JPH11511856A

JPH11511856A - 血液検査の実施方法

Info

Publication number: JPH11511856A
Application number: JP9540286A
Authority: JP
Inventors: アレクサンダー、ベー．エム．ストラッサー; カール、メルバー; ハンス、ディートリッヒ、メンセン; エカルト、ティール
Original assignee: ハンス、ディートリッヒ、メンセン; エカルト、ティール
Priority date: 1996-05-21
Filing date: 1997-05-07
Publication date: 1999-10-12
Anticipated expiration: 2017-05-07
Also published as: DE59708506D1; AU2893697A; DE19620443A1; PT912891E; DE19620443C2; JP3523883B2; US6521460B1; EP0912891B1; DK0912891T3; ES2185937T3; ATE226322T1; WO1997044661A1; EP0912891A1

Abstract

(57)【要約】本発明は血液検査実施方法に関する。本発明は、臨床化学的血液指標が血清のみならず、血漿を用いても測定できるという知見に基ずいている。したがって、少なくとも１種のトロンビン阻害薬と混合した、新鮮に採取した血液試料は、臨床化学的指標および血液学的指標の両方の測定に使用できる。かくして、臨床化学的指標は凝固性成分を最早分離する必要なく、血漿を用いて測定できる。

Description

【発明の詳細な説明】血液検査の実施方法本発明は血液検査の実施方法に関するものである。特に内部疾患の診断およびその過程の管理のためには、多種の血液検査が必要である。これらの血液検査を分類すると、細胞性血液成分に関する検査（血球算定、鑑別血球算定、血液型、血液細胞の免疫表現型）、ならびに血清検査、抗体スクリーニング検査、クームス（Coombs）検査および交差検査に分けられる。血清検査は酵素、代謝産物（例えばクレアチニン、尿素、血糖）、および凝固指標 (parameters)の測定に関する。加えて、ホルモン分析または薬物濃度分析等の特殊検査は血清を用いて実施される。重病で入院中の成人の場合は、長期に亘り毎日、時には１日２回も増補血液検査を実施して患者の身体的状態の重大変化を早期段階で見つける必要がある。血液は、密閉採血システムを用いて曲げた肘（例えば肘正中（V．cubita mediana ））の静脈に突き刺して滅菌条件下に採取する。血液は既に埋め込んだ留置カテーテルを通じて任意に採取してもよい。臨床的必要性および所望試験室的検査に応じて、血液充填管の型と本数が決められている。特定試験室的検査は、かかる検査用に特別調製した特定物質（例えばヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸塩等の特定抗凝固薬）、またはグルコシダーゼ阻害薬（“血糖管”）または凝固促進物質を含んだ採血管（“血清管”）を使用してのみ実施できる。ヘパリンおよびＥＤＴＡは非特異的間接阻害薬である。これらは血液凝固カスケードの特定要素に直接または特異的に作用することはないが、これらの効果はこれらが例えば、凝固システムの種々のタンパク質の活性化には必須であるＣａ²⁺イオンを途中で奪うことにおいて間接的な性質のものである。全ての、または少なくとも大多数の重要な血液検査の実施を可能ならしめるような検査血液（“標準管”）の画一的な前処理は存在しない。その上、臨床化学的または血液学的試験室における標準ロジスティック学的シークエンスからは、同一方法で前処理された多数の採血管がしばしば必要になる。血液管は患者から採血後、測定すべき試験室的数値に応じて多くの場合空間的に離れた試験室（多くの場合、臨床化学的試験室および血液学的試験室および任意に免疫表現型、血清中薬物濃度等の特殊検査のための試験室）へと輸送される。（この場合、郵送または急便による材料発送が必要かもしれない）。試験室で受領された血液管は先ず貯蔵されなければならず、次いで約３，５００ r.p.m. で５分間遠心分離される。次いで採血管は異なった作業場（凝固管は凝固室へ、電解質測定の血清管は炎光光度計等へ送られる。次いで約１０μｌから１００μｌの１回測定に要する試料容量を各自動分析装置に入れる。殆どの測定操作での必要量は極めて小量である。実際の測定操作は数秒から数分（方法および装置に応じて最高５分）である。最終的には測定値を印刷し、出所に応じて発送元へ書類で連絡する。要約すると、現在の採血プロセスでは、各種採血管（所望の試験項目に応じて）を２−１０ｍｌの血液（管サイズに応じて）で充填すべきである。ルーチンの試験室指標を測定するためには、次の管が必要である：血球算定および鑑別（differential）血球算定１×ＥＤＴＡ管血清中のナトリウムおよびカリウム１×血清管肝臓酵素および／またはクレアチニンおよび／または尿素および／またはリパーゼおよびアミラーゼおよび／またはクレアチンキナーゼおよび／またはコレステロールおよびトリグリセライドおよび／または乳酸デヒドロゲナーゼ１×血清管全タンパクおよびタンパク電気泳動１×血清管血清中グルコース１×グルコース管 Quick、ＰＴＴ１×凝固管（クエン酸塩）血液沈降速度１×ＢＳＲ管合計７管これに加えて、血液型測定、抗体スクリーニング検査、および赤血球濃度の提供を要する場合には、さらに２つの採血管（添加剤なし）が必要である。例えばホルモン濃度分析（Ｔ３、Ｔ４、ＴＳＨ基底、等）、薬物濃度（ジギトキシン濃度、バンコマイシン濃度、テオフイリン濃度等）、特殊電解質濃度（マグネシウム、カルシウム、リン酸塩）および特殊凝固値（因子欠損、フイブリン分解産物）その他多数を必要とする特殊検査の場合には、通例として追加的採血管（多くの場合血清管）が各検査に必要である。したがって、この採血システムとは独立に、従来一般に使用されてきた採血方法には次のような欠点が見られる：１．重病患者の場合に遂行される毎日の採血が週間当り約２５０ｍｌの失血になる。この量はドイツ赤十字の健康人１人の献血量の約半分量に当たる。他の欠点は、極めて異なった因子が原因で重病人は貧血を患うことが多いことである。２．必要とされる多くの採血操作は、医療ケア中で高価につく要因である：一方では管の購入費用、他方では高価な管廃棄費用が原因である。使用済み採血管は感染性湿潤廃棄物として分類され、特殊容器中に包装して焼却しなければならない。重病人の場合、毎１週間に約４０本の採血管が必要である。３．いろいろに前処理された血液試料（血球算定用の抗凝固処理全血、酵素検査および電解質測定用血清等）およびこれらに適用される自動測定装置により決められ分けられる職場分類には、必然的に高価な人件費と資金調達を必要とする多数の作業場が必要になる。本発明目的は、血液検査実施の方法の提供にあり、これにより上記欠点を克服し、かつ短時間で迅速かつ確実に多くの血液測定の指標（parameters）を殆ど同時に測定できる方法の提供にある。この目的は、請求項１記載の方法により達成される。かかる目的の達成は、特に、臨床化学的血液指標の殆ど全てが血清のみならず、血漿の使用によっても測定し得ることを見いだしたことによるものでり、この場合のかかる血漿は、標準実務とは対照的に、ヒルジン等のトロンビン阻害薬の添加により調整されていることが前提になる。血清と血漿との違いは、前者が無フイブリンであるのに対して後者はフイブリノゲンを依然として含有することにある。驚くべきことに、試料がトロンビン阻害薬と混合されることを前提にすれば、臨床化学指標と血液学的指標との両方を一つの同し血液試料を使用して測定できることが判明した。トロンビン阻害薬としてはヒルジンおよび／またはデスルフアトヒルジン（desulf atohirudin）の使用が好ましい。この方法は自動化の方法で実施できる。ヒルジンはヒルである Hirudo medicinalis の唾液腺分泌物中に天然に見いだされる高度特異性のトロンビン阻害薬である。Hirudo medicinalis の唾液腺分泌物の抗凝固活性についての最初の記載は約 100年前に Haycraft による(Haycr aft，J，B．(1894)，Naumyn-Schmiedebergs Arch．Exp．Pathol．Pharmakol． 1 8 ，209)である。５０年代には、Markwardt らが純粋形態でヒルジンを得て、生化学的にその特徴付けに成功した［Markwardt，F．および Walsmann，P．(1958) ,Hoppe-Seyler´s Z．physiol．Chemie 312 ，85］。ヒルジンは分子量約 7000 Dalton のポリペプチドの一種で、天然に存在する各種変異型が知られるようになった。天然ヒルジンは生化学研究［Walsmannら、 (1988)Pharmazie 43，737］においてトロンビン阻害薬として使用される。ヒルジンはヒル中に小量だけ見いだされ、その抽出も煩雑なので、ヒルジンの使用は極めて特殊な、小数の適用に限定されてきた。数あるうちで、ヒルジンも血液細胞の状態の機能および変化（例えば血沈速度）を測定するための、血液試料の抗凝固薬として示唆されてきた（ＥＰ−Ａ−第442843号）。８０年代末期以来、酵母または細菌を利用した遺伝子工学法によりデスルフアトヒルジンを大量に調製することが可能になつた。この組換えデスルフアトヒルジンは Hirudo medicinalis の天然ヒルジンと（チロシン６３上の硫酸（sulfat e）基の欠如以外は）同一であり、同じ抗凝固特性を有する。未だ高価な製造費用の観点では、組み換えヒルジンは治療分野での使用目的で開発されるのが好ましい。しかし酵母 Hansenula polymorpha 等の新規発現システムの使用により収率が増加し、ヒルジンに対する非治療的応用が提供され得る程度にまで至った［ Weydemann ら、(1995)，Appl．Microbiol．Biotechnol 44，377］。組換えデスルフアトヒルジンは容易に溶解し、低濃度でも血液凝固をすぐ阻害できる。このために組換えデスルフアトヒルジンは溶解形態または乾燥物質としてのいずれかの形態による供給が可能になり、血液凝固の効率良い阻害が可能になった。供給されるデスルフアトヒルジンの用量は、対応検査に要する時間に応じて、採取血液が未凝固のままでいる量でよい。その上、デスルフアトヒルジン量は、採血容積に希釈影響を与えずに、測定結果に影響を与えない割合でよい。抗凝固剤としてのクエン酸塩溶液使用の場合には標準容積の観察は限界的要因（critical fac tor）である。Ｎａ−ＥＤＴＡまたはクエン酸塩溶液とは対照的に、デスルフアトヒルジンの抗凝固効果はＣａ²⁺イオンの引き抜きによるものではなく、特異的・立体的なトロンビン阻害による。その結果、血液から２価カチオンが除去されることはなく、生理学的条件下に細胞性血液成分の検査ができる。さらに、デスルフアトヒルジンは、例えばヘパリンの場合のような抗凝固活性に対する内因性因子をなんら必要としない。例えばヘパリンは、凝固を有効に阻害するためには抗トロンビンＩＩＩおよびヘパリン補因子２が必要である。デスルフアトヒルジンを使用すると、対応する因子欠損を有する患者由来の血液試料を、追加処置なしに問題なく分析できる。理論的考慮から、天然ヒルジン変異体およびヒルジン画分は、それらがトロンビン阻害効果を有する限り、組換えデスルフアトヒルジンの場合に得られたと同一結果を与えることが期待できる。更に、合成トロンビン阻害剤は、同一の結果を有するものとして使用できる。血液学的指標の検査では、血液細胞は検査時に生きていなければならない。この際の血液は抗凝固処理されており、かつ検査過程でその容積部が変更されてはならない；さもなければ数値が歪められる恐れがある。血液学的検査指標は、例えば全血容積単位当りの赤血球数、白血球数および血小板数、形態学的基準（鑑別血液）下に測定される各種有核血液細胞由来の白血球の割合組成、および個々の赤血球のヘモグロビン負荷度合い（臨床化学測定値ヘモグロビン濃度および容積単位当りの個々の赤血球数からの商）である。さらに免疫学的検査反応体を用いた血液学的測定指標は、無傷赤血球（輸血血清学的検査、保存血の交差試験）または単核血液細胞（例えば悪性腫瘍血液疾患の診断の場合の免疫表現型）の表面特性（抗原性）を説明している。これらの血液学的試験の全ては未破壊の生きた血液細胞を用いてのみ実施されうる点で共通している。血液学的測定指標は顕微鏡［例えば、血液細胞数の測定用算定室；細胞形態（細胞サイズ、核形状、細胞質特性、細胞質の顆粒形成等］による手動、または自動血液細胞算定装置（例えばコールターカウンター）のいずれかで測定する。血中ヘモグロビン値の測定は臨床化学的であり、血液学的測定指標ではない。本発明方法は、新規手法および抗凝固処理様式で採血管中のヒト全血を用いて自動化様式で操作できる方法であり、血液学的、臨床化学的および免疫学的測定指標の自動測定用に血液試料が同時に利用できる；簡単にいえば、殆ど全ての測定指標の測定に血液試料が同時に利用できる方法である。従来採用されてきたルーチンの測定方法は、完全に、または新規抗凝固剤に対する僅かな調整後に採用できる。その上、本発明の方法によれば自動測定装置を用いた定量測定が可能であることが注目される。例えば血球数算定では、新鮮な毛細血が手動測定に使用される。しかし大きな試験室では血液学的検査は最早手動では実施されず、自動測定装置でのみ実施される。この目的達成には、静脈Ｋ２−ＥＤＴＡ−抗凝固処理全血に依存することになる。血液１ｍｌ当り１ｍｇの万国標準濃度で抗凝固薬ジカリウム−エチレンジアミンテトラ酢酸（Ｋ２−ＥＤＴＡ）を添加すると、ＥＤＴＡによるカルシウムイオンの所望錯化とは別に、高濃度のカリウムイオンが血液試料中に導入される。かかる人工的高カリウム濃度は白血球（顆粒球およびリンパ球）と周囲水性環境との間のカリウムの浸透圧勾配（osmotic gradient）の変化に影響を与える。この結果、白血球は細胞水を失い萎縮する。しばらくの時間（３０分）後、カリウムイオンに対する新たな浸透圧勾配が白血球の代償機構を通じて得られ、細胞は失った細胞水の一部を回収する。この新規平衡は数（severa l）時間安定に維持される。当然ながら、Ｋ２−ＥＤＴＡをなんら添加しないもとのままの血液との比較では異なっている。Ｋ２−ＥＤＴＡ−抗凝固処理血液中の有核血液細胞がこの新規平衡に適合し、かつ収縮はしたが安定形態に到達した場合にのみ、自動測定装置による反復性のある形態で計測が可能であり、容積、導電性および迷光特性（自動鑑別血球算定）において互いに確実に識別できるようになる。Ｋ２−ＥＤＴＡ試料前処理に類似した影響はヒルジンでの場合には観察されず、このことは自動化測定に対するヒルジン血液の使用を除外とするようにみえる。しかし驚くべきことに、この結果は、定量的血液学的測定指標がヒルジン抗凝固処理血液を用いて自動化測定装置で測定できることを示している。赤血球、白血球および血小板数等の血液学的指標を自動化態様で測定すると、抗凝固薬クエン酸ナトリウム、修酸ナトリウムおよびヘパリンは間違った測定結果を招くことが一般に知られている。クエン酸ナトリウムまたは修酸ナトリウムをヒト全血に添加すると、赤血球が著しく収縮する結果、赤血球の自動化サイズ測定および計算結果例えばヘマトクリット値からは、非抗凝固処理原血液中の状況の推測はできない。その上、クエン酸ナトリウムで抗凝固処理した血液を使用すると、測定血液細胞の全ての数値、およびヘモグロビン値の全ての数値をフアクター１．１で補正する必要がある。その上、血液細胞の数値が手当たり次第に変わり、このことは現在まで満足には解明されていないが、血小板の場合は１０％範囲で変動し、病理学的に低減した血小板値では、一層大きな範囲で変動する。ヘパリン抗凝固処理血液使用の場合は、血小板および白血球の予測し得ない自発的ランダム凝集が起こることがあり、自動測定装置による算定時に部分的に過った低測定値がこれら細胞に対して決定される。ヘパリン、クエン酸カルシウム更にはＫ２−ＥＤＴＡ等の抗凝固薬を用いた場合、かかる測定の間違いは血液学的指標測定時に特に観察され、この時には、流体力学的に焦点を合わせた試料流の自動鑑別の間に、容量（直流の抵抗測定）、伝導度（高周波交流を用い細胞の内部伝導度測定）および迷光特性（細胞の典型的表面構造および周辺顆粒のヘリウム−ネオンレーザによる測定）（自動鑑別血球算定）にしたがって白血球が鑑別される。例えば、自動鑑別血球算定の間でのヘパリン添加は、特に好塩基性顆粒球の正確な認識には有害であり、これらは寧ろ稀ではあるが診断的観点からは特に重要である。通常は過度に高い好基性顆粒球値が示される。その上、ヘパリン抗凝固処理全血を使用した場合のかかる血球算定誤測定は手動による照合が困難ではあるが、回避できない。ヘパリンの大きな分子静電荷が原因で、ヘパリンを添加すると、対物ガラスキヤリア上に塗布された血液細胞を固定・染色 Giemsa 染色）が妨害される。したがってヘパリンを添加すると、有核血液細胞の青色系に影響を及ぼし、顕微鏡による血液細胞の識別を困難にし、不可能にさえする。最後に、自動測定装置で血液学的ルーチン指標を測定する場合のみならず、手動（manual）測定の場合でも、世界的に推薦され使用されているＫ２−ＥＤＴＡによってさえも、重大な測定の誤認が起こり得る。Ｋ２−ＥＤＴＡ被覆血液管は血液引き抜き後すぐには傾斜・移動されないので、小さな血液凝塊の形成がしばしば起こる。かかる部分凝塊血液試料は、機械または手動で実施する測定操作の場合、血液細胞の計数値を誤らせるので処理すべきではない。その上、これらは自動測定装置の微毛細管を閉塞させるかもしれない。ヒト全血の抗凝固用の異種物質による好ましからぬこれらの多数の干渉が知られており、かかる物質の導入時には詳細には予測できないので、ヒルジン抗凝固処理全血も、重要なルーチン測定方法の幾つかと不利益な様式で干渉するであろうことが考えられた。したがって当業者の間では、単一採血容器を用いて多数の臨床化学指標および血液学的指標を測定するのは不可能であるという一般的先入観があった。しかし本発明によれば、全ての臨床化学的および血液学的関連数値が単一採血容器から同時に測定できる。可能な血液数値の測定には次が包含される：１．血清指標の測定（例えば、アルカリ性ホスフアターゼ、アミラーゼ、コリンエステラーゼ、クレアチンキナーゼ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、γ−ＧＴ、ＨＢＤＨ、ラクターゼ、ＬＤＨ、リパーゼ、アルブミン、ビリルビン、カルシウム、塩化物、コレステロール、クレアチニン、鉄、全タンパク、グルコース、尿酸、尿素、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、トリグリセライド、Ｃ−反応性タンパク質、免疫グロブリン、トランスフエリン、抗−ストレプトリシン−Ｏ、リウマチ因子、Ｃ3、Ｃ4アポリポタンパク、薬剤濃度）。測定は全血から血球成分の分離後に自動測定装置を用いて行うのが好ましい。方法をさらに単純化するために、血清指標も自動測定装置で測定することができ、この場合は血球成分の分離は最早必要としない。２．血球算定検査：部分血球算定（自動）および鑑別血球算定（手動および自動）。３．血液型の測定、抗体スクリーニング検査の実施、クームス試験の実施および赤血球濃縮物の交差試験。４．血液および骨髄中の正常および悪性単核細胞の免疫表現型（immunophenot yping）。本発明で使用できる採血管（普遍標準管）は、溶液、乾燥物質または表面被膜としてのトロンビン阻害剤を含有する採血容器であってもよい。トロンビン阻害剤の量は、上記全ての分析が実施できる一定期間に亙って、採取血液の凝固が充分に阻止され、なんら問題なしに上記方法における測定の実施が許容されるような割合であるべきである。例えば、プラスチック材料、ガラスもしくは金属製の管、注射器、ピペットおよびキヤピラリーは採血容器として適合する。本発明のさらなる態様は、１単位で次の諸機能を併合する自動測定装置を用いて血液検査を実施することに関する： −全ての臨床学的指標の測定、 −全ての血液学的指標の測定、この場合の測定操作過程では、先ず血液学的値（血球算定／鑑別血球算定）を記録すべきであり、次いで細胞性血液成分（＝ヒルジン血漿）の選択的除去に続いて臨床化学指標（特殊測定を包含）を測定すべきである。細胞性成分は例えばマイクロフイルターまたは遠心分離により取り除くことができ。さらに、上記採血容器は、テストストリップを用いて測定操作を実施する測定用装置と共に使用もできる。本発明のさらなる目的は、公知方法よりも一層単純かつ迅速に実施できる臨床化学的指標測定方法の提供にある。この目的は請求項１０記載の方法により成就できる。驚くべきことに、トロンビン阻害剤と混合して新鮮に採取した血液または骨髄試料が上記臨床化学的指標測定に使用可能であることが判明した。フイブリノゲンの分離は必要ない。しかし好ましくは、上記のように細胞性（cellular）成分および血球（corpuscular ）成分は、このように調製した血液血漿から分離できる。トロンビン阻害剤としては、ヒルジンおよび／またはデスルフアトヒルジン、好ましくは組換えヒルジンおよび／またはデスルフアトヒルジンを使用すると有利である。この方法でも、新鮮な採血試料をトロンビン阻害剤含有の採血容器中に入れるべきである。臨床化学的指標は、自動測定装置を用いて測定できる。次の実施例を参照しながら本発明をさらに詳しく説明する：実施例１用量に比例して種々の長時間帯に亙って採血管中で凝固しないヒト全血を作った。全血ｍｌ当りｒヒルジン２００ＡＴＵ（＝２０ｎｇｒヒルジン）濃度では血液は２４時間凝固せず；ｒヒルジン１００ＡＴＵ（＝１０ｎｇｒヒルジン）の濃度では、すでに１２時間後にガラスもしくはプラスチック製採血管中での全血の完全凝固が起きた（表１）。採血直後、健康な３人の被験者（ＳＰ、ＪＲ、ＨＭ）からの全血２ｍｌを、予め各種量の組換えヒルジンを入れた Vacutainer 採血システム（Becton and Dic kinson社）の未調製ガラス管中に導入した。組換えヒルジン（recombinant hiru din）のストック溶液は１０⁴ＡＴＵ／ｍｌであり、管当り２０μｌから１５０μ ｌのストック溶液を使用した。陽性の対照として５ｌＥ／ｍｌヘパリンを用いた。この管をローラー上で永続的に動かした。直径約１−２ｍｍ［凝固開始（＋）］の小凝血塊が生起するまでの時間、および完全凝固（＋＋）が生起するまでの時間を測定した。細胞数測定操作に好ましくなく、かつ結果を歪めるミクロ凝血塊を有する血液管内ミクロ凝塊の存在を、コールター社のＳＴＫＳ装置を用いた細胞の繰返し計数により調べた。ミクロ凝塊の検出は初期凝固（＋）として評価した。マクロまたはミクロ凝塊が検出できない場合、その抗凝固処理血液はなんらの問題なし（−）にコールターのＳＴＫＳで分析できた。血球要素の遠心分離後は、多数の臨床化学的試験室検査が自動測定装置で問題なく実施でき、かつ血液ｍｌ当り２００ＡＴＵｒヒルジンを負荷した採血ガラス管を用いて繰り返し態様で実施できた。病理学的範囲ならびに標準範囲で測定し存在した測定値は従来法（血清法）で得られた数値とは統計的には有意の差はなかった。吸入キヤピラリーの閉塞等、測定装置に関する技術的問題点は滅多に生起せず、頻度は血清法以下であった。次の測定指標を自動測定態様で測定した：ＧＯＴ、ＧＰＴ、アルカリ性ホスフアターゼ、γ−ＧＴ、ナトリウム、カリウム、クレアチニン、尿素、クレアチンキナーゼ、ビリルビン、乳酸デヒドロゲナーゼ、α−ＨＢＤＨ、アミラーゼ、リパーゼ、グルコース、全コレステロール、トリグリセライド、塩化物、マグネシウム、リン酸塩、カルシウム、鉄、全タンパク質、タンパク電気泳動、抗ストレプトリシン力価、Ｃ−反応性タンパク質、β −ＨＣＧ（表２参照）。同じヒルジン処理採血ガラス管に基づいて、部分血球算定（全血中の細胞量の測定および計算）を自動測定装置で追加的に遂行でき、鑑別血球算定を自動装置および手法で遂行できることが判明した。明らかになりかつ病理学的範囲および正常範囲以内にあった測定値は、ルーチン法（ＥＤＴＡ血液）により得られた数値と統計的に有意差がなかった。吸入カニユーレの詰まりまたはＲ−アラーム（登録エラー）等の自動細胞算定装置（Coulter，USA）に関する技術的問題はあまり発生せず、頻度は標準法（ＥＤＴＡ血）以下であった。しかし、ｒヒルジン抗凝固処理全血の鑑別血球算定の正確な自動測定の場合、ＥＤＴＡ抗凝固処理血液に合わせて設定する自動測定装置はｒヒルジン抗凝固処理血液の使用に応じて調整しなければならない。特に顆粒球細胞はＥＤＴＡ添加により最初６０分以内に萎縮し変化する。これにより、ＥＤＴＡ血液の自動鑑別血球計算の測定例えばコールター（Coulter）のＳＴＫＳ装置による測定は、検査に先立つて少なくとも約３０から６０分間、血液をＥＤＴＡ−抗凝固処理をする場合のみ信頼性があるという影響がある。遊離カルシウムイオンのＥＤＴＡ誘発非特異的インターセプションのために必要であるこの尺度は、抗凝固性が細胞に対する有害性が低いヒルジンを用いた高度に特異性抗凝固の場合は、不要でありうる。手法測鑑別血球算定における有核細胞の形態は、ＥＤＴＡ血液中よりｒヒルジン抗凝固処理血液中のほうが特に数時間（several hours）後に一層良好に保存された。次の検査を実施した：健康な被験者（ＸＭ）の肘静脈から静脈血を採取し、Vacutainer 採血システム（Becton and Dickinson）のガラス製採血管中に入れた。メーカー側で調製していない、血清回収用のこれらの管を予めヘパリン（５ＩＥ／ｍｌ）または組換えヒルジン（２００ＡＴＵ／ｍｌ）で負荷した。被験者の静脈天然血液も充填したＥＤＴＡ血球算定管（Becton and Dickson）を対照として用いた。採血操作４時間後（平均輸送および発送時間）、血液試料をコールター(Coult er)のＳＴＫＳを使用して機械的に評価した。このＥＤＴＡ血液は採血直後に追加的に評価した。部分血球算定（数値）および鑑別血球算定は機械で行った。その上、塗布標本を作成し、翌日顕微鏡下に手動で鑑別算定を実施した。要約すると、この血液試料は使用抗凝固剤とは独立に、等しく良好な基準で評価できた。部分血球算定と手動鑑別血球算定における数値の本質的な差異は存在しなかった。しかし、機械による鑑別血球算定に関しては、ＥＤＴＡ血液に較正されたコールターのＳＴＫＳ装置を用いた場合、すなわち、ヘパリン血液およびヒルジン血液両方の場合に、好塩基性顆粒球または単球（monocytes）のいずれかとして認識される好中性顆粒球の一部の誤測定が、予期したように観察できた。この誤った測定は、採血後最初の１時間以内にＥＤＴＡ血液を機械的に評価する既知法においても同様に観察される。この測定誤りは、対応する操作により訂正できた。その上、同じｒヒルジン処理採血ガラス管に基づいて、上記検査に加えて血液型を血清学的に測定でき、抗体スクリーニング検査を遂行でき、クームス試験が実施でき、赤血球濃縮（concentrations）を検査できた。これらの検査は確実に再現性良く実施できた。技術的問題は生起しなかつた。特に抗体スクリーニング検査は、可能であれば無ＥＤＴＡ血液を用いて実施して、Kit a、Kit b、ルイス（Lewis）ａおよびルイスｂ等の補体依存抗体との干渉を回避すべきであることが強調される。現在では凝固血を用いて、滴下法や凝集反応の視覚的読み取りにより、主として手動で行っている保存血の抗体スクリーニング検査や交差試験実施の将来は、とりわけピペット操作および読み取り操作を自動化した大血液銀行や大病院の役目である。保存血の交差検査を行う場合、血清もしくは血漿および赤血球の両方が患者から必要とされるので、自動ピペット装置を用いて自動的態様で交差試験を実施すべき場合には、患者の血液を抗凝固処理して遠心分離しなければならない。さもなければ、遠心分離した赤血球の分離に際して血餅が吸引され、検査を中断しなければならない可能性がある。ＥＤＴＡを用いて抗凝固処理できることは事実である。しかしＥＤＴＡで抗凝固処理した血液は、ＥＤＴＡが補体と相互作用し、Kit a および b、ルイスａおよびｂ等の補体依存抗体が最早検出できなくなるので、ある程度までの抗体スクリーニング検査の遂行にのみ適合する。これとは対照的に、ｒヒルジン抗凝固処理血液を使用すると、自動化法で抗体スクリーニング検査や血液の交差検査が実施でき、Micro Typing Systems を使用する自動ピペット装置 ID-Sampler II（両者共 DiaMed AG，Cressier-sur-Morat,S witzerland）の助けを借りて、なんらの問題なく遂行できることが初めて示すことができた。次の検査を実施できた：Ａ：手動血液型タイピングおよび手動抗体スクリーニング検査健康な被験者からの静脈全血５ｍｌを、予め組換えヒルジン（２００ＡＴＵ／ｍｌ）を入れた無処理のガラス製採血管（Becton and Dickinson）中に導入した。３０分後、無処理ガラス製管中の血液は完全に凝固したが、一方、ヒルジン処理血液は抗凝固されていた。次いで両ガラス管を遠心処理した。引き続いて手動滴下法および凝集視覚読み取り手法を用いて、血液型を両ガラス管中で毎回血清学的に測定した。その上、抗体スクリーニング検査を３種の異なる媒体（０．９％ＮａＣｌ、ブロメリンおよびクームス）中で抗体パネル（スクリーニング）を用いて等しく実施した。要約すると、ｒヒルジン抗凝固処理血液は凝塊血（標準法）同様に血液型測定用、および抗体スクリーニング試験用に使用できた。Ｂ：自動ピペット装置 ID-Sampler II Micro-Typing Systems（DiaMed AG，Cres sier-sur-Morat，Switzerland）を使用する抗体スクリニング試験の自動的遂行健康な被験者からの静脈全血５ｍｌを、予め組換えヒルジン（２００ＡＴＵ／ｍｌ）を入れたガラス製採血管（Becton and Dickinson）中に導入した。この抗凝固処理血液をそのガラス管中で遠心分離処理した。次いで遠心処理した採血管を自動ピペット装置 ID-Sampler II（DiaMed）中に入れた。この自動ピペット装置中で血漿を血液管から取り出し、ＮａＣｌ、クームスおよび冷却媒体中での抗体スクリーニング試験実施用に調製した対応の Micro Typing Cards（DiaMed-ID ）にピペットで移した。次いでこれら Micro Typing Cards を３７℃で保温し、引き続いて遠心処理した。試料の正確な識別のために、Micro Typing Cards上のバーコードをバーコードリーダーを用いて Compacq 4/50 PC 中に手動で入れた。最後に、Micro Typing Cardsを ID Reader M(DiaMed)中に入れ、凝集を光学的に評価し、上記コンピユータ経由で表示した。要約するに、自動ピペット装置 ID-Sampler II Micro Typing Systems（DiaMe d）によるｒヒルジン抗凝固処理全血は、抗体スクリーニング検査を自動的に実施するのに、なんらの問題なく使用できることが示された。最後に、標準手法とは対照的に、検査材料がヘパリン添加により抗凝固処理されずに、ｒヒルジン添加により抗凝固処理されるならば、正常および悪性（白血病、リンパ腫）単核細胞の免疫表現型は、ヒト血液または骨髄では変化しないことが示された。ｒヒルジン抗凝固処理血液または骨髄における細胞形態は、室温（発送の場合の輸送経路のシミユレーション）で９６時間貯蔵後でさえもヘパリン血液（標準法）よりも著しく良好であった。次の検査を行った：骨髄血（Ａ）または末梢血（Ｂ）の免疫表現型タイピングのために、材料５ｍｌをヘパリン（５ＩＥ／ｍｌ）または組換えヒルジン（２００ＡＴＵ／ｍｌ）を用いて調製したプラスチック製注射器中にそれぞれ吸入した。患者Ａは直腸癌を患らっている。急性骨髄性白血病の追加的疑いがあったので患者の骨髄を用いて検査を行った。患者Ｂは慢性期の慢性骨髄白血病を患っている。この診断を確認するために末梢血を用いて検査を実施した。室温での抗凝固処理１時間後（Ａ）または３日後（Ｂ）（発送材料の場合の輸送経路、頻発状況のシミユレーション）、この材料を Ficoll 勾配(Pharmacia社)により遠心処理し、かくして単核細胞を分離した。次いでピペットでガラス管中に単核細胞を移し、コールターカウンターで細胞数を測定し、０．９％ＮａＣｌを用いて細胞数５×１０⁵に調整した。次いで各種一次抗体をピペットでとってこの細胞懸濁物の画分を得た。細胞懸濁物を保温および洗浄後、二次蛍光ラベル化抗体（ＦＩＴＣ−結合Ｆ（ａｂ ’）₂ヤギ抗マウス）を細胞膜結合一次抗体（間接免疫蛍光）の検出に用いた。次いで抗体で処理した細胞懸濁液をフローサイトメトリー（FACS can^R，Becton and Dickinson）により分析した。この数値は評価した蛍光細胞百分率に該当する。要約すれば、ヘパリン抗凝固処理血液（標準法）およびヒルジン抗凝固処理血液の両方共、直後および３日後でも等しく良好な態様でＦＡＣＳｃａｎ^Rを用いた免疫表現型タイピングにより分析でき、かかる分析は抗凝固とは独立に、同等の結果を与えることが明らかになった。要約すると、採血管からのｒヒルジン抗凝固処理血液を利用して、多数の臨床化学的ルーチンおよび特殊検査（血漿使用）、ならびに血液型−血清学的、細胞形態学的および定量的血液細胞測定（全血使用）が、標準ルーチン法を用いた場合と同等の基準で可能であることが示された。実際に、次のような可能性のある改良が予想される：１．特に、時には１日数回（several times）の頻繁な診断用採血に起因する重病患者の血液損失がかなり低減する。２．採血管の購入および処理（disposal）費用の低下により、なかでも均一に抗凝固処理された血液を用いる試験室内での、異なった診断的測定室および作業所の統合が可能により、経費の著しい低減が可能になる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者アレクサンダー、ベー．エム．ストラッサードイツ連邦共和国デュッセルドルフ、ラインゲルスワイデ、16 (72)発明者カール、メルバードイツ連邦共和国デュッセルドルフ、ケルナー、ラントシュトラーセ、44 (72)発明者ハンス、ディートリッヒ、メンセンドイツ連邦共和国ベルリン、ガルテンシュトラーセ、14 (72)発明者エカルト、ティールドイツ連邦共和国ベルリン、スベン―ヘディン―シュトラーセ、39

Claims

【特許請求の範囲】１．新鮮に採取した血液試料を、少なくとも１種のトロンビン阻害剤と混合し、かつ上記血液試料を臨床化学的指標および血液学的指標の両方の測定に使用することを特徴とする、血液検査の実施方法。２．トロンビン阻害剤としてヒルジンおよび／またはデスルファトヒルジンを使用することを特徴とする、請求項１記載の方法。３．組換えヒルジンおよび／またはデスルフアトヒルジンを使用することを特徴とする、請求項２記載の方法。４．臨床化学的指標の測定に先立ち、血液試料から細胞性および血球成分を除去することを特徴とする、請求項１から３いずれか１項記載の方法。５．血球算定および／または鑑別血球算定を実施することを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。６．血液型試験、抗体スクリーニング検査、クームス試験または赤血球濃縮物を用いる検査を実施することを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。７．末梢血または骨髄血を用いて免疫表現型タイピング操作を実施することを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。８．新鮮に採取した血液試料をトロンビン阻害剤含有容器中に入れることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項記載の方法。９．測定操作を自動測定装置で実施することを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項記載の方法。１０．新鮮に採血した血液試料を少なくとも一種のトロンビン阻害剤と混合し、得られた血液試料を用いて臨床化学的指標を測定することを特徴とする、臨床化学的血液指標の測定方法。１１．細胞性および血球成分を、臨床化学的指標測定に先立ち血液試料から除去することを特徴とする、請求項１０記載の方法。１２．ヒルジンおよび／またはデスルフアトヒルジンをトロンビン阻害剤として使用することを特徴とする、請求項１０または１１記載の方法。１３．組換えヒルジンおよび／またはデスルフアトヒルジンを使用することを特徴とする、請求項１２記載の方法。１４．新鮮に採取した血液試料をトロンビン阻害剤含有容器中に入れることを特徴とする、請求項１０から１３のいずれか１項記載の方法。１５．測定操作を自動測定装置により実施することを特徴とする、請求項１０から１３のいずれか１項記載の方法。１６．臨床化学的血液指標を血漿を用いて測定することを特徴とする、請求項１０から１５のいずれか１項記載の方法。１７．臨床化学的指標および血液学的指標両方を測定するための、少なくとも１種のトロンビン阻害剤を含む採血容器の使用。１８．臨床化学的指標を測定するための、少なくとも１種のトロンビン阻害剤を含む採血容器の使用。１９．トロンビン阻害剤がヒルジンおよび／またはデスルフアトヒルジンであることを特徴とする、請求項１７または１８記載の使用。２０．トロンビン阻害剤が組換えヒルジンおよび／またはデスルフアトヒルジンであることを特徴とする、請求項１８記載の使用。２１．採血容器が少なくとも１種のトロンビン阻害剤で被覆されていることを特徴とする、請求項１７から２０のいずれか１項記載の使用。