JP3211250B2 - 細胞機能測定用容器、細沢機能測定用キット及び細胞機能測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、免疫反応や炎症反応などに関与する細胞機
能を測定するための細胞機能測定用キット及び細胞機能
測定方法に関し、より詳細には、例えば、顆粒球、単
球、マクロファージ、リンパ球などの血液細胞が産生す
るサイトカインなどの生理活性物質を測定することによ
り細胞機能を測定するための細胞機能測定用キット及び
細胞機能測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】

顆粒球、単球、マクロファージ、リンパ球等の白血球
は、血液中あるいは各臓器もしくは器官における炎症反
応や免疫反応などの種々の生防御反応において様々な役
割を担っている。これらの細胞は、感染症；肝炎や腎炎
などの炎症性疾患；慢性関節リウマチや喘息などの免疫
・アレルギー性疾患；癌などの様々な病態において重要
な働きをしており、病態の変動と共にこれらの細胞の機
能が抑制されたり、増強されたりすることが知られてい
る。

【０００３】 また、これらの疾患の治療に、抗炎症剤、免疫抑制
剤、免疫増強剤、抗癌剤等の様々の薬剤が用いられてお
り、その際にもこれらの細胞の機能が抑制されたり、ま
たは増強されたりすることも知られている。そのため、
各種疾患の病態や薬剤の効果あるいは副作用を把握する
ことにより、治療指針を決定したり、薬剤の投与量やタ
イミングを決定したりするために、これらの細胞の機能
を調べることが重要である。

【０００４】 従来、病院の検査室や検査センターでは、上記のよう
な理由から、このような細胞機能を測定するために、顆
粒球貧食機能試験、顆粒球殺菌能（活性酵素産生能）試
験、リンパ球幼若化試験等が行われてきた。また、細菌
では、フローサイトメトリー装置と各種免疫担当細胞表
面抗原に対する蛍光標識モノクローナル抗体とを幼いた
表面抗原試験等が行われるようになってきた。しかしな
がら、従来の試験法には、細胞分離、細胞培養及び顕微
鏡測定等の特殊な技術が要求され、測定に時間がかか
り、RI施設やフローサイトメーターなどの高価な装置が
必要であった。

【０００５】 また、血液中の単球やこの単球が組織に出て分化、成
熟したマクロファージは、食作用を介した異物排除や、
抗原提示を介した免疫の成立に関与し、また、サイトカ
イン、プロスタグランジンなどの種々の生理活性物質を
分泌することによって、炎症反応や免疫反応を調節する
など、非常に多彩な機能を持っている。そのため、単球
やマクロファージは、顆粒球やリンパ球と同様に、種々
の病態においても重要な働きをしており、これらの細胞
の機能を調べることは非常に重要である。特に、感染症
などでは、単球やマクロファージは顆粒球やリンパ球と
異なり、細胞数はあまり変動せず、その機能の増幅が主
体であり、細胞機能変化を測定することはより重要であ
る（「マクロファージ」徳永 徹著、講談社サイエンテ
ィフィック1986年初版発行）。

【０００６】 腫瘍壊死因子α（以下、TNFαという）、インターロ
イキン−１β（以下、IL−１βという）、インターロイ
キン−６（以下、IL−６という）は、モノカインと呼ば
れ、血液細胞では主に、単球やマクロファージを含む白
血球によって産生され、種々の炎症反応や免疫反応に関
与するサイトカインである。

【０００７】 これまで、血液や血液から分離した白血球からの上記
サイトカイン産生機能を調べる種々の方法が報告されて
いる。例えば、特開平２−196961号公報、特開平３−28
5692号公報には、血液にリポ多糖（LPS）やレクチンを
反応させ、産生誘導されたTNFαやIL−１βなどのサイ
トカインを測定する方法が開示されている。また、特開
平６−209992号公報、特開平７−76955号公報には、特
定の表面粗さを有する高分子材料や特定の化学構造を有
する高分子材料と血液とを接触させ、TNFαの産生を誘
導する方法が開示されている。また、特開平７−299732
号公報、特開平７−151752号公報には、特定の表面粗さ
を有する高分子材料と血液とを接触させ、TNFαやIL−
１βの産生量を測定する生体反応検査方法が開示されて
いる。また、特表平７−500905号公報には、ヒト末梢血
白血球からのTNFαやIL−１βなどのサイトカインの産
生誘導量を測定することによって、試験物質の免疫活性
能力を測定する方法が開示されている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】 しかしながら、従来、病院の検査室や検査センターで
行われてきた細胞機能測定方法や上記の公開特許公報に
開示の方法には、以下のような問題点があった。すなわ
ち、これらの試験は、いずれも被験者から注射器で血液
を採血後、ピペッティングなどの用手法の手段で血液を
種々の反応容器に移し変える操作、白血球などを分離す
るための細胞分離、並びに機能測定のための細胞培養等
の特殊な操作が必要であった。そのため、検査従事者が
血液に触れ、肝炎、エイズなどの様々な感染症に感染す
る危険性があった。また、これらの操作中に、血液試料
中に様々の雑菌や埃などが混入する恐れがあり、これら
の汚染物あるいは操作による物理的刺激によって、血液
中の細胞が不必要に刺激され、測定結果に悪影響を及ぼ
す恐れがあった。

【０００９】 また、血液を採取し、特定の反応容器内において、白
血球からのサイトカイン、特にTNFαやIL−１βの産生
量を測定する従来法では、例えば注射器のような血液採
取器や反応容器中に元々、グラム陰性菌由来のLPSなど
のエンドトキシンが混入していることがあった。エンド
トキシンは、極微量で白血球からTNFα及びIL−１βの
産生を誘導するため、例えば、製造工程での微量の埃の
混入や使用する洗浄水からの汚染により、少量のエンド
トキシンが上記血液採取器や反応容器に混入した場合、
信頼できる測定結果を得ることは不可能であった。

【００１０】 上述した問題のため、従来よりも、操作が簡単で危険
性がなく、精度の良い細胞機能測定方法が望まれてい
る。他方、従来、血中の種々の生理活性物質の測定、血
液細胞の機能測定、血液細胞の表面抗原測定等におい
て、血液抗凝固剤が用いられている。

【００１１】 しかしながら、抗凝固剤のエンドトキシン含量には一
般的な基準はなく、注射剤として用いられる抗凝固剤に
ついて、第十三改正日本薬局方解説書「エンドトキシン
試験法」に、ウサジの最小発熱投与量として5EU/Kgを規
格値の設定基準として指針があるのみである。

【００１２】 エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁外膜成分のリ
ポ多糖であり、極微量で白血球等の血液細胞を刺激し
て、TNFα、IL−１β、IL−６、または顆粒球−マクロ
ファージコロニー刺激因子等の種々のサイトカインなど
の生理活性物質を産生し、発熱活性やエンドトキシンシ
ョックなどの様々な生理作用を有している（日本医学舘
「炎症とサイトカイン'87炎症セミナー」p.103−10
8）。

【００１３】 また、血液細胞から産生された上記サイトカイン等の
生理活性物質は、オートクリン、パラクリンに作用し合
い、ヒスタミンもしくはアラキドン酸代謝産物または種
々のサイトカインなどのさらなる産生を引き起こし、血
液細胞の様々の機能を修飾したり、血液細胞表面抗原の
量的、質的変化を引き起こす。

【００１４】 従って、血液抗凝固剤がエンドトキシンに汚染され、
しかもそのエンドトキシン含量が生理活性物質の産生を
引き起こすレベルにあるならば、血中の様々の生理活性
物質の測定、血液細胞の機能測定及び血液細胞の表面抗
原測定を正確に行うことは不可能である。

【００１５】 本発明の目的は、従来の細胞機能測定方法の欠点を解
消し、従来よりも操作が簡単であり、危険性がなく、高
精度に細胞機能を測定し得る細胞機能測定用キット及び
細胞機能測定方法を提供することにある。

【００１６】

【課題を解決するための手段】

本発明の広い局面によれば、上記課題を達成するため
に、血液細胞が産生する生理活性物質を測定する際に用
いられる細胞機能測定用キットであって、開口部を有す
る容器と、前記容器の開口部に取付けられており、かつ
試料採取時に取り外されることなく密栓されている栓体
とを備え、容器自体のエンドトキシン含量が測定しよう
とする液量に等しい量の水を採取し、抽出した際の抽出
液中の濃度として0.5EU/ml以下とされている第１の細胞
機能測定用容器と、開口部を有する容器と、前記容器の
開口部に取付けられており、かつ試料採取時に取り外さ
れることなく密栓されている栓体とを備え、血液と接触
することにより該血液中に生理活性物質の産生を誘導す
る材料が前記容器内に収納されており、かつ上記生理活
性物質の測定値に影響を与えないように、使用前の容器
自体のエンドトキシン含量が測定しようとする液量に等
しい量の水を採取し、抽出した際の抽出液中の濃度とし
て0.5EU/ml以下とされている第２の細胞機能測定用容器
と、生理活性物質を定量するための定量試薬とを有す
る、細胞機能測定用キットが提供される。

【００１７】 この第１の細胞機能測定用容器では、上記のように、
測定しようとする液量に等しい量の水を採取し、抽出し
た際の生理活性物質の産生を誘導する材料の量が血液細
胞から生理活性物質を産生しない量に制限されているた
め、すなわち細胞機能測定用容器自体の生理活性物質の
産生を誘導する材料の含量が上記のように制限されてい
るため、採取から測定を行うまで採血した血液に不必要
な刺激を与えず、長時間保存することができる。そのた
め、採血した血液中の生理活性物質を精度よく測定で
き、各種病気の患者の病態を精度よく把握するために用
いることができる。

【００１８】 また、この第１の細胞機能測定用容器は、第２の細胞
機能測定用容器と組み合わせて用いる場合には、コント
ロール値を得るのに好適に用いることができる。

【００１９】 第１の細胞機能測定用容器では、好ましくは、上記生
理活性物質の産生を誘導する材料はエンドトキシンであ
り、かつ使用前の細胞機能測定用容器中のエンドトキシ
ン含量が、測定しようとする液量に等しい水を採取して
抽出を行ったときの抽出液中の濃度として、0.5EU/ml以
下とされる。

【００２０】 第２の細胞機能測定用容器においては、血液中の生理
活性物質の産生を誘導する材料が、血液と接触可能な状
態に収納されているが、使用前の容器自体の生理活性物
質の産生を誘導する材料の含量は、上記のように生理活
性物質の測定値に影響を与えないように制限されている
ので、血液を導入し、生理活性物質の産生を誘導する材
料と接触させて生理活性物質を産生した場合、産生され
た生理活性物質量を高精度に測定することができる。

【００２１】 第２の細胞機能測定用容器では、好ましくは、上記生
理活性物質の産生を誘導する材料はエンドトキシンであ
り、該エンドトキシンが血液と接触された際の全液中の
エンドトキシン濃度が0.6〜100000EU/mlとなるように制
限されている。

【００２２】 また、第1,第２の細胞機能測定用容器においては、血
液の凝固を防止するために、血液抗凝固剤がさらに収納
されていてもよい。 また、上記血液抗凝固剤中の生理活性物質の産生を誘
導する材料の含量は、血液と混合されたときに血液細胞
から生理活性物質を産生しない量とすることが好まし
い。

【００２３】 本発明の特定的な局面においては、上記生理活性物質
の産生を誘導する材料はエンドトキシンであり、生理活
性物質はサイトカインである。 上記サイトカインとしては、腫瘍壊死因子α（TNF
α）、インターロイキン−１β（IL−１β）及びインタ
ーロイキン６（IL−６）から選択した少なくとも１種が
挙げられる。

【００２４】 また、好ましくは、第1,第２の細胞機能測定用容器
は、容器内が減圧にされる。 すなわち、第1,第２の細胞機能測定用容器と、誘導さ
れた生理活性物質の量を定量可能な試薬とを組み合わせ
て、細胞機能測定用キットを構成することができる。

【００２５】 言い換えれば、本発明は、生理活性物質の産生を誘導
する材料が含まれておらず、かつ測定しようとする液量
に等しい量の水を採取し、抽出した際の上記生理活性物
質の産生を誘導する材料の含量が、血液細胞から生理活
性物質を産生しない量とされており、必要に応じて血液
抗凝固剤を含む第１の細胞機能測定用容器と、血液と接
触することにより該血液中に生理活性物質の産生を誘導
する材料及び血液抗凝固剤が、血液と接触可能な状態に
収納されており、かつ上記生理活性物質の測定値に影響
を与えないように、使用前の容器中の上記生理活性物質
の産生を誘導する材料の量が制限されている第２の細胞
機能測定用容器と、生理活性物質を定量するための定量
試薬とを有する、細胞機能測定用キットである。すなわ
ち、本発明に係る細胞機能測定用キットは、上記第１の
細胞機能測定用容器と、上記第２の細胞機能測定用容器
と、上記定量試薬とを組み合わせた構成を有する。

【００２６】 本発明に係る細胞機能測定用キットにおいては、好ま
しくは、前記定量試薬が、第１の細胞機能測定用容器に
血液を採取し、血液中の生理活性物質量を測定するのに
用いられる第１の酵素免疫測定試薬と、第２の細胞機能
測定用容器に血液を採取し、生理活性物質の産生を誘導
する材料と血液との反応により産生される生理活性物質
量を測定するのに用いられ、生理活性物質に対しての測
定感度が第１の酵素免疫測定試薬と異なる第２の酵素免
疫測定試薬とを含む。

【００２７】 また、本発明に係る細胞機能測定用キットの特定的な
局面では、上記生理活性物質の産生を誘導する材料がエ
ンドトキシンであり、第２の細胞機能測定用容器におい
ては、該エンドトキシンの血液と接触された際の全液中
の濃度が0.6〜100000EU/mlとなるようにされている。

【００２８】 本願の第２の発明は、本発明に係る細胞機能測定用容
器に血液を導入し、生理活性物質の産生を誘導する材料
と血液とを接触させて生理活性物質の産生を誘導する工
程を含むことを特徴とする細胞機能測定方法である。第
２の発明に係る細胞機能測定方法では、好ましくは、前
記生理活性物質の産生を誘導する際の温度が26〜45℃で
ある。

【００２９】 また、生理活性物質の産生を誘導する際の時間につい
ては、好ましくは、１〜６時間とされる。さらに、本発
明に係る細胞機能測定方法では、好ましくは、産生誘導
された生理活性物質の量は、定量可能な試薬により定量
される。

【００３０】 また、本発明に係る細胞機能測定方法のより特定的な
局面では、細胞機能測定用キットの第1,第２の細胞機能
測定用容器に血液を導入し、生理活性物質の産生を誘導
する。この場合においても、生理活性物質を誘導する際
の温度は26〜45℃とすることが好ましく、生理活性物質
の産生を誘導する際の時間は１〜６時間とすることが好
ましい。

【００３１】 以下、本発明の詳細を説明する。 （第１の細胞機能測定用容器） 第１の細胞機能測定用容器は、測定しようとする液量
に等しい量の生理活性物質の産生を誘導する材料が含ま
れていない水を採取し、抽出を行ったときに、該生理活
性物質の産生を誘導する材料の量が、血液細胞から生理
活性物質を産生しない量に制限されていることが必要で
ある。

【００３２】 上記抽出の具体的な方法は、測定しようとする液量に
等しく、生理活性物質の産生を誘導する材料が含まれて
いない水を上記細胞機能測定用容器に採取し、37℃で１
時間の条件で攪拌下、抽出することにより行われる。

【００３３】 上記生理活性物質は、好ましくは、サイトカインであ
り、生理活性物質の産生を誘導する材料は、好ましくは
エンドトキシンである。もっとも、生理活性物質につい
ては、サイトカインに限定されず、例えば、プロスタグ
ランジンなどのアラキドン酸代謝物、活性酸素種、可溶
性接着因子、可溶性レセプター、顆粒内酵素などを挙げ
ることができ、生理活性物質の産生を誘導する材料につ
いても、生理活性物質の種類に応じて適宜選択すること
ができる。

【００３４】 生理活性物質の産生を誘導する材料がエンドトキシン
の場合、好ましくは、上記の抽出を行った際の抽出液中
のエンドトキシン含量が0.5EU（国際エンドトキシンユ
ニット）/ml以下と限定される。上記エンドトキシン含
量が0.5EU/mlを超えると、採血された血液がエンドトキ
シンによって生理活性物質の一つであるサイトカインの
誘導を顕著に引き起こすことがあり、誘導されたサイト
カインにより種々の免疫担当細胞が刺激され、免疫担当
細胞の機能が変化し、正確な細胞機能の測定が不可能と
なることがある。

【００３５】 上記測定しようとする液量とは、後述の種々の測定を
する際に使用される全ての液の合計量を指すものであ
り、例えば、測定のための血液量と、必要に応じて添加
される後述の血液抗凝固剤溶液の量、血液凝固促進剤溶
液の量、刺激物質の溶解もしくは懸濁用の液の量を総和
を指す。

【００３６】 なお、上記抽出を行う際のエンドトキシンフリー水の
量は、測定しようとする液量に全く等しい量である必要
は必ずしもなく、抽出が十分になされ得る限り、測定し
ようとする液量未満であってもよい。もっとも、この場
合であっても、抽出液中のエンドトキシン含量が0.5EU/
ml以下であれば、本発明の作用効果を奏し得る。

【００３７】 上記エンドトキシン含量の測定方法については種々の
方法が存在するが、本明細書におけるエンドトキシン含
量の測定方法は、第十三改正日本薬局方解説書「エンド
トキシン試験法」における発色合成基質の加水分解によ
る発色を指標とする比色法であり、例えば、市販品であ
るエンドスペシー（生化学工業社製）を用いて測定する
ことができる。

【００３８】 なお、エンドトキシンを除去もしくは失活させる方法
としては、加熱処理、酸、アルカリ処理による不活化や
メンブレンフィルタによる限外濾過法、アニオン性のキ
トサン系樹脂やエンドトキシンに対して特異的に結合す
るポリミキシンＢ、エンドトキシンに対する抗体を固定
化した吸着剤による除去方法等、公知の種々の方法を用
いることができる。また、上記エンドトキシン除去操作
に用いる器具、容器は、ガラス製の場合には、250℃、
１時間以上の乾熱処理をし、プラスチック製の場合に
は、0.2M水酸化ナトリウム水溶液に浸し、エンドトキシ
ンフリー水で洗浄し、エンドトキシンを失活させたもの
を用いる必要がある。また、水は、エンドトキシンフリ
ー水を用いる必要があり、操作環境はクリーンルームな
どできる限り二次的なエンドトキシンの汚染を防止でき
る環境であることが好ましい。

【００３９】 第１の細胞機能測定用容器は、内部が減圧されている
ことが好ましい。上記減圧の程度は、常圧の血液と上記
細胞機能測定用容器が連通された時に、上記細胞機能測
定用容器の中に常圧の血液が吸入され得る程度の圧力で
あればよく、その圧力は、吸入しようとする血液の量に
よって決められ得る。すなわち、吸入しようとする血液
の量が多ければ多いほど、減圧の程度を大きくすればよ
い。

【００４０】 第１の細胞機能測定用容器の形状としては、特に限定
されず、例えば、採血管、試験管等のようなチューブ状
のもの、マイクロプレート等のようなプレート状のもの
が挙げられ、減圧操作を行い得るものが好ましい。

【００４１】 第１の細胞機能測定用容器の材質としては、例えば、
プラスチックまたはガラスが挙げられる。上記プラスチ
ックとしては、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂のいずれも
が用いられ得る。熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリメチル
メタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフ
タレート、スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチ
レン−無水マレイン酸共重合体、スチレン−アクリル酸
共重合体、スチレン−メチルメタクリレート共重合体、
エチレン−プロピレン共重合体、エチレン−アクリル酸
共重合体、エチレン−アクリル酸エステル共重合体等が
挙げられる。熱硬化性樹脂としては、例えば、不飽和ポ
リエステル樹脂、エポキシ樹脂、エポキシ−アクリレー
ト樹脂等が挙げられる。

【００４２】 第１の細胞機能測定用容器としてチューブ状のものを
用いる場合には、その内部を減圧に維持するために、通
常、栓体が使用される。栓体の材質としては、例えばブ
チルゴム、塩素化ブチルゴム、熱可塑性エラストマー等
が挙げられる。

【００４３】 第１の細胞機能測定用容器としてチューブ状のものを
用いる場合、採取する血液量は、細胞機能測定用容器の
容積によって異なるが、通常４〜5mlの容積の容器を用
いる場合であれば、0.5〜2ml程度とすればよい。

【００４４】 また、第１の細胞機能測定用容器としてマイクロプレ
ート状のものを用いる場合の採取血液量は、0.05〜2ml
程度でよい。 第１の細胞機能測定用容器中には、必要に応じて血液
が凝固しないように血液抗凝固剤が収容されていてもよ
い。上記血液抗凝固剤は、該容器の中に液体または固体
のいずれの状態で存在されてもよい。上記血液抗凝固剤
としては、ヘパリン化合物、クエン酸化合物、シュウ酸
化合物などが挙げられ、ヘパリンナトリウムなどが細胞
の生物学的反応を阻害しないので好ましい。上記ヘパリ
ンナトリウムの該容器中の収容量としては、該容器に血
液が収容された時に、その血液中の濃度が定くなると血
液凝固のおそれがあり、高くなると細胞に不測の活性化
や不活性化を起こすおそれがあるので、４〜50U/mlにな
るように収容されるのが好ましい。

【００４５】 第１の細胞機能測定用容器中に、血液抗凝固剤を添加
する必要がある場合の一例としては、単球、マクロファ
ージ、リンパ球、白血球等の細胞と、生理活性物質の産
生を誘導する材料とを反応させ、産生（遊離または誘
導）される生理活性物質を測定する場合がある。また、
第１の細胞機能測定用容器中に、血液抗凝固剤を添加す
る必要がない場合の一例としては、血小板をトロンビン
刺激して、遊離されるRegulated on Activation,Norm
al Ｔ Expressed and Secreted（RANTES）等を測定
する場合がある。

【００４６】 第１の細胞機能測定用容器中には、また、必要に応じ
て、血液凝固剤が収容されていてもよい。このような場
合としては、血液を凝固させて生理活性物質を測定する
場場合であり、血液凝固剤の例としてはトロンビン等が
挙げられる。

【００４７】 第１の細胞機能測定用容器の製造方法の一例を、容器
としてチューブ状のものを製造する場合について説明す
る。内部を減圧にすることが可能であり、測定しようと
する液量に等しい量のエンドトキシンフリー水を採取し
て抽出を行ったときのエンドトキシン量が、血液細胞か
ら生理活性物質を産生しない量とされたチューブ状の容
器に、必要に応じて血液抗凝固剤または血液凝固剤を加
え、容器を所定の減圧状態にした後、上記容器に栓をす
ることによって製造する。

【００４８】 上記の容器としては、例えば、一端が開口し他端が閉
塞してなる有底管体が好ましく、開口部は、栓体によっ
て閉塞可能なものが好ましい。また、第１の発明の測定
容器は、エンドトキシンや雑菌の混入を避けるため、で
きる限りクリーンな環境で製造するのが好ましく、ま
た、可能であれば、製造後に公知の滅菌処理を施すのが
好ましい。

【００４９】 第１の細胞機能測定用容器の使用に際しては、まず、
血管と上記細胞機能測定用容器とを連通させ、上記細胞
機能測定用容器中に血液を吸入させる。上記血管と上記
細胞機能測定用容器とを連通させる場合には、通常の真
空採血法に用いられる注射針、すなわち、針基の一方の
側に血管刺通側の針を有し、他方の側に上記容器の栓体
を刺通し得る栓体刺通側の針を有し、上記血管刺通側の
針と栓体刺通側の針が連通されている針（通称、マルチ
ブル注射針）を用いればよい。

【００５０】 第１の細胞機能測定用容器を用いて得られた血液は、
他の容器に移すか、またはこの容器をそのまま用いて生
理活性物質の測定に用いられる。また、得られた血液
は、他の反応容器に移すか、またはこの容器を反応容器
として用いて生理活性物質の産生を誘導する材料と接触
させて、産生された生理活性物質を測定してもよい。こ
の容器を反応容器として用いて生理活性物質の産生を誘
導する材料と接触させる場合には、この容器に採血後、
生理活性物質の産生を誘導する材料を添加する。

【００５１】 血液中の生理活性物質の測定方法は、細胞機能測定用
容器を用いて採血された血液中の生理活性物質を測定す
ることにより行う。この場合、第１の発明の細胞機能測
定用容器を用いて得られた血液を、他の容器に移すか、
またはこの容器をそのまま生理活性物質の測定を行う。
この容器をそのまま用いて生理活性物質の測定を行う場
合には、採血後、通常、静置もしくは遠心分離により、
血球と血漿に分離して、血漿中の生理活性物質量を各々
の定量可能な試薬により定量する。

【００５２】 上記生理活性物質としては、例えば、TNF−α;IL−１
β、IL−４、IL−５、IL−６等のインターロイキン;INF
α、INFβ、INFγ等のインターフェロン；コロニー刺激
因子;IL−８、RANTES等の走化性因子などの種々のサイ
トカインや、PGE2、PGE2等のプロスタグランジン;LTB
4、LIC4等のロイコトリエン；一酸化炭素；活性酸素；
ヒスタミン；血小板活性化因子（PAF）などの種々のケ
ミカルメディエーターが挙げられれ。また、可溶性ICAM
Iなどの接着因子、可溶性IL−２レセプターなどの可溶
性サイトカインレセプター、マトリックスメタロプロテ
イナーゼ、マクロファージ特異的エラスターゼなどの細
胞内顆粒酵素も挙げられる。

【００５３】 上記の生理活性物質を測定する方法としては、例え
ば、測定しようとする上記生理活性物質に対するモノク
ローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、ペルオキシ
ダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素及び各々
の酵素の発色基質などを利用した酵素免疫測定方法が挙
げられる。

【００５４】 本発明で用いられる生理活性物質の産生を誘導する材
料とは、エンドトキシン、BCG死菌やコリネバクテリウ
ム属などの種々の微生物；合成リピドA;ピランコポリマ
ー；レクチン（フィトヘマグルチニン、コンカナバリン
Ａ、ポークウィードマイトゲン等）;OK432（ピシバニー
ル）;PSK（クレスチン）；レンチナン；ザイモザン;LPS
（リポポリサッカライド）；カルシウムイオノフォア；
ホルボルエステル；免疫グロブリン固定化担体；ホルミ
ルメチオニルロイシルフェニルアラニン（FMLP）などの
ホルミルペプチド；種々のサイトカインなどが挙げられ
る。

【００５５】 また、喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、アトピー性
皮膚炎、消化管アレルギー、寄生虫アレルギーなどのア
レルゲン検査に用いられる特定抗原（例えば、ハウスダ
スト；ダニ抗原；ブタクサ花粉抽出物、スギ花粉抽出
物、イネ抽出物などの種々の花粉抗原；真菌抗原、アス
カリス抽出物などの寄生虫抗原；卵白アルブミン、小
麦、大豆、エビ、カニ、肉累などの食物抗原；ハチ毒な
ど）も用いられる。

【００５６】 また、上記に示した生理活性物質の産生を誘導する材
料を種々の天然、合成高分子材料に公知の固定化方法
（共有結合法、物理吸着法など）によって固定化した材
料なども挙げられる。

【００５７】 上記生理活性物質の産生を誘導する材料の形状として
は、特に限定されず、例えば、液状、粒子状などが挙げ
られる。また、担体に固定化されていてもよい。上記液
状の場合は、通常、上記生理活性物質の産生を誘導する
材料を、希釈液として、例えば、リン酸緩衝液、ハンク
ス緩衝液などの緩衝液やMEM、RPMI−1640等の通常の培
地、生理食塩液（例えば、大塚製薬社製）、注射用水
（例えば、大塚製薬社製）などで希釈して用いる。

【００５８】 上記生理活性物質の産生を誘導する材料の反応容器中
の存在状態は、固体状であってもよく、また、液体状で
あってもよい。生理活性物質の産生を誘導する材料が水
溶性材料の場合、容器の内壁面に塗布、または添加され
た後、粉末状にされてもよい。例えば、注射用水を用い
て生理活性物質の産生を誘導する材料を希釈した場合
は、生理活性物質の産生を誘導する材料を容器に入れた
後、乾固した方が好ましい。生理活性物質の産生を誘導
する材料が水不溶性の材料の場合には、上記生理活性物
質の産生を誘導する材料の表面に気泡が残ると、転倒混
和等により血液と接触させる際に過度の溶血を引き起こ
し、測定系に影響するおそれがあるため、水不溶性材料
は、例えば、上記のような希釈液に浸しておくのが好ま
しい。

【００５９】 担体に生理活性物質の産生を誘導する材料が固定化さ
れて用いられる場合、固定化する担体が水溶性材料の場
合は、容器の内壁に塗布、あるいは添加した後、分活状
にしてもよい。担体が水不溶性材料の場合は、材料の表
面に気泡が残ると、過度の溶血を引き起こし、測定系に
影響するおそれがあるため、例えば、上記のような希釈
液に浸しておくのが好ましい。

【００６０】 生理活性物質の産生を誘導する材料の反応容器中への
添加量は、生理活性物質の産生を誘導する材料の種類に
よって適宜最適濃度を設定することが好ましい。

【００６１】 第１の血液細胞機能の測定方法において、第１の細胞
機能測定用容器とは別に反応容器を用意する場合、別の
反応容器の形状としては、特に限定されず、例えば、採
血管、試験管等のようなチューブ状のもの、マイクロプ
レート等のようなプレート状のものが挙げられる。該反
応容器は、測定しようとする液量に等しい量のエンドト
キシンフリー水を採取して抽出を行ったときのエンドト
キシン量が、血液細胞から生理活性物質を産生しない量
であることが好ましい。なお、上記の測定しようとする
液量の意味は、前述の細胞機能測定用容器の説明の際に
述べた意味と同様である。

【００６２】 上記のように、細胞機能測定用容器とは別に反応容器
を用意する場合、反応容器に上記生理活性物質の産生を
誘導する材料を加え、容器を所定の減圧状態にしたもの
を用いてもよい。このような反応容器にあっては、採血
後、細胞機能測定用容器とマルチプル注射針などで連通
することにより、採血された血液の反応容器への移送が
用意になると共に、生理活性物質の産生を誘導する材料
が予め収容されているので反応工程が簡便になる。

【００６３】 上記の場合、生理活性物質の産生を誘導する材料の反
応容器中への収容量は、上記誘導材料の種類によって適
宜最適濃度を設定することが好ましい。この反応容器の
製造方法の一例を挙げると、内部を減圧にすることが可
能であるチューブ状の容器に、上記生理活性物質の産生
を誘導する材料及び必要に応じて血液抗凝固剤を加え、
容器を所定の減圧状態にした後、上記容器に栓をする別
法が挙げられる。本発明で用いられる反応容器は、エン
ドトキシンや雑菌の混入を避けるため、できる限りクリ
ーンな環境で製造されるのが好ましく、また、可能であ
れば製造後に公知の滅菌処理を施すのが好ましい。

【００６４】 反応容器としては、例えば、一端が開口し他端が閉塞
してなる有底管体が好ましく、開口部は、栓体によって
閉塞可能なものが好ましい。上記有底管体としては、例
えば、反応後、上記生理活性物質を測定するための遠心
分離操作に好適な試験管状のものがより好ましく、その
サイズとしては、外径が５〜30mm、高さ20〜150mm程度
が好ましい。

【００６５】 （第２の細胞機能測定用容器） 第２の細胞機能測定用容器は、容器内に、血液と接触
することにより該血液中での生理活性物質の産生を誘導
する材料を、血液と接触され得るように収納したことを
特徴とする。この生理活性物質の産生を誘導する材料
を、以下、生理活性物質誘導材料ということもある。生
理活性物質としては、第１の細胞機能測定用容器の説明
において示した生理活性物質を挙げることができ、好ま
しくはサイトカインである。

【００６６】 また、生理活性物質誘導材料は、好ましくはエンドト
キシンである。エンドトキシンは、血液中の単球、マク
ロファージと反応し、これらの細胞の活性化を促し、サ
イトカインの産生を誘導する。上記エンドトキシンとし
ては、例えば、微生物由来の細胞壁多糖（LPS）からな
るエンドトキシンが挙げられる。また、エンドトキシン
を種々の天然または合成高分子材料中の固定化方法によ
って固定化した材料なども用いられ得る。

【００６７】 エンドトキシンの使用量は、血液と接触されたときに
全液（血液と、血液抗凝固剤溶液と、エンドトキシンの
溶解液等との総和）中のエンドトキシン濃度が0.6〜100
000EU/mlとなるようにされていることが好ましく、0.8
〜80000EU/mlとなるようにされていることがより好まし
い。上記濃度が0.6EU/ml未満では、TNFα、IL−１β及
びIL−６の誘導量が少なくなりすぎることがあり、1000
00EU/mlを超えるとTNFα、IL−１β及びIL−６の誘導量
が少なくなりすぎることがあり、その費用も高くなって
くる。

【００６８】 第２の細胞機能測定用容器においては、上記生理活性
物質誘導材料が、容器内に、血液と接触可能な状態とさ
れている。上記血液と接触可能な状態としては、例え
ば、上記生理活性物質誘導材料が上記容器内に収容され
ている場合が挙げられる。

【００６９】 上記生理活性物質誘導材料の形状としては、通常、粉
末状または、該誘導材料が水などの溶媒に溶解された液
状である。該誘導材料の上記容器中の存在状態は、固体
状であってもよく、また、ゲル状、液体状であってもよ
い。該誘導材料は、水溶性の場合、適当な溶媒に溶解さ
れて容器の内壁面に塗布、あるいは添加された後粉末状
にされてもよい。

【００７０】 上記溶媒としては、例えば、リン酸緩衝液、ハンクス
緩衝液などの緩衝液やMEM、RPMI−1640等の通常の培地
など、生理的緩衝液であれば、いずれであっても利用で
きる。また、市販品の注射用水（LPSフリー水、大塚製
薬社製）、生理食塩液（大塚製薬社製）を用いることも
できる。エンドトキシン以外の生理活性物質誘導材料と
しては、第１の発明の説明において例示した各種材料を
同様に用いることができる。

【００７１】 また、さらに、上記生理活性物質誘導材料には、特開
平６−209992号公報に開示されている中心線平均粗さRa
値が0.2μｍ〜10μｍであり、でこぼこ平均間隔Sm値が
５μｍ〜200μｍの表面粗さを有する高分子材料や、特
開平７−67955号公報に開示されている分子中に水酸
基、アミド骨格及びエステル骨格からなる群より選ばれ
る少なくとも１つの化学構造を有する高分子材料または
カチオン性官能基を有する高分子材料も用いられ得る。

【００７２】 また、上記生理活性物質誘導材料のうち、サイトカイ
ン誘導材料としては、フィトヘマグルチニンが好まし
い。フィトヘマグルチニンは、４量体からなるレクチン
であり、その構成サブユニットには、赤血球凝集能を有
するＥサブユニットと白血球凝集能を有するＬサブユニ
ットとがある。用いられるフィトヘマグルチニンとして
は、上記ＥサブユニットとＬサブユニットからなる４量
体であるフィトヘマグルニチン−Ｐ（PHA−Ｐ）、及
び、Ｌサブユニットの４量体であるフィトヘマグルチニ
ン−Ｌ（PHA−Ｌ）が好ましい。PHA−Ｐ及びPHA−Ｌは
それぞれ単独で用いてもよいし、併用して用いてもよ
い。

【００７３】 また、PHA−ＰとPHA−Ｌについて使用量を同一にして
サイトカインの産生誘導能力を比較すると、その誘導量
はPHA−Ｐに比べてPHA−Ｌの方が約10倍高い。従って、
サイトカイン誘導材料としては、PHA−Ｌが特に好まし
い。また、PHA−Ｌの場合、血液と接触されたときの全
液（血液と、血液抗凝固剤溶液と、PHA−Ｌの溶解液等
との総和）中のフィトヘマグルチニン−Ｌの濃度が、0.
1〜100μg/mlとなるようにされていることが好ましく、
0.5〜50μg/mlとなるようにされていることが更に好ま
しい。上記濃度が0.1μg/ml未満では、TNFα及びIL−１
βの誘導量が少なくなりすぎることがあり、50μg/mlを
超えるとTNFα及びIL−１βの誘導量が少なくなりすぎ
ることがあり、その費用も高くなっている。

【００７４】 また、エンドトキシン以外の上記サイトカイン誘導材
料は、エンドトキシンを含まないもの、いわゆるエンド
トキシンフリーのものが好ましい。 また、第２の容器の生理活性物質誘導材料の含量は、
上記産生誘導された生理活性物質の測定値に影響を与え
ないように、使用前に制限されていることが必要であ
る。後述の実施例から明らかなように、LPSなどのエン
ドトキシン含量が多くなると顕著に上記サイトカインの
誘導を引き起こす。従って、第２の細胞機能測定用容器
による細胞機能測定を正確に行うためには、生理活性物
質誘導材料の含量は上記サイトカインの誘導を起こさな
いレベル以下でなければならない。

【００７５】 上記エンドトキシン含量は、第１の細胞機能測定用容
器の場合と同様に測定しようとする液量に等しい量のエ
ンドトキシンフリー水を該容器内に採取し、37℃で１時
間の条件で攪拌下で抽出を行ったとき、該抽出液中の濃
度として0.5EU（国際エンドトキシンユニット）/ml以下
とされているのが好ましい。

【００７６】 なお、エンドトキシンを除去もしくは失活させる方法
としては、第１の発明の説明において記載した各種方法
を用いることができる。 また、第２の細胞機能測定用容器は、血液中の細胞機
能測定に用いられるので、血液が凝固しないように、上
記容器中に血液抗凝固剤が収容されていることが好まし
い。

【００７７】 上記血液抗凝固剤の存在形態、種類、収容量について
は、第１の細胞機能測定用容器の場合と同様である。ま
た、本発明に係る細胞機能測定用容器の材質について
も、第１の細胞機能測定用容器と同様の材料を用いるこ
とかできる。

【００７８】 さらに、第２の細胞機能測定用容器においても、好ま
しくは、その内部を減圧にすることが望ましく、それに
よって血液を第２の細胞機能測定用容器内に容易に吸引
することができる。この場合、内部を減圧に維持するた
めには、第１の細胞機能測定用容器の場合と同様に、栓
体を用いることが望ましく、栓体の材質については、第
１の細胞機能測定用容器において例示した種々の材料を
例示することができる。

【００７９】 第２の細胞機能測定用容器を用いて細胞機能を測定す
る際の血液量は、細胞機能測定用容器の容積によって異
なるが、通常、４〜5mlの容積の細胞機能測定用容器を
用いる場合であれば、0.5〜2ml程度でよい。

【００８０】 第２の細胞機能測定用容器の製造方法の一例を挙げる
と、内部を減圧にすることが可能である容器に、上記生
理活性物質誘導材料及び血液抗凝固剤を加え、容器を所
定の減圧状態にした後、上記容器に栓をする方法が挙げ
られる。

【００８１】 上記容器としては、例えば、一端が開口し他端が閉塞
してなる有底管体が好ましく、開口部は、栓体によって
閉塞可能なものが好ましい。上記有底管体としては、例
えば、サイトカインの誘導反応後、上記サイトカイン量
を測定するための遠心分離操作に好適なものがより好ま
しく、そのサイズとしては、外径が、５〜30mm、高さ20
〜150mm程度が好ましい。

【００８２】 また、第２の細胞機能測定用容器は、エンドトキシン
や雑菌の混入を避けるため、できる限りクリーンな環境
で製造するのが好ましく、また、可能であれば、製造後
に公知の滅菌処理を施すのが好ましい。

【００８３】 第２の細胞機能測定用容器によって、細胞機能を測定
する方法について説明する。 まず血管または採血容器と上記細胞機能測定用容器と
を連通させ、上記細胞機能測定用容器中に検体血液を吸
入させる、次いで、上記細胞機能測定用容器を適度に振
とうしながら、血液細胞と上記生理活性物質誘導材料と
を接触させ反応させて誘導する。反応後、静置もしくは
遠心分離により、血液と血漿に分離して血漿中のサイト
カイン量を各々の定量可能な試薬により定量する。

【００８４】 上記の採血容器と上記細胞機能測定用容器を連通させ
る方法については、第１の細胞機能測定用容器と採血容
器とを連通させる方法と同様にして行い得る。

【００８５】 血液と上記サイトカイン誘導材料との反応温度が低く
なると、細胞の代謝活性が低くなってサイトカイン誘導
量が少なくなりすぎることがあり、高くなると、細胞に
障害が生じてサイトカイン誘導量が少なくなりすぎるこ
とがあるので、26〜45℃が好ましく、より好ましくは、
30〜42℃である。

【００８６】 血液と上記サイトカイン誘導材料との反応時間が短く
なると、サイトカイン誘導量が少なくなりすぎることが
あり、長くなりすぎると測定結果が出るのが遅くなり、
また、サイトカイン誘導量も約４時間をピークとして少
しづつ減少する傾向があるので、１〜６時間が好まし
く、より好ましくは、２〜４時間である。

【００８７】 第２の細胞機能測定用容器を用いた測定方法では、上
記細胞機能測定用容器に採血した後、30〜40℃で２〜６
時間、全血を培養してサイトカインを誘導するのが最も
良い誘導方法である。

【００８８】 誘導されたサイトカインの測定方法については、第１
の細胞機能測定用容器の説明において前述した酵素免疫
測定方法を同様に用いることができる。 以下に、第２の細胞機能測定用容器を用いて、細胞機
能を測定する一実施態様を詳しく説明する。まず、血液
と上記サイトカイン誘導材料とを上記細胞機能測定用容
器の中で反応でさせ、サイトカインを誘導し、誘導後の
細胞機能測定用容器を1200Gで遠心分離し、血球成分と
血漿成分を分離させる。次いで、分離された血漿を、上
記サイトカインに対するモノクローナル抗体を固定化し
たマイクロプレートのウェルに、ピペッティングにより
添加し、37℃で２時間反応させる。次いで、反応後の血
漿液を吸引除去等の手段で廃棄し、さらに未反応成分を
除くため、Tween20等のノニオン系の界面活性剤を含有
する、中性pHの洗浄用緩衝液で上記ウェルを洗浄する。
次いで、西洋わさびペルオキシダーゼを固定化した上記
サイトカインに対するポリクローナル抗体をピペッティ
ングにより上記ウェルに添加し、37℃で１時間反応させ
る。次いで、未反応の西洋わさびペルオキシダーゼ固定
化抗体を除くため、上記ウェルを上記洗浄用緩衝液で洗
浄した後、過酸化水素、テトラメチルベンジジンを含む
基質溶液を添加し、５〜10分間反応させる。次いで、1M
硫酸溶液を添加して、反応を停止させて、酵素反応によ
る基質の発色を450nmの吸光度から測定する。この測定
置と既知濃度の上記サイトカインを用いて作成した検量
線から、上記サイトカインの産生誘導量を測定する。

【００８９】 （細胞機能測定用キット） 第1,第２の細胞機能測定用容器は、それぞれ、生理活
性物質の量を定量可能な試薬、例えば、酵素免疫測定試
薬と組み合わせることにより、細胞機能測定用キットと
して用いることができる。すなわち、第１の細胞機能測
定用容器と、誘導された生理活性物質の量を定量可能な
試薬とを備える細胞機能測定用キットを提供することが
できる。また、第２の細胞機能測定用容器と、誘導され
た生理活性物質の量を定量可能な試薬とを備える細胞機
能測定用キットを提供することも可能である。

【００９０】 上記細胞機能測定用キットの使用方法の一例として
は、前記の、第２の細胞機能測定用容器を用いて細胞機
能を測定する一実施態様を説明した方法と同様である。

【００９１】 （好ましい血液抗凝固剤） 本発明では、上記血液抗凝固剤中の生理活性物質の産
生を誘導する材料の含量が、血液と混合されたときに血
液細胞から生理活性物質を産生しない量とすることが望
ましい。すなわち、血液抗凝固剤自体の生理活性物質誘
導材料の含量が上記のように低くされると、それによっ
て検査を行うまでの間に採血した血液に不要な刺激を与
えることが抑制される。その結果、採血した血液中の生
理活性物質が血液抗凝固剤により産生され難く、種々の
生理活性物質の測定や細胞機能の測定、血液細胞の表面
抗原測定をより一層精度よく行うことができる。また、
採血後、検査を行うまで、血液試料を長時間保存するこ
とができる。

【００９２】 この場合においても、生理活性物質誘導材料としては
前述したものが挙げられ、好ましくはエンドトキシンで
ある。エンドトキシン含量が多くなると、TNFα、IL−
１β、IL−６などの上述したサイトカインの産生が引き
起こされ、正確な測定ができなくなる。従って、血液抗
凝固剤中のエンドトキシン含量は、採取した血液中にお
いて生理活性物質としてのサイトカインを産生しない量
に制限することが望ましい。

【００９３】 後述の実施例から明らかなように、血液抗凝固剤中の
エンドトキシン含量が、反応血液中において0.5EU/mlを
超えると、TNFα、IL−１β、IL−６などのサイトカイ
ンの産生が生じることがある。従って、血液抗凝固剤中
のエンドトキシン含量は、反応液中におけるエンドトキ
シン含量が0.5EU/ml以下となるように制限されることが
望ましい。

【００９４】 上記血液抗凝固剤の量は、採取血液量に応じて異なる
が、通常、血液中に、エチレンジアミンテトラ酢酸ナト
リウムであれば0.5〜5mg/ml、クエン酸ナトリウムであ
れば３〜５重量％、ヘパリンナトリウムであれば４〜50
U/mlの量で用いられる。

【００９５】 従って、本発明においては、血液抗凝固剤のエンドト
キシン含量は、血液抗凝固剤の量と採取血液量によって
適宜選択され、最終的に採取した血液中でのエンドトキ
シン含量が0.5EU/ml以下とされるのが好ましい。

【００９６】 例えば、ヘパリンナトリウムを用いて1mlの血液を採
取して試験する場合、ヘパリンナトリウムは４〜50U/ml
添加されるので、そのエンドトキシン含量は00.125EU/
ヘパリンユニット以下とされることが好ましく、より好
ましくは0.01EU/ヘパリンユニット以下である。

【００９７】 エンドトキシン含量の少ない血液抗凝固剤の製造方法
としては、第１の発明の説明に記載したエンドトキシン
を除去もしくは失活させる種々の方法を用いることがで
きる。

【００９８】 もっとも、加熱処理や酸もしくはアルカリ処理による
エンドトキシンの不活化は、血液抗凝固剤によってはそ
れ自信が失活する場合があるので、メンブレンフィルタ
ーによる眼外濾過、吸着剤による除去が好ましい。

【００９９】 （細胞機能の測定） 本発明における「細胞機能測定」なる表現は、赤血
球、血小板及び白血球に分類される血液細胞の機能を直
接測定する方法だけでなく、上記生理活性物質の測定に
より細胞機能を評価する方法、並びに血液細胞の表面抗
原測定をも含むものとする。

【０１００】 上記赤血球、血小板、白血球に分類される血液細胞の
機能測定としては、例えば、赤血球凝集反応、血小板凝
集能、血球遊走能、白血球遊走阻止試験、白血球ニトロ
ブルーテトラゾリウム還元能、白血球貧食能、リンパ吸
幼若化反応、リンパ球細胞毒性試験、抗体依存性細胞媒
介性細胞障害活性試験、各種サイトカイン産生能、ヒス
タミン遊離試験等が挙げられる。

【０１０１】 また細胞表面抗原の測定とは、ロゼット形成試験やフ
ローサイトメトリー法による細胞表面抗原の測定であ
り、例えば、Fcレセプター、各種CD抗原等の測定等が挙
げられる。

【０１０２】 （本発明に係る細胞機能測定用キット） 本発明に係る細胞機能測定用キットは、上述した第１
の細胞機能測定用容器と、第２の細胞機能測定用容器
と、定量試薬とを有する細胞機能測定用キットである。

【０１０３】 用い得る第1,第２の細胞機能測定用容器の詳細につい
ては、前述した通りである。 本発明に係る細胞機能測定用キットにより細胞機能を
測定するには、採血容器と第２の細胞機能測定用容器と
を連通させ、第２の細胞機能測定用容器中に検体血液を
導き、次に第２の細胞機能測定用反応器を適度に振とう
しつつ、血液細胞と生理活性物質誘導材料を反応させ
る。

【０１０４】 また、コントロール値を得るために、採血容器と上記
第１の細胞機能測定用容器とを連通させ、第１の細胞機
能測定用容器中に検体血液を導く。 次に、上記のようにして血液が導かれた第1,第２の細
胞機能測定用容器を静置もしくは遠心分離することによ
り、血球と血漿とを分類し、第1,第２の細胞機能測定用
容器の血漿中の生理活性物質量をそれぞれ、異なる測定
感度を有する第1,第２の酵素免疫測定試薬により別々に
定量する。

【０１０５】 採血容器と第1,第２の細胞機能測定用容器との連通
は、前述した方法により行い得る。 なお、第２の細胞機能測定用容器における血液とエン
ドトキシンとの反応温度が、低くなると細胞の代謝活性
が低くなり、サイトカイン誘導量が少なくなり、高くな
ると細胞に障害が生じ、サイトカイン誘導量が少なくな
るので、26〜45℃が好ましく、30〜42℃がより好まし
い。

【０１０６】 血液とエンドトキシンとの反応時間については、サイ
トカインの産生が効率的に行われ、過度の溶血を引き起
こさない反応時間である１〜12時間が好ましく、より好
ましくは２〜６時間である。

【０１０７】 本発明に係る細胞機能測定用キットでは、第２の細胞
機能測定用容器中の血液中の生理活性物質、すなわち生
理活性物質誘導材料との反応により産生された血液中の
生理活性物質量を第２の酵素免疫測定試薬により定量
し、生理活性物質誘導材料との反応により産生されたも
のではない血液中の生理活性物質量については、第１の
細胞機能測定用容器の血液中の生理活性物質量を第１の
酵素免疫測定試薬を用いて定量し、これらの差により、
生理活性物質誘導材料により産生された正確な生理活性
物質産生量を測定する。

【０１０８】 通常、エンドトキシンと反応させていない血液中のサ
イトカイン量（第１の細胞機能測定用容器の血液中のサ
イトカイン量）は、数pg/ml〜数百pg/mlであり、エンド
トキシンと反応させた後の血液中のサイトカイン量は数
百pg/mlから数千pg/ml以上である。

【０１０９】 しかしながら、数pg/ml〜数千pg/mlという幅広い測定
感度を有するサイトカイン測定試薬は存在しない。従っ
て、1,000pg/ml以上のサイトカイン量の測定では、適当
な希釈溶液で血漿を希釈し、測定しなければならなかっ
た。ところが、血漿の希釈操作は煩雑であり、希釈液や
希釈容器を別途必要とし、測定にかかる時間が非常に長
くなる。また、測定値は、希釈倍数の積により求められ
るため、測定値の精度が低下するという問題があった。

【０１１０】 これに対して、本発明では、エンドトキシンと反応さ
せていない血液中のサイトカイン量（すなわち第１の細
胞機能測定用容器の血液中のサイトカイン量）を、例え
ば測定感度10〜1,000pg/mlのような高感度の第１の酵素
免疫測定試薬で測定し、エンドトキシンと反応させた血
液中のサイトカイン量（すなわち第２の細胞機能測定用
容器の血液中のサイトカイン量）を、例えば測定感度50
0〜約10,000pg/mlのような低感度の第２の酵素免疫測定
試薬で測定することができる。従って、上述したような
煩雑な希釈操作を必要としない。

【０１１１】 また、上記サイトカインが、TNFα、IL−１βの場合
には、第１の酵素免疫測定試薬は、感度が10〜500pg/m
l、第２の酵素免疫測定試験の感度が500〜10,000pg/ml
であることが好ましく、IL−６の場合には、第１の酵素
免疫測定試薬の感度は10〜1,000pg/ml、第２の酵素免疫
測定試薬の感度は1,000〜20,000pg/mlが好ましい。

【０１１２】 上記第1,第２の酵素免疫測定試薬は、測定しようとす
る上記サイトカインに対するモノクローナル抗体もしく
はポリクローナル抗体、ペルオキシダーゼやアルカリフ
ァスファターゼなどの酵素、並びにそれぞれの酵素の発
色基質などから構成されており、マイクロプレートなど
の固相表面上に予め、測定されるサイトカインに対する
モノクローナル抗体を固定化したサンドイッチ酵素免疫
測定方法が、測定前に固定化する必要はなく再現性にお
いても優れているため好ましい。

【０１１３】 固相表面へのモノクローナル抗体の固定化方法につい
ては、公知の物理吸着法や化学結合法など任意である
が、物理吸着法が操作が簡便であるため好ましい。

【０１１４】 異なる測定感度の第1,第２の酵素免疫測定試薬は、サ
イトカインに対するモノクローナル抗体もしくはポリク
ローナル抗体及びペルオキシダーゼ、アルカリファスフ
ァターゼなどの酵素及び各々の酵素の発色基質の濃度な
どを適宜、調整することによって達成し得る。

【０１１５】 例えば、サンドイッチ酵素免疫測定方法を用いる場
合、マイクロプレートに固定化する上記サイトカインに
対するモノクローナル抗体の固定化量を調整することに
よって感度の異なる第1,第２の酵素免疫測定試薬を調製
できる。すなわち、マイクロプレート表面上に固定化さ
れたモノクローナル抗体の量に応じて、モノクローナル
抗体と結合し得る測定対象サイトカインの量も変化する
ため、測定感度の異なる試薬が調製できる。

【０１１６】 また、固定化されたモノクローナル抗体に結合したサ
イトカインを検出するための試薬、すなわち、固定化モ
ノクローナル抗体とは別の測定対象サイトカインに対す
る酵素標識モノクローナル抗体、もしくは酵素標識ポリ
クローナル抗体を異なる濃度に調製することによっても
可能である。

【０１１７】 また、アビジン−ビオチンなどの特異的結合様式を上
記の酵素免疫測定系に取り入れる方法、例えば、上記の
固定化モノクローナル抗体とは別の測定対象サイトカイ
ンに対する酵素標識抗体の代わりに、ビオチン標識抗体
を用い、さらにアビジン標識酵素を用いる方法がある。

【０１１８】 以下、本発明の異なる測定感度の第1,第２の酵素免疫
測定試薬に用いるモノクローナル抗体固定化マイクロプ
レートの調製例を示す。 まず、測定対象サイトカインに対する特異的モノクロ
ーナル抗体をリン酸緩衝液などの緩衝液に２種類の濃度
で溶解する（用いるモノクローナル抗体と測定対象サイ
トカインとの結合定数によって調製濃度は適宜選択され
る）。溶解したモノクローナル抗体を一定量ずつ、マイ
クロプレートに添加し、２〜８℃で一昼夜インキュベー
トする。次に、Tween20等のノニオン系の界面活性剤を
含有する中性pHの洗浄用緩衝液で洗浄し、１〜４重量％
ウシ血清アルブミン溶解リン酸緩衝液を一定量ずつ、マ
イクロプレートに添加し、37℃で２時間インキュベート
する。次いでマイクロプレートの液を除き、室温で乾燥
させる。

【０１１９】 以下に、本発明の細胞機能測定用キットを用いて、細
胞機能を測定する一態様を詳しく説明する。 まず、血液を第1,第２の細胞機能測定用容器に採取
し、37℃で４時間インキュベートする。各々の反応器を
1600Gで遠心して、血球成分と血漿成分とを分離させ
る。次に、予め測定対象サイトカインに対するモノクロ
ーナル抗体を２種類の濃度で固定化し、ウシ血清アルブ
ミンで未吸着の部位をブロッキングし、乾燥させたマイ
クロプレートのウェルに分離された血漿を添加し、37℃
で２時間反応させる。次いで、反応後の血漿液を吸引除
去等の手段で廃棄し、さらに、未反応成分を除くため、
Tween20等のノニオン系の界面活性剤を含有する中性pH
の洗浄用緩衝液で上記ウェルを洗浄する。次いで、西洋
わさびペルオキシダーゼを固定化した上記サイトカイン
に対するポリクローナル抗体を添加し、37℃で１時間反
応させる。次いで、未反応の西洋わさびペルオキシダー
ゼ固定化抗体を除くため、上記ウェルを上記洗浄用緩衝
液で洗浄した後、過酸化水素、テトラメチルベンジジン
を含む基質溶液を添加し、５〜10分間反応させる。次い
で、2M硫酸溶液を添加し、反応を停止させて、酵素反応
による基質の発色を450nmの吸光度から測定する。この
測定値と、既知濃度の上記サイトカインを用いて作成し
た検量線とから、上記第1,第２の細胞機能測定用容器で
処理した血液中のサイトカイン量を測定する。

【０１２０】 （本発明に係る細胞機能測定方法） 本発明に係る細胞機能測定方法は、第１または第２の
細胞機能測定用容器に血液を導入し、細胞機能を測定す
ることを特徴とする。この場合、好ましくは、前述した
ように、血液抗凝固剤中のエンドトキシン含量は、血液
と混合されたときに血液細胞から生理活性物質を産生し
ない量に制限されている血液抗凝固剤が予め細胞機能測
定用容器内に収納される。

【０１２１】 本発明に係る細胞機能測定方法の一実施態様を以下に
説明する。 採血用注射針付き注射器に、予め血液抗凝固剤とし
て、例えば、ヘパリンナトリウムを採取血液量あたり、
例えば、10U/mlになるように収容し、被験者から血液を
採取する。あるいは真空採血管に血液抗凝固剤を上記と
同様の量で収容し、採血を行ってもよい。次いで、この
血液を1600Gで遠心分離し、血液細胞から産生される生
理活性物質の一例として、血漿中のTNFα量を酵素免疫
測定法で測定する。

【０１２２】 また、本発明に係る細胞機能測定方法において、より
特定的な局面では、第２の細胞機能測定用容器が用いら
れる。この場合には、容器内に生理活性物質誘導材料が
血液と接触されるように配置されている。従って、第２
の細胞機能測定用容器の説明において前述したように、
生理活性物質誘導材料が血液と反応し、生理活性物質が
誘導される。誘導された生理活性物質の測定について
は、前述した方法により行い得る。

【０１２３】 好ましくは、生理活性物質を誘導する際の温度は26〜
45℃の範囲とされ、生理活性物質を誘導する時間につい
ては、好ましくは、１〜６時間とされる。

【０１２４】 また、誘導された生理活性物質の量は、定量可能な試
薬、例えば、酵素免疫測定試薬により定量することがで
きる。

【０１２５】

【発明の実施の形態】

好ましい実施例の説明 次に、本発明の実施例及び比較例を挙げることによ
り、本発明をさらに詳細に述べる。本発明は以下の実施
例に限定されるものではない。

【０１２６】 実施例１〜４、比較例１〜４ （１）細胞機能測定用容器の製造方法 ポリエチレンテレフタレート製の4mlの採血管（直径1
2.6×75mm）を、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社
製）4mlで10回よく洗浄し、濃度が200U/mlとなるように
ヘパリンナトリウム（ノボ・ノルディスクA/S社製、商
品名：ノボ・ヘパリン注1000）を含有させた注射用生理
食塩水（大塚製薬社製）を0.05mlを添加した。

【０１２７】 E.coli UKT−Ｂ由来エンドトキシン（日本薬局方標
準品Lot.8920）を注射用生理食塩水（大塚製薬社製）に
溶解、段階希釈して、上記ヘパリン含有採血管のそれぞ
れ２本ずつに、ヘパリンナトリウム溶解生理食塩水とエ
ンドトキシン溶解生理食塩水との合計の溶液中に、該エ
ンドトキシン濃度が0EU/ml（比較例１）、1EU/ml（比較
例２）、2EU/ml（比較例３）、5EU/ml（比較例４）、10
EU/ml（実施例１）、20EU/ml（実施例２）、50EU/ml
（実施例３）、100EU/ml（実施例４）となるように0.05
ml添加した。

【０１２８】 次いで、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）で
よく洗浄した、管径に合うブチルゴム製の栓体を上記採
血管の開口部に、開口部を密栓しないように、軽く載せ
た後、減圧にできる容器内に置き、上記容器をしてゆ
き、上記容器を570mmHgに減圧したところで、該採血管
の開口部を密栓した。このようにして製造された減圧採
血管を実施例１〜４、比較例１〜４の細胞機能測定用容
器とした。

【０１２９】 （２）採血管（容器）のエンドトキシン含量の測定 注射針のついた注射器に、エンドトキシンフリー水
（大塚製薬社製）を採取し、その注射針を上記（１）で
得られたヘパリンだけを含有した減圧採血管４本のブチ
ルゴム製の栓体部分に突き刺し、採血管内にエンドトキ
シンフリー水（大塚製薬社製）を0.9ml採取し、１時
間、37℃で攪拌し、エンドトキシンを抽出した。次に、
この抽出液中のエンドトキシン含量を生化学工業社製の
エンドトキシン測定用キットであるエンドスペシーES6
（商品名）を用いて、合成発色基質法で測定した。その
結果、試験した採血管４本共に、抽出液中のエンドトキ
シン含量は0.05EU/ml以下であった。

【０１３０】 （３）TNFα、IL−１β、IL−６の誘導能の測定方法 健常人ボランティアから、注射針のついた注射器にヘ
パリン採血し、その注射針を上記（１）で得られた、種
々の濃度のエンドトキシンを添加した減圧採血管のブチ
ルゴム製の栓体部分に突き刺し、採血管内に、検体血液
0.9mlを採取した。次いで、予め37℃に保温しておいた
恒温器中の転倒混和用ロッカープラットフォームに血液
を採取した各々の採血管を取り付け、４時間、転倒混和
した。混和後、各々の容器を1600G、10分間、４℃で遠
心分離して、上澄みの血漿を採取した。採取した血漿中
のTNFα、IL−１β、IL−６各サイトカイン量（pg/ml）
を各々のモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定キッ
トを用いて測定した。

【０１３１】 TNFαの産生量の測定は、PREDICTA Human TNF−α EL
ISA KIT（測定限界35pg/ml）、IL−１βの産生量の測定
は、PREDICTA Human IL−１β ELISA KIT（測定限界15p
g/ml）、IL−６の産生量の測定は、PREDICTA Human IL
−6 ELISA KIT（測定限界35pg/ml）を用いた（いずれも
Genzyme社製）。測定は各々ｎ＝３とした。測定結果を
図１〜３に示した。

【０１３２】 各図における横軸のLPS濃度の単位EU/mlは、血液と接
触したときの全溶液中のエンドトキシン濃度を示し、縦
軸の誘導量（pg/ml）は、血漿中の各サイトカインの濃
度についての各２本の採血管で得られた値の平均値を示
す。この結果から明らかなように、エンドトキシン濃度
が0.6EU/ml以上では、TNFα、IL−１β、IL−６の産生
誘導が起こることが明らかである。なお、エンドトキシ
ン濃度が0EU/ml（比較例１）の場合の測定結果は、図１
〜３に示していないが、この場合は各サイトカインとも
に産生量が各測定の検出限界濃度以下であった。

【０１３３】 実施例５〜10 （１）細胞機能測定用容器の製造方法 ポリエチレンテレフタレート製の4mlの採血管（直径1
2.6×75mm）を、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社
製）4mlで10回よく洗浄し、200U/mlとなるようにヘパリ
ンナトリウム（ノボ・ノルディスクA/S社製、商品名：
ノボ・ヘパリン注1000）を含有させた注射用生理食塩水
（大塚製薬社製）を0.05ml添加した。

【０１３４】 E.coli 055:B5由来エンドトキシン（LBL社製）を注
射用生理食塩水（大塚製薬社製）に溶解、段階希釈し
て、上記ヘパリン含有採血管のそれぞれ２本ずつに、ヘ
パリンナトリウム溶解生理食塩水とエンドトキシン溶解
生理食塩水との合計の溶液中に、該エンドトキシン濃度
が8EU/ml（実施例５）、80EU/ml（実施例６）、800EU/m
l（実施例７）、8000EU/ml（実施例８）、80000EU/ml
（実施例９）、800000EU/ml（実施例10）となるように
0.05ml添加した。

【０１３５】 次いで、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）で
よく洗浄した、管径に合うブチルゴム製の栓体を上記採
血管の開口部に、開口部を密栓しないように、軽く載せ
た後、減圧にできる容器内に置き、上記容器を減圧して
ゆき、上記容器を570mmHgに減圧したところで、該採血
管の開口部を密栓した。このようにして製造された減圧
採血管を実施例５〜10の細胞機能測定用容器とした。

【０１３６】 （２）採血管（容器）のエンドトキシン含量の測定 注射針のついた注射器に、エンドトキシンフリー水
（大塚製薬社製）を採取し、その注射針を上記（１）で
得られたヘパリンだけを含有した減圧採血管４本のブチ
ルゴム製の栓体部分に突き刺し、採血管内にエンドトキ
シンフリー水（大塚製薬社製）を0.9ml採取し、１時
間、37℃で攪拌し、エンドトキシンを抽出した。次に、
この抽出液中のエンドトキシン含量を生化学工業社製の
エンドトキシン測定用キットであるエンドスペシーES6
（商品名）を用いて、合成発色基質法で測定した。その
結果、試験した採血管４本共に、抽出液中のエンドトキ
シン含量は0.05EU/ml以下であった。

【０１３７】 （３）TNFα、IL−１βの誘導能の測定方法 健常人ボランティアから、注射針のついた注射器にヘ
パリン採血し、その注射針を上記（１）で得られた、種
々の濃度のエンドトキシンを添加した減圧採血管のブチ
ルゴム製の栓体部分に突き刺し、採血管内に、検体血液
0.9mlを採取した。次いで、予め37℃に保温しておいた
恒温器中の転倒混和用ロッカープラットフォームに血液
を採取した各々の採血管を取り付け、４時間、転倒混和
した。混和後、各々の容器を1600G、10分間、４℃で遠
心分離して、上澄みの血漿を採取した。採取した血漿中
のTNFα、IL−１β、量（pg/ml）を実施例１と同様にし
て測定した。

【０１３８】 この測定結果を図４に示した。図４における横軸のLP
S濃度の単位EU/mlは、血液と接触したときの血中（全液
中）のエンドトキシン濃度を示し、縦軸の誘導量（pg/m
l）は、血漿中のTNFα、IL−１βの濃度についての各２
本の採血管で得られた値の平均値を示す。この結果から
明らかなように、エンドトキシン濃度が0.8〜80000EU/m
lでTNFα、IL−１βの誘導が認められた。また、エンド
トキシン濃度が８〜800EU/mlでTNFα、IL−１βの誘導
量は、それぞれ、ほぼ等しい値を示したが、エンドトキ
シン濃度が8000EU/mlでは、TNFα、IL−１βの誘導量
は、共に、さらに増加し、エンドトキシン濃度が80000E
U/mlでは、TNFα、IL−１βの誘導量は、共に、エンド
トキシン濃度が8000EU/mlに比べて減少した。

【０１３９】 なお、サイトカイン誘導材料であるエンドトキシン
は、すでに特開平１−503331号公報に、10〜200μｇ
（エンドトキシン濃度に換算して約80000〜2000000EU/m
l）を用いることが記載されているが、本発明ではエン
ドトキシンをより低濃度で使用できるので、高濃度で起
こると考えられる複数の機構によるサイトカインの誘導
を起こさず、患者の病態をより正確に反映したサイトカ
インを誘導できる。

【０１４０】 実施例11〜16 （１）細胞機能測定用容器の製造方法 ポリエチレンテレフタレート製の4mlの採血管（直径1
2.6×75mm）を、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社
製）4mlで10回よく洗浄し、200U/mlとなるようにヘパリ
ンナトリウム（ノボ・ノルディスクA/S社製、商品名：
ノボ・ヘパリン注1000）を含有させた注射用生理食塩水
（大塚製薬社製）を0.05ml添加した。

【０１４１】 E.coli 055:B5由来エンドトキシン（LBL社製）の160
0EU/ml注射用生理食塩水（大塚製薬社製）溶液を、上記
ヘパリン含有採血管のそれぞれに、0.05ml添加した。

【０１４２】 次いで、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）で
よく洗浄した、管径に合うブチルゴム製の栓体を上記採
血管の開口部に、開口部を密栓しないように、軽く載せ
た後、減圧にできる容器内に置き、上記容器をしてゆ
き、上記容器を570mmHgに減圧したところで、該採血管
の開口部を密栓した。このようにして製造された減圧採
血管を実施例11〜16の細胞機能測定用容器とした。

【０１４３】 （２）採血管（容器）のエンドトキシン含量の測定 注射針のついた注射器に、エンドトキシンフリー水
（大塚製薬社製）を採取し、その注射針を上記（１）で
得られたヘパリンだけを含有した減圧採血管４本のブチ
ルゴム製の栓体部分に突き刺し、採血管内にエンドトキ
シンフリー水（大塚製薬社製）を0.9ml採取し、１時
間、37℃で攪拌し、エンドトキシンを抽出した。次に、
この抽出液中のエンドトキシン含量を生化学工業社製の
エンドトキシン測定用キットであるエンドスペシーES6
（商品名）を用いて、合成発色基質法で測定した。その
結果、試験した採血管４本共に、抽出液中のエンドトキ
シン含量は0.05EU/ml以下であった。

【０１４４】 （３）TNFα、IL−１βの誘導能の測定方法 健常人ボランティアから、注射針のついた注射器にヘ
パリン採血し、その注射針を上記（１）で得られた、減
圧採血管のブチルゴム製の栓体部分に突き刺し、採血管
内に、検体血液0.9mlを採取した。次いで、予め保温し
ておいた恒温器25℃（実施例11）、30℃（実施例12）、
33℃（実施例13）、37℃（実施例14）、40℃（実施例1
5）、45℃（実施例16）の中の転倒混和用ロッカープラ
ットフォームに血液を採取した各々の採血管を各実施例
２本ずつ取り付け、４時間、転倒混和した。混和後、各
々の容器を1600G、10分間、４℃で遠心分離して、上澄
みの血漿を採取した。採取した血漿中のTNFα、IL−１
β、量（pg/ml）を実施例１と同様にして測定した。

【０１４５】 この測定結果を図５に示した。図５における横軸の反
応温度は、上記の恒温器の温度を示し、縦軸の誘導量
（pg/ml）は、血漿中のTNFα、IL−１βの濃度について
の各２本の採血管で得られた値の平均値を示す。

【０１４６】 実施例17〜21 （１）細胞機能測定用容器の製造方法 ポリエチレンテレフタレート製の4mlの採血管（直径1
2.6×75mm）を、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社
製）4mlで10回よく洗浄し、200U/mlとなるようにヘパリ
ンナトリウム（ノボ・ノルディスクA/S社製、商品名：
ノボ・ヘパリン注1000）を含有させた注射用生理食塩水
（大塚製薬社製）を0.05ml添加した。

【０１４７】 E.coli 055:B5由来エンドトキシン（LBL社製）1600E
U/ml注射用生理食塩水（大塚製薬社製）溶液を、上記ヘ
パリン含有採血管のそれぞれに、0.05ml添加した。

【０１４８】 次いで、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）で
よく洗浄した、管径に合うブチルゴム製の栓体を上記採
血管の開口部に、開口部を密栓しないように、軽く載せ
た後、減圧にできる容器内に置き、上記容器をしてゆ
き、上記容器を570mmHgに減圧したところで、該採血管
の開口部を密栓した。このようにして製造された減圧採
血管を実施例17〜21の細胞機能測定用容器とした。

【０１４９】 （２）採血管（容器）のエンドトキシン含量の測定 注射針のついた注射器に、エンドトキシンフリー水
（大塚製薬社製）を採取し、その注射針を上記（１）で
得られたヘパリンだけを含有した減圧採血管４本のブチ
ルゴム製の栓体部分に突き刺し、採血管内にエンドトキ
シンフリー水（大塚製薬社製）を0.9ml採取し、１時
間、37℃で攪拌し、エンドトキシンを抽出した。次に、
この抽出液中のエンドトキシン含量を生化学工業社製の
エンドトキシン測定用キットであるエンドスペシーES6
（商品名）を用いて、合成発色基質法で測定した。その
結果、試験した採血管４本共に、抽出液中のエンドトキ
シン含量は0.05EU/ml以下であった。

【０１５０】 （３）TNFα、IL−１βの誘導能の測定方法 健常人ボランティアから、注射針のついた注射器にヘ
パリン採血し、その注射針を上記（１）で得られた、減
圧採血管12本のブチルゴム製の栓体部分に突き刺し、採
血管内に、検体血液0.9mlを採取した。次いで、予め37
℃に保温しておいた恒温器中の転倒混和用ロッカープラ
ットフォームに血液を採取した各々の採血管を取り付
け、30分間（実施例17）、２時間（実施例18）、４時間
（実施例19）、６時間（実施例20）、24時間（実施例2
1）転倒混和した。上記各実施例について各２本ずつ所
定時間混和後、各々の容器を3000rpm、10分間、４℃で
遠心分離して、上澄みの血漿を採取した。採取した血漿
中のTNFα、IL−１β量（pg/ml）を実施例１と同様にし
て測定した。

【０１５１】 この測定結果を図６に示した。図６における横軸の反
応温度は、上記の転倒混和の時間を示し、縦軸の誘導量
（pg/ml）は、血漿中のTNFα、IL−１βの濃度について
の各２本の採血管で得られた値の平均値を示す。

【０１５２】 実施例22 （１）細胞機能測定用容器の製造方法 ポリエチレンテレフタレート製の4mlの採血管（直径1
2.6×75mm）を、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社
製）4mlで10回よく洗浄し、200U/mlとなるようにヘパリ
ンナトリウム（ノボ・ノルディスクA/S社製、商品名：
ノボ・ヘパリン注1000）を含有させた注射用生理食塩水
（大塚製薬社製）を0.05ml添加した。

【０１５３】 次に、エンドトキシンフリー、滅菌済のフィトヘマグ
ルチニン−Ｐ（PHA−Ｐ）（Sigma社製）を注射用生理食
塩水（大塚製薬社製）に溶解し、上記ヘパリン含有採血
管に、ヘパリンナトリウム溶解生理食塩水とエンドトキ
シン溶解生理食塩水との合計の溶液中に、100μg/mlに
なるように0.05ml添加した。

【０１５４】 次いで、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）で
よく洗浄した、管径に合うブチルゴム製の栓体を上記採
血管の開口部に、開口部を密栓しないように、軽く載せ
た後、減圧にできる容器内に置き、上記容器をしてゆ
き、上記容器を570mmHgに減圧したところで、該採血管
の開口部を密栓した。このようにして製造された減圧採
血管を細胞機能測定用容器とした。

【０１５５】 （２）採血管（容器）のエンドトキシン含量の測定 注射針のついた注射器に、エンドトキシンフリー水
（大塚製薬社製）を採取し、その注射針を上記（１）で
得られたヘパリン及びPHA−Ｐを収容した減圧採血管４
本のブチルゴム製の栓体部分に突き刺し、採血管内にエ
ンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）を0.9ml採取
し、１時間、37℃で攪拌し、エンドトキシンを抽出し
た。次に、この抽出液中のエンドトキシン含量を実施例
１と同様にして測定した。その結果、試験した反応器４
本共に、抽出液中のエンドトキシン含量は0.05EU/ml以
下であった。

【０１５６】 （３）TNFα、IL−１β、IL−６の誘導能の測定方法 実施例１の（３）で用いた、種々の濃度のエンドトキ
シンを添加した減圧採血管の代わりに、上記（１）で得
られたヘパリン及びPHA−Ｐを含有した減圧採血管を用
いたことの他は、実施例１の（３）と同様にしてTNF
α、IL−１β、IL−６の誘導能の測定を行い、結果を表
１〜３に示した。

【０１５７】 比較例５ （１）細胞機能測定用容器の製造方法 実施例22で使用したポリエチレンテレフタレート製の
4mlの採血管（直径12.6×75mm）の代わりに、実施例22
で使用したものとは異なるポリエチレンテレフタレート
製の4mlの採血管（直径12.6×75mm）を用いたことの他
は、実施例22（１）と同様に操作して、ヘパリン及びPH
A−Ｐを含有する減圧採血管を製造し細胞機能測定用容
器とした。（２）採血管（容器）のエンドトキシン含量
の測定 上記（１）で得られたヘパリン及びPHA−Ｐのみを含
有する減圧採血管４本を用いたことの他は、実施例22
（２）と同様に操作して採血管のエンドトキシン含量の
測定を行った。その結果、試験した採血管４本の、抽出
液中のエンドトキシン含量は0.65EU/ml、0.74EU/ml、0.
58EU/ml、0.62EU/mlであった。

【０１５８】 （３）TNFα、IL−１β、IL−６の誘導能の測定方法 実施例22の（３）で用いた、ヘパリン及びPHA−Ｐを
含有した減圧採血管の代わりに、上記（１）で得られた
ヘパリン及びPHA−Ｐを含有した減圧採血管10本を用い
たことの他は、実施例22の（３）と同様にしてTNFα、I
L−１β、IL−６の誘導能の測定を行い、結果を表１〜
３に示した。

【０１５９】

【表１】

【０１６０】

【表２】

【０１６１】

【表３】

【０１６２】 表１〜３より抽出液中のエンドトキシン量が0.5EU/ml
以下の細胞機能測定用容器を用いた場合の方が再現性が
良かった。 実施例23〜30 （１）細胞機能測定用容器の製造方法 ポリエチレンテレフタレート製の4mlの採血管（直径1
2.6×75mm）を、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社
製）4mlで10回よく洗浄した。ヘパリンナトリウム（ノ
ボ・ノルディスクA/S社製、商品名：ノボ・ヘパリン注1
000）が40U/mlで、及びPHA−Ｌ（Sigma社製）が表４に
示した濃度で溶解された生理食塩水（大塚製薬社製）1m
lを、上記洗浄済の採血管に２本ずついれた。

【０１６３】 次いで、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）で
よく洗浄した、管径に合うブチルゴム製の栓体を上記採
血管の開口部に、開口部を密栓しないように、軽く載せ
た後、減圧にできる容器内に置き、上記容器をしてゆ
き、上記容器を570mmHgに減圧したところで、該採血管
の開口部を密栓した。このようにして製造された減圧採
血管を実施例23〜30の細胞機能測定用容器とした。

【０１６４】 （２）採血管（容器）のエンドトキシン含量の測定 上記（１）で得られた細胞機能測定用容器のうちのPH
A−Ｌの濃度が異なるものの各１本ずつ（合計８本にな
る）に、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）1.0m
lを採取し、１時間、37℃で攪拌し、エンドトキシンを
抽出した。次に、この抽出液中のエンドトキシン含量を
実施例１と同様にして測定した。その結果、実施例23〜
30のいずれの細胞機能測定用容器も抽出液中のエンドト
キシン含量は0.05EU/ml以下であった。

【０１６５】 （３）TNFα及びIL−１βの誘導能の測定方法 健常人ボランティアから、注射針のついた注射器にヘ
パリン採血し、その注射針を上記（１）で得られた実施
例23〜30の細胞機能測定用容器のブチルゴム製の栓体部
分に突き刺し、採血管内に、検体血液1.0mlを採取し
た。次いで、予め37℃に保温しておいた恒温器中の転倒
混和用ロッカープラットフォームに血液を採取した各々
の採血管を取り付け、２時間、転倒混和した。混和後、
各々の容器を1600G、10分間、４℃で遠心分離して、上
澄みの血漿を採取した。採取した血漿中のTNFα及びIL
−１βを実施例１の（３）と同様にして測定し、結果を
表４に示した。

【０１６６】

【表４】

【０１６７】 実施例31〜34 実施例23のPHA−Ｌの代わりに、PHA−Ｐ（Sigma社
製）を表４に示した濃度で使用したことの他は、実施例
23と同様に操作してTNFα及びIL−１βの産生量を測定
し、結果を表４に示した。なお、実施例31〜34の細胞機
能測定用容器を実施例23の（２）と同様にして抽出した
抽出液中のエンドトキシン含量は、0.05EU/ml以下であ
った。

【０１６８】 実施例35及び比較例６ 市販のヘパリン入り真空採血管であるLPS−free採血
管（積水化学工業社製:LPSフリー規格有り）を第１の発
明の細胞機能測定用容器とした（実施例35）。また、市
販のヘパリン入り真空採血管である、Ａ社製採血管（LP
Sフリー規格無し）を比較例の採血容器とした（比較例
６）。

【０１６９】 それぞれ５本の採血管に、健常人（同一人）の血液を
1mlずつ真空採血し、20℃で２時間保存した。その後、
４℃で遠心分離（1600G、10分）し、血漿を採取して、
血漿中のTNFα量を、Genzyme社製、商品名「PREDICTA H
uman TNF−α ELISA KIT」を用いて測定し、それぞれの
平均値を求めた。その結果、実施例35のものは、検出限
界濃度の15pg/ml以下であった。比較例６のものは、51p
g/mlであった。

【０１７０】 また、それぞれの採血管について、同一ロットの別の
採血管のエンドトキシン量を、次のようにして求めた。
採血管内に、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）
を1ml採取し、１時間、37℃で攪拌し、エンドトキシン
を抽出した。次に、この抽出液中のエンドトキシン含量
を実施例１と同様にして測定した。その結果、実施例35
のものは0.03EU/ml、比較例６のものは958EU/mlであっ
た。

【０１７１】 以上より、血液中のTNFα濃度測定を行う場合、採血
は、測定しようとする液量に等しい量のエンドトキシン
フリー水を採取して抽出を行ったときのエンドトキシン
量が、血液細胞から生理活性物質を産生しない量である
採血容器で行わなければ、血液は、採血容器内のLPSと
反応し、TNFαなどの生理活性物質を産生（誘導）し、
不必要に刺激されて、次第に性質が変化していき、本来
の血液中のTNFαの濃度を測定できないことが明らかで
ある。

【０１７２】 実施例36及び比較例７〜９ 実施例35及び比較例６と同様の採血管、並びに市販の
ヘパリン入り真空採血管である、Ｂ社製採血管及びＣ社
製採血管の、それぞれ５本ずつの採血管に、刺激物質と
してLPSの120ng/ml溶液を50μｌずつ分注して、血液とL
PSを反応させたサイトカインを誘導するための反応容器
を調製した。なお、実施例35と同様の採血管を用いたも
のを実施例36、比較例６と同様の採血管を用いたものを
比較例７、Ｂ社製採血管を用いたものを比較例８、Ｃ社
製採血管を用いたものを比較例９の反応容器とする。な
お、比較例８及び９の採血管について、同一ロットの別
の採血管のエンドトキシン含量を、実施例35と同様にし
て測定した結果、比較例８のものは10EU/ml、比較例９
のものは389EU/mlであった。

【０１７３】 ８〜10週齢のICR系雄性マウス５匹から注射器で心採
血した血液合計6mlを実施例35と同様の採血容器に集め
た。 なお、注射器は予め0.2M水酸化ナトリウム水溶液に一
晩浸してエンドトキシンを失活させ、十分にエンドトキ
シンフリー水で洗浄し、さらに、血中での最終濃度が10
U/mlとなるようにヘパリンを予め添加したものを用い
た。

【０１７４】 次いで、上記採血容器の栓体にマルチプル注射針を突
き刺し、もう片側に、上記実施例36及び比較例７〜９の
反応容器の栓体を順に突き刺して、各々に300μｌずつ
分注した。

【０１７５】 次いで、それぞれの反応容器を攪拌しつつ37℃で４時
間保持した。その後、４℃で遠心分離（1600G、10分）
し、血漿を採取して、血漿中のTNF−α量を、Genzyme社
製、商品名「FACTOR TEST MOUSE TNF−α ELISA KIT」
を用いて測定し、それぞれの平均値を求めると共に、変
動係数（％）〔変動係数とは、（標準偏差／平均値）×
100を指す〕も求め表５に示した。

【０１７６】

【表５】

【０１７７】 表５より、TNF−α産生（誘導）量のばらつき（変動
係数）が最も小さかったのは、LPS−freeの採血容器に
既知量のLPSを添加した実施例36の反応容器を用いた場
合であった。

【０１７８】 以上の結果より、患者の病態等を精度良く、しかも、
簡単に把握できる測定法を確立するためには、採血した
血液を不必要に刺激せず、測定するまで保存することが
不可欠である。このためには、LPS含量が生理活性物質
を産生（遊離または誘導）しない量であり、内部が減圧
にされている採血容器で採血することが重要であること
が明らかになった。

【０１７９】 また、精度良く血液細胞機能を測定するには、測定値
に影響を与えるような量のエンドトキシンで汚染されて
いない採血容器を用いることが必要であり、刺激物質が
一定量収容された反応容器に採血された血液を分注し
て、血液と刺激物質を反応させて、産生（遊離または誘
導）された生理活性物質を測定する必要があることが明
らかである。

【０１８０】 実施例37 ガラス製の器具及び容器は、250℃で２時間以上乾熱
処理をし、プラスチック製の器具、容器は、0.2M水酸化
ナトリウム水溶液に一晩浸してエンドトキシンを失活さ
せ、十分にエンドトキシンフリー水で洗浄したものを用
いた。また、操作はクリーンベンチ内で行った。

【０１８１】 ヘパリンナトリウム（和光純薬社製）10000Unitを注
射用生理食塩水（大塚製薬社製）10mlに溶解した。この
溶液を限外濾過器セントリプレップー100（分画分子量1
0万、アミコン社製）を用いて、500Gで１時間、４℃で
遠心限外濾過した。限外濾過器は、予め0.2M水酸化ナト
リウム水溶液に一晩浸してエンドトキシンを失活させ、
十分にエンドトキシンフリー水で洗浄したものを用い
た。

【０１８２】 上記の限外濾過処理したヘパリンナトリウムのエンド
トキシン含量をエンドスペシーES6（生化学工業社製）
を用いて測定した。その結果、このヘパリンナトリウム
のエンドトキシン含量は0.01EU/ヘパリンUnitであっ
た。

【０１８３】 次に、限外濾過処理したヘパリンナトリウム（1000U/
ml）の0.1mlを10ml採血用注射器（テルモ社製）に入れ
て、健常人ボランティアから10ml採血した（最終血中ヘ
パリン濃度約10U/ml）。この採血直後の血液とこれを37
℃の恒温槽に２時間及び４時間放置した後の血液を各々
1600G、４℃で10分間遠心して上澄みの血漿を採取し
た。

【０１８４】 採取した血漿中のTNFα、IL−１β、IL−６の各サイ
トカイン量を各々モノクローナル抗体を用いた酵素免疫
測定キットを用いて測定した。すなわち、TNFαの産生
量の測定は、実施例１〜４の（３）項に記載の方法によ
り行った。測定は各々ｎ＝３とし、その平均値を表６に
示す。

【０１８５】 比較例10 実施例37において、ヘパリンナトリウムを限外濾過処
理せずに用いたこと以外は同様にして、採血を行い、血
漿中のTNFα、IL−１β、IL−６の各サイトカイン量を
各々のモノクローナル抗体を用いた酵素免疫試薬キット
を用いて測定した。測定は各々ｎ＝３とし、その平均値
を表６に示す。

【０１８６】 なお、本比較例10に用いた上記ヘパリンナトリウムの
エンドトキシン含量を実施例37と同様にして測定したと
ころ、1.2EU/ヘパリンUnitであった。

【０１８７】

【表６】

【０１８８】 表６から明らかなように、エンドトキシン含量を限外
濾過により0.01EU/ヘパリンUnitにまで減少させたヘパ
リンナトリウムを用いた系（血中エンドトキシン濃度約
0.1EU/ml）では、４時間までほとんどTNFα、IL−１
β、IL−６は産生されなかったが、未処理のヘパリンナ
トリウムではエンドトキシン含量が1.2EU/ヘパリンUnit
であった（血中エンドトキシン濃度約12EU/ml）ため、
エンドトキシンにより血液中に経時的にTNFα、IL−１
β、IL−６が産生された。

【０１８９】 実施例38〜40 ガラス製の器具、容器は、250℃で２時間以上乾熱処
理をし、プラスチック製の器具、容器は、0.2M水酸化ナ
トリウム水溶液に一晩浸してエンドトキシンを失活さ
せ、十分にエンドトキシンフリー水で洗浄したものを用
いた。また、操作はクリーンベンチ内で行った。

【０１９０】 実施例37で調製したエンドトキシン含量が0.01EU/ヘ
パリンUnitのヘパリンナトリウムを10Uずつ、エンドト
キシンフリーのポリエチレンテレフタレート製の5ml採
血管（直径12.6×75mm、積水化学工業社製）に0.01ml添
加した。

【０１９１】 次に、E.coli UKT−Ｂ由来日本薬局方標準品エンド
トキシン（16000EU/バイアル）を1.6mlの注射用生理食
塩水に溶解し、段階希釈して、上記のヘパリンナトリウ
ム入りの採血管に、採血管当たりの最終血中エンドトキ
シン濃度が各々0.1、0.2、0.4EU/mlとなるように添加し
た。

【０１９２】 次いで、管径に合うブチルゴム製の栓体を開口部を密
栓しないように軽く載せた後、減圧にできる容器内に置
き、1mlの血液を吸引できるように減圧したところで、
採血管の開口部を密栓した。

【０１９３】 次に、健常ボランティアから、真空採血により上記採
血管に1mlずつ採血した。これを予め37℃に保温してお
いた恒温器の中のロッカープラットフォームに取り付
け、４時間、転倒混和した。混和後、各々の採血管を16
00G、４℃で10分間遠心して上澄みの血漿を採取した。

【０１９４】 採取した血漿中のTNFα、IL−１β、IL−６の各サイ
トカイン量を実施例37と同様にして測定した。測定は各
々ｎ＝３とし、その平均値を表７に示す。

【０１９５】 比較例11,12 実施例38と同様にして調製したヘパリンナトリウム入
り採血管に、実施例38で調製したエンドトキシンの生理
食塩水溶液を、採血管当たりの最終血中エンドトキシン
濃度が各々0.5、1.0EU/mlとなるようにしたこと以外は
同様にして、採血を行い、血漿中のTNFα、IL−１β、I
L−６の各サイトカイン量を実施例37と同様にして測定
した。測定は各々ｎ＝３とし、その平均値を表７に示
す。

【０１９６】

【表７】

【０１９７】 表７から明らかなように、血液中でのエンドトキシン
含量が0.5EU/ml以上では、TNFα、IL−１β、IL−６が
産生されることがわかる。 実施例41 ＜細胞機能測定キットの製造方法＞ 第１の細胞機能測定用容器は、実施例１において作製
したエンドトキシン含量が0.05EU以下の採血管に、ヘパ
リンナトリウム（ノボ・ノルディスクA/S社製、商品
名：ノボ・ヘパリン注1000）を200U/mlになるようにエ
ンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）で希釈したヘパ
リンナトリウム水溶液を、上記採血管に濃度が10Uにな
るように、0.05ml添加し、減圧乾燥し、次いで、栓体を
採血管の開口部に、開口部を密栓しないように、軽く載
せた後、減圧にできる容器内に採血管を置き、1mlの血
液を吸引できるように、570mmHgに減圧したところで、
採血管の開口部を密栓して製造した。

【０１９８】 第２の細胞機能測定用容器は、実施例１で作製したエ
ンドトキシン含量が0.05EU以下の採血管に、ヘパリンナ
トリウム（ノボ・ノルディスクA/S社製、商品名：ノボ
・ヘパリン注1000）を200U/mlになるようにエンドトキ
シンフリー水（大塚製薬社製）で希釈したヘパリンナト
リウム水溶液を、上記採血管に10uになるように、0.05m
l添加し、次いで、E.Coli.055:B5由来エンドトキシン
（LBL社製）をエンドトキシンフリー水（大塚製薬社
製）で希釈して、2,000EU/mlの溶液を0.05ml添加し、減
圧乾燥し、次いで、栓体を採血管の開口部に、開口部を
密栓しないように、軽く載せた後、減圧にできる容器内
に採血管を置き、1mlの血液を吸引できるように、570mm
Hgに減圧したところで、採血管の開口部を密栓して製造
した。

【０１９９】 第1,第２のTNFα測定試薬は、以下のようにして製造
した。 抗ヒトTNFαモノクローナル抗体（Genzyme社製）を0.
1M炭酸緩衝液（pH9.5）で100ng/ml（第１のTNFα測定試
薬用、すなわち高感度測定用、固定化抗体液）及び１μ
g/ml（第２のTNFα測定試薬用、すなわち低感度測定
用、固体化抗体液）になるように希釈して、各希釈液を
100μｌずつ96wellマイクロプレート（Nunc MaxiSorp
microtiter plates）の各wellに添加し、２〜８℃で
一昼夜インキュベートした。次いで、0.05重量％Tween2
0含有リン酸緩衝液（pH7.3）で各wellを３回吸引洗浄し
た。次いで、４重量％ウシ血清アルブミン（Sigma社
製）含有リン酸緩衝液（pH7.3）を250μｌずつ各wellに
添加し、37℃で２時間インキュベートした。次いでマイ
クロプレートの液を除き、室温で乾燥させた。

【０２００】 なお、検量線用のヒトTNFα（Genzyme社製）、ビオチ
ン標識抗ヒトTNFαポリクローナル抗体（Genzyme社
製）、過酸化水素、テトラメチルベンジジンを含む基質
溶液（KPL社製）については市販の試薬を用いた。ま
た、洗浄液としては、0.05重量％Tween20含有リン酸緩
衝液（pH7.3）を用い、反応停止液は2M硫酸溶液を調製
して用いた。

【０２０１】 ＜TNFα産生能の測定＞ 健常人ボランティアから、注射針の付いた注射器にヘ
パリンを採取し、その注射針を上記第1,第２の細胞機能
測定用容器のブチルゴム製の栓体に突き刺し、反応容器
内に、検体血液1mlを採取した。次いで、予め37℃に保
温しておいた恒温器の中の転倒混和用ロッカープラット
フォームに血液を採取した各々の容器を取り付け、４時
間、転倒混和した。混和後、各々の容器を1,600G、10分
間、４℃で遠心して、上澄みの血漿を採取した。第１の
細胞機能測定用容器から採取した血漿中のTNFα量を上
記の高感度測定試薬を用い、実施例１の（３）の方法で
4well測定した。また、第２の細胞機能測定用容器から
採取した血漿中のTNFα量を上記の低感度測定試薬を用
い、実施例１の（３）の方法で4well測定した。

【０２０２】 比較例13 実施例41に記載したように、第1,第２の細胞機能測定
用容器でのTNFα産生誘導を行い、血漿中のTNFα量の測
定を測定感度が15〜1,000pg/mlの市販キット（PREDICTA
Human TNF−α ELISA KIT）を用いて4well測定で
行った。測定値が市販キットの測定限界を超えた場合に
は、１重量％ウシ血清アルブミン（Sigma社製）含有リ
ン酸緩衝液（pH7.3）で約５倍に希釈して、再測定後、
希釈倍数を乗じて測定値とした。

【０２０３】 実施例41及び比較例13の結果を下記の表８に示す。

【０２０４】

【表８】

【０２０５】 表８中のCVは変動係数を示す。 表８の結果から明らかなように、市販キットでは、希
釈操作を行わないと、第２の細胞機能測定用容器で誘導
されたTNFα量を測定できないことが明らかである。ま
た、実施例では、変動係数が約７％程度と再現性に優れ
ていたが、市販キットでは、希釈した後の再測定の結
果、変動係数が約15〜20％で再現性が悪かった。

【０２０６】

【発明の効果】

また、本発明では、上記第１の細胞機能測定用容器
と、第２の細胞機能測定用容器と、生理活性物質を定量
するための定量試薬とを有するため、血液を第1,第２の
細胞機能測定用容器内に導入し、上記定量試薬を用いて
定量することにより、第１の細胞機能測定用容器におい
てコントロール値を得ることができ、第２の細胞機能測
定用容器において、生理活性物質産生誘導材料により産
生された血液中の生理活性物質量に応じた測定値を得る
ことができ、従って、血液中の生理活性物質量を高精度
に測定することが可能となる。

【０２０７】 この場合、第1,第２の細胞機能測定用容器に応じて、
それぞれ、感度の異なる第1,第２の酵素免疫測定試薬を
用いることにより、産生された生理活性物質量をより高
精度に測定することができる。

【０２０８】 また、本発明に係る細胞機能測定用キットにおいて、
生理活性物質産生誘導材料がエンドトキシンの場合、第
２の細胞機能測定用容器中のエンドトキシン含量を、血
液と接触された際の全液中のエンドトキシン濃度を0.6
〜100000EU/mlとすることにより、エンドトキシンが血
液と接触された際の血液中で産生された生理活性物質量
を高精度に測定することができる。

【０２０９】 第1,第２の細胞機能測定用容器において、血液抗凝固
剤をさらに収納した場合には、各細胞機能測定用容器に
おける血液の凝固が確実に防止される。 また、上記血液抗凝固剤中の生理活性物質産生誘導材
料の含量を、血液と混合されたときに生理活性物質を産
生しない量とすることにより、血液抗凝固剤中の生理活
性物質産生誘導材料による影響を受けることなく、産生
された生理活性物質を高精度に測定することができる。

【０２１０】 また、第1,第２の細胞機能測定用容器において、容器
内を減圧とした場合は、血液を細胞機能測定用容器に容
易に導入することが可能となる。従って、被検者から血
液を採血後、ピペッティングなどの手段で血液を種々の
反応容器に移し変えたり、細胞分離、細胞培養等の操作
を必要としないため、試験者は、肝炎、エイズなどの種
々の感染症に感染する危険性がほとんどない。また、エ
ンドトキシン含量が管理され、血液試料中に種々の雑菌
や埃などの混入のおそれがないため、これらの汚染物や
種々の操作による細胞の不要な活性化または活性低下が
惹起される問題もない。また、全血を用いるため、細胞
分離、細胞培養、顕微鏡測定等の特殊な技術も必要な
く、測定時間も短縮でき、RI施設やフローサイトメータ
ーなどの高価な装置も必要としない。そのため、従来よ
りも、操作が簡単で危険性がなく、精度良く細胞機能測
定ができる。

【０２１１】 本発明に係る細胞機能測定方法によれば、第２の細胞
機能測定用容器に血液を導入し、生理活性物質産生誘導
材料と血液とを接触させて生理活性物質を誘導するた
め、すなわち、第２の細胞機能測定用容器中において、
エンドトキシン含量が上記のように制限されているた
め、血液中で産生された生理活性物質量を高精度に測定
することが可能となる。

【０２１２】 この場合、生理活性物質の産生を誘導する温度を26〜
45℃の範囲としたり、あるいは生理活性物質の産生を誘
導する時間を１〜６時間としたりすることにより、血液
中における生理活性物質の産生を確実に誘導することが
できる。

【０２１３】 本発明に係る細胞機能測定方法では、産生された生理
活性物質の量を、定量可能な試薬により定量することに
より、血液中に産生した生理活性物質量を確実にかつ容
易に測定することが可能となる。 図面の簡単な説明

【図１】 実施例１〜４及び比較例２〜４の測定結果を示すグラ
フであり、横軸はLPS濃度、縦軸はTNFαの誘導量を示す
図。

【図２】 実施例１〜４及び比較例２〜４の測定結果を示すグラ
フであり、横軸はLPS濃度、縦軸はILE1βの誘導量を示
す図。

【図３】 実施例１〜４及び比較例２〜４の測定結果を示すグラ
フであり、横軸はLPS濃度、縦軸はIL−６の誘導量を示
す図。

【図４】 実施例５〜10の測定結果を示すグラフであり、横軸は
LPS濃度、縦軸はTNFαまたはIL−１βの誘導量を示す
図。

【図５】 実施例11〜16の測定結果を示すグラフであり、横軸は
反応温度、縦軸はTNFαまたはIL−１βの誘導量を示す
図。

【図６】 実施例17〜21の測定結果を示すグラフであり、横軸は
反応温度、縦軸はTNFαまたはIL−１βの誘導量を示す
図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 特願平9−50403 (32)優先日 平成９年３月５日(1997．3．5) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願平9−132445 (32)優先日 平成９年５月22日(1997．5．22) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） 前置審査 (56)参考文献 特開 平２−196961（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−159397（ＪＰ，Ａ) 実開 昭60−10499（ＪＰ，Ｕ) 登録実用新案3019393（ＪＰ，Ｕ) Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ，ｖｏｌ．124，ｎｏ．172775ｂ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/48 G01N 33/579

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】血液細胞が産生する生理活性物質を測定す
   る際に用いられる細胞機能測定用キットであって、 開口部を有する容器と、前記容器の開口部に取付けられ
   ており、かつ試料採取時に取り外されることなく密栓さ
   れている栓体とを備え、容器自体のエンドトキシン含量
   が測定しようとする液量に等しい量の水を採取し、抽出
   した際の抽出液中の濃度として0.5EU/ml以下とされてい
   る第１の細胞機能測定用容器と、 開口部を有する容器と、前記容器の開口部に取付けられ
   ており、かつ試料採取時に取り外されることなく密栓さ
   れている栓体とを備え、血液と接触することにより該血
   液中に生理活性物質の産生を誘導する材料が前記容器内
   に収納されており、かつ上記生理活性物質の測定値に影
   響を与えないように、使用前の容器自体のエンドトキシ
   ン含量が測定しようとする液量に等しい量の水を採取
   し、抽出した際の抽出液中の濃度として0.5EU/ml以下と
   されている第２の細胞機能測定用容器と、 生理活性物質を定量するための定量試薬とを有する、細
   胞機能測定用キット。
2. 【請求項２】前記定量試薬が、第１の細胞機能測定用容
   器に血液を採取し、血液中の生理活性物質量を測定する
   のに用いられる第１の酵素免疫測定試薬と、 第２の細胞機能測定用容器に血液を採取し、生理活性物
   質の産生を誘導する材料と血液との反応により産生され
   る生理活性物質量を測定するのに用いられ、生理活性物
   質に対しての測定感度が第１の酵素免疫測定試薬と異な
   る第２の酵素免疫測定試薬とを含む、請求項１に記載の
   細胞機能測定用キット。
3. 【請求項３】上記生理活性物質の産生を誘導する材料が
   エンドトキシンであり、第２の細胞機能測定用容器にお
   いては、該エンドトキシンの血液と接触された際の全液
   中の濃度が0.6〜100000EU/mlとなるようにされている、
   請求項１または２に記載の細胞機能測定用キット。
4. 【請求項４】請求項１〜３の何れかに記載の細胞機能測
   定用キットの第1,第２の細胞機能測定用容器に血液を導
   入し、生理活性物質の産生を誘導することを特徴とす
   る、細胞機能測定方法。
5. 【請求項５】前記生理活性物質を誘導する際の温度が26
   〜45℃である、請求項４に記載の細胞機能測定方法。
6. 【請求項６】前記生理活性物質を誘導する際の時間が、
   １〜６時間である、請求項４または５に記載の細胞機能
   測定方法。
7. 【請求項７】請求項４〜６の何れかに記載の方法により
   誘導された生理活性物質の量を、定量可能な試薬により
   定量する細胞機能測定方法。