JP2000081438A

JP2000081438A - 被験者の癌化学療法による免疫機能低下の測定方法

Info

Publication number: JP2000081438A
Application number: JP11168478A
Authority: JP
Inventors: Koji Kobayashi; 幸司小林
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1998-06-25
Filing date: 1999-06-15
Publication date: 2000-03-21

Abstract

(57)【要約】【課題】従来法より精度良く操作が簡単で危険性がな
い、被験者の癌化学療法による免疫機能低下の測定方法
を提供する。【解決手段】使用前の測定容器中のエンドトキシン含
量が、測定しようとする液量に等しい水を採取して抽出
を行ったときの抽出液中の濃度として、０．５ＥＵ／ｍ
ｌ以下とされている測定容器に血液を採取し、血液と接
触させることにより該血液中に生理活性物質の産生を誘
導する材料と反応させ、該血液中に産生される生理活性
物質の量を測定することを特徴とする被験者の癌化学療
法による免疫機能低下の測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、被験者の癌化学療
法による免疫機能低下の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、種々の癌の治療は、主として、外
科手術、放射線療法及び種々の抗癌剤による化学療法に
よって行われている。しかしながら、現在の抗癌剤によ
る化学療法では、抗癌剤が癌細胞だけでなく、副作用と
して骨髄などの造血器官をも傷害することによって、患
者の免疫機能が低下し、その結果、肺炎などの種々の感
染症に罹り、しばしば重篤な事態に陥ることが大きな問
題点となっている。そのため、癌化学療法においては、
患者の免疫機能のモニタリングが重要である。

【０００３】従来、上記の癌化学療法における免疫機能
のモニタリングは、主として末梢血液中の白血球数を測
定することによって行われてきたものの、患者の免疫機
能低下の指標として、あまり鋭敏ではなかった。

【０００４】また、従来、被験者の免疫機能の指標とし
て、末梢血液からリンパ球を分離し、レクチンで刺激し
たときのリンパ球の増殖度合いを測定するリンパ球幼若
化試験が行われてきた。しかしながら、この方法は、血
液からリンパ球を分離し、３〜４日培養するため、熟練
した技術が必要であり、測定結果を得るまで時間がかか
るため、癌化学療法による治療モニタリングとしては不
適当であった。

【０００５】生体の免疫機能は、主に顆粒球、単球、マ
クロファージ、リンパ球等の白血球によって担われてお
り、近年、これらの細胞が産生する種々のサイトカイン
等の生理活性物質が生体の免疫機構の恒常性を保つ上で
重要であることが解ってきている。そのため、これらの
細胞の上記生理活性物質の産生機能の測定は、癌化学療
法による免疫機能低下の指標として重要であると考えら
れる。

【０００６】上記白血球の機能を測定する方法として、
血液や血液から分離した白血球からのサイトカイン産生
機能を調べる種々の方法が報告されている。例えば、特
表平０１−５０３３３１号公報、特開平０２−１９６９
６１号公報、特開平０３−２８５６９２号公報には血液
にリポ多糖やレクチンを反応させ、産生誘導されたＴＮ
Ｆ−α、ＩＬ−１β等のサイトカインを測定する方法が
開示されている。また、特開平０６−２０９９９２号公
報、特開平０７−６７９５５号公報には、特定の表面粗
さを有する高分子材料や特定の化学構造を有する高分子
材料と血液とを接触させ、ＴＮＦ−αの産生を誘導する
方法が開示されている。また、特開平０７−２９９７３
２号公報、特開平０７−１５１７５２号公報には、特定
の表面粗さを有する高分子材料と血液とを接触させ、Ｔ
ＮＦ−α、ＩＬ−１βの産生量を測定する生体反応検査
方法が開示されている。

【０００７】また、上記のサイトカイン産生機能に対す
る種々の薬剤の効果を試験する方法が報告されている。
例えば、特表平０７−５００９０５号公報には、ヒト末
梢血白血球からのサイトカインの産生に対する免疫調節
物質の活性を測定する方法が開示されている。

【０００８】しかしながら、血液を採取し、特定の測定
容器内において、サイトカインの産生量を測定する場
合、例えば、注射器のような血液採取器や測定容器、あ
るいは刺激剤として用いられる抗原の中に元々、グラム
陰性菌由来のエンドトキシン（ＬＰＳ）が混入している
場合に、正確な測定が困難になることが従来法の大きな
問題点であった。エンドトキシンは、極微量で白血球か
ら種々のサイトカインの産生を誘導するため、例えば、
製造工程での微量の埃の混入、使用する洗浄水からの汚
染により、少量のエンドトキシンが上記血液採取器や測
定容器、あるいは刺激剤として用いられる抗原に混入し
た場合、信頼できる測定結果を得ることは不可能であ
る。例えば、「Ｃｙｔｏｋｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏ
ｎｂｙｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ
ｔｉｍｕｌａｔｅｄｈｕｍａｎｂｌｏｏｄｃｅｌ
ｌｓ：Ｅｆｆｅｃｔｏｆｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅ
ｒｏｉｄｓ，ＴＣｅｌｌｉｍｍｕｎｕｎｏｓｕｐ
ｐｒｅｓｓａｎｔｓａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔ
ｅｒａｓｅ４ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」Ｊ．Ｖａ
ｎＷａｕｗｅ，Ｆ．Ａｅｒｔｓ，Ｈ．Ｗａｌ
ｔｅｒａｎｄＭ．ｄｅＢｏｅｒ，Ｉｎｆｌａｍ
ｍＲｅｓ４４，４００−４０５（１９９５）に
は、刺激剤として用いたｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔ
ｉｎｉｎに混入したエンドトキシンが、ＩＬ−２、ＩＬ
−５、γ−ＩＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦの産生量に大きく影響
することが報告されている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記問題点に
鑑みてなされたものであり、その目的は、従来法の欠点
を解決し、従来法より精度良く操作が簡単で危険性がな
い、被験者の癌化学療法による免疫機能低下の測定方法
を提供することである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の被験者の
癌化学療法による免疫機能低下の測定方法は、使用前の
測定容器中のエンドトキシン含量が、測定しようとする
液量に等しい水を採取して抽出を行ったときの抽出液中
の濃度として、０．５ＥＵ／ｍｌ以下とされている測定
容器に血液を採取し、血液と接触させることにより該血
液中に生理活性物質の産生を誘導する材料と反応させ、
該血液中に産生される生理活性物質の量を測定すること
を特徴とする被験者の癌化学療法による免疫機能低下の
測定方法である。

【００１１】請求項２記載の被験者の癌化学療法による
免疫機能低下の測定方法は、血液と接触させることによ
り該血液中に生理活性物質の産生を誘導する材料が、予
め血液と接触可能な状態に収納されていることを特徴と
する請求項１記載の被験者の癌化学療法による免疫機能
低下の測定方法である。

【００１２】請求項３記載の被験者の癌化学療法による
免疫機能低下の測定方法は、血液と接触させることによ
り該血液中に生理活性物質の産生を誘導する材料がエン
ドトキシンであり、該エンドトキシンの血液と接触させ
た際の全液中の濃度が、０．６〜１０００００ＥＵ／ｍ
ｌとなるようにされていることを特徴とする請求項１又
は２記載の被験者の癌化学療法による免疫機能低下の測
定方法である。

【００１３】請求項４記載の被験者の癌化学療法による
免疫機能低下の測定方法は、測定容器内が減圧にされて
いることを特徴とする請求項１、２又は３記載の被験者
の癌化学療法による免疫機能低下の測定方法である。

【００１４】請求項５記載の被験者の癌化学療法による
免疫機能低下の測定方法は、血液中に産生される生理活
性物質の量を酵素免疫測定により定量することを特徴と
する請求項１、２、３又は４記載の被験者の癌化学療法
による免疫機能低下の測定方法である。

【００１５】本発明で用いられる生理活性物質の産生を
誘導する材料は、血液細胞、特に顆粒球、単球、マクロ
ファージ、リンパ球等の白血球と反応し、これらの細胞
の活性化を促し、サイトカイン等の誘導を引き起こす材
料であり、従来、上記細胞の活性化物質として知られる
種々の材料が用いられる。例えば、ＢＣＧ死菌やコリネ
バクテリウム属などの種々の微生物、合成リピドＡ、ピ
ランコポリマー、レクチン（フィトヘマグルチニン、コ
ンカナバリンＡ、ポークウィードマイトゲン等）、ＯＫ
４３２（ピシバニール）、ＰＳＫ（クレスチン）、レン
チナン、ザイモザン、エンドトキシン（ＬＰＳ）、カル
シウムイオノフォア、ホルボルエステル、免疫グロブリ
ン固定化担体、ホルミルメチオニルロイシルフェニルア
ラニン（ＦＭＬＰ）等のホルミルペプチド、種々のサイ
トカイン等が挙げられる。特に、エンドトキシンが生理
活性物質の誘導活性が高く好適である。

【００１６】上記生理活性物質の産生を誘導する材料と
して、また、喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、アトピ
ー性皮膚炎、消化管アレルギー、寄生虫アレルギー等の
アレルゲン検査に用いられる特定抗原（ハウスダスト、
ダニ抗原；ブタクサ花粉抽出物、スギ花粉抽出物、イネ
花粉抽出物等の種々の花粉抗原；真菌抗原、アスカリス
抽出物等の寄生虫抗原；卵白アルブミン、小麦、大豆、
エビ、カニ、肉類等の食物抗原；ハチ毒等）が用いられ
る。また、これらの材料を種々の天然、合成高分子材料
に公知の固定化方法によって固定化した材料等が挙げら
れる。

【００１７】上記生理活性物質の産生を誘導する材料の
必要量としては、用いる材料ごとにその量を変化させ、
指標とする生理活性物質の誘導活性を測定して、その用
量反応曲線から最適量を設定する。例えば、エンドトキ
シン（ＬＰＳ）を生理活性物質の産生を誘導する材料と
して用い、指標とする生理活性物質としてＴＮＦ−αを
用いる場合には、血液中のエンドトキシン濃度として、
０．６〜１０００００ＥＵ／ｍｌとするのが好ましい。

【００１８】上記血液細胞から産生される生理活性物質
は、例えば、インターロイキンー１（ＩＬ−１）、ＩＬ
−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ
−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、リンフ
ォトキシン等のインターロイキン、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ
−β、ＩＮＦ−γ等のインターフェロン、コロニー刺激
因子、ＲＡＮＴＥＳ等の走化性因子などの種々のサイト
カインやＰＧＥ₂、ＰＧＩ₂等のプロスタグランジン、Ｌ
ＴＢ４、ＬＴＣ４等のロイコトリエン、一酸化窒素、活
性酸素、ヒスタミン、血小板活性化因子（ＰＡＦ）等の
種々のケミカルメディエーターが挙げられる。また、可
溶性ＩＣＡＭ１等の接着因子、可溶性ＩＬ−２レセプタ
ー等の可溶性サイトカインレセプターも挙げられる。特
に、ＴＮＦ−αは短時間で誘導されるため好適である。

【００１９】本発明でいう癌とは、頭・頚部癌、肺癌、
咽頭癌、食道癌、胃癌、大腸癌、膵臓癌、肝臓癌、乳
癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮癌、脳腫瘍、皮膚癌、骨肉
腫、白血病等現在臓器ごとに分類されている種々の癌を
言う。

【００２０】本発明の癌化学療法に用いられる抗癌剤
は、現在化学療法に用いられている種々の薬剤をいい、
例えば、シクロフォスファミド、イホスファミド、ニト
ロソウレア、タカルバジン、シスプラチン等のアルキル
化剤；メトトレキセート、５−フルオロウラシル、シタ
ラビン等の代謝拮抗剤；ビンクリスチン、ビンブラスチ
ン、ビンデシン等の植物アルカロイド；マイトマイシン
Ｃ、ドキソルビシン、ブレオマイシン等の抗癌性抗生物
質；プレドニゾロン、デキサメタゾン等のホルモン剤等
が挙げられる。

【００２１】本発明に用いられる測定容器のエンドトキ
シン含量は、採取血液量と同量のエンドトキシンフリー
水を該容器内に採取し、３７℃、１時間の条件で攪拌下
抽出を行ったとき、該抽出液中のエンドトキシン含量が
０．５ＥＵ（国際エンドトキシンユニット）／ｍｌ以下
である必要がある。なお、上記の抽出を行う際のエンド
トキシンフリー水の量は、上記のように測定しようとす
る採取血液量に全く等しい量である必要は必ずしもな
く、抽出が十分になされるなら測定しようとする採取血
液量未満であってもよいが、この場合であっても、抽出
液中のエンドトキシン含量が０．５ＥＵ／ｍｌ以下であ
る必要がある。

【００２２】後述の実験例から明らかなように、上記測
定容器のエンドトキシン含量が０．５ＥＵ／ｍｌを超え
ると、顕著にサイトカインの誘導を引き起こす。従っ
て、本発明による癌化学療法による被験者の免疫機能低
下の測定を正確に行うためには、使用前の測定容器のエ
ンドトキシン含量がサイトカインの誘導を引き起こさな
いレベルでなければならない。

【００２３】本発明でいうエンドトキシン含量の測定方
法は、第１３改正日本薬局方解説書「エンドトキシン試
験法」における発色合成基質の加水分解による発色を指
標とする比色法であり、例えば、市販品のエンドスペシ
ー（生化学工業社製）を用いて測定することができる。

【００２４】本発明において、エンドトキシンを除去も
しくは失活させる方法としては、加熱処理、酸、アルカ
リ処理による不活化やメンブレンフィルターによる限外
濾過法、アニオン性のキトサン系樹脂やエンドトキシン
に対して特異的に結合するポリミキシンＢ、エンドトキ
シンに対する抗体を固定化した吸着剤による除去方法
等、公知の種々の方法を用いることができる。本発明の
エンドトキシン以外の生理活性物質を誘導する材料や血
液抗凝固剤については、サイトカインの誘導を起こさな
いレベル以下にする際、加熱処理や酸、アルカリ処理に
よる不活化は、それらの活性を変化させる恐れがあるた
め、限外濾過法、吸着剤による除去方法が好ましい。ま
た、上記エンドトキシン除去操作に用いる器具、容器
は、ガラス製の場合には、２５０℃、１時間以上の乾熱
処理をし、プラスチック製の場合には、０．２Ｍ水酸化
ナトリウム水溶液に浸し、エンドトキシンフリー水で洗
浄し、エンドトキシンを失活させたものを用いる必要が
ある。また、水は、エンドトキシンフリー水を用いる必
要があり、操作環境はクリーンルーム等できる限り二次
的なエンドトキシンの汚染を防止できる環境で実施する
のが好ましい。

【００２５】本発明で用いられる測定容器の形状として
は、例えば、チューブ状、プレート状のものが挙げら
れ、チューブ状のものとして、採血管、試験管等が、プ
レート状のものとして、マイクロプレート等が挙げられ
る。

【００２６】上記測定容器のチューブ状のものとして
は、例えば、一端が開口し他端が閉塞してなる有底管体
であって、開口部が栓体によって閉塞可能なものが挙げ
られる。

【００２７】上記有底管体としては、例えば、反応後上
記生理活性物質を測定するための遠心分離操作に好適な
試験管状のものであって、サイズとしては、外径が、５
〜３０ｍｍ、高さ２０〜１５０ｍｍ程度のものが挙げら
れる。

【００２８】上記測定容器においては、該測定容器に血
液を入れる際に、二次的なエンドトキシンの汚染を引き
起こし、その結果、生理活性物質の誘導が起こり、正確
な測定ができなくなる恐れがあることから、該測定容器
に予め生理活性物質の産生を誘導する材料及び血液抗凝
固剤を添加し、所定の血液量を採取できるように減圧下
で密栓したものが好適である。

【００２９】上記測定容器の材質としては、例えば、プ
ラスチックやガラス等が挙げられる。

【００３０】上記プラスチックとしては、熱可塑性樹
脂、熱硬化性樹脂のいずれもが用いられる。

【００３１】上記熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリメチル
メタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフ
タレート、スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチ
レン−無水マレイン酸共重合体、スチレン−アクリル酸
共重合体、スチレン−メチルメタクリレート共重合体、
エチレン−プロピレン共重合体、エチレン−アクリル酸
共重合体、エチレン−アクリル酸エステル共重合体等が
挙げられる。

【００３２】上記熱硬化性樹脂としては、例えば、不飽
和ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、エポキシ−アクリ
レート樹脂等が挙げられる。

【００３３】上記測定容器のチューブ状のものにおいて
は、その内部を減圧に維持するために、通常、栓体を使
用する。上記栓体の材質としては、例えば、ブチルゴ
ム、塩素化ブチルゴム、熱可塑性エラストマー等が挙げ
られる。上記減圧の程度は、上記測定容器の中に常圧の
検体血液が吸入され得る程度の圧力であればよく、吸入
しようとする検体血液の量によって決められる。

【００３４】上記測定容器において、チューブ状のもの
を用いる場合は、採取する血液量は、測定容器の容積に
よって異なるが、通常４〜５ｍｌの容積の容器を用いる
場合であれば、０．５〜２ｍｌ程度でよい。また、マイ
クロプレート状のものを用いる場合の採取血液量は、５
０μｌ〜２ｍｌ程度でよい。

【００３５】上記測定容器中には、必要に応じて血液が
凝固しないように血液抗凝固剤を添加する必要がある。
上記血液抗凝固剤としては、ヘパリン化合物、クエン酸
化合物、シュウ酸化合物等が挙げられ、ヘパリンナトリ
ウム等が細胞の生物学的反応を阻害しないので好まし
い。上記ヘパリンナトリウムの該測定容器中の収容量と
しては、該測定容器に血液が収容されたときに、その血
液中の濃度が低くなると血液凝固の恐れがあり、高くな
ると細胞に不測の活性化や不活性化を起こす恐れがある
ので、４〜５０ｕ／ｍｌ、より好ましくは、８〜２０ｕ
／ｍｌになるように収容する。

【００３６】上記測定容器の製造方法としては、例え
ば、内部を減圧にすることが可能である容器に、上記生
理活性物質を誘導する材料及び血液抗凝固剤を加え、容
器を所定の減圧状態にした後、上記容器に栓をすること
によって製造する。上記測定容器は、エンドトキシンや
雑菌の混入をさけるため、できる限り、クリーンな環境
で製造されるのが好ましく、また、可能であれば、製造
後に公知の滅菌処理を施すのが好ましい。

【００３７】本発明の一実施態様として、上記内部を減
圧することが可能である測定容器に、上記生理活性物質
を誘導する材料及び血液抗凝固剤を加えることにより製
造した測定容器を用いて、被験者の癌化学療法による免
疫機能低下を測定する方法を以下に述べる。

【００３８】血管または採血容器と上記測定容器とを連
通させ、上記測定容器中に検体血液を吸入させる。次い
で、上記測定容器を適度に振とうしながら、血液細胞と
上記生理活性物質の産生を誘導する材料とを反応させ、
血液細胞からサイトカイン等の生理活性物質を産生させ
る。反応後、静置もしくは遠心分離により、血球と血漿
とに分離して、血液細胞から産生されたサイトカイン等
の生理活性物質の血漿中濃度をそれを定量可能な試薬に
より定量する。

【００３９】上記採血容器と上記測定容器を連通される
方法としては、例えば、マルチプル注射針（両端が搾針
でき、かつ連通されている採血針）を用いる方法や、採
血容器を注射針付きの注射筒としておき、上記注射針を
上記測定容器の栓体に突き刺す方法等が挙げられる。

【００４０】上記の血液と上記生理活性物質を誘導する
材料との反応温度は、上記生理活性物質の産生が効率的
に行われ、過度の溶血を引き起こさない温度である１５
〜４２℃が良く、より好ましくは、３０〜４０℃であ
る。反応時間は、上記生理活性物質の産生が効率的に行
われ、過度の溶血を引き起こさない反応時間である１〜
４８時間が良く、より好ましくは、２〜２４時間であ
る。

【００４１】本発明の血液細胞から産生されたサイトカ
イン等の生理活性物質の血漿中濃度の定量方法の一態様
を以下に詳述する。

【００４２】血液と上記生理活性物質を誘導する材料と
を上記測定容器の中で反応させ、生理活性物質を誘導
し、誘導後の血液を１６００Ｇで遠心して、血球成分と
血漿成分を分離させる。次いで、分離された血漿を、上
記生理活性物質に対するモノクローナル抗体を固定化し
たマイクロプレートのウェルに、ピペッティングにより
添加し、３７℃で２時間反応させる。次いで、反応後の
血漿液を吸引除去等の手段で廃棄し、さらに、未反応成
分を除くため、Ｔｗｅｅｎ２０等のノニオン系の界面活
性剤を含有する中性ｐＨの洗浄用緩衝液で上記ウェルを
洗浄する。次いで、西洋わさびペルオキシダーゼを固定
化した上記生理活性物質に対するポリクローナル抗体を
ピペッティングにより添加し、３７℃で１時間反応させ
る。次いで、未反応の西洋わさびペルオキシダーゼ固定
化抗体を除くため、上記ウェルを上記洗浄用緩衝液で洗
浄したあと、過酸化水素、テトラメチルベンジジンを含
む基質溶液を添加し、５〜１０分間反応させる。次い
で、１Ｍ硫酸溶液を添加し、反応を停止させて酵素反応
による基質の発色を４５０ｎｍの吸光度から測定する。
この測定値と既知濃度の上記生理活性物質を用いて作成
した検量線から、上記生理活性物質の産生誘導量を測定
する。

【００４３】本発明の被験者の癌化学療法による免疫機
能低下を測定する測定キットに使用される血液細胞から
産生される生理活性物質の測定試薬としては、誘導され
た上記生理活性物質の量を定量可能な試薬であれば、特
に限定されないが、例えば、定量しようとする生理活性
物質に対するモノクローナル抗体もしくはポリクローナ
ル抗体及びペルオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ等の酵素及び各々の酵素の発色基質などを利用した酵
素免疫測定方法が挙げられる。上記測定キットの使用方
法の１例としては、上述の、本発明の測定容器を用いて
被験者の癌化学療法による免疫機能低下を測定する１態
様を説明した方法と同様である。

【００４４】

【発明の実施の形態】次に、実施例、比較例を挙げて本
発明を詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例にの
み限定されるものではない。

【００４５】以下の実施例、比較例において、ガラス製
の器具、容器は２５０℃で２時間の乾熱処理を行い、プ
ラスチック製の器具、容器は市販のエンドトキシンフリ
ーのものを用いるか、予め、０．２Ｍ水酸化ナトリウム
水溶液に一晩浸してエンドトキシンを失活させ、十分に
エンドトキシンフリー水で洗浄したものを用いた。ま
た、操作はクリーンベンチ内で行った。

【００４６】実施例１測定容器としてエンドトキシンフリー（抽出液中のエン
ドトキシン含量が０．５ＥＵ／ｍｌ未満）のポリエチレ
ンテレフタレート製の５ｍｌの採血管（１２．６φ×７
５ｍｍ）（積水化学社製）を用いた。この測定容器に
Ｅ．ｃｏｌｉ０５５Ｂ５由来エンドトキシン（ＬＢＬ社
製）を１００ＥＵずつ添加して、減圧乾燥した。つい
で、管径に合うブチルゴム製の栓体を試験管の開口部
に、開口部を密栓しないように、軽く載せたあと、減圧
にできる容器内に置き、約０．５ｍｌの血液を吸引でき
るように、６６５ｍｍＨｇに減圧したところで、試験管
の開口部を密栓した。

【００４７】８週齢のＩＣＲ系雄性マウス（日本ＳＬＣ
社より購入）を１１日間の予備飼育の後、１群１２匹と
して使用した。前記マウスに、抗癌剤として、Ｃｉｓ−
Ｐｌａｔｉｎｕｍ（II）ＤｉａｍｉｎｅＤｉｃｈｌｏ
ｒｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ社製）（表１・４中、シスプラチ
ンと表わす）を各群ごとにそれぞれ１、２及び５ｍｇ／
ｋｇの用量で、３日間尾静脈内投与した。なお、コント
ロール群には、生理食塩水のみを投与した。

【００４８】最終投与の約２２時間後に、上記４群のマ
ウス各１２匹のうち、各々の群からランダムに６匹ずつ
を選び、ヘパリン（８〜１０ｕ／ｍｌ）をあらかじめ収
容させたシリンジに２７Ｇの注射針をつけて、約１〜
１．５ｍｌずつ心採血した。この血液を採取したシリン
ジの針をエンドトキシンを添加していないエンドトキシ
ンフリーの採血管及び上記のエンドトキシンを添加した
エンドトキシンフリーの採血管の栓体に突き刺し、各々
の測定容器に血液を約０．５ｍｌずつ添加した。次い
で、３７℃で４時間、ゆっくりと攪拌しながら反応させ
た。反応終了後、４℃、１６００Ｇで１０分間遠心分離
して、上澄みの血漿を採取した。

【００４９】採取した血漿中のＴＮＦ−α量をＴＮＦ−
αモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定キットを用
いて測定した。ＴＮＦ−α産生量の測定は、Ｇｅｎｚｙ
ｍｅ社製、商品名、Ｆａｃｔｏｒ−Ｔｅｓｔ−Ｘ^TM Ｍ
ｏｕｓｅＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡＫＩＴを用いた。
なお、この測定方法の測定限界濃度は１５ｐｇ／ｍｌで
あった。結果を表１に示した。

【００５０】なお、使用前の測定容器中のエンドトキシ
ン含量を求めるために、使用した測定容器と同一Ｌｏｔ
の採血管を用いて、以下のような測定を行った。エンド
トキシンフリー水（大塚製薬社製）を約１ｍｌを上記測
定容器に採取し、１時間、３７℃で攪拌し、エンドトキ
シンを抽出した。つぎに、この抽出液中のエンドトキシ
ン含量をエンドスペシーＥＳ５０Ｍセット（生化学工業
社製）を用いて、マイクロプレート法、赤色測定法にて
測定した。その結果、試験した測定容器のすべてにおい
て０．５ＥＵ／ｍｌよりも低いエンドトキシン量であっ
た。

【００５１】比較例１測定容器としてエンドトキシンフリー（抽出液中のエン
ドトキシン含量が０．５ＥＵ／ｍｌ未満）の採血管の代
わりに、規格のないポリエチレンテレフタレート製の５
ｍｌの採血管（１２．６φ×７５ｍｍ）（積水化学社
製）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして試験し
た。ただし、血液は、実施例１の４群のマウス各１２匹
のうち、各群について実施例１で用いなかった残り６匹
ずつのマウスから採血した血液を用いた。結果を表１に
示した。なお、使用前の測定容器中のエンドトキシン含
量を求めるために、使用した測定容器と同一Ｌｏｔの採
血管を用いて、実施例１と同様の測定を行った。その結
果、試験した測定容器のすべてにおいて０．５ＥＵ／ｍ
ｌよりも高いエンドトキシンが測定された。

【００５２】

【表１】

【００５３】実施例２抗癌剤として、Ｃｉｓ−Ｐｌａｔｉｎｕｍ（II）Ｄｉａ
ｍｉｎｅＤｉｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ社製）の
代わりに、５−ＦｕｌｕｏｒｏＵｒａｃｉｌ（和光純
薬社製）を用い、投与用量をそれぞれ１、５及び２０ｍ
ｇ／ｋｇとした以外は、実施例１と同様に行った。結果
を表２に示した。

【００５４】比較例２抗癌剤として、Ｃｉｓ−Ｐｌａｔｉｎｕｍ（II）Ｄｉａ
ｍｉｎｅＤｉｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ社製）の
代わりに、５−ＦｕｌｕｏｒｏＵｒａｃｉｌ（和光純
薬社製）を用い、投与用量を１、５及び２０ｍｇ／ｋｇ
とした以外は、比較例１と同様に行った。ただし、血液
は、実施例２の４群のマウス各１２匹のうち、各群につ
いて実施例２で用いなかった残り６匹ずつののマウスか
ら採血した血液を用いた。結果を表２に示した。

【００５５】

【表２】

【００５６】実施例３抗癌剤としてＣｉｓ−Ｐｌａｔｉｎｕｍ（II）Ｄｉａｍ
ｉｎｅＤｉｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ社製）の代
わりに、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ（ＳＩＧＭ
Ａ社製）を用い、投与用量をそれぞれ１、５及び１０ｍ
ｇ／ｋｇとした以外は、実施例１と同様に行った。結果
を表３に示した。

【００５７】比較例３抗癌剤としてＣｉｓ−Ｐｌａｔｉｎｕｍ（II）Ｄｉａｍ
ｉｎｅＤｉｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ社製）の代
わりに、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ（ＳＩＧＭ
Ａ社製）を用い、投与用量をそれぞれ１、５及び１０ｍ
ｇ／ｋｇとした以外は、比較例１と同様に行った。ただ
し、血液は、実施例３の４群のマウス各１２匹のうち、
各群について実施例３で用いなかった残り６匹ずつのの
マウスから採血した血液を用いた。結果を表３に示し
た。

【００５８】

【表３】

【００５９】比較例４２０ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ・２Ｋ溶液を１０μｌ入れた
エッペンドルフチューブに実施例１で用いた血液を０．
２ｍｌずつ入れて、生理食塩水で２倍に希釈した。次い
で、Ｓｙｓｍｅｘ−Ｋ１０００（東亜医用電子社製）に
て、白血球数を測定した。結果を表４に示した。

【００６０】比較例５実施例２で用いた血液について、比較例４と同様の測定
をおこなった。結果を表４に示した。

【００６１】比較例６実施例３で用いた血液について、比較例４と同様の測定
をおこなった。結果を表４に示した。

【００６２】

【表４】

【００６３】実施例１〜３より、エンドトキシンフリー
（抽出液中のエンドトキシン含量が０．５ＥＵ／ｍｌ未
満）の測定容器を用いた場合は、生理活性物質を誘導す
る材料としてエンドトキシンを添加しない場合は、ＴＮ
Ｆ−αの産生は認められなかった。

【００６４】比較例１〜３より、エンドトキシンフリー
の測定容器を用いない場合は、生理活性物質を誘導する
材料としてエンドトキシンを添加しない場合でも、ＴＮ
Ｆ−αの産生が認めらた。

【００６５】実施例１〜３より、エンドトキシンフリー
の測定容器を用い、生理活性物質を誘導する材料として
一定量のエンドトキシンを添加した場合は、抗癌剤の投
与用量に応じ、生理食塩水投与群に対して、有意なＴＮ
Ｆ−α産生能の低下がみられた。

【００６６】比較例１〜３より、エンドトキシンフリー
の測定容器を用いないで、生理活性物質を誘導する材料
として、一定量のエンドトキシンを添加した場合は、抗
癌剤の投与用量に応じて、有意な傾向がみられなかっ
た。

【００６７】比較例４〜６より、従来、抗癌剤による免
疫機能低下の指標として用いられてきた白血球数は、抗
癌剤の投与量に応じて、有意な傾向がみられなかった。

【００６８】参考例１測定容器としてエンドトキシンフリー（抽出液中のエン
ドトキシン含量が０．５ＥＵ／ｍｌ未満）のポリエチレ
ンテレフタレート製の５ｍｌの採血管（１２．６φ×７
５ｍｍ）（積水化学社製）を用いた。注射器（テルモ社
製、テルモシリンジ）に、ヘパリンナトリウム（ノボ・
ノルディクスＡ／Ｓ社製、商品名ノボ・ヘパリン注１０
００）を予め３５Ｕとって、健常人の肘静脈から２０ｍ
ｌの血液を採血した。この血液を上記の測定容器に約１
ｍｌずつ分注して、Ｅ．ｃｏｌｉＵＫＴ−Ｂ由来エンド
トキシン（日本薬局方標準品）を各々の測定容器に、０
ＥＵ／ｍｌ、０．１ＥＵ／ｍｌ、０．２ＥＵ／ｍｌ、
０．５ＥＵ／ｍｌ、１ＥＵ／ｍｌ、２ＥＵ／ｍｌ、５Ｅ
Ｕ／ｍｌ、１０ＥＵ／ｍｌになるように０．０５ｍｌ添
加した。次いで、３７℃で４時間、ゆっくりと攪拌し
ながら反応させた。反応終了後、４℃、１６００Ｇで１
０分間遠心分離して、上澄みの血漿を採取した。

【００６９】採取した血漿中のＴＮＦ−α、ＩＬ−１
β、ＩＬ−６の各サイトカイン量を各々のモノクローナ
ル抗体を用いた酵素免疫測定キットを用いて測定した。
ＴＮＦ−α産生量の測定は、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製、商品
名、ＰＲＥＤＩＣＴＡＨｕｍａｎＴＮＦ−α ＥＬ
ＩＳＡＫＩＴを用いて行った。なお、この測定方法の
検出限界濃度は、１５ｐｇ／ｍｌであった。また、ＩＬ
−１β産生量の測定は、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製、商品名、
ＰＲＥＤＩＣＴＡＨｕｍａｎＩＬ−１β ＥＬＩＳ
ＡＫＩＴを用いて行った。なお、この測定方法の検出
限界濃度は、３５ｐｇ／ｍｌであった。また、ＩＬ−６
産生量の測定は、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製、商品名、ＰＲＥ
ＤＩＣＴＡＨｕｍａｎＩＬ−６ＥＬＩＳＡＫＩ
Ｔを用いて行った。なお、この測定方法の検出限界濃度
は、３５ｐｇ／ｍｌであった。結果を表５に示した。こ
の結果から、エンドトキシン含量が０．５ＥＵ／ｍｌ以
上では、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６等の生理活
性物質の産生誘導が起こることが明らかである。

【００７０】

【表５】

【００７１】

【発明の効果】本発明では、エンドトキシン含量が管理
された測定容器（抽出液中のエンドトキシン含量が０．
５ＥＵ／ｍｌ以下）を用いるため、細胞の不要な活性化
が惹起される問題もなく、正確に血液細胞、特に白血球
のサイトカイン等の生理活性物質の産生能力を測定する
ことができる。また、全血をそのまま利用することがで
き、血液から単球やリンパ球等を分離する必要がないた
め、操作が簡単化され、分離操作に伴う活性低下の問題
も解消される。また、被験者から血液を採血後、ピペッ
ティング等の手段で血液を種々の測定容器に移し替えた
り、細胞分離、細胞培養等の操作を必要としないため、
試験者は、肝炎、ＡＩＤＳ等の種々の感染症に感染する
危険性もほとんどないうえに、測定時間も短縮でき、Ｒ
Ｉ施設やフローサイトメーター等の高価な装置も必要と
しない。そのため、本方法は、白血球の生理活性物質の
産生能力を指標とした被験者の癌化学療法による免疫機
能低下を従来よりも、精度良く、簡単に測定することを
可能にする。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】使用前の測定容器中のエンドトキシン含
量が、測定しようとする液量に等しい水を採取して抽出
を行ったときの抽出液中の濃度として、０．５ＥＵ／ｍ
ｌ以下とされている測定容器に血液を採取し、血液と接
触させることにより該血液中に生理活性物質の産生を誘
導する材料と反応させ、該血液中に産生される生理活性
物質の量を測定することを特徴とする被験者の癌化学療
法による免疫機能低下の測定方法。
【請求項２】血液と接触させることにより該血液中に
生理活性物質の産生を誘導する材料が、予め血液と接触
可能な状態に収納されていることを特徴とする請求項１
記載の被験者の癌化学療法による免疫機能低下の測定方
法。
【請求項３】血液と接触させることにより該血液中に
生理活性物質の産生を誘導する材料がエンドトキシンで
あり、該エンドトキシンの血液と接触させた際の全液中
の濃度が、０．６〜１０００００ＥＵ／ｍｌとなるよう
にされていることを特徴とする請求項１又は２記載の被
験者の癌化学療法による免疫機能低下の測定方法。
【請求項４】測定容器内が減圧にされていることを特
徴とする請求項１、２又は３記載の被験者の癌化学療法
による免疫機能低下の測定方法。
【請求項５】血液中に産生される生理活性物質の量を
酵素免疫測定により定量することを特徴とする請求項
１、２、３又は４記載の被験者の癌化学療法による免疫
機能低下の測定方法。