JP2007147367A - サイトカイン産生能の測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】測定対象のサイトカインに対する抗体が投与された被験体から採取された血液において、該血液のサイトカインの産生能力を測定することを可能とする方法を得る。
【解決手段】測定対象のサイトカインに対する抗体を投与された被験体から採取された血液と、血液細胞から上記サイトカインの産生を誘導する材料とをインキュベーションし、上記サイトカインを産生させ、次に、測定対象のサイトカインと上記サイトカインに対する抗体とからなる免疫複合体を解離させる第１の前処理工程及び解離させた上記サイトカインを分離する第２の前処理工程とを実施し、しかる後、産生されたサイトカイン量を定量する、各工程を備える、サイトカインの産生能測定方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、血液のサイトカイン産生能を測定する方法に関し、より詳細には、測定対象とするサイトカインに対する抗体が投与された被験体から採取された血液のサイトカイン産生能力を測定する方法に関する。

サイトカインは、種々の細胞から分泌され、細胞の情報伝達に関わるタンパク質の総称で、免疫／生体防御、炎症／アレルギー、発生・分化（形態形成）、造血機構、内分泌系、神経系に直接的あるいは間接的に関与し、またその破綻によって、各種疾病にも深く関係している。

そのため、各種疾病の病態や治療の効果を評価するために、被験者のサイトカイン産生能力を測定することが行われている。特許文献１、特許文献２及び特許文献３には、特定の表面粗さを有する高分子材料や特定の化学構造を有する高分子材料と血液を接触させ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）の産生を誘導する方法が開示されている。また、特許文献４及び特許文献５では血液細胞からのサイトカイン産生能力を正確に測定するためのキットが開示されている。

最近、種々の疾病の病態と特定のサイトカインとの関係が明らかになり、これらのサイトカインをターゲットとする治療法が始まっている。例えば、関節リウマチやクローン病の治療において、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）をターゲットとしたインフリキシマブのような抗ＴＮＦ−α抗体製剤が世界中で広く用いられつつある。
特許第３３５４６６９号公報 特許第３３５４６７０号公報 特許第３５１９８３２号公報 特許第３３４２７９５号公報 特許第３２１１２５０号公報

本発明の目的は、上述した測定対象のサイトカインに対する抗体を投与された被験体から採取された血液のサイトカインの産生能力を測定することにある。

本発明は、測定対象のサイトカインに対する抗体を投与された被験体から採取された血液と、血液細胞から前記サイトカインの産生を誘導する材料とをインキュベーションし、前記サイトカインを産生させる工程と、産生された前記サイトカイン量を定量する工程とを有するサイトカイン産生能の測定方法において、前記サイトカインの定量工程に先立ち、測定対象の前記サイトカインと該サイトカインに対する抗体とからなる免疫複合体を解離させる第１の前処理工程と、第１の前処理工程後に、解離させたサイトカインを分離する第２の前処理工程とをさらに備えることを特徴とするサイトカイン産生能測定方法である。

また、本発明のある特定の局面では、測定対象のサイトカインが腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）である。

以下、本発明の詳細を説明する。

本願発明者らは、抗ＴＮＦ−α抗体製剤の一種であるインフリキシマブを投与された被験体から採取された血液のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）刺激によるＴＮＦ−α産生能を測定した際、ＴＮＦ−αの産生を検出することができないことを初めて見出した。

そこで、このような被験体から採取された血液におけるサイトカインの産生能力の測定方法を鋭意検討した結果、これは、採取された血液中のインフリキマシブがＬＰＳ刺激により産生されたＴＮＦ−αと結合し、ＥＬＩＳＡのような抗原抗体反応を利用した測定系において競合阻害を起こすことによることを見出した。

本発明は、本願発明者により初めて見出された上記問題点を解決するためになされたものであり、インフリキマシブなどの抗ＴＮＦ−α抗体製剤を投与された被験体から採取された血液においても、ＬＰＳ刺激によるＴＮＦ−α産生能の測定を可能とする方法であり、産生されたＴＮＦ−αの定量工程に先立ち、インフリキマシブなどの抗ＴＮＦ−αとＴＮＦ−αとの結合物から、ＴＮＦ−αを解離させる第１の前処理工程と、解離させたＴＮＦ−αを分離する第２の前処理工程とを含むことを特徴とする。

抗ＴＮＦ−α抗体と、ＴＮＦ−αとの結合物から、ＴＮＦ−αを解離する第１の前処理工程は、様々な方法で行うことができる。様々な方法としては、カオトロピックイオンによる処理、酸処理、高イオン強度による処理などが挙げられ、特にカオトロピックイオンによる処理は次の分離工程が容易に行えることから好適に用いられる。

また、解離されたＴＮＦ−αを分離する第２の前処理工程についても、様々な方法により行うことができる。このような方法としては、例えば、分子量の差異を利用する方法（限外ろ過、クロマトグラフィー）が挙げられ、特に短時間で作業工程が簡単な限外ろ過膜を用いた遠心分離法が好適である。

本発明で用いられるサイトカインの産生を誘導する材料とは、血液細胞、特に顆粒球、単球、マクロファージ、リンパ球等の白血球や血小板と反応し、これらの細胞の活性化を促し、種々の生理活性物質の産生、遊離もしくは誘導を引き起こす材料をいい、従来、前記細胞の活性化物質として知られる種々の材料が挙げられる。例えば、結核菌、コリネバクテリウム菌、溶連菌などの種々の微生物、ＯＫ４３２、合成リピドＡ、ピランコポリマー、精製ツベルクリン、レクチン（フィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ、ポークウィードマイトゲン等）、ザイモザン、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、スーパー抗原、ＰＳＫ（クレスチン）、レンチナン、カルシウムイオノフォア、ホルボルエステル、免疫グロブリン固定化担体、ホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン（ＦＭＬＰ）などのホルミルペプチド、及び測定対象のサイトカインの産生を誘導する別のサイトカインなどを用いることができる。特に、ＬＰＳはサイトカインの誘導活性が高く好適である。

本発明における血液細胞から産生されるサイトカインとは、上記材料との反応によって、血液細胞から誘導、産生される物質であり、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）ＩＬ−１〜１８等のインターロイキン、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ等のインターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ等のコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）、ＲＡＮＴＥＳ等が挙げられる。

上記、種々のサイトカインの産生を誘導する材料の必要量は、通常、用いる材料ごとにその量を変化させ、指標とする生理活性物質の誘導活性を測定して、その用量反応曲線から最適量を設定される。例えば、ＬＰＳを生理活性物質の産生を誘導する材料として用い、指標とするサイトカインとしてＴＮＦ−α用いる場合には、血液中のエンドトキシン濃度として、０．６〜１０００００ＥＵ／ｍｌとするのが好ましく、より好ましくは、２０〜１０００ＥＵ／ｍｌである。

本発明では、採血する際に血液が凝固しないように、血液抗凝固剤を添加することが望ましい。血液抗凝固剤としては、ヘパリン化合物、クエン酸化合物、シュウ酸化合物などが挙げられ、ヘパリンナトリウムなどが細胞の生物学的反応を阻害しないので好ましい。上記ヘパリンナトリウムの該容器中の収容量としては、該容器に血液が収容された時に、その血液中の濃度が低くなると血液凝固の恐れがあり、高くなると細胞に不測の活性化や不活性化を起こす恐れがあるので、４〜５０Ｕ／ｍｌ、より好ましくは８〜２０Ｕ／ｍｌになるように収容する。

血液と上記サイトカインの産生を誘導する材料との反応温度は、生理活性物質の産生が効率的に行われ、過度の溶血を引き起こさない温度である１５℃〜４２℃が好ましく、より、好ましくは、３０℃〜４０℃である。反応時間は、上記生理活性物質の産生が効率的に行われ、過度の溶血を引き起こさない反応時間である１〜４８時間が好ましく、より、好ましくは、２〜２４時間である。

上記、血液細胞から産生される生理活性物質の測定試薬としては、産生された上記生理活性物質の量を定量可能な試薬であれば、特に限定されないが、例えば、定量しようとする生理活性物質に対するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体及びペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素及び各々の酵素の発色基質などを利用した酵素免疫測定方法が挙げられる。

以下に、本発明の血液細胞から産生されたサイトカインなどの生理活性物質の血漿中濃度の定量方法の一様態を例として詳しく説明する。

先ず、血液と上記生理活性物質を誘導する材料とを上記測定容器の中で反応させ、生理活性物質を誘導し、誘導後の血液を遠心して、血球成分と血漿成分を分離させる。次いで、分離された血漿を、上記生理活性物質に対するモノクローナル抗体を固定化したマイクロプレートのウェルに、ピペッティングにより添加し、３７℃で約２時間反応させる。次いで、反応後の血漿液を吸引除去等の手段で廃棄し、さらに、未反応成分を除くため、Ｔｗｅｅｎ２０等のノニオン系の界面活性剤を含有する中性ｐＨの洗浄用緩衝液で上記ウェルを洗浄する。次いで、西洋わさびペルオキシダーゼを固定化した上記生理活性物質に対するポリクローナル抗体をピペッティングにより添加し、３７℃で１時間反応させる。次いで、未反応の西洋わさびペルオキシダーゼ固定化抗体を除くため、上記ウェルを上記洗浄用緩衝液で洗浄した後、過酸化水素、テトラメチルベンジジンを含む基質溶液を添加し、５〜１０分間反応させる。次いで、１Ｍ硫酸溶液を添加し、反応を停止させて、酵素反応による基質の発色を４５０ｎｍの吸光度から測定する。この測定値と既知濃度の上記生理活性物質を用いて作成した検量線から、上記生理活性物質の産生誘導量を測定する。

本発明に係るサイトカイン産生能測定方法では、測定対象のサイトカインに対する抗体を投与された被験体から採取された血液と、血液細胞から上記細胞の産生を誘導する材料とをインキュベーションし、サイトカインを産生させた後、第１，第２の前処理工程が行われ、測定対象のサイトカインが、測定対象のサイトカインとサイトカインに対する上記抗体とからの免疫複合体から解離され、かつ分離されている。従って、産生されたサイトカインを確実にかつ高精度に定量することが可能となる。

よって、本発明によれば、抗ＴＮＦ−αの抗体製剤のようなサイトカインに対する抗体が治療目的で投与されている被験体から採取された血液においても、正確に該血液のサイトカイン産生能を測定することができ、被験者の疾病の状態や治療効果を正確に評価することが可能となる。

以下、本発明の具体的な実施例及び比較例を挙げることにより本発明を明らかにする。なお、本発明は実施例に限定されるものではない。

（比較例１）
（１）インフリキシマブの調製
インフリキシマブ（田辺製薬：レミケード点滴静注用１００、Ｌｏｔ．０１Ｌ１０２Ａ）のバイアル（１００ｍｇ）に２５Ｇの注射針を用いて、日局注射用水（大塚製薬：Ｌｏｔ．１Ｃ９９）１０ｍｌを添加し、バイアルを回転させながら緩やかに溶解し、１０ｍｇ／ｍｌ液を調製した。ＬＰＳフリーの器具と日局生理食塩液（大塚製薬：Ｌｏｔ．３Ｆ８１）を用いて、１０ｍｇ／ｍｌインフリキシマブ液を生理食塩水で段階希釈して、インフリキシマブの希釈系列を調製した。

（２）採血との血液の分注
健常人の肘静脈からヘパリンナトリウムを含有するシリンジを用いて、通常の方法で血液を採取した。血液１ｍｌあたりのヘパリンナトリウム濃度は１０〜１５ＩＵとした。採取した血液をエンドトキシンフリーの器具を用いて、１．９ｍｌずつチューブに分注した。

（３）インフリキシマブの血液への添加とプレインキュベーション
血液を分注したチューブに（２）で調製したインフリキシマブ希釈液及び生理食塩水を０．１ｍｌずつ添加し、３７℃で１時間緩やかに振とうした。

（４）インフリキシマブ添加血液でのＴＮＦ−α産生能の測定
１０ｎｇのＬＰＳをあらかじめ添加したチューブに（３）で得たインフリキシマブ添加血液を分注し、各チューブを３７℃の恒温器に入れ、緩やかに４時間振とうしてＴＮＦ−α産生反応を行った。反応後、４℃、１６００×ｇで遠心し各々チューブの血漿を１５０μｌずつ凍結保存チューブに分注して、−７０℃以下に保存した。凍結保存後のＴＮＦ−α産生血漿を室温で融解し、血漿中のＴＮＦ−α濃度をＴＮＦ−α測定ＥＩＡ試薬（積水化学工業株式会社製）で定量した。

（実施例１）
Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１００（分画分子量１００，０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブにセットした。比較例１の（４）において凍結保存したＴＮＦ−α産生血漿を室温で融解し、その１００μｌを上記のＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１００のカップに分注した。次に、３ＭＫＩを１００μｌ混和し３０分室温にて静置後、４℃、１０，０００×ｇで３０分遠心した。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３（分画分子量３，０００、 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を別の１．５ｍｌのエッペンドルフチューブにセットして、遠心後の低分子量分画液を１００μｌピペッティングにて吸い取り、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３のカップに分注した。その後、ＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝液、大日本製薬製）４００μｌを分注混和して、４℃、１０，０００×ｇで３０分遠心した。別の１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに上記遠心後のＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３のカップをセットして、カップ内のＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３高分子量分画液に４８０μｌのＰＢＳを分注混和して、もう一度４℃、１０，０００×ｇで３０分遠心した。遠心後のＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３のカップ内のＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３高分子量分画液を全量ピペッティングにて吸い取り、ＰＢＳで希釈して最終１００μｌとした。この液中のＴＮＦ−α濃度をＴＮＦ−α測定ＥＩＡ試薬（積水化学工業株式会社製）で測定した。測定濃度に３ＭＫＩによる希釈倍数を乗じて、インフリキシマブ添加血漿とＴＮＦ−α産生血漿の混和液のＴＮＦ−α濃度を求めた。

上記、比較例１及び実施例１の結果を表１にまとめた。比較例１の結果から、インフリキシマブを血液に添加しない場合には、ＬＰＳ刺激によって、ＴＮＦ−α濃度９．８０ｎｇ／ｍｌの産生が検出できた。しかし、インフリキシマブを血液に添加した場合には、ＴＮＦ−α産生は全く検出できず、インフリキシマブが血液中に０．００１ｍｇ／ｍｌ以上存在すると、ＬＰＳ刺激によるＴＮＦ−α産生能の測定が不可能になることが判明した。一方、実施例１の結果から明らかなように、ＥＩＡ法でＴＮＦ−αを定量する前に、ＫＩによって、インフリキシマブとＴＮＦ−αの免疫複合体を解離させ、次に限外ろ過によって、インフリキシマブとＴＮＦ−αを分離する処理を行うことによって、ＬＰＳ刺激によるＴＮＦ−α産生能の測定が可能になることが明らかになった。

Claims (2)

1. 測定対象のサイトカインに対する抗体を投与された被験体から採取された血液と、血液細胞から前記サイトカインの産生を誘導する材料とをインキュベーションし、前記サイトカインを産生させる工程と、
   産生された前記サイトカイン量を定量する工程とを有するサイトカイン産生能の測定方法において、
   前記サイトカインの定量工程に先立ち、測定対象の前記サイトカインと該サイトカインに対する抗体とからなる免疫複合体を解離させる第１の前処理工程と、第１の前処理工程後に、解離させたサイトカインを分離する第２の前処理工程とをさらに備えることを特徴とするサイトカイン産生能測定方法。
2. 前記測定対象のサイトカインが、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）である請求項１に記載のサイトカイン測定方法。