CN113341163B - 一种-d-稀有血型筛选试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种‑D‑稀有血型筛选试剂，由以下体积比的各试剂组成：聚凝胺试剂：IgG抗‑D试剂：LIM液＝1:29:5，其中聚凝胺试剂作为增强剂，IgG抗‑D作为检测试剂、LIM液作为稳定剂，该筛选试剂可有效对‑D‑表型及其基因携带者进行初步筛选。其优点表现在：本发明所述试剂去除了常规的辅助试剂“重悬液”；使用了稀释的IgG抗‑D试剂，省略了抗球蛋白配套试剂，所有试剂混合后形成新型筛查试剂，加入待测红细胞即可进行筛查实验，再配合微量板使用可实现大批量快速筛查。该试剂具有材料费用低，操作简便，快速，结果稳定清晰等优点，便于‑D‑血型的大规模筛查，且能实现筛查‑D‑杂合基因样本。
Description
技术领域
本发明涉及血液检测技术领域，具体地说，是一种-D-稀有血型筛选试剂及其应用。
背景技术
Rh血型系统是除ABO血型系统外，人类最重要的血型系统，该系统血型同种抗体在我国是输血免疫反应的最大诱因(AventND，blood,2000)。-D-表型是Rh血型系统中较为稀有的表型，根据国外数据统计，其发生概率约为1/10万，由于该表型仅有RhD抗原而不表达RhCE抗原，因此正常D阳性红细胞输注皆会存在引发Rh血型系统溶血性输血反应风险，威胁患者生命(Daniels G,Human Blood Groups.2nd ed,2002)，因此常规检测中，对该表型进行筛查及血液资源保存是保证该表型患者输血安全的重要保证。
目前该血型表型的筛选方法主要依靠单克隆抗体筛选(抗-Rh17(RhCE蛋白)，日本血液中心)与基因筛选(德国、法国血液保障系统)两种方式。单克隆方法由于单克隆抗体为实验室自制，目前尚无市售商品化试剂，因此无法在我国开展应用；基因筛查方法成本较高，且大部分仅可针对已发现的突变位点，因此会造成漏检；此外，上述方法皆无法对-D-表型基因携带者(即RhD--基因携带者)进行筛查，不利于该血型表型的基因背景与人群发生频率研究。
血清学凝集实验是稀有血型筛查的常规方法，该方法检测的对象是抗原抗体复合物，该方法操作简便，所需仪器简单，是最适合稀有血型筛查工作的方法之一(Fung MK,19th ed.AABB Press,2017)。因此利用此方法建立-D-表型筛选体系是最具实践意义的方法。
-D-表型较其他正常D阳性表型细胞，其发生机理为RhCE基因沉默或被RhD基因取代，表现为RhCE蛋白缺失而D抗原表达量远高于正常D阳性细胞(约为正常D阳性细胞D抗原表达量的4-6倍)(Huang CH,Blood.1995)。因此，本发明利用这一差异性作为筛选指标可解决-D-稀有血型筛选的问题。
本发明首次提出基于抗原表达差异使用IgG抗-D作为检测剂、聚凝胺试剂作为增强剂、LIM液作为稳定剂的-D-纯合子、杂合子筛选试剂，为人群中-D-基因背景及频率的研究提供了可操作性方案。关于本发明一种-D-稀有血型筛选试剂及其应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种-D-稀有血型筛选试剂及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
原理：由抗原抗体反应平衡公式(见下方)可知，由于相同细胞浓度时-D-表型细胞与正常D阳性细胞二者Ab浓度具有显著性差异，因此可利用此原理使得-D-表型细胞发生凝集而正常D阳性细胞不发生凝集，从而达到筛选的目的。
Ka：亲和力常数(仅与抗体本身性质及反应介质有关)
[Ab·Ag]：抗原抗体复合物浓度
[Ab]：游离抗体浓度
[Ag]：游离抗原浓度
聚凝胺(polybrene)是血清学常用增强剂，其对Rh血型抗体检测具有较高敏感度，在日常血清学实验中，通常通过添加聚凝胺试剂作为增强促凝剂，使得反应体系中红细胞形成凝块，再添加重悬液，若无抗体，则凝块散开；而存在IgG类抗体时，由于IgG抗体的作用，凝块不散开(Reisner R,Transfusion,1996)。故本发明认为可利用聚凝胺反应原理作为体系增强剂，改变反应体系中Ka，并通过Ab浓度控制正常D阳性细胞Ab·Ag浓度使得其无法达到血清学凝集检测敏感度下限，但-D-细胞由于Ag浓度远大于正常D阳性细胞，Ab·Ag可达到血清学凝集反应检测敏感度，故被检出。
本发明在上述理论推导后，通过实验配制并验证了一种聚凝胺反应体系，该体系目前可用于-D-稀有血型表型及该表型基因携带者筛选，该体系原理也可运用于其他抗原表达量差异较大的血型抗原表型或其他表达量差异较大生物标志物筛选工作。
在以上原理的基础上，第一方面，本发明提供一种-D-稀有血型筛选试剂，所述筛选试剂是由以下体积比的各试剂组成：聚凝胺试剂：IgG抗-D试剂：LIM液＝1:29:5；
所用的凝聚胺试剂及LIM液来源于上海血液生物医药有限公司生产的改良凝聚胺试剂盒(国械注准2016400557)。凝聚胺试剂(polybrene)：0.05％凝聚胺、2％小牛血清、4.5％葡萄糖、2.5％磷酸二氢钠，规格10mL/瓶；IgG抗-D试剂：抗D(IgG)血型定性试剂，效价69.15IU/mL，规格10mL/瓶；低离子强度溶液(LIM液)：0.5％葡萄糖、0.07％乙二胺四乙酸二钠、抗生素等，规格100mL/瓶。
优选地，所述-D-血型是指仅有RhD抗原、不表达RhCE抗原的Rh血型系统表型。
优选地，-D-血型细胞中RhCE基因沉默或被RhD基因取代、表现为RhCE蛋白缺失而D抗原表达量高于正常D阳性细胞。
优选地，所述-D-血型细胞抗原表达量是正常D阳性细胞抗原表达量的4-6倍。
第二方面，本发明提供了如上所述的-D-血型筛选试剂在制备-D-血型筛选试剂盒、-D-杂合基因样本筛选试剂盒中的应用。
第三方面，本发明提供了一种-D-血型筛选试剂盒，所述试剂盒是由上所述-D-血型筛选试剂组成。
进一步地，本发明提供了一种-D-杂合基因样本筛选试剂盒，所述试剂盒是由上所述-D-血型筛选试剂组成。
第四方面，本发明提供了一种非诊断、非治疗目的的筛选-D-血型、D-杂合基因样本的方法，所述方法包括采用如上所述的筛选试剂对红细胞进行处理的步骤。
本发明优点在于：
1、本发明针对现有技术中没有专门检测筛选-D-血型筛选试剂的缺陷，首次提出了基于抗原表达差异使用特定比例混合的IgG抗-D作为检测剂、聚凝胺试剂作为增强剂、LIM液作为稳定剂的-D-纯合子、杂合子筛选试剂，去除了常规的辅助试剂“重悬液”，使用了稀释的IgG抗-D试剂，省略了抗球蛋白配套试剂，所有试剂混合后形成新型筛查试剂，加入待测红细胞即可进行筛查实验，再配合微量板使用可实现大批量快速筛查，为人群中-D-基因背景及频率的研究提供了可操作性方案。
2、本发明所述试剂以及方法具有材料费用低(仅为现有方法的1/100左右)、操作简便(加样并混匀，离心，振荡观察结果，共三步)、快速(单样本可在10min内出结果)、结果稳定清晰等优点，便于-D-血型的大规模筛查，且该方法能实现筛查-D-杂合基因样本，有很强的实用性，应用前景广，能保障该稀有血型血液供应并实现消除其输血免疫风险。
附图说明
附图1是体系中凝聚胺的量与凝集强度关系结果。
附图2A-2C是体系中抗体量与凝集强度关系。
附图3是凝聚胺与LIM体系配伍比例筛选实验，注：A1、A2为摸索了在抗体固定的情况下，体系中LIM液与聚凝胺试剂比例初步实验结果，其中A1为-D-细胞，A2为正常D细胞。B1、B2为在A1、A2基础上进一步选取适宜LIM液与聚凝胺试剂比例实验结果，其中B1为-D-杂合子细胞，A2为正常D细胞。
附图4是体系优化与验证，注：框内为所选择体系。
附图5是不同红细胞浓度对检测的影响。
附图6是检测体系验证实验。
附图7是-D-表型家系中-D-表型的确认实验。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明设计原理：
血清学凝集实验因其操作简便，配套设备简单，是目前大面积筛查稀有血型的最佳实验方法之一。-D-表型及该基因携带者由于筛选方法限制，目前尚无稳定性好、价格低廉、操作简便的筛选方案，其在中国人群中的发生频率及基因背景皆有待深入探索。由现有研究发现，-D-表型D抗原表达量约为正常D阳性人群的4-6倍，该基因携带者D抗原表达量约为正常人群的2-3倍，故若利用该种抗原表达差异对该表型及其携带者进行筛选可解决上述问题，并为临床此类稀有血型患者血源筛查提供方法，保障该稀有血型血液供应并消除其输血免疫风险。聚凝胺试剂是一种阳离子聚合物，在血清学检测实验中可中和红细胞上的负电荷，故其为血清学实验常用的增强剂之一。本发明利用上述原理，使用聚凝胺为增加剂，使用IgG抗-D作为筛选试剂，建立-D-表型及该表型基因携带者筛选体系。
实施例1预实验
1、聚凝胺、抗体浓度的初步选择
1)聚凝胺浓度初步筛选
分别按照0.5浓度梯度将1-10及20μL聚凝胺试剂与30μL IgG-D抗体混合，加入试管中，每组制备3份混合试剂，然后每份分别加入30μL-D-血型、同期收集CcDEe血型(标为D1，下同)和新鲜CcDEe血型血样(标为D2，下同)，用生理盐水配制的3％红悬液。使用久保田离心机2挡离心，每隔5min观察结果。发现聚凝胺梯度对于整个体系敏感度有较大决定作用(见图1)。单独使用聚凝胺作为筛选试剂增强剂时，体系中添加3-4.5μL聚凝胺均可达到筛选效果；且实验过程发现中，5-30分钟内，试验结果稳定不变。
2)抗体浓度对反应的影响
初步试验后，选取凝集结果较强的7～8μL聚凝胺试剂与30μL IgG-D抗体混合后加入3％红悬液为对照。使用7、7.5、8μL聚凝胺试剂分别与30、60、90、120μL IgG-D抗体混合，每组制备3份混合试剂，然后每份分别加入30μL用生理盐水配制的3％红悬液(-D-红细胞及D1、D2红细胞)。使用久保田离心机2挡离心(1000×g离心30s)，每隔5min观察结果。进一步发现聚凝胺在体系中的浓度对反应结果影响较大，而抗体浓度对其干扰较小。实验中加入增量抗体后(60-120μL抗体)导致总体积增加，凝聚胺浓度因此降低，结果出现假阴性，进一步说明凝聚胺试剂敏感度是本体系的关键(见图2A-2C)。
2、筛选体系中LIM液、聚凝胺、与抗体各组分浓度的选择
前述实验发现聚凝胺在反应体系中最为重要且抗体量不对反应产生明显影响，但仅采用聚凝胺与抗体试剂存在结果稳定性不佳的现象：仅使用凝聚胺和抗体试剂时，在凝聚胺：抗体＝1:4左右时，可区分-D-血型与正常D细胞(-D-结果不稳定，阳性值在3+～4+浮动，正常D细胞为阴性。)根据图3B1、B2可知，加入LIM液后，-D-检测结果明显增强，同时，由于LIM带有缓冲性，加入少量LIM后，可以稳定反应体系的pH值。加入LIM液可提高检出率，同时增强试剂稳定性。此外，摸索了在抗体固定的情况下，体系中LIM液与聚凝胺试剂比例，通过研究发现，当选用聚凝胺试剂：IgG抗-D试剂：LIM液＝1:29:10时，正常D细胞出现假阳性结果；当选用聚凝胺试剂：IgG抗-D试剂：LIM液＝2:29:5时，-D-表型细胞会出现假阴性。改变本体系各试剂比例会导致检测准确度降低。
首先将聚凝胺按4/3梯度稀释制备poly梯度液(300μL盐水连续稀释900μL聚凝胺)，每管300μLpoly梯度液+200μL IgG-D制备混合体系MIX1每孔加入30μLMIX1。板中每列依次加0-35μL LIM液(以5μL为梯度)，再加入30μL 3％红悬液，混匀后，采用板式离心机500×g离心5min，再使用板式震荡仪750rpm震荡3min并观察结果。实验中使用正常D阳性细胞、-D-表型细胞及-D-表型基因携带者细胞分别进行实验。
结果发现，在凝聚胺试剂按1：10-1：30稀释、分别添加5μ-20L LIM液情况下，-D-表型与-D-携带者表型皆可在本体系中检出，结果最为良好(见图3)。
在初步确定较好反应体系后，通过不同新鲜程度D细胞-D-表型(RhD--纯合子)-D-表型基因携带者(RhD--杂合子)对凝聚胺混合LIM筛选体系进行最终选择与优化，通过实验，最终选择了凝聚胺试剂：IgG抗-D：LIM为1:29:5的反应体系作为最终体系(见图4)。
3、细胞浓度对反应体系的影响
由于在其他血清学反应体系中，红细胞浓度变化对反应结果具有一定影响，故采用了血清学最常用细胞浓度范围：2-5％红细胞悬液对本体系进行了验证，验证发现，本体系可适用于该红细胞浓度范围，见图5。
实施例2反应体系的验证
1方法
在体系建立完成并对诸多影响实验因素进行初步验证后，使用该体系对两个-D-家系(家系1：7例，家系2：2例)、50例RhD阳性细胞(分型CCee：20例，Ccee：10例,CcEe：15例,ccEE：8例,ccEe：7例,保存期45天：20例，30天：10例，15天：12例，7天：10例，新鲜收集8例)并使用1例RhD阴性细胞为对照，对反应进行验证。
2结果
发现9例-D-先证者的家系血样中，共检出-D-表型3例(血清学确认仅表达RhD抗原而无RhCE抗原表达见图7)及符合-D-表型基因携带者的特征个体4例，结果符合家系遗传规律。正常RhD阳性与阴性细胞均未发生同等强度凝集。
综上，从各方面试验验证，证实本发明建立的聚凝胺筛选原理与体系可有效对-D-表型及其基因携带者进行初步筛选。
实施例3-D-血型筛选方法
1试剂及材料
聚凝胺试剂(Polybrene)(批号20207504，上海血液生物医药有限公司)；IgG-D试剂(批号20201016，上海血液生物医药有限公司)；低离子强度溶液(LIM液)(批号20207504，上海血液生物医药有限公司)，各种红细胞(2021年3月-2021年5月，收集60份，包含-D-家系两个，共9例；其他RhD阳性红细胞50例，RhD阴性细胞1例)。
2方法
(1)将聚凝胺试剂、IgG-D试剂、LIM液按体积比为1:29:5的比例，充分混匀，配制试剂；
(2)在96孔板中，每孔加入35μL试剂，再加入15μL 2％～3％待检红细胞悬液，
(3)800rpm振摇混匀1min后500×g离心5min，800rpm振摇3min，观察结果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.-D-血型筛选试剂在制备-D-血型筛选试剂盒/-D-杂合基因样本筛选试剂盒中的应用，其特征在于，所述筛选试剂是由以下体积比的各试剂组成：凝聚胺试剂：IgG抗-D试剂：LIM液=1:29:5；
所述的凝聚胺试剂规格是10mL/瓶，所述的凝聚胺试剂是由以下物质组成：0.05%凝聚胺、2%小牛血清、4.5%葡萄糖、2.5%磷酸二氢钠；
所述的IgG抗-D试剂规格是10mL/瓶，所述的IgG抗-D试剂效价是69.15IU/mL；
所述的LIM液规格是100mL/瓶，所述的LIM液包括以下物质：0.5%葡萄糖、0.07%乙二胺四乙酸二钠和抗生素；
所述-D-血型是指仅表达RhD抗原而不表达RhCE抗原的Rh血型系统表型；
所述-D-杂合基因样本为-D-表型基因携带者样本。
2.一种-D-血型筛选试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的筛选试剂是由以下体积比的各试剂组成：凝聚胺试剂：IgG抗-D试剂：LIM液=1:29:5；
所述的凝聚胺试剂规格是10mL/瓶，所述的凝聚胺试剂是由以下物质组成：0.05%凝聚胺、2%小牛血清、4.5%葡萄糖、2.5%磷酸二氢钠；
所述的IgG抗-D试剂规格是10mL/瓶，所述的IgG抗-D试剂效价是69.15IU/mL；
所述的LIM液规格是100mL/瓶，所述的LIM液包括以下物质：0.5%葡萄糖、0.07%乙二胺四乙酸二钠和抗生素；
所述-D-血型是指仅表达RhD抗原而不表达RhCE抗原的Rh血型系统表型。
3.一种-D-杂合基因样本筛选试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的筛选试剂是由以下体积比的各试剂组成：凝聚胺试剂：IgG抗-D试剂：LIM液=1:29:5；
所述的凝聚胺试剂规格是10mL/瓶，所述的凝聚胺试剂是由以下物质组成：0.05%凝聚胺、2%小牛血清、4.5%葡萄糖、2.5%磷酸二氢钠；
所述的IgG抗-D试剂规格是10mL/瓶，所述的IgG抗-D试剂效价是69.15IU/mL；
所述的LIM液规格是100mL/瓶，所述的LIM液包括以下物质：0.5%葡萄糖、0.07%乙二胺四乙酸二钠和抗生素；
所述-D-杂合基因样本为-D-表型基因携带者样本。
4.一种非诊断、非治疗目的的筛选-D-血型/D-杂合基因样本的方法，其特征在于，所述方法包括采用-D-血型筛选试剂对红细胞进行处理的步骤；所述筛选试剂是由以下体积比的各试剂组成：凝聚胺试剂：IgG抗-D试剂：LIM液=1:29:5；
所述的凝聚胺试剂规格是10mL/瓶，所述的凝聚胺试剂是由以下物质组成：0.05%凝聚胺、2%小牛血清、4.5%葡萄糖、2.5%磷酸二氢钠；
所述的IgG抗-D试剂规格是10mL/瓶，所述的IgG抗-D试剂效价是69.15IU/mL；
所述的LIM液规格是100mL/瓶，所述的LIM液包括以下物质：0.5%葡萄糖、0.07%乙二胺四乙酸二钠和抗生素；
所述-D-血型是指仅表达RhD抗原而不表达RhCE抗原的Rh血型系统表型；
所述-D-杂合基因样本为-D-表型基因携带者样本。
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