KR100360981B1 - 세포기능측정용킷트및세포기능측정방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 조작이 간단하며, 위험성이 적고, 높은 정확도로 세포기능을 측정할 수 있는 세포기능 측정용 용기를 제공하는 것을 목적으로 하고 있다.
본 발명에 의하면, 혈액세포가 생성하는 생리활성물질을 측정하는데에 사용되는 세포기능 측정용 용기로서, 측정해야 할 액체량과 동량의 물을 취하여 추출하였을 때의 상기한 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료의 함량이 혈액세포로부터 생리활성물질의 생성을 유도할 수 없는 양으로 제한되어 있는 세포기능 측정용 용기가 제공된다. 또, 혈액과의 접촉하여 혈액중에 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료가 혈액과 접촉가능한 상태로 수납되어 있으며, 사용전의 용기중의 상기한 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료의 함량이, 상기한 생리활성물질의 측정치에 영향을 미치지 않도록, 제한되어 있는 세포기능 측정용 용기도 제공된다.

Description

세포기능 측정용 킷트 및 세포기능 측정방법{Kits for determination of cell functions and method for the determination thereof}
과립구, 단구, 대식구, 임파구 등의 백혈구(leukocytes)는, 혈액 또는 각 기관들에서 염증반응 및 면역반응을 포함하는 다양한 생체방어반응들에서 다양한 역할을 하고 있다. 이들 세포들은, 감염증; 간염(hepatitis) 및 신장염(nephritis) 등의 염증성 질환; 류머티즘성 관절염(rheumatoid arthritis) 및 천식(asthma) 등의 면역·알러지성 질환; 및 암을 포함하는 각종 병상에 있어서 중요한 기능을 나타내며, 병상의 변동에 따라서 이들 세포들의 기능이 억제되거나 증강되는 것으로 공지되어 있다.
또한, 이러한 질환들의 치료에는, 항염증제, 면역억제제, 면역증강제, 항암제 등의 다양한 약제가 유용하며, 이때에도 이러한 세포의 기능이 억제되거나 증강되는 것으로 알려져 있다. 이 때문에 이들 세포의 기능을 조사하는 것이 중요하며, 이렇게 함으로써 각종 질환의 병상 및 약제의 효과 또는 부작용을 파악하여 치료지침을 결정하고 약제의 투여량 및 타이밍(timing)을 결정할 수 있다.
종래, 병원의 검사실이나 검사센터에서는, 상술한 이유로, 이러한 세포기능을 측정하기 위하여, 과립구 식균능 시험(granulocyte phagocytic activity test), 과립구 살균능(활성산소 생성능) 시험(granulocyte bactericidal activity test), 임파구 유약화(幼若化) 시험(lymphocyte transformation test) 등이 행해져 왔다. 또, 최근에는, 플로우 사이토미터(flow cytometer) 장치와 각종 면역담당 세포의 각 표면항원에 대한 형광표식 모노클로날 항체를 이용한 표면항원시험(surface antigen test)이 행해지고 있다. 그러나, 종래의 시험법에서는, 세포분리, 세포배양 및 현미경 측정 등의 특수한 기술이 요구되었으며, 측정에 시간이 걸리는 RI 시설이나 플로우 사이토미터 등의 고가의 장치가 필요하다.
또한, 혈액중의 단구, 또는 이들 단구가 조직으로 이동하여 분화, 성장한 대식구는 식작용(phagocytosis)을 통하여 이물질 배제(exclusion)나 항원제시(antigen presentation)를 통하여 면역의 성립에 관여하며, 또 시토킨, 프로스타글란딘(prostaglandin) 등의 각종의 생리활성물질을 분비함으로써 염증반응이나 면역반응을 조절하는 등, 광범위한 기능을 갖고 있다. 이 때문에, 단구 및 대식구는, 과립구와 임파구와 유사하게, 다양한 병상에 있어서 중요한 역할을 한다. 그러므로, 이들 세포들의 기능을 확인하는 것이 매우 중요하다. 특히, 감염증 등에있어서, 단구와 대식구는, 과립구나 임파구와는 다르게, 세포수를 크게 변화시키지 않으면서 일차적으로 그들의 기능을 증강시키기 때문에 세포기능 변화를 측정하는 것이 무엇보다 중요하다("Macrophages", Tohru Tokunaga, Kodansha Scientific, 1986년 초판발행).
종양괴사(tumor necrosis) 인자 α(이하, TNFα라 한다), 인터류킨(interleukin)-1β(이하, IL-1β라 한다) 및 인터류킨-6(이하, IL-6라 한다)은 모두 모노킨(monokine)이라 불리며, 혈액 세포들 중에서도 단구나 대식구를 포함하는 백혈구에 의해 주로 생성되며 각종 염증반응이나 면역반응에 관여하는 시토킨이다.
혈액이나 혈액으로부터 분리된 백혈구의 상술한 시토킨 생성 기능을 조사하는 여러 방법들이 보고되었다. 예를 들면, 일본특허공개 평 2-196961호 및 일본특허공개 평 3-285692호 공보에는, 혈액에 리포다당(lipopolysaccharide; LPS) 또는 렉틴(lectin)을 반응시켜 생성 유도된 TNFα 또는 IL-1β 등의 시토킨을 측정하는 방법이 개시되어 있다. 또, 일본특허공개 평 6-209992호 및 일본특허공개 평 7-67955호 공보에는, 특정의 표면거칠기(surface roughness)를 갖는 고분자 재료 또는 특정의 화학구조를 갖는 고분자 재료와 혈액을 접촉시켜, TNFα의 생성을 유도하는 방법이 개시되어 있다. 또, 일본특허공개 평 7-299732호 및 일본특허공개 평 7-151752호 공보에는, 특정의 표면거칠기를 갖는 고분자 재료와 혈액을 접촉시켜 TNFα 또는 IL-1β의 생성량을 측정하는 생체반응검사방법이 개시되어 있다. 또한, 일본특허공개 평 7-500905호 공보에는, 사람의 말초혈액 백혈구로부터 유도된 TNFα 또는 IL-1β 등의 시토킨의 생성량을 측정함으로써 시험물질의 면역활성능력을 측정하는 방법이 개시되어 있다.
그러나, 병원의 검사실이나 검사센터에서 행해진 상술한 세포기능 측정방법이나 상기의 공개특허공보에 개시된 방법들은 다음과 문제점들을 갖고 있다. 즉, 이들 시험들은 모두 피험자로부터 주사기로 혈액을 채혈한 후, 피펫팅 등의 수법의 수단으로 수동으로 혈액을 다양한 반응용기에 이동시키는 조작, 백혈구 등을 분리하기 위한 세포분리, 및 기능측정을 위한 세포배양 등의 특수한 조작이 필요하다. 이 때문에, 검사를 수행하는 사람이 혈액과 접촉하게 되는 경우, 간염 및 AIDS 등의 다양한 감염증에 감염되는 위험성이 있다. 또, 이러한 조작중에, 혈액시료중에 다양한 세균 또는 먼지 등이 혼입될 가능성도 있다. 이러한 오염물질 또는 조작에 의한 물리적인 자극에 의해, 혈액중의 세포가 불필요하게 자극되어 측정결과에 악영향을 미칠 수도 있다.
또, 특정 반응용기를 사용하여 혈액을 채취하고 백혈구로부터 생성된 시토킨, 특히 TNFα 또는 IL-1β의 생성량을 측정하는 종래의 방법에서는, 예를 들면 주사기 등의 혈액채취기 또는 반응용기에, 처음부터 그람-음성균 유래의 LSP 등의 내독소(endotoxin)가 혼입되어 있었을 수도 있다. 내독소는 극미량으로도 백혈구로부터 TNFα 및 IL-1β의 생성을 유도하기 때문에, 예를 들면, 제조공정에서의 미량의 먼지의 혼입 또는 사용하는 세정수로부터의 오염에 의해 소량의 내독소가 상기 혈액채취기 또는 반응용기에 혼입되는 경우, 신뢰할 수 있는 측정결과를 얻기는 불가능하다.
상술한 문제점들 때문에, 종래 방법들 보다, 조작이 간단하고 위험성이 적으며, 정확도가 높은 세포기능 측정방법이 요구되고 있다.
한편, 종래, 혈액중의 다양한 생리활성물질의 측정, 혈액세포의 기능측정, 혈액세포의 표면항원 측정 등에 있어서, 혈액 항응고제(anticoagulant)가 사용되어 왔다.
그러나, 항응고제 중의 내독소의 함량에는 일반적인 기준이 없고, 주사제로서 사용되는 항응고제에 대해서만, 제 13차 개정 일본 약국방(日本 藥局方) 해설서에서 "내독소 시험법"에, 토끼에의 최소 발열 투여량(minimal pyrogenic dose)으로서 5EU/㎏을 규격치의 설정기준으로 한 지침이 있을 뿐이다.
내독소는 그람-음성균의 세포벽 외막을 구성하는 리포다당이며, 미소량으로 백혈구 등의 혈액세포를 자극하여 TNFα, IL-1β, IL-6, 또는 과립구-대식구 콜로니-자극인자를 포함하는 다양한 시토킨 등의 생리활성물질을 생성하며, 발열활성(pyrogenic activity) 및 내독소 쇼크(endotoxin shock) 등의 다양한 생리작용을 나타낸다(日本醫學館(Nippon Igaku-kan) "염증과 시토킨 '87 염증세미나(Inflammation and cytokines '87 Inflammation Seminar)", p.103-108).
또, 혈액세포로부터 생성된 상기한 시토킨 등의 생리활성물질은, 오토크린(autocrine) 또는 파라크린(paracrine) 모드로 서로 작용하여 히스타민(histamines), 아라키돈산 대사산물 또는 각종 시토킨의 생성을 일으키고, 혈액세포의 다양한 기능을 개선하며, 혈액세포 표면항원의 양적, 질적 변화를 일으킨다.
따라서, 혈액 항응고제가 내독소로 오염되거나, 이러한 내독소의 함량이 생리활성물질의 생성을 유도하기에 충분한 경우, 혈액 중의 다양한 생리활성물질의 측정, 혈액세포의 기능측정 및 혈액세포의 표면항원 측정을 정확하게 수행하는 것이 불가능하다.
본 발명은, 면역반응 및 염증반응 등에 관련된 세포기능을 측정하기 위한 세포기능 측정용 킷트 및 세포기능 측정방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 예를 들면 과립구(granulocytes), 단구(monocytes), 대식구(macrophages), 임파구 (lymphocytes) 등을 포함하는 혈액세포들에 의해 생성되는 시토킨(cytokines) 등의 생리활성물질을 측정함으로써 세포기능을 측정하기 위한 세포기능 측정용 킷트 및 세포기능 측정방법에 관한 것이다.
도 1은, 실시예 1~4 및 비교예 2~4의 측정결과를 보여주는 그래프이며, 가로축은 LPS 농도, 세로축은 TNFα의 유도량을 나타낸다.
도 2는, 실시예 1~4 및 비교예 2~4의 측정결과를 보여주는 그래프이며, 가로축은 LPS 농도, 세로축은 IL-1β의 유도량을 나타낸다.
도 3은, 실시예 1~4 및 비교예 2~4의 측정결과를 보여주는 그래프이며, 가로축은 LPS 농도, 세로축은 IL-6의 유도량을 나타낸다.
도 4는, 실시예 5~10의 측정결과를 보여주는 그래프이며, 가로축은 LPS 농도, 세로축은 TNFα 또는 IL-1β의 유도량을 나타낸다.
도 5는, 실시예 11~16의 측정결과를 보여주는 그래프이며, 가로축은 반응온도, 세로축은 TNFα 또는 IL-1β의 유도량을 나타낸다.
도 6은, 실시예 17~21의 측정결과를 보여주는 그래프이며, 가로축은 반응시간, 세로축은 TNFα 또는 IL-1β의 유도량을 나타낸다.
본 발명의 목적은, 종래의 세포기능 측정방법의 문제점들을 해소할 수 있으며, 종래보다 조작이 간단하며, 위험성이 적고, 높은 정확도로 세포기능을 측정할 수 있는 세포기능 측정용 킷트 및 세포기능 측정방법을 제공하는 것이다.
본원의 제 1 발명의 광범위한 국면에 따르면, 상기한 목적을 달성하기 위하여, 혈액세포가 생성하는 생리활성물질을 측정하는데에 사용되는 세포기능 측정용 용기에 있어서, 측정해야 할 액체량과 동량의 물을 취하여 추출하였을 때의 상기한 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료, 즉, 유도물질(inducer)의 함량이, 혈액세포로부터 생리활성물질의 생성을 유도할 수 없는 양으로 제한되어 있음을 특징으로 하는 세포기능 측정용 용기가 제공된다.
이 세포기능 측정용 용기에서는, 상기한 바와 같이, 측정해야 할 액체량과 동량의 물을 취하여 추출하였을 때에, 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료(유도물질)의 함량이, 혈액세포로부터 생리활성물질의 생성을 유도할 수 없는 양으로 제한되기 때문에, 즉, 세포기능 측정용 용기 자체가 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료를 상기한 바와 같이 제한된 양으로 함유하고 있기 때문에, 채취에서 측정까지의 기간동안 채혈된 혈액은 불필요한 자극을 거의 받지 않으며, 따라서 장시간 보존할 수 있다. 이 때문에, 채혈된 혈액중의 생리활성물질을 정확하게 측정할 수 있고, 각종 질환의 환자의 병상을 정확하게 파악하는데에 이 용기를 사용할 수 있다.
또, 본원의 제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기를, 후술하는 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기와 조립하여 사용하는 경우에는, 대조값(control value)을 얻는데에 적합하게 사용할 수 있다.
본원의 제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기에서, 상기한 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료(유도물질)는 바람직하게는 내독소(endotoxin)이며, 또 사용전의 세포기능 측정용 용기 중의 내독소의 함량이, 측정해야 할 액체량과 동량의 물을 취하여 추출하였을 때의 추출액중의 농도로서, 0.5EU/㎖ 이하로 제한된다.
본원의 제 2 발명은, 혈액과 접촉하여 혈액중에 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료(유도물질)가 혈액과 접촉가능한 상태로 수납되어 있으며, 사용전의 용기중의 상기한 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료의 함량이, 상기한 생리활성물질의 측정치에 영향을 미치지 않도록, 제한되어 있음을 특징으로 하는 세포기능 측정용 용기이다.
제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기에 있어서, 혈액중에 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료가 혈액과 접촉가능한 상태로 수납되어 있다할지라도, 이들을 수납하기 전에 용기 자체에 존재하는 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료의 함량이 상기한 바와 같이 생리활성물질의 측정치에 영향을 미치지 않도록 제한되어 있다. 따라서, 혈액이 도입되어 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료와 접촉하여 생리활성물질을 생성하는 경우, 생리활성물질의 생성량을 높은 정확도로 측정할 수 있다.
제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기에서, 상기한 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료(유도물질)는, 바람직하게는 내독소이며, 이 내독소가 혈액과 접촉하였을 때의 전체 액체중의 내독소의 농도가 0.6~100000 EU/㎖의 범위로 제한된다.
또한, 제 1, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기에 있어서, 혈액의 응고를 방지하기 위하여 혈액 항응고제가 더 수납되어도 좋다.
또, 상기한 혈액 항응고제 중의 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료의 함량은, 혈액과 혼합되었을 때에 혈액세포로부터 생리활성물질의 생성을 유도할 수 없는 양으로 제한되는 것이 좋다.
본원의 제 1, 제 2 발명의 특정적인 국면에 있어서, 상기한 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료는 내독소이며, 생리활성물질은 시토킨이다.
상기한 시토킨으로서, 종양괴사인자 α(TNFα), 인터류킨-1β(IL-1β) 및 인터류킨-6(IL-6)로부터 선택된 적어도 1종을 들 수 있다.
또한, 바람직하게는, 제 1, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기는, 용기의 내부가 감압된 것이다.
또, 제 1, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기와, 유도된 생리활성물질의 양을 정량할 수 있는 시약을 조합하여 세포기능 측정용 킷트를 구성할 수 있다. 이 경우, 유도된 생리활성물질의 양을 정량할 수 있는 시약으로는, 예를 들면 효소면역 측정시약(enzyme immunoassay reagent)을 사용할 수 있다.
본원의 제 3 발명은, 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료(유도물질)가 함유되어 있지 않은 물을 측정해야 할 액체량과 동량으로 취하여 추출하였을 때의 상기한 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료(제 1 유도물질)의 함량이, 혈액세포로부터 생리활성물질의 생성을 유도할 수 없는 양으로 있고, 필요에 따라 혈액 항응고제를 함유하는 제 1 세포기능 측정용 용기; 혈액과 접촉하여 혈액중에 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료 및 혈액 항응고제가 혈액과 접촉가능한 상태로 수납되어 있고, 사용전의 용기중의 상기한 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료(제 2 유도물질)의 함량이, 상기한 생리활성물질의 측정치에 영향을 미치지 않도록, 제한되어 있는 제 2 세포기능 측정용 용기; 및 생리활성물질을 정량하기 위한 정량시약을 구비하고 있는 세포기능 측정용 킷트이다. 즉, 제 3 발명에 따른 세포기능 측정용 킷트는, 제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기와, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기, 및 상기한 정량시약을 조합한 구성을 갖고 있다. 한편, 제 1 세포기능 측정용 용기에 함유된 유도물질은 제 1 유도물질이라 하고 제 2 세포기능 측정용 용기에 함유된 유도물질은 제 1 유도물질과 동일하거나 구별(제 2 유도물질)된다.
제 3 발명에 따른 세포기능 측정용 킷트에 있어서, 바람직하게는, 상기한 정량시약이, 제 1 세포기능 측정용 용기에 채혈된 혈액중의 생리활성물질의 양을 측정하는데에 사용되는 제 1 효소면역 측정시약과; 제 2 세포기능 측정용 용기에 채혈된 혈액과 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료와의 반응에 의해 생성되는 생리활성물질의 양을 측정하는데에 사용되며, 생리활성물질에 대한 측정감도가 제 1 효소면역 측정시약과 다른 제 2 효소면역 측정시약을 포함한다.
또한, 제 3 발명에 따른 세포기능 측정용 킷트의 특정적인 국면에 의하면, 상기한 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료(유도물질)가 내독소이며, 제 2 세포기능 측정용 용기에 있어서, 이 내독소가 혈액과 접촉하였을 때의 전체 액체중의 내독소 농도가 0.6~100000 EU/㎖의 범위에 있다.
본원의 제 4 발명은, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기에 혈액을 도입하고, 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료와 도입된 혈액을 접촉시켜서 생리활성물질의 생성을 유도하는 공정을 포함하는 것으로 특징으로 하는 세포기능 측정방법이다. 제 4 발명에 따른 세포기능 측정방법에서, 바람직하게는 상기한 생리활성물질이 26~45℃의 온도에서 유도된다.
또, 생리활성물질이 1~6시간동안 유도되는 것이 바람직하다. 또한, 제 4 발명에 따른 세포기능 측정방법에서, 바람직하게는, 생성 유도된 생리활성물질의 양은 정량가능한 시약에 의해 정량된다. 또, 제 4 발명에 따른 세포기능 측정방법의 보다 특정적인 국면에서는, 혈액을 세포기능 측정용 킷트의 제 1, 제 2의 세포기능 측정용 용기에 도입하여 생리활성물질의 생성을 유도한다. 이 경우에 있어서도, 생리활성물질은 26~45℃의 온도에서 유도되는 것이 바람직하고, 또 생리활성물질이 1~6시간동안 유도되는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
(제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기)
제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기는, 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료(유도물질)를 함유하지 않은 물을 측정해야 할 액체량과 동량으로 취하여 추출하였을 때에, 상기한 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료의 함량이, 혈액세포로부터 생리활성물질의 생성을 유도할 수 없는 양으로 제한할 필요가 있다.
상기한 추출의 구체적인 방법은, 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료가 함유되어 있지 않은 물을 측정해야 할 액체량과 동량으로 취하여 상기한 세포기능 측정용 용기에 넣고 37℃에서 1시간 동안 교반하에 추출을 행함으로써 수행된다.
상기한 생리활성물질은, 바람직하게는, 시토킨이며, 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료(제 1 유도물질)는, 바람직하게는 내독소이다. 그러나, 생리활성물질에 있어서는, 시토킨에 한정되지 않으며, 예를 들어 프로스타글란딘 등의 아라키돈산 대사산물, 활성산소종, 가용성 접착인자, 가용성 리셉터(receptors), 과립내효소(intragranular enzymes) 등을 열거할 수 있다. 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료에 있어서도, 생리활성물질의 종류에 따라서 적절하게 선택될 수 있다.
생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료가 내독소인 경우, 상술한 추출에 의해 얻은 추출액 중의 내독소의 함량이 0.5EU(국제 내독소 유닛)/㎖ 이하로 한정되는 것이 바람직하다. 상기한 내독소 함량이 0.5EU/㎖를 초과하는 경우, 채혈된 혈액이 내독소에 의해 생리활성물질들 중의 하나인 시토킨의 유도를 현저하게 야기시키며, 유도된 시토킨에 의해 각종 면역담당 세포들이 자극받아 면역담당세포의 기능을 변화시키며, 그 결과 정확한 세포기능의 측정이 불가능해진다.
상기한 측정해야 할 액체량은 후술하는 여러 가지 측정을 수행할 때에 사용되는 전체 액체의 합계량을 나타내며, 예를 들면 측정해야 할 혈액량과, 필요에 따라 첨가되는 후술할 혈액 항응고제 용액의 양, 혈액응고 촉진제 용액의 양, 및 자극물질의 용해 또는 현탁용 액체의 양 모두를 합한 양을 나타낸다.
이때, 상술한 추출을 행할 때에 사용되는 내독소가 함유되지 않은{내독소-프리(endotoxin-free)} 물의 양은, 측정해야 할 액체량과 정확하게 동일할 필요는 없으며, 추출이 충분히 이루어질 수만 있다면, 측정해야 할 액체량 미만이어도 좋다. 또, 이 경우에도, 추출액중의 내독소 함량이 0.5EU/㎖ 이하라면, 본 발명의 작용 및 효과를 얻을 수 있다.
상기한 내독소 함량을 측정하는 방법으로 여러 방법이 존재하지만, 본 명세서에서의 내독소 함량의 측정방법은, 제 13차 개정 일본 약국방(日本 藥局方) 해설서 중의 「내독소 시험법」에 따라서, 발색합성기질의 가수분해에 의한 발색을 지표로 하는 비색법(colorimetry)이며, 예를 들어 시판품인 ENDOSPECIE(生化學工業社(Seikagaku Kogyo Co.) 제품)를 사용한다.
또, 내독소를 제거하거나 실활시키는 방법으로는, 가열처리, 산 또는 알칼리 처리에 의한 불활성화(deactivation); 멤브레인 필터(membrane filter)에 의한 한외여과법; 음이온성 키토산계 수지, 내독소에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리미키신(polymyxin) B, 또는 내독소에 대한 항체를 고정화시킨 흡착제에 의한 제거방법등, 공지의 여러 방법들을 이용할 수 있다. 또, 상기한 내독소 제거 조작에 사용되는 기구 및 용기는, 이들이 유리로 만들어진 경우에는 250℃에서, 1시간 이상 동안 건열처리를 행하고, 이들이 플라스틱으로 만들어진 경우에는 0.2M의 수산화나트륨 수용액 중에 침지한 후 내독소-프리 물로 세정하여, 사용전에 내독소를 완전히 실활시킬 필요가 있다. 또, 물은 내독소-프리 물을 사용하여야 하며, 조작 환경은 청정실(clean room) 등에 의해 가능한한 2차적인 내독소 오염을 방지할 수 있는 환경이 좋다.
제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기는, 내부가 감압된 것이 좋다. 상기한 감압의 정도는, 상압의 혈액과 상기한 세포기능 측정용 용기의 내부가 연결되어 통할 때에(연통될 때에), 상기한 세포기능 측정용 용기에 상압의 혈액이 흡인될 수 있는 정도의 압력이 좋고, 이 압력은 흡인되어야 할 혈액의 양에 따라서 결정된다. 즉, 흡인되어야 할 혈액의 양이 많을수록 감압의 정도를 크게하는 것이 좋다.
제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기의 형상은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 채혈관, 시험관 등으로 예시되는 튜브상일 수도 있고, 마이크로플레이트(microplates)로 대표되는 판-상일 수도 있다. 바람직하게는 감압 조작을 수행하기에 적합한 것이 좋다.
제 1 발명의 세포기능 측정용 용기의 재질로서는, 예를 들어 유리 또는 플라스틱을 들 수 있다. 상기한 플라스틱으로는, 열가소성 및 열경화성 수지 둘다 사용할 수 있다. 열가소성 수지의 예로는, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리염화비닐, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 스티렌-아크릴로니트릴 공중합체, 스티렌-무수말레인산 공중합체, 스티렌-아크릴산 공중합체, 스티렌-메틸메타크릴레이트 공중합체, 에틸렌-프로필렌 공중합체, 에틸렌-아크릴산 공중합체, 에틸렌-아크릴산에스테르 공중합체 등을 열거할 수 있다. 열경화성 수지의 예로는, 불포화 폴리에스테르 수지, 에폭시 수지, 에폭시-아크릴레이트 수지 등을 열거할 수 있다.
제 1 발명의 세포기능 측정용 용기로서 튜브상의 것을 사용하는 경우에는, 용기의 내부를 감압으로 유지시키기 위하여 통상 스토퍼(stopper)가 사용된다. 스토퍼의 재질로서는, 예를 들어 부틸고무(butyl rubbers), 염소화 부틸고무, 열가소성 탄성체 등이 있다.
제 1 발명의 세포기능 측정용 용기로서 튜브상의 것을 사용하는 경우, 채혈량은 세포기능 측정용 용기의 용적에 따라서 다르며, 통상 4~5㎖의 용적의 용기를 사용하는 경우에는, 0.5~2㎖ 정도로 할 수 있다.
또, 제 1 발명의 세포기능 측정용 용기로서 마이크로플레이트상의 것을 사용하는 경우의 채혈량은 0.05~2㎖ 정도로 할 수 있다.
필요에 따라, 혈액이 응고되지 않도록, 제 1 발명의 세포기능 측정용 용기 중에 혈액 항응고제를 수용할 수도 있다. 상기한 혈액 항응고제는, 용기중에 액체 또는 고체 중의 어떤 상태로 존재하여도 좋다. 상기한 혈액 항응고제로서는, 헤파린 화합물, 구연산 화합물, 옥살산 화합물 등이 예시될 수 있으며, 이중에서 헤파린나트륨이 세포의 생물학적 반응을 방해하지 않기 때문에 좋다. 헤파린 나트륨의 용기 중의 수용량으로는, 용기에 혈액이 수용되어 있을 때에 그의 혈액중의 농도가작으면 혈액응고를 일으킬 수 있고, 그의 농도가 높으면 예기치않게 세포를 활성화 또는 불활성화시킬 수 있으므로, 4~50 U/㎖의 양으로 수용되는 것이 좋다.
제 1 발명의 세포기능 측정용 용기중에 혈액 항응고제를 첨가할 필요가 있는 경우의 일례로서는, 단구, 대식구, 임파구, 백혈구 등의 세포와, 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료를 반응시켜서 생성(유리(遊離) 또는 유도)되는 생리활성물질을 측정하는 경우이다. 또, 제 1 발명의 세포기능 측정용 용기중에 혈액 항응고제를 첨가할 필요가 없는 경우의 일례로서는, 혈소판을 트롬빈 자극시킴으로써 유리되는 RANTES(Regulated on Activation, Normal T Expressed and Secreted) 등을 측정하는 경우이다.
제 1 발명의 세포기능 측정용 용기중에는, 또, 필요에 따라, 혈액 응고제가 수용되어도 좋다. 이런 경우로서는 혈액을 응고시켜 생리활성물질을 측정하는 경우이며, 혈액 응고제의 예로서는 트롬빈(thrombin) 등을 들 수 있다.
제 1 발명의 세포기능 측정용 용기의 제조방법의 일례를, 튜브상 용기를 제조하는 경우에 대하여 설명한다. 내부를 감압시킬 수 있으며, 측정해야 할 액체량과 동량의 내독소-프리 물을 취하여 추출하였을 때의 내독소의 함량이 혈액세포로부터 생리활성물질의 생성을 유도할 수 없는 양으로 제한되어 있는 튜브상의 용기에, 필요에 따라 혈액 항응고제 또는 혈액 응고제를 가하고; 용기를 소정의 감압상태로 한 후; 상기한 용기에 스토퍼(stopper)를 배설함으로써 제조된다.
상기한 용기로서는, 예를 들어 한쪽 말단이 개방되고 반대쪽 말단이 폐쇄된 유저관체(有底管體)가 바람직하며, 개구부가 스토퍼에 의해 폐쇄가능하도록 구성된것이 좋다. 또한, 제 1 발명에 따른 측정용 용기는, 내독소 또는 다양한 세균의 혼입을 방지할 수 있도록 가능한 깨끗한 환경에서 제조하는 것이 좋고, 또 가능하다면 제조를 완료한 후에 공지의 멸균처리를 실시하는 것이 좋다.
제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기를 사용할 때에는, 먼저 혈관과 세포기능 측정용 용기를 연통시켜, 상기한 세포기능 측정용 용기중에 혈액을 흡인시킨다. 혈관과 세포기능 측정용 용기를 연통시키는데에는, 통상의 진공 채혈법에서 사용되는 주사바늘, 즉 바늘단의 한쪽에 혈관에 찔러넣을 바늘을 갖고 있고, 다른쪽에 상기한 용기의 스토퍼에 찔러넣을 바늘을 갖고 있으며, 혈관에 찔러넣을 바늘과 스토퍼에 찔러넣을 바늘이 연통되어 있는 주사바늘(통상 복합주사바늘(multiple injector needle)이라 한다)을 사용하는 것이 좋다.
제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기를 사용하여 얻은 혈액을 다른 용기에 옮겨서, 또는 이 용기를 그대로 사용하여, 생리활성물질의 측정을 행할 수 있다. 또, 얻은 혈액을 다른 반응용기에 옮겨서, 또는 이 용기를 반응용기로서 그대로 사용하여, 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료와 접촉시키고, 생성된 생리활성물질을 측정하여도 좋다. 이 용기를 반응용기로서 사용하여 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료와 접촉시키는 경우에는, 채혈 후에, 이 용기에 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료를 첨가한다.
혈액중의 생리활성물질의 측정방법은, 세포기능 측정용 용기를 사용하여 채혈한 혈액중의 생리활성물질을 측정함으로써 행한다. 이 경우, 제 1 발명의 세포기능 측정용 용기를 사용하여 얻은 혈액을 다른 용기에 옮겨서 또는 이 용기를 그대로 사용하여 생리활성물질의 측정을 행한다. 이 용기를 그대로 사용하여 생리활성물질의 측정을 행하는 경우에는, 채혈 후, 통상 정치시키거나 원심분리에 의해 혈구와 혈장으로 분리하고, 혈장중의 생리활성물질의 양을 각각의 정량시약으로 정량한다.
상기한 생리활성물질로서는, 예를 들어, TNF-α; IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6 등의 인터류킨; INFα, INFβ, INFγ 등의 인터페론; 콜로니-자극인자; IL-8, RANTES 등의 주화성(走化性, chemotactic) 인자 등의 각종 시토킨이나, PGE2, PGI2 등의 프로스타글란딘류; LTB4, LTC4 등의 로이코트리엔(leukotrienes); 일산화질소, 활성산소, 히스타민, 혈소판 활성화인자(PAF) 등의 각종 케미컬 메디에이터(chemical mediator)를 들 수 있다. 또, 가용성 ICAM1 등의 접착인자, 가용성 IL-2 리셉터 등의 가용성 시토킨 리셉터, 매트릭스 메탈로 프로테이나제(matrix metallo proteinase), 및 대식구-특이적 엘라스타제(macrophage-specific elastase) 등의 세포내 과립효소도 예시될 수 있다.
상기한 생리활성물질을 측정하는 방법으로서는, 측정해야 할 생리활성물질에 대한 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체, 퍼옥시다제(peroxidases), 알칼리 포스파타제 등의 효소 및 각종 효소의 발색 기질 등을 이용한 효소면역 측정방법이 예시될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료로는, 내독소(endotoxin), BCG 사균(死菌) 및코리네박테리움(Corynebacterium)속(屬) 등의각종 미생물; 합성 지질 A; 피란(pyran) 공중합체; 렉틴{파이토히머글루티닌(phytohemagglutinin), 콘카나발린(concanavalin) A, 포케위드 미토겐(pokeweed mitogen)}; OK432{피시바닐(Picibanil)}; PSK{크레스틴(Krestin)}; 렌티난(lentinan); 지모산(zymosan); LPS(리포다당); 칼슘 이온투과담체(calcium ionophore); 포르볼 에스테르(phorbol esters); 면역글로불린 고정화 담체; 포르밀-메티오닐-로이실-페닐알라닌(FMLP) 등의 포르밀펩티드; 및 각종 시토킨이 예시된다.
또, 천식, 화분증(pollinosis), 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 소화관 알러지, 기생충 알러지 등의 알레르겐의 검사에 이용되는 특정 항원(예를 들면, 집안의 먼지; 진드기 항원; 두드러기쑥(ragweed) 화분추출물, 세달 화분추출물, 라이스(rice) 추출물 등의 각종 화분 항원; 곰팡이 항원; 회충(ascaris) 추출물 등의 기생충 항원; 오발부민(ovalbumin), 밀, 대두, 대하(lobster), 게(crab), 육류 등의 음식물 항원; 말벌(wasp)의 독)도 사용할 수 있다.
또, 위에서 예시된 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료를 다양한 천연 또는 합성 고분자 재료에 공지의 고정화 방법(공유결합법, 물리흡착법 등)에 의해 고정화시킨 재료들도 예시할 수 있다.
상기한 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료의 형상으로서는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 액상 또는 입자상일 수 있다. 또, 담체에 고정화된 것도 좋다. 액상인 경우에는, 통상, 상기한 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료를, 희석액으로서, 예를 들면 인산염 완충액, 행크스(Hank's) 완충액 등의 완충액, MEM, RPMI-1640 등의 통상의 배지, 생리식염수(예를 들면, 大塚製藥社(Otsuka Seiyaku Co.) 제품), 주사용 물(예를 들면, 大塚製藥社 제품) 등으로 희석시켜 사용한다.
상기한 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료의 반응용기내에서의 존재상태는, 고체상이어도 좋고 또는 액체상이어도 좋다. 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료가 수용성 재료인 경우에는, 용기의 내벽면에 도포 또는 첨가된 후에, 분말상으로 되어도 좋다. 예를 들면, 주사용 물을 사용하여 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료를 희석시킨 경우에는, 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료를 용기내에 도입한 후에 연이어서 건조시켜 고체화시켜도 좋다. 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료가 수불용성인 경우에는, 상기한 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료의 표면에 기포가 잔존하여 텀블 믹싱(tumble mixing) 등에 의해 혈액과 접촉될 때에 과도한 용혈(hemolysis)을 일으켜 측정계에 악영향을 미칠 수 있으므로, 수불용성 재료는 예를 들어 상기한 희석액에 침지시키는 것이 바람직하다.
담체에 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료가 고정화된 것을 사용하는 경우, 고정화 담체가 수용성 재료인 경우에는, 용기의 내벽에 도포 또는 첨가한 후에 분말상으로 하여도 좋다. 담체가 수불용성인 경우에는, 재료의 표면에 잔존하는 기포가 과도한 용혈을 일으켜 측정계에 악영향을 미칠 수 있기 때문에, 예를 들면 상기한 희석액에 침지시키는 것이 바람직하다.
생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료의 반응용기중에의 첨가량은, 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료의 종류에 따라서 적절한 최적 농도로 설정하는 것이 좋다.
제 1 발명에 따른 혈액세포 기능의 측정방법에 있어서, 제 1 발명의 세포기능 측정용 용기와는 다른 반응용기를 사용하는 경우, 다른 반응용기의 형상으로서는, 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들어 채혈관, 시험관 등으로 예시되는 튜브상일 수도 있고, 마이크로플레이트로 대표되는 판-상일 수도 있다. 이 반응용기는, 측정해야 할 액체량과 동량의 내독소-프리 물을 취하여 추출하였을 때의 내독소의 함량이 혈액세포로부터 생리활성물질의 생성을 유도할 수 없는 양으로 제한되는 것이 좋다. 이때, 상기한 측정해야 할 액체량의 의미는, 전술한 세포기능 측정용 용기에 대한 설명에서 기재했던 의미와 동일하다.
상기한 바와 같이, 세포기능 측정용 용기와는 다른 반응용기를 사용하는 경우에는, 반응용기에 상기한 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료를 가한 후, 용기를 소정의 감압상태로 한 것을 사용할 수 있다. 이러한 반응용기에 있어서, 복합주사바늘 등으로 채혈된 혈액이 있는 세포기능 측정용 용기와 연통시킴으로써, 채혈된 혈액의 반응용기에로의 이송이 용이해지며, 동시에 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료가 미리 수용되어 있어 반응공정이 간단해진다.
상술한 경우, 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료의 반응용기중에의 수용량은, 상기한 유도재료의 종류에 따라서 적절한 최적 농도로 설정하는 것이 좋다. 이 반응용기의 제조방법의 일례를 들면, 내부를 감압시킬 수 있는 튜브상 용기에, 상기한 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료 및 필요에 따라 혈액 항응고제를 가하고; 용기를 소정의 감압상태로 한 후; 상기한 용기에 스토퍼(stopper)를 배설하는 방법이 있다. 본 발명에 사용되는 반응용기는, 내독소 또는 다양한 세균의 혼입을 방지할 수 있도록 가능한 깨끗한 환경에서 제조하는 것이 좋고, 또 가능하다면 제조를 완료한 후에 공지의 멸균처리를 실시하는 것이 좋다.
반응용기로서는, 예를 들어 한쪽 말단이 개방되고 반대쪽 말단이 폐쇄된 유저관체(有底管體)가 바람직하며, 개구부가 스토퍼에 의해 폐쇄가능하도록 구성된 것이 좋다. 상기한 유저관체로서는, 예를 들면, 반응 후 상기한 생리활성물질을 측정하기 위한 원심분리 조작에 적합한 시험관상의 것이 좋고, 그의 크기는, 외경이 5~30㎜, 높이가 20~150㎜ 정도가 좋다.
(제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기)
본원의 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기는, 용기내에, 혈액과 접촉함으로써 혈액중에 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료가 혈액과 접촉가능한 상태로 수납되어 있는 것을 특징으로 한다. 이 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료를, 이하, 생리활성물질-유도 재료(또는, 제 2 유도물질)라 한다. 생리활성물질로서는, 제 1 발명의 설명에서 예시된 생리활성물질들을 들 수 있으며, 바람직하게는 시토킨이다.
또, 생리활성물질-유도 재료은, 바람직하게는 내독소이다. 내독소는 혈액중의 단구, 대식구와 반응하여, 이들 세포의 활성화를 촉진하며, 시토킨의 생성을 유도한다. 상기한 내독소로서는, 예를 들면, 미생물 유래의 세포벽다당(LPS)으로 이루어진 내독소를 들 수 있다. 또, 내독소를 각종 천연 또는 합성 고분자 재료 중에고정화방법에 의해 고정화시킨 재료들도 사용할 수 있다.
내독소의 사용량은, 혈액과 접촉하였을 때의 전체 액체(혈액과, 혈액 항응고제 용액과, 내독소의 용해액 등과의 총합) 중의 내독소의 농도가 바람직하게는 0.6~100000 EU/㎖의 범위로, 더욱 바람직하게는 0.8~80000 EU/㎖의 범위로 되도록 하는 것이 좋다. 상기한 농도가 0.6EU/㎖ 미만이면, TNFα, IL-1β 및 IL-6의 유도량이 너무 적어질 수 있고, 100000EU/㎖를 초과하면, TNFα, IL-1β 및 IL-6의 유도량이 너무 적어질 수 있고, 그의 비용도 높아진다.
제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기에서는, 상기한 생리활성물질-유도 재료(제 2 유도물질)가, 용기내에, 혈액과 접촉가능한 상태에 있다. 이러한 혈액과 접촉가능한 상태로서는, 예를 들면, 상기한 생리활성물질-유도 재료가 용기내에 수용된 경우가 예시될 수 있다.
상기한 생리활성물질-유도 재료의 형상으로서는, 통상, 분말상 또는, 유도재료가 물 등의 용매에 용해되어 있는 액상이다. 이 유도재료의 용기내에서의 존재상태는, 고체상이어도 좋고 또는 겔상, 액체상이어도 좋다. 이 유도재료가 수용성인 경우에는, 적당한 용매에 용해되어 용기의 내벽면에 도포 또는 첨가된 후에 분말상으로 되어도 좋다.
상기한 용매로서는, 예를 들면 인산염 완충액, 행크스(Hank's) 완충액 등의 완충액, 또는 MEM, RPMI-1640 등의 통상의 배지 등, 생리적 완충액이기만 하면 어느 것이든지 이용할 수 있다. 또, 시판품인 주사용 물(LPS를 함유하지 않은 물, 大塚製藥社 제품), 생리식염수(大塚製藥社 제품)를 사용할 수도 있다. 내독소 이외의생리활성물질-유도 재료로서는, 제 1 발명의 설명에서 예시된 각종 재료를 동일하게 사용할 수 있다.
덧붙여, 상기한 생리활성물질-유도 재료에는, 일본특허 공개 평 6-209992호 공보에 개시되어 있는, 중심선 평균 거칠기(roughness) Ra값이 0.2㎛~10㎛이고, 절정(peak)에서 골(valley)까지의 평균 간격 Sm값이 5㎛~200㎛인 표면거칠기를 갖는 고분자 재료나, 일본특허 공개 평 7-67955호 공보에 개시되어 있는, 분자중에 수산기, 아미도(amido) 골격 및 에스테르 골격으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종의 화학구조를 갖고 있는 고분자 재료, 또는 양이온성 관능기를 갖고 있는 고분자 재료도 사용할 수 있다.
또, 상기한 생리활성물질-유도 재료들 중에서, 시토킨-유도 재료로서는 파이토히머글루티닌이 바람직하다. 파이토히머글루티닌은 4량체로 된 렉틴이며, 그의 구성 서브유닛에는, 적혈구 응집능을 지닌 E 서브유닛과, 백혈구 응집능을 지닌 L 서브유닛이 포함된다. 유용한 파이토히머글루티닌으로서는, 상기한 E 서브유닛과 L 서브유닛으로 이루어진 4량체인 파이토히머글루티닌-P(PHA-P), 및 L 서브유닛의 4량체인 파이토히머글루티닌-L(PHA-L)가 좋다. PHA-P 및 PHA-L은 각각 단독으로, 또는 병용하여 사용할 수 있다.
또, PHA-P와 PHA-L의 사용량을 동일하게 하여 이들의 시토킨의 생성 유도능력을 비교하면, PHA-P에 비하여 PHA-L에 의한 유도량이 약 10배 높다. 따라서, 시토킨-유도 재료로서는 PHA-L이 특히 바람직하다. 또, PHA-L의 경우, 혈액과 접촉할 때의 전체 액체(혈액과, 혈액 항응고제 용액과, PHA-L의 용해액 등과의 총합) 중의파이토히머글루티닌-L의 농도는, 바람직하게는 0.1~100㎍/㎖의 범위로, 더욱 바람직하게는 0.5~50㎍/㎖의 범위로 되도록 하는 것이 좋다. 상기한 농도가 0.1㎍/㎖ 미만이면, TNFα 및 IL-1β의 유도량이 너무 적어질 수 있고, 50㎍/㎖를 초과하면, TNFα 및 IL-1β의 유도량이 너무 적어질 수 있고, 그의 비용도 높아진다.
또, 내독소 이외의 상기한 시토킨-유도 재료로서는, 내독소를 실질적으로 함유하지 않은 재료, 소위 내독소-프리(endotoxin-free) 재료들이 좋다.
또한, 제 2 발명에서 사용된 용기에 배합되는 생리활성물질-유도 재료의 함량은, 상기한 생성유도된 생리활성물질의 측정치에 영향을 미치지 않도록, 사용전에 제한될 필요가 있다. 후술하는 실시예로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이, LPS 등의 내독소의 함량이 증가하면, 현저하게 상기한 시토킨의 유도를 일으킨다. 따라서, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정을 정확하게 하기 위해서는, 생리활성물질-유도 재료의 함량은 상기한 시토킨의 유도를 일으키지 않는 양 이하이어야만 한다.
상기한 내독소 함량은, 제 1 발명의 경우와 마찬가지로, 측정해야 할 액체량과 동량의 내독소-프리 물을 취하여, 37℃에서 1시간동안 교반하에 추출을 행하였을 때, 추출에 의해 얻은 추출액 중의 농도로서 0.5EU(국제 내독소 유닛)/㎖ 이하로 한정되는 것이 바람직하다.
또, 내독소를 제거하거나 실활시키는 방법으로는, 제 1 발명의 설명에서 기재된 각종 방법을 이용할 수 있다.
또, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기는 혈액중에 존재하는 세포들의 기능을 측정하는데에 사용되기 때문에, 혈액이 응고되지 않도록, 상기한 용기중에혈액 항응고제를 수용하여도 좋다.
상기한 혈액 항응고제의 존재형태, 종류, 수용량에 있어서는, 제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기의 경우와 동일하다. 또, 본 발명에 따른 세포기능 측정용 용기의 재질에 있어서도, 제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기에서와 동일한 재료를 사용할 수 있다.
덧붙여, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기에서도, 바람직하게는, 그의 내부를 감압시키는 것이 바람직하며, 이렇게 함으로써 혈액을 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기 내에 용이하게 흡인시킬 수 있다. 이 경우, 내부를 감압으로 유지시키기 위해서는, 제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기의 경우와 동일하게, 스토퍼를 사용하는 것이 좋고, 스토퍼의 재질에 있어서는, 제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기의 설명에서 예시된 각종 재료를 예시할 수 있다.
제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기를 사용하여 세포기능을 측정할 때의 채혈량은, 세포기능 측정용 용기의 용적에 따라서 다르며, 통상 4~5㎖의 용적의 세포기능 측정용 용기를 사용하는 경우에는, 0.5~2㎖ 정도로 할 수 있다.
제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기의 제조방법의 일례를 들면, 내부를 감압시킬 수 있는 용기에, 상기한 생리활성물질-유도 재료 및 혈액 항응고제를 가하고; 용기를 소정의 감압상태로 한 후; 상기한 용기에 스토퍼를 배설하는 방법이 있다.
상기한 용기로서는, 예를 들면, 한쪽 말단이 개방되고 반대쪽 말단이 폐쇄된 유저관체(有底管體)가 바람직하며, 개구부가 스토퍼에 의해 폐쇄가능하도록 구성된것이 좋다. 상기한 유저관체로서는, 예를 들면, 시토킨의 유도 반응 후, 상기한 시토킨의 양을 측정하기 위한 원심분리 조작에 적합한 것이 보다 바람직하고, 그의 크기는, 외경이 5~30㎜, 높이가 20~150㎜ 정도가 좋다.
또, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기는, 내독소 또는 다양한 세균의 혼입을 방지할 수 있도록 가능한 깨끗한 환경에서 제조하는 것이 좋고, 또 가능하다면 제조를 완료한 후에 공지의 멸균처리를 실시하는 것이 좋다.
이하, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기를 사용하여 세포기능을 측정하는 방법에 대하여 설명한다.
먼저 혈관 또는 채혈용기와 세포기능 측정용 용기를 연통시켜, 상기한 세포기능 측정용 용기중에 검체 혈액을 흡인시킨다. 그 다음, 상기한 세포 기능 측정용 용기를 적당하게 흔들어 혈액세포와 상기한 생리활성물질-유도 재료를 접촉시켜 반응을 유도한다. 반응이 완료되면, 정치시키거나 원심분리에 의해 혈구와 혈장으로 분리하고, 혈장중의 시토킨의 양을 각각의 정량가능한 시약으로 정량한다.
상기한 채혈용기와 상기한 세포기능 측정용 용기를 연통시키는 방법으로서는, 제 1 세포기능 측정용 용기와 채혈용기를 연통시키는 방법을 동일하게 이용할 수 있다.
혈액과 상기 시토킨-유도 재료와의 반응 온도가 낮으면 세포의 대사활성이 저하되어 시토킨 유도량이 적어질 수 있고, 온도가 높으면 세포손상이 일어나 시토킨 유도량이 적어질 수 있으므로, 26~45℃가 적당하며, 보다 바람직하게는 30~42℃가 좋다.
혈액과 상기한 시토킨-유도 재료와의 반응시간이 짧으면 시토킨 유도량이 적어질 수 있고, 길면 측정결과가 나타나는 것이 지연되고, 또 시토킨 유도량도 약 4시간을 피크로 하여 점진적으로 감소하는 경향을 보이므로, 1~6시간이 적당하며, 보다 바람직하게는 2~4시간이 좋다.
제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기를 사용하여 세포기능을 측정하는 방법에서는, 상기한 세포기능 측정용 용기로 채혈한 후, 30~40℃에서 2~6시간 동안 전체 혈액을 배양하여 시토킨을 유도하는 것이 가장 바람직한 유도방법이다.
유도된 시토킨을 정량적으로 측정하기 위하여, 제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기의 설명에서 전술한 효소면역 측정방법을 동일하게 이용할 수 있다.
이하에서는, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기를 사용하여 세포기능을 측정하는 한 구현예를 상세하게 설명한다. 먼저, 혈액과 상기한 시토킨-유도 재료를 상기한 세포기능 측정용 용기 중에서 반응시켜 시토킨을 유도한다. 유도를 완료한 후에, 세포기능 측정용 용기를 1200G에서 원심분리하여 혈구 성분들과 혈장 성분들을 분리시킨다. 그 다음, 분리된 혈장을, 상기한 시토킨에 대한 모노클로날 항체를 고정화시킨 마이크로플레이트의 웰에, 피펫을 사용하여 첨가한 후, 37℃에서 2시간 동안 반응시킨다. 반응 후 혈장을 흡인제거(suction removal) 등의 수단으로 제거하고, 이때 미반응 성분들을 제거하기 위하여 트윈(Tween) 20 등의 비이온계 계면활성제를 함유하는 중성 pH의 세정용 완충액으로 상기 웰을 세정한다. 그 다음, 양고추냉이(horseradish) 퍼옥시다제를 고정화시킨 상기한 시토킨에 대한 폴리클로날 항체를 피펫으로 상기 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간동안 반응시킨다. 그다음, 미반응 양고추냉이 퍼옥시다제-고정화 항체를 제거하기 위하여, 상기 웰을 상기한 세정용 완충액으로 세정한 후, 과산화수소 및 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine)을 함유한 기질 용액을 첨가하여 5~10분간 반응시킨다. 그 다음, 1M의 황산용액을 첨가하여 반응을 정지시키고, 효소반응에 의한 기질의 발색을 450㎚의 흡광도로 측정한다. 이 측정치를, 농도를 이미 알고 있는 시토킨을 이용하여 작성한 검사선(calibration curve)에 대하여 평가하여 상기한 시토킨의 생성유도량을 측정한다.
(세포기능 측정용 킷트)
제 1, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기는, 각각, 생리활성물질의 양을 정량할 수 있는 시약, 예를 들면 효소면역 측정시약과 조합함으로써 세포기능 측정용 킷트로 사용할 수 있다. 즉, 제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기와 유도된 생리활성물질의 양을 정량할 수 있는 시약을 구비한 세포기능 측정용 킷트를 제공할 수 있다. 또, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기와 유도된 생리활성물질의 양을 정량할 수 있는 시약을 구비한 세포기능 측정용 킷트를 제공할 수 있다.
상기한 세포기능 측정용 킷트의 사용방법의 일례로서는, 전술한 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기를 사용하여 세포기능을 측정하는 구현예에서 설명한 방법과 동일하다.
(바람직한 혈액 항응고제)
본 발명에서는, 상기한 혈액 항응고제 중에 함유된 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료의 함량이, 혈액과 혼합되었을 때 혈액세포로부터 생리활성물질을 생성할 수 없는 양으로 조절되는 것이 바람직하다. 즉, 혈액 항응고제 자체에 함유된 생리활성물질-유도 재료의 함량이 상기한 바와 같이 적으면, 검사를 행하기 전에 채혈된 혈액에 불필요한 자극이 가해지는 것을 효과적으로 억제한다. 그 결과, 채혈된 혈액중에 생리활성물질이 혈액 항응고제의 작용에 의해 생성되기 어렵고, 각종 생리활성물질의 측정, 세포기능의 측정, 혈액세포의 표면항원 측정을 보다 정확하게 행할 수 있다. 또, 채혈 후에서 검사를 행할 때까지 장시간동안 혈액시료를 보존할 수 있다.
이 경우에 있어서도, 생리활성물질-유도 재료로서는 전술한 것들을 예시할 수 있고, 바람직하게는 내독소를 사용한다. 내독소 함량이 많으면, TNFα, IL-1β, IL-6 등의 상술한 시토킨의 생성을 유도하여 정확한 측정을 방해한다. 따라서, 혈액 항응고제 중의 내독소의 함량은, 채취된 혈액 중에서 생리활성물질로서의 시토킨을 생성하지 않는 수준으로 제한되는 것이 바람직하다.
후술하는 실시예로부터 명백한 바와 같이, 혈액 항응고제중의 내독소 함량이 반응 혈액중에 0.5EU/㎖를 초과하면, TNFα, IL-1β, IL-6 등의 시토킨의 생성이 유도될 수 있다. 따라서, 혈액 항응고제 중의 내독소 함량은, 반응액중의 내독소 함량이 0.5EU/㎖ 이하가 되도록, 제한하는 것이 좋다.
상기한 혈액 항응고제의 양은 채혈량에 따라서 다르며, 통상 혈액중에, 소듐 에틸렌디아민 테트라아세테이트인 경우에는 0.5~5㎎/㎖, 구연산나트륨인 경우에는 3~5중량%, 헤파린나트륨인 경우에는 4~50 U/㎖의 양으로 사용된다.
따라서, 본 발명에 있어서는, 혈액 항응고제 중의 내독소 함량은, 혈액 항응고제의 양과 채혈량에 따라서 적절하게 선택하며, 최종적으로 채혈된 혈액중의 내독소 함량은 0.5EU/㎖ 이하로 되는 것이 좋다.
예를 들어, 시험용으로 헤파린나트륨을 사용하여 1㎖의 혈액을 채취하는 경우, 헤파린나트륨은 일반적으로 4~50 U/㎖의 양으로 첨가되며, 그의 내독소 함량은 0.125 EU/헤파린 Unit 이하인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 0.01 EU/헤파린 Unit 이하이다.
내독소 함량이 적은 혈액 항응고제의 제조방법으로서는, 제 1 발명의 설명에서 내독소를 제거하거나 실활시키는 방법으로 기재했던 각종 방법을 이용할 수 있다.
그러나, 가열처리 또는, 산 또는 알칼리 처리에 의한 내독소의 불활성화는, 종종 혈액 항응고제 자체의 불활성화를 유발하는 경우도 있으므로, 멤브레인 필터에 의한 한외여과, 흡착제에 의한 제거가 바람직하다.
(세포기능의 측정)
본 발명에 있어서, 「세포기능 측정」이란 표현은, 적혈구, 혈소판 및 백혈구로 분류되는 혈액세포의 기능을 직접 측정하는 방법 뿐만아니라, 상기한 생리활성물질의 측정에 의해 세포기능을 평가하는 방법, 및 혈액세포의 표면항원 측정도 포함한다.
상기한 적혈구, 혈소판, 백혈구로 분류되는 혈액세포의 기능 측정으로서는, 예를 들면, 적혈구 응집반응(hemagglutination), 혈소판 응집능(agglutination), 백혈구 이동능(migration), 백혈구 이동 방지시험, 백혈구 니트로블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium) 환원능, 백혈구 식균능(phagocytic activity), 임파구 유약화 반응(transformation), 임파구 세포독성 시험(cytotoxic test), 항체의존성 세포매개성(cell-mediated) 세포독성 시험, 각종 시토킨 생성능, 히스타민 유리(遊離) 시험 등을 예시할 수 있다.
또한, 세포 표면항원의 측정은 로제트(rosette) 형성시험 또는 플로우 사이토미터리(flow cytometry)법에 의한 세포 표면항원의 측정이며, 예를 들어 Fc 리셉터 및 각종 CD 항원 등의 측정을 포함한다.
(제 3 발명에 따른 세포기능 측정용 킷트)
제 3 발명에 따른 세포기능 측정용 킷트는, 상술한 제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기와, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기와, 정량시약을 구비하는 세포기능 측정용 킷트이다.
유용한 제 1, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기에 대한 상세한 설명은 전술한 바와 같다.
제 3 발명에 따른 세포기능 측정용 킷트에 의해 세포기능을 측정하기 위하여, 채혈 용기와 제 2 세포기능 측정용 용기를 연통시키고, 제 2 세포기능 측정용 용기 중에 검체 혈액을 도입한 후, 제 2 세포기능 측정용 용기를 적당하게 흔들어 혈액세포와 생리활성물질-유도 재료를 반응시킨다.
또, 대조값을 얻기 위하여, 채혈 용기와 상기한 제 1 세포기능 측정용 용기를 연통시키고, 제 1 세포기능 측정용 용기 중에 검체 혈액을 도입한다.
그 다음, 상기한 바와 같이 혈액이 도입된 제 1, 제 2 세포기능 측정용 용기를 정치시키거나 원심분리에 의해 혈구와 혈장을 분리하고, 제 1, 제 2 세포기능 측정용 용기의 혈장중의 생리활성물질의 양을 각각, 다른 측정감도를 갖는 제 1, 제 2 효소면역 측정시약으로 개별적으로 정량한다.
채혈 용기와 제 1, 제 2 세포기능 측정용 용기와의 연통은 전술한 방법에 따라 행한다.
또, 제 2 세포기능 측정용 용기에서 혈액과 내독소와의 반응 온도가 낮으면 세포의 대사활성이 저하되어 시토킨 유도량이 적어지고, 온도가 높으면 세포손상이 일어나 시토킨 유도량이 적어질 수 있으므로, 26~45℃가 적당하며, 보다 바람직하게는 30~42℃가 좋다.
혈액과 내독소와의 반응시간에 있어서는, 시토킨의 생성이 효율적으로 행해지고, 과도한 용혈을 일으키지 않는 반응시간으로 1~12시간이 적당하며, 보다 바람직하게는 2~6시간이 좋다.
본 발명에 따른 세포기능 측정용 킷트에서, 제 2 세포기능 측정용 용기중의 혈액중의 생리활성물질, 즉 생리활성물질-유도 재료와의 반응에 의해 생성된 혈액중의 생리활성물질의 양을 제 2 효소면역 측정시약으로 정량하며; 생리활성물질-유도 재료와의 반응에 의해 생성된 것이 아닌 혈액중의 생리활성물질의 양은 제 1 세포기능 측정용 용기중의 혈액중의 생리활성물질의 양을 제 1 효소면역 측정시약으로 정량함으로써 측정되며, 이들의 차이에 의해, 생리활성물질-유도 재료에 의해 생성된 정확한 생리활성물질 생성량을 측정한다.
통상, 내독소와 반응시키지 않은 혈액중의 시토킨의 양(제 1 세포기능 측정용 용기의 혈액중의 시토킨의 양)은, 수 pg/㎖ ~ 수백 pg/㎖이며, 내독소와 반응시킨 후의 혈액중의 시토킨의 양은 수백 pg/㎖ ~ 수천 pg/㎖ 이상이다.
그러나, 수 pg/㎖ ~ 수천 pg/㎖의 광범위한 측정감도를 갖는 시토킨 측정시약은 존재하지 않는다. 따라서, 1,000pg/㎖ 이상의 시토킨의 양을 측정하는데에는, 적당한 희석용액으로 혈장을 희석시켜서 측정해왔다. 그러나, 혈장의 희석조작은 복잡하고, 희석액 및 희석용기가 별도로 필요하며, 측정에 장시간이 소요된다. 또, 측정치가 희석배수를 곱해서 얻어지므로, 측정치의 정확도가 저하되는 문제가 있다.
이에 반하여, 제 3 발명에 따르면, 내독소와 반응시키지 않은 혈액중의 시토킨의 양(제 1 세포기능 측정용 용기의 혈액중의 시토킨의 양)을, 예를 들어 측정감도가 10 ~ 1,000 pg/㎖인, 보다 고감도의 제 1 효소면역 측정시약으로 측정하고, 내독소와 반응시킨 혈액중의 시토킨의 양(즉, 제 2 세포기능 측정용 용기의 혈액중의 시토킨의 양)을, 예를 들어 측정감도가 500 ~ 약 10,000pg/㎖인, 보다 저감도의 제 2 효소면역 측정시약으로 측정할 수 있다. 따라서, 상술한 바와 같은 복잡한 희석조작을 필요로 하지 않는다.
또, 상기한 시토킨이 TNFα 또는 IL-1β인 경우, 제 1 효소면역 측정시약의 감도는 10~500pg/㎖, 제 2 효소면역 측정시약의 감도는 500~10,000pg/㎖의 범위가 좋고, IL-6의 경우에는, 제 1 효소면역 측정시약의 감도는 10~1,000pg/㎖, 제 2 효소면역 측정시약은 감도는 1,000~20,000pg/㎖의 범위가 좋다.
상기한 제 1, 제 2 효소면역 측정시약은, 측정하고자 하는 상기한 시토킨에대한 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체, 퍼옥시다제 또는 알칼리 포스파타제 등의 효소, 및 각각의 효소의 발색 기질 등으로 구성되며, 측정하고자 하는 시토킨에 대한 모노클로날 항체가 마이크로플레이트 등의 고상 표면상에 미리 고정화되어 있는 샌드위치 효소면역 측정방법이, 측정전에 고정화시킬 필요가 없고 재현성(reproducibility)에 있어서도 우수하여 바람직하다.
고상 표면에의 모노클로날 항체의 고정화 방법에 있어서는, 공지의 물리흡착법 또는 화학결합법 중에서 임의적으로 선택할 수 있으며, 물리흡착법이 조작이 간단하여 바람직하다.
다른 측정감도의 제 1, 제 2 효소면역 측정시약은, 시토킨에 대한 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체, 퍼옥시다제 또는 알칼리 포스파타제 등의 효소, 및 각각의 효소의 발색 기질의 농도 등을 적절하게 조정함으로써 달성될 수 있다.
예를 들어, 샌드위치 효소면역 측정방법을 이용하는 경우, 상기한 시토킨에 대한 모노클로날 항체의 마이크로플레이트에의 고정화량을 조정함으로써 감도가 다른 제 1, 제 2 효소면역 측정시약을 조제할 수 있다. 즉, 마이크로플레이트 표면상에 고정화된 모노클로날 항체의 양에 따라서, 모노클로날 항체와 결합할 수 있는 측정대상 시토킨의 양도 변화하기 때문에, 측정감도가 다른 시약이 조제될 수 있다.
또, 이런 상이한 측정감도들은, 고정화된 모노클로날 항체에 결합된 시토킨을 검출하기 위한 시약으로서, 고정화된 모노클로날 항체의 측정대상 시토킨과는 다른 측정대상 시토킨에 대한 효소-표식(enzyme-labelled) 모노클로날 항체 또는효소-표식 폴리클로날 항체를 다른 농도로 조제함으로써도 달성할 수 있다.
또한, 아비딘(avidine)-비오틴(biotin) 등의 특이적 결합모드를 상기한 효소면역 측정계에 배합하는 방법, 예를 들어 상기의 고정화된 모노클로날 항체의 측정대상 시토킨과는 다른 측정대상 시토킨에 대한 효소-표식 항체 대신에, 비오틴-표식 항체를 이용하고, 여기에 아비딘-표식 효소를 이용하는 방법이 있다.
이하, 본 발명의 다른 측정감도를 갖는 제 1, 제 2 효소면역 측정시약에 사용할 수 있는, 모노클로날 항체가 고정화된 마이크로플레이트의 조제예를 설명한다.
먼저, 측정대상 시토킨에 대한 특이적 모노클로날 항체를 인산염 완충액 등의 완충액으로 2종류의 농도로 용해시킨다(조제농도는, 사용된 모노클로날 항체와 측정대상 시토킨과의 결합정수의 크기에 따라서, 적절히 선택된다). 모노클로날 항체가 용해된 2종류의 용액 각각을 일정량 취하여 마이크로플레이트에 첨가한 후, 2~8℃에서 하루낮 하루밤 동안 보온한다. 그 다음, 트윈 20 등의 비이온계 계면활성제를 함유한 중성 pH의 세정용 완충액으로 세정하고, 보빈 혈청 알부민이 1~4중량% 용해되어 있는 인산염 완충액을 일정량 취하여 마이크로플레이트에 첨가한 후, 37℃에서 2시간동안 보온한다. 그런 다음, 마이크로플레이트로부터 액체를 제거하고, 실온에서 건조시킨다.
이하에서는 제 3 발명에 따른 세포기능 측정용 킷트를 사용하여 세포기능을 측정하는 한 구현예를 상세하게 설명한다.
먼저, 혈액을 제 1, 제 2의 세포기능 측정용 용기에 채취하여, 37℃에서 4시간동안 보온한다. 각 반응기를 1600G에서 원심분리하여 혈구 성분들과 혈장 성분들을 분리시킨다. 그 다음, 미리 측정대상 시토킨에 대한 모노클로날 항체를 2종류의 농도로 고정화시키고, 보빈 혈청 알부민으로 미흡착 부위를 블로킹한 후 건조시킨, 각 마이크로플레이트의 웰에 분리된 혈장을 첨가하여 37℃에서 2시간동안 반응시킨다. 그런 다음, 반응후의 혈장액을 흡인제거 등의 수단으로 제거하고, 이때 미반응 성분들을 제거하기 위하여 트윈 20 등의 비이온계 계면활성제를 함유하는 중성 pH의 세정용 완충액으로 상기 웰을 세정한다. 그 다음, 양고추냉이 퍼옥시다제를 고정화시킨 상기한 시토킨에 대한 폴리클로날 항체를 첨가한 후, 37℃에서 1시간동안 반응시킨다. 그 다음, 미반응 양고추냉이 퍼옥시다제-고정화 항체를 제거하기 위하여, 상기 웰을 상기한 세정용 완충액으로 세정한 후, 과산화수소 및 테트라메틸벤지딘을 함유한 기질 용액을 첨가하여 5~10분간 반응시킨다. 그 다음, 2M의 황산용액을 첨가하여 반응을 정지시키고, 효소반응에 의한 기질의 발색을 450㎚의 흡광도로 측정한다. 이 측정치를, 농도를 이미 알고 있는 시토킨을 이용하여 작성한 검사선에 대하여 평가하여, 상기한 제 1, 제 2 세포기능 측정용 용기 각각에서 처리된 혈액중의 시토킨의 양을 측정한다.
(제 4 발명에 따른 세포기능 측정방법)
본원의 제 4 발명에 따른 세포기능 측정방법은, 제 1 또는 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기에 혈액을 도입하여 세포기능을 측정하는 것을 특징으로 한다. 이 경우, 전술한 바와 같이, 혈액 항응고제중의 내독소 함량이 혈액과 혼합되었을 때 혈액세포로부터 생리활성물질을 생성하지 않는 양으로 제한된 혈액 항응고제가 세포기능 측정용 용기에 미리 수납되는 것이 바람직하다.
제 4 발명에 따른 세포기능 측정방법의 한 구현예를 이하에서 설명한다.
채혈용 주사바늘이 부착된 주사기에, 혈액 항응고제로서 예를 들어 헤파린나트륨을, 채취 혈액량 당, 예를 들어 10 U/㎖의 양으로 미리 수용한 후, 피험자로부터 혈액을 채취한다. 또는, 진공채혈관에 혈액 항응고제를 상기한 바와 동량으로 수용한 후 채혈을 행할 수도 있다. 그 다음, 이 혈액을 1600G에서 원심분리하여 혈액세포로부터 생성된 생리활성물질의 일례로서 혈장중의 TNFα의 양을 효소면역 측정법으로 측정한다.
또, 제 4 발명에 따른 세포기능 측정방법에 있어서 보다 특정적인 국면에서는, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기가 사용된다. 이 경우에는, 용기내에 생리활성물질-유도 재료가 혈액과 접촉가능한 상태로 배치된다. 따라서, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기의 설명에서 전술했던 바와 같이, 생리활성물질-유도 재료가 혈액과 반응하여 생리활성물질이 유도된다. 유도된 생리활성물질은 전술한 방법을 이용하여 측정할 수 있다.
생리활성물질을 유도할 때의 온도는 26~45℃의 범위가 바람직하고, 생리활성물질을 유도하는 시간은 1~6시간이 바람직하다.
또, 유도된 생리활성물질의 양은 정량가능한 시약, 예를 들어 효소면역 측정시약으로 정량할 수 있다.
이하에서는, 본 발명의 실시예 및 비교예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명은 이하의 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1~4, 비교예 1~4
(1) 세포기능 측정용 용기의 제조방법 :
폴리에틸렌 테레프탈레이트로 만들어진 4㎖의 채혈관(직경 12.6×75㎜)을, 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품) 4㎖로 10회 세정한 후, 헤파린나트륨(Novo·Nordisk A/S Co., 상품명 : NOVO·HEPARIN #1000)을 200 U/㎖의 농도로 함유한 주사용 생리식염수(大塚製藥社 제품)를 0.05㎖ 첨가하였다.
대장균(E. coli)UKT-B 유래의 내독소(日本 藥局方 표준품 Lot. 8920)를 주사용 생리식염수(大塚製藥社 제품)에 용해시켜 단계적으로 희석시킨 후, 헤파린-함유 채혈관 각각 2개마다, 헤파린나트륨이 용해된 생리식염수와 내독소가 용해된 생리식염수를 합한 용액 중에, 내독소 농도가 0 EU/㎖(비교예 1), 1 EU/㎖(비교예 2), 2 EU/㎖(비교예 3), 5 EU/㎖(비교예 4), 10 EU/㎖(실시예 1), 20 EU/㎖(실시예 2), 50 EU/㎖(실시예 3), 100 EU/㎖(실시예 4)으로 되도록, 0.05㎖ 첨가하였다.
그런 다음, 미리 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)로 세정한, 채혈관의 직경에 합치되도록 구성된 부틸고무제 스토퍼를 상기한 채혈관의 개구부에, 개구부를 밀봉하지 않도록 가볍게 탑재시킨 후, 감압용 용기(vacuum container)내에 배치하여 상기 용기의 내부가 570㎜Hg의 압력으로 감압되었을 때, 채혈관의 개구부를 밀봉하였다. 이렇게 제조된 감압 채혈관을 실시예 1~4, 비교예 1~4의 세포기능 측정용 용기로서 사용하였다.
(2) 채혈관(용기)의 내독소 함량의 측정 :
주사바늘이 부착된 주사기에 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)을 도입한 후에, 주사바늘을 상기 (1)에서 얻은 헤파린만 함유한 감압 채혈관 4개 각각의 부틸고무제 스토퍼 부분에 찔러넣어 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)을 0.9㎖ 주사한 후, 37℃에서 1시간동안 교반하여 내독소를 추출하였다. 그 다음, 이 추출액중의 내독소 함량을, 세이카가쿠 고오교 가부시끼가이샤에서 시판하고 있는 내독소 측정용 킷트인 ENDOSPECIE-ES6(상품명)을 사용하여 합성발색기질법으로 측정하였다.
그 결과, 시험된 채혈관 4개 모두, 추출액중의 내독소 함량은 0.05 EU/㎖ 이하이었다.
(3) TNFα, IL-1β 및 IL-6 유도능의 측정방법 :
평소 건강한 지원자로부터, 주사바늘이 부착된 주사기를 사용하여 헤파린 채혈(heparinized)을 하였고, 이 주사바늘을 상기 (1)에서 얻은 각종 농도의 내독소를 함유한 감압 채혈관 각각의 부틸고무제 스토퍼 부분에 찔러넣어서 채혈관내에 검체 혈액 0.9㎖를 주사하였다. 그런다음, 미리 37℃로 보온해 놓은 항온기중의 텀블 믹싱용 락커 플랫폼(rocker platform)에 혈액을 채취한 각 채혈관을 탑재하여 4시간동안 텀블 믹싱하였다. 믹싱을 완료한 후, 각 용기를 4℃, 1600G에서 10분간 원심분리하여 상청의 혈장을 모았다. 얻은 혈장중의 각 시토킨의 함량, 즉 TNFα, IL-1β 및 IL-6의 양(pg/㎖)을 각각에 대한 모노클로날 항체를 사용한 효소면역 측정 킷트를 사용하여 측정하였다.
TNFα의 생성량의 측정은 PREDICTA Human TNFα ELISA KIT(측정한계 : 35pg/㎖), IL-1β의 생성량의 측정은 PREDICTA Human IL-1β ELISA KIT(측정한계 : 15pg/㎖), IL-6의 생성량의 측정은 PREDICTA Human IL-6 ELISA KIT(측정한계 : 35pg/㎖)를 사용하였다(모두, Genzyme Inc. 제품). 측정은 각각에 대해 n=3이었다. 측정결과를 도 1 내지 도 3에 나타내었다.
각 도면에서 가로축의 LPS 농도의 단위 EU/㎖는 혈액과 접촉시의 전체 액체중의 내독소 농도를 나타내며, 세로축의 유도량(pg/㎖)은 혈장중의 각 시토킨의 농도로서 각각 2개의 채혈관에서 얻은 값의 평균값이다. 이 결과로부터 명백한 바와 같이, 내독소 농도가 0.6 EU/㎖ 이상에서는, TNFα, IL-1β 및 IL-6의 생성을 유도한다. 또, 내독소 농도가 0 EU/㎖(비교예 1)인 경우의 측정 결과는 도 1 내지 도 3에 나타내지 않았으며, 이것은 이 경우에 각 시토킨의 생성량이 각 측정의 검출 한계농도 이하이었기 때문이다.
실시예 5~10
(1) 세포기능 측정용 용기의 제조방법 :
폴리에틸렌 테레프탈레이트로 만들어진 4㎖의 채혈관(직경 12.6×75㎜)을, 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품) 4㎖로 10회 세정한 후, 헤파린나트륨(Novo·Nordisk A/S Co., 상품명 : NOVO·HEPARIN #1000)을 200 U/㎖의 농도로 함유한 주사용 생리식염수(大塚製藥社 제품)를 0.05㎖ 첨가하였다.
대장균(E. coli)055:B5 유래의 내독소(LBL社 제품)를 주사용 생리식염수(大塚製藥社 제품)에 용해시켜 단계적으로 희석시킨 후, 헤파린-함유 채혈관 각각 2개마다, 헤파린나트륨이 용해된 생리식염수와 내독소가 용해된 생리식염수를 합한 용액 중에, 내독소 농도가 8 EU/㎖(실시예 5), 80 EU/㎖(실시예 6), 800 EU/㎖(실시예 7), 8000 EU/㎖(실시예 8), 80000 EU/㎖(실시예 9), 800000 EU/㎖(실시예 10)으로 되도록, 0.05㎖ 첨가하였다.
그런 다음, 미리 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)로 세정한, 채혈관의 직경에 합치되도록 구성된 부틸고무제 스토퍼를 상기한 채혈관의 개구부에, 개구부를 밀봉하지 않도록 가볍게 탑재시킨 후, 감압용 용기내에 배치하여 상기 용기의 내부가 570㎜Hg의 압력으로 감압되었을 때, 채혈관의 개구부를 밀봉하였다. 이렇게 제조된 감압 채혈관을 실시예 5~10의 세포기능 측정용 용기로서 사용하였다.
(2) 채혈관(용기)의 내독소 함량의 측정 :
주사바늘이 부착된 주사기에 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)을 도입한 후에, 주사바늘을 상기 (1)에서 얻은 헤파린만 함유한 감압 채혈관 4개 각각의 부틸고무제 스토퍼 부분에 찔러넣어 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)을 0.9㎖ 주사한 후, 37℃에서 1시간동안 교반하여 내독소를 추출하였다. 그 다음, 이 추출액중의 내독소 함량을, 세이카가쿠 고오교 가부시끼가이샤에서 시판하고 있는 내독소 측정용 킷트인 ENDOSPECIE-ES6(상품명)을 사용하여 합성발색기질법으로 측정하였다.
그 결과, 시험된 채혈관 4개 모두, 추출액중의 내독소 함량은 0.05 EU/㎖ 이하이었다.
(3) TNFα, IL-1β 유도능의 측정방법 :
평소 건강한 지원자로부터, 주사바늘이 부착된 주사기를 사용하여 헤파린 채혈을 하였고, 이 주사바늘을 상기 (1)에서 얻은 각종 농도의 내독소를 함유한 감압 채혈관 각각의 부틸고무제 스토퍼 부분에 찔러넣어서 채혈관내에 검체 혈액 0.9㎖를 주사하였다. 그런다음, 미리 37℃로 보온해 놓은 항온기중의 텀블 믹싱용 락커 플랫폼에 혈액을 채취한 각 채혈관을 탑재하여 4시간동안 텀블 믹싱하였다. 믹싱을 완료한 후, 각 용기를 4℃, 1600G에서 10분간 원심분리하여 상청의 혈장을 모았다. 얻은 혈장중의 TNFα 및 IL-1β의 양(pg/㎖)을 실시예 1에서와 동일한 방법으로 측정하였다.
측정 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 가로축의 LPS 농도의 단위 EU/㎖는 혈액과 접촉시의 혈액중(전체 액체중)의 내독소 농도를 나타내며, 세로축의 유도량(pg/㎖)은 혈장중의 TNFα 및 IL-1β의 농도로서 각각 2개의 채혈관에서 얻은 값의 평균값이다. 이 결과로부터 명백한 바와 같이, 내독소 농도가 0.8~80000 EU/㎖의 범위에서 TNFα 및 IL-1β의 유도가 확인되었다. 또, 내독소 농도가 8~800 EU/㎖의 범위에 있을 때에는 TNFα 및 IL-1β의 유도량 각각이 완만하게 증가하였고, 내독소 농도가 8000 EU/㎖일 때에는 TNFα 및 IL-1β의 유도량 둘다 크게 증가하였으며, 내독소 농도가 80000 EU/㎖일 때에는 TNFα 및 IL-1β의 유도량 각각은 내독소 농도가 8000 EU/㎖일 때에 비하여 감소하였다.
또, 시토킨-유도 재료로서의 내독소는, 일본특허 공개 평 1-503331호 공보에 10~200㎍/㎖(내독소 농도로 변환하여 약 80000~2000000 EU/㎖)를 사용한 것이 기재되어 있으나, 본 발명에서는 내독소를 보다 저농도로 사용할 수 있으며, 고농도에서 일어나는 것으로 고려되고 있는 복수의 기작에 의한 시토킨의 유도를 일으키지 않는다. 따라서, 본 발명에 따르면 환자의 병상을 보다 정확하게 반영하는 시토킨을 유도할 수 있다.
실시예 11~16
(1) 세포기능 측정용 용기의 제조방법 :
폴리에틸렌 테레프탈레이트로 만들어진 4㎖의 채혈관(직경 12.6×75㎜)을, 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품) 4㎖로 10회 세정한 후, 헤파린나트륨(Novo·Nordisk A/S Co., 상품명 : NOVO·HEPARIN #1000)을 200 U/㎖의 농도로 함유한 주사용 생리식염수(大塚製藥社 제품)를 0.05㎖ 첨가하였다.
대장균(E. coli)055:B5 유래의 내독소(LBL社 제품)를 주사용 생리식염수(大塚製藥社 제품)에 용해시켜 1600EU/㎖의 농도의 용액을 얻었고, 이 용액을 헤파린-함유 채혈관 각각에 0.05㎖ 첨가하였다.
그런 다음, 미리 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)로 세정한, 채혈관의 직경에 합치되도록 구성된 부틸고무제 스토퍼를 상기한 채혈관의 개구부에, 개구부를 밀봉하지 않도록 가볍게 탑재시킨 후, 감압용 용기내에 배치하여 상기 용기의 내부가 570㎜Hg의 압력으로 감압되었을 때, 채혈관의 개구부를 밀봉하였다. 이렇게 제조된 감압 채혈관을 실시예 11~16의 세포기능 측정용 용기로서 사용하였다.
(2) 채혈관(용기)의 내독소 함량의 측정 :
주사바늘이 부착된 주사기에 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)을 도입한 후에, 주사바늘을 상기 (1)에서 얻은 헤파린만 함유한 감압 채혈관 4개 각각의 부틸고무제 스토퍼 부분에 찔러넣어 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)을 0.9㎖ 주사한 후, 37℃에서 1시간동안 교반하여 내독소를 추출하였다. 그 다음, 이 추출액중의 내독소 함량을, 세이카가쿠 고오교 가부시끼가이샤에서 시판하고 있는 내독소 측정용 킷트인 ENDOSPECIE-ES6(상품명)을 사용하여 합성발색기질법으로 측정하였다.
그 결과, 시험된 채혈관 4개 모두, 추출액중의 내독소 함량은 0.05 EU/㎖ 이하이었다.
(3) TNFα, IL-1β 유도능의 측정방법 :
평소 건강한 지원자로부터, 주사바늘이 부착된 주사기를 사용하여 헤파린 채혈을 하였고, 이 주사바늘을 상기 (1)에서 얻은 감압 채혈관 각각의 부틸고무제 스토퍼 부분에 찔러넣어서 채혈관내에 검체 혈액 0.9㎖를 주사하였다. 그런다음, 미리 25℃(실시예 11), 30℃(실시예 12), 33℃(실시예 13), 37℃(실시예 14), 40℃(실시예 15), 45℃(실시예 16)로 보온해 놓은 항온기중의 텀블 믹싱용 락커 플랫폼에 혈액을 채취한 각 채혈관을 각 실시예 2개씩 탑재하여 4시간동안 텀블 믹싱하였다. 믹싱을 완료한 후, 각 용기를 4℃, 1600G에서 10분간 원심분리하여 상청의 혈장을 모았다. 얻은 혈장중의 TNFα 및 IL-1β의 양(pg/㎖)을 실시예 1에서와 동일한 방법으로 측정하였다.
측정 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 가로축의 반응온도는 상기한 항온기의 온도를 나타내며, 세로축의 유도량(pg/㎖)은 혈장중의 TNFα 및 IL-1β의 농도로서 각각 2개의 채혈관에서 얻은 값의 평균값이다.
실시예 17~21
(1) 세포기능 측정용 용기의 제조방법 :
폴리에틸렌 테레프탈레이트로 만들어진 4㎖의 채혈관(직경 12.6×75㎜)을, 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품) 4㎖로 10회 세정한 후, 헤파린나트륨(Novo·Nordisk A/S Co., 상품명 : NOVO·HEPARIN #1000)을 200 U/㎖의 농도로 함유한 주사용 생리식염수(大塚製藥社 제품)를 0.05㎖ 첨가하였다.
대장균(E. coli)055:B5 유래의 내독소(LBL社 제품)를 주사용 생리식염수(大塚製藥社 제품)에 용해시켜 1600EU/㎖의 농도의 용액을 얻었고, 이 용액을 헤파린-함유 채혈관 각각에 0.05㎖ 첨가하였다.
그런 다음, 미리 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)로 세정한, 채혈관의 직경에 합치되도록 구성된 부틸고무제 스토퍼를 상기한 채혈관의 개구부에, 개구부를밀봉하지 않도록 가볍게 탑재시킨 후, 감압용 용기내에 배치하여 상기 용기의 내부가 570㎜Hg의 압력으로 감압되었을 때, 채혈관의 개구부를 밀봉하였다. 이렇게 제조된 감압 채혈관을 실시예 17~21의 세포기능 측정용 용기로서 사용하였다.
(2) 채혈관(용기)의 내독소 함량의 측정 :
주사바늘이 부착된 주사기에 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)을 도입한 후에, 주사바늘을 상기 (1)에서 얻은 헤파린만 함유한 감압 채혈관 4개 각각의 부틸고무제 스토퍼 부분에 찔러넣어 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)을 0.9㎖ 주사한 후, 37℃에서 1시간동안 교반하여 내독소를 추출하였다. 그 다음, 이 추출액중의 내독소 함량을, 세이카가쿠 고오교 가부시끼가이샤에서 시판하고 있는 내독소 측정용 킷트인 ENDOSPECIE-ES6(상품명)을 사용하여 합성발색기질법으로 측정하였다.
그 결과, 시험된 채혈관 4개 모두, 추출액중의 내독소 함량은 0.05 EU/㎖ 이하이었다.
(3) TNFα, IL-1β 유도능의 측정방법 :
평소 건강한 지원자로부터, 주사바늘이 부착된 주사기를 사용하여 헤파린 채혈을 하였고, 이 주사바늘을 상기 (1)에서 얻은 감압 채혈관 12개의 부틸고무제 스토퍼 부분에 찔러넣어서 채혈관내에 검체 혈액 0.9㎖를 주사하였다. 그런다음, 미리 37℃로 보온해 놓은 항온기중의 텀블 믹싱용 락커 플랫폼에 혈액을 채취한 각 채혈관을 탑재하여 30분(실시예 17), 2시간(실시예 18), 4시간(실시예 19), 6시간(실시예 20), 24시간(실시예 21)동안 텀블 믹싱하였다. 상기 각 실시예에 대하여 2개씩 소정의 시간동안 믹싱한 후, 각 용기를 4℃, 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 상청의 혈장을 모았다. 얻은 혈장중의 TNFα 및 IL-1β의 양(pg/㎖)을 실시예 1에서와 동일한 방법으로 측정하였다.
측정 결과를 도 6에 나타내었다. 도 5에서 가로축의 반응시간은 상기한 텀블 믹싱 시간을 나타내며, 세로축의 유도량(pg/㎖)은 혈장중의 TNFα 및 IL-1β의 농도로서 각각 2개의 채혈관에서 얻은 값의 평균값이다.
실시예 22
(1) 세포기능 측정용 용기의 제조방법 :
폴리에틸렌 테레프탈레이트로 만들어진 4㎖의 채혈관(직경 12.6×75㎜)을, 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품) 4㎖로 10회 세정한 후, 헤파린나트륨(Novo·Nordisk A/S Co., 상품명 : NOVO·HEPARIN #1000)을 200 U/㎖의 농도로 함유한 주사용 생리식염수(大塚製藥社 제품)를 0.05㎖ 첨가하였다.
그 다음, 멸균처리한 파이토히머글루티닌-P(PHA-P)(시그마社(Sigma Chemical Co.) 제품)를 주사용 생리식염수(大塚製藥社 제품)에 용해시켜, 헤파린-함유 채혈관에, 헤파린나트륨이 용해된 생리식염수와 PHA-P가 용해된 생리식염수를 합한 용액 중에 100㎍/㎖로 되도록 0.05㎖ 첨가하였다.
그런 다음, 미리 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)로 세정한, 채혈관의 직경에 합치되도록 구성된 부틸고무제 스토퍼를 상기한 채혈관의 개구부에, 개구부를 밀봉하지 않도록 가볍게 탑재시킨 후, 감압용 용기내에 배치하여 상기 용기의 내부가 570㎜Hg의 압력으로 감압되었을 때, 채혈관의 개구부를 밀봉하였다. 이렇게 제조된 감압 채혈관을 세포기능 측정용 용기로서 사용하였다.
(2) 채혈관(용기)의 내독소 함량의 측정 :
주사바늘이 부착된 주사기에 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)을 도입한 후에, 주사바늘을 상기 (1)에서 얻은 헤파린과 PHA-P를 함유한 감압 채혈관 4개 각각의 부틸고무제 스토퍼 부분에 찔러넣어 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)을 0.9㎖ 주사한 후, 37℃에서 1시간동안 교반하여 내독소를 추출하였다. 그 다음, 이 추출액중의 내독소 함량을 실시예 1에서와 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과, 시험된 반응기 4개 모두, 추출액중의 내독소 함량은 0.05 EU/㎖ 이하이었다.
(3) TNFα, IL-1β, IL-6의 유도능의 측정방법 :
실시예 1의 (3)에서 사용한 각종 농도의 내독소를 함유한 감압 채혈관 대신에, 상기 (1)에서 얻은 헤파린과 PHA-P를 함유한 감압 채혈관을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1의 (3)에서와 동일한 방법으로 TNFα, IL-1β 및 IL-6의 유도능을 측정하였으며, 결과를 표 1~3에 나타내었다.
비교예 5
(1) 세포기능 측정용 용기의 제조방법 :
실시예 22에서 사용한 폴리에틸렌 테레프탈레이트로 만들어진 4㎖의 채혈관(직경 12.6×75㎜) 대신에, 실시예 22에서 사용한 것과는 다른 폴리에틸렌 테레프탈레이트로 만들어진 4㎖의 채혈관(직경 12.6×75㎜)을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 22(1)에서와 동일한 방법으로 헤파린과 PHA-P를 함유한 감압 채혈관을 제조하여 세포기능 측정용 용기로서 사용하였다.
(2) 채혈관(용기)의 내독소 함량의 측정 :
상기 (1)에서 얻은 헤파린과 PHA-P를 함유한 감압 채혈관 4개를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 22(2)에서와 동일한 방법으로 채혈관의 내독소 함량을 측정하였다. 그 결과, 시험된 채혈관 4개의 추출액중의 내독소 함량은 0.65 EU/㎖, 0.74 EU/㎖, 0.58 EU/㎖, 0.62 EU/㎖이었다.
(3) TNFα, IL-1β, IL-6의 유도능의 측정방법 :
실시예 22의 (3)에서 사용한 헤파린과 PHA-P를 함유한 감압 채혈관 대신에, 상기 (1)에서 얻은 헤파린 및 PHA-P를 함유한 감압 채혈관 10개를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 22의 (3)에서와 동일한 방법으로 TNFα, IL-1β 및 IL-6의 유도능을 측정하였으며, 결과를 표 1~3에 나타내었다.
실시예 22 비교예 5
TNFα유도량 (pg/㎖) 채혈관 번호 1 452.8 684.5
2 420.5 790.5
3 468.5 948.6
4 440.2 664.5
5 495.6 895.3
6 462.8 980.5
7 442.1 728.6
8 432.8 894.2
9 489.2 925.1
10 438.8 696
평균값(pg/㎖) 454.33 820.78
표준편차(pg/㎖) 24.5 120.9
변동계수(%) 5.4 14.7
실시예 22 비교예 5
IL-1β유도량 (pg/㎖) 채혈관 번호 1 274.6 496.3
2 254.5 582.1
3 268.4 396.1
4 252.4 557.9
5 236.8 689.3
6 257.1 325.6
7 249.6 445.8
8 262.8 625.4
9 257.1 322.4
10 244.6 555.8
평균값(pg/㎖) 255.79 499.72
표준편차(pg/㎖) 11.1 124.9
변동계수(%) 4.3 25.0
실시예 22 비교예 5
IL-6유도량(pg/㎖) 채혈관번호 1 6820 8820
2 6930 12520
3 6240 9630
4 7150 13050
5 6420 9420
6 6390 8420
7 6980 7430
8 6520 12490
9 6480 10060
10 6610 9420
평균값(pg/㎖) 6654 10126
표준편차(pg/㎖) 300 1910
변동계수(%) 4.5 18.9
표 1~3에서 보는 바와 같이, 추출액중의 내독소 함량이 0.5EU/㎖ 이하인 세포기능 측정용 용기를 사용한 경우가 재현성이 양호하였다.
실시예 23~30
(1) 세포기능 측정용 용기의 제조방법 :
폴리에틸렌 테레프탈레이트로 만들어진 4㎖의 채혈관(직경 12.6×75㎜)을,내독소-프리 물(大塚製藥社 제품) 4㎖로 10회 세정하였다. 헤파린나트륨(Novo·Nordisk A/S Co., 상품명 : NOVO·HEPARIN #1000)이 40 U/㎖의 농도로, PHA-L(Sigma社 제품)이 표 4에 명시된 농도로 용해된 생리식염수(大塚製藥社 제품) 1㎖씩을, 위에서 세정한 채혈관 2개에 첨가하였다.
그런 다음, 미리 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)로 세정한, 채혈관의 직경에 합치되도록 구성된 부틸고무제 스토퍼를 상기한 채혈관의 개구부에, 개구부를 밀봉하지 않도록 가볍게 탑재시킨 후, 감압용 용기내에 배치하여 상기 용기의 내부가 570㎜Hg의 압력으로 감압되었을 때, 채혈관의 개구부를 밀봉하였다. 이렇게 제조된 감압 채혈관을 실시예 23~30의 세포기능 측정용 용기로서 사용하였다.
(2) 채혈관(용기)의 내독소 함량의 측정 :
각종 농도의 PHA-L을 함유한 상기 (1)에서 얻은 세포기능 측정용 용기 각 1개(전체 8개)에, 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품) 1.0㎖를 도입한 후에, 37℃에서 1시간동안 교반하여 내독소를 추출하였다. 그 다음, 이 추출액중의 내독소 함량을 실시예 1에서와 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과, 실시예 23~30의 세포기능 측정용 용기 모두, 추출액중의 내독소 함량이 0.05 EU/㎖ 이하이었다.
(3) TNFα 및 IL-1β의 유도능의 측정방법 :
평소 건강한 지원자로부터, 주사바늘이 부착된 주사기를 사용하여 헤파린 채혈을 하였고, 이 주사바늘을 상기 (1)에서 얻은 실시예 23~30의 세포기능 측정용 용기의 부틸고무제 스토퍼 부분에 찔러넣어서 채혈관내에 검체 혈액 1.0㎖를 주사하였다. 그런다음, 미리 37℃로 보온해 놓은 항온기중의 텀블 믹싱용 락커 플랫폼에 혈액을 채취한 각 채혈관을 탑재하여 2시간동안 텀블 믹싱하였다. 믹싱을 완료한 후, 각 용기를 4℃, 1600G에서 10분간 원심분리하여 상청의 혈장을 모았다. 얻은 혈장중의 TNFα 및 IL-1β의 양을 실시예 1의 (3)에서와 동일한 방법으로 측정하여, 결과를 표 4에 나타내었다.
유도재료와 농도(㎍/㎖) 생성량(pg/㎖)
PHA-L PHA-P TNFα IL-1β
실시예 23 0.02 - 5
24 0.2 - 70 80
25 2 - 2178 403
26 10 - 2864 563
27 50 - 2956 567
28 100 - 2431 432
29 200 - 2250 425
30 500 - 153
31 - 0.2 25
32 - 2 63
33 - 10 164
34 - 50 496
실시예 31~34
실시예 23의 PHA-L 대신에, PHA-P(Sigma社 제품)를 표 4에 명시된 농도로 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 23에서와 동일하게 실시하여 TNFα 및 IL-1β의 생성량을 측정하였으며, 결과를 표 4에 나타내었다. 또, 실시예 31~34의 세포기능 측정용 용기를 실시예 23의 (2)에서와 동일하게 추출한 추출액중의 내독소 함량은 0.05 EU/㎖이하이었다.
실시예 35 및 비교예 6
시판되고 있는 헤파린-배합 감압 채혈관인 LPS-프리 채혈관(積水化學工業社 제품 : LPS-프리 규격이 제공됨)을 제 1 발명의 세포기능 측정용 용기로서 사용하였다(실시예 35). 또, 다른 시판되고 있는 헤파린-배합 감압 채혈관으로서, A사 제품 채혈관(LPS-프리 규격이 제공되지 않음)을 비교예의 채혈용기로 하였다(비교예 6).
각각 5개의 채혈관에, 평소 건강한 사람(동일인)의 혈액을 1㎖씩 진공 채혈하여, 20℃에서 2시간 보존하였다. 그 후, 4℃에서 원심분리(1600G, 10분)하여 혈장을 모았다. 얻은 혈장중의 TNFα의 양을, Genzyme사 제품인, 상품명 「PREDICTA Human TNFα ELISA KIT」를 사용하여 측정하여, 각각의 평균값을 구하였다. 그 결과, 실시예 35의 것은 검출한계농도인 15pg/㎖ 이하이었다. 비교예 6의 것은 51pg/㎖이었다.
또, 각각의 채혈관에서, 동일 로트(lot)의 별개의 채혈관의 내독소 함량을 다음과 같이 구하였다. 채혈관내에, 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)을 1㎖ 첨가한 후, 37℃에서 1시간동안 교반하여 내독소를 추출하였다. 그 다음, 이 추출액중의 내독소 함량을 실시예 1에서와 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과, 실시예 35의 것은 0.03EU/㎖, 비교예 6의 것은 958EU/㎖이었다.
이상으로부터 명백한 바와 같이, 혈액중의 TNFα 농도를 측정하는 경우, 측정해야 할 액체량과 동량의 내독소-프리 물을 취하여 추출을 행할 때의 내독소의 양이 혈액세포로부터 생리활성물질을 생성하지 못하는 양으로 있는 채혈용기를 사용하여 채혈을 행하지 않는다면, 혈액은 채혈용기중의 LPS와 반응하여 TNFα 등의 생리활성물질을 생성(유도)하여 불필요하게 자극되어 점진적으로 성질이 변화되며, 본래의 혈액중의 TNFα의 농도를 측정할 수 없게 된다.
실시예 36 및 비교예 7~9
실시예 35 및 비교예 6에서와 동일한 채혈관, 및 시판되고 있는 헤파린-배합 감압 채혈관으로서, B사 제품 채혈관 및 C사 제품 채혈관 각각 5개씩의 채혈관에, 자극물질로서 120ng/㎖의 LPS 용액을 50㎕씩 분주하여, 혈액과 LPS를 반응시켜 시토킨을 유도하기 위한 반응용기를 제조하였다. 이때, 실시예 35와 동일한 채혈관을 사용한 것을 실시예 36, 비교예 6과 동일한 채혈관을 사용한 것을 비교예 7, B사 제품 채혈관을 사용한 것을 비교예 8, C사 제품 채혈관을 사용한 것을 비교예 9의 반응용기로 하였다. 또, 비교예 8 및 9의 채혈관에서, 동일 로트의 별개의 채혈관의 내독소 함량을 실시예 35에서와 동일하게 측정한 결과, 비교예 8의 것은 10EU/㎖, 비교예 9의 것은 389EU/㎖이었다.
8~10주령의 ICR계 웅성 마우스 5마리로부터 주사기로 심채혈한 혈액 합계 6㎖를 실시예 35에서와 동일한 채혈기에 주사하였다.
주사기는 미리 0.2M의 수산화나트륨 수용액에 하루밤 침지하여 내독소를 실활시킨 후, 내독소-프리 물로 충분히 세정하였으며, 혈액중의 최종농도가 10 U/㎖로 되도록 헤파린을 미리 첨가한 것을 사용하였다.
그런 다음, 상기 채혈용기의 스토퍼에 복합주사바늘의 한쪽 바늘부분을 찔러넣고, 그의 다른쪽 바늘부분은 실시예 36 및 비교예 7~9의 반응용기의 스토퍼에 순서대로 찔러넣어 각각에 채혈된 혈액을 300㎕씩 분주하였다.
그 다음, 각각의 반응용기를 교반하면서 37℃에서 4시간 보존하였다. 그 후, 4℃에서 원심분리(1600G, 10분)하여 혈장을 모았다. 혈장중의 TNFα의 양을Genzyme사 제품인, 상품명 「FACTOR TEST MOUSE TNFα ELISA KIT」를 사용하여 측정하였고, 각각의 평균값을 구하였고, 변동계수(%)(변동계수는, (표준편차/평균값) × 100을 나타낸다)도 구하여 표 5에 나타내었다.
TNFα 생성량
평균값(pg/㎖) 변동계수(%)
실시예 36 1036 3.7
비교예 7 5610 23.7
비교예 8 1078 15.1
비교예 9 2961 10.5
표 5에서 보는 바와 같이, TNFα 생성(유도)량에서 가장 작은 변동(변동계수)은 LPS-프리 채혈관에 이미 알고 있는 양의 LPS를 첨가한 실시예 36의 반응용기를 사용하는 경우이었다.
이상의 결과로부터, 환자의 병상 등을 보다 정확하게, 그리고 간단하게 파악할 수 있는 측정법을 확립하기 위해서는, 채혈된 혈액을 불필요하게 자극하지 않고 채혈에서 측정할 때까지 보존하는 것이 필수적인 것으로 믿어진다. 이를 위하여, LPS 함량이 생리활성물질을 생성(유리 또는 유도)하지 않는 양이고, 내부가 감압되어 있는 채혈용기로 채혈하는 것이 중요하다는 것을 명백히 알 수 있다.
또, 혈액세포 기능을 정확하게 측정하기 위해서는, 측정치에 영향을 미치는 양의 내독소로 오염되지 않은 채혈용기를 사용할 필요가 있으며, 자극물질이 일정량 수용된 반응용기에 채혈된 혈액을 분주하여 혈액과 자극물질을 반응시켜서 생성(유리 또는 유도)된 생리활성물질을 측정할 필요가 있음을 명백히 알 수 있다.
실시예 37
유리로 만들어진 기구 및 용기는 250℃에서 2시간 이상 건열처리한 것을, 플라스틱으로 만들어진 기구 및 용기는 0.2M의 수산화나트륨 수용액에 하루밤 침지하여 내독소를 실활시킨 후 내독소-프리 물로 충분히 세정한 것을 사용하였다. 또, 조작은 클린 벤치(clean bench)내에서 행하였다.
헤파린나트륨(和光純藥社 제품) 10000 Unit을 주사용 생리식염수(大塚製藥社 제품) 10㎖에 용해시켰다. 이 용액을 한외여과기 CENTRIPREP-100(분획분자량 10만, Amicon Co. 제품)을 사용하여 4℃, 500G에서 1시간동안 원심한외여과하였다. 한외여과기는, 미리 0.2M의 수산화나트륨 수용액에 하루밤 침지하여 내독소를 실활시킨 후 내독소-프리 물로 충분히 세정한 것을 사용하였다.
위에서 한외여과처리한 헤파린나트륨 용액중의 내독소 함량을 ENDOSPECIE- ES6(生化學工業社 제품)을 사용하여 측정하였다. 그 결과, 이 헤파린나트륨 용액중의 내독소 함량은 0.01 EU/헤파린 Unit이었다.
그 다음, 한외여과처리한 헤파린나트륨 용액(1000 U/㎖) 0.1㎖를 10㎖ 채혈용 주사기(Terumo Co., 제품)에 도입하고, 평소 건강한 지원자로부터 10㎖ 채혈하였다(최종 혈액중의 헤파린 농도 : 약 10 U/㎖). 채혈직후의 혈액과, 이를 37℃의 항온조에서 2시간 및 4시간 방치한 후의 혈액을 각각 4℃, 1600G에서 10분간 원심분리하여 상청의 혈장을 모았다.
얻은 혈장중의 TNFα, IL-1β, IL-6의 각 시토킨의 양을 각각의 모노클로날 항체를 이용한 효소면역 측정킷트를 사용하여 측정하였다. 즉, TNFα의 생성량의 측정은, 실시예 1~4의 (3)항에 기재된 방법에 따라 행하였다. 측정은 각 n=3으로하였으며, 이 평균값을 표 6에 나타내었다.
비교예 10
실시예 37에서, 헤파린나트륨을 한외여과처리하지 않은 것을 제외하고는, 동일한 방법으로 채혈을 행하였다. 혈장중의 TNFα, IL-1β, IL-6의 각 시토킨의 양을 각각의 모노클로날 항체를 이용한 효소면역 측정킷트를 사용하여 측정하였다. 측정은 각 n=3으로 하였으며, 이 평균값을 표 6에 나타내었다.
덧붙여, 비교예 10에 사용된 상기한 헤파린나트륨 용액중의 내독소 함량을 실시예 37에서와 동일한 방법으로 측정하였으며, 결과는 1.2EU/헤파린 Unit이었다.
채혈직후(pg/㎖) 2시간 후(pg/㎖) 4시간 후(pg/㎖)
실시예 37 TNFα 35이하 35이하 35이하
IL-1β 15이하 15이하 15이하
IL-6 35이하 35이하 35이하
비교예 10 TNFα 35이하 2850±298 6580±596
IL-1β 15이하 548±42 3490±412
IL-6 35이하 1225±179 4865±329
표 6으로부터 명백한 바와 같이, 내독소 함량이 한외여과에 의해 0.01EU/헤파린 Unit으로 감소된 헤파린나트륨 용액을 사용한 반응계(혈액중의 내독소 농도 : 약 0.1 EU/㎖)에서는, 채혈에서부터 4시간이 경과할 때까지 TNFα, IL-1β, IL-6는 감지할 수 있는 양으로 생성되지 않았다. 반면, 미처리 헤파린나트륨에서는 내독소 함량이 1.2EU/헤파린 Unit(혈액중의 내독소 농도 : 약 12 EU/㎖)이었기 때문에, 내독소에 의해 혈액중에 경시적으로 TNFα, IL-1β, IL-6가 생성되었다.
실시예 38~40
유리로 만들어진 기구 및 용기는 250℃에서 2시간 이상 건열처리한 것을, 플라스틱으로 만들어진 기구 및 용기는 0.2M의 수산화나트륨 수용액에 하루밤 침지하여 내독소를 실활시킨 후 내독소-프리 물로 충분히 세정한 것을 사용하였다. 또, 조작은 클린 벤치내에서 행하였다.
실시예 37에서 조제한 내독소 함량이 0.01EU/헤파린 Unit인 헤파린나트륨을 10 Unit 함유한 용액 0.01㎖을, 폴리에틸렌 테레프탈레이트로 만들어진, 내독소-프리의 5㎖ 채혈관(직경 12.6×75㎜, 積水化學工業社 제품)에 첨가하였다.
그런 다음, 대장균 UKT-B 유래의 일본약국방 표준품 내독소(16000EU/바이알) 1.6㎖를 주사용 생리식염수에 용해시켜 단계적으로 희석시킨 후, 헤파린나트륨이 들어있는 채혈관에, 채혈관 1개당 최종 혈액중 내독소 농도가 각 0.1, 0.2, 0.4 EU/㎖로 되도록 첨가하였다.
그런 다음, 채혈관의 직경에 합치되도록 구성된 부틸고무제 스토퍼를 상기한 채혈관의 개구부에, 개구부를 밀봉하지 않도록 가볍게 탑재시킨 후, 감압용 용기내에 배치하여 혈액 1㎖를 흡인할 수 있는 압력으로 감압되었을 때, 채혈관의 개구부를 밀봉하였다.
그런 다음, 평소 건강한 지원자로부터 진공채혈에 의해 상기 채혈관에 1㎖씩 채혈하였다. 이를 미리 37℃로 보온해 놓은 항온기중의 락커 플랫폼에 탑재하여 4시간동안 텀블 믹싱하였다. 믹싱을 완료한 후, 각 채혈관을 4℃, 1600G에서 10분간 원심분리하여 상청의 혈장을 모았다.
얻은 혈장중의 TNFα, IL-1β, IL-6의 각 시토킨의 양을 실시예 37에서와 동일한 방법으로 측정하였다. 측정은 각 n=3으로 하였으며, 이 평균값을 표 7에 나타내었다.
비교예 11, 12
실시예 38에서와 동일하게 제조한 헤파린나트륨이 들어있는 채혈관에, 실시예 38에서 조제한 내독소의 생리식염수 용액을, 채혈관 1개당 최종 혈액중의 내독소 각 0.5, 1.0 EU/㎖로 되도록 첨가하는 것을 제외하고는 동일하게 채혈을 행하였다. 혈장중의 TNFα, IL-1β, IL-6의 각 시토킨의 양을 실시예 37에서와 동일한 방법으로 측정하였다. 측정은 각 n=3으로 하였으며, 이 평균값을 표 7에 나타내었다.
혈액중의 내독소 농도(EU/㎖) TNFα(pg/㎖) IL-1β(pg/㎖) IL-6(pg/㎖)
실시예 38 0.1 35이하 15이하 35이하
39 0.2 35이하 15이하 35이하
40 0.4 35이하 15이하 35이하
비교예 11 0.5 485 ±29 154 ±12 189 ±21
12 1.0 3560 ±398 1548 ±162 2225 ±279
표 7로부터 명백한 바와 같이, 혈액중의 내독소 함량이 0.5EU/㎖ 이상인 경우에는, TNFα, IL-1β, IL-6의 생성이 유도된다.
실시예 41
<세포기능 측정 킷트의 제조방법>
제 1 세포기능 측정용 용기는, 실시예 1에서 제작한 내독소 함량이 0.05EU이하인 채혈관에, 헤파린나트륨(Novo·Nordisk A/S Co., 상품명 : NOVO·HEPARIN #1000)을 200U/㎖로 되도록 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)로 희석시킨 헤파린나트륨 용액을, 상기 채혈관에 농도가 10 Unit이 되도록 0.05㎖ 첨가하고, 감압건조한 후, 스토퍼를 채혈관의 개구부에, 개구부를 밀봉하지 않도록 가볍게 탑재시킨후, 감압용 용기내에 배치하여 혈액 1㎖를 흡인할 수 있는 압력, 즉 570㎜Hg로 감압되었을 때, 채혈관의 개구부를 밀봉하여 제조하였다.
제 2 세포기능 측정용 용기는, 실시예 1에서 제작한 내독소 함량이 0.05EU이하인 채혈관에, 헤파린나트륨(Novo·Nordisk A/S Co., 상품명 : NOVO·HEPARIN #1000)을 200U/㎖로 되도록 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)로 희석시킨 헤파린나트륨 용액을, 상기 채혈관에 농도가 10 Unit이 되도록 0.05㎖ 첨가한 후, 대장균 055:B5 유래의 내독소(LBL社 제품)를 내독소-프리 물(大塚製藥社 제품)로 희석시켜 얻은 2000EU/㎖의 용액을 0.05㎖ 첨가하고, 감압건조한 후, 스토퍼를 채혈관의 개구부에, 개구부를 밀봉하지 않도록 가볍게 탑재시킨 후, 감압용 용기내에 배치하여 혈액 1㎖를 흡인할 수 있는 압력, 즉 570㎜Hg로 감압되었을 때, 채혈관의 개구부를 밀봉하여 제조하였다.
제 1, 제 2의 TNFα 측정시약은 다음과 같이 제조하였다.
항-인간 TNFα 모노클로날 항체(Genzyme社 제품)를 0.1M의 탄산완충액(pH9.5)으로, 100ng/㎖(제 1의 TNFα 측정시약용, 즉 고감도 측정용, 고정화 항체액) 및 1㎍/㎖(제 2의 TNFα 측정시약용, 즉 저감도 측정용, 고정화 항체액)로 되도록 희석시켜서 얻은, 각 희석액을 100㎕씩 96웰 마이크로플레이트(Nunc MaxiSorp microtiter plates)의 각 웰에 첨가하고, 2~8℃에서 하루낮, 하루밤 보온하였다. 그 다음, 트윈 20을 0.05중량% 함유한 인산염 완충액(pH7.3)으로 각 웰을 3회 흡인세정하였다. 그런 다음, 보빈 혈청 알부민(Sigma社 제품)을 4중량% 함유한 인산염 완충액(pH7.3)을 250㎕씩 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간동안 보온하였다. 그 다음, 마이크로플레이트의 각 웰로부터 용액을 제거한 후, 각 웰을 실온에서 건조시켰다.
또, 검량선용 인간 TNFα(Genzyme社 제품), 비오틴-표식 항-인간 TNFα 폴리클로날 항체(Genzyme社 제품), 과산화수소, 테트라메틸벤지딘을 함유한 기질용액(KPL社 제품)에 대해서는 시판되고 있는 시약을 사용하였다. 또, 세정액으로서는, 트윈 20을 0.05중량% 함유한 인산염 완충액(pH7.3)을 사용하였고, 반응정지액은 2M의 황산용액을 조제하여 사용하였다.
<TNFα의 생성능의 측정>
평소 건강한 지원자로부터, 주사바늘이 부착된 주사기를 사용하여 헤파린 채혈을 하였고, 이 주사바늘을 상기 제 1, 제 2의 세포기능 측정용 용기의 부틸고무제 스토퍼 부분에 찔러넣어서 반응용기내에 검체 혈액 1㎖를 주사하였다. 그런다음, 미리 37℃로 보온해 놓은 항온기중의 텀블 믹싱용 락커 플랫폼에 혈액을 채취한 각 용기를 탑재하여 4시간동안 텀블 믹싱하였다. 믹싱을 완료한 후, 각 용기를 4℃, 1600G에서 10분간 원심분리하여 상청의 혈장을 모았다. 제 1 세포기능 측정용 용기로부터 모은 혈장을 웰 4개에 분주하여 혈장중의 TNFα의 양을 상기한 고감도 측정시약을 사용하여 실시예 1의 (3)의 방법으로 측정하였다. 또, 제 2 세포기능 측정용 용기로부터 모은 혈장을 웰 4개에 분주하여 혈장중의 TNFα의 양을 상기한 저감도 측정시약을 사용하여 실시예 1의 (3)의 방법으로 측정하였다.
비교예 13
실시예 41에서와 동일한 방법으로, 제 1, 제 2의 세포기능 측정용 용기에서TNFα 생성을 유도하였으며, 각각의 용기로부터 모은 혈장을 웰 4개에 분주하여 혈장중의 TNFα의 양을 측정감도가 15~1000pg/㎖의 시판 킷트(PREDICTA Human TNFα ELISA KIT)를 사용하여 측정하였다. 측정치가 시판 킷트의 측정한계를 초과한 경우에는, 보빈 혈청 알부민(Sigma社 제품)을 1중량% 함유한 인산염 완충액(pH7.3)으로 약 5배 희석하여 다시 측정한 후, 희석배수를 곱하여 측정치로 하였다.
실시예 41 및 비교예 13의 결과를 하기의 표 8에 나타내었다.
실시예 41혈장중 TNFα 농도 (pg/㎖) : 평균값±SD, CV(%)
No. 1 No. 2 No. 3 No. 4
제 2 세포기능 측정용 용기 3870±280,7.2 2570±180,7.0 4870±380,7.8 4520±340,7.5
제 1 세포기능 측정용 용기 검출한계이하 검출한계이하 검출한계이하 검출한계이하
비교예 13혈장중 TNFα 농도 (pg/㎖) : 평균값±SD, CV(%)
No. 1 No. 2 No. 3 No. 4
제 2 세포기능 측정용 용기 2520±400,15.8 2070±310,14.9 4510±620,13.7 4020±780,19.4
제 1 세포기능 측정용 용기 검출한계이하 검출한계이하 검출한계이하 검출한계이하
표 8 중의 CV는 변동계수를 나타낸 것이다.
표 8의 결과로부터 명백한 바와 같이, 시판 킷트는 희석조작을 하기 전에는 제 2 세포기능 측정용 용기에서 유도된 TNFα의 양을 측정하는데에 사용할 수 없음을 알 수 있다. 또, 실시예에서 변동계수가 약 7%정도로 재현성이 우수하며, 반면 시판 킷트는 희석된 후의 재측정의 결과, 변동계수가 약 15~20%로 재현성이 불량하다.
본원의 제 1 발명에 따르면, 혈액세포가 생성하는 생리활성물질을 측정하는데에 사용되는 세포기능 측정용 용기에 있어서, 측정해야 할 액체량과 동량의 물을 취하여 추출하였을 때의 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료의 함량이, 혈액세포로부터 생리활성물질의 생성을 유도할 수 없는 양으로 제한되어 있음을 특징으로 하기 때문에, 채혈에서 측정을 행할 때까지 혈액에 불필요한 자극을 가하지 않으면서 장시간 보존할 수 있다. 이 때문에, 채혈된 혈액중의 생리활성물질을 정확하게 측정할 수 있고, 각종 질환의 환자의 병상을 정확하게 파악할 수 있다.
또, 제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기를 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기와 조립하여 사용함으로써, 제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기를 대조값(control value)을 얻는데에 적합하게 사용할 수 있다.
제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기에서, 상기한 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료가 내독소인 경우에는, 바람직하게는 사용전의 세포기능 측정용 용기 중의 내독소의 함량이, 측정해야 할 액체량과 동량의 물을 취하여 추출했을 때의 추출액중의 농도로서 0.5EU/㎖ 이하이기 때문에, 용기중의 내독소 함량에 의한 방해를 받지 않을 수 있고, 혈액중의 생리활성물질을 보다 정확하게 측정할 수 있다.
또, 본원의 제 2 발명에서는, 혈액과의 접촉에 의해 혈액중에 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료가 혈액과 접촉가능한 상태로 수납되어 있으며, 사용전의 용기 자체의 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료의 함량이, 생리활성물질의 측정치에 영향을 미치지 않도록 제한되어 있기 때문에, 혈액을 도입하고,생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료와 접촉하여 생리활성물질을 생성하는 경우, 생성된 생리활성물질의 양을 보다 정확하게 측정하는 것이 가능하다.
또, 본원의 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기에서, 상기한 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료가 내독소인 경우, 바람직하게는 내독소가 혈액과 접촉할 때의 전체 액체중의 내독소의 농도가 0.6~100000 EU/㎖의 범위로 제한되어 있기 때문에, 혈액을 도입하고, 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료와 접촉하여 생리활성물질을 생성하는 경우, 생성된 생리활성물질의 양을 보다 정확하게 측정할 수 있다.
제 1, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기에 있어서, 혈액 항응고제를 더 수납한 경우에는, 각 세포기능 측정용 용기에서의 혈액의 응고를 확실하게 방지한다.
또, 상기한 혈액 항응고제 중의 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료의 함량이 혈액과 혼합하였을 때 생리활성물질을 생성하지 않는 양이므로, 혈액 항응고제중의 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 재료에 의한 영향을 받지 않고, 생성된 생리활성물질을 높은 정확도로 측정할 수 있다.
또, 제 1, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기에 있어서, 용기내부를 감압으로 한 경우는, 혈액을 세포기능 측정용 용기에 용이하게 도입하는 것이 가능하다. 따라서, 피험자로부터 혈액을 채혈한 후, 피펫 등의 수단으로 혈액을 수동으로 다양한 반응용기에 이동시키거나, 세포분리, 세포배양 등의 조작을 필요로 하지 않기 때문에, 시험자는 간염, AIDS 등의 다양한 감염증에 감염될 위험성도 없다. 또,사용전의 용기중의 내독소 함량이 제한되고, 혈액시료중에 다양한 세균 또는 먼지 등이 혼입될 가능성이 없기 때문에, 이들 오염물질 또는 조작에 의해 혈액중의 세포의 불필요한 활성화 또는 활성저하를 일으킬 문제도 없다. 또, 전체 혈액을 사용하기 때문에, 세포분리, 세포배양, 현미경 측정 등의 특수한 기술도 필요하지 않으며, 측정시간도 단축할 수 있고, RI 시설 또는 플로우 사이토미터 등의 고가인 장치도 필요하지 않다. 이 때문에, 종래보다 조작이 간단하며, 위험성이 적고, 높은 정확도로 세포기능을 측정할 수 있다.
제 1, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기와, 생성 유도된 생리활성물질의 양을 정량할 수 있는 시약을 구비한 본 발명에 따른 세포기능 측정용 킷트에서는, 상기한 정량가능한 시약을 사용하여 세포기능 측정용 용기내에서 생성된 생리활성물질을 용이하게 정량할 수 있다.
또, 본원의 제 3 발명에서는, 상기 제 1 발명에 따른 세포기능 측정용 용기와, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기와, 생리활성물질을 정량하기 위한 정량시약을 구비하고 있기 때문에, 혈액을 제 1, 제 2의 세포기능 측정용 용기내에 도입하여 상기 정량시약을 사용하여 정량할 때에, 제 1 세포기능 측정용 용기에서 대조값을 얻을 수 있고, 제 2 세포기능 측정용 용기에서 생리활성물질-유도 재료에 의해 생성된 혈액중의 생리활성물질의 양에 따른 측정값을 얻을 수 있으며, 따라서 혈액중의 생리활성물질의 양을 더욱 더 정확하게 측정하는 것이 가능하다.
이 경우, 제 1, 제 2의 세포기능 측정용 용기에 대응하여, 각각 감도가 다른 제 1, 제 2 효소면역 측정시약을 사용함으로써, 생성된 생리활성물질을 보다 정확하게 측정할 수 있다.
또, 제 3 발명에 따른 세포기능 측정용 킷트에 있어서, 생리활성물질-유도 재료가 내독소인 경우, 제 2 세포기능 측정용 용기중의 내독소 함량을, 혈액과의 접촉시의 전체 액체중의 내독소 농도가 0.6~100000 EU/㎖의 범위에 있도록 제한함으로써, 내독소가 혈액과 접촉할 때에 혈액중에 생성된 생리활성물질을 매우 정확하게 측정할 수 있다.
본원의 제 4 발명에 따른 세포기능 측정방법에서는, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기에 혈액을 도입하고, 생리활성물질-유도 재료와 도입된 혈액을 접촉시켜서 생리활성물질의 생성을 유도하기 때문에, 즉, 제 2 발명에 따른 세포기능 측정용 용기중에서 내독소 함량이 상기한 바와 같이 제한되기 때문에, 혈액중에 생성된 생리활성물질의 양을 매우 정확하게 측정하는 것이 가능하다.
이 경우, 생리활성물질의 생성을 유도할 때의 온도를 26~45℃의 범위로 하고, 생리활성물질의 생성을 유도하는 시간을 1~6시간으로 함으로써, 혈액중에 생리활성물질의 생성을 확실히 유도할 수 있다.
제 4 발명에 따른 세포기능 측정방법에서는, 생성된 생리활성물질의 양을, 정량가능한 시약에 의해 정량함으로써, 혈액중에 생성된 생리활성물질의 양을 확실하고 용이하게 측정하는 것이 가능하다.

Claims (18)

  1. 세포의 기능을 측정하기 위한 키트로서;
    혈액세포가 생성하는 생리활성물질을 측정함으로써 세포기능을 측정하는 제 1 세포기능 측정용 용기로서, 상기 용기는, 제 1 용기 재료로 만들어지며 제 1 용기의 내부공간을 한정하는 적어도 하나의 벽 및 상기 용기 재료 자체에 함유되어 있는 제 1 유도물질(inducer)을 포함하되, 상기 제 1 유도물질은 상기 생리활성 물질의 생성을 유도할 수 있으며, 그 양은 상기 세포기능 측정을 위한 부피만큼의 수용성 액체가 상기 제 1 용기에 도입되었을 때 상기 수용성 액체에서 상기 유도물질의 농도가 혈액세포에 의하여 생리활성물질의 생성을 유도할 수 없는 양으로 제한되어 있는 대조값용 제 1 세포기능 측정용 용기;
    제 2 세포기능 측정용 용기로서, 상기 제 2 용기는 상기 제 1 용기와 동일한 구조를 가지며, 제 2 용기 재료로 만들어지며 제 2 용기의 내부공간을 한정하는 적어도 하나의 벽, 상기 제 2 용기 재료 자체에 함유되어 있는 제 1 유도물질의 제 1 양 및 제 2 용기의 내부공간에 있는 제 1 유도물질이나 제 2 용기 재료에서 기인한 제 2 유도물질에 의한 제 2양을 포함하되, 상기 유도물질은 혈액과 접촉하여 혈액중에 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있으며, 상기 제 2양이 존재하지 않는 상태에서 상기 세포기능 측정을 위한 부피만큼의 수용성 액체가 상기 제 2 용기에 도입되었을 때, 상기 수용성 액체에서 상기 유도물질의 농도가 혈액세포에 의하여 생리활성물질의 생성을 유도할 수 없는 양으로 제한되어 있으며, 제 2양은 혈액이 상기용기에 도입되었을 때, 상기 유도물질의 농도가 혈액세포에 의하여 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 양으로 제한되어 있는 제 2 세포기능 측정용 용기; 및
    생리활성물질을 정량하기 위한 정량시약;
    을 포함하며, 상기 제 1 및 제 2 용기 각각은 개구부(opening) 및 상기 개구부를 조절하는 스토퍼(stopper)가 있으며, 상기 스토퍼는 혈액을 채혈할 때 제거되지 않는 것을 특징으로 하는 세포기능 측정용 킷트.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 정량시약이,
    상기 제 1 세포기능 측정용 용기에 도입된 상기 수용성 액체 중의 생리활성물질의 양을 측정하기 위한 제 1 효소면역 측정에 사용되는 제 1 정량시약으로서, 상기 효소는 상기 효소면역 측정에서 표식(label)으로로 기능하고, 상기 수용성 액체는 혈액인 것을 특징으로 하는 제 1 정량시약과;
    상기 제 2 세포기능 측정용 용기에서 상기 유도물질(inducer)에 의하여 생산되는 생리활성물질의 양을 측정하기 위한 제 2 효소면역 측정에 사용되는 제 2 정량시약으로서, 상기 효소는 상기 효소면역 측정에서 표식(label)으로로 기능하고, 상기 생리활성물질의 양을 측정하는데 있어서, 상기 제 2 효소면역 측정의 감도는 상기 제 1 효소면역 측정의 감도와 다른 것을 특징으로 하는 제 2 정량시약;
    을 포함함을 특징으로 하는 세포기능 측정용 킷트.
  3. 제 1항에 있어서, 생리활성물질의 생성을 유도할 수 있는 상기 제 1 및 제 2유도물질은 내독소(endotoxin)이며, 상기 제 2 세포기능 측정용 용기에서 혼합된 상기 유도물질의 농도가 0.6~100000 EU/㎖의 범위에 있음을 특징으로 하는 세포기능 측정용 킷트.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 기재된 세포기능 측정용 킷트의 제 1, 제 2의 세포기능 측정용 용기에 혈액을 도입하여 생리활성물질의 생성을 유도하는 것을 특징으로 하는 세포기능 측정방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기한 생리활성물질이 26~45℃의 온도에서 유도됨을 특징으로 하는 세포기능 측정방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기한 생리활성물질이 1~6시간동안 유도됨을 특징으로 하는 세포기능 측정방법.
  7. 제 5항에 있어서, 상기한 생리활성물질이 1~6시간동안 유도됨을 특징으로 하는 세포기능 측정방법.
  8. 제 4항에 기재된 방법에 의해 유도된 생리활성물질의 양을 정량가능한 시약으로 정량함을 특징으로 하는 세포기능 측정방법.
  9. 제 5항 내지 8항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 유도된 생리활성물질의 양을 정량가능한 시약으로 정량함을 특징으로 하는 세포기능 측정방법.
  10. 제 1항에 있어서, 내부에 혈액 항응고제를 더 포함함을 특징으로 하는 세포기능 측정용 킷트.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 또는 제 2 용기의 내부공간이 상압보다 감압되어 있음을 특징으로 하는 세포기능 측정용 킷트.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 생리활성물질이 시토킨(cytokine)임을 특징으로 하는 세포기능 측정용 킷트.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 생리활성물질이, 종양괴사인자 α(tumor necrosis factor α), 인터류킨-1β(interleukin-1β) 및 인터류킨-6으로부터 선택된 적어도 1종 이상임을 특징으로 하는 세포기능 측정용 킷트.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 용기의 내부공간 및 상기 제 2 용기의 내부공간이 상압보다 감압되어 있음을 특징으로 하는 세포기능 측정용 킷트.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 상기 제 1 용기 및 제 2 용기 중 적어도 하나는 내부에 혈액 항응고제를 더 포함하고 있음을 특징으로 하는 세포기능 측정용 킷트.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 유도물질은 내독소(endotoxin)이며, 각각의 용기 재료 자체에 포함된 상기 내독소의 양은 0.5 EU/㎖를 넘지 않는 것을 특징으로 하는 세포기능 측정용 킷트.
  17. 제 2, 3, 14 및 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생리활성물질이 시토킨(cytokine)임을 특징으로 하는 세포기능 측정용 킷트.
  18. 제 2, 3, 14 및 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생리활성물질이, 종양괴사인자 α(tumor necrosis factor α), 인터류킨-1β(interleukin-1β) 및 인터류킨-6으로부터 선택된 적어도 1종 이상임을 특징으로 하는 세포기능 측정용 킷트.
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