一抗TNFα药物。

实施例4：检测中和性抗药物抗体（NAb）的存在和交叉反应性的测定法

此实施例说明与本发明的测定方法相关，用于筛选以确定样品是否为NAb阳性，并预测和/或确定NAb与替代生物药物的交叉反应性（参见例如实施例3）的额外的实施方式。在特别的实施方式中，本文说明的测定方法可用于通过确定从对象获得的样品是NAb阳性或阴性，预测接受第一抗TNFα药物的对象是否将应答备选抗TNFα疗法。如果样品是NAb阳性，方法包括确定NAb是否将与第二抗TNFα药物交叉反应，并且当NAb与第二抗TNFα药物交叉反应时推荐对象改换至非抗TNFα药物。如果样品是NAb阴性，方法包括推荐对象改换至第二抗TNFα药物。

图23说明了本发明的示例性NAb标准曲线的产生和使用。将用经荧光标记的TNF-532/IFX-488平衡的含有多种浓度的兔（Rb）抗IFX抗体（ATI）血清的样品（即标准或未知）在2%血清中注射到大小排阻柱上。大免疫复合物首先洗脱，然后是较小的复合物并且然后是未结合的IFX-488和TNF-532。通过对标准曲线插值可确定未知浓度。可组合含有NAb和非Nab的不同的混合物的兔血清作为对照。本文说明的NAb测定与旧的11.63%截断值相比，具有2.72%的改善的截断值（N=50个正常样品）。表2提供按患者的NAb临床研究的总结。

表2.NAb临床总结-按患者

本发明的交叉反应性测定方法特别用于预测改换至另一生物治疗是否有益。在发现患者对一种药物是NAb阳性后，经荧光标记的备选药物可用于测定。如果患者血清仍显示中和能力，新药将不太可能成功。此类方法是有利的，因为它可用于以经济快捷的方式筛选一组药物，以允许对最优治疗选择的建议或指示。

图24和图25提供对实施例3中说明，图21所示的患者研究的额外的案例研究。特别地，接受Remicade(英夫利昔单抗,IFX)治疗，但随后丧失对IFX的应答的患者3和患者4被鉴定为可能不应答Humira(阿达木单抗,ADL)的患者，因为患者接受IFX治疗时发展出的NAb被确定与ADL具有交叉反应性。

图26说明了证明ATI亲和性成熟和交叉反应性ATI发展的患者研究的非限制性实例。

尽管上述发明为清楚理解的目的通过说明和实施例说明，本领域技术人员将认识到，可在权利要求书的范围内实施某些改变和修改。此外，本文提供的每个引文以引文整体合并入本文，与各个引文单独以引文合并入本文具有相同范围。

Claims

1.测量样品中的针对抗TNFα药物的中和性形式的自体抗体的水平或百分比的方法，所述方法包括：

(i)经标记的抗TNFα药物和自体抗体的第一经标记的复合物；和/或

(ii)经标记的抗TNFα药物、经标记的TNFα，和自体抗体的第二经标记的复合物；

(b)对第一经标记的复合物和/或第二经标记的复合物进行大小排阻色谱以将它们与游离的经标记的TNFα、游离的经标记的抗TNFα药物，和/或经标记的抗TNFα药物和经标记的TNFα的复合物分离；

(c)在大小排阻色谱后测量游离的经标记的TNFα的水平；和

(d)比较在步骤（c）中测量的游离的经标记的TNFα的水平与对照样品中游离的经标记的TNFα的经标准化的水平或百分比，其中对照样品中游离的经标记的TNFα的经标准化的水平或百分比对应于中和性形式的自体抗体的水平或百分比。

2.权利要求1的方法，其中抗TNFα药物选自由REMICADE^TM(英夫利昔单抗)、ENBREL^TM(依那西普)、HUMIRA^TM(阿达木单抗)、

(赛妥珠单抗)、

(戈利木单抗；CNTO148)及其组合组成的组。

3.权利要求1或2的方法，其中针对抗TNFα药物的自体抗体选自由人抗嵌合抗体（HACA）、人抗人源化抗体（HAHA）、人抗小鼠抗体（HAMA）及其组合组成的组。

4.权利要求1至3中任一项的方法，其中步骤(c)包括在大小排阻色谱后测量游离的经标记的TNFα的峰面积。

5.权利要求1至4中任一项的方法，其中对照样品是只含有游离的经标记的TNFα的参考样品。

6.权利要求1至5中任一项的方法，其中对照样品中的游离的经标记的TNFα水平或百分比是通过从游离的经标记的TNFα的测量的峰面积减去经标记的抗TNFα药物和经标记的TNFα之间形成的第三经标记的复合物的测量的峰面积而标准化的。

7.权利要求1至6中任一项的方法，其中对照样品中游离的经标记的TNFα的经标准化的水平或百分比与步骤（c）中测量的游离的经标记的TNFα的水平的差异对应于非中和性形式的自体抗体的水平或百分比。

8.权利要求1至6中任一项的方法，其中当样品具有大于或等于约3.00%的中和性形式的自体抗体时，样品是中和性形式的自体抗体阳性的。

9.权利要求1至8中任一项的方法，其中样品是血清。

10.权利要求1至9中任一项的方法，其中样品获取自接受使用抗TNFα药物疗法的对象。

11.权利要求1至10中任一项的方法，其中经标记的抗TNFα药物和经标记的TNFα包含不同的荧光团或荧光染料。

12.检测样品中针对抗TNFα药物的中和性和/或非中和性形式的自体抗体的存在的方法，所述方法包括：

(c)在大小排阻色谱后测量游离的经标记的TNFα的水平；和

(d)比较在步骤（c）中测量的游离的经标记的TNFα的水平与对照样品中游离的经标记的TNFα的水平，从而检测中和性和/或非中和性形式的自体抗体的存在。

13.权利要求12的方法，其中抗TNFα药物选自由REMICADE^TM(英夫利昔单抗)、ENBREL^TM(依那西普)、HUMIRA^TM(阿达木单抗)、(赛妥珠单抗)、

(戈利木单抗；CNTO148)及其组合组成的组。

14.权利要求12或13的方法，其中针对抗TNFα药物的自体抗体选自由人抗嵌合抗体（HACA）、人抗人源化抗体（HAHA）、人抗小鼠抗体（HAMA）及其组合组成的组。

15.权利要求12至14中任一项的方法，其中步骤(c)包括在大小排阻色谱后测量游离的经标记的TNFα的峰面积。

16.权利要求12至15中任一项的方法，其中对照样品是只含有游离的经标记的TNFα的参考样品。

17.权利要求12至16中任一项的方法，其中当在步骤（c）中测量的游离的经标记的TNFα的水平与对照样品中的游离的经标记的TNFα的水平相同或实质上相同时，检测到中和性形式的自体抗体。

18.权利要求12至16中任一项的方法，其中当在步骤（c）中测量的游离的经标记的TNFα的水平与对照样品中的游离的经标记的TNFα的水平相比降低或不存在时，检测到非中和性形式的自体抗体。

19.权利要求12至18中任一项的方法，其中样品是血清。

20.权利要求12至19中任一项的方法，其中样品获取自接受使用抗TNFα药物疗法的对象。

21.权利要求12至20中任一项的方法，其中经标记的抗TNFα药物和经标记的TNFα包含不同的荧光团或荧光染料。

22.确定针对第一抗TNFα药物的中和性形式的自体抗体是否与第二抗TNFα药物具有交叉反应性的方法，所述方法包括：

(a)根据权利要求1至21中任一项的方法检测或测量样品中的中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比，以确定样品是中和性形式的自体抗体阳性或阴性的；和

如果样品是中和性形式的自体抗体阳性的，则：

(b)将样品与经标记的第二抗TNFα药物接触，以形成经标记的第二抗TNFα药物和中和性形式的自体抗体的经标记的复合物；

(c)对经标记的复合物进行大小排阻色谱以分离经标记的复合物；和

23.权利要求22的方法，其中第一和第二抗TNFα药物独立地选自由REMICADE^TM(英夫利昔单抗)、ENBREL^TM(依那西普)、HUMIRA^TM(阿达木单抗)、

(赛妥珠单抗)、(戈利木单抗；CNTO148)及其组合组成的组。

24.权利要求22或23的方法，其中针对第一抗TNFα药物的自体抗体选自由人抗嵌合抗体（HACA）、人抗人源化抗体（HAHA）、人抗小鼠抗体（HAMA）及其组合组成的组。

25.权利要求22至24中任一项的方法，其中经标记的复合物的存在是针对第一抗TNFα药物的中和性自体抗体与第二抗TNFα药物具有交叉反应性的提示。

26.权利要求22至24中任一项的方法，其中经标记的复合物不存在是针对第一抗TNFα药物的中和性自体抗体不与第二抗TNFα药物具有交叉反应性的提示。

27.权利要求22至26中任一项的方法，其中样品是血清。

28.权利要求22至27中任一项的方法，其中样品获取自接受使用抗TNFα药物疗法的对象。

29.权利要求22至28中任一项的方法，其中经标记的第二抗TNFα药物包含荧光团或荧光染料。

30.在接受使用抗TNFα药物的疗程的对象中对抗TNFα药物进行监测和/或优化疗法的方法，所述方法包括：

(a)根据权利要求1至21中任一项的方法在疗程中的多个时间点检测或测量针对抗TNFα药物的中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比；

31.权利要求30的方法，其中抗TNFα药物选自由REMICADE^TM(英夫利昔单抗)、ENBREL^TM(依那西普)、HUMIRA^TM(阿达木单抗)、

(赛妥珠单抗)、

(戈利木单抗；CNTO148)及其组合组成的组。

32.权利要求30或31的方法，其中针对抗TNFα药物的自体抗体选自由人抗嵌合抗体（HACA）、人抗人源化抗体（HAHA）、人抗小鼠抗体（HAMA）及其组合组成的组。

33.权利要求30至32中任一项的方法，其中基于中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比随时间的改变，增加、降低或维持疗程的随后的剂量。

34.权利要求30至32中任一项的方法，其中不同的疗程包含不同的抗TNFα药物，现有疗程连同免疫抑制剂，或改换至不是抗TNFα药物的疗程。

35.权利要求34的方法，其中当中和性形式的自体抗体的水平或百分比随时间增加时，施用不同的疗程。

36.在接受使用第一抗TNFα药物疗程的对象中优化疗法和/或降低毒性的方法，所述方法包括：

(a)通过根据权利要求1至21中任一项的方法检测或测量来自对象的样品中的中和性形式的自体抗体的存在、水平或百分比，确定针对第一抗TNFα药物的中和性形式的自体抗体是否与第二抗TNFα药物具有交叉反应性；和

37.权利要求36的方法，其中第一和第二抗TNFα药物独立地选自由REMICADE^TM(英夫利昔单抗)、ENBREL^TM(依那西普)、HUMIRA^TM(阿达木单抗)、

(赛妥珠单抗)、

(戈利木单抗；CNTO148)及其组合组成的组。

38.权利要求36或37的方法，其中针对第一抗TNFα药物的自体抗体选自由人抗嵌合抗体（HACA）、人抗人源化抗体（HAHA）、人抗小鼠抗体（HAMA）及其组合组成的组。

39.权利要求36至38中任一项的方法，其中不同的疗程包含改换至不是抗TNFα药物的疗程。

40.权利要求39的方法，其中非抗TNFα药物选自由IL-6受体抑制性单克隆抗体、抗整联蛋白分子、JAK-2抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、营养疗法及其混合组成的组。

41.权利要求36至40中任一项的方法，其中方法还包括确定现有疗程随后的剂量应当增加或减少，或者确定应当向对象施用不同的疗程，如果中和性形式的自体抗体不与第二抗TNFα药物具有交叉反应性。